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Salbomycin und Verfahren zu seiner Herstellung
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Die Erfindung betrifft eine völliy neuartige, biologisch aktive Substanz,
die im folgenden Salbomycin genannt wird und interessante Eigenschaften bezüglich
ihrer Verwendung in der Human- und Tiermedizin besitzt.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Salbomycin,
sowie Präparate und pharmazeutische Mittel, die Salbomycin enthalten- einschließlich
der Züchtung von Salbomycin produzierenden Mikroorganismen und die Aufarbeitung
der entstandenen Kulturen.
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Salbomycin zeigt einerseits eine beachtliche antibiotische Wirksamkeit,
beispielsweise gegen Trichomonaden, andererseits ist es in der Lage, eine zytostatische
Wirkung zu entfalten. Diese Eigenschaften hängen mit der speziellen molekularen
Struktur des Salbomycins zusammen, die dieses Antibiotikum befähigen, besondere
Aktivitäten beispielsweise an biologischen Membranen zu entfalten. So eignet sich
Salbomycin zum Einsatz auf allen jenen Gebieten, wo FehLfunktionen durch die oben
erwähnten Eigenschaften des Salbomycins behoben werden können.
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Das Salbomycin ist durch die Strukturformel, die in der Fig. 1 wiedergegeben
ist, gekennzeichnet. Die Konfiguration der asyiretrisch substituierten Kohlenstoffatome
ist Elier bei durch die Buchstaben R und S beschrieben (zur Bedeutung von R und
S vergleiche z.B. L.F. Fieser und M. Fieber "Lehrbuch der Organischen Chemie", erschienen
im Verlag Chemie, Weinheim, 2. verbesserte Auflage, 1972, S. 90 f.).
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Gegenstand der vorliegenden Erfinduny ist somit neben Salbomycin auch
ein Verfahren zur Herstellung von Salbomycin, das dadurch gekennzeichnet ist7 daß
man einen Salbomycinerzeugenden Streptomyces in einem Fermentation smedium im Submers-Verfahren
kultiviert t und das Salbomycin aus dem
Myzel und dem Kulturfiltrat
extrahiert und reinigt.
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Erfindungsgemäß wurde zur Herstellung des Salbomyclns der Streptomyces
albus ATCC 21 838 (DSM 2566) verwendet. Es können aber auch seine Varianten und
Mutanten eingesetzt werden, ja sogar andere Streptomyceten, die von Streptomyces
albus abweichen, aber in der Lage sind, Salbomycin zu bilden. Die taxonomischen
Eigenschaften des Streptomyces albus (ATCC 21 838 - DSM 2566) sind von Miyazaki
et al.
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in J. Antibiotics 27, S. 815-816 (1974) beschrieben.
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Zur Gewinnung des Salbomycins wird der Streptomyces albus ATCC 21
838 (DSM 2566) in einem wässrigen Nährmedium, vorzugsweise unter submersen aeroben
Bedingungen gezüchtet, bis man eine ausreichende Konzentration des Salbomycins erhält.
Das Nährmedium enthält einerseits Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Kohlenhydrate,
andererseits Stick.stoffquerlen, wozu jede geeignete Stickstoffvcrbindung zählt,
wie z.B. proteinhaltige Sterialien. Bevorzugte Kohlenstoff liefernde Verbindungen
sind Glucose, Saccharose, Glycerin, Malzextrakt, Stärke, Öle, Fette und dergleichen.
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Bevorzugte Stickstoff liefernde Substanzen sind beispielsweise Maisquellwasser,
Hefeextrakte, Sojamehl, Fischmehl, Magermilchpulver, angedautes Casein oder Fleischextrakt.
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Es können auch sogenannte "synthetische" Nährlösungen verwendet werden,
die jedoch häufig niedrigere Ausbeuten zur Folge haben. Es kann weiterhin nützlich
sein, Spurenelemente, wie z.B. Zink, Magnesium, Eisen, Kobalt oder Mangan dem Fermentationsmedium
zuzugeben.
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Die Fermentation, die zur Bildung des Salbomycins führt, kann in an
sich bekannter Weise in einem weiten Temperaturbereich durchgeLührt werden, beispielsweise
bei Temperaturen zwischen 10 und 400C, vorzugsweise zwischen ungefähr 25 und 350C.
Den pH-Wert des Mediums hält man ebenfalls bei Werten, die dem Wachstum der Mikroorganismen
förderlich sind, beispielsweise bei Werten zwischen 4,0 und 8,0, vor-
zugsweise
zwischen 5,0 und 7,0. In Abhängigkeit vom Nährmedium, wie z.B. seiner Zusammensetzung
und Konzentration und den Fermantationsbedigungen, wie z.B. Belüftungsrate, Temperatur
oder pH-Wert, erfolgt die Bildung des Salbomycins in der Kulturlösung gewöhnlich
nach etwa 2 bis 10 Tagen.
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Das Salbomycin kann sich sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat
der Fermentaticnen befinden. Die Hauptmenge des Salbomycins ist im allgemeinen im
Mycel zu finden.
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Deshalb wird vorteilhafterweise das Mycel von der wässrigen Phase,
beispielswe: e durch Filtration oder Zentrifugation -etrennt und das Salbomycin
aus den jeweiligen Phasen mit geeigneten Lösungsmitteln, wie z.B. Methanol, Methylenchlorid,
Aceton, Butanol oder Essigester oder mit Mischungen dieser Lösungsmittel extrahiert.
Zur Reinigung des Salbomycins kann eine große Zahl von Verfahren, wie beispielsweise
Lösungsmittelextraktion, Verteilungschromatographie, Graig-Verteilung, Kristallisation,
Chromatographie an verschiedenen Trägern, wie z.B. Aluminiumoxid, Molekularsieben,
Kieselgel oder Adsorptionsharzen verwendet werden.
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Ein bevorzugtes Anreicherungsverfahren zur Gewinnung des Salbomycins
besteht darin, daß man das Antibiotikv1za aus dem Mycel vorzugsweise mit Aceton
oder Methanol oder aus der wässrigen Phase mit einem geeigneten, mit Wasser nicht
mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Butanol, Ethylacetat, Chloroform
oder Methylenchlorid extrahiert.
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Den Extrakt trocknet man dann nach bekannten Methoden, wie z.B. Zugabe
von üblichen Trockenmitteln, und engt Ihn im Vakuum ein, wobei das Rohp:odukt anfällt.
Das Rohprodukt kann dann durch eine oder mehrerc der obengenannten Methoden, vorzugsweise
durch wiederholte Chromatographie an Kieselgel bis zur Reinsubstanz angereichert
werden. Der letzte Schritt der Isolierung ist vorteilhafterweise die Kristallisation,
beispielsweise aus Methanol, Tetrahydrofuran oder Benzol.
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Die Kristallmasse wird dann nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise
durch Abfiltrieren abgetrennt und getrocknet.
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Das reine Salbomycin ist ein farbloser, kristalliner Feststoff, dessen
Elementaranalyse die Anwesenheit von Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff, sowie
das Fehlen von Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Halogenen im Molekül ergibt. Das
Ultraviolette Licht wird in Methanol vom Salbomycin absorbiert mit #max = 252 nm,
(E1 cm1 % = 570).
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Der Schmelzpunkt beträgt 189 - 1900C, die spezifische 20 Drehung [α]D
= -52 <c = 0,5 in Chloroform). Salbomycin ist in Chloroform, Methylenchl.orid,
Aceton und aliphatischen Alkoholen gut löslich, in Wasser und Petroläther ist die
Löslichkeit schlecht. Die biologischen Eigenschaften des Salbomycins sind im Hinblick
auf seine Anwendung als Therapeutikum, Wachstumsförderer oder als Konservierungsstoff
interessant.
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Als Beispiel für das mikrobiologische Wirkungsspektrum seien folgende
Werte genannt.
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Testorganismen Minimale Hemmkonzentration [mcg/ml] Staph. aureus SG
511 1,56 Staph. aureus 285 1,56 Staph. aureus 503 1,56 Steptoc. pyogenes 308 A 1,56
Streptoc. pyogenes 77 A 1,56 Streptoc. faecium D 3,13 Pseudom. aeruginosa ATCC 9027
>100,0 E. coli 055 >100,0 Trichophyton mentagrophytes (100/25) >125 Candida
albicans (200/175) 125 Aspergillus niger (500/284) >125 Trichomonas vaginalis
(carneri) 1,95 Entamoeba histolytica 15,6 Eimeria tenella in vivo Wirksamkeit Leukämiezellen
der Maus, L-1210 0,2
Salbomycin entfaltet ganz -allgemein einen
Einfluß auf biologische Membranen. Dieser Effekt ist z.B. über das Aktionspotential
oder andere Meßgrößen zu ermitteln. Eine positive Wirkung des Salbomycins ist auch
zur Imnunstimulation im sogenannten Makrophagentest nachweisbar und meßbar, ebenso
wie die zytostatische Aktivität. Die ein flussung von biologischen Membranen ist
allgemein in der Human und Tiermedizin häufiy erforderlich. Salbomycin ist überall
dort von großem Wert, wo seine ausgeprägte Fähiykeit, biologische Membranen in der
richtigen Richtung verändern zu können, nutz werden kann.
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Die Erfindung betrifft auch Präparate, insbesondere Arzneipräparate,
beispielsweise zur topischen oder parenteralen Applikation, die durch einen Gehalt
an Salbomycin charakterisiert sind. Das Salbomycin kann auch in mombination mit
anderen Wirkstoffen zur Anwendung kommen.
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Präparate, die Salbomycin als Wirkstoff enthalten, können hergestellt
werden, indem man Salbomycin mit einem oder mehreren pharmakologisch verträglichen,
an sich bekannten trägerstoffen oder Verdünnungslaitteln vermischt und in eine für
die gewünschte Applikation geeignete Zubereitungsform bringt.
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Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur weiteren Erläuterung
der Erfindung, schränken sie jedoch nicht darauf ein.
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Beispiel 1 Die Impfstoffanzucht erfolgt - wie in der mikrobiologischen
Produktion üblich - aus eincr gefriergetrockneten Dauerform des Organismus Streptomyces
albus ATCC 21 838 / DSM 2566 über Einzelkoloniepassage und Schrägröhrchen. Die für
die Fermentation notwendige Massenproduktion an Sporen wird ebenfalls auf festem
Nährhoden in Roux-Flaschen durchgeführt.
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Agaymedium für Platte, Schrägröhrchen und Roux-Flasche: Glycerin 2,6
% Hefeextrakt 0,2 % Kochsalz 0,1 % Agar-Agar 2,0 90 pH-Wert 7,0 Sterilisation bei
1200C 20 min.
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Inkubation bei 30°C 9 Tage.
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Mit der Sporenabschwemmung von der Roux-Flasche in 1 00 ml sterilem
Wasser wird eine vegetative Fermentationsvorstufe in einer Fernbachflasche beimpft
(Arbeitsvolumen 1,2 1).
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Vorstufenmedium: Glucose 4,0 % Sojamehl 1,0 % Trockenhefe 1,0 % Calciumcarbonat
0,2 % pH-Wert 6,7 Sterilisation 1200C 20 min Inkubation bei 28°C 2 Tage auf einer
Schüttelmaschine mit 150 UpM und 5 cm Aplitude
2. Vorfermentation:
Nach 48 Stunden Vorkultur (s.o.) wurden 200 1 Vorfermentationsmedium mit 1,2 1 Impfstoff
aus der Fernbach-Flasche inokuliert.
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Medium: Sojamehl 1,0 % Trockenhefe 1 , 0 % Calciumcarbonat 0,2 g Glucose
4,0 % pH-Wert 6,3 Sterilisation 120°C 30 min.
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Inkubation bei 33°C unter Rührung mit eine Umfangsgeschwindigkeit
5 m/sec. und Belüftung mit 0,6 vvm 2 Tage.
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3. Hauptfermentation: Nach 48 Stunden Vorfermentation (s.o.) werden
2400 1 Haupfermentationsmedium mit 35 -l Kulturbrühe aus der Vorfermentation beimpft.
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Medium: Soja-Ol 10,0 % Glucose 0,5 90 Sojamehl 0,5 % Weizenkeime 0,5
% Ammonsulfat 0,3 % Kochsalz 0,1 % Calciuncarbonat 0,5 % Kaliumchlorid 0,5 % Di-Kalium-Hydrogenphosphat
0,1 % pH-Wert 7,5 Sterilisation bei 120°C 20 min Inkubation bei 330C unter Rührung
mit einer Umfangsgeschwindigkeit von 5 m/sec. und Be-
lüftung von
0,76 vvm 9 Tage.
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Der pH-Wert fällt innerhalb ca. 48 Stunden auf 5,5 und wird mit Natriurrh,7drorid
(30 gig) auf 5,5 - 6,0 gesteuert.
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Ausbeute: ca. 1.600 kg Salbomycin enthaltende Kuklturlösung.
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Beispiel 2 1 80 l Kulturlösung, gewonnen nach Beispiel 1, wurden durch
Zentrifugieren in Zellmasse und wässrigen Uberstand getrennt und die Zellmasse mit
60 1 Aceton, der wässrige Überstand mit 75 1 n-Butanol extrahiert. Die klaren organischen
Phasen wurden vereinigt und im Vakuum auf 6 1 einbeengt Die wasserfreie, noch butanolhaltige
Suspension versetzte man mit 60 1 Petroläther. Der hierbei entstandene Niederschlag
wurde abzentrifugiert und mit Methanol ausgewaschen. Die Methanolphase enthielt
das Salbomycin als Rohprodukt, das im Vakuum getrocknet wurde. 25 g dieses Rohmaterials
wurden in 50 ml Chloroform-Methanol (Mischungsverhältnis 95:5) gelöst und auf eine
Säule aufgetragen, die 500 g Kieselgel in Chloroform enthielt. Die Chromatographiesäule
hatte die Maße 5,5 x 45 cm. Nach dem Auftrag wurde der Säuleninhalt zunächst mit
2 1 Chloroform, dann mit 2 1 Chloroform-Methanol (95:5) gewaschen und anschließend
mit 2 1 Chloroform-Methanol (90:10) eluiert.
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Das Eluat wurde fraktioniert aufgefangen, die gegen Ende der Elution
auftretenden salbomycinhaltigen Fraktionen vereinigt und im Vakuum auf 1/30 des
Volumens eingeengt.
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In diesem Konzentrat kristallisierte das Salbomycin. Es wurde abgetrennt,
in Methanol umkristallisiert und getrocknet. Man erhielt 1 g Salbomycin.
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- L e e r s e i t e -