DE1072774B - Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von Verbindungen mit Novobiocinaktivität - Google Patents

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen, Reinigen und Konzentrieren von Novobiocin, Dihydronovobiocin und anderen Novobiocinanalogen aus diese enthaltenden Lösungen oder Suspensionen, z. B. Gärmedien, in welchen Novobiocin oder seine Analogen entwickelt sind und welche außerdem Mikroorganismenmyzel und Nährstoffe enthalten.

Bisher wurde Novobiocin aus Gärmedien, in welchen dieses Antibiotikum gewachsen war, durch zeitraubende Maßnahmen, einschließlich wiederholter Lösungsmittelextraktion und Umkristallisieren, isoliert und getrennt.

Es wurde nun gefunden, daß Novobiocin und Novobiocinanalogen, die in folgendem als novobiocinaktive Verbindungen bezeichnet werden, aus diese enthaltenden Lösungen oder Suspensionen, z. B. Gärmedien, Rohkonzentraten, Extrakten, abgetrennt und gereinigt werden, wenn man diese Lösungen oder Suspensionen mit einem stark basischen Anionenaustauschharz behandelt und aus diesem die novobiocinaktive Verbindung eluiert.

Vorliegende Arbeitsweise hat gegenüber den bekannten Verfahren zur Gewinnung von Novobiocinaktivität durch Lösungsmittelextraktion oder -verteilung den Vorteil, daß die Raummengen der zu behandelnden Flüssigkeit bei der neuen Arbeitsweise vergleichsweise klein sind und daher die Betriebsanlage und Laboratoriumseinrichtungen zu ihrer Durchführung äußerst klein gehalten werden können.

Ein weiterer Vorteil der neuen Arbeitsweise liegt darin, daß die Novobiocinaktivität, verglichen mit der nur teilweisen Gewinnung der Novobiocinaktivität nach anderen Verfahren wie Lösungsmittelextraktion, praktisch vollständig bei Verwendung von Anionenaustauschharzen unter optimalen Bedingungen gewonnen wird.

Bei der erfmdungsgemäßen Arbeitsweise wird die Novobiocin enthaltende Flüssigkeit mit einem stark basischen, polymeren, organischen, stickstoffhaltigen Anionenaustauschharz behandelt; hierbei wird die Novobiocinaktivität an dem Harz adsorbiert und danach durch Abtrennung des Harzes aus der Lösung und Eluieren der novobiocinaktiven Verbindungen gewonnen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer geeigneten Säule oder durch Behandlung von Ansätzen eines novobiocinaktiven Stoffes in Behältern durchgeführt werden. Im ersteren Falle wird das Harz in einer senkrechten Säule gepackt und die novobiocinaktive Lösung durch das Harzbett geleitet. Die aus der Säule abströmende Flüssigkeit wird fortlaufend geprüft, ob ihre Novobiocinaktivität ein willkürlich angenommenes Minimum überschreitet. Wenn der Mindestwert erreicht ist, wird die Zufuhr der

Verfahren zum Abtrennen und Reinigen

von Verbindungen mit Novobiocinaktivität

Anmelder: Merck & Co., Inc., Rahway, N.J. (V. St. A.)

Vertreter: E. Maemecke, Berlin-Lichterfelde West,

und Dr. W. Kühl, Hamburg 36, Esplanade 36 a,

Patentanwälte

Beanspruchte Priorität: V. St v. Amerika vom 21. Mai 1957

Frank James Wolf, Westfield, N. J. (V. St. Α.), ist als Erfinder genannt worden

Frischlösung unterbrochen und die adsorbierte novobiocinaktive Verbindung aus dem Harz mittels einer durchfließenden geeigneten Lösung eluiert.

Das abgestreifte Harz wird dann mittels einer geeigneten Lösung regeneriert und gegebenenfalls unter Zusatz von frischem Harz dem Adsorptionsverfahren wieder zugeführt.

Bei absatzweiser Durchführung des Verfahrens wird das Anionenaustauschharz in einem geeigneten Behälter mit der novobiocinaktiven Lösung bewegt; die' Mengenverhältnisse von Harz und Lösung werden empirisch aufeinander eingestellt. Wenn die Konzentration der Novobiocinaktivität in der Lösung auf den gewünschten Wert gesunken ist, wird die Lösung z. B. durch Abgießen von dem Harz getrennt. Sodann wird die novobiocinaktive Verbindung aus dem Harz gegebenenfalls in einer Säule eluiert.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden novobiocinaktive Verbindungen an dem Ionenaustauschharz aus dem ganzen Gärmedium, welches außer den novobiocinaktiven Verbindungen Mikroorganismenmyzel, Nährstoffe und verschiedene Nebenprodukte der Gärung enthält, adsorbiert. In diesem Fall setzt man das Harz dem Gärmedium nach der Ernte zu, läßt die novobiocinaktive Verbindung in dem Gärmedium durch das Harz adsorbieren und trennt das nunmehr bela'dene Harz z. B. durch Filtrieren, Absieben, mittels Frü'ssigkeitszyklonen, Riffeltischen, Sichtern usw. ab. Siebe, deren Maschenweite das Harz zurückhalten und das Myzel passieren

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lassen, mit normalerweise etwa 4 bis 80 Maschen/cm sind hierfür besonders geeignet, weil die Siebe nicht durch Myzel oder Gärmedium verstopft werden. Die Abtrennung wird durch Verwendung von Schüttelsieben erleichtert.

Für das vorliegende Verfahren geeignete Ionenaustäuschharze sind besonders stark basische, polymere, stickstoffhaltige Anionenaustauschharze, namentlich solche mit quaternären Ammonium- oder Aminogruppen an einem Styrol-Divinylbenzolgerüst als Matrix. Die »Dowex«-Harze, z. B. »Dowex 1-X2«, »Dowex 1-X4« und »Dowex 2-X4«; die »Amberlite«- Harze, z.B. »AmberliteIRA-400«, »Amberlite IRA-401«, »Amberlite IRA-411« und »Amberlite XE-98«; die »Duolite«, z.B. »DuoliteA-40«, »DuoliteA-IOl« und »Duolite A-102«, sind Beispiele für diesen Harztypus. Diese Handelsnamen sind geschützte Warenzeichen. Aber auch andere Ionenaustauschharze mit stark basischem Charakter können benutzt werden.

Die Teilchengröße des Harzes ist nicht entscheidend; jedoch erweisen sich solche mit 4 bis 80 Maschen/cm, vorzugsweise mit 14 bis 40 Maschen/cm, als für die Adsorption besonders geeignet.

Um die adsorbierte Novobiocinaktivität aus dem Ionenaustauschharz zu eluieren, bedient man sich einer wäßrigen elektrolythaltigen Eluierungslösung, am besten in einem organischen Lösungsmittel für das Antibiotikum. Wäßrige saure Lösungen, welche ein organisches Lösungsmittel für die novobiocinaktive Verbindung enthalten, erweisen sich als besonders wirksam. Zu nennen sind hier z. B. wäßrige Lösungen von Salzsäure oder Essigsäure zusammen mit einem geeigneten mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. einem Alkohol oder Keton, Die Konzentration der sauren Verbindung in der Elutionslösung beträgt vorzugsweise etwa 1 bis 10 Gewichtsteile je 100 Volumteile Lösung. Die organische Phase kann aus etwa 70 bis 98% organischem Lösungsmittel und etwa 30 bis 2 % Wasser bestehen.

Die Eluierung kann säulen- oder absatzweise durchgeführt werden. Wegen der geringeren Raummengen und der relativen Leichtigkeit der periodischen Analyse des Eluates und dessen Aufteilung in Fraktionen wird der säulenweise Betrieb bevorzugt.

Das Eluat kann z. B. zur weiteren Reinigung anschließend behandelt werden, z. B. unter Durchleiten durch eine chromatographische Säule, etwa aus Aluminiumoxyd, welches mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen war, und Behandlung des gereinigten und entfärbten Eluates mit einer sauren Lösung, z. B. Methanol-Essigsäure-Lösung, um die Novobiocinsäure auszukristallisieren. Die Kristalle werden nitriert, mit Wasser-Methanol-Lösung od. dgl. gewaschen, filtriert und getrocknet. Die Novobiocinsäure kann durch entsprechende Neutralisation in verschiedene Novobiocinsalze übergeführt werden. Eluate, welche Novobiocinanalogen wie Dihydronovobiocin enthalten, können in ähnlicher Weise aufgearbeitet werden.

Der weiteren Erläuterung der Erfindung dienen nachstehende Beispiele. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht an in den Beispielen enthaltende Werte gebunden.

Beispiel 1

25 ecm filtriertes Gärmedium, welches durch Kultivierung eines Novobiocin erzeugenden Stammes von Streptomyces spheroides in einem geeigneten Nährstoff erhalten war und etwa 7200000 Einheiten Novobiocinaktivität enthielt, wurde durch eine Säule geleitet, welche mit 500 ecm Ionenaustauschharz »Amberlite IRA-411« beschickt war. Das Harz wurde in seiner Chloridphase verwendet. Die Berührungszeit von Lösung und Harz in der Säule betrug etwa 10 Minuten. Die ablaufende Flüssigkeit enthielt keine meßbare Novobiocinaktivität. Das Harz wurde nacli Berührung mit der Lösung zur Entfernung der Verunreinigungen mit 95%igem Methanol gewaschen. Novobiocin wurde dann mittels einer Lösung, welche 16% konz. Salzsäure und 85% Methanol enthielt, eluiert. Die Novobiocinaktivität des Eluates betrug 4500000 Einheiten. Das Eluat hatte ein Gesamtvolumen von weniger als 3 1 und enthielt etwa 62% der Novobiocinaktivität der behandelten Kulturflüssigkeit.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde mit 33 1 filtriertem novobiocinhaltigem Gärmedium, welches eine Aktivität von 270 Einheiten Novobiocin/ccm zeigte, und mit 300 ecm Harz in der Chloridphase bei einer Berührungszeit von etwa 25 Minuten wiederholt. Das Eluat betrug etwas mehr als 3 1 und enthielt etwa 82 % der gesamten in der ursprünglichen Lösung vorhandenen Novobiocinaktivität.

Beispiel 3

Zwei Portionen zu 30 ecm »Dowex 1-X2«-Harz (20 bis 40 Maschen/cm) in der Chloridphase wurden in 300 ecm eines !infiltrierten novobiocinhaltigen Gärmediums einer Aktivität von 510000 Einheiten eingetragen. Jede Harzportion wurde aus der verbrauchten Gärflüssigkeit mittels eines 28-Maschen-Siebes gesiebt, nach einer Berührungszeit von 10 Minuten in eine Kolonne (2,5 cm Durchmesser) eingebracht und dort mit einer Lösung eluiert, welche 16% konz. Salzsäure und 84% Methanol enthielt. Das Eluat zeigte eine Aktivität von 202 000 Einheiten.

Beispiel 4

5 g Natriumdihydronovobiocin wurden in 500 ecm Wasser gelöst; danach wurden 50 ecm »Dowex 1-X2«- Harz in der Chloridphase eingetragen. Die Lösung blieb sodann 3 Stunden stehen. Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. 17 ecm Harz wurden in einer Kolonne mit einer Lösung eluiert, welche 16 ecm konz. Salzsäure und 84 ecm Methanol enthielt. Das Eluat zeigte 95% der Dihydronovobiocinaktivität der Beschickung.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von Verbindungen mit Novobiocinaktivität aus diese enthaltenden Lösungen oder Suspensionen, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Lösungen oder Suspensionen mit einem stark basischen Anionenaustauschharz behandelt und aus diesem die novobiocinaktive Verbindung eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die novobiocinaktive Verbindung aus dem Ionenaustauschharz mittels einer sauren, z. B. salzsauren Lösung, die zweckmäßig ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, für die novobiocinaktive Verbindung enthält, eluiert wird.

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