DE10007629A1

DE10007629A1 - Lyso 1, Gen, cDNA, Expression, Aminosäuresequenz

Info

Publication number: DE10007629A1
Application number: DE2000107629
Authority: DE
Inventors: Michael Brues; Heinz Boenisch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-02-21
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2001-08-23

Description

1. Mit Hilfe der Aminosäuresequenz eines G Protein gekoppelten Rezeptors wurde durch Homologiesuche in einer Datenbank ein potentielles Gen für einen neuen G Protein gekoppelten Rezeptor auf dem humanen Chromosom 11p identifiziert. Aus der Gensequenz wurden Oligonukleotide zur Amplifikation des potentiellen Rezeptorgens und dessen abgeleiteter cDNA (mRNA) Sequenz hergestellt und für die PCR-Amplifikation des Gens und der cDNA eingesetzt. Mittels dieser Primer konnte das intronlose Gen aus humaner genomischer DNA kloniert und sequenziert werden. Weiterhin konnte mit diesen Primern die cDNA für die volle kodierende Region des Gens aus einer humanen Colon- sowie aus einer humanen Lymphozyten-DNA-Bank hergestellt werden.
Sequenzierung des Gens und der cDNAs ergaben folgende Eigenschaften des Gens: das Gen (4621 Basenpaare) enthält (wie viele Gene von G Protein gekoppelten Rezeptoren) keine Introns. Der kodierende Bereich des Gens (Pos. 1196 bis 2239) besteht aus einem offenem Leseraster von 1044 Basen und kodiert somit ein Protein von 348 Aminosäuren.
Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt, daß es sich um einen G Protein gekoppelten Rezeptor mit sieben transmembranalen Domänen handelt. Die Aminosäuresequenz ist neu und bisher unbekannt und weist die beste Homologie (74% Identität und 76% Homologie) zum humanen "Endothel-Differenzierungs-Rezeptor EDG6 (ein G Protein-gekoppelter Rezeptor auf Chromosom 19p13.3) auf. Dieser Rezeptor gehört zur Familie der Lysophosphatid/Lysosphingolipid-Rezeptor Familie welche u. a. wichtige Signalfunktionen auf Lymphozyten vermitteln. Die zweithöchste Homologie (60% Identität; 69% Homologie) besteht zum EDG6-Rezeptor der Maus. Aufgrund der Homologie unseres neuen Rezeptors zur Familie der EDG-Rezeptoren ist es höchstwahrscheinlich, daß auch dieser Rezeptor zur Familie gehört. Weiterhin gehören zu der zu patentierenden Sequenz 1195 Basen des 5' nichttranslatierten Bereichs des Gens, welche vermutlich den Promotor (mit GC Boxen und CAP Signalen) enthalten, sowie 2382 Basen des 3' nichttranslatierten Gen- Bereichs, welcher mehrere typische Polyadenylierungssignale im Bereich von 3900 bis 4300 enthält.
Weiterhin wurden die flankierenden Bereiche im Genom welche 5' und 3' von unserem als Lyso1 bezeichneten Rezeptor durch Datenbank-Vergleiche untersucht: Hierbei zeigte sich, daß in diesem Bereich ESTS von Gessler Wilms Tumoren lokalisiert sind, weiterhin finden sich Gene für G-Protein Untereinheiten Galpha11 und Galpha16 im 5' bzw 3' Bereich des Rezeptorgens für Lyso 1. Zusätzlich ist ein Gen für ein "Katalase interagierendes Protein" in dieser Region lokalisiert. Mangelnde oder fehlende Katalase Aktivität findet man auch bei Gessler Wilms Tumoren. Weiterhin findet man auf diesem Chromosomenabschnitt ein Gen welches hoch homolog zu einem Brustkrebs Suppressor Element ist. Die Deletion dieses Tumor-Suppressors könnte ursächlich mit der Entstehung von Gessler Wilms Tumoren verbunden sein. Unser neuer Rezeptor und auch andere flankierende Gene in dieser Region sind hoch homolog zum humanen EDG6 Rezeptor auf Chromosom 19q13. Zum Beispiel findet sich eine 100%ige Homologie auf Chromosom 11 in der Nähe des Lyso 1 Gens zu einer Hormonsensitiven Lipase, welche auch auf Chromosom 19q13.1-q13.2 lokalisiert ist. Es gibt also eine Reihe von Hinweisen, daß der Lyso 1 Rezeptor a) auf Chromosom 11 in einer Region lokalisiert ist, welche bei Gessler Wilms Tumoren deletiert ist, und b) daß diese Region auf Chromosom 11 hoch homolog ist zu der entsprechenden Region auf Chromosom 19q wo das humane Gen für den EDG6 lokalisiert ist.
2. Die Expression dieses Gens wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Primern (sense: 5' GCCATGAACGCCACGTGGAC 3';
antisense: 5' CGAAAGCTGTCCCTTGGCCTC 3), welche die kodierende Region des Gens flankieren nachgewiesen. Dazu wurde folgendes Temperaturprogramm für die PCR verwendet: 94°C 1 min, 62°C 1 min, 72°C 3 min, 35 Zyklen. Wir konnten so die volle kodierende cDNA (offenes Leseraster) dieses Rezeptors aus einer humanen Colon- sowie einer humanen Lymphozyten-cDNA Bank vervielfältigen. Hiermit ist die Expression der mRNA dieses Rezeptors in diesen Geweben eindeutig bewiesen. PCR mit genomischer DNA und diesen Primern ergab eine Bande von identischer Größe und durch Sequenzierung wurde eindeutig bewiesen, daß das Gen intronlos ist. Weiterhin konnte durch Homologiesuche in Datenbanken von exprimierten Sequenzstücken humaner Gene (EST = expressed sequence tags) zwei exprimierte Sequenzen (Accession NR. AI766522.1 und AI869921.1) mit 97 %iger Identität zu einem Sequenzstück des nichttranslatierten 3' Bereichs kurz hinter dem Stop-Codon des Gens identifiziert werden. Diese ESTs stammen aus humanem Colon- Gewebe. Weiter 3' gelegen findet man Homologien zu ESTs aus Gessler-Wilms-Tumoren mit 92%-iger Homologie. Gessler-Wilms-Tumoren sind gekennzeichnet durch Deletionen auf Chromosom 11p13-p15. Hier liegen u. a. Genloci für Katalase, Calcitonin und G-Protein- Untereinheiten. Der von uns neu gefundene Rezeptor liegt in einem Bereich von Chromosom 11p, welcher
Zeichen: MBHB-REZEPT-8 (Fortsetzung)
vermutlich beim Gessler-Wilms-Tumor deletiert ist. Möglicherweise trägt der Ausfall dieses Rezeptors zum Krankheitsbild bei. Außerdem kann das Gen als Marker für die Diagnose dieser Krankheit dienen.
3. Die von der cDNA Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Rezeptors ist 348 Aminosäuren lang. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt eine putative Sekundärstruktur des Proteins als integrales Membransprotein mit 7 (bzw. je nach angewendeter Software 6 bis 8) transmembranalen Domänen. Das Protein enthält zwei potentielle N-Glykosylierungstellen im N-terminalen Bereich (Aminosäure Positionen 2 und 30). Weiterhin sind in der Aminosäuresequenz zwei potentielle Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen (Aminosäure Positionen 75 und 107) enthalten, deren fakultative Phosphorylierung an der Modulation der Rezeptorfunktion beteiligt sein können. In Position 87 der Aminosäuresequenz befindet sich eine potentielle Caseinkinase II Phosphorylierungsstelle. Potentielle N-Myristoylierungstellen befinden sich in Aminosäurepositionen 33, 50, 52, 144, 209, 216, 263 und 329.
4. Einordnung und potentielle Funktionen des zu patentierenden Rezeptors und seines Gens (bzw cDNA; mRNA):
Der Rezeptor gehört höchstwahrscheinlich zur großen Genfamile der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Innerhalb dieser Großfamile zählt er zur Sub-Famile der "Klasse A Rhodopsin-ähnlichen" Rezeptoren. Er besitzt hohe Homologie zur Familie der EDG- Rezeptoren (endothelial differentiation G protein coupled receptors), Rezeptoren für Lysophosphatidsäure (LPA) oder Sphingolipide, weshalb wir diesem humanen Rezeptor die Kurzbezeichnung "Lyso1" verleihen.
Expression des Lyso1-Rezeptors in humanen Geweben:
Mittels PCR und geeigneter cDNA-Banken konnten wir nachweisen, daß der "Lyso1" in humanem Colon und Lymphozyten exprimiert wird.
Da Lysophosphatidsäure (LPA) auch an der Aktivierung von Thrombozyten und Endothelzellen (wo LPA eine vermehrte Synthese von Endothelin auslösen kann) beteilgt ist, kommt dem "Lyso1" möglicherweise auch eine Rolle bei der Pathogenese der Atherosklerose zu. Der "Lyso1" ist möglicherweise auch an der Pathogenese bestimmter Nierenerkrankungen beteiligt (LPA-vermittelte Wirkungen an Mesangialzellen). Möglicherweise werden über den "Lyso1" auch neuroprotektive Effekte von LPA vermittelt.
Der "Lyso1" könnte auch eine Rolle bei der Signaltransduktion immunkompetenter Zellen spielen (LPA ist ein Wachstumsfaktor für humane B-Lymphozyten und bindet an neutrophile Zellen und T-Zellen). Lysophosphatidsäure Rezeptoren (und vermutlich auch der "Lyso1") sind auch an der Neurotransmitter-Freisetzung beteiligt. Bisher bekannte Lysophosphatidsäure Wirkungen, welche über LPA-Rezeptoren vermittelt werden, lassen sich wie folgt zusammenfassen: Beteiligung an Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen; Wundheilung; Geweberegeneration; Wachstumsstimulation; Unterdrückung von Apoptose (programmierter Zelltod); Kontraktion; Sekretion; Adhäsion; Chemotaxis; cerebrale Mikrozirkulation; Reifung menschlicher Eizellen und somit der Fruchtbarkeit.
Wegen der bekannten mitogenen und chemotaktischen Aktivität bioaktiver Lipide (wie LPA) glauben wir, dass der "Lyso1" eine wesentliche Rolle in der Signalübermittlung durch Lymphozyten spielt.

MBHB-REZEPT-8: Lyso-1-Gen und cDNA

MBHB-Rezapt-8: Lyso-1-Aminosäuresequenz

Claims

1. Das dargestellte Gen inclusive des 5' und 3' nichttranslatierten Bereichs.

2. Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerasen und Pharmaka sowie Chemikalien die die Expresssion des Gens in positiver oder negativer Weise beeinflussen.

3. Die von dem Gen transkribierte messenger RNA inclusive davon abgeleitete Spleißvarianten und Isoformen.

4. Die von der mRNA oder von dem intronlosen Gen abgeleitete cDNA.

5. Das von der mRNA (oder dem Gen oder der cDNA) abgeleitete oder hergestellte Protein.

6. Antikörper oder Antiseren, welche gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

7. Monoklonale Antikörper oder Antiseren, die gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.

8. Expressionssysteme (eukaryotische Zellinien, Hefezellen, Xenopus Oocyten, Baculovirussysteme, Insektenzellsysteme, bakterielle Expressionssysteme), welche das genannte Protein exprimieren (nativ oder recombinant).

9. Ligand Bindungsstudien und Screening-Assays an nativen oder recombinanten Rezeptoren oder Zellen oder Zellmembranen, welche diesen Rezeptor enthalten.

10. Transgene Tiere und knock-out Tiere, welche diesen Rezeptor oder die entsprechende Speziesvariante in veränderter Dichte oder gar nicht exprimieren.

11. Methoden der Gentherapie, welche sich auf diesen Rezeptor bzw sein Gen oder seine mRNA (cDNA) erstrecken und deren Entwicklung und Anwendung.

12. Sense- und Antisense-Oligonukleotide, welche von diesem Gen abgeleitet wurden sowie deren Anwendung.

13. Die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit diesem Rezeptor in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen.

14. Methoden zur Diagnose von Erkrankungen, die mit diesem Rezeptor (oder dessen Gen, mRNA) in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen wie z. B. Hybridisierungstechniken, Sequenzierung, SSCP, RFLP, Northern Blot, Southern Blot, Western Blot, Expressions-Arrays, Antikörper, Mutationsanalysen.

15. Die Benutzung der Informationen zur Entwicklung neuer Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien und die Evaluierung vorhandener Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien sowie zur Entwicklung neuer Technologien oder Evaluierung vorhandener Technologien.

16. Das Patent soll sich auch erstrecken auf die Punkte 1. bis 15. für modifizierte Proteine und Gen-, cDNA- und mRNA-Sequenzen (Aminosäureaustausche, Basenaustausche).

17. Die Diagnose und Analyse von Gessler Wilms Tumoren mittels dieses Rezeptorgens und der oben genannten flankierenden Gene.

18. Die Genduplikation von Chromsom 19 nach Chromosom 11 (oder umgekehrt von Chr. 11 nach Chr. 19) welche den humanen EDG6 Rezeptor und flankierende Gene auf Chromosom 19 bzw unseren neuen Rezeptor Lyso 1 und flankierende Gene auf Chr. 11 betrifft und auf Chromosom 11p13-p15 liegt und mit der Entstehung von Gessler Wilms Tumoren (wahrscheinlich durch Deletion) assoziiert ist.