DE2616399C2 - Desamino-1,7-dicarbacalcitonine und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Desamino-lJ-dicarbacalcitonine der allgemeinen Formel I

ι (CH₂)S 1

L- CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gin-Glu-Leu-His-

Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-A₂₅-Aj₆-Gly-A₂₈-Gly-Thr-Pro-NH2 (I)

worin

a) A₂S Asp, A₂,, VaI und A₃₈ AIa oder

b) A15 Asn, A_J6 Thr und A_:8 Ser

bedeuten, sowie deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze und übliche Komplexe mit langer anhaltender Wirksamkeit und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Desamino-lJ-dicarbacalcitonine der allgemeinen Formel i besitzen den Calciumspicgel des Serums senkende Eigenschaften.

Calcitonin ist ein bekanntes Polypeptid mit den Calciumspiegel des Serums bei Säugetieren senkenden Eigenschaften und wird aus Säugetier- oder Vögelschilddrüsen oder aus dem letzten Kiemenkörper von Fischen isoliert. Die Aminosäuresequenz des Calcitonins hängt von seiner natürlichen Herkunft ab, und kürzlich wurden synthetische Calcitonine bekannt, die dieselbe chemische Struktur wie diejenigen natürlichen Ursprungs aufweisen.

Die Calcitonine natürlichen Ursprungs wie z.B. Aal-, Lachs- oder Humancalcitonin sind Polypeptide, die ()5 aus 32 Aminosäuren bestehen, wobei die erste und die siebte Aminosäure jeweils L-Cyslein ist und deren Mercaptogruppen unter Bildung einer Disulfidbrücke miteinander verbunden sind.

Die Polypeptide gemäß der Erfindung enthalten demgegenüber weder als erste noch als siebente Aminosäure L-Cystein, das L-Cystein ist vielmehr durch a-Aminokorksäure der Formel

CH₂-CH₂-CH₂-CH₂

CH₂COOH H₂N—CH-COOH

ersetzt

Die ^-Carboxylgruppe ist an die N-terminale Aminosäure unter Bildung einer Ringstruktur gebunden.

Die erfrädungsgernäßen Desamino-lJ-dicarbacalcitonine weisen ein bedeutendes Ausmaß an therapeutischer Wirkung auf. Die neuen Verbindungen können verordnet werden, um den Serum-Calcium-Spfegel bei Krankheiten wie beispielsweise Hypercalcämie, endogener Calcitonin-Mangelkrankheit, welche durch Dysthyroidismus oder Hyperparathyroidismus verursacht wird, herabzusetzen. Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen ist dabei größer und von längerer Dauer als die von Calcitonin aus Säugetieren (Schweineschilddrüs e>.

Die neuen Verbindungen können für eine Calcium benötigende Chiropraktik wie beispielsweise Osteoporose, Osteomalazie, Fraktur, Faser-Dysplasie des Knochsns oder Rachitis, welche durch Corticosteron-Therapie oder eine Inaktivierung nach dem Klimakterium -oder durch äußere Verletzung verursacht wird, verordnet werden, insbesondere kombiniert mit Calcium oder Phosphor. Die neuen Verbindungen können auch zur Therapie der Pagetschen Krankheit verwendet werden. Ferner zur Therapie oder zur Verhinderung von Magengeschwüren. Nach Verabreichung beim Menschen erreicht die Blutkonzentration nach 30 Minuten ein Maximum und bleibt 120 Minuten nachweisbar. Die Konzentration in Niere und Leber erreicht ein Maximum aafih 30 bis 120 Minuten und fallt dann ab. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I ist dabei im Vergleich mit Caiciionin aus Säugetieren gleich oder höher wie Vergleichsversuche bei Ratten sigeben haben. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind im Serum in der Leber oder in der Niere stabiler als das Calcitonin und außerdem stabiler bei Verfahren zu ihrer Reinigung und bei der Lagerung, und zwar infolge des Fehlens einer Disulfid-Brückenbindung.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können mittels herkömmlicher peptidsynthetischer Methoden wie in den Ansprüchen 2 bis 4 angegeben hergestellt werden: Eine Aminosäure und/oder ein Peptid mit zwei oder mehr, vorzugsweise zwei bis vier Aminosäuren, wird in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz gemäß der allgemeinen Formel I kondensiert, und das Aminosäurekondensat, das die Sequenz der Formel II

(CH₂)sCOOR

H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO- _{II)

enthält, wird bei irgendeiner Resktior-sstufe beim Aufbau des Peptids einer Ringschlußreaktion unterworfen und die zum Schutz der reaktiven Gruppe eingeführte Schutzgruppe wird in irgendeiner Reaktionsstufe wieder abgespalten. Gewünschtenfalls kann die Verbindung in ein Säu.-eadditionssalz oder einen Komplex übergeführt werden.

Die bei der Synthese der Ausgangsmaterialien oder der Zwischenprodukte verwendeten Schutzgruppen stellen fur Peptidsynthesen übliche Schutzgruppen dar und sollen durch Hydrolyse, Säurezersetzum» Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse leicht entfernt werden können. *"

Beispielsweise wird die Aminogruppe in herkömmlicher Weise durch eine Acylgruppe wie beispielsweise eine Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfony! , p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl- oder 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppe, eine Aralkylgruppe wie beispielsweise eine Benzyl-, Diphenylmethyl- oder Triphenylmethylgrupp.s geschützt (diese Gruppen können gegebenenfalls durch eine Niederalkoxygruppe wie beispielsweise eine o-Methoxy- oder p-Methoxygruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe wie beispielsweise eine Benzyloxyi:arbonyl-, o-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl- oder p-(p'-Methoxyphenyla;:o.)-benzyloxycarbonylgruppe, eine aliphatische Oxycarbonvlgruppe wie beispielsweise eine Cyclopentyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-" tert.-Butoxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe wie beispielsweise eine 2-Phenyiisopropoxycarbonyl-, 2-Tosyl-isopropoxycarbonyI- oder 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe substituiert sein. Die Aminogruppe kann durch Bildung eines Enamins durch Umsetzung mit einem 1 3-Diketon wie beispielsweise Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden. '

Die Carboxylgruppe kann durch Bildung ihres Amids, ihres Hydrazids oder durch Veresterung geschützt werden. Die Amidgruppe ist durch eine 3,4-Dimethoxybenzyl- oder Bis(p-methoxyphenyl)methylgruppe substituiert. Die Hydrazidgruppe ist durch eine Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Trifluoracetyltert.-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe substituiert. Die Estergruppe ist durch ein Alkanol wie beispielsweise Methanol, Äthanol, tert.-Butanol oder Cyanomethylalkoho! ein Aralkanol wie beispielsweise Benzylalkohol, p-Brombenzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol P-Nitrobenzylalkohol, 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, Benzhydrylalkohol, Benzoyimethylalkohol p-Brombenzoylmethylalkohol oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol, ein Phenol wie beispielsweise 2 4 6-Trich'lorphenol Pentachlorphenol, ρ-Nitrop..-nol, 2,4-DinitrophenoI, p-CyanophenoI oder p-Methansulfonylphenol oder ein Thiophenol wie beispielsweise Thiophenol, Thiokresol oder p-Nitrothiophenol substituiert Die HydroxyrCppe in Serin. Threonin oder*Tyrosin kann geg'ebenenfall's durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden Eine tür den Schutz durch Veresterung verwendete Schutzgruppe ist beispielsweise eine Niederalkanoylgruppe wie beispielsweise die Acetylgruppe, eine Aroylgruppe wie beispielsweise die Benzoylgruppe oder eine Gruppe, die sich von Carbonyl ableitet, wie beispielsweise die Benzyloxycarbonyl- oder Äthoxycarbonylgruppe. Eine für den Schutz durch Verätherung verwendete Schutzgruppe ist beispielsweise die

Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder tert.-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxygruppe kann durch die 2,2,2-Trifluor-l-tert-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-l-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppe erfolgen. Es ist jedoch nicht immer notwendig, diese Hydroxygruppen zu schützen. Die Aminogruppe oder Guanidinogruppe in Arginin kanu durch die Nitro-, Tosyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden, jedoch muß die Guanidinogruppe nicht unbedingt geschützt werden. Die Iminogruppe in jfiistidin kann durch die Benz;^ , Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Adamantyloxycarbonyl-, 2,2,2-Trifluor-l-tert-butyIoxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-l-benzyloxycarbonyIaminoäthylgruppe geschützt werden, jedoch muß diese Iminogruppe nicht unbedingt immer geschützt werden.

Die Peptide der Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte werden synthetisiert durch Kondensation von Aminosäuren oder von Peptiden aus vorzugsweise zwei bis vier Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäure-Sequenz der Formel I.

Beispielsweise wird eine Aminosäure oder ein Peptid, welches eine geschützte ir-Aminogruppe oder eine aktivierte endständige Caiooxylgruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, welches eine freie ff-Aminogruppe und eine geschützte endständige Carboxylgruppe enthält, umgesetzt Andererseits wird eine Aminosäure oder ein Peptid, welches eine aktive ar-Aminogruppe und eine geschützte endständige Carboxylgruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, welches eine freie endständige Carboxylgruppe und eine geschützte ff-Aminogruppe enthält, umgesetzt.

Die oben angegebene Carboxylgruppe kann aktiviert werden, wie beispielsweise als Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid oder einen aktiven Ester, wie beispielsweise durch Überführung in einen Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, p-Methansulfonylphenylester, Thiodylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester. 2,4.5-Trichlorphenylester. 2.4.6-Trichlorphenylester, Püilachlorphenylester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydrciypipfcridinester oder N-Hydroxypiperidinester, oder ein Carbodiimid, Ν,Ν'-Carbonyl-diimidazoI oder Isoxazoliumsalz wie beispielsweise Woodward-Reagenz.

Die Kondensationsreaktionen werden bevorzugt nach der Wunsch-Methode, Azid-Methode, aktive-Ester-Methode oder Geiger-Methode durchgeführt. Bei der Kondensationsreaktion soll eine Racemisierung sorgfältig vermieden werden.

Die Baueinheit, die das auf diese Weise erhaltene Peptid der Formel II

(CH₂)SCOOR

I

H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO- (II)

enthält, worin R einen reaktiven Esterrest bedeutet, wird der Ringschlußreaktion unterworfen. Die Ringschlußreaktion wird durch Kondensation der aktivierten «y-Carboxylgruppe der <r-Aminokorksäure mit der freien Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure der Baueinheit durchgeführt. Bei der Kondensationsreaktion wird die Hydroxylgruppe des Serins und Threonins vorzugsweise geschützt.

Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Peptidring (mit wahlweise geschützten aktiven Gruppen), der die e-Aminokorksäure enthält, mit dem übrig bleibenden anderen großen Peptidbaustein, der wahlweise geschützte aktive Gruppen besitzt, kondensiert. Das heißt, das N-ter-minale Bruchstück, das aus der 1. bis 6. oder 9. Aminosäure besteht, wird mit dem restlichen Teil des Peptids mit der Gesamtsequenz der 7. bis 10. oder 31. Aminosäure kondensiert. Wegen der Reaktivität beider Fragmente bei der Kondensation und um eine Racemisierung zu verhindern, wird Glycin vorzugsweise als C-terminale Aminosäure verwendet.
Gemäß der Erfindung wird vorzugsweise ein Peptid mit der aus der 1. bis 9. Aminosäure bestehenden Sequenz mit einem Peptid mit der aus der 10. bis 31. Aminosäure bestehenden Sequenz umgeretzt.

Die genannte Kondensationsreaktion kann ausgehend von dem Peptid mit der freien terminalen Carboxylgruppe, nach der sog. Wunsch-Methode, oder nach entsprechenden Methoden durchgeführt werden. Vorzugsweise kann sie mittels der Azid-Methode durchgeführt werden, ausgehend von einem Peptid mit einer terminalen Azid- oder Hydrazid-Gruppe, mittels der aktive-Ester-Methode oder mittels der gemischten Anhydrid-Methode.

Die Synthese des N-terminalen Fragments, nämlich des Nonapeptids mit der aus der 1. bis 9. Aminosäure begehenden Sequenz, wird nachstehend im einzelnen erläutert werden; das Hexapeptid 1-6, das Heptapeptid 1-7 bzw. das Oktapeptid 1-8 kann jedoch ebenso mit Hilfe desselben Verfahrens hergestellt werden.

Die Nonapepiid-Sequenz kann durch Verknüpfen jeder Aminosäure mit einem niedrigen Peptid, das aus 2-4 Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz, ausgehend von der C-terminalen Aminosäure, besteht, hergestellt werden. Aminosäuren wie Glycin, Leucin, Valin, α-Aminokorksäure, Threonin, Methionin, Serin oder Asparagin werden vorzugsweise mittels der aktive-Ester-Methode kondensiert. Die niederen Peptide, wie z.B. dasTripeptid aus den Aminosäuren 2-4, werden vorzugsweise mittels derGeiger- oder der Wunsch-Methode kondensiert.

Bei der Kondensationsreaktion nach dem Azid-, Aktivester· oder Säureanhydridverfahren muß die endständige Carboxylgruppe im Decapeptid nicht unbedingt geschützt werden. Die Carboxylgruppe kann auch durch Veresterung z.B. mit Methanol, Benzylalkohol oder einem anderen Alkohol geschützt werden. Die Estergruppe, beispielsweise der Methylester, kann durch verdünnte Natriumhydroxidlösung oder durch Überführung in ein Hydrazid entfernt werden, die Benzylestergruppe kann dur,h katalytische Hydrierung entfernt werden. Die Aminogruppe des Zwischenproduktes wird durch übliche Schutzgruppen wie beispielsweise die Benzyloxycarboni'l·, Trityl-, tert.-Butoxycarbonyl- oder die 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe geschützt. Die Carboxylgruppe kann gewünschtenfalls durch herkömmliche Veresterung geschützt werden.

Die Hydroxylgruppe in Serin und Threonin kann gewünschtenfalls durch Veretherung unter Verwendung von tert.- Butanol, Benzylalkohol oder eines anderen Alkohols geschützt werden.

Die oben genannten Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzylester- und Benzylestergruppen werden durch katalytische Hydrierung in Gegenwart von Palladium/Kohle abgespalten. Die N-Tritylgruppe wird durch wäßrige Essigsäure abgespalten, und die tert.-Butoxycarbonylgruppe kann durch Trifluoressigsäure zersetzt werden. Die o-Nilrophenylsulfenylgruppe wird durch Chlorwasserstoff, Cyanwasserstoff oder schwefelige Säure in einem organischen Lösungsmittel abgespalten. Die Diphenylisopropoxycarbonylgruppe wird durch ein Essigsäure/Ameisensäure-Wassergemisch (7:1:2) abgespalten. Der Methylester, Äthylester oder p-Nitrobenzylester wird unter Verwendung von Hydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt. Die Methylestergruppe kann durch verdünnte Natriumhydroxidlösung, der tert.-Butylester durch Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Ein C-terminales Peptid mit der aus der 7.-1(1. bzw. bis 31. Aminosäure bestehenden Sequenz, welches mit dem oben genannten N-terminalen Peptid kondensiert wird, wird vorzugsweise durch Verknüpfen der C-terminalen Aminosäure (Aminosäure Nr. 31) oder eines C-terminalen Bruchstückes, z.B. des Peptids mit der Sequenz der Aminosäuren 30 bis 31, 28 bis 31, 25 bis 31, 24 bis 31 oder 23 bis 31, mit jeder Aminosäure oder jedem niederen Peptid synthetisiert, das aus 2-4 Aminosäuren in der Reihenfolge der genannten Aminosäuresequenz besteht.

Beispielsweise kann ein C-terminales Teilstück mit der aus der 10.-31. Aminosäure bestehenden Sequenz hergestellt werden durch Kondensation von Aminosäuren und niederen Peptiden wie beispielsweise dem Dipeptid aus den Aminosäuren 28 bis 29, dem Dipcptid 26 bis 27, dem Tripeptid 20 bis 22, dem Tetrapeptid 15 bis 18 und dem Tripeptid 10 bis 12 in der Reihenfolge der genannten Aminosäuresequenz, und zwar ausgehend von der Seite mit der endständigen Carboxylgruppe nach der Aktivestermethode oder der Geiger-Methode. Als Schutzgruppen werden bevorzugt verwendet: Für die ff-Aminogruppe die tert.-Butoxycarbonylgruppe; für die Seitenketten-Carboxylgruppe von Asparaginsäure und Glutaminsäure die Benzylestergruppe; für die r-Aminogruppe von Lysin die o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe; für die Hydroxylgruppe von Serin, Threonin und Tyrosin die Benzylgruppe; und für die Aminogruppe in der Guanidingruppe des Arginins und für die Iminognippe des Histidins die Tosylgruppe.

Die Schutzgruppe des C-terminalen, aus den Aminosäuren 7 bis 10 bzw. bis 31 bestehenden Teilstücks, welche die ff-Aminogruppe schützt, beispielsweise das aus der Sequenz der 10. bis 31. Aminosäure bestehende Dodecapeptidamid, wird nach irgendeinem geeigneten Verfahren entfernt. Die Tritylgruppe z.B. wird durch wäßrige Essigsäure abgespalten. Die Diphenylisopropoxycarbonylgruppe, Benzyloxycarbonylgruppe und tert.-Butoxycarbonylgruppe werden durch ein Eisessig-Ameisensäure-Wasser-Gemisch, Hydrierung bzw. Trifluoressigsäure entfernt.

Auf diese Weise erhält man das Hentriacontapeptidamid mit einer geschützten σ-Aminogruppe, einer geschützten f-Aminogruppe und wahlweise geschützter Carboxyl- und/oder Hydroxylgruppe in der Seitenkette. Diese Schutzgruppen werden mit Hilfe eines der oben beschriebenen Verfahren abgespalten, vorzugsweise einer Säure wie z.B. Fluorwasserstoff, und schließlich erhält man das Produkt der Formet I.

Im Falle der Synthese der neuen erfindungsgemäßen Polypeptide nach der Merrifield-Festphasen-Peptidsynthese kann die Hydroxygruppe in Serin, Threonin und Tyrosin durch beispielsweise eine Benzylgruppe geschützt werden; die Iminogruppe in Histidin kann beispielsweise durch die l-Benzyloxycarbonylamino-2,2,2-trifluoräthylgruppe geschützt werden; die Guanidinogruppe in Arginin kann beispielsweise durch die Nitrogruppe geschützt werden; und die Seitenkette in der Glutaminsäure kann durch die Benzylestergruppe geschützt werden. Eine Schutzgruppe für die a-Aminogruppe ist beispielsweise die tert.-Butyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder o-Brombenzyloxycarbonylgruppe. Das geschützte Peptid wird von dem Trägerharz entfernt, und die Schutzgruppe wird durch wasserfreien Fluorwasserstoff entfernt.

Eine einstufige Entfernung sämtlicher Schutzgruppen durch Hydrolyse unter Verwendung von Trifluoressigsäure kann erreicht werden, wenn die tert.-Butoxycarbonylgruppe für den Schutz der Aminogruppe, der tert.-Butylester für den Schutz der Seitenketten-Carboxylgruppe, ten.-Butyläther für den Schutz der Hydroxylgruppe in Serin, Threonin und Tyrosin und die 2,2,2-TrifIuor-l-tert.-butoxycarbonylaminoäthy!gruppe für den Schutz der Iminogmppe in Histidin verwendet werden. so

Die Polypeptide der Formel I können in Form der freien Base oder eines Salzes erhalten werden. Die freie Base kann in üblicher Weise aus ihrem Salz hergestellt werden. Die frei; Base kann in ein pharmakologisch verträgliches Salz übergeführt werden durch Umsetzen mit einer anorganischen Säure, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, oder Phosphorsäure, oder mit einer organischen Säure, wie beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Benzoesäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure.

Die Polypeptide gemäß Anspruch 1 können auf übliche Weise durch Zugabe einer anorganischen oder organischen Substanz in einen Komplex mit länger anhaltender Wirksamkeit übergeführt werden.

Beispiele für diese komplexbildenden Substanzen sind anorganische Verbindungen, die von einem Metall, wie beispielsweise Calcium, Magnesium oder Zink, abgeleitet sind, insbesondere Phosphate, Pyrophosphate oder Polyphosphate dieser Metalle. Weitere Beispiele für komplexbildende Substanzen sind organische Verbindungen, wie beispielsweise nicht-antigene Gelatine, CMC, Polyglutaminsäure.

Die hier verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:

BOC: tert-Butoxycarbony],
AOC: terL-Amyloxycarbonyl,
DIP: Diisopropylmethoxycarbonyl,

	Cbz:	26 16 399	Benzyloxycarbonyl,
	CICbz:	o-Chlorbenzyloxycarbonyl,
	BzI:	Benzyl,
	HOSU:	N-Hydroxysuccinimid,
	Tos:	Tosyl,
5	OÄt:	Äthylester,
	OBzI:	ßenzylester,
	O"P:	p-Nitrophenylester,
	OSU:	N-Hydroxysuccinimidester,
	Phe:	L-Phenylalanin,
10	Ser:	L-Serin,
	Asn:	L-Asparagin,
	Leu:	L-Leucin,
	Thr:	L-Threonin,
	VaI:	L-Valin,
15	Pro:	L-Prolin,
	Arg:	I.-Arginin,
	Asp:	L-Asparaginsäure,
	Ala:	L-Alanin,
	TFA:	Trifluoressigsäure,
20	TosOH:	p-Toluolsulfonsäure,
	CHA:	Cyclohexylamin,
	DCHA:	Dicyclohexylamin,
	THF:	Tetrahydrofuran,
	GIv:	Gycin,
25	Lys:	L-Lysin,
	Gin:	L-Glutamin,
	GIu:	L-Glutaminsäure,
	His:	L-Histidin,
	Tyr:	L-Tyrosin,
30	O^.u:	t-Butylester,
	Met:	L-Methionin,
	He:	L-Isoleucin,
	DMF:	Dimethylformamid,
	AcOÄt:	Äthylacetat,
35	DCC:	Dicyclohexylcarbodiimid,
	WSC:	N-Äthyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimid,
	HOBT:	1 -Hydroxybenzotriazol,
	MeOH:	Methanol,
	ÄtOH:	Äthanol,
40	AcOH:	Essigsäure.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Zunächst wird die Versuchsmethode zur Bestimmung der den Calciumspiegel im Serum senkenden Wirksamkeit, der Träger und das Entwicklersystem für die Dünnschichtchromatographie sowie die Bedingungen für die Analyse beschrieben.

Versuchsmethode

Die Probe wird mit einer '1,1 N-Natriumacetat-0,1%-Albuminlösung in geeigneter Weise verdünnt. Jeweils 0,2 ml der Lösung werden curch intravenöse Injektion einzelnen männlichen Ratten verabreicht. N ich einer Stunde werden alle Ratten getötet, ihr Blut wird entnommen, und der Serum-Calcium-Wert jeder Blutprobe wird durch Atomabsorptionsspektrophotometrie bestimmt. Andererseits wird eine Standard-Versuchsprobe B, welche einen aus Schweineschilddrüsen gewonnenen Extrakt darstellt, so verdünnt, daß Lösungen von 2,5, 5, 10 und 20 MRC mU/0,2 ml erhalten werden. Jeweils 0,2 ml dieser Lösungen werden durch intravenöse Injektion an männliche Ratten verabreicht. Der Serum-Calcium-Wert der Ratten wird nach demselben Verfahren wie oben beschrieben eine Stunde nach der Injektion bestimmL Aus der Wirksamkeit der entsprechenden Standard-Versuchsprobe wird die Wirksamkeit des Calcitonins in der Probe bestimmt.

Dünnschichtchromatographie (DSC):

Träger: Silikagel G
Zellulose

Lösungsmittelsystem für den Entwickler:

1. CHCl₃-MeOH-AcOH

2. CHCl₃-MeOH-AcOH

3. CHCl₃-MeOH-AcOH

95:5:3

85:15:5

85:10:5

W ''* ;■' ""4 '·; l'f /E	4.	CIICI1-MeOH-AcOH	2O	80	26 16 399
·.	5.	CHCIi-ÄtOH-AcOÄt		5:	:25:2
X:	6.	CHCI1-MeOH-AcOH-H	H2O	10	2:5
	7.	Benzol-AcOÄt		2:	: 10:1 :1 (untere Schicht)
Ά	8.	n-BuOH - Pyridin - AcOH -		15	1
Ί ''■'■	9.	Methanol			: 10:3:12
J
Γ			Aminosäureanalyse

Die Probe wird mit 6 N-HCl (unter Zugabe einiger Tropfen Anisol) bei 110⁰C 40-45 Stunden lang hydrolysiert, unter vermindertem Druck getrocknet und dann der Aminosäureanalyse unterworfen.

Beispiel 1
Herstellung von

-(CHi)₅-

¹—CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-

20 Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH,

I g (0,27 mMol)

BOC-LysiClCbzi-Leu-SeKBzD-Gln-GluiOBzD-Leu-His-LysiCICbzJ-Leu-Gln-ThrtBzD-TyriBzD-Pro-Arg (Tos)-Thr(Bzl)-Asp{OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂

wurden in 10 ml TFA bei -5⁰C unter vermindertem Druck gelöst und 1 ml 4 N-HCl/Dioxan zugesetzt. Nach 40minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung im Vakuum eingeengt und mit Äther versetzt, bis sich ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde über Natriumhydroxid getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 5 ml DMF gelöst, und die Lösung wurde durch Zugabe von Triäthylamin rnter Kühlung auf pH 7 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde Wasser zur Bildung eines Niederschlags zugeteben. Der Niederschlag wurde über P₂O₅ getrocknet, wonach die de-BOC-Verbindung als freie Base erhalten wurde. 400 mg

35 I (CH₂J₅

·— CO-SeriBzO-Asn-Leu-SeriBzD-ThrfBzO-HNCHCO-Val-Leu-Gly-OH

wurden in 2 ml DMP gelöst. Die Lösung wurde mit 90 mg HOSU und danach unter Kühlung mit 120 mg DCC versetzt und anschließend über Nacht gerührt. Nach der Reaktion wurde ausgefallener Harnstoff :bgetrennt, und die so erhaltene Lösung wurde mit der oben erhaltenen freien Base de-BOC und mit 5 mg DMF als Lösungsmittel versetzt. Nach drei Tagen wurde der Lösung Wasser zugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtration gesarmielt, gründlich mit Essigester und Äther gewaschen und getrocknet, worauf 1,4 g

-(CH₂J₅-

CO-SeriBzD-Asn-Leu-SeriBzD-ThKBzD-HNCHCO-Val-Leu-Gly-LysiClCbzi-Leu-SertBzD-Gln-GluiOBzO-Leu-His-LysiClCbzi-Leu-Gln-ThKBzD-TyrtBzD-Pro-ArgiTosi-ThriBzD-AspiOBzD-Val-

Gly-Ala-GIy-Thr(Bzl)-Pro-NH₂

als Rohprodukt erhalten wurden. Diese 1,4 g des Rohproduktes wurden mit Fluorwasserstoff und 15 ml eines Phenol-Anisol (1:1](-Gemisches bei 0⁰C 90 Minuten lang behandelt. Nach dem Abziehen des Fluorwasser-Stoffs wurde der Rückstand mit Essigester und Benzol gewaschen, um das Produkt zu verfestigen, und anschließend wurde in 1 M-Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde auf eine Dowex 1 χ 1 (Acetatform)-Säule gegeben und chromatographiert. Das Eluat wurde gefriergetrocknet, und es wurden 870 mg pulverformiges Produkt erhalten.

870 mg dieses Pulvers wurden durch Sephadex® G-50 Gelfiltration, CM-Zellulose-Ionenchromatographie und Sephadex" LH-20 Gelfiltration gereinigt, wonach 200 mg (3450 MRC U/mg) des Produkts erhalten wurden.

I Rf = 0,71 (Träger: Merck-Zellulose; Entwickler: n-BuOH-Pyridin-AcOH-Wasser (15:10:3:12)). ^;. Aminosäureanalyse: Lys 0,91x2, His 0,92, Arg 0,92, Asp 1,02x2, Thr 0,73x4, Ser 1.00x3, GIu 1,00 χ 3, Pro 0,99 χ 2, GIy 0,92 χ 3, Ala 1,11, VaI 0,90 χ 2, Leu 0,78 χ 5, Tyr 0,96, α-Aminoko'rksäure 0,97.

Das Ausgangsmaterial wird wie folgt hergestellt:

26 16

Darstellung der Teilsequenz rter Aminosäuren 10-31:

BOC-LysCCICbzJ-Leu-SeriBzD-Gln-GluCOBzO-Leu-His-LysCClCbzJ-Leu-Gln-ThKBzD-TyUBzD-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Giy-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂.

(1) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH₂

67,7 g BOC-Thr(Bzl)-OH, 33 g H-PrO-NH₂-HCl und 29,6 g HOBT werden zu 220 ml THF hinzugerügt. Dazugibt man 40 ml WSC unter Kühlen bei -5⁰C, rührt eine Stunde bei -5⁰C und sodann über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit 800 ml Essigester versetzt, und anschließend wird zweimal mit 400 ml 1 N-HCl, zweimal mit 300 ml 5%iger Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit Wasser gewaschen. Nach dem Entwässern über wasserfreiem Ma~nesiumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Das ölige Material wird auf eine aus 450 g Silikagel bestehende Säule zwecks Chromatographie aufgebracht. Es wird mit einer Mischung aus Benzol-Äthylacetat (1:1), Äthylacetat und Methanol in dieser Reihenfolge entwickelt, und die Fraktionen werden eluiert und durch Silikagel-Dünnschichtchrnmatographie untersucht. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und in 500 cm³ Äthylacetat gelöst, sodann zweimal mit 300 cnv¹ 5%iger wässeriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit η-Hexan behandelt, wobei BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ in Form eines weißen Pulvers erhalten wiH. (54,5 g, Ausbeute: 61,4%). Rf, = 0,48 [a]² _D ^s = 14,0° (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C₂|Hj|N0.₅):

Gef.: C 62,04 H 8,01 N 9,90%
Ber.: C 62,20 H 7,71 N 10,30%.

(2) Herstellung von BOC-Ala-Gly-OBzl

94,6 g BOC-AIa-OH, 168,8 g H-Gly-OBzl · TosOH und 67,6 g HOBT werden in 450 cm³ THF gelöst, und dazu werden 91,5 cm³ WSC hinzugefügt; nun wird eine Stunde bei 0°C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in 800 cm³ Äthylacetat gelöst. Es werden 500 cm³ 1 n-HCl hinzugefügt, der Niederschlag wird abfiltriert, und die Äthylacetatschicht wird mit 400 cm' 1 n-HCl, zweimal mit einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit η-Hexan behandelt, wobei 152,5 g rohes Material erhalten werden. Es wird zweimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 144 g BOC-Ala-Gly-OBzl erhalten werden. Ausbeute 85,7%. Fp. 87-88,5°C. DSC: 1 Fleck, RF, = 0,59.

(3) Herstellung von BOC-Ala-Gly-OH

101 g BOC-Ala-Gly-OBzl werden in 500 cm' THF gelöst und unter Zugabe von 7 g 5% Palladium/Kohle hydriert. Nach 6 Stunden wird der Katalysator entfernt, es wird eingeengt und in 800 cm³ THF gelöst Nun wird wiederum unter Zugabe von 5% Palladium/Kohle hydriert. Nach 4 Stunden wird der Katalysator entfernt, und es wird im Vakuum eingeengt; der Rückstand wird durch Behandlung mit N-Hexan verfestigt. Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat-THF-n-Hexan erhält man 72 g BOC-Ala-Gly-OH. Ausbeute: 97,4%, Fp. 129-132°C. DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsystem 3). [a]² _D ^s = -8,87° (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C|₀H|₈N₂O₅):

Gef.: C 48,80 H 7,41 N 11,29%
Ber.: C 48,77 H 7,37 N 11,38%.

(4) Herstellung von BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂

10,0 g BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ werden zu 30 cm³ TFA bei -5°C gegeben, es wird 30 Minuten gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther behandelt, filtriert und über Natrium getrocknet, wobei H-Thr(Bzl)-Pro-NH-TFA erhalten wird.

6,08 g des in (3) erhaltenen BOC-Ala-Gly-OH und 3,34 g HOBT werden zu 100 cm³ THF hinzugefügt, wozu 4,5 cm³ WSC bei -5°C (pH 4,0) hinzugefügt werden. Nach einstündigem Rühren bei -5°C und siebenstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird die Mischung auf -5°C gekühlt, 0,8 cm³ WSC werden hinzugefügt, und der pH-Wert wird auf 4,0 eingestellt; nun wird eine Stunde bei -5°C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 400 cm³ Äthylacetat gelöst,

mit gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 100 cm³ 5%iger wässeriger Natriumbicarbonatlösung, mit 100 cm³ i n-HCl, weiches mit NaCi gesättigt ist, und 50 cnr Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und die wässerige Schicht wird mit Chloroform extrahiert, welches zweimal mit Wasser gewaschen und sodann mit der Äthylacetatschicht

vereinigt wird. Die organische Schicht wkd im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird unter Verwendung von 150 g Silikagel Chromatographien. Durch die Säule wird Äthylacetat und Methanol geleitet. Das Methanol-Eluat wird im Vakuum eingeengt Zu dem Rückstand wird η-Hexan hinzugefügt, um das BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ auszukristallisieren. Fp.: 106-116⁰C, 11,5 g. Ausbeute: 82,3%. DSC: 1 Heck, Rf₄ = 0,29, Rf₅ = 0,52.

(5) BOC-Val-Gly-OÄt

219,2 g BOC-VaI-OH-DCHA werden in 1 Liter Äthylacetat eingetragen. Die Lösung wird zweimal mit 600 cm³ 1 n-HCl und 500 cm³ Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingeengt Zu dem Rückstand werden 100 cm³ THF und 400 cm³ Dichlormethan hinzugefügt, und dazu werden 69,8 g H-Gly-OÄt - HCl und 70 cm³ Triäthylamin gegeben. Nun werfen 103,2 g DCC bei -5°C hinzugefügt, und es wird eine Stunde bei -5°C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt Zu dem Reaktionsgemisch werfen 10 cm³ Essigsäure hinzugefügt, es wird eine Stunde gerührt und filtriert Das Filtrat wird zweimal mit 500 cm³ 1 n-HCL, zweimal mit 500 cm³ 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum eingeengt Der Rückstand wird dreimal unter Verwendung von Athylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 105,4 g BOC-Val-Gly-OÄt erhalten werden. Fp.: 95-96°C. Ausbeute: 69,7%.

(6) Herstellung von BOC-VaI-GIy-OH

96,8 g BOC-Val-Gly-OÄt werfen in 150 cm³ Methanol gelöst, und dazu werfen 368 cm³ einer 1 n-NaOH-Lösung bei -5°C hinzugefügt Nach einstündigem Rühren wirf der pH-Wert mit 1 n-HCl auf 8,0 eingestellt. Das Methanol wird durch Einengen im Vakuum entfernt, und die wässerige Schicht wird mit 100 cm Äthyläther gewaschen. Die wässerige Schicht wird durch Zugabe von 1 n-HCl auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt Die wässerige Schicht wird mit 200 cm³ Äthylacetat viermal extrahiert. Der Extrakt wirf über wasserfrei :m Natriumsulfat getrocknet und daraufhin im Vakuum eingeengt Der Rückstand wird mit η-Hexan behandelt und aus Äthylacetat.-n-Hexan umkristallisiert, wobei 85,5 g BOCVaI-GIy-OH erhalten werfen. Ausbeute: 97,4%. Fp.: 112-117°C, (Zers.) DSC: 1 Fleck, Rf₁ = 0,35.

(7) Herstellung von BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂

10,5 g BOC-AIa-GIy-TtIr(BzI)-PrO-NH₂ werfen zu_35 cm³ TFA bei -S⁰C eingetragen. Nach 30 Minuten dauerndem Rühren wirf im Vakuum eingeengt Der Rückstand wird mit Äthyiäther behandelt, das ausgeiaiite Material wirf abfiltriert und im Vakuum über Natriumhydroxid getrocknet, wobei H-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ · TFA erhalten wird. Dazu werfen 100 cm³ THF hinzugefügt, und Triäthylamin wird bei -5⁰C zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,0 einzustellen.

5,49 g BOC-Val-Gly-OH und 2,66 g HOBT werfen eingetragen. Zu dieser Mischung gibt man tropfenweise 3,61 cm³ WSC bei -5°C und rührt eine Stunde bei -5°C und dann über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in 300 cm³ Chloroform gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 200 cm³ 1 n-HCl, welches mit NaCI gesättigt ist, zweimal mit 200 cm³ 5%iger Natriumbicarbonatlösung, welche mit NaCI gesättigt ist, und mit 75 cm³ gesättigter NaCl-Lösung in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Äthyläther erhält man 12,0 g BOC-VaI-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-Pro-NHj. Ausbeute: 88,3%. Fp.: 121-135°C (Zers.). DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsystem 6). [a]% = 10,30° (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C₃₃H₅₁N₇O₉ · V₂ H₂O): Gef: C 56,67 H 7,43 N 13,90%
Ben: C 56,72 H 7,50 N 14,03%.

(8) Herstellung von BOC-ASp(OBzI)-VaI-GIy-AIa-GIy-TtIr(BzI)-PrO-NH₂

100 cm³ TFA werfen zu 33,1g BOC-Val-GIy-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ bei -5⁰C eingetragen, es wird 30 Minuten gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand wird Äthyläther hinzugesetzt, und das ausgefällte Material wird im Vakuum über NaOH getrocknet. 80 cm³ DMF und ferner Triäthylamin zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 werden hinzugefügt. Nach Zugabe von 950 mg HOBT und 30,2 g BOC-Asp(OBzl)-OSU wird der pH-Wert durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7,5 eingestellt, und es wird zwei Tage gerührt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin während des Rührens auf 7,5 eingestellt. Nun werfen neuerlich 2,0 g BOC-Asp(OBzl)-OSU hinzugefügt, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, und es wird über Nacht gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wird eine große Menge Wasser hinzugefügt, und die ausgefällte klebrige Substanz wird abdekantiert und durch Behandlung mit Äthyläther auskristallisiert. Die wässerige Schicht wird mit Chloroform extrahiert, und der Extrakt wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt, wobei eine klebrige Substanz ausfällt. Die ausgefallene klebrige Substanz wird mit Äthyläther behandelt, um sie zu kristallisieren.

Die Feststoffe werden vereinigt und viermal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert und sodann mit heißem Äthylacetat-Äthyläther gewaschen und getrocknet, wobei 34,2 g BOC-AspiOBzO-Val-Gly-Ala-Gly-ThriBzlj-Pro-NH, erhalten werden. Ausbeute: 79,6%. Fp.: 195-199°C. DSC: 1 Heck. Rf₅ = 0,46. [a]f = 18,27° (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C₄₄H₆₂N₆Oi₂ · H₂O):

Gef.: C 58,08 H 6,90 N 12,47%
Ber.: C 57,88 H 7,07 N 12,27%.

(9) BOC-ThriBzD-AspiOBzD-Val-Gly-Aia-Gly-ThriBzD-Pro-NHj

30 cm³ TFA werden zu 7,2 g BOC-ASp(OBzI)-VaI-GIy-AIa-GIy-ThT(BzI)-PrO-NH₂ bei -5°C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt, und

das ausgefallene Material wird im Vakuum über NaOH getrocknet. 15 cm³ DMF werden hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylarnin auf 7,5 eingestellt Nach der Zugabe von 100 mg HOBT und 4,0 g BOC-Thr(Bzl)-OSU wird der pH-Wert mittels N-Methylmorpholin eingestellt, und es wird zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Durch Zugabe von 3 cm³ DMF und N-Methylmorpholin wird der ph-Wert auf 7,5 eingestellt, worauf über Nacht gerührt wird.

Nachdem die Reaktion beendet ist, wird eine große Menge Wasser hinzugefügte, und das ausgefallene Material wird filtriert und dreimal aus Methanol-Äthyläther umkristaiiisiert, wobei 6," g BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-G]y-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ erhalten werden. Ausbeute: 77,1%. Fp.: 172-188°C. DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsysteni 3 und 6). [a]% = -13,65°C (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C₅₅H₇₅N₉Oi₄ · V₂ H₂O):
Gef.: C 60,31 H 6,92 N 11,58%
Ber.: C 60,31 H 7,00 N 11,51%.

(10) Herstellung von AOC-Arg(TOS)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Aila-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂

20 cm³ TFA werden bei -5°C zu 6,52 g BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äthyläther behandelt, und die ausgefallene Substanz wird im Vakuum über NaOH getrocknet. 25 cm³ DMF werden hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin bei —5°C auf 5,0 eingestellt. Es werden 972 mg HOBT und 3,2 g AOC-Arg(Tos)-OH hinzugefügt, worauf 1,3 cm³ WSC tropfenweise unter Kühlung bei -5°C hinzugefügt werden; daraufhin wird eine Stunde bei -5⁰C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt.
Zu dem Reaktionsgemisch wird Äthylacetat hinzugefügt, und der Niederschlag wird mit heißem Methanol

(400 cm³)-Äthyläther (50 cm³) behandeit und daraufhin mit heißem Methanol (300 cm³)-ÄthyIäther (100 cm³) behandelt, wobei 7,0 g AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ erhalten werden. Ausbeute: 82,7%. Fp.: 187-193°C (Zers.). DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsystem 2 und 5) Rf₃ = 0,42.

Elementaranalyse (C₆₉H₉₅N₁₃Oi₇S · H₂O):

Gef.: C 57,97 H 6,88 N 12,76 S 2,26%

Ben: C 58,01 H 6,84 N 12,75 S 2,24%.

Aminosäurezusammensetzung:

NH₃ 1,28, Arg 0,95 (1), Asp 1,04 (1), Thr 1,50 (2), Pro 0,98 (1), GIy 1,84 (2), AIa 1,00 (1), VaI 1,01 (1). 50

(11) Herstellung von BOC-Tyr(Bzl)-Pro-O9zl

37,6 g BOC-Tyr(Bzl) · OH · CHA werden mit 300 cm³ Äthylacetat und 120 cm³ 1 n-HCl gemischt; die Schichten werden getrennt, und die Äthylacetatschicht wird dreimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt, und der ölige Rückstand wird in 80 cm³ Dichloräthan gelöst. Dazu werden 19,3 g H-Pro-OBzl · HCl hinzugefügt. In die Mischung werden 14,6 cm³ WSC bei -5°C eingetragen, worauf eine Stunde bei -5°C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wird.

Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird mit 800 cm³ Äthylacetat und 400 cm' 1 n-HCI ausgeschüttelt. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt. Die organische Schicht wird zweimal mit 300 cm' 1 n-HCl, zweimal mit 300 cm³ Wasser, dreimal mit 300 cm³ 5%iger Natriumbicarbonallösung und zweimal mit 300 cm³ Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die organische Schicht wird über Natriumcarbonat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das rohe Produkt wird durch Säulenchrornato- ^

graphie unter Verwendung von 400 g Silikagel untersucht. Durch die Säule wird eine Choroform-Äthyl- 1|

acetat-(4:1)-Mischung geleitet, und die Eluate werden mittels Dünnschichtchromatographie unter Verwcn- ^i:i

dung des Lösungsmittelsystems 1 untersucht, wobei öliges BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl (43 g), Rf, = 0,88, erhallen wird.

(12) Herstellung von BOC-ThT(BzI)-TyT(BzI)-PrO-OBzI

50 cm³ TFA werden unter Kühlung auf-5°C in 20 g BOC-TyT(BzI)-PrO-OBzI eingetragen, es wird 10 Minuten bei —5°C und 50 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über NaOH über Nacht getrocknet; daraufhin we?den 30 cm³ DMF hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin bei -5°C auf 7,5 eingestellt 470 mg HOBT und 14,2 g BOC-Thr(Bzl)-OSU werden hinzugefügt, und es wird eine Stunde bei -5°C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt Während des Rührens wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von N-Methylmorpholin t M einem pH-Wert von 7 gehalten. Nach zwei Tagen wird 1 cm³ Dimethylaminopiopylamin hinzugefügt, und es wird weitere zwei Stunden gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit 500 cm³ Wasser und 500 cm³ Äthylacetat geschüttelt; worauf die Athylacetatschicht abgetrennt wird. Die wässerige Schicht wird neuerlich mit 200 cm³ Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschichten werden vereinigt, dreimal mit 1 n-HCl, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Entwässern über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt Der Rückstand wird aus Äthyläther-n-Hexan kristallisiert, wobei 19,6 g rohes Material erhalten werden. Dieses rohe Material wird aus dem gleichen Lösungsmittel umkristallisiert, wobei 14,4 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl erhalten werden. Ausbeute: 54,9%. Rf₂ = 0,67.

(13) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH

14,2 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl werden in 30 cm³ THF gelöst, und es werden 23 cm³ 1 n-NaOH-Lösung tropfenweise während 15 Minuten bei -5°C hinzugefügt. Nach vierstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 n-HCl auf 7 eingestellt, worauf im Vakuum zur Entfernung von THF eingeengt wird. Zu der wässerigen Schicht wird Wasser hinzugefügt, und nach dem Waschen mit Äthyläther wird der pH-Wert der wässerigen Schicht durch Zugabe von 1 η-HO auf 2 eingestellt Nun wird zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, worauf im Vakuum eingeengt wird. Der Rückstand wird aus Äthyläther-n-Hexan kristallisiert, wobei 12 g rohes Material erhalten werden. Dieses rohe Material wird in Äthylacetat gelöst, Äthyläther wird hinzugefügt, und die Lösung wird beiseite gestellt, wobei durch allmähliche Zugabe von η-Hexan 10,5 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH auskristallisieren. Ausbeute: 84%. Fp.: 136-138°C. DSC: 1 Fleck. Rf₁ = G,68, Rf₅ = i),63.

Elementaranalyse (C37H45N3O8):

Gef.: C 67,33 H 6,85 N 6,40% Ben: C 67,35 H 6,88 N 6,37%.

(14) Herstellung von
BOC-ThKBzD-TyriBzD-Pro-Arg-Tos-ThriBzD-AspiOBzD-Val-GIy-Ala-Gly-ThrtBzD-Pro-NHj

6,0 g AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ werden zu 20 cm³ TFA bei -5°C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und sodann unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt und im Vakuum über NaOH getrocknet. 20 cm³ DMF werden hinzugefügt, und nach dem Einstellen des pH-Wertes mit Triäthylamin bei -5°C auf 4,5 werden 851 mg HOBT und 4,2 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH hinzugefügt; sodann werden 1,2 ein³ WSC tropfenweise bei -5°C hinzugeben. Das Rühren wird eine Stunde bei -5°C und sodann über Nacht bei Zimmertemperatur fortgesetzt. 300 cm³ Methanol und 100 cm³ Äthyläther werden in das Reaktionsgemisch eingetragen, und das ausgefällte Material wird abfiltriert, welches dreimal aus Methanol-Äthyläther, DMF-Äthyläther und Methanol-Äthyläther in dieser Reihenfolge umkristallisiert wird, wobei 5,8 g BOC-ThKBzlJ-TyKBzU-Pro-ArgCTosi-ThriBzl)-ASp(OBzI)-VaI-GIy-AIa-GIy-ThKBzI)-PrO-NH₂ erhalten werden. Ausbeute: 71,3%. Fp.: 186,5-190⁰C (Zers.). DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsysteme 3 und 6). [a]$ = -15,86° (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C₁O₀Hi₂₈Ni₆O₂₂S ■ V₂ H₂O):

Sef.: C 61,44 H 6,63 N 11,55 S 1,73% Ber.: C 61,68 H 6,68 N 11,51 S 1,65%.

Aminosäureanalyse:

NHj 1,60, Arg 0,92 (1), Asp 1,04 (1), Thr 2,1 (3), Pro 2,08 (2), GIy 1,86 (2), VaI 1,00 (1), Tyr 0,91 (1).

(15) Herstellung von
BOC-GlnThKBzDTyriBzD-Pro-ArgtTosiThKBzD-AspiOBzD-Val-Gly-Ala-Gly^ThriBzD-Pro-NHj

5,4 g BOCThr(Bzl)^Iyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-A]a-GlyThr(Bzl)-Pro-NH₂ werden 21· 20 cm' TFA bei -5°C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der kLckstand wird mit Äthyläther behandelt und über NaOH im Vakuum getrocknet. Es werden 18 cm DMF hinzugelugt, worauf Triäthylamin zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 sowie 100 mg HOBT und 1,54 g

BOC-Gln-ONP zugesetzt werden; sodann wird zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Während des Rührens wird der pH-Wert durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7,5 gehalten. Ferner werden 0,2 g BOCV GIn-ONP zugesetzt, und der pH-Wert wird unter Rühren über Nacht auf 7,0 eingestellt Nach der Reakti^ wird eine große Menge Wasser zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, um das Produkt auszufällen, welches dreimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert wird. Man erhält so 4,8 g BOC-Gln-Thr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂. Ausbeute: 82,9%. Fp.: 178-182°. Rf= 0,67. [a]$ = 15,19° (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (Ck	)5H|	I36Nj8 1	O24I	S-2H2O)	1,47%
Gef.: C 59,92	H	6,56	N	12,05 S	1,53%.
Ben: C 59,98	H	6,71	N	11,99 S

(16) Herstellung von BOC-Lys (ClCbz)-Leu-ÖÄt

7,32 g BOC-Lys(ClCbz)-OH - tert.-Butylamin-salz, welches in Äthylacetat suspendiert ist, werden dreimal mit 100 cm³ 1 n-HCl und 100 cm³ Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird das Äthylacetat abdestilliert. Zu dem Rückstand gibt man 60 cm³ Dichlormethan, 2,93 g H-Leu-OÄt · HCl und 2,0 g HOBT, ferner 2,75 cm³ WSC bei -5°C und rührt eine Stunde. Es wird nun über Nacht bei Zimmertemperatur weiter gerührt. Nach beendeter Umsetzung wird das Dichlormet^an im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in 150 cm³ Äthylacetat gelöst Die Lösung wird mit 1 n-HCl. äVoiger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und anschließendem Einengen im Vakuum wird der Rückstand aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 6,4 g BOC-LyS(ClCbZ)-LeU-OAt erhalten werden. Ausbeute: 76,6%. Fp.: 76-79°C.

(17) Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH

Zu einer Lösung von 6,13 g BOC-Lys(CICbz)-Leu-OÄt in 20 cm³ Äthylacetat werden 12,1 era³1 n-NaOH bei 0°C hinzugefügt, und es wird zwei Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Ferner werden 1,1 cm³ 1 n-NaOH zugesetzt, und nach 1 Stunde dauerndem Rühren wird er pH-Wert auf 7 eingestellt, und es wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther gewaschen, die wässerige Schicht wird auf den pH-Wert von 3 eingestellt, und es wird dreimal mit 100 cm³ Äthylacetat extrahiert. Nach dem Waschen der Äthylacetatschicht mit 100 cm³ Wasser und Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 50 cm³ Äthyläther gelöst, unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet, wobei BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH in Form eines Pulvers erhalten werden. Fp.: >46-60°C. [a]'^ = -10,68° (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C₂₅H₃₈N₃O₇Cl · V₃ H₂O):

Gef.: C 56,25 H 7,35 N 8,00%
Ber.. C 56,21 H 7,31 N 7,87%.

(18) Herstellung von BOC-Leu-His-OH

3,83 g H-His-OH · HCl werden unter Erhitzen in 25 cm³ Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur werden 1,84 g Natriumcarbonat und sodann 270 mg HOBT, 8,53 g BOC-Leu-OSU und 55 cm³ THF hinzugefügt. 10 cm³ Wasser werden zugesetzt, und es wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von wässerigem Natriumbicarbonat auf 7 eingestellt, worauf 1,3 g BOC-Leu-OSU zugesetzt werden und gerührt wird. Nach 6 Stunden werden weitere 1,3 g BOC-Leu-OSU hinzugegebtn, und das Rühren wird über Nacht fortgesetzt Nachdem das Ende der Reaktion durch Prüfung mittels Dünnschichtchromatographie festgestellt worden war, wird das Reaktionsgemisch zur Entfernung von organischem Lösungsmittel im Vakuum eingeengt, und die übrigbleibende wässerige Schicht wird mit Äthylacetat gewaschen. Die wässerige Schicht, wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und auf den Kopf einer mit HP-20 (2,3 χ 18 cm) gefüllten Säule gegossen; nun wird mit Wasser gewaschen, bis das Wascheluat eine negative Ninhydrin-Reaktion aufweist. Sodann wird mit Methanol eluiert. Das Eli-at wird im Vakuum eingeengt, und zu dem Rückstand wird Äthyläther hinzugesetzt Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und zweimal mit Methanol/Äthyläther umgefällt, wobei 3,94 g getrocknetes Pulver erhalten werden. Ausbeute: 53,5%. Fp.: 178-180°C. Mi,⁹ = -0,19 (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (Ci₇H₂₈N₄O₅ · ²/₃ H₂O):

Gef.: C 53,39 H 7,65 N 14,71%
Ber.: C 53,65 H 7,79 N 14,73%.

6: (19) Herstellung von BOC-Leu-Ser(Bzl)-OIi

11,7 g H-Ser(Bzl)-'JH werden in 50 cm³ Wasser gelöst, und 10,1 g Natriumbicarbonat und 10 cm¹ Dioxan werden hinzugefügt. Nun setzt man 16,4g BOC-Leu-OSU in 15 cm³ Dioxan und 5 cm³ DMF hinzu. Nach dem

Rühren über Nacht wird der pH-Wort des Reaktionsgemisches auf 7 eingestellt, und es wird zur Entfernung des organischen Lösungsmittels im Vakuum eingeengt. Die wässerige Schicht wird mit 100 cm³ Äthylacetat geschüttelt, und die organische Schicht wird zweimal mit I n-HCl und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird zweimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 16,Ig BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH erhalten werden. Ausbeute: 78,8%. Fp.: 82-86°C.

(20) Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH

4,1 g(IOm Mol) des BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH werden in 25 cm³ auf -5°C gekühltes JFA eingetragen, es wird 25 Minuten gerührt und daraufhin im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand wird Äthyläther zugesetzt, wobei das Material ausfällt, weiches über NaOH im Vakuum getrocknet wird.

Die Kristalle werden in 8 cm³ DMF gelöst, und es werden 8 g BOC-LyS(ClCbZ)-ONP und 270 mg HOBT zugesetzt, der pH-Wert wird mit N-Methylmorpholin auf 8 eingestellt, worauf über Nacht bei Zimmertemperatür gekühlt wird. Man gibt 1 n-HCl hinzu und löst den Niederschlag in Chloroform, welches dreimal mit I n-HCl, dreimal mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen wird. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird die Chloroformschicht im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird dreimal aus Äthylacetat-n-Hexan umgefällt, ferner dreimal wiederholt aus Äthyläther-n-Hexan umgefällt und sodann durch eine Säule aus 180 g Silikagel geleitet. Diese wird mit Äthylacetat-Benzol (2:1) gewaschen und mit Methanol eluicrt. Das Methanoleluat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 5,25 g BOC-Lys(CICbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH erhalten werden. Ausbeute: 74,5%. Fp. 84-100⁰C (Zers.). DSC: 1 Fleck.

Aminosäurezusammensetzung:

Lys: 0,98 (1), Leu: 1,00 (1), Ser: 0,82 (1).

(21) Herstellung von BOC-LysiClCbzJ-Leu-Gln-ThriBzO-TyrfBzD-Pro-ArgtTosJ-ThKBzD-AspiOBzl)-

Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-Pro-NH₂

7,65 g des BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-"I hr(Bzl)-Pro-Nh₂ werden in 35 cm³ TFA bei -5°C gelöst, 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Diäthyläther behandelt, und das ausgefallene Material wird über NaOH im Vakuum getrocknet. Daraufhin wird es in 25 cm³ DMF gelöst, und 600 mg HOBT, 2,35 g des in (2) erhaltenen BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH sowie 0,69 cm³ WSC bei -5°C werden hinzugesetzt, worauf eine Stunde bei -5°C und daraufhin über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wird. Zu dem Reakiionsgernisch wird 1 n-HCl hinzugesetzt, wobei das Material ausfällt, welches zweimal aus Methanol-Äthyläther umgerällt und getrocknet wird, wobei 8,0 g des Produktes erhalten werden. Ausbeute: 87,3%. Fp.: >164°C (Zers.). [a]'_D ^s = -18,65 (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C,₂₅H,_MN₂,0₂₈SCI · HCl):

Gef.: C 59,63 H 6,67 N 11,78%
Ben: C 59,75 H 6,62 N 11,71%.

(22) Herstellung von BOC-Leu-His-LysiClCbzi-Leu-Gln-ThKBzD-TyrfBzD-Pro-ArgiTosJ-ThriBzl)-ASp(OBzI)-VaI-GIy-AIa-GIy-ITIr(BzI)-PrO-NH₂

7,68 g des BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Vai-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ werden in 40 cm³ TFA bei -5°C gelöst, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 20 cm³ DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von Triethylamin auf 5 eingestellt, worauf 430 mg HOSU, 1,37 g BOC-Leu-His-OH und 58 cm³ WSCO bei -5°C hinzugefügt werden. Sodann wird eine Stunde -5°C gerührt und daraufhin über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wird 1 n-HCl hinzugefügt, und das ausgefallene Material wird aus Methanol-Äthyläther umgefällt und femer aus DMF-Äthyläther wiederholt umgefällt. Beim Trocknen erhält man 8,30 g des Produktes. Ausbeute: 98,2%. Fp.: 167-175°C. [a]'_D ^s = -17,45 (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C₁₃₇H₁₈₂N₂₅O₃₀SCl · HCl · 4 H₂O):

Gef.: C 58,19 H 6,71 N 12,42%

Ber.: C 58,04 H 6,79 N 12,35%.

(23) Herstellung von BOC-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(BzI)-Tyr(Bz])-Pro-AΓg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-GIy-AIa-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂

7,64 g des BOC-Leu-His-LysiCICbz^eu-Gln-ThrCBzO-TyriBzD-Pro-Argaosi-ThKBzO-AspCOBzD-Val-Gly-AIa-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ werden in 35 ml TFA bei -5°C gelöst, es wird 40 Minuten gerührt und sod.vm im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 30 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von

N-Methylmorphoün auf 7 eingestellt, worauf 70 mg HOBT und 1,82 g BOC-GIu(OBzI)-OSU hinzugefügt werden. Der pH-Wert wird erneut mit N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, und es wird 2 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 1 N-HCI, und der gebildete Niederschlag wird zweimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert. Nach dem Trocknen werden 7,55 g des Produktes erhalten Ausbeute: 92,5%. Fp.: 161- 169°C (Zers.). i.

Aminosäurezusammensetzung.·

Lys: 0,94, His: 0,83 (1), Arg: 1,05 (1), Asp: 1,08 (1), Thr: 2,52 (3), GIu: 2,06 (2), Pro: 2,16 (2), GIy: 2,00 (2), AIa: 1,06 (1), VaI: 1,10 (I), Leu: 1,82 (2), Tyr: 0,73 (1).

(24) Herstellung von BOC-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Giy-Thr(Bzl)-Pro-NH₂

7,29 g des BOC-Glu(OBzl)-Leu-H!s-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp-(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ werden in 30 ml TFA bei -5⁰C gelöst, es wird 45 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, worauf 100 mg HOBT und 1,4 g BOC-GIn-ONP hinzugefügt werden. Nun wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reakiiuusgeiüisch gibt man 1 N-HCi, sanimcit den Niederschlag und wäscht ihn mit Wasser. Es wird dreimal wiederholt umgefällt, wobei 7,0 g des getrockneten Produktes erhalten werden. Ausbeute: 91,5%. Fp.: 171-175⁰C (Zers.).

(25) Herstellung von BOC-LysiClCbzJ-Leu-SeriBzD-Gln-Glu-iOBzD-Leu-His-LysiClCbzJ-Leu-Gln-ThrCBzD-TyKBzD-Pro-ArgiTosJ-ThKBzD-AspiOBzD-Val-Gly-Ala-Gly-ThriBzD-Pro-NHj

6,70 g des BOC-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(CICbz)-Le^l-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-ThΓ(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ werden in 30 ml TFA bei -5°C gelöst, 2,2 ml 4N-HCl/Dioxan werden hinzugefügt, und es wird 45 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und Äthyläther wird hinzugefügt, wobei das Material ausfallt, welches gründlich mit /kthyläther gewaschen und über NaOH im Vakuum getrocknet wird.

Die so erhaltene Substanz wird in 15 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 5,5 bis 6 eingestellt, worauf 360 mg HOBT, 1,86 g BOC-LyS(ClCbZ)-LeU-SeKBzI)-OH und 540 mg DCC, gelöst in 5 ml DMF, hinzugefügt werden. Sodann wird eine Stunde gerührt und anschließend über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. 1 N-HCl wird hinzugefügt, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert. Der in Äthanol unlösliche Teil des Niederschlages und das ausgefallene Material, welches durch Zugabe von Äthyläther zürn Fütrat erhalten wurde, werden vereinigt. Man fügt Methanol-Diäthyläther hinzu und kristallisiert den Niederschlag wiederholt aus Methanol-Äthyläther um, wobei 7,0 g des Produktes erhalten werden. Ausbeute: 87,6%. Fp.: 171-177°C (Zers.). [a]'J = -18,45 (c = 1, DMF).

Elementaranalyse (C₁₈₄H₂₄₂N₃₂O₄ISCl₂ · HCl · V₂ H₂O): Gef.: C 58,43 H 6,65 N 11,83 Cl 2,64 S 0,94% Ber.: C 58,21 H 6,74 N 11,81 Cl 2,80 S 0,84%.

₄₅ Aminosäurezusammensetzung:

Lys: 1,86 (2), His: 0,74 (1), Arg: 0,97 (1), Asp: 1,04 (1), Thr: 2,55 (3), Ser: 0,53 (3), GIu: 2,85 (3), Pro: 2,08 (2), GIy: 2,00 (2), AIa: 1,04 (1), VaI: 1,04 (1), Leu: 2,67 (3), Tyr: 0,67 (1).

Die Sequenz der Aminosäuren Nr. 1-9:

-CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO-Val-Leu-Gly-OH
wird wie folgt hergestellt:

(26) Herstellung von

(CH₂)sCOOH

60 I

BOC-Thr(Bzl)-HN-CH-COOCH₃

56 g

(CH₂)SCOOH

CbZ-HNCH-COOCH₃
(Öl) wurden in 300 ml Methanol und 150 ml Wasser gelöst. Zu der Lösung wurde Aktivkohle gegeben, und

14

|i nach einstündigem Rühren wurde Palladium-Kohle zugefügt und 10 Stunden lang hydriert. Nachdem vom

I? Katalysator abgetrennt war, wurde im Vakuum auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Hierzu wurden 200 ml

F IDioxan, 21 ml Triäthylamin unter Kühlen und 80 g BOC-Thr(BzI)-OSU zugegeben. Nach 3tägigem Rühren

f; bei Raumtemperatur wurde N,N-Dimethylamino-l,3-propandiamin zugesetzt, 3 Stunden lang gerührt, an-

|ί schließend auf ein Volumen von 100 ml eingeengt und mit Essigester extrahiert. Die Essigesterschicht wurde

Ii mit 1 N-HCl und Wasser gewaschen und im Vakuum abgezogen. Das so erhaltene ölige Produkt wurde in

j/, Äther gelöst und in eine 5%ige Natriumbicarbonatlösung eingetragen. Nach sorgfältigem Waschen der wäßri-

f' gen Schicht mit \ther wurde erneut mit Essigester extrahiert, anschließend mit Wasser, 1 N-HCl und Wasser

>;i in dieser Reihenfofge gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und der Essigester wurde abge-

f·;' zogen, wonach 57 g eines öligen Produktes erhalten wurden.

{.; (27) Herstellung von

Pj (CH₂)sCOOH

BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCOOCH₃· CHA

50e
i! (CHz)₅COOH

BOC-Thr(Bzl)-HNCHCOOCH₃

wurden in 150 ml TFA zunächst unter Kühlen, nach 30 Minuten bei Raumtemperatur, gelöst. TFA wurde unter H vermindertem Druck abgezogen, der ölige Rückstand über NaOH im Vakuum eine Nacht lang getrocknet.

Das ölige Material wurde in 100 ml DMF gelöst und der pH-Wert auf 6 durch Zugabe von 40 ml Triäthylamin unter Kühlen eingestellt. 5 g HOBT und 50 g BOC-Ser(Bzl)-OSU wurden zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 6 durch Zugabe von N-Methylmorpholin eingestellt und 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde N,N-Dimethylamino-l,3-propandiamin zugegeben und eine Stunde lang gerührt, dann wurde Wasser zugegeben und schließlich mit Essigester extrahiert. Der Extrakt wurde mit 1 N-HCl, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Jatriumsulfat getrocknet. Der Essigester wurde abgezogen und der Rückstand in 300 ml Äther gelöst und dann er-JjI neut mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit HCl angesäuert, mit

\ Essigester extrahiert, die Essigesterschicht mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und

1 anschließend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem der Essigesterschicht eine gleiche Menge Cyclohexylamin zugegeben worden war, wurde das Gemisch unter vermindertem Druck destilliert, wobei ein öliges Produkt erhalten wurde, das durch Zugabe von Äther und η-Hexan verfestigt wurde. Ausbeute: 41 g. Fp.: 70-73⁰C. [a}% = +4,9° (c = 2,7, DMF).

f; (28) Herstellung von BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-NHNH₂

U 15 g (27,2 mMol) BOC-SeriBzD-Asn-Leu-OÄt wurden in 100 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wur-

p den 50 ml 80Vo-H₂N-NH₂ · H₂O zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen-

si gelassen. Um den ausfallenden Niederschlag zu vervollständigen, wurde Äther hinzugefügt, der Niederschlag

|j anschließend mit Äther gewaschen und aus Methanol-Essigester-Äther umkristallisiert, wonach 13,5 g des

■\i Produktes erhalten wurden. Ausbeute: 92,5%. Fp.: 207-209°C (Zers.). [a]f = -17,4° (c = 0,77, DMF).

I

I] (29) Herstellung von

1 (CH^COOH

BO C-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(B zl)-HN C H C O O H

10,0 g

(C H₂J₅C O OH

BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCH-COOCH₃ - CHA

wurden mit 1 N-HCl in Essigester zur Herstellung der freien Säure behandelt, anschließend wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. 30 ml TFA wurden dem öligen Rückstand unter Kühlen zugesetzt. Nach 30minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde TFA unter vermindertem Druck acgezogen. Der Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet.

8,5 g BOC-Ser(Bzi)-Asn-Leu-NHNH₂ wurden in 30 ml DMF geiöst und zu 14 mi Dioxan, das 1 N-HCl und 3,1 ml Isoamylnitrit enthielt, zugefügt, worauf man das Gemisch 20 Minuten lang zur Bildung des Azids reagieren ließ.

Das vorstehend beschriebt-ne getrocknete TFA-Saiz wurde in 10 ml DMF gelöst, mit Triäthylamin neutralisiert und anschließend langsam einer Lösung unterhalb von -40⁰C zugefügt, die die Azid-Verbindung enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7 durch Zusatz von Triäthylamin eingestellt, und das Gemisch wurde 3 Tage lang bei 5⁰C umgesetzt.

Das Reaktionsgemisch wurde bei -5°C langsam in 300 ml 0,5 N-HCl eingetragen. Der abfiltrierte Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und mit 500 ml Chloroform extrahiert. Nach dem Waschen der Chloroformschicht mit 1 N-HCl und wäßriger NaCI-Lösung wurde das Chloroform unter vermindertem Druck abgezogen und der Rückstand durch Zusatz von Chloroform-n-Hexan ausgefällt. Ausbeute: 11,8 g (84,3%). Fp.: 183-185°C (Zers.). [a]$ = -5,5° (c = 0,72, DMF).

Aminosäurenanalyse:

Asp 1,00 (1), Thr 0,82 (1), Ser 1,62 (2), Leu 0,91 (1), a-Aminokorksäure 1,05 (1).

(30) Herstellung von

(CH₂)s

SeriBzD-Asp.-Leu-Se^BzO-ThriBzD-HNCHCONHNHj

3,2 g (i mMol)

(CH₂)SCOOH

BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(BzI)-Thr(Bzl)-HNCHCOCH₃

wurden in 30 ml trockenem Pyridin gelöst, zu 5 g TFA-ONP zugefügt und 3 Stunden bei 45⁰C gerührt. Das Rea^w.:onsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und anschließend mit Äther versetzt. Der Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und getrocknet, wonach 2,9 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten wurden. 20 ml TFA wurden diesem Pulvc unter Kühlen zugesetzt, anschließend wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt und schließlich die TFA entfernt. Der Rückstand wurde in 20 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde bei 45°C in 2,5 1 trockenes Pyridin unter Rühren innerhalb von 30 Minuten eingetropft. Bei 50⁰C wurde noch 7 Stunden und bei Raumtemperatur über Nacht weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt, in 2 1 Chloroform gelöst und mit gesättigter wäßriger Kochsalzlösung, 1 N-HCl und fünfmal mit wäßriger Kochsalzlösung in dieser Reihenfolge gewaschen, und schließlich wurde die Chloroformschicht bis auf ein Volumen von 10 ml im Vakuum eingeengt. Anschließend wurden 500 ml η-Hexan zugesetzt und der Niederschlag abfiltriert. Ausbeute: 2,0 g (72%). Fp.: 165°C (Zers.).

3.9 g dieser Verbindung wurden in 10 ml DMF und 50 ml Methanol gelöst, und die Lösung wurde 30 ml 80%-H₂N -NH₂- H₂O zugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde Wasser zugesetzt und der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen, mit 100 ml Methanol versetzt und unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, der Niederschlag abfiltriert, worauf 1,4 g des Produkts erhalten wurden, [ar]!,⁰ = -8,6° (r = 0,8, DMF).

Aminosäurenanalyse:

Asp 1,10 (1), Thr 1,00 (1), Ser 1,64 (2), Leu 1,00 (1), a-Aminokorksäure 1,08 (1).

(31) Herstellung von BOC-Leu-Gly-OBzl

Eine Lösung aus 34 g WSC in 50 ml Methylenchlorid wurde unter Rühren bei -5°C während einer Stunde in eine Suspension aus 46,2 g BOC-Leu-OH, 1 g HOBT und 74 g H-Gly-OBzl · TosOH in 100 ml DMF und 200 ml Methylenchlorid eingetropft. Nach einer Stunde wurde die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt, um das Methylenchlorid zu entfernen. Die DMF-Schicht wurde mit Wasser versetzt und mit 11 Essigester und anschließend nochmals mit 500 ml desselben Lösungsmittels extrahiert. Die Essigesterschicht wurde mit 1 N-HCl, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, worauf 82 g öliges BOC-Leu-Gly-OBzl erhalten wurden. Rf = 0,68.

(32) Hersteilung von BOC-Val-Leu-Gly-OBzl

70 ml TFA wurden bei -5°C 76 g BOC-Leu-Gly-OBzl zugesetzt, anschließend wurde 30 Minuten lang gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet. Hierzu wurden 200 ml DMF gegeben und der pH-Wert auf 6,5 durch Zugabe von etwa 50 ml Triäthylamin bei -5°C eingestellt. Hierzu wurden 19 g BOC-VaI-OSU und 2 g HOBT zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf pH 6 eingestellt und 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt Während des Rührens wurde der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 6 gehalten. Schließlich wurde eine große Menge Wasser zugegeben und mit Essigester extrahiert, der Extrakt mit 1 ml N,N-Dimethylamino-l,3-propandiamin versetzt und das Gemisch 30 Minuten lang gerührt. Der Extrakt wurde

mit Wasser, 1N-HCL 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Der Essigester wurde abgezogen und das Produkt aus n-Hexan umkristallisiert. Es wurden 90 g BOC-Val-Leu-Gly-OBzl erhalten. Ausbeute: 94%. Fp.: 119-12PC.

Elementaranalyse (Ct₅H₃₉NjO₆):

Gef.: C 62,73 H 8,34 N 8,85%
Ben: C 62,86 H 8,25 N 8,80%.

(33) Herstellung von

-CO-SeriB^Asn-Leu-SeriBzD-ThriBzli-HNCH-CO-Val-Leu-Gly-OH

1,36 g (1/2 mMol)

-(CH₂Js-

CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCONHNH₂

wurden in 5 ml DMF suspendiert. Diese Suspension wurde mit 2 ml Dioxan, das 4 N-HCl enthielt, bei -5°C versetzt und bei 10⁰C vollständig gelöst Bei -5 bis - 10⁰C wurden 0,3 ml Isoamylnitrit zugegeben, und es wurde 20 Minuten gerührt. Nach der Reaktion wurden bei —50⁰C 1,2 g H-Val-Leu-GIy-OH zugegeben, der pH-Wert durch Zugabe von Triäthylamin auf 7 eingestellt und anschließend 2 Tage lang im Eisbad gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Kühlen langsam in 200 ml 0,5 N-HCI eingetragen. Der Niederschlag wurde mit 0,5N-HCl und Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 1,5 g des Produktes erhalten. Fp.: 24f°C (Zers.). Ausbeute: 84,3%. [a]% = -18,4° (c = 0,7, DMF).

30 Beispiel 2

Herstellung von 1

I 35

CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gki-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHj

500 mg (0,130 mMol) BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzi)-Gln-GIu(OBzl)-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-Gln-Thr(BzI)-TyriBzD-Pro-ArgCrosJ-ThriBzD-Asn-ThriBzO-Gly-SeKBzD-Gly-ThriBzD-Pro-NHj wurden in 5 ml TFA und 0,5 ml 4 N-HCI/Dioxan bei -5°C gelöst Nach 40minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung im Vakuum eingeengt und durch Zusatz von Äther wurde ein Niederschlag ausgefällt. Der Niederschlag wurde über NaOH getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 3 ml DMF gelöst, und 2,3 ml (entsprechrnd 100 μΜοΙ) dieser Lösung wurden auf ein Volumen von 1 ml eingeengt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Triäthylamin unter Kühlen auf 7 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 23 mg HOSU, 90 mg (90 mMol)

■(CHA-

CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-OH

und 41 mg DCC gegeben, und das Gemisch wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurden zum Ausfallen des Produktes 150 ml 1 M-AcOH zugegeben, und der so gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 520 mg des Produktes. Diese 520 mg des pulveriSrmigen Produktes wurden mit 50 ml Fluorwasserstoff und 2 ml Phenol/Anisol (1:1) bei 0⁰C 90 Minuten lang behandelt. Nach dem Abziehen des Fluorwasserstoffs wurde der Rückstand in 1 M-AcOH gelöst. Die Lösung wurde auf eine Dowex 1 χ 2 (Acetatform)-Säule gegeben, das Eluat wurde gefriergetrocknet, wobei 341 mg eines Pulvers erhalten wurden. 341 mg dieses Pulvers wurden in 0,01 M wäßriger Ammoniumacetatlösung gelöst, und die Lösung wurde auf eine CM-Zellulose (2,3 χ 50 cm)-SäuIe gegeben, mit 0,01 M wäßriger Ammoniumacetatlösung (pH 4,5, 700 ml) gewaschen und mit 0,01 bis 0,1 M-Ammoniumacetatlösung (pH 4,5) bei linearen Elutionsgradienten eluiert. Es wurden jeweils Fraktionen von 10 g gesammelt; die aktiven Fraktionen (Fraktionen Nr. 80-111) wurden gesammelt und zu einem akiiven Pulver gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in 0,1 M-AcOH gelöst und über eine Sephadex® G-50 (2,2 χ 105 cm)-Säule chromatographiert, wobei mit 0,1 M-AcOH mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/h eluiert wurde. Das Eluat (5 g) wurde fraktioniert, die aktiven Fraktionen (Nr. 55-63) wurden gesammelt und zu 22 mg eines aktiven Pulvers lyophilisiert.

17

22 mg des aktiven Pulvers wurden in 0,01 M wäßriger Ammoniumacetatlösung gelöst und über eine CM-Zellulose (2,3 χ 25 cm)-Säule Chromatographien und mit 600 ml 0,01 M- bis 600 ml 0,1 M-Ammoniumacelatlösung (pH 4,5) mit einem Gradienten eluiert. Es wurden Fraktionen von jeweils 8 g gesammelt, und die aktiven Fraktionen Nr. 109 -119 wurden gefriergetrockneL Das so erhaltene Pulver wurde in einer geringen Menge 5 0,1 M-Essigsäure gelöst und die Lösung über eine Sephadex* LH-20 (2,3 χ 135 cm)-Säule chromatographiert, wobei mit 0,1 M-Essigsäure eluiert wurde; Fraktionen von jeweils 6 g des Eluats wurden gesammelt, die aktiven Fraktionen Nr. 31—34 wurden zu einem aktiven Pulver gefriergetrocknet Rf = 0,61 (Merck Zellulose; n-BuOH : Pyridin: AcOH: Wasser (15:10:3:12)).

I₀ Aktivität:

3025 MRC Einheiten/mg.

Aminosäurenanalyse:

Lys 1,82 (2), His 0,97 (1), Arg 0,98 (1), Asp 1,96 (2), Thr4,35 (5), Ser2,88 (4), GIu 3,00 (3), Pro 2,16 (2), 15 GIy 2,85 (3), VaI 1,12 (1), Leu 4,20 (5), Tyr 1,01 (1), ff-Aminokorksäure 0,99 (1).

Claims (4)

1. Patentansprüche:
   1. Desamino-l.T-dicarbacalcitonine der allgemeinen Formel I

   CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-

   Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-A2ä-A₂₆-Gly-A₂8-Gly-Thr-Pro-NH₂ (I)

   in der bedeuten:

   a) A15 Asp, A₂₆ VaI und A₂₈ AIa oder

   b) A₂S Asn, A₂₆ Thr und A₂₈ Ser,

   sowie deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze und übliche Komplexe mit langer anhaltender Wirksamkeit.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Desamino-lJ-dicarbacalcitonine der Formell nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise Kondensationsreaktionen mit Aminosäuren oder Peptiden aus zwei oder mehr Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I und mit der Peptideinheit, die jeweils das Bruchstück II

   (CH₂)SCOOR
   H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO- (II)

   enthält, worin R einen reaktiven Esterrest bedeutet, bei irgendeiner Reaktionsstufe Ringschlußreaktionen durchfuhrt sowie gegebenenfalls die erhaltene Verbindung in ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz oder einen Komplex überführt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man mit der Peptideinheit, die jeweils das Bruchstück II enthält, während der Bildung der Peptideinheit, die die a-Aminokorksäureeinheiten enthält, eine Ringschlußreaktion durchrührt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Peptideinheit, die jeweils das Bruchstück II enthält, während der Bildung der Peptideinheit, die die a-Aminokorksäureeinhcilen enlhält, einer Ringschlußreaktion unterwirft und daß man mindestens eine Amino- oder Carboxygruppe der Verbindung der Formel 1 durch eine Schutzgruppe schützt und die Schutzgruppe anschließend wiQiJer abspaltet.