DE1135899B - Verfahren zur Herstellung von 1, 4-Dien-3-keto-steroiden - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von 1,4-Dien-3-keto-steroiden Die verschiedenen Perhydrocyclopentenophenanthrene, die gleichzeitig in 1 - und 4-Stellung eine Doppelbindung enthalten - z. B. Prednisolon, Prednison, Triamcinolon, A',LAndrostadien-3,17-dion und viele andere -, besitzen nach wie vor großes Interesse als therapeutische Produkte oder als Ausgangsstoffe für deren Herstellung. Nicht nur chemische, sondern auch mikrobiologische Methoden sind zu ihrer Darstellung bekanntgeworden,wobeidieletzterendenVorteilhaben, auch bei gegen chemische Reagenzien empfindlichen Verbindungen anwendbar zu sein und darüber hinaus auch häufig mit einer beachtlichen Ausbeutesteigerung verbunden zu sein. Für die Einführung der A 1-Doppelbindung wurden sowohl Pilze als auch Bakterien zur Anwendung gebracht.
• Die in der Familie Bacillaceae zusammengefaßten Spezies haben die gemeinsame Fähigkeit der Sporenbildung. Hinsichtlich der biochemischen Wirksamkeit unterscheiden sich nicht nur die verschiedenen Spezies, sondern sogar auch die Stämme jeder Spezies untereinander auffallend stark, und im Gegensatz zu den Pilzen kann man bei den Bakterien aus ihrer Stellung im System keine Voraussagen auf ihre biochemischen Fähigkeiten machen, da oft die Herkunft des einzelnen Stammes einer Spezies für dessen biochemische Eigenschaften ausschlaggebend ist. So besitzt z. B. eine große Anzahl der bisher zugänglich gewordenen Stämme des Bacillus subtilis (Naturwissenschaften, Bd. 43, S. 39 -- Höchst), die nach der Veröffentlichung zu erwartende Eigenschaft nicht, in l(2)-Stellung eines Steroidhormons zu dehydrieren.
• Bei der Spezies Bacillus sphaericus, die schon zur l(2)-Dehydrierung in der Steroidreihe verwandt wurde, hat sich neben sehr langsamer Reaktionsgeschwindigkeit darüber hinaus gezeigt, daß der Erfolg der z11-Einführung außerdem stark von der Struktur des angewandten Ausgangsmaterials abhängig ist. So lassen sich z. B. nur Z] 4-3-Ketosteroide, aber nicht A 5-3-Hydroxysteroide in die entsprechenden A '-Verbindungen überführen.
• Bekannterweise sind auch aus der Familie Corynebacteriaceae die Spezies Corynebaeterium mediolanum Lind Corynebacterium simplex sowohl zur l(2)-Dehydrierung als auch zur Umwandlung von Dehydroepiandrosteron in z11,4-Androstadien-3,17-dion befäliigt, jedoch sind bei nur langsamer Reaktionsgeschwindigkeit mit diesen Mikroorganismen nur äußerst mäßi-e Ausbeuten zu erzielen.
• Unvorteilhaft für die Umwandlung von Dehydroepiandrosteron in AI,4-Aiidrostadien-3,17-dion ist auch die Verwendung von Fusarium solani oder Streptomyces lavendulae, da neben dem gewünschten AI,4-Androstadien-3,17-dion noch große Mengen an Testololacton und 1,2-Dehydrotestololacton anfallen.
• Es wurde nun gefunden, daß man aus an sich wenig wirksamen Stämmen der Familie Baeillaceae, vorzugsweise des Genus Bacillus, insbesondere der Spezies Bacillus lentus durch Auslese künstlich erzeugter Mutanten zu Stämmen gelangen kann, die eine ausgezeichnete Verbesserung der biochemischen Fähigkeiten aufweisen.
• So wird durch UV-Bestrahlung eines in bezug auf l(2)-Dehydrogenaseaktivität an sich wenig wirksamen Stammes der Spezies Baeillus lentus, der aus Kompost isoliert war, durch systematische Selektion eine Mutante (MB 284) erhalten, die nun nicht nur die gewünschte Fähigkeit der Dehydrierung in l(2)-Stellung in ganz besonderem Maße besitzt, sondern darüber hinaus auch befähigt ist, eine 3-Hydroxy-,d'- bzw. 3-Acyloxy-A5-Gruppierung in die 3-Keto-J1,4-Gruppierung umzuwandeln. Dies bedeutet offensichtli#li eine sehr willkommene Erweiterung der Gruppe von geeigneten Ausgangsstoffeil zur Herstellun,- von /A1,4-3-Keto-Steroiden. Diese überraschende Eigenschaft teilt MB284 bisher mit keinem anderen bekannten Stamm der Familie Bacillaceae, und es war auch durchaus nicht vorauszusehen, daß man bei der künstlichen Mutation eines an sich wenig wirksamen Stammes zu einer Mutante mit derartig verbesserten biochemischen Eigenschaften gelangen würde. So erhält man bei der Fermentierung mit der Mutante MB 284 z. B. nicht nur überraschend hohe Ausbeuten, sordern es unterbleibt auch die unerwünschte Umwandlung des D-Ringes zum Lactonring, und darüber hinaus wird die Reaktionsgeschwindigkeit um etwa das 5- bis 7fache gesteigert.

  Bacillus lentus Baeillus lentus MB 284

  50/,Glukose--#0,5%Kaliumnitrat- keinWachstum sehr zartes Wachstum

  Schrägagar

  1,5()/, Sojabohnenmehl-Schrägagar zartes Wachstum zartes Wachstum

  Nährbouillon gutes Wachstum, uniforme Trübung, gutes Wachstum, uniforme Trübung

  granuläres Sediment

  Milchagar-Strichplatte Casein wird nicht hydrolysiert Casein nicht hydrolysiert

  Milch unverändert unverändert

  Kartoffelagar kein Wachstum zartes Wachstum

  Stärke-Strichplatte wird hydrolysiert keine Hydrolyse

  Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet wird nicht gebildet

  0,5 "/, Natriumeitrat, kein Wachstum kein Wachstum

  0,5 0/, Ammoniumnitrat

  Nitratreduktion wird nicht gebildet, keine Gasbildung wird nicht gebildet, keine Gasbildung

  Gelatine Hochschicht keine Verflüssigung keine Verflüssigung

  Gelatine Platte keine Verflüssigung keine Verflüssigung

  Natriumchlorid-Nährbouillon 4 0/, gutes, 5 0/, kein Wachstum 2 bis 110/, gutes, 12 0/,) schwaches

  2 bis 12 "/, Wachstum

  Gasbildung keine keine

  Fleischextrakt Ar. in Gegenwart von Ammoniumsalzen 0

  + 0,5111, Ammonium- Xy. als Stickstoffquelle findet keine +

  chlorid Gl. Säurebildung statt +

  La. 0

  Ma,

  So. +

  Sc.

  10/, Fleischextrakt Ar. + 0

  + 111/0 Pepton Xy. + 0

  Gl. + +

  La. 0

  Ma. 0

  So. 0

  Sc. +

  In der Tabelle bedeuten: La. = Lactose

  Ar. = Arabinose Ma. = Mannose

  Xy. = Xylose So. # Sorbose

  Gl. # Glucose Sc. = Saccharose

  Für die Gewinnung der Mutante MB 284 wird im Rahmen der Erfindung Schutz nicht begehrt. , In die obengenannte erweiterte Gruppe geeigneter Ausgangsprodukte fallen erfindungsgemäß in l(2)-Stellung gesättigte Perhydrocyclopentenophenanthrenverbindungen, die an den Kohlenstoffatomen 1 und 2 mindestensje einWasserstoffatom,vorzugsweisejedoch aber je zwei oder auch an einem der beiden Kohlenstoffatome ein und an dem anderen zwei, eine Sauerstoff-Funktion am Kohlenstoffatom 3, vorzugsweise eine Keto-, Hydroxy- oder Acyloxygruppe, in Verbindung mit einer Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 4 und 5 oder 5 und 6 enthalten, was nicht ausschließt, daß an anderen Stellen des Steroidgerüstes weitere Doppelbindungen vorliegen, und/oder auch am Kohlenstoffatom 10 eine Methyl-, eine freie oder funktionell abgewandelte Hydroxylgruppe oder nur ein Wasserstoffatorn und an den anderen Kohlenstoffatomen wie z. B. in 6-, 9-, 11-, 16-, 17-, 20- oder 21-Stellung des Steroidgerüstes beliebige Substituenten wie z. B. Keto-, Hydroxyl-, Methyl-, Epoxygruppen oder Halogen, insbesondere Fluor auftreten können.
• Die weiteren biochemischen Eigenschaften der Mutante MB 284 sind in der vorstehenden Tabelle denen der Spezies Bacillus lentus (nach Bergeys Manual Det. Bact., 1957) gegenübergestellt. Beispiele Allgemeines Verfahren: Ein Fermenter aus rostfreiem Stahl mit 50 1 Fassungsvermögen wurde mit 30 1 der in der folgenden Tabelle angegebenen Nährlösung beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 120'C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit einer Bakteriensuspension beimpft, die durch Abschwemmen einer Bouillonagaroberfläche von 64 cm' mit 7 ml physiologischer Kochsalzlösung erhalten wurde.
• Nach zweitägiger Vermehrung bei 25'C unter Rühren (220 U/min) und Belüftung (1650 1/h) wurden 1,8 1 der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen Fermenter mit 28,2 1 des gleichen Mediums übergeführt. Zur gleichen Zeit versetzte man mit einer Lösung von 7,5 g Steroid in 200 ml Äthanol und fermentierte unter den gleichen Bedingungen. Die Fermentationszeiten wurden je nach Art des Steroids, wie in der Tabelle angegeben, variiert.
• Den Verlauf der Fermentation überprüfte man durch Entnahme von Proben, die mit Methylisobutylketon extrahiert wurden. Die Extrakte wurden papierchromatographisch analysiert, vorzugsweise mit den Systemen Dioxan + Toluol/Propylenglykol und Heptan/ Propylenglykol.
• Nach Ablauf der Fermentationszeit wurde die Kulturbrühe 3mal mit je 10 1 Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden in einem Vakuumumlaufverdampfer eingeengt und dann im Vakuum unter Stickstoff zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde an Silicagel (100/, Wasserzusatz) chromatographiert. Die benutzten Elutionsmittel sowie die Lösungsmittel für die Umkristallisation der isolierten Substanzen sind im einzelnen in der folgenden Tabelle angegeben.
• Die Nährlösung Md. 7« hat folgende Zusammensetzung: 1 % Hefeextrakt, 5 % Maisquellwasser und 211/0 Glukose bei einem pil von 7.
• Die Nährlösung »Md. 36« hat folgende Zusammensetzung: 15 "/, Pepton, 6 % Maisquellwasser und 3 % Glukose bei einem pil von 7.
• Die speziellen Beispiele sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE-. 1. Verfahren zur Darstellung von 1,4-Dien-3-keto-steroiden durch Bebrütung der entsprechenden 1,2-Dihydrosteroide mit einer Kultur eines Mikroorganismus des Genus Bacillus oder den daraus erhaltenen dehydrierend wirkendenden Enzymen unter üblichen aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man in l(2)-Stellung gesättigte Perhydrocyclopentenophenanthrenverbindungen, die mindestens an den Kohlenstoffatomen 1 und 2 je ein Wasserstoffatom, vorzugsweise jedoch aber je zwei oder auch an einem der beiden Kohlenstoffatome ein und an dem anderen zwei, eine Sauerstoff-Funktion am Kohlenstoffatom 3, vorzugsweise eine Keto-, eine freie Hydroxyl- oder auch eine Acyloxy-Gruppe, in Verbindung mit einer Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 4 und 5 oder 5 und 6 enthalten, was nicht ausschließt, daß an anderen Stellen des Steroidgerüstes weitere Doppelbindungen vorliegen können, und/oder auch am Kohlenstoffatom 10 eine Methyl-, eine freie oder funktionell abgewandelte Hydroxylgruppe oder nur ein Wasserstoffatom und an den übrigen Kohlenstoffatomen des Steroidgerüstes beliebige Substituenten auftreten können, als Substrate und Bacillus lentus MB 284 als Mikroorganismus verwendet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 4-Pregnen-lIß,17oc,21-triol-3,20-dion, 4-Pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion, 4-Pregnen-17oc,21-diol-3,20-dion, 4-Pregnen-14x-17oc,21-triol-3,20-dion, 4-Pregnen-12ß,17oc,21-triol-3,20-dion, 4-Pregnen-6p,17a,21-triol-3,20-dion, 5-Androsten-3p-ol-17-on, 4-Androsten-3,17-dion, 9cc-Fluor-4-pregnen-Ilß,17x,21-triol-3,20-dion, 17a-Methyl-4-androsten-17ß-ol-3-on, 16x-Methyl-4-pregnen-3,20-dion, 16,17x-Oxydo-5-pregnen-3,21-diol-20-on-21-acetat, 16x-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol-3,20-dion, 16x-Methyl-4-pregnen-Ilfl, 17,x,21-triol-3,20-dion, 16x-Methyl-9oc-fluor-4-pregnen-llß,17x,21-triol-3,20-dion, Dehydroepiandrosteron-3-acetat, Testololacton, 4-Pregnen-Ilß, 17,x-diol-3,20-dion, 4-Pregnen-llß,21-diol-3,20-dion, 16oc-Methyl-4-pregnen-Ilß,17oc-diol-3,20-dion oder 16,w-Methyl-4-pregnen-llß,21-diol-3,20-dion als Ausgangsprodukte verwandt werden.