DE1062891B - Verfahren zur Gewinnung von Antibiotica - Google Patents

Description

XJDk

Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Gewinnung von Antibiotica aus Rohlösungen, insbesondere zur Gewinnung und Konzentrierung von Antibiotica aus Gärflüssigkeiten, in denen Antibiotica gebildet sind und außerdem MikrooTganismenmyzel 5 sowie geeignete Nährstoffe enthalten sind.

Bisher wurden Antibiotica aus Gärflüssigkeiten, in welchen sie erzeugt waren, durch Lösungsmittelextraktion und mittels Ionenaustauschern isoliert und getrennt; dieser Arbeitstechnik wurden Gärflüssigkeiten, filtriert oder unfiltriert, nach der Ernte unterworfen.

Die vorliegende Erfindung richtet sich allgemein auf eine neue Arbeitsweise zum Isolieren von durch Gärungsprozesse erzeugten Antibiotica.

Die Erfindung betrifft ein neues verbessertes Verfahren zum Trennen und Reinigen von. Antibiotica aus der Gärflüssigkeit, in welcher sie gebildet waren, die Isolierung der Antibiotica in hoher Ausbeute und ein für den Betrieb geeignetes Verfahren zur Gewinnung der antibiotischen Aktivität aus Gärflüssigkeiten, in welchen die Antibiotica entwickelt waren.

Andere Zweckangaben und Vorteile der Erfindung können der folgenden Beschreibung entnommen werden.

Es wurde gefunden, daß Antibiotica aus den Gärflüssigkeiten, in welchen sie entwickelt waren, im Zuge der Gärung isoliert werden können. Die Isolierung vollzieht sich also· während der Entwicklung des A.ntibioticums. Zu diesem Zweck setzt man ein ausgewähltes Ionenaustauschharz der Gärflüssigkeit zu und läßt die Gärung einige Zeit nach Zusatz des Harzes vor sich gehen.

Es ist überraschend, daß erfindungsgemäß neben der Vereinfachung der Durchführung des Verfahrens sowie Einsparung an Arbeitszeit und Vorrichtungen die Ausbeute an dem Antibioticum erhöht wird, und zwar um etwa 25%, bezogen auf die bei der adsorptiven Behandlung geernteter Gärflüssigkeiten erhaltenen Werte. Die Ausbeuteerhöhung wird dadurch herbeigeführt, daß man die Gärung in Gegenwart eines Ionenaustauschharzes durchführt, welches das Antibioticum nach Maßgabe seiner Bildung adsorbiert, Eine weitere Steigerung der Ausbeute wird dadurch erzielt, daß die Filtration der Gärflüssigkeit vor der Weiterbehandlung unterbleibt. Weiterhin wird die Adsorption durch das Harz dadurch wirksamer, daß die Berührungszeiten von Gärflüssigkeit und Harz während der Gärung verlängert werden. Außerdem wird das Gärgefäß selbst für die Adsorption benutzt; die Gärflüssigkeit braucht also nicht mehr in ein weiteres Gefäß zur Behandlung mit dem Harz übergeführt zu werden.

Der hohe Wirkungsgrad der Erfindung kann an Verfahren zur Gewinnung
von Antibiotica

Anmelder:

Merck & Co., Inc.,

Rahway, N. J. (V. St. A.)

Vertreter: E. Maemecke, Berlin-Lichterfelde West,
und Dr. W. Kühl, Hamburg 36, Esplanade 36 a,
Patentanwälte .

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 21. Mai 1957

Robert George Denkewalter und James, Gillin,

Westneid, N. J. (V. St. A.),
sind als Erfinder genannt worden

einem unbeständigen Antibioticum wie Penicillin ermessen . werden, wenn dieses nach Maßgabe seiner Bildung aus der Lösung adsorptiv entfernt wird, in der es merklich unbeständig ist und chemisch und enzymatisch abgebaut wird.

Für die wirksame Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es wesentlich, daß das Ionenaustauschharz in die Gärflüssigkeit in einem solchen Zeitpunkt eingetragen wird, daß' die Flüssigkeit in Gegenwart des Harzes vergoren werden kann. Das Harz kann schon zu Beginn der Gärung oder spätestens etwa 1 Stunde vor der Ernte der Gärflüssigkeit zugesetzt werden. Eine Stunde ist erfahrungsgemäß das Zeitminimum, um die antibiotische Aktivität aus der Gärflüssigkeit möglichst vollständig zu gewinnen. Bei einer bevorzugten Ausführungsfoirm der Erfindung wird das Ionenaustauschharz etwa 48 Stunden nach Beginn der Gärung bis zu 24 Stunden vor Ernte der Gärflüssigkeit zugegeben.

Das Harz wird in die Gärflüssigkeit in beliebiger Konzentration, vorzugsweise'von etwa 1 bis 5 Volumprozent, nach Maßgabe der Konzentration der in der Gärflüssigkeit entwickelten antibiotischen Aktivität eingebracht.

Wesentlich ist für das erfindungsgemäße Verfahren, daß das Ionenaustauschharz während der Gärung zugesetzt und die Gärung in Gegenwart des Harzes fortgeführt wird. Einige antibiotische Gärungen sind nun

909 580/390

gegen eine Verunreinigung durch fremde Mikroorganismen empfindlich, die einen vollständigen Verlust der Ausbeute an dem erwünschten Gärprodukt, z. B. Penicillin, verursachen können. In diesem Falle wird das Ionenaustauschharz vor Zusatz in das Gärgefäß, z. B. durch Hitze oder Dampf, sterilisiert. Wenn das Harz wärmeunbeständig ist, empfiehlt sich die Verwendung eines Antisepticums, z. B. wäßrigen Alkohols.

Nach der Adsorption kann das Antibioticum aus dem Ionenaustauschharz in üblicher Weise isoliert werden. So werden Gärflüssigkeit und Harz beispielsweise, abgesiebt. Das abgetrennte Harz kann zur Entfernung von Spuren von Myzel oder nichtadsorbierten chemischen Verunreinigungen gewaschen und dann mit einer Lösung eluiert werden, welche sich zum Auswaschen der antibiotischen Aktivität aus dem Harz eignet. Das Eluat kann der Kristallisation, Lösungsmittelextraktion oder einem anderen Verfahren zur Gewinnung des reinen Antibioticums zugeführt werden.

Das eluierte Harz kann dann mit einer geeigneten Lösung regeneriert und für die antibiotische Adsorption, gegebenenfalls zusammen mit frischem neuem Harz, in das Gärgefäß wiederaufgegeben werden. Die verbrauchte Gärflüssigkeit kann mit frischem oder regeneriertem Harz nochmals in Berührung gebracht und gemäß obigen Angaben wieder abgetrennt werden.

Die Erfindung wird nunmehr für Novobiocin als Beispiel eines Antibioticums näher erläutert.

Ionenaustauschharze für vorliegendes Verfahren, insbesondere Novobiocin, sind besonders starkbasische polymere, Stickstoff enthaltende Anionenaustauschharze, gewöhnlich solche mit quaternären Ammonium gruppen an einem Styrol'Divinylbenzol-Kern, Die »Dowex«-Harze der Dow Chemical Co., Midland, Mich., z. B. »Dowex 1-X2«, »Dowex 1-X4« und »Dowex 2-X4«, ferner die »Amberlite«-Harze der Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pa., z. B. »Amberlite IRA-400«, »Amberlite IRA-401« und »Amberlite XE-98«, weiter die »Duolite«-Harze der Chemical Process Co., Redwood City, Calif., ζ. B. »Duolite A-40«, »Duolite A-IOl« und »Duolite A-102«, sind Vertreter dieser Harzgruppe. Außer diesen Sorten können, andere starkbasische Ionenaustauschharze für die: Adsorption von Novobiocin benutzt werden.

Andere Antibiotica benötigen gegebenenfalls andere Ionenaustauschharze. Penicillin. G, ein. weiteres saures Antibioticum, kann an für ■ die Novobioeinadsorption geeigneten basischen Anionenaustauschharzen adsorbiert· werden. Für die wirksame Adsorption, basischer Antibiotica wie Streptomycin, Neomycin, Eulicin und Cytovirin wird ein saures Kationenaustauschharz benötigt.

Die Teilchengröße des Harzes ist nicht entscheidend; Harze im Bereich von etwa 4 bis 80, vorzugsweise etwa 14 bis 40 Maschen eignen sich besonders gut für die Adsorption.

Für die Trennung des Harzes, an welches die antibiotische Aktivität der Gärflüssigkeit adsorbiert ist, aus der verbrauchten Flüssigkeit empfiehlt es sich, zunächst die Flüssigkeit mit Wasser oder einem anderen Verdünnungsmittel zu verdünnen. Dieser Schritt ist zwar nicht unbedingt erforderlich, erleichtert aber :die Trennung der 'verbrauchten· Flüssigkeit von dem Harz. Die Abtrennung des Harzes wird durch Vermischen .'der verbrauchten Flüssigkeit, welche Mikroorganismenmyzel, unverbrauchtes Nährmittel und an-■derö feste Verunreinigungen enthält, mit der gleichen jRaummenge Wasser erleichtert.

Die Flüssigkeit wird dann von dem Harz abgesiebt oder sonstwie getrennt. Ein Sieb, dessen Maschen das Harz zurückhalten und das Myzel durchlaufen lassen (normalerweise etwa 4 bis 80 Maschen), ist für die Trennung wirksam, ohne daß das Sieb mit Myzel oder verbrauchter Gärflüssigkeit verstopft wird. Zur Vereinfachung der Trennung verwendet man ein Schüttelsieb. Man kann sich aber auch jeder anderen Trennungsmethode, z. B. eines Flüssigkeitszyklons, geriffelter Tische oder Sichter, bedienen.

Zum Eluieren der adsorbierten antibiotischen Aktivität aus dem Ionenaustauschharz wird eine wäßrige elektrolythaltige Lösung benutzt. Für Novobiocin sind wäßrige saure Lösungen, welche ein. organisches Lösungsmittel für Novobiocin enthalten, z. B. wäßrige Lösungen von Salzsäure oder Essigsäure im Gemisch mit einem geeigneten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Alkohol oder Keton, zu empfehlen. Die Konzentration der sauren. Verbindung in der Elutionslösung beträgt vorzugsweise etwa 1 bis 10 Gewichtsteile je 100 Volumteile Lösung. Die organische Phase kann sich zu etwa 70 bis 98% aus dem organischen Lösungsmittel und etwa 30 bis 2 °/o aus Wasser zusammensetzen.

Für andere Antibiotica als Novobiocin werden geeignete Elutionsjösungen benutzt, um die antibiotische Aktivität aus dem Ionenaustauschharz auszuwaschen. Beispielsweise verwendet man eine wäßrige Ammoniaklösung zum Eluieren von Neomycin und Cytovirin, Methanolische Salzsäure ist zum Eluieren von Eulicin und Streptomycin brauchbar.

Die Elution kann in einer Kolonne oder absatzweise vor sich gehen. Bevorzugt wird der Betrieb in einer Kolonne, weil die benötigten Raummengen kleiner sind und das Eluat sich verhältnismäßig leicht periodisch analysieren sowie in Fraktionen aufteilen läßt.

Das Eluat kann zur weiteren Reinigung weiterbehandelt werden, z. B., wenn es Novobiocin enthält, durch eine chromatographische Kolonne, etwa aus Aluminiumoxyd, geleitet werden, welches mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen war; das gereinigte und entfärbte Eluat wird dann mit einer sauren Lösung z. B. aus Methanol—Essigsäure zwecks Kristallisation der Novobiocinsäure behandelt. Die Kristallmasse wird filtriert und z.B. mit Wasser¹— Methanol gewaschen, filtriert und getrocknet. Gegebenenfalls werden Novobiocinsalze aus der Novobiocinsäure durch Neutralisation hergestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an den folgenden Beispielen erläutert, an deren Werte die Erfindung nicht gebunden ist. Beispielsweise können andere Antibiotica als Novobiocin, z.B. Streptomycin, Neomycin, Eulicin, Cytovirin, Penicillin, aus der Gärflüssigkeit während der Gärung im Sinne der Erfindung isoliert werden.

Beispiel 1

In 29 ecm einer Novobiocin enthaltenden Gärflüssigkeit wird 1 ecm »Dowex-1-X2«-Harz (20 bis 40 Maschen) in der Chloridphase eingetragen; das Harz war zuvor mit wasserfreiem Äthanol sterilisiert. Die Gärung dauert insgesamt 168 Stunden, Das Harz wird von der verbrauchten Flüssigkeit durch ein Sieb (28 Maschen) getrennt und in eine Kolonne (1'·15αη) eingebracht, mit Methanol gewaschen und mit einer 16°/oigen wäßrigen Salzsäure in Methanol-2 n-Lösung in einer Menge von 0,2 ecm je Minute eluiert. Nach einer biologischen Prüfung enthält das Eluat

20000 Einheiten Novobiocinaktivität. Die Prüfung weist eine Ausbeute im Eluat von 75 %, bezogen auf einen Parallelversuch in Abwesenheit von Harz, aus.

Die folgende Tabelle faßt die Ergebnisse von Beispiel 1 zu verschiedenen Zeitpunkten des Harzzusatzes zusammen.

Harzzusatz (Stunden nach Beimpfen)	Ernte (Stunden nach Beimpfen)	Gärflüssigkeit (ecm)	Harz (ecm)	Ausbeute im Eluat (°/o)
48 144 156	180 168 168	3,000 378,500 2,721	35+1 5,000+3 35+3	90+2 90+4 85+4

+*' Mit Dampf sterilisiertes Harz.

+² Bezogen auf einen Parallelversuch in Abwesenheit von Harz.

+³ Das Harz wurde nicht sterilisiert.

+⁴ Bezogen auf die Aktivität in der Flüssigkeit im Zeitpunkt des Harzzusatzes,

Beispiel 2

In 3000 ecm einer Neomycin enthaltenden Gärflüssigkeit werden 180 ecm »Duolite^C-25«-Harz in ao der Natriumphase eingetragen; das Harz war zuvor mit einer Lösung aus 70% Äthylalkohol und 30% Wasser sterilisiert worden. Dieses Harz ist ein hochporöses sulfoniertes Polystyrol-Divinylbenzol-Kationenaustauschharz der Chemical Process Company, Redwood City, Calif. Das Harz wird 48 Stunden nach dem Beimpfen eingetragen und die Flüssigkeit 163 Stunden nach dem Beimpfen geerntet. Das Harz wird von der verbrauchten Flüssigkeit durch ein Sieb (11 Maschen) getrennt, mit Wasser gewaschen, in eine Kolonne von 2,5 cm eingebracht und mit aufwärtsströmendem Wasser zur Entfernung der restlichen Feststoffe aus dem Gärungsprozeß gewaschen. Das Harz wird dann mit einer abwärts strömenden 1 n-Ammoniaklösung in einer Menge von 3 ecm je Minute eluiert. Die durch den biologischen Test bestimmte Aktivität des Eluates entspricht einer Ausbeute von 90%, bezogen auf einen Parallel versuch in Abwesenheit von Harz.

Neomycin kann auch an »Amberlite-IRC-50«-Harz der Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pa., adsorbiert werden; dies ist ein saures Polystyrol-Divinylbenzol-Kationenaustauschharz, dessen Ionenaustauschfähigkeit im wesentlichen auf Carbonsäuregruppen zurückgeht. Außerdem können andere Harze, welche saure Kationenaustauschharze sind, benutzt werden.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Antibiotica aus Gärflüssigkeiten, in denen Antibiotica erzeugende Mikroorganismen fermentiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Gärflüssigkeit während des Gärungsvorganges ein das Antibioticum adsorbierendes Ionenaustauschharz einträgt, die Gärung in Gegenwart des Harzes vor sich gehen läßt, die verbrauchte Gärflüssigkeit und das Myzel von dem Ionenaustauschharz abtrennt und das adsorbierte Antibioticum aus dem Ionenaustauschharz eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ionenaustauschharz in die Gärflüssigkeit ab Beginn der Gärung bis etwa 1 Stunde vor der Ernte der Gärflüssigkeit einträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ionenaustauschharz in die Gärflüssigkeit frühestens 48 Stunden nach Beginn der Gärung und spätestens 24 Stunden, vor der Ernte der Gärflüssigkeit einträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Ionenaustauschharz ein basisches, hoehporöses Amonemaustauschharz oder ein saures, hochporöses Kationenaustauschharz ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ionenaustauschharz mit dem adsorbierten Antibioticum aus der erschöpften Gärflüssigkeit und von dem Myzel mit einem Sieb solcher Maschengröße trennt, daß das Ionenaustauschharz auf dem Sieb zurückbleibt und die erschöpfte Gärflüssigkeit durch das Sieb abläuft.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Sieb während der Abtrennung des Ionenaustauschharzes von der erschöpften Gärflüssigkeit und dem Myzel geschüttelt wird.

© 909 580/390 7.