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Verfahren zur Herstellung von Polyoxysteroiden der Pregnanreihe Die
Entdeckung der bemerkenswerten therapeutischen Eigenschaften von Cortison, Hydrocortison
und ähnlichen verwandten Verbindungen hat ein starkes Bedürfnis zur Auffindung solcher
Verbindungen hervorgerufen. Bisher wurden diese Verbindungen in erster Linie durch
äußerst verwickelte Synthesen hergestellt, die eine erhebliche Anzahl von Trennungsstufen
erforderten, wobei die Anzahl der Stufen naturgemäß von dem Ausgangsstoff abhing.
So erfordert z. B. eine Synthese von Hydrocortison aus der verhältnismäßig billigen
Desoxycholsäure etwa vierzig verschiedene Reaktionen. Die schwierigsten Verfahrensstufen
bei der Synthese dieser Verbindungen liegen in der Einführung von Sauerstoffsubstituenten
in verschiedene Stellungen des Steroidmoleküls, besonders in die 11-, 17-und 21-Stellung.
Wegen der Schwierigkeit der Einführung dieser Sauerstoffsubstituenten ist die richtige
Auswahl des Ausgangsstoffes und die Reihenfolge und Anzahl der Verfahrensstufen
von besonderer Wichtigkeit. Die Auswahl des Ausgangsstoffs erfordert eine richtige
Abwägung der Kosten gegen die Leichtigkeit der Sauerstoffeinführung, und es ist
daher erhebliche Forschungsarbeit nötig, um zu bestimmen, welches die am meisten
Erfolg versprechenden Ausgangsstoffe sind.
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In der letzten Zeit wurde die Substitution von Steroiden mit Sauerstoff
mit Hilfe von Fermentationsverfahren durch die Wirkung besonderer, Sauerstoff einführender
Stämme von Mikroorganismen oder ihrer Sauerstoff einführenden Enzyme vorgeschlagen.
Die im Schrifttum veröffentlichten Verfahren zur Herstellung mehrfach sauerstoffsubstituierter
Produkte (d. h. Produkte, die an zwei oder mehreren Stellen des Steroidmoleküls
durch Sauerstoff substituiert sind) führen jedoch zur Bildung vieler anderer unerwünschter
Sauerstoffsubstitutionsprodukte, wie Steroisomere und Stellungsisomere, statt zur
Bildung nennenswerter Mengen eines einzigen Produkts. Die Ausbeuten an den einzelnen
jeweils gewünschten Erzeugnissen sind sehr gering, und infolge der verschiedenen
Arten von Gemischen, die man dabei erhält, sind äußerst umständliche Extraktionsverfahren
erforderlich, um die Bestandteile voneinander zu trennen. Es ist daher nicht lohnend,
mehrfach durch Sauerstoff substituierte Steroide in technischem Maßstab nach diesen
bekannten Verfahren herzustellen.
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Das Bedürfnis nach der Möglichkeit der Herstellung mehrfach durch
Sauerstoff substituierter Steroide in guter Ausbeute und besonders zur Herstellung
solcher Verbindungen, bei denen bestimmte Stellungen durch Sauerstoff substituiert
sind und die zur Weiterverarbeitung auf wertvolle Hormone erforderlich sind, liegt
auf der Hand. Ein solches Verfahren würde die Ausschaltung vieler verwickelter Verfahrensstufen
gestatten, die bisher zur Herstellung von als Hormone wirksamen Steroiden unerläßlich
waren, und würde, was vielleicht noch wichtiger ist, die sorgsame Auswahl des Ausgangsstoffes
überflüssig machen und damit die Verwendung billiger Ausgangsstoffe zu diesem Zweck
ermöglichen, die bisher für die Herstellung von Hormonen als unverwendbar galten.
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Ein Hauptzweck der Erfindung ist die Herstellung von Oxysteroiden
nach einem Verfahren, bei dem sich nicht die Schwierigkeiten ergeben, die die bisher
bekannten Verfahren mit sich bringen. Ein weiterer Zweck ist die Herstellung mehrfach
durch Sauerstoff substituierter Steroide nach einem Fermentationsverfahren in wirtschaftlich
tragbaren Ausbeuten ohne Bildung unerwünschter Nebenprodukte. Ein weiterer Zweck
ist die direkte Bindung von Sauerstoff an die 11-, 17- und 21ständigen Kohlenstoffatome
des Steroidmoleküls durch ein einfaches und wirksames Fermentationsverfahren. Weitere
Zwecke und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.
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Erfindungsgemäß wird die Einführung mehrerer Sauerstoffsubstituenten
in das Steroidmolekül in einfacher Weise in einem einzigen Fermentationsverfahren
erreicht, indem man Steroide nacheinander der Wirkung von zwei oder mehreren Sauerstoff
einführenden Kulturen von Mikroorganismen oder der von diesen Mikroorganismen hervorgebrachten,
Sauerstoff einführenden Enzyme aussetzt, wobei jeder Mikroorganismus bzw. jedes
Enzym selektiv in erster Linie in eine bestimmte Stellung des Steroidmoleküls Sauerstoff
einführt. Ein Kennzeichen dieses Verfahrens besteht darin, daß es eine Möglichkeit
schafft, Sauerstoff in zwei oder mehrere Stellungen eines Steroidmoleküls einzuführen,
ohne daß dabei eine große
Anzahl unerwünschter Sauerstoffsubstitionsprodukte,
wie Stereoisomere und Stellungsisomere, entstehen, die zu geringen Ausbeuten an
dem gewünschten Produkt führen und umständliche Extraktionsverfahren zur Abscheidung
des gewünschten Produkts von den unerwünschten Produkten erforderlich machen. Die
Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, mehrfach durch Sauerstoff substituierte
Steroide in guter Ausbeute hervorzubringen, ist ein neues und überraschendes Ergebnis,
da zu erwarten war, daß die verschiedenen in dem gleichen Verfahren angewandten
Mikroorganismen sich gegenseitig stören und dadurch zu geringen Ausbeuten an den
gewünschten Produkten führen würden, indem entweder einer oder mehrere der Organismen
den oder die anderen vergiftet oder infolge einer sonstigen gegenseitigen Beeinflussung,
die zur Zersetzung der Organismen führen könnte. Im Gegensatz dazu wurde gefunden,
daß es bei Verwendung bestimmter Mikroorganismen zur Bindung von Sauerstoff an verschiedene
Kohlenstoffatome möglich ist, die Sauerstoffsubstitution des Steroids unter strenger
Kontrolle zu halten und hohe Ausbeuten an dem gewünschten, mehrfach durch Sauerstoff
substituierten Produkt zu erzielen. Die Möglichkeit der Regelung der Einführung
von Sauerstoff in mehrere Stellungen ist von großer Bedeutung, da eine solche Regelung
nach den bisher bekannten Verfahren zur mehrfachen Sauerstoffsubstitution unmöglich
war.
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Nach der Erfindung kann die mehrfache Sauerstoffsubstitution in einem
einzigen Fermentationsverfahren durchgeführt werden, wodurch die Notwendigkeit der
Abscheidung der Komponenten nach jeder einzelnen Sauerstoffsubstitutionsstufe entfällt,
wie sie erforderlich wäre, falls man jede Sauerstoffsubstitutionsstufe einzeln durchführen
wollte. Dies ist ein Vorteil, da die Ausbeute hierdurch weit über diejenige hinaus
gesteigert wird, die bei Anwendung einzelner aufeinanderfolgender Fermentationsverfahren
erzielt wird, weil im letzteren Falle immer eine erhebliche Menge des sauerstoffsubstituierten
Steroid, sauf das das Verfahren abzielt, im Laufe der Gewinnung und Abtrennung von
der Fermentationsbrühe verlorengeht. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der
durch die Gewinnung des Produkts bedingte Verlust erheblich herabgesetzt. Werden
z. B. 2 Kohlenstoffatome durch Sauerstoff substituiert, so wird der Verlust um ungefähr
50 °% und bei der Substitution von 3 Kohlenstoffatomen um ungefähr 67 O% herabgesetzt.
Jede Herabsetzung des durch die Gewinnung bedingten Verlustes ist wegen der hohen
Kosten der erzeugten Verbindungen von erheblichem wirtschaftlichem Wert. Dieses
besondere Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist auch deswegen von besonderem
Vorteil, weil die Herabsetzung des Verlustes bei der Gewinnung auch zu einer Erhöhung
der Ausbeute führt und daher die Verwendung von Stämmen von Mikroorganismen gestattet,
die zwar vom Gesichtspunkt der Sauerstoffeinführung etwas weniger wirksam, jedoch
aus anderen Gründen, wie z. B. wegen ihres Nahrungsbedarfs, ihrer Beständigkeit
und. ihrer Verfügbarkeit, größere Vorteile bieten.
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Die Art, in der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird,
ist nicht ausschlaggebend. Die verschiedenen Kulturen der Mikroorganismen werden
nacheinander zugesetzt.
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Eines der ungewöhnlichsten und überraschendsten Kennzeichen der Erfindung
besteht darin, daß die Reihenfolge der Einführung der verschiedenen Mikroorganismen
zur Einführung von Sauerstoff in die verschiedenen Stellungen des Steroidmoleküls
unerheblich ist. Die Substitution durch Sauerstoff in den verschiedenen Stellungen
kann in jeder beliebigen Reihenfolge erfolgen, indem man einfach die jeweiligen
Mikroorganismen in der gewünschten Reihenfolge zusetzt. Es wäre zu erwarten gewesen,
daß die Verwendung gewisser anpassungsfähiger Mikroorganismen infolge unerwünschter
Anpassung zur Bildung unerwünschter Sauerstoffsubstitutionsprodukte der Steroide
führen würde oder daß die Anwesenheit bestimmter Gruppen die Sauerstoffsubstitution
hindern würde.
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Auch die besondere Art des nach der Erfindung verwendetenMikroorganismus
ist nicht wichtig, sofern man nur einen Mikroorganismus verwendet, der bezüglich
der Einführung von Sauerstoff in die gewünschte Stellung hoch selektiv ist. Unter
einem selektiven Mikroorganismus ist ein solcher zu verstehen, der das gewünschte
Oxysteroid in einer Ausbeute von mindestens 30 0/a, vorzugsweise von mindestens
50 0/" hervorbringt. Die Ausbeute an dem gewünschten Produkt ändert sich j edoch
mit dem jeweils verwendetenFermentationsmedium, und es kann von Vorteil sein, diese
prozentualen Ausbeuten etwas herabzusetzen, um die Verwendung bestimmter Medien
zu ermöglichen.
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Tabelle 1 ist eine Liste von Mikroorganismen, die Sauerstoff in die
11-Stellung einführen, mit Angabe der jeweiligen Konfigurationen, in der die Sauerstoffsubstitution
in der 11-Stellung stattfindet.
| Tabelle 1 |
| Mikroorganismus Stellung |
| Spondylocladium ...................... 11 |
| Acrothicium nigrum ................. Il a |
| Acrothicium lunatum ................ Il a |
| Acrothicium robustrum ............... Il a |
| Acrothicium aerenarium . ............ 11 a |
| SI-1711............................. 11a |
| SI-547 .............................. Il a |
| SI-697.............................. 11a |
| SI-549.............................. 11a |
| SI-475 .............................. l i a |
| SI-1709............................. 11a |
| F 20-1179 .......................... Il a |
| F 4-1568 ........................... 11ß |
| Helminthosporium ..................... 11 |
| Brachysporium ........................ 11 |
| Heterosporium......................... 11 |
| Napicladium .......................... 11 |
| Diplococium........................... 11 |
| Alternaria............................. 11 |
| Stemphylium .......................... 11 |
| Aspergillus............................ 11 |
| Aspergillus clavatus ................. 11a |
| Aspergillus fischeri................... 11a |
| Aspergillus flavus .................... Il a |
| Aspergillus itaconicus ................ Il a |
| Aspergillus luchuensis ............... 11 a |
| Aspergillus nidulans.................. lla |
| Aspergillus niger..................... 11a |
| Aspergillus ochraceus ................ 11a |
| Aspergillus ustus .................... Il a |
| Aspergillus wenti.................... 11a |
| Streptomyces ......................... 11 |
| Streptomyces fradiae ................ lla |
| Streptomyces endus ................. 11a |
| Penicillium ........................... 11 |
| Penicillium admetzi .................. Il a |
| Penicillium raistrickii ................ 11 a |
| Penicillium urticae .................. 11 a |
| Penicillium luteum................... Il a |
| Penicillium expansum ............... Il a |
| Penicillium notatum ................. 11 a |
| Penicillium lilacinum ................ 11 a |
| Penicillium brevi-compactum ......... Il a |
| Mikroorganismus Stellung |
| Penicillium citrinum ................. 11 a |
| Penicillium thomii .................. 11 a |
| Penicillium janthinellum.............. lla |
| Penicillium nigricans ................ 11 a |
| Penicillium oxalicum ................. 1 l a |
| Curvularia ............................ 11 |
| Curvularia falcata ................... 11 |
| Curvularia brachyspora............... 11 |
| Curvularia lunata ................... llß |
| Curvularia pallescens ................ 11ß |
| Rhizopus ............................. 11 |
| RH 176 ............................ lla |
| ATCC 6227b ........................ 1 l a |
| Cunninghamella ....................... 11 |
| blackesleana......................... llß |
| Mucor................................ 11 |
| Omphalia ..............:............. 11 |
| Omphalia tralucida .................. 11 ß |
| Stigmina ............................. 11 |
| Stigmina platani..................... 11ß |
Zur Einführung von Sauerstoff in die 11-Stellung wird die Verwendung einer Sauerstoff
einführenden Pilzkultur der Familie der Dematiaceen oder eines durch diese Mikroorganismen
hervorgebrachten, Sauerstoff einführenden Enzyms bevorzugt, da diese Organismen
die Sauerstoffsubstitution selektiv bewirken. Eine Gruppe, die sich als besonders
wirksam erwiesen hat, ist das Genus Spondylocladium. Zur Einführung der Hydroxylgruppe
in die 11-Stellung in ß-Konfiguration, wie sie beim Hydrocortison vorliegt, wird
der Stamm F4-1568 bevorzugt. Auch die Verwendung der Sorte Aspergillus ochraceus
des Genus Aspergillus ist von großem Vorteil zur Einführung von Sauerstoff, da diese
Sorte eine Sauerstoffsubstitution in 11 a-Stellung in sehr hoher Ausbeute bewirkt.
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Die Verwendung der anderen Mikroorganismen zur Einführung von Sauerstoff
in die 11-Stellung ist bei dem Verfahren nach der Erfindung zwar möglich, jedoch
weniger vorteilhaft, da diese nicht die selektiven Eigenschaften der Familie der
Dematiaceen und der Sorte A. ochraceus besitzen und ihre Verwendung daher zu einer
gewissen Bildung unerwünschter Produkte führt. Eine andere Schwierigkeit liegt darin,
daß viele dieser Sauerstoff einführenden Mikroorganismen, wie z. B. verschiedene
Sorten der Mucorales, sehr wählerisch hinsichtlich ihres Nahrungsbedarfs sind und
daher die zur Züchtung derartiger Mikroorganismen geeigneten Kulturmedien beschränkt
sind. Ferner werden die Sporen vieler Phycomyceten, einschließlich der Mucorales,
durch das Lyophilisierungsverfahren zerstört. Daraus ergibt sich eine große Schwierigkeit,
die gewünschten Eigenschaften dieser Stämme zu erhalten, da die Kulturen der Entartung
unterliegen. Außerdem verläuft das Wachstum der Mucorales in Submerskultur sehr
schlecht, und wenn man die Ansammlung von Schaum an der Oberfläche der Fermentationsflüssigkeit
zuläßt, so sammeln sich die Mucorales in dem Schaum an und bilden eine sich über
die Oberfläche des Kulturmediums ausbreitende Haut. Diese Bildung einer Oberflächenhaut
ist unerwünscht, weil der Mikroorganismus dadurch daran gehindert wird, mit dem
in der Hauptmenge der Fermentationsbrühe enthaltenen Steroid in innige Berührung
zu kommen. Unter solchen Bedingungen muß man daher große Mengen von Schaumverhinderungsmitteln
zusetzen, wodurch die Isolierung der gewünschten sauerstoffsubstituierten Steroide
erschwert wird.
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In Tabelle 2 ist eine Anzahl von Mikroorganismen aufgeführt, die Sauerstoff
in die 17-Stellung einführen. Auch andere Sorten des Genus Trichoderma eignen sich
zu Einführung von Sauerstoff in die 17-Stellung.
| Tabelle 2 |
| Mikroorganismus Stellung |
| Gliocladium .......................... 17a |
| Trichoderma .......................... 17a |
| lignorum ........................... 17a |
| F5-1688 ............................ 17a |
| album ............................. 17a |
| glaucum ............................ 17a |
| nigrovirens.......................... 17a |
| konigi.............................. 17a |
| viride .............................. 17a |
| nunbergii ........................... 17a |
| narcissi ............................ 17a |
Tabelle 3 gibt eine Zusammenstellung von Mikroorganismen, die Sauerstoff in die
21-Stellung einführen. Zu dem gleichen Zwecke können auch andere Sorten der Familie
der Sphaeroidaceen und besonders diejenigen des Genus Wojnowicia Verwendung finden.
| Tabelle 3 |
| Mikroorganismus Stellung |
| Sphaeroidaceae ........................ 21 |
| Wojnowicia ......................... 21 |
| graminis (MF-2419) ................ 21 |
| Hendersonia......................... 21 |
| acicola............................ 21 |
| herpotricha ....................... 21 |
| phragmitis........................ 21 |
| rubi ............................. 21 |
| aberrans ......................... 21 |
| abietus ........................... 21 |
| Ceratopycnis ........................ 21 |
| Eriosporina ......................... 21 |
| Prosthemium ....................... 21 |
| Cryptostictes ....................... 21 |
| Dilophospora ....................... 21 |
| Uroconis ........................... 21 |
| Phoma ............................. 21 |
| umicola .......................... 21 |
| hibernica ......................... 21 |
| betae ............................ 21 |
| Pyrenochaeta ....................... 21 |
| decipiens........ .................. 21 |
| Coniothyrium fuchelii ................ 21 |
| Septoria aesculi ..................... 21 |
| Phopsis citri ......................... 21 |
| Septoria apii ........................ 21 |
| Septoria lycopersici .................. 21 |
Die Sauerstoffsubstitution in 6-Stellung kann durch gewisse Stämme des Genus Rhizopus,
wie z. B. arrhizus und RH 176, erfolgen. Es kann auch Sauerstoff in verschiedene
andere Stellungen des Steroids, z. B. in die 7-, 8- und 14-Stellung, mit Hilfe anderer,
an sich bekannter Mikroorganismen eingeführt werden.
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Zur Einführung von Sauerstoff in zwei oder mehrere Stellungen des
Steroidmoleküls kann ein einziger Mikroorganismus in einer oder mehreren Verfahrensstufen
verwendet werden; im allgemeinen ist ein solcher Mikroorganismus jedoch unvorteilhaft,
da Mikroorganismen, die in zwei gewünschten Stellungen mit Sauerstoff substituieren,
meist auch eine große Anzahl anderer Produkte mit verschiedenen Graden von Sauerstoffsubstitution
bilden. Die Verwendung solcher Mikroorganismen macht es daher schwierig, die Sauerstoffsubstitution
unter Kontrolle zu halten.
Die oben aufgeführten Mikroorganismen
können aus bekannten Quellen, wie z. B. aus den Northern Regional Research Laboratories,
Peoria, Illinois, V. St. A., der American Type Culture Collection, Washington, D.
C., oder vom Centraalbureau voor Schimmelculture in Baarn, Holland, bezogen werden.
Andererseits können sie auch nach bekannten mikrobiologischen Verfahren aus natürlichen
Quellen erhalten werden.
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Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Steroid,
in das Sauerstoff eingeführt werden soll, der Wirkung des Sauerstoff einführenden
Enzyms ausgesetzt, welches durch Züchtung einer Sauerstoff einführenden Kultur von
Pilzen hervorgebracht wird. Dies geschieht am besten durch Züchtung des Mikroorganismus
unter aeroben Bedingungen in einer geeigneten Nährlösung in inniger Berührung mit
dem durch Sauerstoff zu substituierenden Steroid, wobei man die Züchtung des Mikroorganismus
fortsetzt, bis die gewünschte Substitution durch Sauerstoff stattgefunden hat. Wahlweise
kann das Verfahren auch unter Verwendung homogenisierter ruhender Zellen ausgeführt
werden, indem man zunächst den Mikroorganismus in einem geeigneten Fermentationsmedium
unter aeroben Bedingungen züchtet, sodann die Zellen von dem Fermentationsmedium
abtrennt und schließlich das Steroid zu diesen ruhenden Zellen zusetzt und die aeroben
Bedingungen lange genug bestehenläßt, um die gewünschte Einführung von Sauerstoff
zu erreichen.
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Das Steroid kann dem Nährmedium als Suspension in einem geeigneten
Lösungsmittel, wie Wasser, als Lösung in einem Lösungsmittel, wie Aceton, Propylenglykol,
Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, oder in feinzerteilter Form, z. B. als staubfeines
Pulver, zugesetzt werden. Im allgemeinen soll das Steroid in sehr fein verteilter
Form zugegeben sein, damit der größtmögliche Kontakt mit dem Sauerstoff einführenden
Kulturmedium ; stattfindet und die Reaktion vollständig verläuft.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl mit stationären Kulturen
als auch mit Submerskulturen von unter aeroben Bedingungen züchtbaren Mikroorganismen
ausgeführt werden; für praktische Zwecke wird es jedoch am vorteilhaftesten ausgeführt,
indem man die Mikroorganismen unter submersen Bedingungen in einem das Steroid enthaltenden
geeigneten wäßrigen Fermentationsmedium züchtet.
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Es ist jedoch im Rahmen der Erfindung wesentlich, daß man ein Fermentationsmedium
wählt, welches für die Züchtung eines jeden der Mikroorganismen geeignet ist, und
daß die Bedingungen, unter denen ein jeder der Mikroorganismen die Sauerstoffsubstitution
in wirksamer Weise zustande bringt, während der gesamten Dauer des Verfahrens eingehalten
werden. Da die Mikroorganismen sowohl nacheinander als auch gleichzeitig zur Einführung
von Sauerstoff verwendet werden können, ermöglicht das Verfahren eine sorgsame Regelung
der für jeden Sauerstoff einführenden Organismus günstigsten Bedingungen.
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Die Verwendung einer Kombination von Mikroorganismen im Rahmen der
Erfindung ermöglicht eine wirksame und vollständige Ausnutzung des Nährmediums,
während bei anderen Fermentationsverfahren das Nährmedium nur unvollständig ausgenutzt
wird. Hierdurch werden die i Betriebskosten verringert, was eine weitere Einsparung
bedeutet.
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Wäßrige Nährmedien, die zur Züchtung Sauerstoff einführender Stämme
der Mikroorganismen geeignet sein sollen, müssen sowohl assimilierbaren Kohlenstoff
und f Stickstoff als auch geringe Mengen anorganischer Salze enthalten. Als Quellen
für assimilierbaren Kohlenstoff können alle zu diesem Zwecke üblichen Stoffe verwendet
werden, wie Dextrose, Cerelose, Glukose oder invertierte Melasse. Ebenso sind die
üblicherweise in Fermentations- 7 verfahren verwendeten komplexen Quellen für Stickstoff,
wie angedautes Lactalbumin (»Edamine«) und Maismaischflüssigkeit, oder anorganische
Quellen für Stickstoff, wie sek. Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat u. dgl., auch
zur Verwendung in den Fermentationsmedien nach der Erfindung geeignet. Geringe Mengen
anderer Stoffe, wie Nicotinamid oder anorganische Salze, z. B. geeignete lösliche
Salze von Magnesium, Zink, Kalium, Natrium, Phosphor und Eisen, sind gewöhnlich
in komplexen Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthalten oder können in geringen
Mengen dem Fermentationsmedium zugesetzt werden, um das schnellste Wachstum des
Sauerstoff einführenden Mikroorganismus zu fördern.
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Im folgenden werden Beispiele für wäßrige Nährmedien angegeben, die
in dem vorliegenden Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide Verwendung
finden können. Medium Nr. 1 Handelsübliche Dextrose (»Cerelose«) . . 50,0 g Handelsübliches
angedautes Lactalbumin (»Edaminea) ................. 20,0 g Maismaischflüssigkeit
................ 5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen
von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt.
Medium Nr. 2 Invertierte Melasse .................. 100,0 g Handelsübliches
angedautes Lactalbumin (»Edaminea) ................. 20,0 g Maismaischflüssigkeit
................ 5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen
von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt.
Medium Nr. 3 Invertierte Melasse .................. 100,0 g Maismaischflüssigkeit
................ 5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen
von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt.
Medium Nr. 4 Invertierte Melasse .................. 100,0 g Maismaischflüssigkeit
................ 20,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein
Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5
eingestellt. Medium Nr. 5 Invertierte Melasse .................. 50,0 g Maismaischflüssigkeit
................ 6,3 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen
von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pa mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt.
Medium Nr. 6 Dextrose .......................... 50,0 g (NH4)2HP0........................
7,5 g K,HP04 .......................... 1,0 g MgS04 - 7 11,0 ....................
0,5 g KCl............................... 0,5g Fe S 04 - 7 HI O .....................
0,01 g Zn S 04 . 7 H20 ..................... 0,01 g
Destilliertes
Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und
das p. mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt. Medium Nr. 7 Invertierte cubanische
Melasse ....... 50,0 g Maismaischflüssigkeit ................ 5,0
g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium
zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 5,9 eingestellt. Medium Nr. 8 Invertierte
cubanische Melasse ....... 100,0 g Maismaischflüssigkeit ................
5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium
zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 5,8 eingestellt. Bei manchen Fermentationsmedien
ist der Zusatz von Schaumverhinderungsmitteln, wenn auch nicht wesentlich, so doch
von Vorteil. Es hat sich herausgestellt, daß im Falle gewisser Fermentationsmedien
der Zusatz eines substituierten Oxazalins, eines nicht flüchtigen, kationischen
oberflächenaktiven Amins, welches im Handel unter dem Namen »Alkaterge C« erhältlich
ist, die Menge des Schaumes besonders stark herabsetzt; man kann jedoch auch andere
Schaumverhinderungsmittel verwenden, die sich für diesen Zweck nützlich erwiesen
haben.
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Die Anwendung dieser Verfahren bringt auch viele andere Einsparungen
an Betriebskosten mit sich. Eine derartige Ersparnis liegt in der Zeit, woraus sich
eine Einsparung in der erforderlichen Anlage und im Kraftbedarf ergibt. Bei der
Anwendung dieser Verfahren ist nur ein Fermenter erforderlich, während man bisher
zwei oder mehrere Fermenter brauchte. Auch die Sterilisierung des Fermentationsmediums
kann in einer einzigen Verfahrensstufe erfolgen, wodurch eine weitere Einsparung
erzielt wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Einführung
von Sauerstoff in 4-Pregnen-3,20-dion, einen verhältnismäßig billigen Ausgangsstoff,
welcher hierbei durch Einführung von Hydroxylgruppen in die 11ß-, 17a- und 21-Stellung
in 4-Pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion übergeführt wird. Nach dem Verfahren
können auch andere Steroide der Pregnanreihe durch Sauerstoff substituiert werden,
wobei man Hormone oder Zwischenprodukte zur Herstellung von Hormonen erhält. So
kann man beispielsweise nach dem vorliegenden Verfahren außer 4-Pregnen-3, 20-dion
weitere Steroide der Pregnanreihe, wie 4-Pregnen-17 a-ol-3, 20-dion, 4-Pregnen-17a-ol-3,
20-dion-21-acetat, Desoxycorticosteron, 4-Pregnen-17 a, 21-diol-3, 20-dion, 4-Pregnen-3ß-ol-20-on,
5, 6-Dichlorpregnan-3ß-ol-20-on, 5, 6-Dichlorpregnan-21-ol-3, 20-dion oder 4-Pregnen-6-ol-3,
20-dion in der 11-, 17- und 21-Stellung durch Sauerstoff substituieren, wobei man
die entsprechenden Polyoxyderivate erhält.
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Man kann z. B. ein 11, 17, 21-Desoxypregnen nach dem folgenden Verfahren
mit Sauerstoff substituieren: Drei Proben eines sterilen Kulturmediums, z. B. eines
der obigen Medien, werden zunächst jedes mit einem verschiedenen Mikroorganismus
beimpft, welcher Sauerstoff selektiv in die 11-, 17- bzw. 21-Stellung einführt,
indem man eine geringe Menge einer Sporensuspension oder eines vegetativen Wachstums
des Organismus zusetzt. Das mit dem in 21-Stellung substituierenden Mikroorganismus
beimpfte Nährmedium wird dann bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45° bebrütet,
wobei es in Gegenwart von Sauerstoff über einen Zeitraum von einigen Stunden bis
zu mehreren Tagen in Bewegung gehalten wird. Dann setzt man eine Lösung des 11,
17, 21-Desoxypregnens in einem Lösungsmittel, wie Propylenglykol, zu dem Fer-3 mentationsmedium
zu und fährt mit der Bewegung und Belüftung des Nährmediums noch etwa 5 bis 30 Stunden,
oder bis die Sauerstoffsubstitution vollständig ist, fort. Während dieser Fermentationsdauer
wird das zweite, mit dem in 17-Stellung substituierenden Mikroorganismus beimpfte
Medium bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45° bebrütet, wobei es ebenfalls in
Gegenwart von Sauerstoff für eine Zeitdauer von einigen Stunden bis zu mehreren
Tagen in Bewegung gehalten wird. Sodann wird dieses Medium zu dem mit dem Desoxypregnen
versetzten fermentierten Medium zugegeben und die Bewegung und Belüftung weitere
5 bis 30 Stunden fortgesetzt. Sodann gibt man den zuvor in ähnlicher Weise bebrüteten,
in 11-Stellung substituierenden Mikroorganismus zu und setzt die Fermentation noch
5 bis 30 Stunden fort. Wenn die Einführung des Sauerstoffes beendet ist, kann das
11, 17, 21-Trioxypregnen aus der Fermentationsbrühe durch Extraktion mit einem geeigneten,
mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungmittel gewonnen werden. Zu diesem
Zweck geeignete Lösungsmittel sind z. B. Chloroform, Methylenchlorid, 2-Methyl-5-äthylpyridin,
Ester organischer Säuren, aromatische Koblenwasserstoffe, Ketone oder Amide. Die
Lösung des durch Sauerstoff substituierten Steroids kann dann eingedampft werden,
wobei man das gewünschte Produkt erhält, welches durch Umkristallisieren oder andere
übliche Verfahren gereinigt werden kann.
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Wahlweise kann das erfindungsgemäße Verfahren auch so ausgeführt werden,
daß man das Sauerstoff einführende Enzym, welches durch Fermentation der Mikroorganismen
erzeugt wurde, mit dem durch Sauerstoff zu substituierenden Steroid in Berührung
bringt. Dies kann erfolgen, indem man die Sauerstoff einführenden Enzyme aus der
Fermentationsbrühe nach an sich bekannten Verfahren gewinnt und sie mit dem Steroid
in einem wässerigen Medium in ähnlicher Weise, wie oben beschrieben, in innige Berührung
bringt.
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Ähnlich kann ein 11, 17, 21-Trioxypregnen vor seiner Abtrennung von
dem Medium mit anderen Mikroorganismen weiterfermentiert werden, um noch andere
Stellungen mit Sauerstoff zu substituieren. Beispielsweise kann das obige Verfahren
mit einem Mikroorganismus, wie z. B. Rhizopus arrhizus, fortgesetzt werden, der
Sauerstoff in die 6-Stellung einführt, worauf man das so gewonnene 6, 11, 17, 21-Tetraoxypregnen
von der Fermentationsbrühe abscheidet.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Beispiel
1 Vier Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 170°
in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Jedes der Medien wurde dann mit etwa 5 ccm eines
vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia graminis (MF-2419) beimpft. Die beimpften
Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit
von 220 Umdr./Min. etwa 72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine Temperatur von
28° eingehalten wurde. Zu jedem der Kolben wurde dann eine sterile Lösung von 20
mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 5 ccm Propylenglykol zugesetzt, und die Mischungen wurden
mit der gleichen Geschwindigkeit noch etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten. Dann
wurden zu jedem der Kolben je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die ursprünglich aus
dem Medium Nr. 1 und 5 ccm einer vegetativen Zucht von Spondylocladium F 4-1568
bestand.
Diese Zucht wurde durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus
in dem Medium erhalten. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden in Bewegung
gehalten und nach 12-, 24-, 48- bzw. 72stündiger Bebrütung aus der Vorrichtung herausgenommen
und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papierstreifen chromatographiert
und mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid nach dem Verfahren von Zaffaroni
(Science 111, 1950, S. 6) entwickelt. Es wurde ein im Ultraviolett absorbierendes,
Tetrazolium reduzierendes Produkt erhalten, welches die gleiche chromatographische
Beweglichkeitbesaß wie 4-Pregnen-11 ß, 21-diol-3, 20-dion. Ein Streifen des Oxydationsproduktes
wurde aus dem Papier eluiert und das UV-Spektrum seines Schwefelsäurechromogens
festgestellt. Dieses erwies sich als identisch mit dem Spektrum von 4-Pregnen-11
ß, 21-diol-3, 20-dion. Beispiel 2 Sechs Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums
Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes
Medium mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia graminis
(MF-2419), beimpft. Die beimpften Mischungen wurden dann auf einer rotierenden Schüttelmaschine
mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten,
wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Sodann wurde zu jedem der Kolben
eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20e dion in 2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt
und die Bewegung mit der gleichen Geschwindigkeit etwa 48 Stunden fortgesetzt. Hierauf
wurden in jeden Kolben 50 ccm, einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem
Medium Nr. 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Spondylocladium F 4-1568
bestand. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium
erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung
gehalten und nach 6-, 12-, 24-, 48-, 72- bzw. 96stündiger Bebrütung aus der Vorrichtung
entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papierstreifen chromatographiert
und mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid entwickelt. Es wurde ein im Ultraviolett
absorbierendes, Tetrazolium reduzierendes Produkt erhalten, das die gleiche chromatographische
Beweglichkeit besaß wie 4-Pregnen-11 ß, 21-diol-3, 20-dion. Beispiel 3 Sechs Proben
von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr.1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben
sterilisiert. Dann wurde jedes der Medien mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums
der Kultur Spondylocladium F 4-1568 beimpft. Die beimpften Mischungen wurden dann
auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min.
etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine Temperatur von 28° eingehalten
wurde. Sodann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-17
a-ol-3, 20-dion in 2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt, und die Kolben wurden mit der
gleichen Geschwindigkeit weitere 24 Stunden in Bewegung gehalten. Hierauf wurden
in jeden Kolben 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium
Nr. 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Wojnowicia graminis (MF-2419) bestand.
Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten
worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten
und dann jeweils nach Bebrütungszeiten von 6, 12, 24, 48, 72 bzw. 96 Stunden abgenommen
und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papier chromatographiert
und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol entwickelt. Es wurde ein im Ultraviolett
absorbierendes und Tetrazolium reduzierendes Umwandlungsprodukt auf dem Papier an
einer Stelle gegenüber 4-Pregnen-1lß, 17a-21-triol-3, 20-dion beobachtet. Das UV-Spektrum
des Produkts in konzentrierter Schwefelsäure erwies sich beim Vergleich als identisch
mit demjenigen von 4-Pregnen-11 ß, 17 a-21-triol-3, 20-dion. Die Ausbeute betrug
etwa 45 °/o.
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Beispiel 4 Fünf Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1
wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes Medium
mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia graminis (MF-2419)
beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine
mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten,
wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Dann wurde zu jedem der Kolben
eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt,
und die Kolben wurden weitere 48 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung
gehalten. Darauf wurden in jeden Kolben 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich
aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Trichoderma F 5-1688
bestand. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium
erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter mit der gleichen
Geschwindigkeit und bei der gleichen Temperatur noch 72 Stunden in Bewegung gehalten.
Am Ende dieser Zeit wurden zu jedem der Kolben 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die
ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Spondylocladium
F 4-1568 bestanden hatte. Diese Kultur war in ähnlicher Weise erhalten worden wie
die anderen Kulturen. Die nunmehr etwa je 150 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter
in Bewegung gehalten und jeweils nach Bebrütungszeiten von 6, 12, 24, 48 bzw. 72
Stunden abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papier
chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol entwickelt. Es
wurde ein im Ultraviolett absorbierendes, Tetrazolium reduzierendes Oxydationsprodukt
beobachtet, dessen R f-Wert und Spektrum in Schwefelsäurelösungmit den mit4-Pregnen-11
ß,17 a, 21-triol-3, 20-dion erhaltenen Werten identisch waren. Die Ausbeute betrug
etwa 45 %. Beispiel 5 Fünf Proben von j e etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden
20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit
etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Aspergillus niger beimpft. Die
beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit
von 200 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf
28° gehalten wurde. Dann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 20 mg
4-Pregnen-3, 20-dion in '-/2 ccm Dimethylformamid zugesetzt, und die Kolben wurden
etwa 48 Stunden weiter in Bewegung gehalten. Hierauf wurden in jeden der Kolben
50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm
eines vegetativen Wachstums von Trichoderma album bestanden hatte. Die Kultur war
durch 48stündige Entwicklung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden.
Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und nach
48 Stunden abgenommen. Einer der Kolbeninhalte wurde mit Chloroform
extrahiert
und auf einem Papierstreifen chromatographiert. Der chromatographische Fleck lag
in der Gegend von 4-Pregnen-lla, 17a-diol-3, 20-dion. Zu den übrigen Kolben wurden
je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen
Wachstums von Hendersonia acicola erhalten worden war. Die nunmehr etwa 150 ccm
enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach 24-, 48-,
72- bzw. 96stündiger Bebrütung abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte
wurden auf Papierstreifen chromatographiert und mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid
entwickelt. Der hierbei erhaltene chromatographische Fleck lag in der Gegend von
4-Pregnen-11a, 17a, 21-triol-3, 20-dion. Beispiel 6 Fünf Proben von je etwa 50 ccm
des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert.
Dann wurde jedes Medium mit etwa 5 ccm einer vegetativen Zucht der Kultur Trichoderma
glaucum beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine
mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten,
wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Dann wurde zu jedem der Kolben
eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 1/Z ccm Dimethylformamid zugesetzt,
und die Kolben wurden weitere 60 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung
gehalten. Hierauf wurden in jeden Kolben je 50 ccm einer Kultur eingegeben, die
ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Wojnowicia
graminis bestand. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in
dem Medium erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weitere
48 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung gehalten. Der Inhalt eines
der Kolben wurde sodann mit Chloroform extrahiert und auf einem Papierstreifen chromatographiert.
Der hierbei erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dion.
Darauf wurden zu jedem der übrigen Kolben je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die
ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Cunninghamella
blackesleana bestanden hatte. Diese Kultur war durch 1tägige Entwicklung des Mikroorganismus
in dem Medium erhalten worden. Die nunmehr etwa 150 ccm enthaltenden Kolben wurden
weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach einer Bebrütungsdauer von 12, 24, 48
bzw. 72 Stunden abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf
Papier chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol entwickelt.
Die hierbei erhaltenen Flecke lagen in der Gegend von 4-Pregnen-11 ß,
17a, 21-triol-3, 20-dion. Beispiel 7 Es wurde nach Beispie16 mit dem Unterschied
gearbeitet, daß zu Anfang die Kultur von Wojnowicia graminis, an zweiter Stelle
die Kultur Trichoderma glaucum und zum Schluß diejenige von Cunninghamella blackesleana
zugesetzt wurde. Die Ergebnisse waren die gleichen wie im.Beispiel 6.
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Beispiel 8 Fünf Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1
wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes Medium
mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Penicillium adametzi beimpft.
Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer
Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine
Temperatur von 28° eingehalten wurde. Zu jedem der Kolben wurde dann eine sterile
Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 1/, ccm Dimethylformamid zugegeben, und
die Kolben wurden weitere 48 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung
gehalten. Hierauf wurden in jeden der Kolben 50 ccm einer Kultur eingegeben, die
ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Trichoderma
lignorum bestanden hatte. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus
in dem Medium erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weitere
60 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit und bei der gleichen Temperatur in Bewegung
gehalten. Dann wurde der Inhalt eines der Kolben mit Chloroform extrahiert und auf
einem Papierstreifen chromatographiert. Der hierbei erhaltene Fleck lag in der Gegend
von 4-Pregnen-11 a, 17a-diol-3, 20-dion. Sodann wurden zu jedem der übrigen Kolben
je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen
Wachstums von Wojnowicia graminis entwickelt worden war. Die nunmehr etwa 150 ccm
enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach Bebrütungsdauer
von 24, 48, 72 bzw. 96 Stunden abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte
wurden auf Papier chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol
entwickelt. Der hierbei erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-11 a-17
a, 21-triol-3, 20-dion. Beispiel 9 Es wurde nach Beispiel ß gearbeitet mit dem Unterschied,
daß zuerst die Kultur von Wojnowicia graminis, dann die Kultur von Trichoderma lignorum
und zum Schluß die Kultur von Penicillium adametzi zugesetzt wurde. Die Ergebnisse
waren die gleichen wie nach Beispiel B. Beispiel 10 Es wurde nach Beispie18 gearbeitet
mit dem Unterschied, daß zu Beginn die Kultur von Trichoderma lignorum, sodann diejenige
von Wojnowicia graminis und als letzte Kultur die von Penicillium adametzi zugesetzt
wurde. Die Ergebnisse waren die gleichen wie nach Beispiel B.
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Beispiel 11 Es wurde nach Beispie18 gearbeitet mit dem Unterschied,
daß zu Anfang die Kultur von Penicillium adametzi, sodann die Kultur von Wojnowicia
graminis und als letzte die Kultur von Trichoderma lignorum zugesetzt wurde. Das
Ergebnis war das gleiche wie nach Beispiel B.
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Beispiel 12 Fünf Proben von je 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden
20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes der Medien
mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Trichoderma F5-1688 beimpft.
Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer
Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die
Temperatur auf 28° gehalten wurde. Sodann wurde zu jedem der Kolben je eine sterile
Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 1/2 ccm Dimethylformamid zugesetzt, und
die Kolben wurden weitere 48 Stunden in Bewegung gehalten. Hierauf wurden in jeden
Kolben je 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1
und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Wojnowicia graminis bestanden hatte und
durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus
in dem Medium erhalten
worden war. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden dann weiter mit der gleichen
Geschwindigkeit 48 Stunden in Bewegung gehalten. Sodann wurde einer der Kolbeninhalte
mit Chloroform extrahiert und auf einem Papierstreifen chromatographiert. Der hierbei
erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dion. Zu den
übrigen Kolben wurden je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die aus dem Medium Nr. 1
und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Omphaliatra lucida (MF-22101) durch 7tägige
Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden war. Die nunmehr je 150
ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach Bebrütungsdauer
von 12, 24, 48 bzw. 72 Stunden aus der Vorrichtung entfernt und mit Chloroform extrahiert.
Die Extrakte wurden auf Papier chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol
entwickelt. Hierbei ergab sich ein Fleck, der Tetrazolium reduzierte und in der
Gegend von 4-Pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion lag. Von einem Teil des
Rückstandes wurde das UV-Spektrum in konzentrierter Schwefelsäure festgestellt,
und dieses erwies sich als ähnlich demjenigen von 4-Pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3,
20-dion. Ein zweiter Teil des Extraktes wurde wieder auf Papier chromatographiert
und dann mit Dichromat in Eisessig oxydiert. Nach dem Entwickeln zeigte das Papier
einen Fleck von der gleichen Beweglichkeit wie 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 20-trion.
Ein weiterer Teil wurde auf Empfindlichkeit gegen Eosin untersucht und als aktiv
befunden. Beispiel 13 Fünf Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden
20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes der Medien
mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Hendersonia rubi beimpft.
Die beimpften Mischungen wurden auf einer Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit
von 220 Umdr./Min. etwa 72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf
28° gehalten wurde. Dann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 20 mg
4-Pregnen-3, 20-dion in 3 ccm Propylenglykol zugesetzt, und die Kolben wurden weitere
48 Stunden in Bewegung gehalten. Hierauf wurden zu jedem der Kolben 50 ccm einer
Kultur zugegeben, die aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums
von Trichoderma nigrovirens durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium
erhalten worden war. Die je etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weitere 48 Stunden
mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung gehalten. Dann wurde einer der Kolbeninhalte
mit Chloroform extrahiert und auf einem Papierstreifen chromatographiert. Der hierbei
erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dion. Zu jedem
der übrigen Kolben wurden je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die aus dem Medium Nr.
1 und 5 ccm vegetativen Wachstums von Stigmina platani (MF-2395) durch 3tägige Züchtung
des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden war. Die nunmehr je etwa 150 ccm
enthaltenden Kolben wurden nochmals 24 Stunden in Bewegung gehalten und dann mit
Chloroform extrahiert. Die Lösungen wurden vereinigt, zur Trockne gedampft, auf
Papierstreifen chromatographiert und entwickelt. Hierbei ergab sich eine Tetrazolium
reduzierende Verbindung an einer Stelle unmittelbar gegenüber 4-Pregnen-11ß, 17a,
21-triol-3, 20-dion.