DE2309899C2

DE2309899C2 - Verfahren zum Abtrennen von Cephalosporin C aus rohen wäßrigen Lösungen

Info

Publication number: DE2309899C2
Application number: DE2309899A
Authority: DE
Inventors: Hideo Osaka Fukuda; Kazuyoshi Katamato; Nariakira Mizokami; Kiyoshi Kyoto Nara; Kazuhiko Ohta
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-03-02
Filing date: 1973-02-28
Publication date: 1982-03-18
Also published as: US3926973A; FR2174236A1; JPS5230594B2; JPS4886890A; NL175073B; DK145742C; SE390307B; GB1422241A; DK145742B; NL7303016A; CH585758A5; NL175073C; DE2309899A1; FR2174236B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus rohen wäßrigen Lösungen, die Cephalosporin C enthalten.

Für die Abtrennung von Cephalosporin C von Kulturfiltraten von Mikroorganismen, die Cephalosporin C bilden (z. B. Cephalosporium), wurde bereits ein chromatographisches Verfahren vorgeschlagen, bei dem Anionenaustauschharze verwendet werden. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß das Cephalosporin C nicht genügend weitgehend von den zwangsläufig in den Kulturfiltraten enthaltenen Verunreinigungen (z. B. Cephalosporin N, Pigmenten und Salzen) abgetrennt werden kann, und daß das Verfahren nichi nur eine äußerst große Menge eines komplizierten Elutionsmittels (einer Pufferlösung, die ein tertiäres Amin zusammen mit Schwefelsäure oder Oxalsäure enthält), sondern auch eine sehr umständliche Regenerierung für die Wiederverwendung der Anionenaustauscherharze erfordert. Die Entwicklung eines von den vorstehend genannten Nachteilen freien, großtechnisch durchführbaren Chromatographieverfahrens für die Abtrennung von Cephalosporin C ist daher seit langem erwünscht.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Cephalosporin C im wesentlichen ohne Abbau von Cephalosporin N, Pigmenten und Salzen, die in den Kulturfiltraten der Cephalosporin bildenden Mikroorganismen enthalten sind, durch eine bestimmte Aufeinanderfolge bestimmter Verfahrensslufen, wie sie durch die Ansprüche gekennzeichnet sind, abgetrennt werden kann. Berücksichtigt man, daß Cephalosporin C unter alkalischen Bedingungen bekanntlich sehr instabil ist, so ist di*: Tatsache, daß Cephalosporin C ohne Abbau aus der Aktivkohle, an der Cephalosporin C adsorbiert worden ist, mit einem alkalischen Gemisch von Wasser und einem der im Anspruch genannten organischen Lösungsmittel fraktioniert eluiert werden kann, sehr überraschend, dies um so mehr, als selbst bei Verwendung eines neutralen oder sauren Gemisches von Wasser mit einem organischen Lösungsmittel als Elutionsmittel oder bei Verwendung von Wasser, das alkalisch gemacht worden ist. das Cephalosporin C von den Verunreinigungen, insbesondere von den Pigmenten, nicht abgetrennt werden kann.

Gegenstand der Erfindung, ist demgemäß das durch die Ansprüche gekennzeichnete, großtechnisch durchführbare Verfahren, bei dem Cephalosporin C mit hohem Wirkungsgrad von den Verunreinigungen einschließlich der Pigmente und Salze unter Verwendung eine:- geringen Menge des Elutionsmittels abgetrennt werden kann, und bei dem das Adsorptions-ί mittel nahezu beliebig oft wiederverwendet werden kann, ohne daß es einer besonderen Regenerierung unterworfen wird.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird eine wäßrige Lösung, die Cephalosporin C enthält, mit

ίο Aktivkohle behandelt, wobei das Cephalosporin C an der Aktivkohle adsorbiert wird. Als Beispiele roher wäßriger Lösungen, die Cephalosporin C enthalten, sind Kulturmedien von Cephalosporin C bildenden Mikroorganismen und ihre flüssigen verarbeiteten Maierialien, z.B. Kulturfiltrate, Waschflüssigkeiten, Konzentrate und Flüssigkeiten, die bei deren pH-Einstellung erhältlich sind, zu nennen. Zweckmäßig werden diese Lösungen vor der Behandlung mit der Aktivkohle beispielsweise mit verdünnter Schwefelsäurfc auf einen pH-Wert von etwa 4,5 bis 6,8, insbesondere etwa 5 bis 6, eingestellt

Als .Aktivkohlen eignen sich beispielsweise die Produkte, die durch Carbonisierung und anschließende Aktivierung mit Wasserdampf oder chemische Aktivierung (z. B. mit Zinkchlorid) von Sägemehl, Kokosnußschalen und Steinkohle hergestellt werden können. Besonders vorteilhaft sind Aktivkohlen, die mit Zinkchlorid aktiviert worden sind. Diese Aktivkohlen können in körniger Form oder Pulverform verwendet

JO werden. Vorteilhaft ist die Verwendung von Aktivkohlen, die eine Korngröße von etwa 03 bis 2 mm und eine Oberfläche von etwa 300 bis 2000 m²/g, insbesondere von etwa 600 bis 1500 mVg, haben.
Die Adsorption von Cephalosporin C an der

J5 Aktivkohle kann nach beliebigen Verfahren einschließlich der Chargenbehandlung erfolgen. Zur Erzielung einer ausreichenden Abtrennung durch die anschließende Elution ist es vorteilhaft, die das Cephalosporin C enthaltende rohe wäßrige Lösung von oben nach unten durch die Aktivkohlesäule zu leiten. Hierbei ist die optimale Raumströmungsgeschwindigkeit (Vol.-Einheiten der durchzuleitenden rohen wäßrigen Lösung pro Volumeneinheit Aktivkohle pro Stunde) verschieden in Abhängigkeil von Faktoren wie der Konzentration von Cephalosporin C in der rohen wäßrigen Lösung und der Länge der Aktivkohlesäule. Die vorteilhafteste Raumströrnungsgcschwindigkeit, die im wesentlichen vollständige Adsorption von Cephalosporin C an der Aktivkohle ermöglicht, liegt bei etwa 0,1 bis 2,0, insbesondere bei etwa 0,5 bis 2,0 V/V/S'd.

Wenn die rohe wäßrige Lösung chargenweise mit der Aktivkohle zusammengeführt wird, z. B. durch Mischen der Lösung mit der Aktivkohle, wird die das Cephalosporin C adsorbierende Aktivkohle vor der anschließenden Elution in eine Kolonne gefüllt.

Durch die vorstehend beschriebene Behandlung der das Cephalosporin C enthaltenden rohen wäßrigen Lösung mit Aktivkohle wird im wesentlichen die gesamte Menge an Cephalosporin C, die in der Lösung enthalten ist an der Aktivkohle adsorbiert. Gleichzeitig werden von den in der Lösung enthaltenen Verunreiniguii i'cn das Cephalosporin N und die Pigmente ebenfalls an der Aktivkohle adsorbiert. Diese Adsorption kann fortgesetzt werden, bis die Aktivkohle mit der

h-, adsorbierten Menge an Cephalosporin C gesättigt ist. d. h. ihr Adsorptionsvermögen für Cephalosporin C gefallen ist. Es ist vorteilhaft, die Aktivkohle, die genügend Cephalosporin C adsorbiert hat. vor der

anschließenden Elution mit Wasser zu waschen.

Gemäß der Erfindung werden Cephalosporin C und andere an der Aktivkohle adsorbierte gelöste Stoffe mit einem alkalischen Gemisch von Wasser und bestimmten organischen Lösungsmitteln von der Aktivkohle eluiert. Als organische Lösungsmittel eignen sich folgende hydrophile organische Lösungsmittel: niedere Alkohole (z. B. Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol und Isobutanol), insbesondere solche mit bis zu 5 C-Atomen, niedere Ketone (z. B. Aceton und Methyläthylketon), insbesondere solche mit bis zu 4 C-Atomen, niedere Alkylester von niederen Fettsäuren (z. B. Methylacetat, Äthylacetat und Methylpropionat), insbesondere solche mit bis zu 7 C-Atomen, cyclische Äther (z. B. Dioxan und Tetrahydrofuran) und Gemische dieser Lösungsmittel. Das Mengenverhältnis von Wasser und organischem Lösungsmittel im Gemisch wird in Abhängigkeit von Faktoren wie der Art der organischen Lösungsmittel gewählt. Im allgemeinen liegt das optimale Volumenverhältnis von Wasser zu organischem Lösungsmittel bei etwa 15:1 bis 1:3, insbesondere etwa !5:1 bis 1:1. Das Gemisch des Wassers mit dem organischen Lösungsmittel wird vor der Verwendung alkalisch gemacht. Die Einstellung des Gemisches auf eine geeignete Alkalität erfolgt zweckmäßig mit einer Base, z. B. Alkali- und Erdaikalihydroxyden (z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumh.Mdroxyd, Calciumhydroxyd und Magnesiumhydroxyd), Ammoniak oder mit organischen Aminen, z. B. Trimethylamin. Die optimale Alkal'tät ändert sich etwas mit Faktoren wie der Art der organischen Lösungsmittel, jedoch liegt der pH-Wert im allgemeinen im Bereich von etwa 7,5 bis 13,0, insbesondere im Bereich von etwa 9,5 bis 12,0.

Das alkalische Gemisch wird zweckmäßig von oben nach unten durch die Säule der Aktivkohle, die das Cephalosporin C adsorbiert hat, geleiteu Das Eluat wird in bestimmten Fraktionen aufgefangen, so daß das Cephalosporin C in andere Fraktionen als die übrigen adsorbierten gelösten Stoffe einschließlich Cephalosporin N und der Pigmente eluiert wird. Die optimale Raumströmungsgeschwindigkeit (Volumeneinheiten des durchzuleitenden alkalischen Gemisches pro Volumeneinheit Aktivkohle pro Stunde) bei dieser fraktionierten Elution ändert sich mit Faktoren wie der an der Aktivkohle adsorbierten Menge an Cephalosporin C, der Art der verwendeten organischen Lösungsmittel und der Länge der Aktivkohlesäule. Die vorteilhafteste Raumströmungsgeschwindigkeit liegt zwischen etwa 0.1 und 2,0, insbesondere etwa 0,3 und 0,8 V/V/Std.

Die das Cephalosporin C enthaltenden Fraktionen können aufgefangen werden, indem beispielsweise die Cephalosporin-C-Aktivität oder die optische Dichte der jeweiligen Fraktionen bei 260 μηΐ überwacht wird. Die hierbei erhaltenen Cephalosporin-C-Fraktionen enthalten das von Cephalosporin N, Pigmenten, Salzen und anderen Verunreinigungen abgetrennte Cephalosporin C in hoher Konzentration. Das Cephalosporin C kann aus den Fraktionen, die es enthalten, nach an sich bekannten Verfahren isoliert werden, z. B. durch Einengung der Fraktionen, wobei das Cephalosporin C beispielsweise als entsprechendes Alkalisalz auskristallisiert, worauf das Salz von Her Mutterlauge abgetrennt und getrocknet werden kann. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch in Verbindung mit verschiedenen anderen Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Eine der vorteilhaften Kombinationen besteht darin, daß man die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen, das Cephalosporin C enthaltenden Fraktionen einer Acylierungsreaktion unterwirft und dann das erhaltene fettlösliche acyiierte Derivat vom Reaktionsgemisch abtrennt.

Durch die beschriebene Elution der Aktivkohle mit j dem alkalischen Gemisch von Wasser und organischem Lösungsmittel werden Cephalosporin C und andere an der Kohle absorbierte gelöste Stoffe in das Elutionsmittel desorbiert, und die Aktivkohle wird regeneriert Die regenerierte Aktivkohle kann in fast unendlicher

ίο Wiederholung für die Zyklen aus Adsorption und Elution verwendet werden.

Die in den folgenden Beispielen genannten Oberflächenwerte wurden nach der Methode von Brunauer, Emett und Teller (BET-Methode) ermittelt, die z. B. in

ii »J.A. C.S.« 60 (1938) 309 beschrieben wird. Die Titer voi: Cephalosporin C und Cephalosporin N wurden nach der Biotestmethode gemessen die z. B. in »Antimicrobial Agents and Chemotherapy« (1962), 682, beschrieben wird. Die Prozentsätze beziehen auch auf

2u das Volumen, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Ein Cephalosporin bildender Mikroorganismus der Gattung Cephalosporium (Cephalosporium acremonium ATCC-14553, aufgeführt in »The American Type Culture Collection, Catalogue of Strains, 9. Auflage, 1970«) wurde 7 Tage im Schrägröhrchen auf Kartoffel-Dextrose-Agarnährbootin kultiviert, wobei gutes Wachstum erzielt wurde. In einen 21-Kolben wurden

ω 500 ml eines Mediums (pH 6,8) gegeben, das 1,5% Fleischextrakt, 0,5% Maisquellwasser, 3,0% Saccharose und 0,15% Calciumcarbonat enthielt. Anschließend wurde im Autoklaven sterilisiert. Der Kolben wurde mit Sporen aus der erhaltenen Schrägkultur beimpft und 3

J5 Tage unter Schütteln bei 28°C bebrütet.

In einen Fermentationsbehälter aus nichtrostendem Stahl wurden 25 I eines Mediums gefüllt, das 3,0% rohes Sojabohnenmehl. 10% Saccharose, 1% DL-Methionin. 0,15% Calciumchlorid, 3,0% Baumwollsaatmehl und 0,05% Sojabohnenöl enthielt. Nach Si^-ilisation unter hohem Druck und Abkühlung wurde der Behälter aseptisch mit der vorstehend genannten Vorkultur beimpft und bei 24⁰C unter Belüftung und Rühren (100% Belüftung pro Minute, 280 UpM) bebrütet.

Nach einer Kultivierungszeit von 140 Stunden wurde das Kulturmedium (25 I) aus dem Behälter genommen und mit verdünnter Schwefelsäure auf pH 5,0 eingestellt. Dann wurden 0,5 kg Filterhilfsmittel zugesetzt, worauf die Zellen mit einer Filterpresse, die mit 0,25 kg des

•ίο Filterhilfsmittels vorbeschichtet war, abgetrennt wurden. Das hierbei erhaltene klare rötlichbraune Filtrat enthielt pro ml 2000 μg Cephalosporin C und lOOOjtg Cephalosporin N.
2000 ml des Kulturfiltrats wurden durch eine Säule

υ (61 cm Höhe, 3,7 cm Durchmesser), die mit 550 ml chromatographischer Aktivkohle gefüllt war, die eine Korngröße von etwa 0,42 mm und eine Oberfläche von 1460 m²/g hatte, mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,9 V/V/Std. geleitet. Die Säule wurde mit 1000 ml reinem Wasser gewaschen. Der Ablauf wurde mit der Waschflüssigkeit vereinigt, Die Gesamtlösung wurde der Dünnschichlchromatographie an mikrokristalliner Cellulose unter Verwendung eines aus n-Butanol, Eisessig und Wasser (Volumenverhältnis 3:1 : I)

< ι bestehenden Lösungsmittelsystems unterworfen. Das Chromatogramm zeigte einen Flecken bei Rf 0.3 für Cephalosporin N und einige andere Flecken, die von dem Flecken, der dem Cephalosporin C zuzuschreiben

war, zu unterscheiden waren und positive Ninhydrin- und Jodreaktionen zeigten.

Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgemisch (pH 12,0) von 2000 ml einer 7%igen wäßrigen n-Butanollösung und 200 ml einer wäßrigen 0,ln-Natriumhydroxydlösung bei einer Raumströmungsgescliwindigkeit von 0,45 V/V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ml aufgefangen. Die Mengen an Cephalosporin C in diesen Fraktionen wurden durch Ablesen der optischen Dichten (Extinktionen) jeder Fraktion bei 260 ιτιμ für Cephalosporin C und bei 420 ιτιμ für Pigmente am Spektrophotometer überwacht.

Die optische Dichte bei 260 πιμ stieg beginnend mit der Fraktion 15 steil an, erreichte eine Spitze bei der Fraktion 20 und fiel dann, bis sie bei der Fraktion 30 fast bei 0 war. Die Extinktion der Fraktion 20 betrug 320 und der Titer von Cephalosporin C in der gleichen Fraktion

Die optische Dichte bei 420 πιμ begann bei der Fraktion 23 steil zu steigen, erreichte einen Spitzenwert bei der Fraktion 27 und fiel dann bei der Fraktion 30 bis fast auf 0. Die optischen Dichten der Fraktion 27 betrug 1,2 bei 420 πιμ und 100 bei 260 πιμ. Der Titer von Cephalosporin C in dieser Fraktion betrug 2500 μg/ml.

Die Fraktionen 10 bis 18 wurden zusammengegossen und der Dünnschichtchromatographie an mikrokristalliner Cellulose in einem Lösungsmittelsystem aus n-Butanol, Eisessig und Wasser (Volumenverhällnis 3:1 : 1) unterworfen. Das Chromatogramm zeigte den Flecken, der Cephalosporin N zuzuordnen ist, und einige weitere Flecken, die positive Ninhydrin- und Jodtests zeigten. Im wesentlichen kein Flecken konnte bei Rf 2,0 entsprechend Cephalosporin C festgestellt werden.

Die blaßgelben Fraktionen 19 bis 26, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden zusammengegossen, mit ln-Natriumhydroxyd auf pH 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 30°C eingeengt. Die gebildeten Kristalle des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 960 mg im wesentlichen farbloser Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden.

Die Wiederholung der vorstehend beschriebenen Behandlung ergab weitere Ausbeuten von Kristallen aus den Mutterlaugen. Die Gesamtausbeute betrug 2,21 g. Ein Biotfst im Vergleich zu einer authentischen Probe (ε i*. =590) des Natriumsalzes von Cephalosporin C zeigte, daß der Gehalt an Cephalosporin C-Natrium in den vorstehend genannten Kristallen 90,6 Gew.-% betrug. Die Aktivitätsaüsbeute von Cephalosporin C aus dem Kulturfiltrat betrug etwa 50%. Das Dünnschichtchromatügramm des Produkts an mikrokristalliner Cellulose in einem Lösungsmittelsystem aus n-Butanol, Eisessig und Wasser (3:1 :1) zeigte einen Flecken bei Rf 0,2 für Cephalosporin C und eine Spur eines Fleckens bei Rf 0,3. Zur Gewinnung von reinem Cephalosporin C wurde das vorstehende Produkt aus 10 ml eines Gemisches von Wasser und Äthanol (Volumenvenhältnis 1:1) umkristallisiert. Die Ausbeute nach der Umkristallisation betrug 1,68 g. Das Dünnschichtc iromatogramm und die Ultraviolett- und infrarotspektren dieses Produkts stimmten mit der authentischen Probe vollständig überein.

Beispiel 2

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedinguriger wurden 2000 ml des ft.f die in Beispiel I beschriebene Weise erhaltenen Kulturfilirats durch eine Aktivkohlesäure geleitet. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und darm mit einem Lösungsmiuelgerr.isclr(pH 11,5) aus 2000 ml einer 7%igen wäßrigen Lösung von n-Butanol und 100 ml einer wäßrigen 0,1 n-Kaliumhydroxydlösung bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,5 V/V/ Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ml aufgefangen. Jede Fraktion wurde nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden analysiert.

in Der Verlauf der optischen Dichte der Fraktionen bei 260 Γημ und 420 Γπμ war im wesentlichen identisch mit dem in Beispiel 1 genannten Verlauf. Das Dünnschichtchromatogramm jeder Fraktion wurde den Ninhydrin- und Jodtests unterworfen. Die blaßgelben Fraktionen 27 bis 36, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden vereinigt. Die Lösung wurde zur Entfernung des Kaliumions mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 1,0 V/V/Std. von oben nach unten durch eine Säule (40 χ 2,5 cm) geleitet, die mit 200 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes (freie Form, z. B. Amberlite IR-120®) grillt war. Der Ablauf (einschließlich der Waschflüssigkei'en) wurde mit 1 n-Natriumhydroxyd auf pH 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 30⁰C eingeengt.

Die hierbei gebildeten Kristalle des Nairiumsaizes von Cephalosporin C wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 1000 mg im wesentlichen farbloser Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden. Weitere Ausbeuten an Kristallen wurden aus den Mutterlaugen gewonnen. Die Gesamtausbeute betrug 2,26 g. Die Analyse gegen eine authentische Probe (ε J^ =190) von Cephalosporin-C-Natrium ergab, daß die Kristalle 92 Gew.-% Cephalosporin-C-Natrium enthielten. Die Ausbeute an Cephalosporin C-Aktivität aus dem Kulturfiltrat betrug 52%.

Dieses Produkt wurde aus 2 ml Wasser umkristallisiert, wobei 1,6 g reines Produkt erhalten wurden. Dieses Produkt stimmte im Dünnschichtchromatogramm und in den Ultraviolett- und Infrarotspektren mit der authentischen Probe vollständig überein.

B e i s ρ i e I 3

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wurden 2000 ml des auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen Kulturfiltrats durch eine Aktivkohlesäule geleitet, die dann mit Wasser gewaschen wurde. Die Kolonne wurde dann mit einem Lösungsmittelgemisch (pH 10,6) aus 2000 ml einer 7%igen wäßrigen n-Butanollösung und 200 ml wäßrigem O.ln-Ammoniak bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,45 V/ V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ml aufgefangen. Diese Fraktionen wurden nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden analysiert. Die blaßgelben Fraktionen 23 bis 32, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden vereinigt. Das Ammoniak wurde bei niedriger Temperatur von nicht mehr als 30⁰C abgedampft und dann chargenweise durch Zugabe von 200 m'l eines stark sauren Kationenaustauscherharzes (freie Form, z. B. Amberlite IR-120®,) entfernt, worauf mit 400 ml Wasser gewaschen wurde.

Das Filtrat und -!as Waschwasser wurden zusammengegossen, mit ln-Natriumhydroxyd auf pH 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 30°C eingeengt. Die hierbei gebildeten Krisulle von Cepha-Iosporin-C-Natrium wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 800 mg im wesentlichen farblose Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden. Durch wiederholte Kristallisation aus der Mutterlauge wurden insgesamt 2,22 g erhalten. Ein Biotest gegen eine authentische

Probe (e \\ =190) von Cephalosporin C-Natrium ergab, daß das Produkt 90 Gew.-% Cephalosporin C-Natrium enthielt. Die Aktivitätsausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 50%. Das Produkt wurde weiter aus 1.1 ml Wasser umkristallisiert, wobei 1,5 g reines Produkt erhalten wurden. Dieses reine Produkt stimmte im Dünnschichtchromatogramm und in den Ultraviolett- und Infrarotspektren mit der authentischen Probe völlig überein.

Beispiel 4 "

150 ml Kulturfiltrat. das auf die in Beispiel I beschriebene Weise erhalten worden war. wurden mit einer Raumströmungsgeschwiiidigkeit von 1.0 V/V/Std. durch eine Säule (30 cm Höhe, 2 cm Durchmesser) ιί geleitet, die mit 50 ml chromatographischer Aktivkohle gefüllt WHr die eine Korngröße von etwa 0.42 mm und eine Oberfläche von 1 500 m'/g hatte. Die Kolonne wurde mit 250 ml Wasser gewaschen und dann mit einem l.ösungsmittelgemisch (pH 12,0) aus 1000 ml •jincr 7%igen wäßrigen Äthylacetatlösung und 100 ml einer wäßrigen O.ln-Nalriumhydroxydlösiing bei einer Raiimströmiinasgeschwindigkeit von 0,5 V/V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ml aufgefangen. Diese Fraktionen wurden den in Heispiel I ?i beschriebenen Analysen unterworfen.

Die optische Dichte bei 260 πιμ stieg beginnend mit der Fraktion IM st^il an. erreichte einen Spitzenwert bei der Fraktion i 2 und fiel dann, bis sie bei der Fraktion 20 fast 0 erreicht hatte. Die optische Dichte bei 420 ιτιμ ο stieg beginnend mit der Fraktion 14 allmählich an und erreichte bei der Fraktion 17 einen Spitzenwert, worauf sie fiel, bis sie bei der Fraktion 25 nahezu 0 erreicht hatte.

Die blaligelben Fraktionen 10 bis 16. die überwiegend is Cephalosporin C enthielten, wurden zusammengegossen, mit In-Na'.numhydroxyd auf pH 6.5 eingestellt und hei einer Außentemperatur von nicht mehr als 30^rC eingeengt. Die erhaltenen Kristalle des Natriumsalzes '.on Cephalosporin C wurden abfütriert und getrocknet, .u, wobei 100 mg im wesentlichen farblose Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden.

Weitere Kristallisationen aus der Mutterlauge erga-Don insgesamt 170 mg Kristalle. Ein Biotest gegen eine authentische Probe (ε J^ -190) von Cephalosporin C-Natrium ergab, daß das Produkt 9! Gew.-% Cephalosporin C-Natrium enthielt. Die Ausbeute an Cephalosporin C-Aktivität aus dem Kulturfiltrat betrug 51 b°.'t). Die Umkristallisation aus 02 m! Wasser ergab i 20 mg reines Produkt. Dieses Produkt stimmte in den physikalischen und chemischen Eigenschaften mit der authentischen Probe völlig überein.

Beispiel 5

Unter den in Beispiel 4 genannten Bedingungen wurden 150 ml des Kulturfiltrats.das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten worden war, durch eine Aktivkohlesäule geleitet, die dann mit 250 ml Wasser gewaschen wurde. Die Säule wurde dann mit einem Lösungsmittelgemisch (pH 11,9) von 200 ml einer 50%igen wäßrigen Dioxanlösung und 20 ml einer wäßrigen 0.1 n-Natriumhydroxydlösung bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,5 V/V/Std- eluiert Das Eluat wurde in Fraktionen von je 10 ml aufgefangen. Die Analysenwerte dieser Fraktionen wurden nach den in Beispiel I beschriebenen Methoden verfolgt Die optische Dichte bei 260 ιημ zeigte beginnend mit der Fraktion 5 einen steilen Anstieg, erreichte bei der Fraktion 7 einen Spitzenwert und fiel dann, bis sie· bei der Fraktion 10 nahezu 0 erreicht hatte. Die optische Dichte bei 420 Γημ stieg beginnend mit der Fraktion 7 allmählich und erreichte bei der Fraktion 10 einen Spitzenwert, worauf sie fiel, bis sie bei der Fraktion 15 fast 0 erreicht hatte.

Die blaßgeiben Fraktionen 5 bis 9, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden vereinigt, mit I n-Natriumhydroxyd auf pH 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 30" C eingeengt. Die hierbei gebildeten Kristalle des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 80 mg im wesentlichen farblose Kristalle als eiste Ausbeute erhalten wurden. Durch wiederholte Kristallisation aus der Mutterlauge wurden insgesamt 16£! mg erhalten. Ein Biotest gegen eine authentische Probe (f. W =190) des Natriumsalzes von Cephalosporin C ergab, daß dieses Produkt eine Reinheit von 90 Gev .% hatte. Die Ausbeute an Cephalosporin C-Aktivität aus dem Kulturfiltrat betrug 50.5%. Durch I '!«kristallisation aus 0,5 ml eines Gemisches von Wasser und Äthanol (Volumenverhältnis I :1) wurden 110mg reines Produkt erhalten. Dieses Produkt stimmte im Dünn schichtchromatogramm. in der optischen Drehung und in den Ultraviolett- und Infrarotspektren mit einer authentischen Probe des Natriumsalzes von Cephalosporin C völlig überein.

Beispiel 6

Unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen wurden 1 50 ml des Kulturfiltrats, das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten worden war. durch eine Aktivkohlesäule geleitet, die dann mit 250 ml Wasser gewaschen wurde. Die Säule wurde dann mit einem Lösungsmittelgemisch (pH 12,1) von 200 ml einer 5O°/oigen wäßrigen Acetonlösung und 20 ml einer wäßrigen 0.1 n-Natriumhydroxydlösung bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0.5 V/V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 10 ml aufgefangen. Die Analysenwerte dieser Fraktionen wurden durch die in Beispiel 1 beschriebene Dünnschichtchromatographie verfolgt.

Die blaßgelben Fraktionen 5 bis 9. die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden vereinigt, mit 1 n-Natriumhydroxyd auf pH 6.5 eingestellt und bei einer äußeren Temperatur von nicht mehr als 30° C eingeengt. Die hierbei gebildeten Kristalle des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 75 mg im wesentlichen farblose Kristalle als er. .ε Ausbeute erhalten wurden. Durch wiederholte Kristallisation aus der Mutterlauge wurden insgesamt 162 mg erhalten. Ein Biotest gegen eine authentische Probe (ε Ji — 190) des Natriumsalzes von Cephalosporin C ergab, daß dieses Produkt eine Reinheit von 92 Gew.-% hatte. Die Ausbeute an Cephalosporin C-Aktivität aus dem Kulturfiltrat betrug 49%. Durch Umkristallisation aus 03 ml eines Gemisches von Wasser und Äthanol (Volumenverhältnis 1:1) wurden 105 mg reines Produkt erhalten. Dieses Produkt stimmte im Dünnschichtchromatogramm, in der optischen Drehung und in den Ultraviolett- und Infrarotspektren mit einer authentischen Probe von Cephalosporin C völlig Oberein.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus rohen wäßrigen Lösungen, die Cephalosporin C enthalten, durch Adsorption an Aktivkohle und anschließende Elution, dadurch gekennzeichnet, daß man eine fraktionierte Elution mit einem Gemisch von Wasser und einem niederen Alkanol, niederen Keton, niederen Alkylester, einer niederen Fettsäure oder einem cyclischen Äther bei einem pH-Wert von 7,5 bis 13,0 durchführt, wobei das Volumenverhältnis zwischen Wasser und dem organischen Lösungsmittel 15 :1 bis 1 :3 beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Elutionsmittel einen pH-Wert von 9,5 bis 12,0 hat.