DE19928417A1 - RLPALR1: Gen,eDNA, Experession und Aminosäuresequenz - Google Patents

Description

Mit Hilfe der Aminosäuresequenz eines G Protein gekoppelten Rezeptors wurde durch Homologiesuche in einer öffentlich zugänglichen Datenbank ein potentielles Gen für einen neuen G Protein gekoppelten Rezeptor auf dem humanen Chromosom 6 identifiziert. Aus der Gensequenz wurden Oligonukleotide zur Amplifikation des potentiellen Rezeptorgens und dessen abgeleiteter cDNA (mRNA) Sequenz hergestellt und für die PCR-Amplifikation des Gens und der cDNA eingesetzt. Mittels dieser Primer konnte das intronlose Gen aus humaner genomischer DNA kloniert und sequenziert werden. Weiterhin konnte mit diesen Primer die cDNA für die volle kodierende Region des Gens aus einer humanen Amygdala sowie aus einer humanen Hippocampus cDNA Bank hergestellt werden. Sequenzierung des Gens und der cDNAs ergaben folgende Eigenschaften des Gens: das Gen (3438 Basenpaare) enthält (wie viele Gene von G Protein gekoppelten Rezeptoren) keine Introns. Der kodierende Bereich des Gens (Pos. 717 bis 1973) besteht aus einem offenem Leseraster von 1257 Basen und kodiert somit ein Protein von 419 Aminosäuren. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt, daß es sich um einen G Protein gekoppelten Rezeptor mit sieben transmembranalen Domänen handelt. Die Aminosäuresequenz ist neu und bisher unbekannt und weist die beste Homologie (55% Identität; 73% Homologie) zu einem Xenopus Laevis "growth factor like lipid mediator lysophosphatidic acid receptor" (Rezeptor für den wachstumsfaktorartigen Lipidmediator Lysophosphatidsäure (LPAR)). Die zweithöchste Homologie (52% Identität; 71% Homologie) besteht zu einem neuen humanen "Orphan- Rezeptor" (GPR45), der im peripheren und zentralen Nervensystem exprimiert wird, aber dessen Gen auf einem anderen Chromosom (Chr. 2q11.1-q12) lokalisiert ist. Weiterhin gehören zu der zu patentierenden Sequenz 716 Basen des 5' nichttranslatierten Bereichs des Gens, welche vermutlich den Promotor (mit typischer TATA Box und CAP Signal) enthalten, sowie 1465 Basen des 3' nichttranslatierten Bereichs des Gens welche ein typisches Polyadenylierungssignal in Position 3190 bis 3195 enthalten.

Die Expression dieses Gens wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Primern (sense: 5' CCATCCTACTGAAACCATGG 3'; antisense: 5' GTCAGCCAGTTCCAATATTC 3) welche die kodierende Region des Gens flankieren nachgewiesen. Dazu wurde folgendes Temperaturprogramm für die PCR verwendet: 94°C 1 min, 50°C 1 min, 72°C 3 min, 35 Zyklen. Wir konnten so die volle kodierende cDNA (offenes Leseraster) dieses Rezeptors aus einer humanen Amygdala- sowie einer humanen Hippocampus cDNA Bank vervielfältigen. Hiermit ist die Expression der mRNA dieses Rezeptors in diesen zentralnervösen Geweben eindeutig bewiesen. PCR mit genomischer DNA und diesen Primern ergab eine Band von identischer Größe und durch Sequenzierung wurde eindeutig bewiesen, daß das Gen intronlos ist. Weiterhin konnte durch Homologiesuche in Datenbanken von exprimierten Sequenzstücken humaner Gene (EST = expressed sequence tags) eine exprimierte Sequenz von 460 Basenpaaren mit 100%iger Identität zu einem Sequenzstück des nichttranslatierten 3' Bereichs (Pos. 2719 bis 3179) des Gens identifiziert werden. Dieser EST (AI 199 539) entstammt einem humanen anaplastischen Oligodendrogliom. Hiermit ist weiterhin bewiesen, daß dieser Sequenzbereich (2719-3179) auf der mRNA des Rezeptors enthalten ist. Das Ende dieses ESTs befindet sich 11 Basen vor dem von uns identifizierten Polyadenylierungssignal in Pos. 3190-3195.

Die von der cDNA Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Rezeptors ist 419 Aminosäuren lang. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt eine putative Sekundärstruktur des Proteins als integrales Membranprotein mit 6 bis 8 transmembranalen Domänen (je nachdem welche Software angewendet wird). Das Protein enthält drei potentielle N-Glykosylierungstellen im N-terminalen Bereich (Aminosäure Positionen 16, 28 und 62). Weiterhin sind in der Aminosäuresequenz vier potentielle Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen (Aminosäure Positionen 144, 268, 389 und 400) enthalten, deren fakultative Phosphorylierung (sofern sie intrazellulär lokalisiert sind) an der Modulation der Rezeptorfunktion beteiligt sein können. In Position 278 der Aminosäuresequenz befindet sich eine potentielle Caseinkinase II Phosphorylierungsstelle. Potentielle N-Myristoylierungstellen befinden sich in Aminosäurepositionen 13, 264 und 282.

Einordnung und potentielle Funktionen des zu patentierenden Rezeptors und seines Gens (bzw cDNA; mRNA)

Der Rezeptor gehört höchstwahrscheinlich zur großen Genfamile der G-Protein-gekoppleten Rezeptoren (GPCRs). Innerhalb dieser Großfamile zählt er zur Sub-Famile der "Klasse A Rhodopsin-ähnlichen" Rezeptoren. Er besitzt hohe Homologie zu Rezeptoren für Lysophosphatidsäure (LPA), weshalb wir diesem humanen Rezeptor die Kurzbezeichnung "hLPALR1" (engl.: human lysophosphatidic acid like receptor 1) verleihen.

Expression des hLPALR1 in humanen Geweben

Mittels PCR und geeigneter cDNA-Banken konnten wir nachweisen, daß der "hLPALR1" in humanem Hippocampus und Amygdala exprimiert wird. Zusätzlich wird er in humanen Oligodendroglioma exprimiert (Sequenzbereiche finden sich in EST AI 199 539). Das Vorkommen in Zentralnervensystem und ZNS-Tumoren spricht für eine vermutlich wichtige Rolle des "hLPALR1" bei der Regulation von Wachstum und Differenzierung neuronaler und/oder glialer Zellen. Da LPA auch an der Aktivierung von Thrombozyten und Endothelzellen (wo LPA eine vermehrte Synthese von Endothelin auslösen kann) beteiligt ist, kommt dem "hLPALR1" möglicherweise auch eine Rolle bei der Pathogenese der Atherosklerose zu. Der "hLPALR1" ist möglicherweise auch an der Pathogenese bestimmter Nierenerkrankungen beteiligt (LPA-vermittelte Wirkungen an Mesangialzellen).

Möglicherweise werden über den "hLPALR1" auch neuroprotektive Effekte von LPA vermittelt.

"hLPALR1" könnte auch eine Rolle bei der Signaltransduktion immunkompetenter Zellen spielen (LPA ist ein Wachstumsfaktor für humane B-Lymphozyten und bindet an neutrophile Zellen und T-Zellen). Lysophosphatidsäure Rezeptoren und vermutlich auch der hLPALR1 sind auch an der Neurotransmitter-Freisetzung beteiligt. Bisher bekannte Lysophosphatidsäure Wirkungen (welche über LPA-Rezeptoren vermittelt werden) lassen sich wie folgt zusammenfassen: Beteiligung an Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen; Wundheilung; Geweberegeneration; Wachstumsstimulation; Unterdrückung von Apoptose (programmierter Zelltod); Kontraktion; Sekretion; Adhäsion; Chemotaxis; Cerebrale Mikrozirkulation; Reifung menschlicher Eizellen und somit der Fruchtbarkeit.

Claims (16)

1. Dieses Patent soll sich erstrecken auf folgende Daten, Techniken und Anwendungen und Entwicklungen:
das dargestellte Gen inclusive des 5' und 3' nichttranslatierten Bereichs.

2. Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerasen und Pharmaka sowie Chemikalien die die Expresssion des Gens in positiver oder negativer Weise beeinflussen.

3. Die von dem Gen transkribierte messenger RNA inclusive davon abgeleitete Spleißvarianten und Isoformen.

4. Die von der mRNA oder von dem intronlosen Gen abgeleitete cDNA.

5. Das von der mRNA (oder dem Gen oder der cDNA) abgeleitete oder hergestellte Protein.

6. Antikörper oder Antiseren welche gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

7. Monoklonale Antikörper oder Antiseren die gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

8. Expressionssysteme (eukaryotische Zellinien, Hefezellen, Xenopus Oocyten, Baculovirussysteme, bakterielle Expressionssysteme) welche das genannte Protein exprimieren (nativ oder recombinant).

9. Ligand Bindungsstudien und Screening assays an nativen oder recombinanten Rezeptoren oder Zellen oder Zellmembranen welche diesen Rezeptor enthalten.

10. Transgene Tiere und knock out Tiere welche diesen Rezeptor in veränderter Dichte oder gar nicht exprimieren.

11. Methoden der Gentherapie welche sich auf diesen Rezeptor bzw. sein Gen oder seine mRNA (cDNA) erstrecken und deren Entwicklung und Anwendung.

12. Sense und Antisense Oligonukleotide welche von diesem Gen abgeleitet wurden sowie deren Anwendung.

13. Die Diagnose und Behandlung von Krankheiten die mit diesem Rezeptor in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen.

14. Methoden zur Diagnose von Erkrankungen die mit diesem Rezeptor (oder dessen Gen, mRNA) in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen wie z. B. Hybridisierungstechniken, Sequenzierung, SSCP, RFLP, Northern Blot, Southern Blot, Western Blot, Expressions Arrays, Antikörper, Mutationsanalysen.

15. Die Benutzung der Informationen zur Entwicklung neuer Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien und die Evaluierung vorhandener Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien sowie zur Entwicklung neuer Technologien oder Evaluierung vorhandener Technologien.

16. Das Patent soll sich auch erstrecken auf die Punkte 1. bis 15. für modifizierte Proteine, und Gen, cDNA und mRNA Sequenzen (Aminosäureaustausche, Basenaustausche).