DE19930285A1 - P2YLi: Gen, CDNA, Expression und Aminosäuresequenz - Google Patents

Description

Mit Hilfe der Aminosäuresequenz eines G Protein gekoppelten Rezeptors wurde durch Homologiesuche in einer öffentlich zugänglichen Datenbank ein potentielles Gen für einen neuen G Protein gekoppelten Rezeptor auf dem humanen Chromosom 12 p13.3 identifiziert. Aus der Gensequenz wurden Oligonukleotide zur Amplifikation des potentiellen Rezeptorgens und dessen abgeleiteter cDNA (mRNA) Sequenz hergestellt und für die PCR-Amplillkation des Gens und der cDNA eingesetzt. Mittels dieser Primer konnte das intronlose Gen aus humaner genomischer DNA kloniert und sequenziert werden.

Das zu patentierende Gen erstreckt sich über 3180 Basen. Der kodierende Bereich des Gens (Pos. 909 bis 2024) besteht aus einem offenem Leseraster von 1116 Basen und kodiert somit ein Protein von 372 Aminosäuren. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt, daß es sich um einen G Protein gekoppelten Rezeptor mit sieben transmembranalen Domänen handelt. Die Aminosäuresequenz ist neu und bisher unbekannt und weist die beste Homologie (37% Identität; 58% Homologie) zum humanen P2Y5-Purinozeptor auf und er besitzt auch eine relativ hohe Homologie zum humanen Somatostatin-4 und zum humanen Interleukin-8 Rezeptor (Typ B).

Weiterhin gehören zu der zu patentierenden Sequenz 908 Basen des 5' nichttranslatierten Bereichs des Gens, welche vermutlich den Promotor (mit typischer TATA Box und CAP Signal im Bereich um Base 500) enthalten, sowie 1156 Basen des 3' nichttranslatierten Bereichs des Gens, welche ein typisches Polyadenylierungssignal in Position 2997 bis 3002 enthalten.

Die Expression dieses Gens wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Primern (sense: 5' CAATCCCACTTTGGCACGATG 3'; antisense: 5' AGCGCAATGGCATGTGTGTTC 3'), welche die kodierende Region des Gens flankieren nachgewiesen. Dazu wurde folgendes Temperaturprogramm für die PCR verwendet: 94°C 1 min, 60°C 1 min, 72°C 3 min, 35 Zyklen. Wir konnten so die volle kodierende cDNA (offenes Leseraster) dieses Rezeptors aus einer humanen Hippocampus-cDNA Bank vervielfältigen. Hiermit ist die Expression der mRNA dieses Rezeptors in diesem zentralnervösen Geweben eindeutig bewiesen. PCR mit genomischer DNA und diesen Primern ergab eine Band von identischer Größe und durch Sequenzierung wurde eindeutig bewiesen, daß das Gen intronlos ist. Weiterhin konnte durch Homologiesuche in Datenbanken von exprimierten Sequenzstücken humaner Gene (EST = expressed sequence tags) eine exprimierte Sequenz von 449 Basenpaaren mit 100%iger Identität zu einem Sequenzstück des nichttranslatierten 3' Bereichs (Pos. 2127 bis 2576) des Gens identifiziert werden. Dieser EST (AA769338) entstammt einer humanen B Lymphozyten cDNA Bank. Hiermit ist weiterhin bewiesen, daß dieser Sequenzbereich (2127-2576) auf der mRNA des Rezeptors enthalten ist, und daß das Gen in B Lymphozyten exprimiert wird.

Die von der cDNA Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Rezeptors ist 372 Aminosäuren lang. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt eine putative Sekundärstruktur des Proteins als integrales Membransprotein mit wahrscheinlich sieben transmembranalen Domänen. Das Protein enthält zwei potentielle N-Glykosylierungstellen im N-terminalen Bereich (Aminosäure Positionen 4 und 9). Weiterhin sind in der Aminosäure­ sequenz sechs potentielle Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen (Aminosäure Positionen 21, 211; 226, 232, 307 und 332) enthalten, deren fakultative Phosphorylierung (sofern sie intrazellulär lokalisiert sind) an der Modulation der Rezeptorfunktion beteiligt sein können. In Position 342 der Aminosäuresequenz befindet sich eine potentielle Caseinkinase II Phosphorylierungsstelle. Potentielle N-Myristoylierungstellen befinden sich in Aminosäure­ positionen 36, 258 und 324.

Einordnung und potentielle Funktionen des zu patentierenden Rezeptors und seines Gens (bzw eDNA; mRNA)

Der Rezeptor gehört höchstwahrscheinlich zur großen Genfamile der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Innerhalb dieser Großfamilie zählt er zur Sub-Famile der "Klasse A Rhodopsin ähnlichen" Rezeptoren. Er besitzt hohe Homologie zu Purinorezeptoren ( insbesondere P2Y Typ 5), zu Somatostatin Rezeptoren (inbesondere Typ 4) und zu Interleukin Rezeptoren (insbesondere Typ 8).
Expression des P2YLi Rezeptors in humanen Geweben:
Das Genprodukt wird in humanen B Lymphozyten exprimiert (Sequenzbereiche finden sich in EST AA769338, 100%ige Homologie). Weiterhin wurde ein 100% homologer EST (AA993247) aus humanem Hoden gefunden der ein acrosomales Protein (SP32) kodieren soll. Diese Sequenz überlappt mit dem 5'nichttranslatierten Bereich inclusive start codon und der folgenden 25 Basen der kodierenden Region. Dieser Befund zeigt, daß offensichtlich zwei Gene (das Gen für das acrosomale Protein SP32 und das Gen für den P2YLi Rezeptor) gemeinsame Chromosomenbereiche benutzen, das heißt, die Gene überlappen.

Da alle bisher klonierten P2Y-Rezeptoren von Säugern ihre Zellantwort über eine Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) vermitteln, dürfte dies auch auch auf den putativen "P2YLi"- Rezeptor zutreffen; d. h. der putative "P2YLi"-Rezeptor könnte auch eine Rolle bei Wachstums und Differenzierungsvorgängen spielen. P2Y-Rezeptoren kommen vor allem auf glatten Muskelzellen (Darm, Blutgefäße) vor und vermitteln über eine Freisetzung von Stickstoffinonoxid (NO) eine Relaxation (Vasodilatation).

Der putative "P2YLi"-Rezeptor dürfte daher eine physiologische und pathophysiologische Rolle bei der Regulation der Darmfunktion, des Blutdrucks, der Durchblutung von Organen oder Körperregionen (z. B. Herz, Niere, Corpus cavernosum) spielen. Das Vorkommen von P2Y-Rezeptoren auf dentritischen Zellen, T-Zellen und Thrombozyten und hämatopoetischen Zellen spricht dafür, daß der putative "P2YLi"-Rezeptors auch bei der Funktion dieser Zellen eine Rolle zukommt (z. B. bei Blutgerinnung, Hämatopoese, Immunreaktionen). Auch an Zellen des Nervensystems (z. B. Schwann-Zellen) und ZNS wurden P2Y-Rezeptoren nachgewiesen, weshalb dem putativen "P2YLi"-Rezeptor auch hier eine bisher noch nicht erkannte Rolle zukommen dürfte. Schließlich sind P2Y-Rezeptoren (und damit möglicherweise auch der "P2YLi"-Rezeptor) an der Freisetzung von Interleukinen (z. B. IL-6) beteiligt, d. h. der "P2YLi"-Rezeptor könnte auch an Entzündungsprozessen beteiligt sein.

Der "P2YLi"-Rezeptor weist eine 33%-ige Identität mit dem Somatostatinrezeptor-Typ4 auf, was auch bedeuten kann, daß das Genprodukt von "P2YLi" einen bisher unbekannten Subtyp eines Somatostatin-Rezeptors darstellt. Falls dies zutrifft, könnte der "P2yLi"-Rezeptor an der Hemmung der Freisetzung von Wachstumshormonen, Hemmung der Säuresekretion und an der Kontrolle der neuronalen Aktivität unterschiedlicher ZNS-Kerngebiete (z. B. locus coeruleus) beteiligt sein.

Die 31%-ige Identität (51% Homologie) des "P2YLi"-Rezeptors mit einem humanen Interleukin-8-Rezeptor (hIL-8R) schließt auch die Möglichkeit ein, daß das Genprodukt des "P2YLi" einen bisher nicht bekannten Subtyp eines hIL-8-Rezeptors darstellt. In diesem Fall würde der "P2YLi"-Rezeptor an Entzündungsprozessen der, der Modulation der Blutbildung (Hämatopoese), Gewebsreparaturprozessen und der Regulation von Immunfunktionen beteiligt sein.

Claims (16)

1. Das dargestellte Gen inclusive des 5' und 3' nichttranslatierten Bereichs und der Befund, daß das P2YLi Gen mit dem Gen für das acrosomale Protein SP32 überlappt.

2. Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerasen und Pharmaka sowie Chemikalien die die Expresssion des Gens in positiver oder negativer Weise beeinflussen.

3. Die von dem Gen transkribierte messenger RNA inclusive davon abgeleitete Spleißvarianten und Isoformen.

4. Die von der mRNA oder von dem intronlosen Gen abgeleitete cDNA.

5. Das von der mRNA (oder dem Gen oder der cDNA) abgeleitete oder hergestellte Protein.

6. Antikörper oder Antiseren, welche gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

7. Monoklonale Antikörper oder Antiseren, die gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

8. Expressionssysteme (eukaryotische Zellinien, Hefezellen, Xenopus Oocyten, Baculovirussysteme, bakterielle Expressionssysteme), welche das genannte Protein exprimieren (nativ oder recombinant).

9. Ligand Bindungsstudien und Screening assays an nativen oder recombinanten Rezeptoren oder Zellen oder Zellmembranen, welche diesen Rezeptor enthalten.

10. Transgene Tiere und knock out Tiere, welche diesen Rezeptor in veränderter Dichte oder gar nicht exprimieren.

11. Methoden der Gentherapie, welche sich auf diesen Rezeptor bzw sein Gen oder seine mRNA (cDNA) erstrecken und deren Entwicklung und Anwendung.

12. Sense und Antisense Oligonukleotide, welche von diesem Gen abgeleitet wurden sowie deren Anwendung.

13. Die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit diesem Rezeptor in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen.

14. Methoden zur Diagnose von Erkrankungen, die mit diesem Rezeptor (oder dessen Gen, mRNA) in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen wie z. B. Hybridisierungstechniken, Sequenzierung, SSCP, RFLP, Northern Blot, Southern Blot, Western Blot, Expressions Arrays, Antikörper, Mutationsanalysen.

15. Die Benutzung der Informationen zur Entwicklung neuer Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien und die Evaluierung vorhandener Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien sowie zur Entwicklung neuer Technologien oder Evaluierung vorhandener Technologien.

16. Das Patent soll sich auch erstrecken auf die Punkte 1. bis 15. für modifizierte Proteine, und Gen, cDNA und mRNA Sequenzen (Aminosäureaustausche, Basenaustausche).