DE69417223T2

DE69417223T2 - Ein menschlicher t-zell rezeptor der protein g-gekoppelte rezeptor familie

Info

Publication number: DE69417223T2
Application number: DE69417223T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Herbert Hanke; Kevin Thomas Ogborne
Original assignee: Pfizer Corp Belgium
Current assignee: Pfizer Corp Belgium
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 1999-07-08
Anticipated expiration: 2014-01-29
Also published as: DK0692026T3; GR3030152T3; ATE177783T1; JPH08506246A; EP0692026B1; ES2129120T3; DE69417223D1; WO1994024282A1; EP0692026A1; CA2159813A1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft einen menschlichen T-Zellrezeptor. Genauer betrifft die Erfindung Nucleotidsequenzen, die einen menschlichen T-Zellrezeptor codieren, rekombinante DNA, die solche Nucleotidsequenzen umfaßt, Vektoren, die diese rekombinante DNA enthalten und tranformierte Zellen, die eine solche Nucleotidsequenz enthalten. Die Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide, die als Rezeptor in Säugetierzellen dienen, Antikörper dagegen und Liganden, die an dieses Polypeptid binden. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Nachweis der Fähigkeit eines Mittels, als Agonist oder Antagonist des T-Zellrezeptors zu dienen. Die Erfindung betrifft außerdem Antisense-Sequenzen dieser Nucleotidsequenzen.

Stand der Technik

G-Proteine sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt als Guaninnucleotid-bindende Proteine. Auch mit G-Protein gekoppelte Rezeptoren sind im Stand der Technik wohlbekannt als Rezeptoren, die mit Guaninnucleotid-bindendem Protein gekoppelt sind. G-Proteine übertragen Signale von den assoziierten Rezeptoren an der Zelloberfläche zu bestimmten Effektorenzymen innerhalb der Zelle über eine GTP-Bindung und einen Hydrolysezyklus. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren haben typischerweise 7 die Membran durchdringende Segmente. K. E. Chaffin et al., EMBO Journal 9:3821-3829 (1990) schlagen vor, daß ein Pertussis-Toxin-Signalisierungsverfahren Gi-Proteine betrifft und die Thymozytenemigration regelt.
Über das chemische Ansprechen von Lymphozyten auf das neutrophile Anziehungs/Akivierungs-Protein-1 (NAP-1) in einer Wirksamkeit, die gering ist, verglichen mit dem Ansprechvermögen von Neutrophilen, wird von E. J. Leonard et al., J. Immunol. 144:1323-1330 (1990) berichtet. Die Aminosäuresequenz von NAP-1 wurde von T. Yoshimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9233-9237 (1987) offenbart. NAP-1 ist auch als Interleukin-8 (IL-8) bekannt.
Die Klonierung und die Sequenzen von 2 mit G-Protein gekoppelten Somatostatinrezeptoren (SSTR1 und SSTR2) wurden von Y. Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 251-255 (1992) offenbart. Die Klonierung und die Sequenz des mit menschlichem CSaG-Protein gekoppelten Rezeptors wurde von N. P. Gerard et al., Biochemistry 29: 9274-9281 (1990) offenbart. Die Klonierung und die Sequenz eines mit IL-8-G-Protein gekoppelten Rezeptors mit geringer Affinität wurden von P. M. Murphy et al., Science 253: 1280-1283 (1991) offenbart und die Klonierung und die Sequenz eines anderen mit IL-8-G-Protein gekoppelten Rezeptors wurde von W. E. Holmes et al., Science 253: 1278-1280 (1991) offenbart.
F. Boulay et al., Biochemistry 29: 11123-11133 (1990) offenbaren die Klonierung und die Sequenz von zwei Varianten des menschlichen N-Formylpeptid chemisch anziehenden mit G-Protein gekoppelten Rezeptors.
Polypeptidanaloga einer mit dem IL-8-Rezeptor wechselwirkenden Stelle, Antikörper dagegen und die Verwendung solcher Antikörper in einem IL-8-Immunoassay und zur Behandlung von Entzündungen werden in WO 9204372, veröffentlicht am 19. März 1992 offenbart. Das menschliche Komplementrezeptortyp 1-Gen, das kodierte Protein und Fragmente davon und die Verwendung solcher Proteine und Fragemente zur Behandlung von Immunstörungen, Herzinfakt, Schädigungen aufgrund von Entzündungen, und, in Kombination mit einem thrombolytischen Mittel, von Thrombose werden in WO 9105047, veröffentlicht am 18. April 1991, offenbart. Die Herstellung und Verwendung eines C5a-Rezeptorproteins wird in EP 377 489, veröffentlicht am 11. Juli 1990, offenbart.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung liefert einen T-Zellrezeptor und Nucleotidsequenzen, die den Rezeptor codieren. Die Nucleotidsequenzen der Erfindung bestehen im wesentlichen aus den unten als Sequenz ID Nr. 1 und Sequenz ID Nr. 5 gezeigten Nucleotidsequenzen. Sequenz ID Nr. 1 umfaßt die Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 5. Bevorzugt sind die Nucleotidsequenzen von Sequenz ID Nr. 1 und Sequenz ID Nr. 5.
Die Erfindung liefert weiterhin eine rekombinante DNA, die eine Nucleotidsequenz im wesentlichen von Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 umfaßt. Bevorzugt ist eine solche rekombinante DNA, bei der die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verbunden ist.
Die Erfindung liefert weiterhin Vektoren, die rekombinante DNA, wie vorher beschrieben, enthalten.
Erfindungsgemäß werden auch transformierte oder transfizierte Wirtszellen bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz im wesentlichen gemäß Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 umfassen.
Die transformierten oder transfizierten Wirtszellen der Erfindung sind Zellen, die zur Replikation und/oder Expression der oben beschriebenen Nucleotidsequenzen geeignet sind. Als Beispiel und nicht als Begrenzung schließen solche Zellen Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica und Säugetierzellen ein.
Die Erfindung liefert weiterhin Antisense-Sequenzen von Nucleotidsequenzen, die im wesentlichen die Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 aufweisen. Der Ausdruck Expressionssequenz, wenn er in der Einzahl oder in der Mehrzahl verwendet wird, schließt Nucleotidsequenzen ein, die Translations kontroll- und/oder Struktursequenzen codieren, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Antisense-Sequenzen der Erfindung sind geeignet, um die Expression des Polypeptids mit der Sequenz ID Nr. 2 in Zellen abzusenken und finden daher Nutzen zur Behandlung einer Transplantatabstoßung und/oder von entzündlichen Zuständen bei einem Tier, einschließlich einem Menschen.
Die Erfindung liefert auch ein im wesentlichen reines Polypeptid mit Sequenz ID Nr. 2. Das Polypeptid von Sequenz ID Nr. 2 wird von der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 5 ebenso wie von Sequenz ID Nr. 1 kodiert und ist ein möglicher Human-T-Zell-G-Protein-gekoppelter Rezeptor. Die erfindungsgemäßen Polypeptide, wie vorher beschrieben, sind geeignet zur Herstellung von Antikörpern. Weiterhin sind die Polypeptide geeignet für Nachweisverfahren, wie solchen, die unten beschrieben werden, für Agonisten oder Antagonisten eines T- Zellrezeptors. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Polypeptide, die eine Bindungsstelle enthalten, nützlich zur Herstellung von löslichen Polypeptiden oder Fragmenten davon, die die Rezeptorfunktion hemmen, indem sie um die Bindung an den Liganden konkurrieren. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind auch nützlich zur Isolation eines Liganden des von dem Polypeptid von Sequenz ID Nr. 2 gebildeten Rezeptors ebenso wie zur Identifizierung von Klonen, die einen natürlichen Liganden davon exprimieren innerhalb einer Expressionsbibliothek.
Die Erfindung liefert auch Methoden, um die Fähigkeit eines Mittels nachzuweisen, als Ligand oder Agonist eines T-Zellrezeptors, der ein Polypeptid der Sequenz ID Nr. 2 umfaßt, zu wirken; Methoden, um die Fähigkeit eines Mittels, als selekiver Antagonist eines solchen T-Zellrezeptors zu wirken, nachzuweisen und Methoden, um die Fähigkeit eines Mittels, als Antagonist solcher T-Zellrezeptoren zu wirken, nachzuweisen. Die Methoden sind unten angegeben.
Erfindungsgemäß werden auch die hier beschriebenen Antikörper bereitgestellt, die nützlich sind, um Zellen zu identifizieren, die den von dem Polypeptid mit Sequenz ID Nr. 2 gebildeten Rezeptor exprimieren, und sie könnten Nutzen finden bei der Behandlung einer Transplantatabstoßung und/oder von entzündlichen Zuständen bei einem Tier, einschließlich einem Menschen. Bevorzugt sind die Antikörper monoklonale Antikörper.
Weiterhin liefert die Erfindung einen Liganden für den Rezeptor, wobei der Ligand in einem Rezeptorbindungstest nützlich ist, um einen Rezeptorantagonisten oder -agonisten zu identifizieren.
Der Ausdruck "rekombinante DNA", wie er hier in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet wird, bedeutet eine DNA, die eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz umfaßt, unabhängig von der Art der DNA. So schließt beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, rekombinante DNA lineare DNA- Fragmente ein ebenso wie chromosomale DNA, in die eine Nucleotidsequenz der Erfindung eingesetzt wurde, ebenso wie durch Replikation erhaltene Derivate davon.

Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist eine Karte des Plasmids pCR11/Da6, worin pBR322 ori den Replikationsursprung von Plasmid pBR322 bedeutet, Ampicillin die die Ampicillinresistenz codierende Sequenz bedeutet, Kanaymcin die die Kanamycinresistenz codierende Sequenz bedeutet, f1 ori den Replikationsursprung des Phagen f1 bedeutet, LacZ die teilweise codierenden Bereiche der β- Galactosidase bedeutet, MCS eine multiple Klonierungsstelle bedeutet, DA6 die Sequenz bedeutet, die Sequenz ID Nr. 1 enthält, wie hier beschrieben, HpaII die Restriktionsstellen für das Enzym HpaII bedeutet, ATG den Ort des Startcodons für die codierende Sequenz von Da6 bedeutet (d. h. Sequenz ID Nr. 5) und STOP den Ort des Stopcodons am 3'-Ende der codierenden Sequenz von Da6 (Sequenz ID Nr. 5) bedeutet.

Detaillierte Beschreibung

1. Herstellung und Identifizierung des Klons Da6

Unter Anwendung der Guanidiumisothiocyanatmethode, die von P. Chomczynski et al. in Analytical Biochemistry 162: 156-159 (1987) beschrieben wurde, wurde mRNA aus frischen humanen peripheren Blut-T-Zellen isoliert. Mit dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannten Methoden, wie sie in Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Teil 2, J. Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Seiten 8.60-8.63 beschrieben werden, wurde cDNA des ersten Strangs aus der mRNA erzeugt unter Verwendung von Reverser Transcriptase. Zwei Primer wurden kommerziell von Genosys Corp., Houston, TX, hergestellt. Ein Primer war ein degeneriertes Oligonucleotid entsprechend einer Konsensussequenz, die durch Vergleich der M2-Transmembrandomäne des menschlichen Interleukins 8 [IL-8, W.E. Holmes et al., Science 253: 1278-1280 (1991)], F-met-Leu-Phe[FMLP, F. Boulay et al., Biochemistry 29:11123-11133 (1990)], Komplement C5a [N. P. Gerard et al., Nature 349: 614-617 (1991)] Neurokinin A [NKA, N. P. Gerard et al., The Journal of Biological Chemistry 265:20455-20462 (1990)] und dem von Glucocorticoid induzierten Rezeptor [MUSGCP, M. T. Harrigan et al., Molecular Endocrinology 5:1331-1338 (1991)] erhalten wurde. Der degenerierte M2-Primer hatte die Sequenz ATAAGCTTAANNTNGCNNTNGCNGAC (Sequenz ID Nr. 3). Der zweite Primer war ein degeneriertes Oligonucleotid mit einer Konsensussequenz, die durch Vergleich der M6-Transmembrandomäne von IL-8, hFMLP, hC5a, hNKA und MUSGCP-Rezeptor erhalten wurde. Der degenerierte M6- Primer (reverses Komplement) hatte die Sequenz TCGAATTCNANNTNNTANGGNNNCCA (sequenz ID Nr. 4).
Unter Verwendung der degenerierten M2- und M6-Primer von Sequenz ID Nr. 3 und Sequenz ID Nr. 4 wurde die oben beschriebene cDNA amplifiziert unter Verwendung eines modifizierten PCR-Amplifikationsprotokolls, wobei die DNA 30 Zyklen lang amplifiziert wurde mit 30 Sekunden bei einer Denaturierungstemperatur von 94ºC und 54 Sekunden bei einer Extensionstemperatur von 72ºC. Die Anelierungstemperatur war 37ºC für den ersten Zyklus und die Temperatur wurde pro Zyklus um 0,5ºC danach erhöht. Die entstehenden amlifizierten Sequenzen wurden in das Plasmid pBSK (Stratogene, LaJolla, CA) als Restriktionsfragment (EcoRI/HindIII) kloniert. Die entstehenden Klone wurden unter Verwendung eines Fluoreszenssequenzierungsverfahrens an einem Applied Biosystems 373A DNA-Sequenzautomaten (Applied Biosystems Inc. Foster City, CA) sequenziert.
Ein Teil des Da6-Klons wurde identifiziert durch Vergleich der translatierten Sequenz der Klone mit der PIR-Proteindatabase unter Verwendung der BLAST-Sequenzvergleichssoftware. [National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, NIH, Bethesda, MD; S. F. Altschul et al., Journal of Molecular Biology 215: 403-410 (1990)]. Der Teil- Da6-Klon wurde dann verwendet, um den kompletten Da6-Klon durch Hybridisierung mit einer menschlichen Thymus-λ-gt-11- cDNA-Bibliothek (Klontech, Palo Alto, CA) zu isolieren. Anfangs wurden ungefähr 500.000 Plaques, immobilisiert auf Nitrocellulosefiltern, mit dem Teil Da6-Klon in 5X Denhardt's Lösung, 5X SSPE, 50% Formamid, 100 ug/ml ssDNA, 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42ºC 16 Stunden lang hybridisiert. Die Filter wurden dann mit 0,16X SSC/1,0% SDS bei 50ºC 30 Minuten lang gewaschen. Dann wurde ein Röntgenfilm 12 Stunden bei - 70ºC mit den Filtern autoradiographiert mit Verstärkungsschirmen. Entstehende positive Klone wurden 2 weiteren Runden des Plaque-Screenings, wie oben beschrieben, unter Verwendung der Teil Da6-cDNA unterzogen, um den Da6- Klon vollständiger Länge zu reinigen. Ein entstehender positiver Klon wurde amplifiziert und seine DNA gewonnen, wie in Molecular Cloning, Zweite Ausgabe, Teil 1, Sanbrook et al., Op. cit., Seiten 2.69-2.71 ausgeführt. Die gereinigte DNA wurde dann einer PCR (Hoffman LaRoche, Nutley, NJ) unterzogen unter Verwendung von im Handel erhältlichen DNA- Primern, die die klonierende Region von λgt11 (Clonetech, Palo Alto, CA) flankieren. Die amplifizierten Sequenzen wurden dann in ein pCRII- "TA-Klonierungssystem" (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert unter Verwendung der vom Hersteller zur Verfügung gestellten Ligierungsbedingungen. Der Da6-Klon mit voller Länge wurde durch automatische Fluoreszenzsequenzierung bestätigt (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Der Klon Da6 enthält eine einzigartige Sequenz auf Basis der Recherchen sowohl in der PIR- als auch der Genbank-Sequenzdatabase (Intelligenetics, Inc., Mountain View, CA). Aufgrund einer gewissen Homologie zwischen Da6 und dem Plättchenaktivierungsfaktor und IL-8-Rezeptoren wurde geschlossen, daß Da6 einen neuen möglichen G-Protein gekoppelten Rezeptor kodiert. Eine Karte des Plasmids pCRII/Da6 ist in Fig. 1 angegeben.
Unter Verwendung von Da6 als Sonde wurde mit Northern-Analyse (Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Teil 1, J. Sambrook et al., Op. cit., Seiten 7.37-7.52) gezeigt, daß der davon kodierte Rezeptor hauptsächlich in T-Zellen exprimiert wird. Die Nucleotidsequenz des Rezeptors von Klon Da6, einschließlich der assoziierten 5'- und 3'-Nucleotidsequenzen, ist unten als Sequenz ID Nr. 1 gezeigt.
Klon Da6, der Sequenz ID Nr. 1 in pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) umfaßt, wurde nach den Vorschriften des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, einer anerkannten Hinterlegungsstelle, die die permanente Hinterlegung und Zugänglichkeit für jedermann sicherstellt, wenn auf die Anmeldung ein Patent erteilt ist, hinterlegt. Klon Da6 umfaßt Escherichia coli, der mit dem Plasmid pCRII/Da6 transformiert ist und dieses enthält. Das HpaII-Fragment von pCRII/Da6 enthält 999 bp der Da6 codierenden Sequenz (Sequenz ID Nr. 5), 60 bp der 5'-flankierenden Sequenz von Da6 (Sequenz ID Nr. 6) und 554 bp der 3'-flankierenden Sequenz von Da6 (Sequenz ID Nr. 7). Die Hinterlegung wurde während des Schwebens der Anmeldung verfügbar gemacht für jemanden, der von dem Commissioner of the United States Patent and Trademark Office bestimmt wurde als berechtigt gemäß 37 C. F. R. 1.14 und 35 U. S. C. 122 und gemäß den Patentgesetzen in anderen Ländern, indenen parallele Anmeldungen zu dieser Anmeldung oder dem Rechtsnachfolger eingereicht wurden. Alle Beschränkungen bezüglich der Verfügbarkeit des hinterlegten Mikroorganismus für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich bei Erteilung des Patentes zurückgenommen. Klon Da6 erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 69248.

2. Expression der Sequenz ID Nr. 1 in Säugetierzellen

Die Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 1 mit ihrer vollen Länge wird aus pCRII/Da6 herausgeschnitten unter Verwendung des Restriktionsenzyms HpaII und wird mit glatten Enden in die EcoRV-Restriktionsstellen des Vektors pcDNA/Neo (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert. Für die Zwecke der nachfolgenden Antikörpererkennung wird eine synthetische FLAG-Sequenz CCAGCAGCCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAA (Sequenz ID Nr. 8) an dem 5'-Ende von Sequenz ID Nummer 1 in Vektor pcDNA/Neo durch Ligierung der anelierten komplementären Oligonucleotide, die diese Sequenz im Transaktionsrahmen stromaufwärts der Da6- codierenden Sequenz enthalten, insertiert (E. Harlow et al., Antibodies, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Der Vektor wird dann in transformierten, kompetenten E. coli- Zellen amplifiziert und aus diesen Zellen gereinigt unter Verwendung einer 2-fachen Reinigung mit einem CsCl-Gradienten (Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Teil 1, J. Sambrook et al., Op. cit., Seiten 1.42-1.43). Geeignete Säugetierwirtszellen, wie β-Zellen, Fibroblasten oder COS-Zellen (d. h. Zellen, die natürlicherweise kein Protein der Sequenz ID Nr. 2 exprimieren) werden mit 10 bis 50 ug des gereinigten Vektors unter Verwendung von Calciumchlorid, Elektroporation, Liposomen oder anderem dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannten Mitteln transfiziert (Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Teil 3, J. Sambrook et al., Op. cit., Seiten 16.30- 16.55). Die entstehenden transfizierten Zellen werden mit einer Northernanalyse oder einer Reverse-Transcriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) der isolierten mRNA auf Expression von mRNA, die dem markiertem Polypeptid entspricht, getestet. Die Expression von Sequenz ID Nr. 2 aus Sequenz ID Nr. 1 wird nachgewiesen unter Verwendung eines Antikörpers gegen die FLAG-Sequenz unter Verwendung von FACS, Immunfällung, Western-blotting oder immunohistochemischem Färben. Solche Techniken sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt und werden in Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Teil 3, J. Sambrook et al., Op. cit. Seiten 18.19-18.75 und D. Kunz et al., J. Biol. Chem. 267:9101-9106 (1992) beschrieben. Alternativ kann ein Antikörper gegen eine extrazelluläre Sequenz von Sequenz ID Nr. 2 verwendet werden, um die Expression mit den direkt vorher beschriebenen Techniken nachzuweisen.

3. Produktion von Antikörpern gegen Sequenz ID Nr. 2

Polypeptide mit den einzigartigen Sequenzen, die in den möglichen extrazellulären Domänen von Sequenz ID Nr. 2 gebildet werden [d. h. WFLMYPFRFHDCKQKYDLY1 (Sequenz ID Nr. 9) und PLLRTSDDTSGNRTKCFVDLPTRNV Sequenz ID Nr. 10)] werden synthetisiert und mit einem Antigen, wie Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) oder Rinderserumalbum (BSA) konjugiert. Die Konjugate werden in einem Adjuvans resuspendiert und verwendet, um Tiere zu immunisieren und zu boostern und Seren werden nach jeder Boosterimpfung abgenommen. Die Seren werden unter Verwendung eines ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, das konjugierte Peptid, nicht aber ein Kontrollpeptid, zu binden. Seren, die mit dem konjugierten Peptid reagieren, werden dann auf ihre Fähigkeit getestet, an die Oberfläche von Sequenz ID Nr. 2 exprimierenden Zellen zu binden, unter Verwendung von FACS, ELISA, Immunfällung oder Western-blotting oder Immunocytohistochemie. Alternativ werden Fusionsproteine hergestellt unter Verwendung der Polypeptidsequenzen von Sequenz ID Nr. 2 und verwendet, um Tiere zu immunisieren, um Antiseren zu erzeugen. Um solche Fusionsproteine herzustellen, können Nucleotidsequenzen von Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 an lacZ-DNA oder eine andere DNA ligiert werden und in E. coli exprimiert werden. Das Fusionsprotein wird dann gereinigt und verwendet, um Tiere, wie oben beschrieben, zu immunisieren.
Alternativ und bevorzugt werden monoklonale Antikörper für die geeignete extrazelluläre Polypeptidsequenz mit Standardtechniken hergestellt (E. Harlow et al., Antibodies, 1988, Seiten 55-240, Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Polypeptide oder Fusionsproteine, die Peptidsequenzen von Sequenz ID Nr. 2 enthalten, werden verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Eine geeignete Menge von antigen Peptiden oder Fusionproteinen (5 bis 50 ug) werden mit komplettem Adjuvans vermischt und in die intraperitoneale Höhle von Mäusen injiziert. Alternativ kann das Antigen durch subkutane Injektion oder Injektion direkt in Lymphoidorgane zugeführt werden. Nachfolgende Injektionen erfolgen unter Verwendung von inkompletten Freundschem Adjuvans. Die Seren werden unter Verwendung eines ELISA auf ihr Fähigkeit getestet, ein geeignetes Peptidantigen, nicht aber ein Kontrollpeptidantigen, zu binden. Die Seren, die mit dem geeigneten Antigen reagieren, werden dann auf ihre Fähigkeit getestet, an die Oberfläche von Sequenz ID Nr. 2 exprimierenden Zellen zu binden, unter Verwendung von FACS, ELISA, Immunfällung oder Immunocytochemie. Tiere, die Antiseren erzeugen, die mit dem geeigneten Antigen reagieren, werden verwendet, um Hybridomas herzustellen, die monoklonale Antikörper erzeugen. Tiere werden mit dem geeigneten Antigen 3 bis 5 Tage vor der Fusion geboostert. Splenocyten werden von Mäusen erhalten und mit den geeigneten Myelomzellen fusioniert unter Verwendung von Polyethylenglycol (E. Harlow, et al., Antibodies, Ibid.). Die Hybridomas werden ausgewählt nach ihrer Verwertung von Hypoxanthin-, Aminoptesin und Thymidinselektions-(HAT)-Medium oder eines anderen geeigneten Selektionsmediums. Hybridoma-Pools werden auf die Antikörperproduktion unter Verwendung eines ELISA-Tests getestet. Positive Pools werden kloniert und einzelne Klone werden auf gleiche Weise bezüglich der Produktion geeigneter Antikörper getestet. Positive Klone werden expandiert und gezüchtet, um Überstände zu erzeugen, die den monoklonalen Antikörper für Sequenz ID Nr. 2 enthalten. Monoklonale Antikörper können auf Protein A-Säulen (E. Harlow et al., Antibodies, Op. cit.) oder mit anderen dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Methoden der Proteinreinigung gereinigt werden.

4. Nachweis der Da6-Funktion durch Calciumflux-Test

A. Fura-2-Test

Im wesentlichen mit Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 transfizierte Zellen werden mit Fura-2-acetoxymethylester (2,5 pH) in Calcium/Magnesium-freiem PBS 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann werden die Zellen gewaschen, wieder in Calcium/Magnesium-freiem PBS, das 10 mM HEPES pH 7,4, 0,25% BSA und 10 mM Glucose enthält, resuspendiert. Die Zellen werden in Quarzküvetten verteilt und die äußere Calciumkonzentration wird auf 1 mM mit CaCl&sub2; eingestellt. Rezeptorligand wird in einer wirksamen Konzentration zugegeben und die Fluoreszenz überwacht unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrophotometers mit Erregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm und einer Emissionwellenlänge von 510 nm. Der Calciumgehalt wird bestimmt unter Verwendung des Verhältnisses der entsprechenden Fluoreszenzmesswerte.

B. Durchflusszytometrie

Mit dem von W. E. Holmes et al., Science 253:1278-1280 (1991) beschriebenen Verfahren werden Zellen, die im wesentlichen mit Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 transfiziert sind, mit Indo-1-acetoxymethylester (2 uM) in RPMI 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Das intrazelluläre Calcium wird dann mit einem Durchflusszytometer bestimmt aus dem Verhältnis der Fluoreszenz bei den Wellenlängen 405 nm und 525 nm.

5. Nachweis der Da6-Funktionen durch Reportertest

Für die Transfektion kompetente Zellen werden unter Verwendung von Elektroporation oder anderen Transfektionsprotokollen (Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Teil 3, J. Sambrook et al., Op. cit., Seiten 16.30-16.55) mit einem Vektor cotransfiziert, der Sequenz ID Nr. 2 in diesen Zellen exprimieren kann, und einem Vektor, der Luciferase unter der Kontrolle eines G-Protein-empfindlichen Promotors kodiert (z. B.. minimal multimerisiertes CRE, NFkB oder minimal multimerisierten AP-1-promoter driving Luciferase als GAT). Minimal multimerisierte CRE-, NFkB oder AP-1-Promotor-Luciferase/CAT- Plasmide werden erhalten durch Klonierung einer ligierten Doppelstrangsequenz, die mehrfache Kopien der CRE-, NFkB- oder AP-1-Konsensusseguenzbindungsstellen stromaufwärts eines Minimal-Thymidinkinase- oder IL-2-Promotors enthält. Die cotransfizierten Zellen werden mit einer wirksamen Menge des Rezeptorliganden stimuliert und die Funktion des Rezeptors mit Sequenz ID Nr. 2 wird bestimmt durch die Menge an Luciferase oder GAT-Aktivität, die von der Zelle erzeugt wird, wie im Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Teil 3, J. Sambrook et al., Op. cit., Seiten 16.60-16.65 und J. R. DeWet et al., Molecular and Cellular Biology 7:725-737 (1987) beschrieben.

6. Verfahren zur Identifizierung natürlicher Liganden und Agonisten mit Sequenz ID Nr. 2

Die Anwendung transfizierter Zellen gemäß dem oben beschriebenen Fura-2-, Durchflusszytometrie- oder Reportertest und Inkubation der Zellen in Gegenwart einer chemischen Substanz in einer geeigneten solubilisierten Form, eines natürlichen Produktes, eines gereinigten Faktors oder eines rohen Zellextraktes bei verschiedenen Konzentrationen und Testen der Wirkung auf die Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen, ermöglicht die Auswahl von Agonisten und natürlichen Liganden von Sequenz ID Nr. 2 da diese Substanzen den Calciumflux (Fura-2 oder Durchflusszytometrietest) stimulieren oder die Luciferase/CAT-Aktivität (Reportertest) erhöhen.

7. Identifizierung von selektiven Antagonisten mit Sequenz ID Nr. 2

Zellen, die stabil im wesentlichen mit der Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 transfiziert sind oder diese Sequenzen exprimieren können, werden in Gegenwart einer definierten Konzentration einer chemischen Substanz inkubiert vor der Zugabe eines natürlichen Liganden oder Agonisten von Sequenz ID Nr. 2. Um die Selekivität des Antagonisten zu testen, wird eine Zellinie, die einen bekannten G-Protein gekoppelten Rezeptor (d. h. eine IL-8R-exprimierende Kontrollzellinie) auch mit der chemischen Substanz vor der Zugabe eines natürlichen Liganden (z. B. IL-8) oder eines Agonisten davon vorinkubiert. In beiden Fällen wird die Wirkung der Substanz entweder auf den Calciumflux oder die Reporteraktivität bestimmt. Solche chemischen Substanzen, die die Liganden- oder Agonistaktivierung des Calciumflux in den stabil transfizierten Zellen, nicht aber in der Kontrollzellinie hemmen oder blockieren, sind für die Sequenz ID Nr. 2 selektive Antagonisten.
Alternativ kann ein Rezeptorbindungstest, wie in einer der Literaturstellen D. Kunz et al., J. Biol. Chem. 267: 9101- 9106 (1992), S. Nourshargh et al., J. Immunol. 148: 106-111 (1992), W. E. Holmes et al., Science 253:1278-1280 (1991) oder N. P. Gerard et al., Biochemistry 29: 9274-9281 (1990) unter Anwendung eines markierten Liganden mit Sequenz ID Nr. 2 angewendet werden. Transfizierte Zellen, die im wesentlichen Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 exprimieren können, werden mit verschiedenen Konzentrationen einer chemischen Substanz über einen vorbestimmten Zeitraum unter geeigneten Bindungsbedingungen inkubiert und anschließend wird ein markierter Ligand zugegeben, der an Sequenz ID Nr. 2 bindet. Als Kontrolle wird der Bindungstest auch durchgeführt unter Verwendung der gleichen chemischen Substanz, aber mit einem Kontrollrezeptor (z. B. IL-8R), mit dem die gleiche Wirtszellinie transfiziert wurde, wie die, die verwendet wurde, um mit Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 transfizierte Zellen zu erhalten und mit einem markiertem Liganden des Kontrollrezeptors. Eine chemische Substanz, die die Bindung des markierten. Liganden an mit Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 transfizierte Zellen, nicht aber Kontrollzellen blockiert oder hemmt ist ein Antagonist, der für Sequenz ID Nr. 2 selektiv ist.

8. Transgene Tiere enthaltend Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 (nicht beansprucht)

Ein transgener Vektor wird konstruiert, der im wesentlichen Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 zusammen mit Transkriptions- und Prozessierungselementen umfaßt, um die Expression in dem Gewebe oder den Geweben der Wahl in dem transgenen Tier zuzulassen. Die Expression kann unter Verwendung der beschriebenen Vektoren auf T-Lymphozyten gerichtet werden [M. P. Cooke et al., Cell 65: 281-291 (1991)]. Nach Konstruktion und Amplifikation mit dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannten Methoden werden ungefähr 200 Kopien der linea ren Vektor DNA in den männlichen Pronucleus des fertilisierten Eis des Tieres mikroinjiziert, um es transgen zu machen mit den von D. Hanahan, Science 246:1265-1275 (1989) und R. L. Brinster et al., The Harvey Lecture Series 80:1-38 (1986) beschriebenen Methoden. Die injizierten Eier werden dann in den Eileiter von trächtigen Pflegemuttertieren implantiert und die Nachkommenschaft auf die Integration der Transgene getestet unter Verwendung einer Dot-Blot-Analyse, einer Southern-Analyse oder einer PCR-Analyse, wie in Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Teil 2, J. Sambrook et al., Op. cit., Seiten 9.4-9.58 und 14.5-14.14.21 beschrieben. Gewebe aus für die Transgenintegration positiven Tieren wird bezüglich der Transgenexpression getestet unter Verwendung einer Northern-Analyse oder PCR-Analyse zum Nachweis des Gehaltes an transgener nRNA. Transgen positive Tiere, die das Transgen exprimieren, werden vermehrt und die Nachkommen davon auf Gegenwart und Funktion des Transgens getestet, um die Etablierung einer transgenen Tierlinie zu bestätigen. Solche transgenen Tiere sind nützlich zur Erzeugung von Tierkrankheitsmodellen, die durch Überexpression von Rezeptoren von Sequenz ID Nr. 2 entstehen. Diese Tiere sind auch nützlich, um die Wirkungen von Antagonisten, Agonisten oder natürlichen Liganden auf die Rezeptorfunktion in vivo zu testen.

9. Antisense-Sequenzen

Eine synthetische Antisense-DNA-Sequenz mit ungefähr 15 bis 30 Basenpaaren Länge, die komplementär zu einem Teil einer Expressionssequenz von Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 ist. Die Antisense-Sequenz wird mit Standardmethoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, hergestellt, z. B. durch Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten (Applied Biosystems, Inc. Mountain View, CA). Die Antisense-Sequenz wird dann einer T-Zelle oder einem Tier in einer Menge, die wirksam ist, die Expression von Sequenz ID Nr. 2 zu hemmen, verabreicht. Weiterhin können modifizierte Oligonucleotide, die die Antisense-Sequenzen binden und zu einer erhöhten Zellaufnahme, in vivo-Absorption, biologischen Verfügbarkeit und/oder einem Schutz vor Nucleasen führen, hergestellt und angewendet werden in Zusammensetzungen, in denen solche Antisense-Sequenzen bei solchen Methoden verwendet werden, wie sie von J. S. Cohen, Pharmac. Ther. 52: 211-225 (1991) beschrieben werden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Hanke, Jeffrey H. Ogborne, Kevin T., Pfizer Inc., (nicht USA)
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Human-Rezeptor
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Gregg C. Benson, Pfizer Inc. (B) STRASSE: Eastern Point Road (C) ORT: Groton (D) BUNDESLAND: Connecticut (E) LAND: U.S.A. (F) POSTLEITZAHL: 06340
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/M5-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER ANMELDUNG
(A) ANMELDENUMMER: (B) ANMELDEDATUM: (C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION ÜBER ANWALT/VERTRETER
(A) NAME: Benson, Gregg C. (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 30,997 (C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: PC8348AGCB
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION
(A) TELEFON: (203)441-4901 (B) TELEFAX: (203)441-5221

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1613 Basenpaare (B) ART: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Doppelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 333 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare (B) ART: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: CDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 11 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "c oder t"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 12 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "c oder t".
(ix) MERKML
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte_Base (B) LAGE: 14 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder a""
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 17 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder c"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 18 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g, c oder t"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder a"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 23 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "c oder t"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare (B) ART: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 9 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder c"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 11 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder c"
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Base (B) LAGE: 12 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder c",
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Base (B) LAGE: 14 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder t"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Base (B) LAGE: 15 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "a oder g"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 18 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder t"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLUSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 21 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "g oder c"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte_Base (B) LAGE: 22 (D) SONSTIGE ANGABEN:/mod_base = anders /note = "a oder g"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 999 Basenpaare (B) ART: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Doppelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: CDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 554 Basenpaare (B) ART: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Doppelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare (B) ART: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Doppelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

Claims

1. Nucleotidsequenz, die einen Human-T-Zellrezeptor kodiert, im wesentlichen bestehend aus Sequenz ID Nr. 1.

2. Rekombinante DNA enthaltend eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1.

3. Rekombinante DNA nach Anspruch 2, worin die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verbunden ist.

4. Vektor enthaltend rekombinante DNA nach Anspruch 2 oder Anspruch 3.

5. Transformierte oder transfizierte Wirtszelle umfassend eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1.

6. Nucleotidsequenz, die einen humanen T-Zellrezeptor kodiert, im wesentlichen bestehend aus Sequenz ID Nr. 5.

7. Rekombinante DNA enthaltend eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 6.

8. Rekombinante DNA nach Anspruch 7, worin die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verbunden ist.

9. Vektor enthaltend rekombinante DNA nach Anspruch 7 oder Anspruch 8.

10. Transformierte oder transfizierte Wirtszelle enthaltend eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 6.

11. Escherichia coli ATCC 69248.

12. Plamid pCRII/Da6, graphisch dargestellt in Fig. 1.

13. Im wesentlichen reines humanes T-Zellrezeptorpolypeptid mit Sequenz ID Nr. 2.

14. Antikörper gegen ein Polypeptid nach Anspruch 13.

15. Antikörper nach Anspruch 14, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

16. Verfahren zum Nachweis der Fähigkeit eines Mittels, als Ligand oder Agonist eines Zellrezeptors zu wirken, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Verfahren umfaßt, daß man:

(a) Zellen, die mit Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 transfiziert sind und diese Sequenzen exprimieren können, in Gegenwart einer solubilisierten chemischen Substanz, einem natürlichen Produkt, einem gereinigten Faktor oder einem rohen Zellextrakt inkubiert;

(b) Kontrollzellen der gleichen Art, wie in Stufe (a), die aber nicht transfiziert sind, in Gegenwart der gleichen solubilisierten chemischen Substanz, des natürlichen Produkts, gereinigten Faktors oder rohen Zellextraktes, wie er in Stufe (a) angewendet wird, inkubiert;

(c) die Wirkung der solubilisierten chemischen Substanz, des natürlichen Produkts, des gereinigten Faktors, oder rohen Zellextraktes auf die Zellen der Stufen (a) und (b) untersucht und

(d) bestimmt, ob die solubilisierte chemische Substanz, das natürliche Produkt, der gereinigte Faktor oder der rohe Zellextrakt die Aktivität des Zellrezeptors, der ein Polypeptid nach Anspruch 13 umfaßt, erhöht oder stimuliert für die Zellen in Stufe (a) verglichen mit den Zellen von Stufe (b).

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin in Stufe (c) die Wirkung untersucht wird, indem der Calciumflux gemessen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16, worin in Stufe (a) die transfizierten Zellen mit einem Vektor cotransfiziert werden, der Luciferase unter der Kontrolle eines für G- Protein empfindlichen Promotors codiert; in Stufe (b) die Zellen mit dem Vektor, der Luciferase unter der Kontrolle eines für G-Protein empfindlichen Promotors enthält, der verwendet wird, um die Zellen in Stufe (a) zu cotransfizieren, transfiziert werden und in Stufe (c) die Wirkung getestet wird, indem die Luciferaseaktivität gemessen wird.

19. Verfahren, um die Fähigkeit eines Mittels zu testen, als selektiver Antagonist eines Zellrezeptors zu wirken, der ein Polypeptid nach Anspruch 13 umfaßt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man:

(a) getrennt Zellen, die mit Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 transfiziert sind oder diese Sequenzen exprimieren können, und Zellen, die einen bekannten mit G-Protein gekoppelten Rezeptor enthalten, in Gegenwart einer chemischen Substanz inkubiert;

(b) zu den Inkubationen von Stufe (a) einen natürlichen Liganden oder Agonisten von Sequenz ID Nr. 2 zu den stabil transfizierten Zellen, und einen natürlichen Liganden oder Agonisten zu den bekannten mit G-protein gekoppelten Rezeptorzellen zugibt;

(c) die Wirkung der chemischen Substanz auf die Zellen untersucht und

(d) bestimmt, ob die chemische Substanz selektiv den natürlichen Liganden oder Agonisten von Sequenz ID Nr. 2 hemmt oder blockiert.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin in Stufe (c) die Wirkung bestimmt wird, indem der Calciumflux gemessen wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19, worin in Stufe (a) die Zellen cotransfiziert werden und die Zellen, die einen bekannten mit G-Protein gekoppelten Rezeptor enthalten, mit einem Vektor transfiziert werden, der Luciferase unter der Kontrolle eines für G-Protein empfindlichen Promotors codiert, und in Stufe (c) die Wirkung untersucht wird, indem die Luciferaseaktivität gemessen wird.

22. Verfahren um die Fähigkeit eines Mittels zu untersuchen, als Antagonist eines Zellrezeptors, der ein Polypeptid nach Anspruch 13 umfaßt, zu wirken, wobei das Verfahren umfaßt, daß man:

(a) transfizierte Zellen, die Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 exprimieren können, und Kontrollzellen der gleichen Art, die aber mit einem anderen Kontrollrezeptor, als dem Rezeptor, der ein Polypeptid nach Anspruch 13 umfaßt, transfiziert sind und diesen exprimieren können, getrennt mit verschiedenen Konzentrationen einer chemischen Substanz inkubiert;

(b) zu den jeweiligen Zellen von Stufe (a) einen markierten Liganden der jeweiligen Rezeptoren zugibt und

(c) bestimmt, ob die chemische Substanz die Bindung des markierten Liganden an Sequenz ID Nr. 1 oder Sequenz ID Nr. 5 exprimierende transfizierte Zellen, nicht aber Kontrollzellen blockiert oder hemmt.

23. Antisense-Sequenz einer Expressionssequenz einer Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 6.