DE60038531T2

DE60038531T2 - Transporter organischer anionen der plazenta und dessen gen

Info

Publication number: DE60038531T2
Application number: DE60038531T
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Sagamihara-shi ENDOU; Takashi Tachikawa-shi SEKINE; Seok Mitaka-shi CHA
Original assignee: J Pharma Co Ltd
Current assignee: J Pharma Co Ltd
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 2000-06-15
Publication date: 2009-07-16
Anticipated expiration: 2020-06-16
Also published as: US7393939B2; JP4435334B2; EP1108784B1; WO2001002562A1; CA2340795A1; US20030096947A1; CA2340795C; US6673898B1; JP2001017174A; DE60038531D1; EP1108784A1; EP1108784A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das an einem Transport eines organischen Anions (organischen negativ geladenen Ions) beteiligt ist, und ein Polypeptid, für welches das Gen codiert. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung einen Organisches-Anion-Transporter OAT4 von einem Plazenta-Typ, ein Gen, das dafür codiert, eine Sonde für den Nachweis des Gens und einen Antikörper, der in der Lage ist, das Protein zu erkennen.
Hintergrund der Erfindung
Niere und Leber spielen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel und bei der Ausscheidung von Xenobiotika und Pharmazeutika. Die Harnröhrenzellen der Niere sind Epithelzellen, die eine Polarität aufweisen, und treten mit dem Blut über eine basolaterale Membran in Kontakt, um eine Übertragung von verschiedenen Substanzen auszuführen. Es ist aus den physiologischen Studien bis heute vorhergesagt worden, dass ein Teil des organischen Ions in die Niere durch einen Transport-Träger (Transporter) über eine basolaterale Membran inkorporiert wird, und auch, dass ein organisches Anion, das durch den Stoffwechsel in den Zellen erzeugt wird, durch den Transporter ausgeschieden wird.
Da ein organisches Anion Pharmazeutika und Umweltgifte oder viele der Metaboliten davon beinhaltet, war ein Organisches-Anion-Transportsystem weithin als ein Xenobiotika-Ausscheidungssystem oder ebenso ein Pharmazeutika-Transportsystem bekannt.
Eine Inkorporierung eines organischen Anions durch Harnröhrenzellen ist durch ein experimentelles System unter Verwendung eines Perfusions-Verfahrens eines isolierten Organs, eines Vesikelsystems einer isolierten Zellmembran etc. untersucht worden. Jedoch ist es der herkömmlichen Mittel zufolge schwierig, das Organisches-Anion- Transportsystem über die basolaterale Membran bis ins Einzelne zu analysieren, und es gab einen Bedarf, dass der Transporter per se isoliert und analysiert wird.
Ein Organisches-Anion-Transport erfolgt auch in anderen Geweben als der Niere und der Leber. Die Plazenta ist ein Gewebe, wo der Materialaustausch zwischen dem Fötus und dem Körper der Mutter aktiv durchgeführt wird und die Substanzen, die für den lebenden Organismus notwendig sind, was Saccharide und Aminosäuren einschließt, in effizienter Weise zum Fötus aus dem Körper der Mutter über einen Transporter transportiert werden.
Auf der anderen Seite spielt die Plazenta auch eine Rolle als eine Gewebeschranke für den Fötus gegen die äußere Umwelt. Die Plazenta weist eine bestimmte Art von Beschränkung gegen einen freien Transfer der durch den Körper der Mutter eingenommenen Xenobiotika zum Fötus auf, und von einem Teil einer solchen Funktion nimmt man an, dass er durch eine Entfernung der Xenobiotika aus dem Kreislauf eines Fötus durch einen Xenobiotikum-Ausscheidungs-Transporter stattfindet.
Darüber hinaus finden auch verschiedene Stoffwechselreaktionen selbst im Körper des Fötus statt, und als eine Folge wird ein organisches Anion erzeugt. Aufgrund einer anatomischen Besonderheit des Fötus wird der größte Teil der Ausscheidung von solchen Metaboliten über die Plazenta durchgeführt. Es ist vernünftig, zu dem Schluss zu kommen, dass ein Organisches-Anion-Transporter in der Plazenta vorhanden ist und eine solche Rolle spielt.
Als solches nimmt man an, dass der Transport von Xenobiotika (insbesondere der Transport eines organischen Anions) in der Plazenta eine wichtige Rolle für das Wachstum und die genetische Toxizität eines Fötus spielt. Jedoch waren die Einzelheiten der Übertragung darin anders als bei der Niere und der Leber unbekannt.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben einen Organisches-Anion-Transporter OAT1 (J. Biol. Chem., Band 272, Seiten 18526–18529, 1997), OAT2 (FEBS Letter, 429, Seiten 179–182, 1998) und OAT 3 (J. Biol. Chem., Band 274, Seiten 13675–13680, 1999), welche eine zentrale Rolle in Niere, Leber, Gehirn etc. spielen, isoliert und darüber berichtet. Patentanmeldungen für sie sind bereits ebenfalls eingereicht worden. OAT1, OAT2 und OAT3 sind die Transporter, die in der Lage sind, zahlreiche organische Anionen mit unterschiedlichen chemischen Strukturen zu transportieren, und sie führen den Transport von verschiedenen anionischen Pharmazeutika ebenfalls durch.
Eine Isolierung und Identifizierung von OAT1, OAT2 und OAT3 zeigt, dass die Organisches-Anion-Transporter eine Familie bilden. Die Mitglieder dieser Familie waren dafür bekannt, dass sie nicht nur in Organen wie der Niere und der Leber exprimiert werden, die eine zentrale Rolle in der externen Ausscheidung von Xenobiotika spielen, sondern auch im Gehirn, das eine Gewebeschranke bildet.
Aus diesen Tatsachen heraus haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung die Anwesenheit eines Organisches-Anion-Transporters in der Plazenta als eine funktionale Einheit der Gewebeschranke und als einen Weg für die Ausscheidung von Metaboliten des Fötus vorhergesagt und haben einen neuen Organisches-Anion-Transporter isoliert, der in der Plazenta vorhanden ist.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Organisches-Anion-Transporter-Gen, das an einem Organisches-Anion-Transport in der Plazenta beteiligt ist, und auch einen Organisches-Anion-Transporter, der ein Polypeptid ist, für das das Gen codiert, zu identifizieren und zur Verfügung zu stellen. Andere Ziele sind aus den folgenden Beschreibungen ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt eine organisches-Anion-inkorporierende Aktivität, wenn OAT4 der vorliegenden Erfindung in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert wird.
Die 2 zeigt das Ergebnis eines dynamischen Tests des Transports von Estronsulfat und Dehydroepiandrosteronsulfat unter Verwendung der Oozyten, in denen der OAT4 der vorliegenden Erfindung exprimiert wird.
Die 3 zeigt die Auswirkung durch die Gegenwart von verschiedenen Kationen beim Transport von Estronsulfat, unter Verwendung der Oozyten, in denen der OAT4 der vorliegenden Erfindung exprimiert wird.
Die 4 zeigt das Ergebnis des Tests der Transport-Hemmung von verschiedenen organischen Substanzen bei einem Organisches-Anion-Transport von OAT4 der vorliegenden Erfindung.
Die 5 zeigt das Ergebnis des Tests der Transport-Hemmung von OAT4 durch verschiedene Sulfat-Konjugate und Glucuronsäure-Konjugate.
Die 6 ist ein fotografisches Bild, das das Ergebnis der Northern-Blotting-Analyse des OAT4-Gens der vorliegenden Erfindung zeigt.
Beschreibung von Ausführungsformen
Wie bereits erwähnt, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung drei Organisches-Anion-Transporter – OAT1, OAT2 und OAT3 isoliert. Sie weisen eine Homologie in einer Aminosäuresequenz in einem Grad von etwa 40% zueinander auf. Auf der Grundlage solcher Sequenzen wurde eine EST-Datenbank (Datenbank exprimierter Sequenz-Tags (expressed sequence tag database)) abgefragt, und eine neue cDNA, die eine Homologie zu OAT1, 2 und 3 aufwies, wurde identifiziert. Unter Verwendung dieses cDNA-Fragments wurde ein neuer Klon (OAT4), von welchem bisher nicht berichtet worden ist, aus einer cDNA-Bibliothek einer menschlichen Niere identifiziert und als ein Plazenta-Typ bestätigt.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung einen Organisches-Anion-Transporter OAT4 von einem Plazenta-Typ. Insbesondere betrifft sie einen Organisches-Anion-Transporter, der eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 der Sequenzauflistung oder eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 55 Aminosäurerest(e) der SEQ ID Nr.: 2 substituiert oder deletiert ist/sind, umfasst.
Der Organisches-Anion-Transporter OAT4 eines Plazenta-Typs gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Organisches-Anion-Transporter OAT4 eines Plazenta-Typs sein, welcher eine Fähigkeit aufweist, ein organisches Anion, wie Estronsulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und/oder Ochratoxin A zu inkorporieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure oder vorzugsweise eine DNA, die eine Basensequenz aufweist, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 der Sequenzauflistung besitzt oder das eine Aminosäuresequenz besitzt, wo ein Teil der Aminosäuren deletiert sein kann und (eine) andere Aminosäure(n) damit substituiert oder daran angefügt sein kann/können, oder eine Basensequenz aufweist, die damit unter einer stringenten Bedingung hybridisieren kann. Sie betrifft auch das Gen, das für den oben erwähnten Anion-Transporter OAT4 von einem Plazenta-Typ der vorliegenden Erfindung codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäure oder vorzugsweise eine DNA, die eine Basensequenz aufweist, die mindestens 14 zusammenhängende Basen oder vorzugsweise mindestens 20 zusammenhängende Basen der DNA umfasst, welche die durch die SEQ ID Nr.: 1 der Sequenzauflistung gezeigte Basensequenz oder eine komplementäre Kette davon aufweist. Die Nukleinsäure, wie die DNA, ist als eine Sonde für den Nachweis, die Identifizierung oder die quantitative Bestimmung des Gens nützlich, das für den oben genannten Organisches-Anion-Transporter OAT4 eines Plazenta-Typs der vorliegenden Erfindung codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus einen Antikörper, der in der Lage ist, den oben erwähnten Organisches-Anion-Transporter OAT4 eines Plazenta-Typs der vorliegenden Erfindung zu erkennen.
Der Organisches-Anion-Transporter OAT4 der vorliegenden Erfindung ist ein Transporter, der eine Substratselektivität von einem weiten Bereich mit einem Vermögen aufweist, ein organisches Anion mit einer unterschiedlichen chemischen Struktur zu transportieren (inkorporieren). Der Organisches-Anion-Transporter OAT4 eines Plazenta-Typs der vorliegenden Erfindung besitzt ein Vermögen, ein organisches Anion, wie Estronsulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und/oder Ochratoxin A zu inkorporieren
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine EST-Datenbank, die der Öffentlichkeit offengelegt worden ist, auf der Grundlage einer Basensequenzinformation für OAT1, OAT2 und OAT3 abgefragt, welche bereits durch die Erfinder der vorliegenden Anmeldung isoliert waren, woraufhin sie ein neues cDNA-Fragment H12876 erhalten haben, das eine Homologie zu OAT1, OAT2 und OAT3 aufwies. Unter Verwendung einer Sonde, in der dieses H12876 mit ³²P markiert war, screenten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung eine cDNA-Bibliothek von humaner Niere, die bereits errichtet war.
Als ein Ergebnis wurde eine neue cDNA (hOAT4-cDNA) erhalten, welche eine organisches-Anion-transportierende Aktivität besaß. Die Bestimmung der Basensequenz der resultierenden cDNA (OAT4-cDNA) wurde durch einen automatischen Sequenzierer (hergestellt von Applied Biosystems) unter Verwendung eines spezifischen Primers durchgeführt, und es wurde herausgefunden, dass sie eine Basensequenz besitzt, die in der SEQ ID Nr.: 1 der Sequenzauflistung gezeigt ist.
Um zu bestätigen, dass der resultierende OAT4 eine Organisches-Anion-Transport-Aktivität besitzt, wurde cRNA (eine RNA, die zu der cDNA komplementär ist) aus einem Plasmid, welches diese cDNA enthält, gemäß eines Verfahrens von Sekine et al. (Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., Band 272, Seiten 18526–18529, 1997) präpariert, und in Oozyten von Xenopus laevis injiziert, und die Oozyten wurden einem Inkorporierungsexperiment für verschiedene organische Anionen und organische Kationen unterzogen, welche mit Radioisotopen markiert waren.
Das Ergebnis ist in der 1 gezeigt. Wie in der 1 gezeigt, wurde herausgefunden, dass die Oozyten, die den OAT4 exprimierten, ³H-Estronsulfat, ³H-Dehydroepiandrosteronsulfat und ³H-Ochratoxin A inkorporierten. Im Gegensatz dazu wurde für ¹⁴C-TEA (Tetraethylammonium), welches ein typisches organisches Kation ist, keine Inkorporierung beobachtet.
Danach wurden die oben erwähnten Oozyten, in welche OAT4-cRNA injiziert war, dazu verwendet, die Änderungen in der Menge an Estronsulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und Ochratoxin A, die durch den OAT4 der vorliegenden Erfindung bei verschiedenen Konzentrationen inkorporiert wurden, zu untersuchen, wobei ein dynamischer Michaelis-Menten-Test für einen Organisches-Anion-Transport durchgeführt wurde.
Das Ergebnis ist in der 2 gezeigt. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass der OAT4 der vorliegenden Erfindung die inkorporierte Menge des organischen Anions in Abhängigkeit von der Konzentration erhöhte. Es wurde herausgefunden, dass die Km-Werte von Estronsulfat und Dehydroepiandrosteronsulfat 1,01 ± 0,15 μM bzw. 0,63 ± 0,04 μM betrugen.
Es wurde die Abhängigkeit des OAT4 der vorliegenden Erfindung von Natrium bei einem Organisches-Anion-Transport untersucht. Eine Inkorporierung von Estronsulfat durch OAT4 wurde in Anwesenheit von verschiedenen extrazellulären Kationen getestet. Das Ergebnis ist in der 3 gezeigt. Wie in der 3 gezeigt, wurde eine Inkorporierungs-Aktivität von Estronsulfat über den OAT4 bemerkt, wenn Natrium-Ion, Cholin-Ion und Lithium-Ion als ein extrazelluläres Ion vorhanden sind, und selbst wenn das extrazelluläre Natrium durch Lithium und Cholin ersetzt wird, gab es keine Veränderung im Transport von Estronsulfat über den OAT4, woraufhin abgeklärt wurde, dass der OAT4 ein Organisches-Anion-Transporter ist, der unabhängig vom extrazellulären Natrium war.
Ferner, um die Substrat-Selektivität von OAT4 der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurden verschiedene ionische Substanzen zu einem experimentellen System der Inkorporierung von ³H-Estronsulfat hinzugefügt und der Einfluss dadurch wurde getestet (Inhibierungs-Experiment).
Das Ergebnis ist in der 4 gezeigt. Als ein Ergebnis inhibierten verschiedene anionische Substanzen (wie Probenecid, Penicillin G, Indomethacin, Ibuprofen, Diclo fenac, Furosemid, Bumetanid, Bromsulfophthalein, Cholsäure und Taurocholsäure) in signifikanter Weise den Transport von ³H-Estronsulfat durch OAT4, aber kationische Substanzen, wie Tetraethylammonium und anorganische Sulfate zeigten keine inhibierende Wirkung. Aus dem oben genannten Ergebnis wurde verdeutlicht, dass der OAT4 ein multi-selektiver Organisches-Anion-Transporter war.
Da der OAT4 der vorliegenden Erfindung eine Inkorporierungs-Aktivität für Konjugate der beiden Sulfate, d. h. Estronsulfat und Dehydroepiandrosteronsulfat, zeigte, wurde ein inhibierendes Experiment durchgeführt, um zu prüfen, ob verschiedene Sulfat-Konjugate und Glucuronat-Konjugate eine Wechselwirkung mit OAT4 zeigten. Das Ergebnis ist in der 5 gezeigt. Als ein Ergebnis zeigten alle Sulfat-Konjugate mit Ausnahme von Minoxidil-Sulfat eine Wechselwirkung mit OAT4. Im Gegensatz dazu zeigten Glucuronat-Konjugate nur eine schwache Wechselwirkung mit OAT4, mit Ausnahme von α-Naphthyl-β-Glucuronid.
Anschließend wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, um zu untersuchen, an welcher Stelle von menschlichem Gewebe das OATA4 des Vorliegenden exprimiert wird.
Das Ergebnis des Northern-Blottings ist in der 6 gezeigt. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass eine starke Bande nur in der Niere und der Plazenta bei dem OAT4 der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wurde, und folglich, dass der OAT4 der vorliegenden Erfindung ein Plazenta-Typ war.
Folglich ist der OAT4 der vorliegenden Erfindung ein Organisches-Anion-Transporter von einem humanen Plazenta-Typ, und, in der vorliegenden Erfindung, wird jener als ein Organisches-Anion-Transporter OAT4 von einem Plazenta-Typ bezeichnet.
In Bezug auf das Protein der vorliegenden Erfindung können zusätzlich zu jenem, das eine Aminosäuresequenz besitzt, welche durch die SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, jene beispielhaft angegeben werden, bei denen eine oder mehrere Aminosäure(n) in der durch die SEQ ID Nr.: 2 gezeigten Aminosäuresequenz deletiert oder substituiert ist/sind. Eine Deletion oder Substitution von (einer) Aminosäure(n) kann innerhalb eines solchen Umfangs liegen, dass eine Organisches-Anion-Transport-Aktivität nicht verloren geht und die Zahl(en) von 1 bis 55 Aminosäure(n) beträgt/betragen. Solch eine Aminosäure weist in Bezug auf eine Aminosäuresequenz zu der durch die SEQ ID Nr.: 2 gezeigten Aminosäuresequenz eine Homologie in einem Grad von normalerweise 75% oder vorzugsweise von 90% auf.
In der vorliegenden Erfindung wird eine Hybridisierung unter einer stringenten Bedingung normalerweise in solch einer Art und Weise ausgeführt, dass die Hybridisierung in einer Hybridisierungslösung von 5 × SSC oder einer dazu ähnlichen Salzkonzentration bei der Temperaturbedingung von 37–42°C während etwa 12 Stunden durchgeführt wird, ein vorbereitendes Waschen mit einer Lösung von 5 × SSC oder einer dazu ähnlichen Salzkonzentration durchgeführt wird und anschließend ein Waschen mit einer Lösung von 1 × SSC oder einer dazu ähnlichen Salzkonzentration durchgeführt wird. Um eine höhere Stringenz zu erreichen, kann es ausgeführt werden, indem ein Waschen in einer Lösung von 0,1 × SSC oder einer dazu ähnlichen Salzkonzentration durchgeführt wird.
Eine Nukleinsäure, die einer Hybridisierung bei einer stringenten Bedingung in der vorliegenden Erfindung unterzogen werden kann, schließt jene ein, die einer Hybridisierung unter den oben genannten Bedingungen unterzogen werden kann.
Es ist auch möglich, dass der Organisches-Anion-Transporter und das Gen davon gemäß der vorliegenden Erfindung mit Hilfe eines Screenings isoliert und erhalten wird, bei dem Gewebe oder Zellen von einem geeigneten Säuger zusätzlich zum Menschen als eine Genquelle verwendet werden. In Hinblick auf den Säuger können nicht menschliche Tiere, wie Hunde, Rinder, Pferde, Ziegen, Schafe, Affen, Schweine, Kaninchen, Ratten und Mäuse verwendet werden. Das Screening und die Isolierung des Gens kann vorteilhafterweise mit Hilfe eines Homologie-Screenings, eines PCR-Screenings etc. durchgeführt werden.
Was die resultierende cDNA betrifft, wird ihre Basensequenz durch ein herkömmliches Verfahren bestimmt, und eine translatierte Region wird analysiert, wobei das dafür codierte Protein oder die Aminosäuresequenz von OAT4 bestimmt werden kann.
Die Tatsache, dass die resultierende cDNA eine cDNA eines Organisches-Anion-Transporters ist, oder in anderen Worten, das Genprodukt, das durch die cDNA codiert wird, ein Organisches-Anion-Transporter ist, kann zum Beispiel wie folgt überprüft werden. Somit wird cRNA, die aus der resultierenden OAT4-cDNA präpariert wurde, in Oozyten für eine Exprimierung eingeführt, und ein Vermögen, das organische Anion in Zellen zu transportieren (inkorporieren), kann durch das Messen der Expression des Substrats in die Zellen mit Hilfe eines herkömmlichen Expressions-Experiments (Sekine, et al., J. Biol. Chem., Band 272, Seiten 18526–18529, 1997) unter Verwendung eines geeigneten Anions als ein Substrat bestätigt werden.
Es ist auch möglich, dass das Expressions-Experiment, welches genauso ist, wie in den oben erwähnten exprimierten Zellen, angewendet wird, um die Transportcharakteristik und die Substratspezifität von OAT4 zu untersuchen.
Wenn eine geeignete cDNA-Bibliothek oder genomische DNA-Bibliothek, die aus einer unterschiedlichen genetischen Quelle erzeugt wurde, unter Verwendung der OAT4-cDNA gescreent wird, ist es möglich, ein homologes Gen, ein chromosomales Gen etc. zu isolieren, die von verschiedenen Geweben und verschiedenen lebenden Körpern abgeleitet sind.
Es ist ferner möglich, das Gen aus einer cDNA-Bibliothek durch ein herkömmliches PCR-Verfahren unter Verwendung eines synthetischen Primers zu isolieren, der auf der Grundlage der Information der offenbarten Basensequenz (oder eines Teils von ihr), welche in der Basensequenz (SEQ ID Nr.: 1) gezeigt ist, des Gens der vorliegenden Erfindung entworfen wurde.
Die DNA-Bibliothek, wie eine cDNA-Bibliothek und eine genomische DNA-Bibliothek kann durch ein Verfahren erzeugt werden, das zum Beispiel in Molecular Cloning von Sambrook, J., Fritsh, E. F. und Maniatis, T., veröffentlicht durch Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, genannt ist. Wenn eine Bibliothek im Handel erhältlich ist, kann jene ebenso gut verwendet werden.
Der Organisches-Anion-Transporter (OAT4) der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel mit Hilfe einer Gen-Rekombinations-Technik unter Verwendung von cDNA, die für den Organisches-Anion-Transporter codiert, hergestellt werden. Zum Beispiel wird DNA (cDNA oder dergleichen), die den Organisches-Anion-Transporter codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor inkorporiert, und die resultierende rekombinante DNA kann in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden. Beispiele für das Expressionssystem (Wirt-Vektor-System) für die Herstellung eines Polypeptids sind Expressionssysteme von Bakterien, Hefe, Insektenzellen und Säugerzellen. Um ein funktionales Protein unter ihnen zu erhalten, ist es wünschenswert, Insektenzellen und Säugerzellen zu verwenden.
Zum Beispiel, um ein Polypeptid in einem Säuger zu exprimieren, wird DNA, die für einen Organisches-Anion-Transporter codiert, in eine stromabwärts zu einem geeigneten Promotor (wie einem SV40-Promotor, LTR-Promotor und Elongation-1α-Prornotor) gelegene (Stelle) in einem geeigneten Expressionsvektor (wie einem Vektor eines Retrovirus, einem Papilloma-Virus, einem Vaccinia-Virusvektor und einem Vektor eines SV40-Typs) insertiert, woraufhin ein Expressionsvektor konstruiert wird. Anschließend werden geeignete tierische Zellen unter Verwendung des resultierenden Expressionsvektors einer Transformation unterzogen, und der Transformant wird in einem geeigneten Medium inkubiert, um ein gewünschtes Polypeptid zu erhalten. Beispiele für die Säugerzellen, die als ein Wirt verwendet werden, sind Zellstämme, die COS-7-Zellen von Affen, CHO-Zellen vom chinesischen Hamster, humane Hela-Zellen, Primärkulturen-Zellen, die von Nierengeweben abgeleitet sind, LLC-PK1-Zellen, die von der Niere eines Schweins abgeleitet sind, OK-Zellen, die von einer Opossum-Niere abgeleitet sind, etc. einschließen.
Im Hinblick auf die cDNA, die für einen Organisches-Anion-Transporter OAT4 codiert, kann zum Beispiel die cDNA verwendet werden, welche eine Basensequenz besitzt, die in der SEQ ID Nr.: 1 gezeigt ist, und darüber hinaus ist es nicht auf die oben erwähnte cDNA beschränkt, sondern DNA, die zu der Aminosäuresequenz korrespondierend ist, wird entworfen, und die für das Polypeptid codierende DNA kann verwendet werden. In diesem Fall war/waren 1–6 Art(en) eines Codons für die Codierung jeder Aminosäure bekannt, und, obwohl ein beliebiges Codon für die Anwendung ausgewählt werden kann, kann eine Sequenz entworfen werden, die eine höhere Expression aufweist, wenn zum Beispiel eine häufige Nutzung eines Codons durch den Wirt, welcher bei der Expression zur Anwendung kommt, in Betracht gezogen wird. Wie im Fall der chemischen Synthese von DNA und einer Fragmentierung der oben genannten cDNA kann die DNA, welche eine entworfene Basensequenz besitzt, zum Beispiel mit Hilfe einer partiellen Modifizierung der Basensequenz hergestellt werden. Eine künstliche partielle Modifizierung einer Basensequenz und die Einführung einer Variation darin kann durch eine ortsgerichtete Mutagenese (Mark, D. F., et al: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 18, Seiten 5662–5666, 1984) etc. unter Verwendung eines Primers durchgeführt werden, der ein synthetisches Oligonukleotid umfasst, das für die gewünschte Modifikation codiert.
Das Nukleotid (Oligonukleotid oder Polynukleotid), das an das Gen des Organisches-Anion-Transporters der vorliegenden Erfindung unter einer stringenten Bedingung hybridisiert, kann als eine Sonde für einen Nachweis für das Organisches-Anion-Transporter-Gen verwendet werden, und darüber hinaus kann es als Antisense-Oligonukleotid, Ribozym, Decoy (Lockmittel) etc. für eine Modulierung der Expression des Organisches-Anion-Transporters eingesetzt werden. Im Hinblick auf ein solches Nukleotid, kann zum Beispiel ein Nukleotid verwendet werden, das eine Teilsequenz von normalerweise nicht weniger als 14 zusammenhängenden Basen in der Basensequenz, die in der SEQ ID Nr.: 1 gezeigt ist, oder einer komplementären Sequenz davon enthält, und um spezifischer zu hybridisieren kann eine längere Sequenz, wie nicht weniger als 20 Basen oder nicht weniger als 30 Basen als eine Teilsequenz verwendet werden.
Es ist auch möglich, dass der Organisches-Anion-Transporter der vorliegenden Erfindung oder ein Polypeptid, das die immunologische Homologie dazu besitzt, dazu verwendet wird, um einen Antikörper dazu zu erhalten, und der Antikörper in der Lage ist, für den Nachweis, die Reinigung etc. des Organisches-Anion-Transporters eingesetzt zu werden. Der Antikörper kann hergestellt werden, indem der Organisches-Anion-Transporter der vorliegenden Erfindung oder ein Fragments davon oder ein synthetisches Peptid, das eine Teilsequenz davon besitzt, als ein Antigen verwendet werden. Ein polyklonaler Antikörper kann durch ein herkömmliches Verfahren hergestellt werden, bei dem ein Antigen in ein Wirtstier (wie eine Ratte oder ein Kaninchen) eingeimpft wird und Immunserum erhalten wird, während ein monoklonaler Antikörper durch eine herkömmliche Art, wie ein Hybridoma-Verfahren, hergestellt werden kann.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird jetzt durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht werden, obgleich jene Beispiele die vorliegende Erfindung nicht einschränken.
In den folgenden Beispielen wird jede Arbeitsweise, wenn nicht anders aufgeführt, durch ein Verfahren durchgeführt, das in Molecular Cloning von Sambrook, J., Fritsh, E. F. und Maniatis, T., veröffentlicht durch Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, erwähnt ist, oder gemäß der Anleitung für die Verwendung des im Handel erhältlichen Produktes, wenn ein im Handel erhältlicher Kit verwendet wird.
Beispiel 1. Isolierung der cDNA vom multispezifischen Organisches-Anion-Transporter 4 (OAT4) und Analyse davon.
Eine offengelegte EST-Datenbank wurde auf der Grundlage einer Basensequenzinformation von OAT1, OAT2 und OAT3 untersucht, die bereits durch die Erfinder der vorliegenden Anmeldung isoliert waren. Als ein Ergebnis wurde ein neues cDNA-Fragment 12876 erhalten, das eine Homologie mit OAT1, OAT2 und OAT3 aufwies.
Eine cDNA-Bibliothek von menschlicher Niere, welche bereits aufgebaut war, wurde unter Verwendung einer Sonde gescreent, in der das resultierende H12876 mit ³²P markiert war. Es wurde eine Hybridisierung eine Nacht und einen Tag lang in einer Lösung für die Hybridisierung bei 37°C durchgeführt, und danach wurde die Filtermembran mit einem 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 37°C gewaschen. Hinsichtlich der Hybridisierungslösung wurde ein Puffer von einem pH-Wert 6,5 verwendet, der 50% Formamid, 5 × Standard-Kochsalz-Citrat (SSC), 3 × Denhardts Lösung, 0,2% SDS, 10% Dextransulfat, 0,2 mg/ml modifizierte Lachssperma-DNA, 2,5 mM Natrium-Pyrophosphat, 25 mM MES und 0,01% Antischaum B (hergestellt von Sigma) enthielt.
Ein Klon, der in λ-Zip-Lox hinein isoliert wurde, wurde ferner einer Subklonierung in einen Plasmidvektor pZL durch ein in vivo-Exzisionsverfahren unterzogen. Als ein Ergebnis wurde eine neue cDNA (hOAT4-cDNA) präpariert, die eine organisches-Anion-transportierende Aktivität besaß.
Die Bestimmung einer Basensequenz der oben hergestellten cDNA (OAT4-cDNA) wurde durch einen automatischen Sequenzierer (hergestellt von Applied Biosystems) unter Verwendung eines spezifischen Primers durchgeführt. Die Basensequenz ist in der SEQ ID Nr.: 1 der Sequenzauflistung gezeigt.
Beispiel 2. Charakterisierung der OAT4-Funktion.
Aus einem die OAT4-cDNA enthaltenden Plasmid wurde cRNA (eine RNA, die zu der cDNA komplementär ist) in vitro unter Verwendung einer T7-RNA-Polymerase erzeugt (Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., Band 272, Seiten 18526–18529, 1997).
Die resultierende cRNA wurde in Oozyten von Xenopus laevis gemäß des bereits berichteten Verfahrens (Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., Band 272, Seiten 18526–18529, 1997) injiziert, und die Oozyten wurden einem Inkorporierungsexperiment unter Verwendung von verschiedenen markierten organischen Anionen und organischen Kationen unterzogen. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, wie es in der 1 gezeigt ist, dass die Oozyten, in denen OAT4 exprimiert wurde, eine Inkorporierung von ³H-Estronsulfat, ³H-Dehydroepiandrosteronsulfat und ³H-Ochratoxin A zeigten. Im Gegensatz dazu wurde eine Aufnahme von ¹⁴C-TEA (Tetraethylammonium), was ein typisches organisches Kation darstellt, nicht beobachtet.
Beispiel 3. Kinetischer Test von OAT4 für einen Organisches-Anion-Transport
Ein dynamischer Michaelis-Menten-Test wurde für einen Organisches-Anion-Transport von OAT4 durchführt. Es wurden die Änderungen in der Aufnahmemenge von verschiedenen Konzentrationen von Estronsulfat und Dehydroepiandrosteronsulfat durch OAT4 getestet, wobei die Konzentrationsabhängigkeit von jenen Substraten durch OAT4 untersucht wurde. Das Aufnahmeexperiment von markiertem Estronsulfat und Dehydroepiandrosteronsulfat wurde gemäß des oben erwähnten Verfahrens unter Verwendung von Oozyten durchgeführt, in welche OAT4-cRNA injiziert wurde.
Als ein Ergebnis betrugen die Km-Werte von Estronsulfat und Dehydroepiandrosteronsulfat 1,01 ± 0,15 μM bzw. 0,63 ± 0,04 μM (Verweis auf die 2).
Beispiel 4. Test auf die Kationenabhängigkeit beim Organisches-Anion-Transport von OAT4.
Die Natrium-Abhängigkeit von OAT4 bei einem Organisches-Anion-Transport wurde untersucht. Selbst wenn extrazelluläres Natrium durch Lithium und Cholin ersetzt wurde, gab es keine Änderung im Transport von Estronsulfat über den OAT4, und es wurde deutlich gemacht, dass der OAT4 ein Organisches-Anion-Transporter ist, der von extrazellulärem Natrium unabhängig ist (Verweis auf die 3).
Um die Substrat-Selektivität von OAT4 weiter zu untersuchen, wurden verschiedene anionische Substanzen zu einem System in einem Aufnahmeexperiment-System von ³H-Estronsulfat in Oozyten hinzugefügt, in welche OAT4-cRNA injiziert wurde, und die Auswirkung wurde untersucht (Inhibierungsexperiment). Ein Aufnahmeexperiment von ³H-Estronsulfat wurde gemäß des oben genannten Verfahrens unter Verwendung von Oozyten durchgeführt, in welche OAT4-cRNA injiziert wurde. Eine Aufnahme von 50 nM ³H-Estronsulfat wurde bei der Gegenwart und Abwesenheit von 500 μM an verschiedenen Verbindungen (unmarkiert) gemessen. Das Ergebnis war, dass verschiedene anionische Substanzen (wie Probenecid, Penicillin G, Indomethacin, Ibuprofen, Diclofenac, Furosemid, Bumetanid, Bromsulfophthalein, Cholsäure und Taurocholsäure) den Transport von ³H-Estronsulfat durch OAT4 in signifikanter Weise inhibierten (Verweis auf die 3). Auf der anderen Seite zeigten kationische Substanzen, wie Tetraethylammonium und anorganische Sulfate, überhaupt keine inhibierende Wirkung (Verweis auf die 4). Aus den oben genannten Ergebnissen wurde klar gemacht, dass der OAT4 ein multi-spezifischer Organisches-Anion-Transporter ist.
Beispiel 5. Aufnahmetest von verschiedenen Sulfat-Konjugaten und Glucuronsäure-Konjugaten durch OAT4.
OAT4 zeigte eine Aufnahme-Aktivität für Konjugate der beiden Sulfate – Estronsulfat und Dehydroepiandrosteronsulfat –, und daher wurde ein inhibitorischer Test durchgeführt, um herauszufinden, ob verschiedene Sulfat-Konjugate und Glucuronsäure-Konjugate ebenfalls eine Wechselwirkung mit OAT4 zeigten. Wie in der 5 gezeigt, zeigten alle Sulfat-Konjugate mit Ausnahme von Minoxidil-Sulfat eine Wechselwirkung mit OAT4. Im Gegensatz dazu zeigten Glucuronsäure-Konjugate nur eine schwache Wechselwirkung mit OAT4, mit Ausnahme von α-Naphthyl-β-Glucuronid.
Beispiel 6. Northern-Blotting-Analyse vom OAT4-Gen
Es wurde eine Analyse der Expression (Northern-Blotting) vom OAT4-Gen in verschiedenen Geweben des Menschen durchgeführt. Volllängen-cDNA von OAT4 wurde mit ³²P-dCTP markiert, und diese wurde als eine Sonde für die Durchführung einer Hybridisierung von einem Filter (hergestellt von Clonetec) verwendet, auf den RNA geblottet wurde, die aus verschiedenen Geweben vom Menschen extrahiert worden ist. Die Hybridisierung wurde über Nacht unter Verwendung einer Hybridisierungslösung durchgeführt, die die Volllängen-cDNA des OAT4 enthielt, und der Filter wurde bei 65°C mit einem 0,1 × SSC gewaschen, der 0,1% SDS enthielt. Als ein Ergebnis des Northern-Blottings wurde eine starke Bande nur in den Fällen von Niere und Plazenta nachgewiesen (Verweis auf die 6). Im Übrigen zeigen die Blots in der 6 Gehirn, Herz, Skelettmuskel, Dickdarm bzw. Kolon, Thymus, Milz, Niere, Leber, Dünndarm, Plazenta, Lunge und periphere Blut-Leukozyten von links nach rechts.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Organisches-Anion-Transporter OAT4 von einem Plazenta-Typ und ebenfalls ein Gen, das dafür codiert, zur Verfügung. Ein Transporter ist ein Protein, das eine Substanz, die für die Aufrechterhaltung des Lebens von Zellen notwendig ist, genau wie ein Kanal, inkorporiert oder ausscheidet, und seine Anomalie verursacht verschiedene Erkrankungen. Insbesondere wird der Organisches-Anion-Transporter OAT4 eines Plazenta-Typs gemäß der vorliegenden Erfindung selektiv in der Niere und der Plazenta exprimiert, und seine Aufklärung ist für die Vorbeugung und Behandlung von verschiedenen Nierenerkrankungen und einem abnormalen Wachstum des Fötus nützlich. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Organisches-Anion-Transporter, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus: (a) einer Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr.: 2 der Sequenzauflistung repräsentiert wird, oder (b) einer Aminosäuresequenz, worin 1 bis 55 Aminosäurerest(e) der SEQ ID Nr.: 2 substituiert oder deletiert ist/sind.
Organisches-Anion-Transporter gemäß Anspruch 1, wobei er das Vermögen besitzt, Estronsulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und/oder Ochratoxin A zu inkorporieren.
Nukleinsäure, die einen Organisches-Anion-Transporter gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert, mit einer Basensequenz, welche gewählt ist aus: (a) einer Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr.: 1 der Sequenzauflistung repräsentiert wird, oder (b) einer Basensequenz, welche an der Nukleinsäure mit einer durch die SEQ ID Nr.: 1 repräsentierten Nukleotidsequenz unter einer stringenten Bedingung hybridisieren kann.
Antikörper, welcher den Organisches-Anion-Transporter von Anspruch 1 oder 2 erkennt.