DE10028901A1

DE10028901A1 - Arminosäuresequenz

Info

Publication number: DE10028901A1
Application number: DE2000128901
Authority: DE
Inventors: Michael Brues; Heinz Boenisch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-06-10
Filing date: 2000-06-10
Publication date: 2001-12-20

Description

1. Mit Hilfe der Aminosäuresequenz eines G Protein gekoppelten Rezeptors wurde durch Homologiesuche in einer Datenbank ein potentielles Gen für einen neuen G Protein gekoppelten Rezeptor auf dem humanen Chromosom 19 identifiziert. Aus der Gensequenz wurden Oligonukleotide zur Amplifikation des potentiellen Rezeptorgens und dessen abgeleiteter cDNA (mRNA) Sequenz hergestellt und für die PCR-Amplifikation des Gens und der cDNA eingesetzt. Mittels dieser Primer konnte das intronlose Gen aus humaner genomischer DNA kloniert und sequenziert werden. Weiterhin konnte mit anderen Primern die cDNA für die volle kodierende Region des Gens aus einer humanen Gehirn-cDNA-Bank hergestellt werden.

Sequenzierung des Gens und der cDNA ergaben folgende Eigenschaften des Gens: das Gen (5640 Basenpaare) enthält (wie viele Gene von G Protein gekoppelten Rezeptoren) keine Introns im kodiereneden Bereich. Der kodierende Bereich des Gens (Pos. 2501 bis 3694) besteht aus einem offenem Leseraster von 1194 Basen und kodiert somit ein Protein von 398 Aminosäuren. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt, daß es sich um einen G Protein gekoppelten Rezeptor mit sieben transmembranalen Domänen handelt. Die Aminosäuresequenz ist neu und bisher unbekannt und weist die beste Homologie (87% Identität und 91% Homologie) zum (Endothel-differentiation-gene) Rezeptor EDG-8 der Ratte auf. Dieser Rezeptor gehört zur Familie der Spingosin-1-Phosphat-Rezeptoren welche u. a. wichtige Signalfunktionen auf im Gehirn und anderen Geweben vermitteln. Aufgrund der Homologie unseres neuen Rezeptors zur Familie der EDG-Rezeptoren ist es höchstwahrscheinlich, daß auch dieser Rezeptor zur Familie gehört und das humane Gegenstück zum EDG-8-Rezeptor der Ratte ist. Erste funktionelle Untersuchungen mit dem transfizierten Rezeptor bestätigen diese Annahme. Wir haben dem Rezeptor daher den Namen hEDG-8 gegeben. Weiterhin gehören zu der zu patentierenden Sequenz 2500 Basen des 5' nichttranslatierten Bereichs des Gens, welche vermutlich den Promotor (mit GC Boxen und CAP Signalen) enthalten, sowie 1946 Basen des 3' nichttranslatierten Gen-Bereichs, welcher mehrere typische Polyadenylierungssignale (AATAAA) im Bereich von 4500 bis 4800 enthält.

2. Die Expression dieses Gens wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Primern (sense: 5'GTATCTTGCCTCTCCAACAG 3';
antisense: 5'CTTGGGAAGACAGTCGTGG 3), welche die kodierende Region des Gens flankieren nachgewiesen. Dazu wurde folgendes Temperaturprogramm für die PCR verwendet: 94°C 1 min, 56°C 1 min, 72°C 3 min, 35 Zyklen. Wir konnten so die volle kodierende cDNA (offenes Leseraster) dieses Rezeptors aus einer humanen Gehirn-cDNA- Bank amplifizieren und klonieren. Hiermit ist die Expression der mRNA dieses Rezeptors in humanem Gehirn eindeutig bewiesen. PCR mit genomischer DNA und diesen Primern ergab eine Bande von identischer Größe und durch Sequenzierung wurde eindeutig bewiesen, daß das Gen intronlos ist. Weiterhin konnte durch Homologiesuche in Datenbanken von exprimierten Sequenzstücken humaner Gene (EST = expressed sequence tags) fünf exprimierte Sequenzen mit 100%iger Identität zu einem Sequenzstück der kodierenden Region des hEDG-8 Gens bzw. mRNA gefunden, welche aus humanen Multiple-Sklerose- Läsionen (3 ×), humaner Niere (1 ×) und humanem Adenokarzinom (1 ×) stammen. Das mehrfache Auffinden von ESTs des hEDG-8 Rezeptors aus Multiple-Sklerose-Läsionen zeigt, dass dieser Rezeptor in den Multiple-Sklerose-Läsionen stark exprimiert wird. Da EDG- Rezeptoren in Oligodendrozyten als Angriffspunkt neu zu entwickelnder Pharmaka gegen demyelinisierende Erkrankungen angesehen werden, ist der EDG-8 ein Rezeptor an welchem solche Pharmaka entwickelt werden können und an welchem dann auch diese Pharmaka angreifen.

3. Die von der cDNA Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Rezeptors ist 398 Aminosäuren lang. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt eine putative Sekundärstruktur des Proteins als integrales Membransprotein mit 7 transmembranalen Domänen. Das Protein enthält eine potentielle N-Glykosylierungstelle im N-terminalen Bereich (Aminosäure Positionen 20). Weiterhin sind in der Aminosäuresequenz sechs potentielle Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen (Aminosäure Positionen 22, 100, 146, 237, 309 und 363) enthalten, deren fakultative Phosphorylierung (sofern sie intrazellulär lokalisiert sind) an der Modulation der Rezeptorfunktion beteiligt sein können. In Position 79, 309, 340 und 361 der Aminosäuresequenz befinden sich potentielle Caseinkinase II Phosphorylierungsstellen. Von Aminosäureposition 121 bis 137 findet sich ein typisches Aminosäure-Motiv der Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren.

4. Einordnung und potentielle Funktionen des zu patentierenden Rezeptors und seines Gens (bzw cDNA; mRNA):
Der Rezeptor gehört zur großen Genfamile der G-Protein ekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Innerhalb dieser Großfamile zählt er zur Sub-Famile der "Klasse A Rhodopsin-ähnlichen" Rezeptoren. Er besitzt sehr hohe Homologie zur Familie der EDG-Rezeptoren insbesondere zum EDG-8 der Ratte, und stellt somit den humanen EDG-8-Rezeptor dar, welcher bisher unbekannt war.

EDG-Rezeptoren werden in unterschiedlichen neuronalen und peripheren Geweben exprimiert, und den einzelnen Rezeptoren kommen verschiedene Funktionen in diesen Geweben durch Kopplung an unterschiedliche second messenger Wege zu. EDG-Rezeptoren sind am Zellwachstum, der Zell-Differenzierung und -Aufrechterhaltung wesentlich beteiligt. Die Rezeptoren sind an wichtigen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt und spielen eine Rolle bei der Zell-Proliferation, Zell-Entwicklung, Zell-Differenzierung, Zell-Migration, Zell-Apoptose und Zell-Plastizität. Der hier von uns beschriebene humane hEDG-8 Rezeptor wird stark in Multiple-Sklerose-Läsionen exprimiert (und in der Niere und in Adenokarcinomen) und spielt mit höchster Wahrscheinlichkeit eine wichtige Rolle bei der Pathogenese bzw neuen Therapiemöglichkeiten der Multiplen Sklerose und andrer demyelinisierender Erkrankungen.

Der von uns klonierte Rezeptor kann rekombinant exprimiert und funktionell untersucht werden. An transfizierten Zellen, welche diesen Rezeptor exprimieren bzw an Plasmamembranen solcher Zellen, können Pharmaka getestet werden, welche Agonisten oder Antagonisten an diesem Rezeptor sind. Solche Studien können als "high throughput screening" für eine Vielzahl an Chemikalien, Naturstoffen und Pharmaka durchgeführt werden (z. B. Agonisten-induzierte [355]GTP-gamma S Bindung oder second messenger assays oder Bindungsstudien mit Radioliganden)und zur Entwicklung neuer, spezifischer Pharmaka, welche an diesem Rezeptor angreifen genutzt werden.

Die von uns beschriebene Gensequenz kann ferner genutzt werden zur Identifizierung von Mutationen oder Polymorphismen welche die Funktion des Rezeptors oder die Expression des Gens beeinflussen bei Gesunden und bei erkrankten Patienten. Solche Informationen können dann zur Diagnose von Krankheiten und eventuell auch zu einer Gentherapie eingesetzt werden. Die funktionelle Charakterisierung des von uns beschriebenen 5' Bereichs des Gens (Promotor) kann genutzt werden, um neue Substanzen zu finden welche die Expression dieses Gens in positiver oder negativer Weise beeinflussen.

MBHB-Rezept-15: hEDG-8 Gen

MBHB-Rezept-15: hEDG-8 cDNA

MBHB-Rezept-15: hEDG-8 Aminosäuresequenz

Claims

1. Dieses Patent soll sich erstrecken auf folgende Daten, Techniken und Anwendungen und Entwicklungen:
Das dargestellte Gen inclusive des 5' und 3' nichttranslatierten Bereichs.

2. Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerasen und Pharmaka sowie Chemikalien die die Expresssion des Gens in positiver oder negativer Weise beeinflussen.

3. Die von dem Gen transkribierte messenger RNA inclusive davon abgeleitete Spleißvarianten und Isoformen.

4. Die von der mRNA oder von dem intronlosen Gen abgeleitete cDNA.

5. Das von der mRNA (oder dem Gen oder der cDNA) abgeleitete oder hergestellte Protein.

6. Antikörper oder Antiseren, welche gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

7. Monoklonale Antikörper oder Antiseren, die gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

8. Expressionssysteme (eukaryotische Zellinien, Hefezellen, Xenopus Oocyten, Baculovirussysteme, Insektenzellsysteme, bakterielle Expressionssysteme), welche das genannte Protein exprimieren (nativ oder recombinant).

9. Ligand Bindungsstudien und Screening-Assays an nativen oder recombinanten Rezeptoren oder Zellen oder Zellmembranen, welche diesen Rezeptor enthalten.

10. Transgene Tiere und knock-out Tiere, welche diesen Rezeptor oder die entsprechende Speziesvariante in veränderter Dichte oder gar nicht exprimieren.

11. Methoden der Gentherapie, welche sich auf diesen Rezeptor bzw sein Gen oder seine mRNA (cDNA) erstrecken und deren Entwicklung und Anwendung.

12. Sense- und Antisense-Oligonukleotide, welche von diesem Gen abgeleitet wurden sowie deren Anwendung.

13. Die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit diesem Rezeptor in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen.

14. Methoden zur Diagnose von Erkrankungen, die mit diesem Rezeptor (oder dessen Gen, mRNA) in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen wie z. B. Hybridisierungstechniken, Sequenzierung, SSCP, RFLP, Northern Blot, Southern Blot, Western Blot, Expressions-Arrays, Antikörper, Mutationsanalysen.

15. Die Benutzung der Informationen zur Entwicklung neuer Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien und die Evaluierung vorhandener Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien sowie zur Entwicklung neuer Technologien oder Evaluierung vorhandener Technologien.

16. Das Patent soll sich auch erstrecken auf die Punkte 1. bis 15. für modifizierte Proteine und Gen-, cDNA- und mRNA-Sequenzen (Aminosäureaustausche, Basenaustausche).

17. Diagnostische, therapeutische und gentherapeutische Verfahren und Pharmaka zur Therapie und Diagnose der multiplen Sklerose und anderer demyelinisierenden Erkrankungen welche mit diesem Gen bzw dem von diesem Gen kodierten Rezeptor in Zusammenhang stehen.