DE2519382A1 - Verfahren zur gewinnung einer gereinigten alpha-galactosidase aus einer alpha-galactosidase enthaltenden fluessigkeit - Google Patents
Verfahren zur gewinnung einer gereinigten alpha-galactosidase aus einer alpha-galactosidase enthaltenden fluessigkeitInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer gereinigten
Gt-Galactosidase. Insbesondere befasst sich die Erfindung
mit einem Verfahren zur Gewinnung einer oG-Galactosidase
mit hoher Reinheit aus einer oi-Galactosidase-enthaltenden
Kulturbrühe, die durch Züchten eines Qf-Galactosidaseerzeugenden
Mikroorganismus erhalten wird, oder aus einerίί-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit, die durch Extraktion von oc-Galactosidase aus den Mikroorganismenzellen nach dem
Züchten gewonnen worden ist.
Es ist bekannt, dass cC-Galactosidase durch Mikroorganismen,
wie Strahlenpilze, Schimmelpilze etc. erzeugt wird. Sie ist ein Enzym, welches die Fähigkeit besitzt, Raffinose zu Rohrzucker
und Galactose zu hydrolysieren. Bei der Rübenzuckererzeugung in der Industrie wird dieses Enzym zur Hydrolyse der
Raffinose eingesetzt, die in der Rübenzuckerlösung vorliegt,
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beispielsweise in dem Rübensaft und in den Rübenmelassen, um
die Ausbeute an Rohrzucker zu verbessern. Ferner wird c^-Galactosidase
mit hoher Reinheit als Strukturermittlungsmittel in der Chemie sowie in der Biochemie eingesetzt.
e£-Glactosidase besitzt die Fähigkeit, die iX-Galactosidverknüpfung
in Sacchariden aufzuspalten. Kann man eine Cc-Galactosidase
mit hoher Reinheit auf billigem Wege herstellen, so ist es möglich, dieses Enzym zur Herstellung von Nahrungsmitteln,
Arzneimitteln, Drogen, Reagentien etc. sowie zur Herstellung von Rübenzucker und zur Bestimmung der Strukturen von
chemischen Verbindungen in wirtschaftlicher Weise einzusetzen.
Die ö£-Galactosidase, die durch das Züchten eines Mikroorganismus
erzeugt wird, tritt hauptsächlich innerhalb der Zellen des Mikroorganismus auf. Um eine tfC-Galactosidase mit hoher Reinheit
aus dem Mikroorganismus zu erhalten, muss daher das erzeugte Enzym aus den Zellen extrahiert und dann einer Reinigungsbehandlung
"unterzogen werden.
Es war bisher bekannt, die Extraktion von Pf-Galactosidase in
der Weise durchzuführen, dass die Zellen, welche die gebildete i£-Galactosidase enthalten, physikalisch aufgebrochen werden.
Dabei ist jedoch der Gewinnungsgrad der #-Galactosidase sehr
niedrig und liegt in der Grössenordnung von 40 bis 50 %, wobei die Reinheit nicht in ausreichendem Maße hoch ist. Es ist ferner
bekannt, die (X-Galactosidase aus den Mikroorganismenzellen zu
extrahieren und sie auf chemische Weise zu reinigen, beispielsweise durch Ausfällung der 06-Galactosidase unter Einsatz von
Ammoniumsuifat, Tannin oder einem organischen Lösungsmittel. Die
nach diesen Methoden erhaltenen Extrakte enthalten jedoch Verunreinigungen,
wie Fremdproteine, Zucker, Nukleinsäuren, Fette
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etc./ und zwar in hohen Konzentrationen, so dass es erforderlich ist, ein Extraverfahren zur Reinigung anzuschliessen.
Keine dieser Methoden hat es bisher ermöglicht, et-Galactosidase
in einem Verfahren in wirksamer Weise zu gewinnen und zu reinigen.
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur leichten Gewinnung von ^T-Galactosidase mit hoher Reinheit sowie
in einer hohen Ausbeute aus einer o^-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit.
Zur Lösung der vorstehend umrissenen Aufgabe wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Verfügung gestellt, welches darin
besteht, die #-Galactosidase-enthaltende Flüssigkeit in Kontakt
mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz in Gegenwart einer Pufferlösung zu bringen und damit die OC-Galactosidase
selektiv an dem Harz zu adsorbieren, worauf anschliessend die adsorbierte cC-Galactosidase von dem Harz unter Einsatz
einer Pufferlösung desorbiert wird, wobei im Falle dieser Pufferlösung wenigstens einer der zwei Faktoren Konzentration
und pH-Wert einen höheren Wert besitzt als die Pufferlösung, die zur Adsorption eingesetzt wird.
Da die in der Flüssigkeit vorliegende CC-Galactosidase selektiv
durch das Ionenaustauscherharz adsorbiert wird und damit in einfacher Weise von der Mutterlauge abgetrennt werden kann,
ist das erfindungsgemässe Verfahren besonders einfach im Vergleich
zu den üblichen Rexnigungsverfahren und gestattet eine Verbesserung der Ausbeute, wobei ferner der Vorteil erzielt
wird, dass die WärmeStabilität der vC-Galactosidase, die nach
dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigt wird, um ungefähr
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100C über die Wärmestabilität hinaus gesteigert wird, die im
Falle einer j^-Galactosidase festgestellt wird, die nach einer
der bekannten Methoden gereinigt wird. Infolge einer derartigen Erhöhung der Wärmestabilität kann die erzeugte öi-Galactosidase
innerhalb eines breiteren Bereiches von Reaktionsbedingungen eingesetzt werden.
Die Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung näher erläutert.
Diese ist eine graphische Darstellung, welche die Wärmestabilität des nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigten
Enzyms im Vergleich zu der Wärmestabilität eines Enzyms wiedergibt, das nach einem üblichen Verfahren gereinigt worden ist.
Die bisher für die Reinigung von (fc-Galactosidase bekanntgewordenen
Verfahren sind mit verschiedenen Nachteilen behaftet, beispielsweise mit einem schlechten Gewinnungsgrad, einer unzureichenden
Reinheit sowie nach einer komplizierten Verfahrensweise. Es stellte sich daher die Aufgabe, eine neue Methode zu
finden, mit deren Hilfe in vorteilhafter Weise ^i-Galactosidase
erhalten werden kann. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch
gelöst, dass öC-Galactosidase selektiv an einem Ionenaustauscherharz
adsorbiert wird, welches in spezifischer Weise die <%-Galactosidase
zu binden vermag. Es wurde ein Ionenaustauscherharz gefunden, welches diesen Zweck zu erfüllen vermag. Die Erfindung
beruht auf der Erkenntnis, dass ein schwach saures Kationenaustauscherharz in spezifischer Weise o£-Galactosidase in Gegenwart
einer Pufferlösung unter bestimmten Bedingungen zu adsorbieren vermag, wobei eine Desorption unter Einsatz einer Pufferlösung
möglich ist, die ebenfalls bestimmten Bedingungen genügen muss. Diesen Erkenntnissen liegt die Erfindung zugrunde. Als 6C^-Galactosidase-enthaltende
Flüssigkeit, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren behandelt werden kann, kann man jede C-Galactosidase-
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enthaltende Kulturbrühe verwenden, die durch Züchten einer der bekannten ß-Galactosidase-erzeugenden Mikroorganismen erhalten
wird, oder auf eine öi-Galactosidase-enthaltende Flüssigkeit
zurückgreifen, die durch Extraktion der #C-Galactosidase
erhalten wird, die in gefrorenen Mikrozellen oder in getrockneten Mikrozellen enthalten sind. Die Konzentration der (Χ-Galactosidase
in der Brühe oder Flüssigkeit schwankt nur geringfügig. Insbesondere im Falle einer öC-Galactosidase, die beim Züchten
von Schimmelpilzen gebildet wird, wird die cC-Galactosidase
aus den Zellen durch physikalische oder chemische Behandlung der Zellen extrahiert, da das Enzym hauptsächlich innerhalb der
Zellen der Schimmelpilze auftritt. Der dabei erhaltene Extrakt wird der Behandlung unterzogen.
Das zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzte
Ionenaustauscherharz ist ein schwach saures Kationenaustauscherharz. Beispiele für ein derartiges Harz sind Aniberlite
IRC-50, IRC-75, IRC-84, CG 50 (Produkte der Rohm & Haas
Company, USA), Duolite CS-101, CS-100 (Produkte der Diamond
Alkali Co.,' USA), Permutit H-7 (Produkt der Permutit Co., USA), Ionac C-270 (Produkt der American Zeolite Corporation, USA),
Wofatit CN (Produkt der Farbenfabriken Wolfen, DDR), IMAC C-19
(Produkt der Industrieele Maatschppij Activit N.V., Holland), Dowex CCR-2 (Produkt der Dow Chemical Co., USA) etc.
Zur selektiven Adsorption der öt-Galactosidase durch ein derartiges
Ionenaustauscherharz oder zur Desorption der adsorbierten ä£-Galactosidase von dem Ionenaustauscherharz wird eine Pufferlösung
verwendet, beispielsweise eine Lösung von Phosphorsäure, Essigsäure, Natriumchlorid oder Kaliumchlorid. Die Adsorption
oder Desorption des Enzyms steht in einer engen Beziehung zu der Art, Konzentration und dem pH-Wert der jeweils ein-
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gesetzten Pufferlösung.
Zunächst wird ein Beispiel beschrieben, bei dessen Durchführung die Adsorption von #-Galactosidase durch das Ionenaustauscherharz
sowie die Desorption der adsorbierten tfC-Galactosidase von
dem Harz unter Einsatz von Phosphatpufferlösungen durchgeführt werden.
Sieben Glasrohre werden mit einem Ionenaustauscherharz (Amberlite
CG-50) gefüllt, worauf Phosphatpufferlösungen mit einer festen Konzentration von 0,1 Mol, die auf verschiedene pH-Werte
eingestellt worden sind, durch die Ionenaustauscherharzbette in den Glasrohren geschickt werden, um das Ionenaustauscherharz
zu äquilibrieren oder in den Gleichgewichtszustand zu bringen. Danach wird eine 0,5 ml-Portion der oi-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit (Gesamt- Gd-Galactosidase-Aktivität 202 500 Einheiten)
in jedes der Ionenaustauscherharzbetten eingeführt. Die Ergebnisse der #-Galactosidase-Adsorption, die dabei erhalten
werden,gehen aus der Tabelle I hervor. Unter dem Begriff "oC-Galactosidase-Aktivität"
ist die Aktivität zu verstehen, die nach dem PNPG-Verfahren bestimmt wird.
Dann wird eine Phosphatpufferlösung mit entweder einer höheren
Konzentration oder einem höheren pH-Wert als die Phosphatpufferlösung, die zur Adsorption verwendet worden ist, durch
jedes Ionenaustauscherharzbett geschickt, an dem die 0C-Galactosidase
unter den zuvor geschilderten Bedingungen adsorbiert worden ist. Die Ergebnisse der Desorption, die dabei erzielt werden,
gehen aus der Tabelle II hervor. Teil A der Tabelle II zeigt die Ergebnisse der (K-Galactosidase-Desorption, die.dann erzielt
werden, wenn durch das Harz, an dem die CC-Galactosidase unter
den Bedingungen gemäss Tabelle I adsorbiert worden ist, eine
Phosphatpufferlösung geschickt wird, deren pH-Wert gleich der
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Pufferlösung ist, die zur Durchführung der Adsorption eingesetzt worden ist und von dieser Lösung nur durch eine höhere
Konzentration von 0,2 Mol verschieden ist. Die Ergebnisse der Oi-Galactosidase-Desorption, die durch Behandlung des Harzes
erhalten wird, an dem ^-Galactosidase adsorbiert ist, und zwar
unter Einsatz einer Phosphatpufferlösung, deren Konzentration
gleich der Phosphatpufferlösung ist, die zur Durchführung der
Adsorption eingesetzt worden ist und sich nur aufgrund eines erhöhten pH-Wertes von 9,2 von der anderen Lösung unterscheidet,
gehen aus Teil B der Tabelle II hervor. In der Tabelle handelt es sich bei den Adsorptionsgraden und bei den Gewinnungsgraden
der (/-Galactosidase jeweils um Werte, die auf der Basis der
Gesamt-oC-Galactosidase-Aktivität vor der Adsorptionsbehandlung,
die als 100 gewählt wird, berechnet worden sind.
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CjO CO
Phosphatpuffer--- Konzen- n
lösung tration (Mol) '
Menge der adsorbierten CC -G (Einheiten)
o6-G-Adso rptionsgrad (%)
Tabelle I
(Adsorption der i^-Galactosidase)
(Adsorption der i^-Galactosidase)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
4,5 5,3 5,9 6,5 7,0 8,0 9,2
200 225 201 825 201 840 191 700 122 175 70 875 52 750
99 100 100 95 61 35 27
Phospliatpuffer-- Konzenlösung
tration (Mol)
Menge der desorbierten u6-G (Einheiten)
0C-G -Gewinnungsgrad, (%)
0,2
4,5
745 0,0
Phosphatpuffer- Konzentration (Mol) u'1
Pw 9,2
lösung
0,2
5,3
!■ 3
0,2 9,2
| Tabelle | II | (A) | ) | 0, | 2 | 0,2 |
| (Desorption | von | oc -g: | 7, | 0 | 8, 0 | |
| 0,2 | o, | 2 | ||||
| 5,9 | 6, | 5 | ||||
0,2
C
420 166 050 117 320 67 225 43
82 57 33 Tabelle II (B)
0,2 9,2
Menge der desorbierten oC-G (Einheiten)
(X -G -Gewinnungsgrad, (%)
199 800 184 275 128 925 8 97 94 63 0,2 9,2
675 0,0
0,2 9,2
670 0,0
CO
cn
CD
ro
Aus den vorstehenden Tabellen ist zu ersehen, dass dann, wenn die Adsorption von <£-Galactosidase durch das Ionenaustauscherharz
in Gegenwart einer Phosphatpufferlösung versucht wird,
deren Konzentration 0,1 Mol beträgt, 95 % oder mehr der gesamten vorliegenden Ci-Galactosidase von dem Harz adsorbiert werden,
sofern der pH-Wert in einen Bereich zwischen 4 und 6,5 fällt. Bei der Desorption der adsorbierten &'-:Galactosidase von dem
Harz besteht dann, wenn die Adsorption unter einem relativ niedrigen pH-Wert von 4 bis 6 durchgeführt worden ist, eine Neigung
dahingehend, dass die Desorption durch eine Erhöhung des pH-Wertes der Pufferlösung eher erleichtert wird als durch eine
Erhöhung der Konzentration dieser Lösung. Wurde die Adsorption bei relativ hohen pH-Werten von 6 bis 6,5 durchgeführt, dann besteht
jedoch eine Neigung, dass die Desorption mehr durch eine Erhöhung der Konzentration der Pufferlösung als durch eine Erhöhung
ihres pH-Wertes erleichtert wird.
Nachfolgend wird ein Versuch beschrieben, bei dessen Durchführung die Adsorption von OC-Galactosidase durch das Ionenaustauscherharz
und die Desorption der adsorbierten c^-Galactosidase
von dem Harz unter Einsatz von Acetatpufferlösungen durchgeführt werden.
Sechs Glasrohre werden mit einem Ionenaustauscherharz (Amberblite
CG—50) gefüllt, worauf Acetatpufferlösungen mit verschiedenen
Konzentrationen, die auf verschiedene pH-Werte eingestellt worden sind, durch die Ionenaustauscherharzbetten in den Glasrohren
geschickt werden, um das Ionenaustauscherharz in den Gleichgewichtszustand zu bringen. Anschliessend wird eine 0,5 ml-Portion
einer OC-Galactosidase-enthaltenden Flüssigkeit (Gesamt-o6-Galactosidase-Aktivität
202 500 Einheiten) in jedes der Ionenaustau-
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scherharzbetten eingeführt. Die Ergebnisse der αί-Galactosidase-Adsorption,
die dabei ermittelt werden, gehen aus der Tabelle III hervor.
Die Teile A, B und C der Tabelle IV zeigen jeweils die Ergebnisse der O^-Galactosidase-Desorption, die dann erhalten
werden, wenn durch das Harz, an dem ui-Galactosidase adsorbiert
ist, eine Acetatpufferlösung mit einer höheren Konzentration oder mit einem höheren pH-Wert geschickt wird als im Falle
der Acetatpufferlösung, die zur Durchführung der Adsorption eingesetzt wird. Die Desorption wird unter Einsatz einer
Pufferlösung durchgeführt, die auf den gleichen pH-Wert wie
die Pufferlösung eingestellt ist, die zur Durchführung der Adsorption
verwendet wird, wobei sie eine höhere Konzentration von 0,2 Mol (Teil A) aufweist. Dann wird die Desorption der
zurückgebliebenen adsorbierten ^-Galactosidase von dem Harz unter Einsatz einer Pufferlösung durchgeführt, die eine noch
höhere Konzentration von 1,0 Mol (Teil B) aufweist.Abschliessend
wird die Desorption von noch zurückgebliebener 0C-Galactosidase
von dem Harz unter Einsatz einer Acetatpufferlösung versucht, die auf einen pH-Wert von 9,2 eingestellt worden ist
und eine Konzentration von 0,2 Mol (Teil C) aufweist.
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Tabelle III (Adsorption von &
Acetat- Konzen- 0,05 0,05 0,05 0,05 0,01 0,01
puffer- tration lösung (Mol)
P11 3,5 4,1 5,0 5,9 4,1 5,0
Menge der adsorbierten 0,-G 178 925 201 505 201 875 18 200 141 750 200 950
(Einheiten)
a-G-Adsorptions- 88,4 99,5 99,7 8,9 70,0 99,2
grad (%)
Tabelle IV (A) (Desorption von
Acetat- Konzen-
puffer- tration 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
lösung (Mol)
pH 3,5 4,1 5,0 5,9 4,1 5,0
Menge der desor- 825
bierten Oi-G (Einheiten)
Ä-G-Gewinnungs- 0,0 0,0 0,0 5,3 0,0 0,1
grad (%)
Tabelle IV (B)
Acetat- Konzen-
puffer- tration 1,0 1,0 1,0 - 1,0 1,0
lösung (Mol)
P^ 3,5 4,1 5,0 - 4,1 5,0
Menge der desor-
bierten U-G- 675 620 202 250 - 650 199
(Einheiten)
OC-G-Gewinnungs- 0,0 0,0 99,9 - 0,0 98,5
grad (%)
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| o, 9, |
NJ N) | Tabelle IV (C) | 9, | |
| Acetat- Konzen- puffer- tration lösung (Mol) |
177 | 625 | 0,2 9,2 |
,2
,2 |
| Menge der desor- bierten OC-G (Einheiten) |
87 | ,7 | 202 100 | 700 |
| 0C -G-Gewinnungs- | 99,8 | o, | ||
| ,0 |
0,2 0,2
9,2 9,2
140 150 620
69,2 0,0
grad (%)
Aus der Tabelle III ist zu ersehen, dass dann, wenn die Adsorption
der #,-Galactosidase durch das Ionenaustauscherharz in Gegenwart
einer Acetatpufferlösung durchgeführt wird, deren Konzentration zwischen 0,01 und 0,05 Mol liegt, 70 % oder mehr der gesamten
vorliegenden öT-Galactosidase von dem Harz adsorbiert werden, wenn
der pH-Wert in einen Bereich zv/ischen 3,5 und 5 fällt, wobei
jedoch auch zu ersehen ist, dass der Adsorptionsgrad scharf abfällt, wenn der pH-Wert über die obere Grenze des Bereiches hinaus
erhöht wird. Es ist festzustellen, dass bei der Desorption der
adsorbierten ££-Galactosidase von dem Harz die Desorption mehr
durch eine Erhöhung des pH-Wertes der Desorptionspufferlösung als durch eine Erhöhung der Konzentration derselben (vgl. Tabelle
IV) erleichtert wird, wenn die vorangegangene Adsorption in der Nähe eines pH-Wertes von 4 durchgeführt wird. Ist die
Adsorption in der Nähe eines pH-Wertes von 5 durchgeführt worden, dann besteht jedoch eine Neigung dahingehend, dass die Desorption
der adsorbierten oC-Galactosidase mehr durch eine Erhöhung der
Konsentration der Desorptionspufferlösung als durch eine Erhöhung
ihres pH-Wertes erleichtert wird. Wird die Desorption der adsorbierten iJC-Galactosidase durch eine Pufferlösung mit einem pH-Wert
zwischen 6 und 9 versucht, dann können praktisch 100 % der gesamten von dem Ionenaustauscherharz adsorbierten cO-Galactosidase
desorbiert und gewonnen werden. Mit steigendem pH-Wert werden jedoch auch andere Proteine als QL-Galactosidase, die durch
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-' 13 -
das Harz adsorbiert worden sind, desorbiert und setzen die spezifische fli-Galactosidase-Aktivität herab ( OC-Galactosidase-Aktivität
pro mg Proteine). Daher kann eine öC-Galactosidase
mit einer hohen spezifischen Aktivität unter Einsatz einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von nicht mehr als 7 zur Desorption
der adsorbierten C^-Galactosidase erhalten werden.
Wird die Adsorption der #-Galactosidase durch das Ionenaustauscherharz
und die Desorption der adsorbierten #-Galactosidase von dem Harz unter Einsatz einer Pufferlösung aus
Natriumchlorid oder Kaliumchlorid versucht, dann zeigt die Adsorption eine Neigung, die derjenigen ähnlich ist, die bei
der Adsorption unter Einsatz einer Phosphatpufferlösung beobachtet
wird. Im Falle einer Chloridpufferlösung, die auf einen pH-Wert von 5 eingestellt worden ist und eine Konzentration
von 0,05 Mol aufweist, übersteigt der Adsorptionsgrad der c6-Galactosidase 90 %. Es besteht eine Neigung dahingehend,
dass die Desorption mehr durch eine Erhöhung des pH-Wertes der Pufferlösung als durch eine Anhebung ihrer Konzentration
erleichtert wird.
Die Pufferlösung, die für die Adsorption verwendet wird, muss nicht von der gleichen Art sein, wie die Lösung, die für die
Desorption eingesetzt wird. Beispielsweise kann die Oi-Galactosidase,
die durch das Ionenaustauscherharz in Gegenwart einer Acetatpufferlösung oder einer Natriumchloridpufferlösung adsorbiert
worden ist, unter Einsatz einer Phosphatpufferlösung desorbiert werden. Umgekehrt kann eine £?£-Galactosidase, die
von dem Harz in Gegenwart einer Phosphatpufferlösung adsorbiert, worden ist, unter Einsatz einer Acetatpufferlösung desorbiert
werden. In jedem Falle ist es wesentlich, dass die für die De-
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sorption eingesetzte Pufferlösung die Pufferlösung, die für
die Absorption verwendet worden ist, wenigstens bezüglich einer der Faktoren Konzentration und pH-Wert übersteigt. Ist
dies nicht der Fall, dann wird keine ausreichende Desorption festgestellt.
Die Temperatur, bei welcher die Adsorption der #-Galactosidase
durch das Ionenaustauscherharz oder die Desorption der adsorbierten ct-Galactosidase von dem Harz durchgeführt wird, übt
keine merkliche Wirkung auf den Gewinnungsgrad aus. Es ist nur erforderlich, dass die Temperatur niedriger ist als die
höchste Temperatur, bei welcher das Ionenaustauscherharz bei seiner Verwendung stabil ist, wobei die Temperatur ferner niedriger
sein muss als die Inaktivierungstemperatur des Enzyms.
Die Adsorption der <^-Galactosidase sowie die Desorption der
adsorbierten #-Galactosidase können unter Einsatz verschiedener
bekannter Methoden durchgeführt werden. Beispielsweise wird eine Säule mit dem Ionenaustauscherharz gefüllt, worauf
das Harz mit der Pufferlösung in den Gleichgewichtszustand gebracht wird. Anschliessend wird die ^-Galactosidase-enthaltende
Flüssigkeit in die Säule eingeführt, damit die c6-Galactosidase
von dem Ionenaustauscherharz adsorbiert werden kann.
Anschliessend wird die Pufferlösung für die Desorption durch das Harzbett geschickt, an welchem die c£-Galactosidase adsorbiert
ist. Dies hat zur Folge, dass die adsorbierte Λ-Galactosidase
aus dem Harzbett zusammen mit der Pufferlösung entfernt wird. Die oC-Galactosidase wird dann von der Pufferlösung
nach bekannten Entionisationsmethoden abgetrennt und gewonnen, beispielsweise unter Einsatz einer semipermeablen Membran (exosmotischer
Druck) oder unter Anwendung einer GeIfiltrations-
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methode. Das erfindungsgemäss gereinigte Enzym Jässt sich
weiter nach einer bekannten Methode zur Ausfällung von p(-Galactosidase
unter Einsatz von Ammoniumsulfat, Tannin oder eines organischen Lösungsmittels reinigen.
Ein horizontales Reaktionsgefäss kann anstelle der Säule verwendet
werden. Das Reaktionsgefäss wird mit dem lonenaustauscherharz
gefüllt. Anschliessend werden die Af-Galactosidase enthaltende
Flüssigkeit und die Pufferlösung für die Adsorption gleichzeitig durch das Harzbett geführt, damit die #T-Galactosidase
an dem Harz adsorbiert wird. Dann kann die Pufferlösung für die Desorption durchgeschickt werden, damit die adsorbierte
O^-Galactosidase von dem Harz desorbiert wird. Wahlweise kann
man auch chargenweise arbeiten. Zu diesem Zweck wird ein Behälter aus einem Metallmaschendraht mit dem Ionenaustauscherharz
gefüllt. Dieser Behälter wird dann in ein Reaktionsgefäss eingetaucht
und in diesem bewegt, welches die tfC-Galactosidase-enthaltende
Flüssigkeit sowie die Pufferlösung für die Adsorption enthält, damit das Harz die #-Galactosidase kontaktieren und
adsorbieren kann. Dann wird der Behälter aus dem Reaktionsgefäss
herausgehoben und in ein anderes Reaktionsgefäss eingetaucht, das die Pufferlösung enthält, um die Desorption durchzuführen,
wodurch die adsorbierte #-Galactosidase von dem Harz durch die Pufferlösung desorbiert wird. In jedem Falle werden bessere Ergebnisse
erhalten, wenn das Ionenaustauscherharz zuvor mit der Pufferlösung, die für die Adsorption eingesetzt werden soll,
ins Gleichgewicht gebracht wird.
Was die Behandlungszeit betrifft, so reicht eine Zeitspanne aus, die lang genug ist, damit die #-Galactosidase-enthaltende
Flüssigkeit oder die Pufferlösung durch das Ionenaustauscherharze^
strömen kann und im Falle einer Säule oder eines horizontalen Reaktionsgefässes eine Adsorption oder Desorption erfolgt. Im
Falle eines chargenweise durchgeführten Verfahrens reicht eine
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— ι ο —
Zeitspanne von ungefähr 5 Minuten für die Adsorption oder für die Desorption aus. Jede zu grosse Zeitspanne zur Durchführung
der Adsorption oder Desorption hat keine wesentliche Verbesserung des Adsorptionsgrades oder des Gewinnungsgrades zur Folge.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht, ist das erfindungsgemässe
Verfahren ungewöhnlich einfach, da es nur eine entsprechende Einstellung der Konzentration oder des pH-Wertes der
Pufferlösungen erfordert, die zum Zwecke der Adsorption der CC-Galactosidase
an dem Ionenaustauscherharz und zur Desorption der adsorbierten #-Galactosidase von dem Harz verwendet werden.
Darüber hinaus werden andere als u6'-Galactosidase an dem Ionenaustauscherharz
adsorbierte Proteine kaum von dem Harz desorbiert, so dass es möglich ist, &-Galactosidase in hoher Reinheit zu
gewinnen. Diese Neigung ist besonders ausgeprägt, wenn Acetatpufferlösungen
zur Durchführung des Verfahrens eingesetzt werden.
Darüber hinaus besitzt die nach dem erfindungsgemässen Verfahren
gereinigte O^-Galactosidase den Vorteil, dass ihre Wärmestabilität
um ungefähr 100C höher ist. Eine nach üblichen Methoden hergestellte
'-\?-Galactosidase wird inaktiv, wenn die Temperatur auf
einen Wert von mehr als ungefähr 500C ansteigt. Demgegenüber wird
die erfindungsgemäss erhaltene iC-Galactosidase nicht inaktiviert,
solange die Temperatur nicht über ungefähr 600C ansteigt. Eine
derartige Verbesserung der Wärmestabilität gestattet beim Einsatz der gereinigten oC-Galactosidase eine entsprechend erhöhte Reaktionstemperatur,
so dass die Reaktion bei höheren Temperaturen durchgeführt werden kann. Dies bietet erhebliche Vorteile.
Es sind bisher viele Reinigungsverfahren unter Einsatz von Ionenaustauscherharzen
bekannt geworden. Keines der bekannten Verfahren gestattet jedoch die Adsorption und Desorption eines sehr spezifischen
Enzyms unter Einsatz eines Ionenaustauscherharzes, so wie
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dies erfindungsgemäss möglich ist. Wird das Ionenaustauscherharz
bezüglich seines Adorptionsvermögens für <ä£-Galactosidase
durch einen längeren Betrieb verschlechtert, dann kann es nach bekannten Methoden regeneriert werden. Auf diese Weise kann
das Ionenaustauscherharz halbkontinuierlich eingesetzt werden, so dass die Verfahrensweise äusserst wirtschaftlich ist.
Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung.
Ein Glasrohr mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 5 cm wird mit 3 g eines Ionenaustauscherharzes /Amberlite
CG-50) gefüllt. Dann wird eineO,1m Phosphatpufferlösung (pH
4,5) durch das Glasrohr geschickt, um das Harz in den Gleichgewichtszustand zu bringen. Dem Harz werden 0,5 ml einer OC-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit (Gesamt- oC-Galactosidase-Aktivität
202 500 Einheiten) bei Zimmertemperatur zugeführt. Anschliessend werden 100 ml der Pufferlösung durchgeschickt,
um freie oi-Galactosidase, andere Proteine als oC~
Galactosidase sowie andere Verunreinigungen zu eluieren.
Die aus dem Glasrohr ablaufende Flüssigkeit wird getestet, wobei man feststellt, dass sie 3775 ßz-Galactosidase-Aktivitätseinheiten
enthält. Daraus geht hervor, dass der Adsorptionsgrad der #-Galactosidase ungefähr 98,1 % beträgt.
Anschliessend werden 50 ml einer 0,2m Phosphatpufferlösung (pH
9,2) durch das Harz geschickt. Die Pufferlösung, die anschlies-
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send aus dem Glasrohr abläuft, wird getestet, wobei man feststellt,
dass sie eine &'-Galactosidase-Aktivität von 196 920 Einheiten aufweist, woraus hervorgeht, dass 99,1 % der gesamten
an dem Ionenaustauscherharz adsorbierten OC-Galactosidase desorbiert
worden sind. Ferner zeigt dieser Wert, dass das Gewinnungsverhältnis der ßi-Galactosidase ungefähr 97,2 %, bezogen
auf die gesamte (X-Galactosidase-Aktivität der Ct-Galactosidaseenthaltenden
Flüssigkeit, beträgt.
Die Adsorption und die Desorption werden in der vorstehend beschriebenen
Weise wiederholt, mit der Ausnahme, dass anstelle der 0,2m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 9,2 eine
0,1m Phosphatpufferlösung mit einem pH von 9,2 als Lösung zur Durchführung der Desorption verwendet wird. In diesem Falle enthält
die Lösung, die aus dem Glasrohr abläuft, 149 82 0 oi-Galactosidase-Einheiten.
Das Gewinnungsverhältnis der oi-Galactosidase,
bezogen auf die Ausgangs-Gesamt- ßO-Galactosidase-Aktivität, beträgt
ungefähr 74 %.
Unter Einhaltung der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wird das Ionenaustauscherharz in dem Glasrohr unter Einsatz
einer 0,05 m Acetatpufferlösung (pH 4,0) ins Gleichgewicht gebracht. Dem Harz werden 0,5 ml einer ct-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit (Gesamt- C^.-Galactosidase-Aktivitat 202 500 Einheiten)
zugeführt. Anschliessend wird die gleiche Pufferlösung durch das Harz zum Waschen durchgeschickt. Die Flüssigkeit, die
anschliessend aus dem Glasrohr abläuft, wird getestet, wobei man feststellt, dass sie 620 oi-Galactosidase-Einheiten enthält, woraus
hervorgeht, dass der Adsorptionsgrad der oO-Glactosidase ungefähr
99,7 % beträgt.
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Anschliessend wird eine 0,2m Acetatpufferlösung (pH 6,0)
durch das Ionenaustauscherharz geschickt. Die Pufferlösung, die anschliessend aus dem Glasrohr abläuft, wird getestet, wobei
man feststellt, dass sie 194 290 ^-Galactosidase-Einheiten enthält. Dies zeigt, dass 96,2 % der gesamten an dem Harz adsorbierten
otr-Galactosidase von dem Harz desorbiert werden.
Ferner sieht man, dass der Gewinnungsgrad 95,5 %, bezogen auf die Gesamt- (%-Galactosidase-Aktivität der eingeführten (K-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit, beträgt.
Die beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, wobei die in der Tabelle V angegebenen Pufferlösungen eingesetzt werden,
um die Adsorption und Desorption der D^-Galactosidase zu bewirken.
Die erhaltenen Ergebnisse gehen ebenfalls aus der Tabelle V hervor.
-■ - Tabelle V
Pufferlösung Menge an 4T-G-Ad- Puff er lö- Menge der OC -G-Gefür
die Ad- adsorbier- sorptions- sung für desorbier- winnungssorptdon
ter oi -G, grad, (%} die Desor- ten ö^-G, grad,(%)
^Einheiten) ption (Einheiten)
0,05m Acetatpuffer lösung (pH 5,0)
0,05m Kaliumchloridpuffer lösung (pH 5,0)
0,5m Ace-
201 575 99,5 tatpuffer- 193 485 95,5
lösung (pH 5,0) 0,2m SuIfat-
188 750 93,2 pufferlösung 180 225 89,0
(pH 9,2)
Unter Einhaltung der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wird das Ionenaustauscherharz in dem Glasrohr unter Einsatz
einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 4,1) ins Gleichgewicht gebracht.
Dem Harz werden 0,5 ml einer ßOGalactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit (Gesamt- aS-Galactosidase-Aktivität 202 500
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Einheiten) zugeführt. Anschliessend wird die gleiche Pufferlösung,
wie sie vorstehend erwähnt worden ist, durch das Harz zum Waschen geschickt. Die anschliessend aus dem Glasrohr
ablaufende Flüssigkeit enthält 10 120 ßf-Galactosidase-Einheiten,
woraus hervorgeht, dass der ^-Galactosidase-Adsorptionsgrad
ungefähr 99,7 % beträgt.
Anschliessend wird eine Acetatpufferlösung (pH 9,2) mit der
gleichen Konzentration (0,1m) dem Ionenaustauscherharz zugeführt. Die Pufferlösung, die anschliessend aus dem Glasrohr
,abläuft, wird getestet, wobei man feststellt, dass sie
127 110 <#-Galactosidase-Einheiten enthält. Daraus geht hervor,
dass der Gewinnungsgrad ungefähr 63 % beträgt, bezogen auf die Gesamt- ££-Galactosidase-Aktivität der zugeführten ö6~Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit.
Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wird ein Ionenaustauscherharz (Amberlite IRC-50) unter Einsatz einer
0,1m Phosphatpufferlösung (pH 4,5) ins Gleichgewicht gebracht. Dem Harz werden 0,5 ml einer SC-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit (Gesamt-#-Galactosidase-Aktivität 202 500 Einheiten)
zugeführt. Anschliessend wird das Harz unter Einsatz der gleichen Pufferlösung gewaschen. Die anschliessend aus dem
Glasrohr ablaufende Flüssigkeit wird getestet, wobei man feststellt, dass sie 35 100 if-Galactosidase-Einheiten enthält.
Daraus geht hervor, dass der Adsorptionsgrad der ö^-Galactosidase
85,1 % beträgt.
Anschliessend wird eine 0,2m Phosphatpufferlösung (pH 9,2)
durch das Harz geschickt. Die aus dem Glasrohr ablaufende Puf-
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ferlösung wird getestet, wobei man feststellt, dass sie 119 110 (^-Galactosidase-Aktivitätseinheiten enthält. Daraus
geht hervor, dass der Gewinnungsgrad der C£-Galactosidase ungefähr
50,7 % beträgt, bezogen auf die Gesamt- 06-Galactosidase-Aktivität.
Wird die beschriebene Arbeitsweise unter Einsatz einer 0,05m Acetatpufferlösung (pH 5,0) zur Durchführung der Adsorption
sowie auch der gleichen Pufferlösung zur Durchführung der Desorption wiederholt, dann beträgt der Adsorptionsgrad der oC~
Galactosidase 95,2 % (die ablaufende Flüssigkeit enthält 11 205 ui-Galactosidase-Aktivitätseinheiten) , während der Gewinnungsgrad
der fc^-Galactosidase, bezogen auf die Anfangs-Gesamt-öc-Galactosidase-Aktivität,
zu 50,2 % ermittelt wird (die gewonnene #>Galactosidase zeigt 117 895 Einheiten).
Unter Einhaltung der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise werden 3 g eines Ionenaustauscherharzes (Amberlite CG-50) unter
Einsatz einer 0,05m Acetatpufferlösung (pH 5,0) ins Gleichgewicht gebracht. Diesem Harz werden 0,5 ml einer öC-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit (Gesamt- Öi-Galactosidase-Aktivität
235 000 Einheiten, spezifische Aktivität 42 000 Einheiten/mg des Proteins) zugeführt. Anschliessend wird das Harz mit
der gleichen Pufferlösung gewaschen. Die ablaufende Flüssigkeit wird getestet. Sie enthält 625 öC-Galactosidase-Aktivitätseinheiten.
Dies bedeutet einen fli-Galactosidase-Adsorptionsgrad
von annähernd 100 %.
Die Arbeitsweise wird wiederholt, wobei die in der Tabelle VI zusammengefassten Pufferlösungen eingesetzt werden. Die desorbierte
#-Galactosidase-Aktivität, die Proteindesorption sowie
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- 22 -
die spezifische Aktivität werden ermittelt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VI hervor.
Pufferlösung Desorbier- tf-G-Ge- Proteinfür
die De- te oS~G~ winnungs- menge,
sorption Menge, grad, % mg Einheiten
Spezifische Erhöhung der spe-Aktivität, zifischen Aktivi-Einhei- tat (wobai der Aus-
ten/mg gangswert als 1 ge
nommen wird)
| 0,2m Acetat pufferlösung (pH 5,9) |
232 | 000 | 98,7 | 1,00 | 232 | 000 | 5,52 |
| 0,2m Phosphat puff er.lösung (pH 5,9) |
99 | 000 | 42,1 | 0,53 | 187 | 000 | 4,45 |
| 0,2m Phosphat pufferlösung (pH 6,5) |
214 | 000 | 91,1 | 1,03 | 207 | 000 | 4,93 |
| 0,2m Phosphat pufferlösung (pH 7,0) |
227 | 000 | 96,6 | 1,42 | 160 | 000 | 3,81 |
| 0,2m Phosphat pufferlösung (pH 9,2) |
230 | 000 | 97,9 | 1,58, | 146 | 000 | 3,48 |
(Der Test zur Bestimmung des Proteingehalts erfolgt nach der
Folin-Methode).
Aus der Tabelle VI geht hervor, dass die spezifische Aktivität der ßi-Galactosidase einige Male ansteigt, woraus hervorgeht,
dass das Enzym bis zu einer hohen Reinheit gereinigt wird.
In ein Gefäss werden 0,5 ml einer it-Galactosidase-enthaltenden
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Flüssigkeit (Gesamt- ßi-Galactosidase-Aktivität 8 425 000 Einheiten,
spezifische Aktivität 132 000/mg), 5 ml einer 1m Phosphatpufferlösung
(pH 4,5), 40 ml Wasser und 5 g eines Ionenaustauscherharzes (Amberlite CG-50) eingefüllt. Der Gefässinhalt
wird bei 300C während einer Zeitspanne von 20 Minuten
gerührt. Anschliessend wird das Harz mit einer 0,1m Phosphatpufferlösung (pH 4,5) gewaschen. Die Menge der adsorbierten
cC-Galactosidase beträgt 7 995 000 Einheiten, woraus hervorgeht,
dass der Adsorptionsgrad 94,9 % beträgt. Das Harz wird in 50 ml einer 0,2m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert
von 6,5 bei der Durchführung eines Tests und mit einem pH-Wert von 9,2 bei der Durchführung eines anderen Tests eingetaucht,
um die Desorption der adsorbierten Of-Galactosidase zu bewirken.
Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VII hervor.
pH-Wert der Menge der af-G-Ge-
Pufferlösung desorbier- winnungs-
ten ΰί-G, grad, %
Einheiten
6,5
9,2
9,2
7 276 000
7 618 000
7 618 000
86,4 90,4
Menge des Proteins, mg
24,17 35,26
Spezifische Aktivität, Einheiten/mg
301 000 216 000
Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wird unter den gleichen Bedingungen wiederholt, mitder Ausnahme, dass die Zeit
der Adsorptionsbehandlung variiert wird. Die Ergebnisse sind der Tabelle VIII zu entnehmen.
509846/0999
Reactions- 5 10 20 40 60 '
zeit, Mm.
tf-G-Adsorptions- 4^g ^5 ^5 ^1 ^9 g5^ g5^
graci , %
Proteinadsor p- __ c . o o cr. -. ,-->,- otic^c er *
tionsgrad, % 37'5 48'2 50'6 53'6 54'2 56'5 56'1
Aus der Tabelle VIII ist zu ersehen, dass sogar dann, wenn chargenweise
gearbeitet wird, der Adsorptionsgrad der iX-Galactosidase
80 % übersteigt, wenn die Adsorptionsbehandlung während einer Zeitspanne von ungefähr 5 Minuten durchgeführt wird.
.ähnlich wie in Beispiel 6 werden in ein Gefäss 1,0 ml einer
öi-Galactosidase-enthaltenden Flüssigkeit (Gesamt- &-Galactosidase-Aktivität
1 685 000 Einheiten, spezifische Aktivität 132 000/mg), 0,5 ml einer 1m Kaliumchloridlösung (pH 5,0), 8,5 ml Wasser und
1 g eines Ionenaustauscherharzes (Amberlite CG-50) eingefüllt. Der Inhalt wird bei 300C während einer Zeitspanne von 30 Minuten
gerührt. Anschliessend wird das Harz mit einer 0,1m Kaliumchloridpufferlösung gewaschen. Dieses Harz wird in einer 0,2m Phosphatpufferlösung
(pH 9,2) eingetaucht, um eine Desorption der oC-Galactosidase
zu bewirken. Durch Wiederholung dieser Arbeitsweise wird die Adsorption der <&-Galactosidase unter Einsatz einer 0,1m
Kaliumchloridpufferlösung sowie von 0,05m und 0,1m Natriumchloridpufferlösung
bewirkt. Das Harz, welches oi-Galactosidase absorbiert
hat, wird unter Einsatz der gleichen Phosphatpufferlösung behandelt, um die adsorbierte #-Galactosidase zu desorbieren. Die Ergebnisse
gehen aus der Tabelle IX hervor.
509846/0999
Art der Itonzen- Adsor-Puffer-
tra- bierte lösung tion, Gi-Gr-MoI
Menge, Einhu
Kaliumchlorid- pufferlösung
Natriumchlorid puffer— lösung
Oi-G-Ad- Desor- d -G- Pro- Spezifische
sorptions- bierte Gewin- tein- Aktivität,
grad, % OC-G- nungs- menge, Einheiten/mg
Menge, grad, mg
Einh. %
| 05 | 1 | 580 | 000 | 9 3,8 . | 9 | 1 | 527 | 000 | 90,6 | 6,10 | 250 | 000 | |
| o. | 1 | 1 | 548 | 000 | 91, | 1 | 1 | 449 | 000 | 86,0 | 6,31 | 230 | OQO |
| o. | 05 | 1 | 535 | 000 | 91, | 4 | 1 | 412 | 000 | 83,8 | 6,17 | 229 | 000 |
| o, | 1 | 1 | 506 | 000 | 89, | 1 | 387 | 000 | 82,3 | 6,07 | 229 | 000 |
In ein Gefäss werden 1,0 ml einer (jC-Galactosidase-enthaltenden
Flüssigkeit (Gesamt-Aktivität 1 685 000 Einheiten), 1,0 ml einer
1m Phosphatpufferlösung und 8,0 ml Wasser sowie verschiedene Mengen (0,1 g, 0,25 g, 0,5 g, 0,75 g oder 1,0 g) eines Ionenaustauscherharzes
(Amberlite CG-50) eingefüllt. Der Gefässinhalt wird bei 300C während einer Zeitspanne von 6 0 Minuten gerührt. Die </.:-
Galactosidase-Adsorptionsgrade sowie die Proteinadsorptionsgrade gehen aus der Tabelle X hervor.
| 0, | 1 | Tabelle X | 25 | |
| Zugesetzte Harzmenge |
26, | 0 | o, | 8 |
| öi-G-Adsorptions- grad> % |
28, | 6 | 48, | 3 |
| Proteinadsorptions grad , % |
36, | |||
0,5
72,7
44,6
0,7 5
90,0
54,2
509846/0999
Aus der Tabelle X geht hervor, dass die für die Adsorption, ausreichende
Ionenaustauscherharzmenge 1 g pro 2 300 000 <X>-Gälactosidase-Aktivitätseinheiten
beträgt.
Die in Beispiel 8 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, wobei
die gleiche i£-Galactosidase-enthaltende Flüssigkeit und
die gleiche Phosphatpufferlösung verwendet werden. Die Harzmenge
wird auf 1 g festgelegt, mit der Ausnahme, dass während einer
Zeitspanne von 20 Minuten bei verschiedenen Temperaturen (5aCf
200C oder 3 00C) gerührt wird. Die Mengen der adsorbierten. <&-
Galactosidase sowie die Adsorptionsgrade gehen aus der Tabelle XI
hervor.
| 5 | Tabelle XI | 30 | 000 | |
| Temperatur, °C | 1 58 9 000 | 20 | 1 575 | 5 |
| Adsorbierte Qi-G- Menge, Einheiten |
94,3 | 1 53 0 00 0 | 93, | |
| OC -G-Ad sorptions— grad, % |
90,8 | |||
Aus der Tabelle XI ist zu ersehen, dass der Ädsorptions.grad der
QC-Galactosidase an dem Ionenaustauscherharz im wesentliehen
konstant bleibt, und zwar auch dann, wenn die B:ehandlungstemperatuar
in einem gewissen Ausmaße schwankt.
3000 ml einer wässrigen 0,1 m NaCl-LösurLg (pH S^O) werden 500 g
öi-Galactosidase-enthaltender Schimmelpilzzellesi: CGesamt- öC-Galac-
tosidase-Aktivität 743 000 000 Einheiten) zugesetzt. Die Mischung
wird bei ungefähr 450C während einer Zeitspanne von 4
Stunden gerührt, wobei der pH-Wert zwischen 8,5 und 9,0 gehalten wird, um die OC-Galactosidase aus den Zellen zu extrahieren.
Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wird mit einem Drahtsieb zur Entfernung der Zellen filtriert. Das FiItrat wird unter Verwendung
einer 2n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 5 eingestellt, während einer Zeitspanne von ungefähr 3 Stunden stehen gelassen,
um die Ausfällung zu induzieren, und zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert. In der erhaltenen überstehenden
Flüssigkeit, deren Volumen 2600 ml beträgt, beträgt die Gesamt- <7i-Galactosidase-Aktivität 370 000 000 Einheiten.
Der Hälfte (1300 ml) der überstehenden Flüssigkeit wird Kaliumphosphat
solange zugesetzt, bis die Konzentration 0,1m und der pH-Wert 4,5 beträgt. Dann wird die erhaltene Lösung durch eine
Säule geschickt, die mit 90 g eines Ionenaustauscherharzes (Amberlite^G-SO) gefüllt ist, wobei das Harz zuvor mit einer
0,1m Kaliumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 4,5 ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann werden 500 ml einer 0,2m
Dinatriumphosphatlösung (pH 9,0) der Säule zugeführt. Die Flüssigkeit, die anschliessend von der Säule abläuft, enthält
175 650 000 öC-Galactosidase-Aktivitätseinheiten, was bedeutet,
dass 94,9 % der oC-Galactosidase der überstehenden Flüssigkeit
gewonnen worden sind.
Der restlichen Hälfte (1300 ml) der überstehenden Flüssigkeit wird Ammoniumsulfat solange zugesetzt, bis die Endkonzentration
bis zu einer 0,8-fachen Sättigung gebracht worden ist, ohne dass
509846/0999
dabei die vorstehend beschriebene Behandlung zur Adsorption und Desorption unter Einsatz des Ionenaustauscherharzes durchgeführt
wird. Anschliessend wird die Lösung bei ungefähr 5°C über Nacht stehen gelassen, um eine Ausfällung zu ermöglichen.
Der gebildete Niederschlag wird mit Celite (Kieselgur) filtriert. Der auf dem Celite abgeschiedene Niederschlag wird zusammen
mit dem Celite in einer 0,1m Phosphatpufferlösung (pH 7,0) aufgelöst. Die Lösung wird von nicht-aufgelöstem Celite
unter Verwendung eines Glasfilters befreit. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat enthält 123 750 000 ^-Galactosidase-Aktivitätseinheiten,
was bedeutet, dass 66,9 % der cö-Galactosidase
gewonnen worden sind. Daher ist die Ausbeute des Enzyms, das nach dem zuerst geschilderten Verfahren gereinigt worden ist, wesentlich
höher als die Enzymausbeute, die aufgrund des letzteren Verfahrens erzielt wird.
Ein Vergleich der zwei Enzyme bezüglich ihrer Wärmestabilität zeigt, wie auch aus der beigefügten graphischen Darstellung hervorgeht,
dass beide Enzyme bis zu 500C aktiv bleiben, und dass ungefähr 12 % des letzteren Enzyms nach einem Stehenlassen bei
550C während einer Zeitspanne von 15 Minuten inaktiviert werden
und ungefähr 25 % des Enzyms bei Temperaturen bis zu 600C
beim Stehenlassen während einer Zeitspanne von 15 Minuten inaktiv werden (gestrichelte Linie in der Zeichnung), während das
erstere Enzym kaum bei Temperaturen bis zu 600C inaktiviert
wird und bei Temperaturen oberhalb 60°C eine Inaktivierung erleidet
(durchgehende Linie). Daher wird durch das erfindungsgemässe
Verfahren die Wärmestabilität um ungefähr 100C verbessert,
wahrscheinlich deshalb, da die Behandlung mit dem Ionenaustauscherharz die Qualität der cC-Galactosidase verbessert.
5098A6/09S9
Claims (2)
1. Verfahren zur Gewinnung einer gereinigten OC-Galeictosidase
aus einer Öc-Galactosidcise-enthaltenden Flüssigkeit unter Einsatz
eines Ionenaustauscherharzes in Gegenwart von Pufferlösungen, dadurch gekennzeichnet, dass die oC-Galtictosidase-enthaltende
Flüssigkeit in Kontakt mit einem schwach sauren Kationenaustauscher~
harz in Gegenwart einer Pufferlösung zur Adsorption der #—.Galactosidase
in der Flüssigkeit an dem Harz gebracht wird, die adsorbierte O^-Galactosidase von dem Harz unter Einsatz einer Pufferlösung
desorbiert wird, die wenigstens bezüglich einer der aus Konzentration und pH-Wert bestehenden Faktoren höhere Vierte besitzt
als die Pufferlösung, die zur Durchführung der Adsorption eingesetzt wird, und die desorbierte oC-Galactosidase in der
von dem Harz ablaufenden Flüssigkeit gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Durchführung der Adsorption der i£-Galactosidase eingesetzte
Pufferlösung eine Phosphatpufferlösung, Acetatpufferlösung,
Natriumchloridpufferlösung oder . Kaliunichloridpufferlösung und
die zur Desorption der tfC-Galactosidase verwendete Pufferlösung
eine Phosphatpufferlösung, Acetatpufferlösung, Natriumchloridpufferlösung
öder Kaliumchloridpufferlösung ist.
509846/0999
so
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