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DE1695830C3 - Zygosporin A, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltendes Arzneimittel - Google Patents

Zygosporin A, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltendes Arzneimittel

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Publication number
DE1695830C3
DE1695830C3 DE1968S0114090 DES0114090A DE1695830C3 DE 1695830 C3 DE1695830 C3 DE 1695830C3 DE 1968S0114090 DE1968S0114090 DE 1968S0114090 DE S0114090 A DES0114090 A DE S0114090A DE 1695830 C3 DE1695830 C3 DE 1695830C3
Authority
DE
Germany
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zygosporin
zygosporium
atcc
phenylbutazone
rats
Prior art date
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Application number
DE1968S0114090
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English (en)
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DE1695830B2 (de
DE1695830A1 (de
Inventor
Hyogo Amagasaki
Shohei Hayakawa
Katsumi Nishinomiy Hyogo Hirose
Takashi Matsushima
Hitoshi Toyonaka Osaka Minato
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
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Publication date
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Publication of DE1695830B2 publication Critical patent/DE1695830B2/de
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
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    • C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
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Description

' Die Erfindung betrifft eine als Zygosporin A bezeichnete, fermentativ erzeugte antiinflammatorische Substanz, ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und ein diese Verbindung als Wirkstoff enthaltendes Arzneimittel.
Als antiinflammatorische Mittel werden meistens Adrenocorticoide, z. B. Cortison, Hydrocortison, Prednison und Prednisolon verwendet. Diese Adrenocorticoide weisen jedoch im allgemeinen unerwünschte Nebenwirkungen auf. wenn sie lange Zeit ununterbrochen verabreicht werden. Wegen dieses Nachteils der Adrenocorticoide wurden einige nichtadrenocorticale antiinflammatorische Mittel empfohlen. Diese nichtadrenocorticalen Verbindungen sind jedoch Jen Adrenocorticoiden hinsichtlich der antiinflammatorischen Aktivität im allgemeinen unterlegen. Es besteht daher ein Bedarf an anderen nichtadrenocorticalen Verbindungen, die ebenso wie die Adrenocorticoide eine hohe antiinflammatorische Aktivität aufweisen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß ZygosporiunvSpecies, die mit MFC-612 Und MFG-702 in der Sammlung von Shionogi Research Laboratory, Shionogi & Co., Ltd., Ösaka( Japan, bezeichnet und bei der American Type Culture Collection unter den Nummern ATCC No, 20011 bzw. 20012 hinterlegt sind, eine kristalline Substanz produzieren, die eine starke antiinflammatorische Aktivität aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist nun das Fermentationsprodukt Zygosporin A der Formel
CH1
C-OH
13CH
CH"
C —O—C—CH,
I5\ Il
H O
NH
H, C
H3C CH2 <J>
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Zygosponn A, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Zygosporin erzeugenden Stamm von Zygosporium masonii ATCC Nr. 20011 und Zygosporium mycophilum ATCC Nr. 20012
jo in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen etwa 50 bis 150 Stunden bei etwa 25 bis 32°C züchtet und die so erzeugte antiinflammatorische Substanz aus der Fermentationsbrühe gewinnt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Arzneimittel mit antiinflammatorischer Wirkung, das Zygosporin A als Wirkstoff neben üblichen Träger- und Verdünnungsmitteln enthält.
Zygosporium MFC-612 wurde aus einer Probe toter Blätter von Daphniphyllum macropodum isoliert, die 1965 in Kyoto gesammelt wurden, und zeigt folgende morphologische Eigenschaften:
Das Wachstum auf Kartoffel-Saccharose-Agar ist mittelstark und die Kolonie ist weiß, filzartig mit dunkelgrauen gefaserten Zentralen, in denen Sporuia-5 tion erfolgt. Die Conidiophoren sind aufrecht und bestehen aus drei Teilen:
(1) Ein aufrechter Basalsproß, der aus I bis 3 Zellen besteht, ist blaßbraun gefärbt und hat eine Größe von 5 bis 20 χ 2 bis 2,5 Mikron. (2) Auf dem Basalsproß sitzt
ίο ein Mittelteil, der aus einer aufrechten Kette von 2 bis 4 Vesiceln besteht, die jeweils an ihren Enden miteinander verbunden sind. Die Vesicel sind dunkelbraun gefärbt, 7 bis 12 Mikron lang, von vorne gesehen keulenförmig, unten 2 Mikron und oben 4 Mikron breit. Seitlich
Vi betrachtet haben sie etwa die Gestalt eines Axblatts mit einem 2 bis 4 Mikron langen Rostrum. Die Seitenwand ist dick mit der Ausnahme der Stelle, an die das nächste Vesicel gebunden ist. Das Rostrum trägt 2 sporogene Zellen, die divergent aufwärts gekrümmt, ovoid
mi zugespitzt und hyalin sind und eine Größe von 4 bis 6 χ 2 bis 2,5 Mikron haben, (3) Am Ende der Conidiophoren befindet sich eine lange hyaline apicale Hyphe, die 20 bis 30 χ 1 bis 2 Mikron groß, kontinuierlich und oben zu einer ovalen Birne mit einem Durchmesser von etwa 2,5 bis 3,5 Mikron angeschwollen ist. Die Conidien werden einzeln aus dem Apex jeder sporogenen Zeile erzeugt und sind trocken, oval, hyalin, mit feinen Warzen besetzt und 6 bis 9 χ 4 bis 6 Mikron groß.
Auf Grund dieser Merkmale wurde Zygosporium MFC-612 als Zygosporium masonii Hughes (S. J. Hughes: Mycol. Pap„ C.M.I.,44, 15 [1951]) identifiziert Dieser isolierte Stamm, d. h. Zygosporium masonii MFC-612 wurde bei der Amencal Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Nummer ATCC No. 20011. Vorzugsweise erfolgt die Erhaltungszüchtung von Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC No. 20011) auf Kartoffel-Karotten-Agar bei 100C mit Übertragungen nach jeweils 3 Monaten.
Zygosporium MFC-702 wurde aus einer Probe toter Blätter von Osmanthus ilicifdius isoliert, die 1966 in Asakawa, Tokyo, gesammelt wurden, und weist folgende Merkmale auf:
Das Wachstum auf Kartoffel-Saccharose-Agar ist verhältnismäßig langsam, und die Kolonie ist blaßbraun gefärbt. Das Mycel besteht aus hyalinen bis subhyalinen verzweigten und septierten 1 bis 3 Mikron breiten Hyphen. Falces sitzen direkt auf dem Mycel ab Seitenzweig auf. Der Vesicel tragende Stiel ist zylindrisch. 4 bis 16 χ 2 bis 3 Mikron groß. 0 bis lmal septiert und braun gefärbt Das Vesicel ist dunkelbraun gefärbt, obyriform zu einem einseitigen Rostrum am Apex ausgebildet, 13 bis 15 Mikron lang, von vorn gesehen an der breitesten Stelle 6 bis 8 Mikron und seitlich betrachtet an der breitesten Stelle 4,5 bis 6 Mikron breit Drei divergente sporogene Zellen am Apex des Rostrums sind hyalin, eiförmig zugespitzt, manchmal gebogen und 4 bis 6 χ 3 bis 4 Mikron groß. Die sterile Zelle, die auf der Spitze des Vesicels sitzt, ist zylindrisch mit einem abgerundeten, schwach verdickten und häufig gewungenen Ende und 5 bis 8 χ 2 bis 3 Mikron groß. Die Conidien Herder am Apex jeder sporogenen Zelle erzeugt, sind o/a1 und 8 bis 10 χ 6 bis 7 Mikron groß.
Auf Grund dieser Merkmale wurde Zygosporium MFC-702 als Zygosporium mycophilum (VuilT.) Sacc. (S. J. Hughes: Mycol. Pap., C. M. I., 44.9[195I]) identifiziert. Dieser isolierte Stamm, d. h. Zygosporium mycophilum MFC-702 ist bei der American Type Culture Collection w unter der Nummer ATCC Nr. 20012 hinterlegt. Die Erhaltungszüchtung von Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC Nr. 20012) erfolgt vorzugsweise auf Kartoffel-Saccharose-Agar unter denselben Bedingungen, wie sie oben für Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) beschrieben wurden.
Erfindungsgemäß wird die antiinflammatorische Substanz Zygosporin A während der Züchtung der Zygosporin erzeugenden Stämme von Zygosporium masonii und Zygosporium mycophilum in einem wäßrigen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 —32°C, vorzugsweise 27 —29°C unter aeroben Bedingungen erzeugt. Die Zusammensetzung des Nährmediums kann in einem sehr weiten Bereich geändert werden. Was im wesentlichen erforderlich ist, sind ein? Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Elemente. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose, Glycerin, Dextrin, Maltose, Fructose, Saccharose, Lactose, Mannit und Melasse. Zu geeigneten Stickstoffquellen für das Fermentätiörtsverfähren gehören beispielsweise Fleischextrakte, Pepton, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Erdnußniehl, Weizengluten, Baumwollsaatmehl, Casaminosäure (Säurehydrolysat von Casein), NZ^Amin (enzymatisches Hydrolysat Von Casein), Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumchlorid, Beispiele geeigneter Quellen für anorganische Elemente sind Mineralsalze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Kaliumphosphat. Man kann das Nährmedium vor dem Beimpfen mit dem Mikroorganismus auf etwa pH 7,0 einstellen oder keine solche Einstellung vornehmen. Wenn übermäßiges Schäumen auftritt, kann man dem Fermentationsmedium vor oder während der Fermentation Antischaummittel, z. B. pflanzliche öle. Speck- oder Schmalzöl und Polypropylenglycol zusetzen. Die maximalen Ausbeuten der antiinflammatorischen Substanz Zygospor^n A können nach etwa 50 bis 150 Stunden, gewöhnlich etwa 70 bis 100 Stunden Fermenrationsdauer unter optimalen Temperatur- und Belüftungsbedingungen erzielt werden.
Im allgemeinen sammelt sich die gewünschte Substanz Zygosporin A hauptsächlich in dem Fermentationsmedium an. Nach dem Wachstum des Mikronorganismus wird das Mycel mit Hilfe üblicher Vorrichtungen, z. B. Filterpressen und Zentrifugen von der Fermentationsbrühe abgetrennt, worauf Zygosporin A aus dem Filtrat durch übliche Trennverfahren, z. B. Solventextraktionsverfahren und Adsorptionsverfahren gewonnen wird. Nötigenfalls kann das gesammelte Mycel ebenfalls der Solventextraktion unterworfen werden, da das aktive Produkt in gewissem Umfang in dem Mycel enthalten ist Zu geeigneten Lösungsmitteln für die Extraktion und Eiution der aktiven Komponente gehören beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Tetrahydrofuran, Äther, Äthylacetat, Butylacetat, Amylacetat. Chloroform, Methylenchlorid, Dichloräthan, Tnchloräthan und Benzol. Beispiele für geeignete Adsorbentien sind Celite (eine Art von Diatomeenerde), Hyflo-Super-Cel (eine Art von Diatomeenerde), Kieselsäure. Kieselsäuregel und Aktivkohle. Gewöhnlich wird eine Kombination einer Solventextraktion mit einer Kristallisation durch Konzentrieren angewandt. Beispielsweise wird das Filtrat der Kulturbrühe mit einem geeigneten mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Äthylacetat und Chloroform extrahiert, und der Extrakt wird eingeengt, um die aktive Verbindung in Form roher Kristalle abzuscheiden.
Die so erhaltene rohe aktive Komponente wird durch geeignete Maßnahmen, z. B. Umkristallisieren, Chromatographieren weiter gereinigt Beispiele geeigneter Lösungsmittel für die Umkristallisation sind Aceton, Methanol und Äthanol. Die bevorzugten chromatographischen Adsorptionsmittel sind Kieselsäure und Kieselsäuregel.
Die antiinflammatoriäche Substanz Zygosporin A besteht aus farblosen nadelartigen Kristallen, die nach Umkristallisation aus Aceton bei 268 —2700C unter Zersetzung schmelzen. Sie ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Äthylacetat und Pyridin, wenig löslich in Äther und Benzol und unlöslich in Petroläther und Wasser. Sie verhält sich wie eine neutrale Substanz.
Zygosporin A weist folgende Werte der Elomentaranalyseauf:
Kohlenstoff
Wasserstoff
Sauerstoff
Stickstoff
71,00%
7.29%
18,93%
2,76%
Die Verbindung hat, bestimmt durch Dampfdruckerniedrigung, ein Molekulargewicht von etwa 500, Das Molekulargewicht wurde durch den massenspeklrometrisch ermittelten Wert von 507 bestätigt. Auf Grund der oben angegebenen Analysenergebnisse hat die Verbin-
dung die Bruttoformel C30H37O6N. Der spezifische Drehwert von Zygosporin A ist [«] Γ = - 7,5° (± 0,6) (c. = 0,55% in Dioxan). Zygosporin A zeigt keine charakteristische Absorptionsbande im Ultraviolettbereich. Das Infrarotabsorptionsspektrum von Zygosporin A, gemessen als Kaliumbromidpreßling, zeigt folgende Frequenzen (S = stark): 3404 (S), 3240,1742(S), 1703(S), 1693(S), 1645, 1605, 1498, 1456, 1427, 1375, 1351, 1277, 1233(S), 1178, 1127. 1112, 1049(S), 1039, 1009(S), 962(S), 936, 907(S), 780, 751(S), 726 und 706fS) cm"1. Ferner zeigt das Spektrum, gemessen als Chloroformlösung, folgende Frequenzen: (S = stark) 3409(S), 1742(S), 1702(S), 1605, 1495, 1455, 1435, 1371, 1350, 1322, 1302, 1270, 1111, 1069, 1043, 1006(S), 966(S) und 911(S) cm"1. Das kernmagnetische Resonanzspektrum von Zygosporin A, das in Deuterochloroform (CDCI3) bestimmt wurde, zeigt folgende Signale (S = Singulett, d = Dublett, m — Multiplen, ] = Kopplungskonstante):
9,07 (d, J =6,8, CH3)
3,82 (d, J =6,3, CH3)
20 OH
8,51 \s, CH3- C—
7,76(S1CH3COO-)
OH j 6,23 d-m,J =10,4,—C—Hj
5,42 (s), 4,95 (m, 1 H), 4,75 (m), 4,43 (m),
4,02 (d, J = 3,1), 3,76 (d, J = 3,1) und 2,77 fm) r .
Das so hergestellte Zygosporin A weist bei geringer akuter Toxizität eine hohe antiinflammatorische Aktivität auf. In der folgenden Tabelle I äind die Toxizität von Zygosporin A und einer repräsentativen Vergleichssubstanz, nämlich dem im Handel erhältlichen antiinfiammatorischen Mittel Phenylbutazon aufgeführt.
Tabelle I Zygosporin A Phenylbutazon
Toxizität (Maus) (mg/kg) (mg/kg)
36,0 1255
1,85 840
LD50 (oral)
LD50(S-C.)
In der folgenden Tabelle II sind die durch orale Verabreichung an Ratten ermittelten Ergebnisse hinsichtlich der Odeminhibierungsaktivität von Zygosporin A und der Vergleichssubstanz Phenylbutazon als ED50-Werte und als therapeutischer Index angegeben.
Tabelle II
Odeminhibierungsaktivität (bei oraler Verabreichung)
ED50 (mg/kg) Therapeutischer ED50 (mg/kg) Therapeu
2 Stunden nach Index 3 Stunden nach tischer
der Verab der Verab Index
reichung des reichung des
phlogistischen phlogistischen
Mittels Mittels
Zygosporin A 2,44 14,75 2,89 12,46
Phenylbutazon 215 5,84 ?34 5,36
Bemerkung:
Die Ratten wurden oral mit der zu untersuchenden Verbindung vorbehandelt, worauf das phlogistische Mittel, nämlich l%iges Carragheenin, subkutan verabreich, wurde. Das erzeugte Ödem wurde gemessen und mit dem verglichen, das bei Fehlen der Vorbehandlung erzeugt wurde.
Aus der vorstehenden Tabelle II ist zu erkennen, daß die erfindungsgemäße Substanz Zygosporin A auf Grund ihres therapeutischen Index der Vergleichssub^ stanz erheblich überleiten ist.
Die Odeminhibierungsaktivität Von Zygosporin A wurde ferner durch subkutane Verabreichung an Ratten geprüft. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse im Vergleich zu Phenylbutazon sind in der folgenden Tabelle IH zusammengestellt.
Tabelle III
Ödeminhibierungsaktivität (bei subkutaner Injektion)
ED50 (mg/kg) Therapeutsichef ED50 (mg/kg) Therapeu
2 Stünden nach Index 3 Stunden nach tischer
der Verab der Verab Index
reichung des reichung des
phlogistischen phlogistischen
Mittels Mittels
Zygosporin A 0,158 11,71 0,245 7,55
Phenylbutazon 204 4,11 263 3,19
Bemerkung:
Die Ratten wurden subkutan mit der zu untersuchenden Verbindung vorbehandelt, worauf das phlogistische Mittel, nämlich l%iges Carragheehiri, subkutan verabreicht wurde. Das erzeugte Ödem wurde gemessen und mit dem verglichen, das bei Fehlen der Vorbehandlung erzeuet wurde.
Aus der obigen Tabelle III ist zu ersehen, daß Zygosporin A auch bei subkutaner Verabreichung auf Grund des besseren therapeutischen Index der Vergleichssubstanz Phenylbutazon in der Ödeminhibierungsaktivität überlegen ist.
Weiterhin wurde die Abszeßinhibierungsaktivität von Zygosporin A an Ratten untersucht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse im Vergleich zu Phenylbutazon -sind in den folgenden Tabellen IV und V angegeben.
Testverbindung
Gesamtdosis
Abszeß
mittleres
Gewicht
Inhibierung
(mg/kg) (mg)
Zygosponn A
Phenylbutazon
2,5
50
1532 ± 76
1516 + 112
23,1
23,9
Tabelle IV
Abszeßinhibierungsaktivität		 ED50
(mg/kg)		 Therapeutischer
Index
8.62
ca. 50		 4.18
25
Zygosporin A
Phenylbutazon
Bemerkung:
Durch subkutane Injektion von 2%igem Carragheenin in die Kreuzgegend von Ratten wurde ein Abszeß erzeugt. Dann wurden die zu untersuchenden Verbindungen oral verabreicht. Eine Hälfte der Gesamtdosis wurde unmittelbar nach der Injektion und die übrige Hälfte 3 Stunden später verabreicht Die Ratten wurden 24 Stunden nach der Injektion getötet, worauf die Abszesse herausgeschnitten und gewogen wurden.
Bermerkung:
Ein Abszeß wurde durch subkutane Injektion von 2%igem
Carragheenin in die Kreuzgegend von Ratten erzeugt. Dann wurden die Testverbindungen oral verabreicht. Eine Hälfte der Gesamtdosis wurde unmittelbar nach der Injektion und die übrige Hälfte 2 Stunden später verabreicht. Die Ratten wurden 24 Stunden nach der Injektion getötet, und die Abszesse wurden herausgeschnitten und gewogen.
Aus den vorstehenden Tabellen IV und V ist ersichtlich, daß Zygosporin A bei oraler Verabreichung hinsichtlich der Abszeßinhibierungsaktivität etwa 20mal so wirksam ist wie Phenylbutazon.
Die Granulomininhibierungsaktivität von Zygosporin A wurde durch orale Verabreichung an sechs aufeinanderfolgenden Tagen geprüft. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen VI und VII im Vergleich zu Phenylbutazon angegeben:
Tabelle V
Abszeßinhibierungsaktivität		 Gesamt
dosis
(mg/kg)		 Abszeß
mittleres
Gewicht
(mg)		 87
106		 Inhibierung
(%)		 Tabelle VI
Granulationsinhibierungsaktivität		 Tages
dosis
(mg/kg)		 Granulom
mittleres
Gewicht
(mg)		 Granulations-
Inhibierung
(%)
Testverbindung 1 991 +
1728 +		 13,2 bU
Testverbindung
65 		1 277,6 + 15,1
264,6 ± 19,3		 4,7
030 227/20
Kontrolle
Zygosporin A		 Kontrolle
Zygosporin A
Foriscuunt»
'festverbindung Tagesdosis
Granulom
mittleres
Gewicht
Gfanulations-Inhibierung
(mg/kg) (mg)
Zyg,riporin A
Phenylbutazon
2,5
25
265,1 ±20,5
235,6 ± 15,8
4,5
15,1
Bemerkung:
Granulome wurden durch Einbettung eines carragheeningetränkten Filterpapierpfropfens in die lacterovetrale Region von Ratten erzeugt. Dann wurden die Testverbindungen sechs Tage lang einmal täglich oral verabreicht. 24 Stunden nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten getötet, und die Granu'ome wurden herausgeschnitten und gewogen.
Tabelle VIl
Granulationsinhibierungsaktivität
Testverbindung Tages
dosis		 Granulom
mittleres
Gewicht		 Granulations-
Inhibierung
(mg/kg) (mg) (%)
Kontrolle - 294 ± 8,4 -
Zygosporin A 5 263,9 ± 16,9 10
Phenylbutazon 50 199,5 ±11,5 34
Bemerkung:
Granulome wurden durch Einbettung eines carragheeningetränkten Filterpapierpfropfens in die lacterovetrale Region von Ratten erzeugt. Dann wurden die Testverbindungen sechs Tage lang einmal täglich oral verabreicht. 24 Stunden nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten getötet, und die G'anulome wurden herausgeschnitten und gewogen.
Aus den Tabellen VI und VII ist zu ersehen, daß die Granulominhibierungsaktivität von Zygosporin A wenigstens um ein Mehrfaches stärker ist als die von Phenylhnta7nn.
Ferner wurde die lokale Exsudationsinhibierungsaktivität von Zygosporin A an Ratten bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII im Vergleich zu Phenylbutazon aufgeführt.
Tabelle VIII
Exsudationinhibitionsaktivität
Testverbindung Dosis Exsudat
volumen
(mg) (ml)
Kontrolle - 53,9 ±3,5
Zygosporin A 50 6,8 ± 0,6
Zygosporin A 5 15,7 ±0,8
Zygosporin A 0,5 26,2 ± 3,0
Phenylbutazon 50 27,6 ± 1,7
Phenylbutazon 5 43,9 ±4,9
Bemerkung: Am ersten Tag wurde ein Voiumen von 20 ml Stickstoffgas den Ratten subkutan injiziert, um eine Tasche zu erzeugen, in deren Höhlung Op ml 10%iges Crotonöl injiziert wurden. Am 6. Tag wurden den Ratten die Testverbindungen lokal in die Tasche injiziert. Am 11. Tag wurden die Ratten getötet, und das Exsudatvolumen wurdegemessen.
ίο
Es ist ersichtlich, daß die Exsudafiortsinhibitierüngsaktivität von Zygosporin A etwa das lOOfache der Von Phenylbutazon beträgt.
Zygosporin A ist also im Vergleich zu einem im Handel erhältlichen nicht-adrenocorticalen antiinflammatorischen Mittel bemerkenswert wirksam. Es kann daher als starkes nicht-adrenocorticales antiinflammatorisches Mittel verwendet werden. Es kann in Form üblicher Zubereitungen angewandt werden.
Der aktive Bestandteil Zygosporin A wird in Dosiefurtgseinheiteh, z. B. zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger, verabreicht, besonders zur Linderung verschiedener Entzündungen und Ödeme, z. B. von Rheumatismus. Gewöhnlich wird die Zubereitung oral verabreicht, sie ist jedoch ebenso wirksam, wenn sie in anderer Weise verabreicht wird. Sie kann oral in verschiedenen Dosierungen, z. B. 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 20, 25 oder 30 mg verabreicht werden, der Dereich für
etwa 0,2 bis etwa 50 mg und vorzugsweise von etwa 1 bis 25 mg reichen. Sie kann verschiedenen pharmazeutischen Trägern zugesetzt oder in anderer Weise mit diesen angewandt werden. Es können verschiedene feste Träger angewandt werden, beispielsweise Lactose, Mannit, Maisstärke, Talkum und Magnesiumstearat sowie andere Tablettierhilfen und Füllstoffe. Diese Mischung kann dann je nach der gewünschten Handelsform tablettiert oder in einer Hartgelatinekapsel verkapselt werden. Gewöhnlich wird das Tablettieren bevorzugt. Die Menge an Träger odei* Verdünnungsmittel kann in Abhängigkeit von der gewünschten Tablettengröße oder davon, ob die Dosierung in verkapselter Form zubereitet wird, von 0 bis zu der höchsten Menge betragen, die den praktischen Mengengrenzen für eine Dosierungseinheit entspricht Gewöhnlich beträgt der Träger, mit dem das Medikament vermischt wird, nicht mehr als etwa 300 bis 500 mg.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung.
Eine Impfkultur wird nach dem folgenden Dreistufen-Verfahren hergestellt: (1) ein Kartoffel-Saccharose-Schrägagar wird durch Zugabe von 1,5% Agar zu einem Kartoffel-Saccharose-Medium hergestellt, das aus Kartoffelsaft (durch 20 Minuten langes Kochen von 200 g Kartoffelscheiben in 500 ml Wasser und 10 g Saccharose und Wasser (bis zu einer Gesamtmenge von 1 1) besteht Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC No. 20011) wird auf den Schrägagar inokuliert und bei ,27—28°C 7 bis 10 Tage gezüchtet, bis die Sporulation beendet ist (2) 100 ml eines Kartoffel-Saccharose-Mediums der gleichen Zusammensetzung wie oben beschrieben, werden in einen 500-ml-Kolben gebracht, sterilisiert und mit einer geeigneten Menge der Sporen der oben beschriebenen Schrägkultur inokuliert Die Züch-
tung wird bei 27—28°C 3 Tage unter Schütteln durchgeführt (3) Die Kulturbrühe (50 ml) wird auf ein neues Kartoffel-Saccharose-Medium (500 ml) überführt, das aus den gleichen Stoffen wie oben beschrieben besteht, in einem 2-I-Kolben enthalten ist und vorher sterilisiert wurde. Die Züchtung wird bei 27—28°C 4 Tage lang durchgeführt, und die so erhaltene Kulturbrühe wird als Inokulum verwendet
201 eines Kartoffel-Saccharose-Mediums der glei-
chen Zusammensetzung wie oben beschrieben, werden in einen 30-UKrugfermenter gebracht, sterilisiert und mit dem oben hergestellten Inokulum (500 ml) beimpft. Die Züchtung wird bei 27—280C 4 Tage unter Rühren (250 UpM) unter Belüften (20 I pro Minute) mit einem Druck von 0,5 bis 0,7 ^g/cm2 durchgeführt.
Man versetzt die Kulturbrühe mit 500 g Celite (Diatomeenerde) u/id zentrifugiert, um das Mycel (1,1 kg einschließlich des Celits) und die überstehende Flüssigkeit (17 I) zu erhalten.
Man versetzt das Mycel mit 1,5 1 Methanol und rührt die Mischung 2 Stunden bei Zimmertemperatur. Nach Abfiltrieren wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird nacheinander mit Wasser, 2 η Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 50 bis 60°C eingedampft. Dabei verbleibt ein οϋσ2Γ Rückstand der eus Aceton zu 18(1 Γπσ Zugosporin A umkristallisiert wird.
Die überstehende Flüssigkeit (17 I) wird mit 3x71 Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt (ca. 201) wird nacheinander mit Wasser, 2 η Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 50 bis 60°C eingedampft. Durch Umkristallisieren des Rückstands aus Äther oder Aceton werden 277 mg kristallines Zygosporin A erhalten.
Umkristallisieren aus Aceton liefert reines Zygosporin A als farblose Nadeln vom F. 268-2700C.
Beispiel 2
Das Verfahren von Beispiel 1 wird mit Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC No. 20012) an Stelle von Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC No. 20011), wiederholt. Zygosporin A wird aus der Kulturbrühe in der gleichen Ausbeute wie in Beispiel 1 gewonnen.
35
40
Beispiel 3
Eine Impfkultur wird nach dem folgenden Dreistufen-Verfahren hergesteilt; (1) Aus 200 g Kartoffeln, 10 g Saccharose, 5 g Agar und 1 1 Wasser wird ein Kartoffel-Saccharose-Agar-Schrägkulturmedium hergestellt. Zygosporium masonii MFG^612 (ATCC No. 20011) wird auf das Schrägkulturmedium inokuliert und bei 28° C 7 Tage gezüchtet. (2) 100 ml eines wäßrigen Nährmediums, das 3,0% Glucose, 2,0% Pepton und 0,5% Natriumchlorid enthält, (pH 6,0) wird in einen 500-ml-Kolben gebracht, sterilisiert und mit Sporen aus der oben beschriebenen Schrägkultur beimpft. Die Züchtung erfolgt bei 280C 4 Tage unter Schütteln (140 Umkehrungen pro Minute mit 7-cm-Amplitude). (3) Die Kulturbrühe (30 ml) wird auf ein neues Nährmedium (700 ml) überführt, das aus den gleichen Stoffen besteht, wie sie in Stufe 2 verwendet wurden, in einem 2-l-Kolben enthalten ist und vorher sterilisiert wurde. Die Züchtung wird bei 28° C 3 Tage unter Schütteln (300 Wechsel/Minute) durchgeführt, und die so erhaltene Kulturbrühe wird als Inokulum verwendet.
70 I eines wäßrigen Nährmediums, das 3,0% Glucose, 2,0% Pepton und 0,5% Natriumchlorid enthält (pH 6,8), wird in einen 100-1-Tank gebracht und mit 84 g des Antischaummittel Polypropylenglycol, hergestellt von der Dow Chemical Company, versetzt. Die Mischung wird sterilisiert. Das Medium wird mit dem oben beschriebenen Inokulum (2,1 1) beimpft. Die Züchtung erfolgt bei 28°C 3Tage unter Rühren (370—380 Umdrehungen pro Minute) unter Belüften (70 1 pro Minute) mit einem Druck von 0,7 kg/cm2.
Die Kulturbrühe wird zur Entfernung des Mycels zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit (67 1) wird mit 2 χ 20 I Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft, wodurch man 5,7 g rohes Zygosporin A erhält. Umkristallisieren aus Aceton liefert 5,4 g reines Zygosporin A als farblose Nadeln vom F. 268-270°C(Zers.).

Claims (3)

  1. Patentansprüche:
    I, Zygosponn A der
    O
    Η     Formel
    CH3     Il
    Tr r< /~<     -C-OH
    "CH
    Ν     CH10 CH"
    I         9CH,
    ι "     I
    C-O-C-CH3
    /15\ Il
    /HO         CH8
    Il     Il
    7CH
    HO
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Zygosporin erzeugenden Stamm von Zygosporium masonii ATCC Nr. 20011 und Zygosporium mycophilum ATCC Nr. 20012 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen etwa 50 bis 150 Stunden bei etwa 25 bis 32° C züchtet und die so erzeugte antiinflammatorische Substanz ati·;der Fermentationsbrühe gewinnt.
  3. 3. Arzneimittel, enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1 neben üblichen Träger- und Zusatzstoffen.
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