DE19937846A1

DE19937846A1 - h BOCT: Gen, cDNA, Expression, Aminosäuresequenz

Info

Publication number: DE19937846A1
Application number: DE1999137846
Authority: DE
Inventors: Michael Brues; Heinz Boenisch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-08-13
Filing date: 1999-08-13
Publication date: 2001-02-15

Description

1. Mit Hilfe der Aminosäuresequenz eines organischen Cationentransporters wurde durch Homologiesuche in einer Datenbank ein potentielles Gen für einen neuen, noch nicht bekannten, Transporter auf dem humanen Chromosom 14 identifiziert. Aus der Gensequenz wurden flankierende sense und antisense Oligonukleotide zur Amplifikation des potentiellen Transportergens und dessen abgeleiteter cDNA (mRNA) Sequenz hergestellt und für die PCR- Amplilikation des kompletten Gens und der cDNA eingesetzt. Mittels dieser Primer konnte das Gen aus humaner genomischer DNA kloniert und sequenziert werden. Weiterhin konnte mit diesen Primer die cDNA für die volle kodierende Region des Gens aus einer humanen Gehirn cDNA Bank hergestellt werden. Sequenzierung des Gens und der cDNA ergaben folgende Eigenschaften: das Gen (5700 Basenpaare) enthält sieben Exons und sechs Introns. Der kodierende Bereich des Gens (Pos. 1766-1828; 2430-2595; 2795-2940; 3105-3210; 3370-3587; 3889-4000; 4165-4453) besteht aus einem offenen Leseraster von 1098 Basen und kodiert somit ein Protein von 366 Aminosäuren. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt, daß es sich um ein integrales Membranprotein mit sechs transmembranalen Domänen handelt. Die Aminosäuresequenz ist neu und bisher unbekannt und weist die beste Homologie zu einem hirnspezifischen Transporter der Maus auf. Weiterhin gehören zu der zu patentierenden Sequenz 1765 Basen des 5' nichttranslatierten Bereichs des Gens, welche vermutlich den Promotor (mit typischer TATA Box und CAP Signal) enthalten, sowie 11247 Basen des 3' nichttranslatierten Bereichs des Gens, welche ein typisches Polyadenylierungssignal (AATAAA) in Position 4757 bis 4762 enthalten.

Wir haben diesem Transporter und seinem Gen den Namen hBOCT gegeben.

2. Die Expression dieses Gens im menschlichen Gehirn wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Primern, welche die kodierende Region des Gens flankieren, nachgewiesen. Wir konnten so die volle kodierende cDNA (offenes Leseraster) dieses Rezeptors aus einer humanen Hirn-cDNA Bank vervielfältigen. Hiermit ist die Expression der mRNA dieses Rezeptors in diesem zentralnervösen Gewebe eindeutig bewiesen. Weiterhin wurde durch Datenbanksuche mit der Gensequenz eine Vielzahl von fast 100% homologen ESTs (expressed sequence tags) in folgenden humanen Geweben identifiziert: Gehirn, Knochenmark, Hoden, embryonales Herz, postmitotische hNT Neurone, Parathyroid Tumor, Gessler Wilms Tumor, Uterus (endometriales Adenokarzinom).

Zeichen: MBHB-REZEPT-6

3. Die von der cDNA Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Transporters ist 366 Aminosäuren lang. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt eine putative Sekundärstruktur des Proteins als integrales Membransprotein mit 6 transmembranalen Domänen. In der Aminosäuresequenz des Transportproteins befindet sich eine potentielle cAMP/cGMP-abhängige Proteinkinase Phosphorylierungsstelle (Aminosäure Positionen 343), deren fakultative Phosphorylierung (sofern sie intrazellulär lokalisiert ist) an der Modulation der Transporterfunktion beteiligt sein könnte. In den Positionen 29, 85, 269 und 324 der Aminosäuresequenz befindet sich eine potentielle Protein Kinase C Phosphorylierungsstelle und in den Positionen 179 und 351 der Aminosäuresequen sind potentielle Casein Kinase II Phosphorylierungsstellen. Eine Amidierungsstelle ist in Position 208.

4. Einordnung und potentielle Funktionen des zu patentierenden Transporters und seines Gens (bzw˙ cDNA; mRNA):
Der hier neu entdeckte humane organische Kationen-Transporter weist hohe Homologie zur großen Familie der organischen Kationen-Transporter auf. Da auch eine Homologie zu Anionen-Transportern besteht, ist der Transport von Anionen nicht ausgeschlossen. Bekannte organische Kationen-Transporter transportieren verschiedene Substrate wie z. B. die Neurotransmitter Noradrenalin, Dopamin und Serotonin, neurotoxische Substanzen wie 1- Methyl-4-Phenyl-Pyrimidinium (MPP⁺, eine Parkinson-induzierende Substanz), Tetraethylammonium, Nicotinamid etc. Das optimale physiologische Substrat dieser Transporter ist bisher nicht gesichert.

Der hier neu beschriebene humane Transporter (hBOCT) wurde von uns bereits in ersten Versuchen funktionell untersucht: er transportiert Noradrenalin und Dopamin und ist zumindest partiell hemmbar durch Desipramin und GBR12909. Es ist jedoch durchaus möglich, daß der Transporter andere Substrate (denkbar wäre z. B. Histamin) mit viel höherer Effizienz transportieren kann, und daß andere Chemikalien/Medikamente bessere Hemmstoffe mit höherer Affinität darstellen.

MBHB-Rezept-6: hBOCT-Gensequenz

MBHB-Rezept-6: hBOCT-cDNA-Sequenz

MBHB-Rezept-6: hBOCT-Aminosäuresequenz

Claims

1. Das dargestellte Gen inclusive des 5' und 3' nichttranslatierten Bereichs sowie die Exon- Intron Organisation und die chromosomale Lokalisation auf Chromosom 14 des Menschen.

2. Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerasen und Pharmaka sowie Chemikalien, die die Expression des Gens in positiver oder negativer Weise beeinflussen.

3. Die von dem Gen transkribierte messenger RNA inclusive davon abgeleitete Spleißvarianten und Isoformen.

4. Die von der mRNA oder von dem Gen abgeleitete cDNA.

5. Das von der mRNA (oder dem Gen oder der cDNA) abgeleitete oder hergestellte Protein.

6. Antikörper oder Antiseren, welche gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

7. Monoklonale Antikörper oder Antiseren, die gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

8. Expressionssysteme (eukaryotische Zellinien, Hefezellen, Xenopus Oocyten, Baculovirussysteme, bakterielle Expressionssysteme), welche das genannte Protein exprimieren (nativ oder recombinant).

9. Ligand-Bindungsstudien und Screening-Assays an nativen oder recombinanten Rezeptoren oder Zellen oder Zellmembranen, welche diesen Rezeptor enthalten.

10. Transgene Tiere und knock-out Tiere, welche diesen Rezeptor in veränderter Dichte oder gar nicht exprimieren.

11. Methoden der Gentherapie, welche sich auf diesen Transporter bzw. sein Gen oder seine mRNA (cDNA) erstrecken und deren Entwicklung und Anwendung.

12. Sense- und Antisense-Oligonukleotide, welche von diesem Gen abgeleitet wurden sowie deren Anwendung.

13. Die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit diesem Transporter oder seinem Gen oder seiner mRNA/cDNA in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen.

14. Methoden zur Diagnose von Erkrankungen, die mit diesem Transporter (oder dessen Gen, mRNA) in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen wie z. B. Hybridisierungstechniken, Sequenzierung, SSCP, RFLP, Northern Blot, Southern Blot, Western Blot, Expressions Arrays, Antikörper, Mutationsanalysen.

15. Die Benutzung der Informationen zur Entwicklung neuer Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien und die Evaluierung vorhandener Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien sowie zur Entwicklung neuer Technologien oder Evaluierung vorhandener Technologien.

16. Das Patent soll sich auch erstrecken auf die Punkte 1. bis 15. für modifizierte Proteine, und Gen, cDNA und mRNA Sequenzen (Aminosäureaustausche, Basenaustausche).

17. Das dargestellte Expressionsmuster in verschiedenen humanen Geweben und Tumorgeweben.