DE2035814B2

DE2035814B2 - Pleuromutilin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE2035814B2
Application number: DE2035814A
Authority: DE
Inventors: Ernst Dr. Kundl Brandl; Franz Woergl Knauseder
Original assignee: Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1969-07-21
Filing date: 1970-07-18
Publication date: 1980-05-29
Also published as: SE388628B; NL7010227A; US3716579A; DE2035814C3; FR2059539A1; JPS5137350B1; DK138315B; IL34955A; DK138315C; AT301752B; JPS529759B1; PL85120B1; CA940851A; SE402451B; CS149921B2; DE2035814A1; GB1303038A; IL34955A0; ES381941A1; FR2059539B1

Description

Die Erfindung betrifft Pleuromutilin-Derivate der Formell,

O—C—CH₂—R O CH

CH=CH,

worin R für eine

CH₃

CH₃ - (CH₂)? - CH = CH - (CH₂)? - COO-, CH₃-(CH₂J₄-CH= CH-CH₂-CH=CH-(CH₂)?-COO-, CH₃-(CH₂), - CH = CH - (CH₂)? - COO-Gruppe

oder für Wasserstoff steht,

sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Isolierung.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R obige Bedeutung besitzt, einen Organismus der Spezies Ciitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. (NRRL 3100) bzw. dessen Variante (NRRL 3279), der Spezies Ciitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer (NRRL 3473) sowie der Spezies Ciitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. joss. (NRRL 3474) bzw. deren Varianten oder Mutanten in einer wäßrigen, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthal tenden Nährlösung in Gegenwart pflanzlicher oder

tierischer öle züchtet und zur Isolierung aus dem gewonnenen Rohprodukt die Verbindungen in an sich bekannter Weise abtrennt oder

b) zur Herstellung von 14-Desoxy-14-acetoxymutilin

4·) der Formel Ia

O—C—CH,

O CH

(la)

Mutiiin mit Hilfe eines Organismus der Spezies Ciitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. (NRRL 3100) bzw. dessen Variante (NRRL 3279), der Spezies Ciitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer (NRRL 3473) sowie der Spezies Ciitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. Joss. (NRRL 3474) bzw. deren Varianten oder Mutanten oder mit Enzymextrakten bzw. Trockenmycelen dieser Mikroorganismen in einer wäßrigen, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung enzymatisch ace-

tyliert und zur Isolierung aus dem gewonnenen Rohprodukt die Verbindung in an sich bekannter Weise abtrennt

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen gehören zur Familie Tricholomataceae, der Ordnung Agricales und Klasse Basidiomycetes. Kulturen dieser Organismen sind bei der Fermentations Division of the Northern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, Illinois, unter den oben angegebenen Nummern hinterlegt.

Die in Verfahrensvariante a) beschriebene Fermentation erfolgt üblicherweise nach dem Submersverfahren, wenn gleich such die Anwendung des Oberflächenverfahrens möglich ist Als Kohlenstoffquellen sind Zucker, insbesondere Glucose, Lactose oder Stärke, und als Stickstoffquellen anorganische oder organische Stickstoffverbindungen, wie Natriumnitrat, Ammoniumsulfat, Hefeautolysat oder Cornsteepliquor, brauchbar. Diese decken in ihren unreinen Fornr^n gleichzeitig den üblichen Mineralstoffbedarf. Der Fermentationsverlauf ist bezüglich pH-Änderung, Sauerstoffaufnahme, Nährstoffumsatz und Bildung der gewünschten Produkte mit einer Penicillinfermentation vergleichbar. Gärtemperaturen zwischen 25 und 28° C führen unter gutem Wachstum zu hohen Ausbeuten. Zusätze von Maisöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Spermöl und anderen ölen tierischer und pflanzlicher Herkunft werden zur Bildung der erfindungsgemäßen Pleuromutilinderivate vorzugsweise in Mengen zwischen 0,05 und 5% (Vol.-°/o) angewendet. Die Fermentationsdauer hängt entscheidend von den angewendeten Bedingungen ab. Normalerweise liegt sie bei 3 — 5 Tagen; sie kann jedoch auch darunter oder darüber liegen. Die gewünschten Produkte werden teils in das umgebende Medium abgeschieden, teils auch in den Zellen akkumuliert. Ihre Isolierung kann daher aus dem Kulturfiltrat und/oder aus dem abgetrennten, gegebenenfalls getrockneten, Mycel erfolgen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der in Verfahrensvariante a) beschriebenen Fermentation besteht darin, daß man den Mikroorganismus der Spezies Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. (NRRL 3100) zuerst in einer Vorkultur, die als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, Malzextrakt und ferner Bohnenmehl, Hefeextrakt, Agar, Pepton sowie Mineralsalze enthält, züchtet und den dabei erhaltenen Fermentationsbrei anschließend zur weiteren Züchtung in eine Fermentationslösung einträgt, die als Kohlehydratquelle Glucose und als Stickstoffquelle Bierhefeautolysat sowie Mineralsalze enthält. Der dabei erhaltene Fermentationsbrei wird gegebenenfalls erneut in eine Fermentationslösung der letztgenannten Art zur weiteren Züchtung eingetragen. Nach beendeter Züchtung werden die so erhaltenen Pleuromutilinderivate in bekannter Weise isoliert. Gegebenenfalls erfolgt eine Auftrennung des Substanzgemisches in ein Pleuromutilinfettsäureestergemisch und das H-Desoxy-H-acetoxymutilin.

Eine weitere Ausführungsforrr. der obigen Verfahrensvariante a) kann jedoch auch darin bestehen, daß man eine analog zu oben gezüchtete Vorkultur in eine Fermentationslösung einbringt, die als Kohlenstoffquelle Glucose und als Stickstoffquelle Preßhefeautolysat sowie Mineralsalze enthält. Der dabei erhaltene Mycelbrei wird erneut in eine Fermentationslösung obiger Art überführt. Nach Beendigung dieser Züchtung bringt man den so gewonnenen Fermentationsbrei schließlich in eine weitere Fermentationslösung, die als Kohlenstoffquelle Glucose und als Stickstoffquelle Sojabohnen-Stickstoff sowie Mineralsalze enthält Nach Beendigung dieser letzten Züchtung wird das dabei erhaltene Substanzgemisch in bekannter Weise isoliert, wobei eine zu dem erstgenannten Verfahren analoge Aufarbeitung erfolgen kann.

Bei der enzymatischen Acetylierung von Mutilin zu 14- Desoxy- 14-acetoxymutilin gemäß Verfahrensvariante b) kann als Enzymträger das durch Submers- oder Oberflächenverfahren gewonnene Mycel der Mikroorganismen dienen. Trockenmycel oder Enzymextrakte der beschriebenen Fungi können jedoch ebenfalls verwendet werden. Die Umwandlungsrate ist von der angebotenen Belüftung abhängig. Für große Umwandlungsraten liegt die Substratkonzentralion beispielsweise zwischen 0,5 und 5,0 g Mutilin pro Liter. Die Acetylierung erfolgt mit Vorteil in einem gepufferten Medium bei pH-Werten zwischen 4,5 und 8,0 unter Zusatz einer Kohlenstoffquelle und guter Belüftung. Als Kohlenstoffquelle kommen Zucker, wie Glucose oder Lactose, in Frage. Es lassen sich jedoch auch Maisöl, Spermöl, Sonnenblumenöl, Oelsäuremethylester, Palmitinsäure. Glycerin, Aethanol oder Aminosäuren verwenden. Die Konzentrationen hierfür liegen beispielsweise zwischen 0,5 und 5 Gew.-%. Durch Zusatz von Cu-Jonen in geringer Konzentration, vorzugsweise 10 ppm, wird die Acetylierung stimuliert.

Eine bevorzugte Ausführungsform der obigen enzymatischen Acetylierung von Mutilin zu 14-Desoxy-14-acetoxymutilin besteht darin, daß man die gemäß der

jo Verfahrensvarianten a) erhaltene Vorkultur des Mikroorganismus NRRL 3100 von Clitopilus passeckerianus in eine Fermentationslösung bringt die als Kohlenstoffquelle Glucose und als Stickstoffquelle Preßhefeautolysat sowie Mineralsalze enthält Der

j5 dabei erhaltene Mycelbrei wird in einer Fermentationslösung, die unter anderem Cornsteepliquor und Spermöl enthält, gezüchtet und die so gewonnene Züchtung endlich in einem Replacementmedium suspendiert das mit Phosphat gepuffert ist und Maisöl als Kohlenstoffquelle enthält Die Substratkonzentration beträgt hierbei 3 g Mutilin pro Liter Kultur. Die Aufarbeitung der Ansätze zu dem gewünschten 14-Desoxy-14-acetoxymutilin, welches nach 48stündiger Belüftung in hoher Ausbeute erhalten wird, erfolgt in bekannter Weise.

Die Struktur der erfindungsgemäß hergestellten Pleuromutilinfensäureester ist durch UV- und IR-Spektren, Abbaureaktionen, Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie gesichert Die Dünnschichtchromatographie der durch Umesterung der Pleuromutilinfettsäureester erhaltenen Fettsäuremethylester ergibt auf AgNO3-imprägnierten Kieselgelplatten, auf denen eine Trennung der verschiedenen Isomeren möglich ist, den Hinweis auf Oelsäure, Linolsaure und Gadoleinsäure. Die Struktur des H-Desoxy-H-acetoxymutilins ist durch IR-Spektren, Abbaureaktionen und Synthese von Pleuromutilin ausgehend gesichert

Die erfindungsgemäß erhaltenen Pleuromutilin-Derivate stellen wertvolle Antibiotika dar und bilden einen hervorragenden Zusatz zu Fertigfuttermischungen.

Infolge der geringen Dosierung im Fertigfutter und wegen ihrer schlechten Resorption im tierisehen Organismus besteht beim Verzehr damit behandelter Tiere keine Gefahr einer Resistenzentwicklung von Krankheitserregern im Menschen. Außerdem werden die erfindungsgemäßen Pleuromutilin-Derivate nicht im Humanbereich eingesetzt, so daß die dort üblichen Antibiotika ihre volle Wirksamkeit behalten.

Die zu verabreichende Dosis an Pieuromutilin-Deri-

vaten der Formel I beträgt für Geflügel zweckmäßigerweise 2,5 bis 90 mg pro kg Fertigfuttermischung. Für Schweine liegt die entsprechende Dosis bei 10 bis 180 mg pro kg Fertigfuttermischung. Bei Kälbern und Mastrindern sollen die Verbindungen der Formel I in solchen Dosen verfüttert werden, daß vom Tier täglich etwa 25 bis 120 mg Wirkstoff aufgenommen werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten Pleuromutilin-Derivate zeigen ferner eine günstige Wirkung gegen tierpathogene Keime, so daß sie in der Tierheilkunde verwendet werden können.

Beispiel 1
Fermentation

Zwei Kulturen von Clitopilus passeckerianus (NRRL 3100) auf Agar-Nährböden werden mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung abgespült, worauf man mit je 3 ml der erhaltenen Suspension jeweils 60 ml steriler Fermentationsnährlösung beimpft, die sich in zwei 500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben befinden.

Nährboden für Schrägagar	Glucose	10,0 g
Bohnenmehl	Bierhefeautolysat-Stickstoff	0,5 g
KH₃PO₄	KH₂PO₄	1,0 ml
FeCIj(I %ige Lösung)	MgSO₄ ■ 7 H₂O	0,1g
Hefeextrakt	Ca(NO₃J₂	50,0 g
Malzextrakt	NaCl	1,0 g
Pepton	FeSO₄ · 7 H₂O	15,0 g
Agar	mit Aqua dest auf 1000 ml
mit Aqua dest. auf 1000 ml	auffüllen;
auffüllen;	pH vor der Sterilisation: 6,0
natürliches pH.
Fermentationsnährlösung	50,0 g/l
1,0 g/l
1,0 g/l
0,5 g/l
0,5 g/l
0,1 g/l
0,05 g/l

Nach 120 Stunden Fermentation bei 25° C auf einer Rundschüttelmaschine mit 40 mm Hub und 250 U/min wird der Inhalt der zwei 500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben dickbreiig. Je 10 ml davon werden zur Beimpfung von zehn 2-Liter-Erlenmeyer-Weithalskolben verwendet, die mit je 200 ml der obigen sterilen Fermentationsnährlösung gefüllt sind. Die Bebrütung erfolgt unter denselben Bedingungen wie bei der Heranführung der Vorstufe. Nach 72 Stunden wird mit dem in den zehn 2-Liter-Erlenmeyerkolben enthaltenen Fermentationsbrei (jeder Kolben enthält 200 ml) ein mit 40 Liter obiger steriler Fermentationsnährlösung gefülltes Fermentationsgefäß beimpft, das mit den Einrichtungen für eine Submersfermentation nach dem Schikanensystem ausgestattet ist Man fermentiert 120 Stunden bei 25° C unter Rühren und Belüften, worauf der dickbreiige Inhalt in einen größeren Fermenter überführt wird, der mit 140 Liter der gleichen sterilen Nährlösung versehen ist Danach wird Spermöl in einer Konzentration von 2VoL-% (2,81) zugesetzt Nach 72stündigem Rühren und Lüften bei einem Gegendruck von 0.8 atü wird die Fermentation abgebrochen. Das Erntegut wird über eine Druckfilternutzsche abgepreßt und der Mycelkuchen in einem Hordentrockner bei ca. 40⁰C getrocknet. Auf diese Weise erhält man 3,8 kg Trockenmycel, aus dem später die gewünschten Substanzen isoliert werden.

Beispiel 2
Fermentation

Von einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Clitopilus passeckerianus (NRRL 3100) wird das Mycel mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung abgespült. Mit je 5 ml der erhaltenen Suspension werden 4 Stück 500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben beimpft, die mit je 50 ml folgender steriler Fermentationsnährlösung beschickt sind.

Preßhefeautolysat-Stickstoff	1,5 g/l
Glucose	30,0 g/l
Dextrin	10,0 g/l
KH₂PO₄	4,0 g/l
(NH₄J₂SO₄	5,0 g/l
mit Aqua dest. auf 1000 ml
auffüllen;
pH vor der Sterilisation: 6,0

Die Kolben werden 100 Stunden auf einer Längsschüttelmaschine mit 10 cm Ausladung und 90 Bewegungen pro Minute bei 25°C geschüttelt, worauf mit dem Inhalt je 6 Stück 2-Liter-Erlenmeyerkolben beimpft werden, die mit je 400 ml der gleichen sterilen Fermentationsnährlösung beschickt sind. Nach 36stündigem Schütteln unter den obigen Bedingungen wird der erhaltene Mycelbrei in ein 100 Liter fassendes Submersgefäß überführt, das 50 Liter folgender steriler Fermentationsnährlösung enthält:

Sojabohnen-Stickstoff	2,0 g/l
Rohrzucker	20,0 g/l
Glucose	20,0 g/l
mit Aqua dest. auf 1000 ml
auffüllen;
pH vor der Sterilisation: 6,5
CaCÜ3 (getrennt sterilisiert)	5,0 g/I

Nach 120stündiger Fermentation wird mit dem Inhalt dieses Gefäßes ein Submerstank beimpft, der 1000 Liter der letztgenannten Fermentationsnährlösung enthält. Es wird 96 h belüftet und gerührt (0,5 Liter Luft/Liter Nährlösung/min; 210 Umdrehungen/min.) Danach wird Spermöl in einer Konzentration von 2,5 Vol.-% (2,51) zugesetzt Nach einem anfänglichen Absinken des pH-Wertes auf 5,5 steigt dieser nach 48 Stunden auf 6,8 an, hat nach 72 Stunden einen Wert von 6,5 und erreicht gegen Fermentationsende 7,0. Das Mycelgewicht beträgt nach 48 Stunden 18 g/l. Das Mycel wird über einen Saugzellenrundfilter abfiltriert und in einem Hordentrockner bei ca 40° C getrocknet Auf diese Weise erhält man 193 kg getrocknetes Mycel, welches den Hauptanteil der gewünschten biologisch aktiven Verbindungen enthält

Beispiel 3
Fermentation

Von einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Clitopilus passeckerianus (NRRL 3279) wird das Mycel mit physiologischer Kochsalzlösung abgespült Mit je 7 ml der erhaltenen Suspension werden 2 Stück 500-ml-Erlenmeyerkolben beimpft, die mit je

50 ml der im Beispiel 2 beschriebenen Fermentationslösung für die Vorstufe beschickt sind.

Die Kolben werden auf einer Rundschüttelmaschine mit 40 mm Hub und 260 U/Minute bei 25°C während 120 Stunden geschüttelt, worauf mit dem Inhalt 4 Stück 2-Liter-Erlenmeyerkolben beimpft werden, die mit je 500 ml der gleichen sterilen Fermentationslösung beschickt sind. Nach 48stündigem Schütteln unter den obigen Bedingungen wird der erhaltene Mycelbrei in einen 12 Liter fassenden Glasfermenter überführt, der mit 7,5 Liter folgender steriler Nährlösung gefüllt ist;

Sojabohnenstickstoff l,8g/Litcr Rohrzucker 30,0 g/Liter Glukose 10,0 g/Liter Spermöl 5,0 g/Liter

mit Aqua dest. auf 1000 ml

auffüllen,

pH vor Sterilisation 6,5,CaCO₃

(getrennt sterilisiert)

Nach 120stündiger Fermentation unter Belüftung und Rührung bei 25⁰C beträgt das Trockenmycelgewicht ca. 12 g/Liter. Das Mycel wird über einer Drucknutsche abfiltriert, mit Wasser nachgewaschen und in einem Hordentrockner getrocknet Das so erhaltene Produkt wird in der nachfolgend beschriebenen Weise für die Isolierung der ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester eingesetzt.

Beispiel 4 Fermentation

Von einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Clitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer y, (NRRL 3473) werden analog Beispiel 3 2 Liter Mycelbrei als Impfgut für einen 12 Liter fassenden Glasfermenter bereitet Die Nährlösung für die Hauptstufe hat folgende Zusammensetzung:

Beispiel 6

Enzymatische Acetylierung von Mutilin zu 14-Desoxy-14-acetoxymutilin

^r) Mit einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Clitopilus passeckerianus (NRRL 3100) werden 120 ml der in Beispiel 2 genannten Fermentationsnährlösung in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben beimpft und 72 Std. bei 24° C unter guter belüftung

κι geschüttelt. Mit dieser Impfgutstufe werden 20 Stück 500-ml-Erlenmeyerkolben beschickt, welche mit je 50 ml folgender Nährlösung gefüllt sind:

N als Cornsteep solids	1,2 g/l
Glucose	50,0 g/l
MgSO₄ -7H₂O	2,0 g/l
mit Aqua dest. auf 1000 ml
auffüllen;
pH vor der Sterilisation: 6,0

10

N als Cornsteep Solids 1,0 g/Liter Glukose 50,0 g/Liter MgSO₄ · 7 H₂O 0,5 g/Liter KH₂PO₄ 0,5 g/Liter Spermöl 5,0 g/Liter

mit Aqua dest auf 1000 ml

auffüllen,

pH vor Sterilisation 6,5,

CaCO₃ (getrennt sterilisiert) 3,0 g/Liter

Nach 144stündiger Fermentation analog Beispiel 3 wird ein Trockenmycelgewichl von 14,5 g/Liter erreicht Nach der Ernte des Mycels werden aus diesem die ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester in nachfolgend beschriebener Weise isoliert

Beispiel 5 Fermentation

Es wird anstelle von Clitopilus prunulus der Stamm Clitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. Joss. (NRRL 3474) eingesetzt und analog Beispiel 4 vorgegangen.

Nach 144st0ndiger Fermentation in der Hauptstufe wird ein Trockenmycelgewicht von 12J5 g/Liter erreicht Aus dem getrockneten Mycel werden die ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester in nachfolgend beschriebener Weise isoliert

3,0 g/Liter 2« Die auf dieser Nährlösung bei 24° C und guter Belüftung während 72 Stunden herangeführte Hauptstufe wird steril über Glasfilternutschen abgesaugt und das Mycel jedes Kolbens in je 50 ml Replacementmedium suspendiert das aus Phosphatpuffer mit pH-Wert 6,5 25 (0,066 molar) und einer Kohlenstoffquelle besteht Als Kohlenstoffquelle wird Maisöl in einer Konzentration von 2% verwendet. Die Substratkonzentration beträgt 3 g Mutilin pro Liter Kultur. Nach 48stündiger Belüftung der Ansätze bei 24° C ist das eingesetzte Mutilin zu 95% in 14-Desoxy-14-acetoxymutilin umgewandelt

Beispiel 7 Isolierung von 14-Desoxy-14-acetoxymutilin,

gebildet durch enzymatische Acetylierung von

Mutilin im Replacementverfahren

Der Inhalt von 5 Kolben (ca. 230 ml), die (entsprechend Beispiel 2) zu 95% acetyliertes Mutilin enthalten, wird homogenisiert und dreimal mit je 115 ml Essigsäureäthylester extrahiert Die vereinigten und entwässerten Extrakte werden mit 03 Gew.-% Aktivkohle behandelt auf ca. 5 ml Vakuum eingeengt mit 15 ml Diisopropyläther versetzt und in den Eisschrank gestellt Kurz darauf fällt das H-Desoxy-H-acetoxymutilin in kristalliner Form aus. Es wird anschließend zweimal umkristallisiert Die Ausbeute beträgt 401 mg Kristallisat mit einem Smp. von 183°C(unkorr.).

Beispiel 8

Isolierung der ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester und des 14-Desoxy-14-acetoxymutilins

1 kg Trockenmycel, hergestellt gemäß Beispiel 1 oder 2, wird fünfmal mit je 5 Liter 60%igem Methanol extrahiert worauf man den Methanolextrakt zweimal mit je 2^ Liter Petroläther entfettet Nach Entwässern und weitgehendem Einengen der Petrolätherphase wird der dickflüssige Rückstand über 10 Stufen zwischen 95%igem Methanol und Petroläther (Verhältnis 1:1) verteilt Die 3. bis 8. Stufe enthält die Pleuromutilinfettsäureester, die 9. und 10. Stufe das ^Desoxy-l^acetoxymutilin. Die 3. bis 8. Stufe wird vereinigt entwässert, soweit als möglich eingeengt mit der lOfachen Menge Hexan versetzt, gekühlt und von ausgeschiedenem Material abfiltriert Nach abermaligem Einengen bleibt ein gelbes, dickflüssiges öl zurück. Dieses wird in Diisopropyläther aufgenommen und mit 10 Gew.-%

40

45

60

65

r>

Aktivkohle behandelt. Hierbei erhält man ein dünnschichtchromatographisch reines Gemisch der verschiedenen Fettsäureester des Pleuromutilins. Die Ausbeute beträgt 5,3 g.

Um Näheres über die prozentuelle Zusammensetzung zu erfahren, wird 1 g des Substanzgemisches in 20 ml Petroläther gelöst, mit 10 ml methanolischer Kalilauge überschichtet und eine Stunde unter ständigem Schütteln und Lichtausschluß bei -5⁰C gehalten. Die Petrolätherphase wird mit l%iger Salzsäure sowie mit Wasser gewaschen und getrocknet, worauf man die Methylester der jeweiligen Fettsäuren erhält. Ein Teil der Methylester wird gaschromatographisch analysiert, wobei sich folgende Zusammensetzung ergibt:

40-45% ölsäuremethylester
45—50% Linolsäuremethylester
ca. 5% Gadoleinsäuremethylester

200 mg Estergemisch werden in 20 ml Essigester mit 2,0 g Palladiumkohle hydriert. Die Wasserstoffaufnahme kommt bereits nach 30 Minuten zum Stillstand. Eine IR-Aufnahme der hydrierten Ester zeigt, daß die Verbindungen durchhydriert sind. Die Ester werden anschließend gespalten und die entstandenen Säuren papierchromatographisch untersucht. Das Gemisch 2^r> besteht zu über 90% aus einer Qs-Säure, der Rest aus einer C2o-Säure.

Das bei einer Umesterung der Fettsäureester entstandene Pleuromutilin wird aus der Methanolphase isoliert und mit einem durch Fermentation gewonnenen j<> Material im Snip., Ir und UV verglichen. Die Verbindungen sind identisch. Auch liefert eine alkalische Verseifung in jedem Fall Mutilin.

Die 9. und 10. Stufe der Verteilung, welche das 14-Desoxy-14-acetoxymutilin enthält, wird entwässert und im Vakuum stark eingeengt. Die weitere Reinigung erfolgt durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule. Das Verhältnis von aufgegebenem Material zu Adsorbens beträgt 1 :100. Man eluiert mit Chloroform und erhält nach Einengen der aktiven Fraktionen und Zugabe von Diisopropyläther die gewünschte Verbindung in kristalliner Form. Sie wird zweimal aus Diisopropyläther umkristallisiert und getrocknet. Ausbeute: 1,23 g mit einem Smp. von 183^cC(unkorr.).

Vergleichsversuch

Die biologische Aktivität von 14-Desoxy-14-acetyl-mutilin

Die Untersuchungen der biologischen Aktivität von 14-Desoxy-14-acetyl-mutilin im Vergleich zu den bekannten Verbindungen erfolgt im üblichen Reihenverdünnungstest mit dem Faktor 0,5 bei einer Anfangskonzentration von 100 j>/ml in der Bouillon der jeweiligen Substanz. Die Einsaat beträgt jeweils etwa 10⁵ Keime/ml.

Die Ergebnisse der Untersuchung können der nachfolgenden Versuchstabelle entnommen werden, in welcher jeweils die minimale Hemmdosis in μg/ml angegeben ist.

Tabelle

Testorganismus	Minimale Hemmdosis	in \|xg/ml	14-Desoxy-
	Pleuromutilin	Mutilin	14-acetylmutilin
			0,08
Staph. aureus SG 511	0,8	>100	0,16
Staph.aureus 209 P	1,6	>100	0,8
Staph. aureus R 1	3,1	>100	0,06
Staph. aureus R Il	0,8	>100	0,12
Staph. aureus R III	3,1	>100	0,12
Staph. aureus 2595	0,8	>100

Claims

1 20 35 814 2 I (D Patentansprüche: I 1. Pleuromutilin-Derivate der Formel I, O
11
Q-C-CH₂-R O CH ι/ \ CH₃ \
/ CH₃
/\

CH=CH,

CH₃ OH

worin R für eine

CH₃ - (CH₂)/- CH=CH - (CHz)₇ - COO-. CH₃-(CH₂)4-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH₂)7-COO-_> CH₃-(CH₂J₉-CH=CH -(CH₂J₇ -COO-Gruppe

oder für Wasserstoff steht 2. Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Pleuromutilin-Derivaten der Formel I,

CH=CH₂

CH,

OH

worin R für eine

CH₃ - (CH₂)? - CH=CH - (CHi)₇ - COO-,

CH₃- (CH₂), - CH=CH - CH₂ - CH = CH - (CH₂), - COO-,

CH₃ - (CH₂H - CH - CH - (CH₂J₇ - COO-Gruppe

oder für Wasserstoff steht,

dadurch gekennzeichnet, daß man a) zur Hersteiiung von Verbindungen der Formel I, worin R obige Bedeutung besitzt, einen Organismus der Spezies Clitopilus passeckerianus (PiL) Sing. (NRRL 3100) bzw. dessen Variante (NRRL 3279), der Spezies Clitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer (NRRL 3473) sowie der Spezies Clitopilus pinsitus (FR). ss. Romagn. Joss. (NRRL 3474) bzw. deren Varianten oder Mutanten in einer wäßrigen, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung in Gegenwart pflanzlicher und tierischer öle züchtet und zur Isolierung aus dem gewonnenen Rohprodukt die Verbindungen in an sich bekannter Weise abtrennt oder

55

t,o

b) zur Herstellung von H-Desoxy-M-acetoxymutilin der Formel Ia

Q-C -CH,

O CH

CH, (la)

CH = CH₂

CH₃ OH

Mutiiin mit Hilfe eines Organismus der Spezies Ciitopilus passeckerianus (PiL) Sing. (NRRL 3100) bzw. dessen Variante (NRRL 3279), der Spezies Ciitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer (NRRL 3473) sowie der Spezies Ciitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. Joss. (NRRL 3474) bzw. deren Varianten oder Mutanten oder mit Enzymextrakten bzw. Trockenmycelen dieser Mikroorganismen in einer wäßrigen, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung enzymatisch acetyliert, und in Isolierung aus dem gewonnenen Rohprodukt die Verbindung in an sich bekannter Weise abtrennt

3. Tierarzneimittel enthaltend mindestens ein Pleuromutilin-Derivat nach Anspruch 1.