CN1551920A

CN1551920A - 除草剂抗性的棉花植物及生产和鉴定其的方法

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Publication number: CN1551920A
Application number: CNA028173813A
Authority: CN
Inventors: L��ֵ¶�; L·特落林德尔; J·格温; ն�; M·德博克勒尔
Original assignee: Bayer CropScience NV
Current assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2001-08-06
Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2022-07-19
Also published as: US7834168B2; EP1417312B1; US7442504B2; ATE524550T1; AU2002333260B2; WO2003013224A3; MXPA04001108A; BR122014009174B1; AR036209A1; BRPI0211726B1; US20090087853A1; WO2003013224A2; US20030097687A1; EP1417312A2; AR100107A2; US6818807B2; CN100523190C; BR0211726A; ES2373434T3; AR100106A2

Abstract

本发明涉及转基因棉花植物、植物材料和种子，其特征在于：在棉花基因组的特定位置包含特定转化事件，特别是存在编码赋予除草剂抗性的蛋白质的基因。本发明的棉花植物将除草剂抗性表型和最佳农艺性状结合在一起。

Description

除草剂抗性的棉花植物及生产和鉴定其的方法

技术领域

本发明涉及转基因棉花植物，植物材料和种子，其特征在于：在棉花基因组的特定位置包含特定的转化事件，特别是存在编码赋予除草剂抗性的蛋白质的基因。本发明的棉花植物将除草剂抗性表型和在缺乏杂草压力的情况下等同于非转化棉花株系的农艺性状、遗传稳定性和对不同遗传背景的适应性结合在一起。

在此，并入这里所引用的所有文献为参考文献。

背景技术

植物中转基因的表型表达不仅取决于基因本身的结构还取决于基因在植物基因组中的位置。同时，转基因在基因组中不同位置的存在将以不同的方式影响植物的整体表型。通过遗传操作向植物中引入商业有意义的性状并在农业或工业水平上获得成功，这一过程由于不同的因素而可能是漫长的。遗传转化植物的实际转化和再生仅仅是一系列筛选步骤的第一步，所述一系列筛选步骤包括广范的遗传鉴定、育种和大田试验的评估。

棉花纤维是世界上一种最重要的纺织原料。每年全球收获大约8千万英亩的棉花。在美国，按照面积产量，棉花是第五大农作物，2000年种植的棉花超过1500万英亩。主要的棉花杂草物种是番薯属(Ipomoea sp.)(牵牛花)，苋属(Amaranthus spp.)(苋)，莎草属(Cyperus spp.)(nutsedge)，苍耳属(Xanthium spp.)(苍耳)和高梁属(Sorghum spp.)(约翰逊草)。在可以用于生长中的棉花田的阔叶除草剂引入前，种植者利用非选择性除草剂直接萌后施用，施用同时注意不让除草剂接触生长中的作物。因为这种施用要求杂草和农作物高度的差异，所以该种施用方法不总是可行的。特别是对于小的棉花，该种施用费时，并且潜在地伤害农作物。

bar基因(Thompson等，1987，EMBO J 6：2519-2523；Deblock等，.1987，EMBO J.6：2513-2518)是编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的基因，当它在植物中表达时，赋予了对除草剂化合物膦丝菌素(也称为草铵膦(glufosinate))或双丙氨酰膦(也参见例如美国专利5,646,024和5,561,236)及其盐和旋光异构体的抗性。膦丝菌素控制阔叶杂草，包括牵牛花，并且具有广谱应用。

通过许多方法，包括棉花外植体的农杆菌感染(Firoozabady等，1987，Plant Molecular Biology 10：105-116；Umbeck等，1987，Bio/Technology5：263-266和WO 00/71733，US 5,004,863，和US 5,159,135中)，及通过微粒轰击棉花分生组织实现的直接基因转移(Finer和Mc Mullen，1990，PlantCell Reports，5：586-589；McCabe和Martinell，1993，Bio/Technology11：596-598，WO92/15675，EP0 531 506)已经获得了棉花的成功遗传转化。已经报道了利用Hansen等(1994，Proc.Nat.Acad.Sci.91：7603-7607)，Veluthambi等(1989，Journal of Bacteriology 171：3696-3703)和WO00/71733所述方法可以增加农杆菌转化的转化效率。

也已经描述了用于棉花植物再生的不同方法(WO 89/05344，US5,244,802，US 5,583,036，WO 89/12102，WO98/15622，和WO97/12512)。

然而，前述文献均未教导或提示本发明。

发明概述

本发明涉及转基因棉花植物，或者其种子、细胞或组织，它们包含稳定整合进其基因组的包含除草剂抗性基因的表达盒子，该除草剂抗性基因含有bar基因编码序列(如本文实施例1.1所述)，其中所述转基因棉花棉物、其种子、细胞或组织不仅具有除草剂抗性，而且在缺乏杂草压力的情况下与非转基因等株系(isoline)具有实质上等同的农艺性状。在杂草压力和适当的Liberty^TM处理的情况下，该植物比非转基因植物具有更优良的农艺表型。

在本发明的一个实施方式中，棉花植物或其种子、细胞或组织包含pGSV71表达盒子(如本文实施例1.1，表1所述)。在本发明优选的实施方式中，棉花植物或其种子、细胞或组织包含原种事件(elite event)EE-GH1。

在本发明另一个实施方式中，转基因棉花植物或其种子、细胞或组织：

(i)在其基因组中包含事件EE-GH1；或

(ii)包含事件EE-GH1，但条件是用于此事件的bar基因被替换成能在严格条件下与bar基因互补序列杂交的核酸序列。

更具体地，本发明涉及转基因棉花植物，其种子、细胞或组织，它们的基因组DNA可通过如下事实来表征：当用分别指向EE-GH1的5’或3’侧翼区和外源DNA的两个引物，在如这里所述的PCR鉴定方法中分析所述基因组DNA时，可以产生针对EE-GH1的特异片段。优选地，引物分别指向SEQ ID NO：1内的5’侧翼区域和外源DNA；最优选地，引物分别含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的核苷酸序列，并且产生250至290bp，优选约269bp的DNA片段。

在ATCC已经保藏了包含本发明原种事件的标准种子(referenceseed)，保藏号为PTA-3343。因此，本发明一个优选的实施方式是包含原种事件EE-GH1的种子，该种子保藏在ATCC，保藏号为PTA-3343，该种子可以长成抗草铵膦的棉花植物。ATCC保藏号PTA-3343的种子是由约50％非转基因核和50％转基因核(对转基因而言为半合子)组成的种批，其包含本发明的原种事件，该种子可以长成抗草铵膦的植物。如这里所述，可以播种种子，并且用PPT或Liberty^TM处理生长的植物以获得100％的包含本发明原种事件的草铵膦抗性植物。本发明进一步涉及来源于包含本发明原种事件的植物的细胞、组织、子代及后裔，其中所述植物由保藏在ATCC，具有保藏号PTA-3343的种子长成。本发明进一步涉及通过对包含本发明原种事件的棉花植物进行繁殖和/或育种可获得的植物，其中所述棉花植物由保藏在ATCC，具有保藏号PTA-3343的种子长成。

本发明进一步涉及包含外源DNA序列，优选地如这里所述的除草剂抗性基因的植物、种子、细胞或组织，所述外源DNA序列在包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4的植物DNA序列，更优选地包含SEQ ID NO：5的DNA序列或者在严格条件下与如下序列杂交的序列的区域中整合进入染色体DNA，其中所述如下序列是与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4和/或SEQID NO：5的植物DNA序列的序列互补的序列。

本发明还提供了生产转基因棉花植物细胞的方法，该方法包括将重组DNA分子插入棉花细胞、组织或愈伤组织的染色体DNA区域，该染色体DNA区域包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4的植物DNA序列，或者包含能在严格条件下与如下序列杂交的序列，所述如下序列是与包含SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：4的植物DNA序列的序列互补的序列。

本发明还涉及鉴定包含原种事件EE-GH1的转基因植物或者其细胞或组织的方法，该方法以鉴定转基因植物、细胞或组织中这种DNA序列编码的特征DNA序列或氨基酸的存在为基础。根据本发明优选的实施方式，这种特征DNA序列是15bp，优选20bp，最优选30bp或更长的序列，其包含事件的插入位点，即一部分外源DNA和与之邻接的一部分棉花基因组(5’或3’侧翼区)，从而允许插入事件的特异鉴定。

根据本发明的另一个方面，公开了DNA序列，其包含事件的插入位点及足够长度的棉花基因组DNA和外源DNA(转基因)多核苷酸，以致于可以用作EE-GH1检测的引物或探针。优选地，这种序列在插入位点的两侧分别包含EE-GH1的棉花基因组DNA的至少9个核苷酸和相似数目的外源DNA(转基因)核苷酸。最优选地，这种DNA序列包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中与插入位点邻接的棉花基因组DNA的至少9个核苷酸和相似数目的外源DNA核苷酸。

根据本发明的另一个优选方面，鉴定包含原种事件EE-GH1的转基因植物或者其细胞或组织的方法包括：利用聚合酶链式反应，用至少两个引物扩增生物样品中存在的核酸序列，所述引物之一识别EE-GH1的5’或3’侧翼区中的植物DNA，另一个引物识别外源DNA内的序列。优选地，利用分别识别EE-GH1的植物5’侧翼区内的序列，最优选地SEQ ID NO：1的植物DNA序列内的序列和外源DNA内的序列的引物分析基因组DNA。特别优选地，根据这里所述的PCR鉴定方法分析基因组DNA，由此，识别5’侧翼区中的序列的引物包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列。特别地，识别5’侧翼区中的序列的引物包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列而识别外源DNA中的序列的引物包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，由此，扩增的片段优选是250至290bp，更优选地是260至270bp，最优选地是约269bp。

因此，本发明涉及根据上述EE-GH1鉴定方法可以鉴定的转基因植物，其细胞或组织。

本发明涉及鉴定生物样品中原种事件EE-GH1的方法，该方法以特异识别EE-GH1的5’和/或3’侧翼序列的引物或探针为基础。在本发明优选实施方式中，这些方法以识别SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4中的序列的引物或探针为基础，更特别地以包含SEQ ID NO：2的序列的引物或探针为基础。根据本发明的另一个实施方式，这种方法以识别EE-GH1的特征序列的引物或探针为基础，所述特征序列是包含事件插入位点的DNA序列，该序列包括足够数量的5’或3’侧翼DNA核苷酸和随之的外源DNA核苷酸以致于可以用于事件的诊断。最特别地，这种方法以包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中足够数量的5’或3’侧翼DNA核苷酸和随之的外源DNA核苷酸的序列为基础。这种方法是本领域已知的，并且包括但不限于Lyamichev等(1999，Nature Biotechn 17：292-296)所述的方法。

本发明还涉及这里所述的EE-GH1的特异侧翼序列，其可以用于开发生物样品中EE-GH1的特异鉴定方法。更具体地，本发明涉及EE-GH1的5’和/或3’侧翼区，其可以用于特异引物和探针的开发；并涉及从EE-GH1的5’和/或3’侧翼序列及与其邻接的插入位点开发的特异引物和探针。本发明还涉及基于这种特异引物或探针的使用来鉴定生物样品中EE-GH1的存在的方法。

因此，本发明也涉及用于鉴定生物样品中原种事件EE-GH1的试剂盒，该试剂盒包含至少一个特异识别EE-GH1的5’或3’侧翼区的引物或探针。

优选地，为了用在PCR鉴定方法中，本发明的试剂盒除了包含特异识别EE-GH1的5’或3’侧翼区的引物外，还包含特异识别EE-GHI的外源DNA中的序列的第二引物。优选地，本发明试剂盒包含两个(或更多个)特异引物，其中一个引物识别EE-GH1的5’侧翼区内的序列，更优选SEQID NO：1的植物DNA区内的序列，而另一个引物识别外源DNA内的序列。特别优选地，识别5’侧翼区内植物DNA序列的引物包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列。特别地，识别5’侧翼区内植物DNA序列的引物包含SEQ IDNO：2的核苷酸序列而识别外源DNA的引物包含这里所述的SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

根据另一实施方式，本发明涉及用于鉴定生物样品中原种事件EE-GH1的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一个特异引物或者探针，该特异引物或探针具有与在严格条件下能和EE-GH1的特异或特征区杂交的序列相应(或者互补)的序列。优选地，探针序列相应于包含一部分外源DNA和与之邻接的EE-GH1的一部分5’或3’侧翼区(植物DNA)的特异区域。最优选地，特异探针包含(或者互补于)能在严格条件下与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：4内跨越插入位点的15到30个核苷酸的序列杂交的序列，所述插入位点位于外源DNA的5’或3’区。特别优选地，特异探针包含(或者互补于)能在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中具有邻接插入位点的9个植物DNA核苷酸和相似数目的外源DNA核苷酸的序列杂交的序列。根据一个特定的实施方式，这种引物包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中具有邻接插入位点的9个植物DNA核苷酸和相似数目的外源DNA核苷酸的序列。

本发明包括的方法和试剂盒可以用于不同的目的，例如，但不限于：鉴定植物、植物材料或产品，如，但不限于包含或来源于植物材料的食品或饲料产品(新鲜或加工的)中的EE-GH1。此外或者可替代地，本发明的方法和试剂盒可以用于鉴定转基因植物材料，从而使转基因和非转基因材料分离；此外或者可替代地，本发明方法和试剂盒可以用于检测包含EE-GH1的植物材料的质量(即纯材料的百分率)。

本发明还涉及在将原种事件EE-GH1引入不同品种中后跟踪基因组中包含原种事件EE-GH1的植物的方法。

应理解，可以通过这里引用的从属权利要求描述本发明特定的实施方式。

附图简述

可以结合并入此处的附图作为参考，以理解通过举例方式给出的下面的详细描述，这些例子不意味着将本发明限制于所述的特定实施方式，其中：

图1：利用EE-GH1 PCR鉴定方法对原种事件EE-GH1和其它事件的PCR分析。凝胶上样顺序：泳道1：分子量标准参照物(100bp梯)，泳道2：来源于包含转基因事件EE-GH1的棉花植物的DNA样品，泳道3：来源于包含另一个转基因事件的棉花植物的DNA样品，泳道4：来源于野生型棉花的DNA，泳道5：野生型+1拷贝BamHI消化的pGSV71(阳性对照)，泳道6：阴性对照(没有模板)，泳道8：分子量标准参照物(100bp梯)。

优选实施方式的详述

这里所用术语“基因”指包含几个可操作连接的DNA片断，如启动子区、5’非翻译区(5’UTR)、编码区(其可以编码或不编码蛋白质)和包含聚腺苷酸化位点的3’非翻译区(3’UTR)的任何DNA序列。通常在植物细胞中，5’UTR、编码区和3’UTR转录为RNA，对于蛋白质编码基因而言，编码区的RNA被翻译为蛋白质。基因可以包含另外的DNA片段如，内含子。如这里所用的基因座是植物基因组中给定基因的位置。

当术语“嵌合”指基因或DNA序列时，用于指包含至少两个功能相关DNA片段(如启动子、5’UTR、编码区、3’UTR、内含子)的基因或DNA序列，所述功能相关DNA片段在天然情况下不相关联和/或来源于例如不同来源。与植物物种相对而言的“外源”基因或DNA序列被用于表示该基因或DNA序列不是在该植物物种中天然存在的，或者不是在该植物物种的所述基因座中天然存在的基因或DNA序列。这里术语“外源DNA”指通过转化已经掺入了植物基因组的DNA序列。这里所用的“转化DNA”指用于转化过程的重组DNA分子。转化DNA通常包含至少一个“目的基因”(例如嵌合基因)，所述目的基因具有赋予被转化的植物一种或多种特异特征的能力。术语“重组DNA分子”用于举例说明并因此可包括分离的核酸分子，该分离的核酸分子可以是DNA并可以通过重组或其它方法获得。

这里所用术语“转基因”指掺入植物基因组中的目的基因(或外源DNA的整体)。“转基因植物”指在所有细胞的基因组中都包含至少一个转基因的植物。

优选地，本发明植物中存在的外源DNA将包含除草剂抗性基因，更具体地是35S-bar基因作为目的基因。

这里所用的“除草剂抗性”基因指能赋予植物对除草剂的抗性的基因。除草剂抗性基因的例子是包含位于组成型启动子控制下的编码膦丝菌素乙酰转移酶的序列的基因，该酶可以解除膦丝菌素的毒性。更具体地，在本发明原种事件中，除草剂抗性基因包含花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell等，(1985)，Nature 313：810-812)控制下的吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)双丙氨酰膦抗性基因(bar)的编码序列(Thompson等.(1987)EMBO J 6：2519-2523)，这里也称为“35S-bar”。35S-bar基因的表达赋予了对除草剂化合物膦丝菌素或双丙氨酰膦或草铵膦或者更一般地谷氨酰胺合成酶抑制剂或者其盐或旋光异构体的抗性，该抗性这里通常称为“草铵膦抗性”。

在“严格条件”下杂交意指Sambrook等(1989)(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY)所述的常规杂交条件，该杂交条件例如可以包括下列步骤：1)在滤膜上固定植物基因组DNA片断，2)在42℃，50％甲酰胺、5XSSPE、2XDenhardt’试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1到2小时，或者在68℃，在6X SSC、2X Denhardt’试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1到2小时，3)加入标记的杂交探针，4)温育16到24小时，5)在室温，在1X SSC、0.1％SDS中洗滤膜20分钟，6)在68℃，在0.2X SSC、0.1％SDS中洗滤膜3次，每次20分钟，和7)在-70℃，用增感屏以滤膜曝光X射线胶片24到48小时。

植物基因组中重组DNA分子的掺入通常通过细胞、组织或愈伤组织的转化来实现(或由其它基因操作来实现)。掺入的具体位点既可以是随机的也可以是预先确定的位置(如果利用定向整合的方法)。

通过重组DNA或“转化DNA”转化植物细胞或组织而引入植物基因组中的DNA此后称为“外源DNA”，其可以包含一个或多个“转基因”。因此，外源DNA既可以包括重组DNA也可以包括新引入的重新排列的植物DNA。然而，本发明上下文中术语“植物DNA”指在相应野生型植物的相同基因座中通常存在的植物DNA。

可以通过重组DNA分子在植物基因组中的掺入位点的位置和构型来表征外源DNA。重组DNA分子在植物基因组中的插入位点也称为“插入位点”或“靶位点”。重组DNA插入植物基因组中可能会涉及称为“靶位点缺失”的植物DNA缺失。这里所用的“侧翼区”或“侧翼序列”指至少20bp，优选至少50bp，及多达5000bp的植物基因组序列，其位于外源DNA的紧上游并且邻接外源DNA，或者其位于外源DNA的紧下游并且邻接外源DNA。引起外源DNA随机整合的转化方法将产生具有不同侧翼区的转化体，所述侧翼区对每个转化体都是特征性和独特的。当通过传统杂交方法(crossing)将转基因植物中存在的重组DNA引入不同植物中时，重组DNA在植物基因组中的插入位点和它的侧翼区通常将不会改变(除了由于突变或交换和转座子引起的偶然改变外)。这里所用的“插入区”指对应于至少40bp，优选至少100bp，及多达10000bp以上的区域的区，其中，所述区域在(未转化的)植物基因组中被包含外源DNA的上游和/或下游侧翼区的序列包围(并且包含插入位点和可能的靶位点缺失)。考虑到由于物种内突变引起的小差异，在该物种的具体植物中，插入区将保留同包含外源DNA的上游和下游侧翼区的序列至少85％，优选90％，更优选95％，最优选100％的序列同一性。

目的基因的表达指基因赋予植物一种或多种表型性状(例如，除草剂抗性)的事实，其中所述性状的赋予旨在通过转化期间所用的重组DNA分子——转化DNA的引入(基于部分或所有目的基因的结构和功能)来实现。

“事件”(也称为转化事件)定义为作为基因工程结果的(人工)基因座，其携带有包含至少一个目的基因拷贝的外源DNA。通过转基因的表达可以在表型上表征事件。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。在分子水平上，可以通过限制性图谱(例如，通过Southern印迹测定)和/或通过外源DNA的上游和/或下游侧翼序列和/或包含转基因的外源DNA的分子构型来表征事件。通常，当用转化DNA转化植物细胞、组织或愈伤组织时，可产生大量事件，每个事件都是独特的。

这里所用的“原种事件”是根据转基因的表型表达和稳定性，从通过用相同的转化DNA进行转化或与此转化所导致的植物进行回交而获得的一组事件中选出的事件，该事件将对包含它(即，选定的转化事件)的植物的农艺性状不产生负面的影响。因此，原种事件的筛选标准是下面的一个或多个，优选地为两个或多个，有利地为下面的所有标准：

a)植物中外源DNA的存在不损害植物的其它期望特征，例如与农艺性状或商业价值有关的特征；

b)事件可以通过十分明确的分子构型来表征，而且所述分子构型能稳定遗传，并且可以针对该分子构型开发出适当的诊断手段以实现事件身份的控制；

c)在事件以纯合子形式存在的情况下，目的基因显示出适当的且稳定的空间和时间表型表达，这种表型表达在一系列环境中均可以达到商业上可接受的水平，其中所述环境为带有该事件的植物于正常的农业应用中所可能接触到的一系列环境。

优选外源DNA与植物基因组中的如下位置相关，所述植物基因组位置允许外源DNA渐渗进入期望的商业遗传背景。

通过原种事件在不同相关遗传背景中的渐渗现象和所观察到的事件对上述一个、两个或所有标准(例如上述a)，b)和c))的满足情况可以确认作为原种事件的事件状态。

因此，“原种事件”指满足上述标准的包含外源DNA的基因座。植物、植物材料或子代如种子在其基因组中可以包含一个或多个原种事件。因此，当涉及在其基因组中包含原种事件EE-GH1的植物、种子细胞或组织时，意指植物、种子细胞或组织包含这里所述的外源DNA(包含35S-bar基因)，该外源DNA通过这里所述的整合位点整合在基因组中。

可以基于原种事件特异的基因组特征开发用于鉴定原种事件或包含原种事件的植物或植物材料或包含含有原种事件的植物材料的产品的手段，所述特异基因组特征是例如包含外源DNA的基因组区的特异限制性图谱、分子量标准参照物或外源DNA的侧翼区序列。

一旦测序了外源DNA的一个或两个侧翼区，就可以通过分子生物学技术，研制特异识别样品核酸(DNA或RNA)中的这个(这些)序列的引物和探针。例如可以开发PCR方法以鉴定生物样品(如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中的原种事件。这种PCR以至少两个特异性“引物”为基础，其中一个引物识别原种事件的5’或3’侧翼区内的序列，另一个引物识别外源DNA内的序列。优选地，引物有15至35个核苷酸的序列，在优化的PCR条件下，该引物分别“特异识别”原种事件的5’或3’侧翼区内的序列和外源DNA内的序列，以致从包含原种事件的核酸样品可以扩增出特异性片段(“整合片段”)。这意味着在优化的PCR条件下仅仅扩增定向整合片段，而不扩增植物基因组或外源DNA中(该大小的)其它序列。

优选地，整合片段有50至500个核苷酸长，最优选地100至350个核苷酸长。优选地，特异性引物分别具有与原种事件的5’或3’侧翼区内序列和原种事件的外源DNA内序列有80％至100％同一性的序列，前提是错配仍旧允许在优化的PCR条件下实现原种事件的特异鉴定。然而，可允许的错配范围可以容易地实验测定，并且是本领域技术人员已知的。

因为用于原种事件的引物序列和它们识别的基因组序列是独特的，所以将仅仅在包含原种事件(核酸)的生物样品中出现整合片段的扩增。优选地，当利用PCR鉴定未知样品中EE-GH1的存在时，包括如下一套对照引物在内，所述对照引物可以扩增包含事件的植物物种的“持家基因”内的片段。持家基因是在大多数细胞类型中表达的基因，其与所有细胞共有的基本代谢活动有关。优选地，从持家基因扩增的片段是比扩增的整合片段大的片段。根据待分析的样品的不同，可以包括其它对照。

在现有技术中已描述了标准的PCR方法，参见如＇PCR ApplicationsManual″(Roche Molecular Biochemicals，第二版，1999)。在“PCR鉴定方法”中详述了每个原种事件的最佳PCR条件，包括特异性引物的序列。然而，可以理解，为适应具体的实验室条件，可能需要调整PCR鉴定方法中的多个参数，并且可以稍微修改这些参数以获得相似的结果。例如，针对不同的DNA制备方法的应用，可能需要调整例如所用引物及聚合酶的量和退火条件。相似地，其它引物的选择也可能为PCR鉴定方法规定其它的最适条件。然而，这些调整对本领域技术人员将是显而易见的，并且在目前的PCR应用指南如上述指南中详述了这些调整。

可替代地，可以利用特异性引物扩增整合片段，该整合片段可以用作鉴定生物样品中EE-GH1的“特异性探针”。在允许探针与生物样品核酸中的对应片段杂交的条件下，用探针接触生物样品的核酸，将引起核酸/探针杂交体的形成。可以检测该杂交体的形成(例如，标记核酸或探针)，由该杂交体的形成指示EE-GH1的存在。现有技术中已描述了(在固相载体上或溶液中)基于与特异性探针的杂交的这种鉴定方法。优选地，特异性探针是在优化的条件下能特异地与包含原种事件的部分5’或3’侧翼区以及与之邻接的部分外源DNA的区域(此后也称为事件的“特异区域”)杂交的序列。根据所用的方法，这种特异性探针可以包含15至30bp或50至500bp，优选100至350bp的序列，所述序列在严格条件下能与特异区域的核苷酸序列(或这种序列的互补序列)杂交。优选地，特异性探针将包含与原种事件特异区域相同(或互补)的约15到约100个连续核苷酸的序列。最优选地，这种探针包含至少9个与3’或5’侧翼区相同(或互补)的核苷酸和相似数目的与之邻接的外源DNA中的核苷酸。最优选地，这种探针包含至少9个与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的3’或5’侧翼区相同(或互补)的核苷酸和相似数目的在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中与之邻接的外源DNA核苷酸。

这里所用的“限制性图谱”指用一个或一组特定限制性酶切割植物基因组DNA(和/或包含于其内的外源DNA)，并且与探针在标准严格条件下杂交后获得的一组Southern印迹图，其中所述探针与外源DNA具有序列相似性。这里所用的标准严格条件指本文所述的杂交条件或指Sambrook等.(1989)(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbour Laboratory Press，NY)所述的常规杂交条件，该杂交条件例如可以包括下列步骤：1)在滤膜上固定植物基因组DNA片断，2)在42℃，50％甲酰胺，5X SSPE，2X Denhardt’试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1到2小时，或者在68℃，在6X SSC，2X Denhardt试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1到2小时，3)加入标记的杂交探针，4)温育16到24小时，5)在室温，在1X SSC，0.1％SDS中洗滤膜20分钟，6)在68℃，在0.2X SSC，0.1％SDS中洗滤膜3次，每次20分钟，和7)在-70℃，用增感屏以滤膜曝光X射线胶片24到48小时。

由于在外源DNA掺入前植物基因组中存在(内源)限制性位点，故外源DNA的插入将改变该基因组的特异限制性图谱。因此，可以通过一个或多个特异限制性谱鉴定特定的转化体或源于其的子代。

可替代地，可以根据PCR鉴定方法，通过实验鉴定包含原种事件的植物或植物材料。所述PCR是特异识别原种事件的PCR。实质上，可以开发一套PCR引物，其识别a)原种事件3’或5’侧翼序列内的序列和b)外源DNA内的序列，其中引物扩增优选100至300个核苷酸的片段(整合片段)。优选地，包括一套可以扩增该植物物种“持家基因”内的片段(优选比扩增的整合片段大的片段)的对照引物。在“PCR鉴定方法”中详述了最适PCR条件，包括特异性引物的序列。

本发明也设想到鉴定包含原种事件EE-GH1的植物、植物材料或包含植物材料的产品的其它方法。这些方法包括基于用特异性探针检测原种事件的侧翼序列和外源DNA序列的所有方法。更具体地，设想了基于芯片的技术，如Hacia等.1996 (Nat Genet 14(4)：441-447)和Shoemaker等.1996(Nat Genet 14(4)：450-456)所述的方法。这些方法通过利用固定的探针阵列或通过用寡核苷酸给基因加尾，随后通过杂交进行筛选，允许以高密度阵列形式分离靶分子。作为备选方案，设想到third wave检测方法，如Lyamichev等.(1999，上引文)描述的方法。

通过现有技术中描述的经典蛋白质检测方法，如基于蛋白质的层析或电磁特性或基于特异单克隆抗体的检测的那些方法(如在“Guide to proteinpurification”，Murray P.Deutscher编者中所述)可以完成原种事件的外源DNA所编码的蛋白质的鉴定。

这里所用“试剂盒”指用于实施本发明方法，更具体地，用于生物样品中原种事件EE-GH1鉴定的一套试剂。更特别地，本发明试剂盒优选的实施方式包含至少一个或两个上述特异性引物。任选地，试剂盒可以进一步包含这里所述的PCR鉴定方法中的任何其它试剂。

可替代地，根据本发明另一个实施方式，试剂盒可以包含上述特异性探针，所述探针可以与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定其中存在的EE-GH1。任选地，该试剂盒可以进一步包含利用特异性探针鉴定生物样品中EE-GH1时用到的其它任何试剂(例如，但不限于杂交缓冲液，标记物)。

可以利用本发明试剂盒，并且可以具体地调整其成分，以实现质量控制(例如种批的纯度)或植物材料或者包含或源于植物材料的材料(如，但不限于食品或饲料产品)中原种事件的检测。

本发明涉及棉花中原种事件EE-GH1的开发，涉及包含该事件的植物及从这些植物获得的子代及源于该事件的植物细胞或者植物材料。如实施例1中所述，通过用pGSV71转化获得了包含原种事件EE-GH1的植物。

根据本文实施例4中所述的EE-GH1的PCR鉴定方法可以鉴定包含EE-GH1的棉花植物或植物材料。简而言之，用特异识别EE-GH1之5’或3’侧翼序列内的序列的引物，特别是具有SEQ ID NO：2的序列的引物和识别外源DNA内的序列的引物，特别是具有SEQ ID NO：3的序列的引物，通过PCR扩增棉花基因组DNA。利用内源棉花DNA引物作为对照。如果植物材料产生250至290bp，优选约269bp的片段，则可以确定该棉花植物含有原种事件EE-GH1。

含有EE-GH1的植物可以通过其草铵膦抗性来表征，在本发明上下文中，草铵膦抗性包括植物对除草剂Liberty^TM的抗性。可以用不同方式检测对Liberty^TM的抗性。当希望鉴定抗性和敏感性植物，但是不想杀死敏感性植物时，本文所述的叶片涂抹方法是最有用的。可替代地，可以通过Liberty^TM喷雾施用检测抗性。为了得到最好结果，应该在V3和V4叶期(leaf stage)之间进行喷雾处理。通过用至少200g活性组分/公顷(g.a.i./ha)，优选400g.a.i./ha，和可能地多达1600g.a.i./ha(4X正常大田比率)进行植物喷雾而不杀死植物的事实来表征抗性植物。撒施应该以28-34盎司Liberty^TM的比率进行。最好利用扇形雾喷嘴，以每英亩20加仑水体积施用，同时注意不要直接喷雾至植物的轮生体内以避免叶片上表面活性剂灼烧。除草剂的作用应该在48小时内出现，并且在5-7天内清楚可见。

此外，可以通过植物细胞中膦丝菌素乙酰转移酶的存在来表征含有EE-GH1的植物，其中可以通过PAT测定法测定所述膦丝菌素乙烯转移酶的存在(De Block等，1987，上引文)。

例如，可以通过保藏在ATCC，保藏号为PTA-3343的种子获得含有EE-GH1的植物，所述种子含有50％的对原种事件而言为半合子的核。可以进一步繁殖这种植物以将本发明原种事件引入相同植物物种的其它品种中。从这些植物获得的选定的种子将包含稳定掺入它们基因组的原种事件。本发明还涉及包含EE-GH1、来源于ATCC保藏号PTA-3343的植物。这里的术语“来源于”表示植物是相关的，即它们都是通过杂交来自相同转化体的子代(直接的子代或两代或更多代后的子代)。

在无杂草压力和不使用Liberty^TM进行杂草控制的情况下，也可以通过植物所具有的与美国商业棉花品种可比较的农艺特征来表征含有EE-GH1的植物。已经观察到在本文所述的棉花植物基因组插入区中存在外源DNA可以赋予包含这种事件的植物特别有意义的表型和分子特征。更具体地，外源DNA在这些植物基因组的该特定区域中的存在可以使植物显示出目的基因的稳定表型表达，而又不显著地损害植物的任何期望农艺性状。由此，证明与包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4的植物DNA的序列对应的插入区域，更优选与SEQ ID NO：5相应序列对应的插入区域，最优选与其中的EE-GH1插入位点相对应的插入区域特别适于目的基因的引入。更特别地，EE-GH1的插入区域(对应于SEQ ID NO：5内至少40bp的棉花基因组DNA序列，或在严格条件下与SEQ ID NO：5的互补序列杂交的至少40bp序列)特别适于包含除草剂抗性基因的外源DNA的引入，在该区域的引入可以确保这些基因能在植物中表达而不损害农艺性状。

通过定向插入方法可以在插入区域特异地插入重组DNA分子。这种方法对本领域技术人员是已知的，并且包括，例如利用重组酶如，但不限于来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP重组酶(公开的PCT申请WO 99/25821)、来源于大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体P1的CRE重组酶(公开的PCT申请WO 99/25840)、来源于Saccharomyces rouxii的pSR1的重组酶(Araki等.1985，J Mol Biol 182：191-203)、噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser和Kahlmann，1991，Mol Gen Genetics 230：170-176)或者λ噬菌体重组系统(如美国专利4,673,640中所述)的同源重组。

这里所用的“序列同一性”当涉及核苷酸序列(DNA或RNA)时指具有相同核苷酸的位置的数目除以两个序列中较短序列的核苷酸数目。利用20个核苷酸的视窗大小、4个核苷酸的字长及空位罚分4，通过Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann，1983，Proc Nat Acad Sci USA80：726)进行两个核苷酸序列的比对。可以例如利用Wisconsin包的程序(来源于Genetics Computer Group，Inc)方便地进行计算机辅助的分析和序列数据的解释，包括上述的序列比对。当序列具有至少约75％，特别是至少约80％，更特别是至少约85％，十分特别是约90％，尤其是约95％，更尤其是约100％序列同一性，且非常尤其是当序列相同时，该序列被称为“基本相似”。当说RNA序列与DNA序列基本相似或有一定程度的序列同一性时，很清楚的是，将DNA序列中的胸腺嘧啶(T)与RNA序列中的尿嘧啶(U)视为等同。这里所用的“互补于”指核苷酸序列中A和T(U)，及G和C核苷酸间的互补性。

这里所用的“生物样品”是植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语“植物”意指包括处于任何成熟阶段的棉花(如，但不限于陆地棉(Gossypium hirsutum))植物组织，及取自或源于任何这种植物的细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶片、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。这里所用的“植物材料”指从植物获得或源于植物的材料。包含植物材料的产品涉及用植物材料生产或者可能被植物材料污染的食品，饲料或其它产品。可以理解，在本发明上下文中，优选检测这种生物样品中EE-GH1特异性核酸的存在，意即样品中核酸的存在。因此，这里提到的鉴定生物样品中原种事件EE-GH1的方法优选涉及对生物样品中包含原种事件的核酸的鉴定。

这里所用的“包含”被解释为规定了所提到的特征、整数、步骤或成分的存在，但是不排除一个或多个特征，整数、步骤或成分或其组合的存在或添加。因此，例如包含数个核苷酸或氨基酸的核酸或蛋白质可以包含比实际提到的更多的核苷酸或氨基酸，即处于更大的核酸或蛋白质中。包含功能或结构明确的DNA序列的嵌合基因也可以包含另外的DNA序列，等等。

下面的实施例描述了含有原种事件EE-GH1的棉花植物的产生和特征，及用于生物样品中原种事件EE-GH1鉴定的工具的开发。

除非另有叙述，否则根据Sambrook等.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY和Ausubel等，(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA第1和2卷中所述的标准方法实施所有重组DNA技术。在BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications，UK出版的，R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述了用于植物分子工作的标准材料和方法。

在说明书和实施例中，涉及到下列序列：

SEQ ID NO：1：含有5’侧翼区的序列

SEQ ID NO：2：引物GHI06

SEQ ID NO：3：引物GHI05

SEQ ID NO：4：含有3’侧翼区的序列

SEQ ID NO：5：插入区域

SEQ ID NO：6：质粒pGSV71

SEQ ID NO：7：质粒pRVA44

SEQ ID NO：8 引物MDB327

SEQ ID NO：9：引物MLD015

SEQ ID NO：10：引物MLD016

SEQ ID NO：11：引物MDB612

SEQ ID NO：12：物MDB053

SEQ ID NO：13：引物MDB356

SEQ ID NO：14：引物DPA017

SEQ ID NO：15：引物MLD019

SEQ ID NO：16：包含靶位点缺失的序列

SEQ ID NO：17：引物GHI01

SEQ ID NO：18：引物GHI02

实施例

实施例1用除草剂抗性基因转化棉花

1.1包含组成型启动子控制下的bar基因的嵌合DNA的构建

按照标准方法构建质粒pGSV71，表1中给出了质粒pGSV71的遗传元件的顺序(SEQ ID NO：6)：

表1：pGSV71中遗传元件的核苷酸位置

核苷酸位置	缩写	说明和参考文献
核苷酸位置	缩写	说明和参考文献	198-222	-	来自pTiB6S3的TL-DNA右边界重复(Gielen等，1984，EMBO J.3：835-846)
223-249	-	多接头	198-222	-	来自pTiB6S3的TL-DNA右边界重复(Gielen等，1984，EMBO J.3：835-846)
223-249	-	多接头	250-1634	P35S3	花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Odell等，(1985)，Nature 313：810-812)
1635-2186	bar	编码来自吸水链霉菌的膦丝菌素乙酰转移酶的编码序列(Thompson等，(1987)EMBO J.6：2519-2523)。野生型bar编码区N-末端的两个密码子已经分别置换为密码子ATG和GAC。	250-1634	P35S3	花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Odell等，(1985)，Nature 313：810-812)
1635-2186	bar		2187-2205	-	多接头
2206-2465	3’nos	来源于pTiT37之T-DNA的胭脂碱合成酶基因3’非翻译区的260bp TaqI片段(Depicker等，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)	2187-2205	-	多接头
2206-2465	3’nos		2466-2519	-	多接头
2520-2544	-	来自pTiB6S3的TL-DNA左边界重复(Gielen等，1984，EMBO J.3：835-846)	2466-2519	-	多接头

1.2.陆地棉(Gossypium hirsutum)的转化

利用农杆菌转化法(US 5,986,181)，用pGSV71转化Coker312植物的棉花组织，并且在适当培养基中再生成植物。

转移选择性再生培养基上出现的小植物到新的萌发培养基上(所有培养基都无激素)。然后转移幼苗到生长室或温室中。

除了幼苗再生外，在所有其它阶段在膦丝菌素(PPT)上进行筛选，而幼苗再生为加速生长是在缺乏PPT的情况下进行的。这产生了一组初级的转化体(T0代植物)。

实施例2：事件的开发

2.1.带有事件性状的株系的开发

将T0小苗转移到温室土壤，用PAT ELISA(Steffens BiotechnischeAnalysen GmbH，Ebringen，Germany)筛选植物的PAT酶的存在并筛选植物的草铵膦抗性。

在温室中生长T1到T3植物，以2X的比率(通过喷雾56盎司/ha)检测Liberty^TM抗性。利用Deblock等.1987(EMBO J.6：2513-2518)所述的Pat测定法检测阳性植物的bar基因表达。

通过Southern印迹分析检查外源DNA的存在和拷贝数。根据Doyle等(1987，Phytochem.Bull.19：11)的CETAB方法从1g叶片组织分离总基因组DNA，并且用EcoRI限制酶消化总基因组DNA。

如下的探针用于Southern分析：

“bar”探针：质粒pDE110(WO 92/09696)的474bp KpnI-BglI消化物

“35S”探针：质粒pRVA44(SEQ ID NO：7)的892bp NcoI-MunI消化物

此外，与非转基因的等基因系比较评估了T2植物总的表型特征。在以后的子代中，与野生型比较，筛选了如下株系，所述株系在存在半合子或纯合子形式的转基因的情况下未观察到表型或农艺性状受到负面影响。

在大田中生长T4材料，根据不同程序，在大田条件下检测Liberty^TM抗性。

在之后的子代中，比较植物和商业品种的产量、纤维质量和植物图谱数据。评估农艺特征，如植物高度、节高、棉铃保留、直立、茁壮长势、纤维长度、纤维强度和棉绒产量。

确定了一个事件有等同或好于相应审核标准(check)的表现，并且确定了对于该事件而言产量取决于背景而不是转基因的存在。

2.2.原种事件的筛选

该筛选方法产生了一个原种事件，该原种事件显示了35S-bar基因的最佳表达，即对草铵膦的抗性，而对农艺性状和产量没有损害。该原种事件命名为EE-GH1。

2.3.在具有不同遗传背景和位于不同区域的棉花品种中检测EE-GH1

将选定的事件引入不同商业遗传背景中，包括FM989，FM832，FM958和FM966，并且比较4个不同场所的大田试验结果。利用不同的处理(1x3-5叶期，4x，3-5叶期，1x+1x，3-5叶期，4x+4x，3-5叶期，0作为对照)，用1600g.a.i./ha喷雾植物。

原种事件的出苗率和活力评定非常好。

不管施用除草剂时植物发育的速率和阶段如何，在施用后，从来没有观察到可见的因除草剂施用引起的损害。除草剂施用对植物的形态学和生长习性均没有有害的影响。

而且，在多种遗传背景中，事件具有正常的叶、花和棉铃形态学，优良的能育性，并且未显示出疾病或异常的昆虫敏感性。在向多种遗传背景的渐渗过程中，经过4代没有观察到异常的问题或反常。

2.4.基因座的遗传分析

经过几代在子代植物中，通过分子和表型分析检查EE-GH1事件的插入的遗传稳定性。

对于EE-GH1事件，比较了T1、T2和T3代植物的Southern印迹分析。发现获得的印迹图在不同代中是相同的。这证明EE-GH1中外源DNA的分子构型是稳定的。

在至少随后3代中，EE-GH1事件作为单基因座显示了转基因的孟德尔分离，表明该插入是稳定的。

实施例3：原种事件EE-GH1的表征

3.1.基因座的深入分子和遗传分析

在鉴定EE-GH1事件为获得了最佳的转基因表达和整体农艺性状的事件之后，在分子水平上详细分析转基因的基因座。这包括转基因侧翼区的测序。

利用Liu等.(1995，Plant .J.8(3)：457-463)所述的TAIL-PCR方法，检测EE-GH1事件中插入的转基因的侧翼区域的序列。

a)5’侧翼区的检测

所用引物是：

		序列(5’→3’)	在pGSV71中位置
		序列(5’→3’)	在pGSV71中位置	简并引物	MDB327	NTg.Agg.WTC.NWg.TSA.T(SEQ ID NO：8)	-
初级TAIL	MLD015	Tgg.TTC.CTA.gCg.TgA.gCC.AgT.g(SEQ ID NO：9)	606→585	简并引物	MDB327	NTg.Agg.WTC.NWg.TSA.T(SEQ ID NO：8)	-
初级TAIL	MLD015	Tgg.TTC.CTA.gCg.TgA.gCC.AgT.g(SEQ ID NO：9)	606→585	二级TAIL	MLD016	AgC.TgC.TgC.TCT.TgC.CTC.TgT(SEQ ID NO：10)	467→447
三级TAIL	GHI05	ggA.CCg.TTA.TAC.ACA.ACg.Tag(SEQ ID NO：3)	358→338	二级TAIL	MLD016	AgC.TgC.TgC.TCT.TgC.CTC.TgT(SEQ ID NO：10)	467→447

其中，N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T

利用MDB327-GHI05扩增的片段是用于测序的约1200bp(5’侧翼：SEQ ID NO：1)。在bp1和bp677间的序列包含植物DNA，而bp678和bp850间的序列对应于pGSV71DNA。

b)3’侧翼区的检测

所用引物是：

		序列(5’→3’)	pGSV71中位置
		序列(5’→3’)	pGSV71中位置	简并引物	MDB612	NgT.gCT.SWg.ANA.WgA.T(SEQ ID NO：11)	-
初级TAIL	MDB053	CAT.gAC.gTg.ggT.TCC.Tgg.Cag.C(SEQ ID NO：12)	2109-2130	简并引物	MDB612	NgT.gCT.SWg.ANA.WgA.T(SEQ ID NO：11)	-
初级TAIL	MDB053	CAT.gAC.gTg.ggT.TCC.Tgg.Cag.C(SEQ ID NO：12)	2109-2130	二级TAIL	MDB356	AAT.CCT.gTT.gCC.ggT.CTT.gCg(SEQ ID NO：13)	2252-2272
三级TAIL	DPA017	gAT.TAg.AgT.CCC.gCA.ATT.ATA.C(SEQ ID NO：14)	2362-2383	二级TAIL	MDB356	AAT.CCT.gTT.gCC.ggT.CTT.gCg(SEQ ID NO：13)	2252-2272

其中，N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T

利用MDB612-DPA017扩增的片段是约400bp，测定了其完整的序列(SEQ ID NO：4)。核苷酸第1位和179位间的序列对应于T-DNA，而核苷酸第180位和426位间的序列对应于植物DNA。

c)靶位点缺失的鉴定

利用对应于转基因侧翼区内序列的引物，以野生型陆地棉(Gossypiumhirsutum)作为模板，鉴定转基因的插入位点。

利用下面的引物：

序列(5’→3’) 5’侧翼中位置 3’侧翼中位置

(SEQ ID NO：1) (SEQ ID NO：

4)

TTg.CAC.CAT.CTA.gCT.C

AC.TC 815→795 -----

GHI06

(SEQ ID NO：2)

CAA.gAT.gCg.AgC.AAC.TA

MLD019 ----- 285→266

T.gT(SEQ ID NO：15)

这产生了200bp的片段(SEQ ID NO：16)，其中bp85到122对应于靶位点缺失。

因此，所测序的插入区(SEQ ID NO：5)包含：

1-677： 5’侧翼区 SEQ ID NO：1的bp1到677

678-714：靶位点缺失 SEQ ID NO：16的bp85到122

715-916：3’侧翼区 SEQ ID NO：4的bp180到426

3.2基因座的遗传分析

经过几代在子代植物中进行分子和表型分析从而检测了插入的遗传稳定性。比较了T0、T₁和T₂代EE-GH1棉花植物的草铵膦抗性植物的Southern印迹分析，发现它们是相同的。这证明在含有EE-GH1的植物中转基因的分子构型是稳定的。

在上述结果的基础上，鉴定EE-GH1为原种事件。

实施例4：用于事件身份控制的诊断工具的开发

已开发EE-GH1原种事件PCR鉴定方法以鉴定植物、植物材料或生物样品中EE-GH1的存在。

EE-GH1原种事件聚合酶链式反应鉴定方法

在试图筛选未知样品以前必须利用所有适当对照进行试行实验。本方法可能需要针对实验室间可能存在差异的成分进行优化(所述成分为模板DNA制备，Taq DNA聚合酶，引物的质量，dNTP，热循环仪等)。

内源序列的扩增在该方法中起了重要作用。人们必须获得能扩增已知转基因基因组DNA模板中等摩尔量的内源和转基因序列的PCR和热循环条件。如果通过琼脂糖凝胶电泳判定，没有扩增出靶内源片段或扩增出的靶序列不具有相同的溴乙锭染色强度，则可能需要进行PCR条件的优化。

模板DNA

根据Doyle和Doyle(1987，Phytochem.Bull.19：11)所述的CTAB方法制备模板DNA。当利用通过其它方法制备的DNA时，应该利用不同量模板进行试行实验。通常50ng基因组模板DNA产生最好的结果。

指定阳性和阴性对照

下面的阳性和阴性对照应该包括在PCR运行中：

-母混合物对照(DNA阴性对照)。这是没有向反应中添加DNA的PCR。当观察到预期结果，即没有PCR产物时，表明靶DNA没有污染此PCR混合物。

-DNA阳性对照(已知含有转基因序列的基因组DNA样品)。该阳性对照的成功扩增证明PCR是在允许靶序列扩增的条件下进行的。

-野生型DNA对照。这是所提供的模板DNA是从非转基因植物制备的基因组DNA的PCR。当观察到预期结果，即没有转基因PCR产物的扩增，但是有内源PCR产物的扩增时，表明在基因组DNA样品中没有可检测的转基因背景扩增。

引物

利用下面特异识别转基因和EE-GH1侧翼序列的引物：

引物	序列(5’→3’)	在SEQ IDNO：1中的位置	靶
引物	序列(5’→3’)	在SEQ IDNO：1中的位置	靶	GHI05	ggA.CCg.TTA.TAC.ACA.ACg.Tag(SEQ ID NO：3)	758→738	pGSV71序列
GHI06	TTg.CAC.CAT.CTA.gCT.CAC.TC(SEQ ID NO：2)	815→795	植物DNA序列	GHI05	ggA.CCg.TTA.TAC.ACA.ACg.Tag(SEQ ID NO：3)	758→738	pGSV71序列

靶向内源序列的引物总是被包含在PCR混合物中。这些引物在未知样品和DNA阳性对照中起到内对照的作用。内源引物对的阳性结果证明在基因组DNA制品中有充足DNA，该DNA质量足以用于产生PCR产物。

所用的内源引物是：

GHI01：5’-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3’(SEQ ID NO：17)

(醇脱氢酶基因Acc.NO：AF036569，1070→1090)

GHI02：5’-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg-3’(SEQ ID NO：18)

(醇脱氢酶基因Acc.NO：AF036569，1515→1495)

扩增的片段

PCR反应中预期的扩增片段是：

对于引物对GHI01-GHI02：445bp(内源对照)

对于引物对GHI05-GHI06：269bp(EE-GH1原种事件)

PCR条件

50μl反应的PCR混合物包含：

5μl模板DNA

5μl 10x扩增缓冲液(与Taq聚合酶一起提供)

1μl 10mM dNTP

0.5μl GHI01(10pmoles/μl)

0.5μl GHI02(10pmoles/μl)

1μl GHI05(10pmoles/μl)

1μlGHI06 (10pmoles/μl)

0.2μl Taq DNA聚合酶(5单位/μl)

加水到50μl

下面是获得最佳结果的热循环模式：

95℃，4分钟

接着： 95℃，1分钟

57℃，1分钟

72℃，2分钟

5个循环

接着： 92℃，30秒

57℃，30秒

72℃，1分钟

25个循环

接着： 72℃，5分钟

琼脂糖凝胶分析

在1.5％琼脂糖凝胶上(Tris-硼酸盐缓冲液)上样适当分子量标准参照物(例如，100bp序列梯PHARMACIA)和10至20μl PCR样品。

结果的确认

除了1)DNA阳性对照显示预期的PCR产物(转基因片段和内源片段)，

2)DNA阴性对照为PCR扩增阴性(没有片段)和3)野生型DNA对照显示预期的结果(内源片段扩增)外，不应该接受来源于单次PCR运行和单一PCR混合物的有关转基因植物DNA样品的数据。

显示出预期大小的可见量转基因和内源PCR产物的泳道表明用于制备该基因组模板DNA的相应植物遗传了EE-GH1原种事件。没有显示出可见量转基因PCR产物但显示了可见量内源PCR产物的泳道表明用于制备该基因组模板DNA的相应植物不含有原种事件。没有显示可见量内源和转基因PCR产物的泳道表明该基因组DNA的质和/或量不允许PCR产物产生。这些植物不能被计算在内。应该重复基因组DNA的制备并且必须利用适当对照进行新的PCR运行。

应用区别PCR方法来鉴定EE-GH1

根据上述方法检测来源于包含不同转基因事件的棉花植物的叶片材料(样品1到4)。来源于野生型棉花的样品作为阴性对照。

在图1中示例了PCR分析的结果。样品1被辨别出包含原种事件EE-GH1。所用其它受试株系不包含该原种事件。

实施例5：EE-GH1向优选品种中的渐渗

通过重复回交将原种事件EE-GH1引入下面商业棉花品种：FM5013，FM5015，FM5017，FM989，FM832，FM966和FM958中。

观察到转基因的表达通过草铵膦抗性测定满足了商业可接受的水平，并观察到原种事件向这些品种中的渐渗未显著影响这些品种的任何期望表型和农艺特征(无连锁拖累(linkage drag))。这证实了事件EE-GH1作为原种事件的状态。

如下面权利要求中所用，除非清楚地另外指明，所用的术语“植物”意在包括任何成熟阶段的植物组织及取自或来源于任何这种植物的细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。

在2001年4月26日，在ATCC(10801 Universlty Blvd.，Manassas，VA20110-2209)保藏了包含原种事件EE-GH1的标准种子，ATCC保藏号为PTA-3343。

本方面的上述描述意在示例而非限制。本领域技术人员可以想到所述实施方式中的各种变化或修改。可以进行这些变化或修改而不背离本发明的精神或范围。

序列表

<110>拜尔生物科学公司

<120>除草剂抗性的棉花植物及生产和鉴定其的方法

<130>EE-GH1

<150>US 09/921,922

<151>2001-08-06

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>850

<212>DNA

<213>人工序列：包含5’侧翼区的序列

<400>1

aaaggggatg agattgaatg ttaccttatc aacaaaagga gttgtagctc atggaacaac 60

aatagtcttt tccacggaaa cctagatgat gtttctccaa tgcttgataa atctttaaca 120

ttgtcatcat aagttgcaac ctcatgtttc acacaagcat caatcaaatg ttgatcttca 180

ttactaaaat gtgcttgatc cttccttaca caaatctacc tatgttgtgg tattttgttc 240

tattcatcat tctaacaagt tttgcaattg agttgaactt cttccaatct cgtatcagcc 300

tataatagtg gggtctaata tgtccatttt tcccacaata atgacatata atctttctaa 360

agcttttatt ctctgcctta tgatgaaaag aacccaaatc tttaacttta acaaaaataa 420

gatgagcgat aggttcttca cctttattga tgtaaccaag tcctctatgg catggttcaa 480

ttctcattga agccaaaatt tcatgaaact tctcacattg gcctctaaac ttcttcaaga 540

tagcctttgc accatctagc tcactcttgg ttgttttcaa aacatcatcc gtttcttgga 600

ccacaatttt gagcttttca ttttctattt tgaggataat agtttattcc ctcaaggaac 660

tattcaactg agcttaacag tactcggccg tcgaccgcgg tacccggaat tccaatccca 720

caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg tattcaacac 780

cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata cgatgactgg 840

ggttgtacaa 850

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列：引物GHI06

<400>2

ttgcaccatc tagctcactc 20

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列：引物GHI05

<400>3

ggaccgttat acacaacgta g 21

<210>4

<211>426

<212>DNA

<213>人工序列：包含3′侧翼区的序列

<400>4

gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa 60

ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcgggaag atcctctaga 120

gtcgacctgc aggcatgcaa gcttagatcc atggagccat ttacaattga atatatcctc 180

caaatattta aaaagaatat caccattatc cgaatcttct ttaaaatctg ttagaacacg 240

gtttggaata gtggtagtaa aagtaacata gttgctcgca tcttgatcta cattaaactt 300

tcttcatcac tccaagtgat tgtaaatgac ttctatttct tcttagtatt agcacattct 360

aattttaagt gaaacaatcc cttacattca taacattgaa tatccttcta tcatctcaca 420

gcacga 426

<210>5

<211>961

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)：插入区

<400>5

aaaggggatg agattgaatg ttaccttatc aacaaaagga gttgtagctc atggaacaac 60

aatagtcttt tccacggaaa cctagatgat gtttctccaa tgcttgataa atctttaaca 120

ttgtcatcat aagttgcaac ctcatgtttc acacaagcat caatcaaatg ttgatcttca 180

ttactaaaat gtgcttgatc cttccttaca caaatctacc tatgttgtgg tattttgttc 240

tattcatcat tctaacaagt tttgcaattg agttgaactt cttccaatct cgtatcagcc 300

tataatagtg gggtctaata tgtccatttt tcccacaata atgacatata atctttctaa 360

agcttttatt ctctgcctta tgatgaaaag aacccaaatc tttaacttta acaaaaataa 420

gatgagcgat aggttcttca cctttattga tgtaaccaag tcctctatgg catggttcaa 480

ttctcattga agccaaaatt tcatgaaact tctcacattg gcctctaaac ttcttcaaga 540

tagcctttgc accatctagc tcactcttgg ttgttttcaa aacatcatcc gtttcttgga 600

ccacaatttt gagcttttca ttttctattt tgaggataat agtttattcc ctcaaggaac 660

tattcaactg agcttaaatc tcaatttttt ttaacatatg actataagta tcctccaaat 720

atttaaaaag aatatcacca ttatccgaat cttctttaaa atctgttaga acacggtttg 780

gaatagtggt agtaaaagta acatagttgc tcgcatcttg atctacatta aactttcttc 840

atcactccaa gtgattgtaa atgacttcta tttcttctta gtattagcac attctaattt 900

taagtgaaac aatcccttac attcataaca ttgaatatcc ttctatcatc tcacagcacg 960

a 961

<210>6

<211>9555

<212>DNA

<213>人工序列：质粒pGSV71

<400>6

agattcgaag ctcggtcccg tgggtgttct gtcgtctcgt tgtacaacga aatccattcc 60

cattccgcgc tcaagatggc ttcccctcgg cagttcatca gggctaaatc aatctagccg 120

acttgtccgg tgaaatgggc tgcactccaa cagaaacaat caaacaaaca tacacagcga 180

cttattcaca cgcgacaaat tacaacggta tatatcctgc cagtactcgg ccgtcgaccg 240

cggtacccgg aattccaatc ccacaaaaat ctgagcttaa cagcacagtt gctcctctca 300

gagcagaatc gggtattcaa caccctcata tcaactacta cgttgtgtat aacggtccac 360

atgccggtat atacgatgac tggggttgta caaaggcggc aacaaacggc gttcccggag 420

ttgcacacaa gaaatttgcc actattacag aggcaagagc agcagctgac gcgtacacaa 480

caagtcagca aacagacagg ttgaacttca tccccaaagg agaagctcaa ctcaagccca 540

agagctttgc taaggcccta acaagcccac caaagcaaaa agcccactgg ctcacgctag 600

gaaccaaaag gcccagcagt gatccagccc caaaagagat ctcctttgcc ccggagatta 660

caatggacga tttcctctat ctttacgatc taggaaggaa gttcgaaggt gaaggtgacg 720

acactatgtt caccactgat aatgagaagg ttagcctctt caatttcaga aagaatgctg 780

acccacagat ggttagagag gcctacgcag caggtctcat caagacgatc tacccgagta 840

acaatctcca ggagatcaaa taccttccca agaaggttaa agatgcagtc aaaagattca 900

ggactaattg catcaagaac acagagaaag acatatttct caagatcaga agtactattc 960

cagtatggac gattcaaggc ttgcttcata aaccaaggca agtaatagag attggagtct 1020

ctaaaaaggt agttcctact gaatctaagg ccatgcatgg agtctaagat tcaaatcgag 1080

gatctaacag aactcgccgt gaagactggc gaacagttca tacagagtct tttacgactc 1140

aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg acactctggt ctactccaaa 1200

aatgtcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaaggata 1260

atttcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat cgaaaggaca 1320

gtagaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcatt 1380

caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg 1440

gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga catctccact 1500

gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga 1560

agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctat aaatctatct 1620

ctctctctat aaccatggac ccagaacgac gcccggccga catccgccgt gccaccgagg 1680

cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc acggtcaact 1740

tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc 1800

gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc 1860

cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc 1920

gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag tccctggagg 1980

cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca 2040

tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg 2100

ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccggta ccgccccgtc 2160

cggtcctgcc cgtcaccgag atctgagatc acgcgttcta ggatccgaag cagatcgttc 2220

aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat 2280

catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt 2340

atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga 2400

aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact 2460

agatcgggaa gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttagatc catggagcca 2520

tttacaattg aatatatcct gccgccgctg ccgctttgca cccggtggag cttgcatgtt 2580

ggtttctacg cagaactgag ccggttaggc agataatttc cattgagaac tgagccatgt 2640

gcaccttccc cccaacacgg tgagcgacgg ggcaacggag tgatccacat gggactttta 2700

aacatcatcc gtcggatggc gttgcgagag aagcagtcga tccgtgagat cagccgacgc 2760

accgggcagg cgcgcaacac gatcgcaaag tatttgaacg caggtacaat cgagccgacg 2820

ttcacggtac cggaacgacc aagcaagcta gcttagtaaa gccctcgcta gattttaatg 2880

cggatgttgc gattacttcg ccaactattg cgataacaag aaaaagccag cctttcatga 2940

tatatctccc aatttgtgta gggcttatta tgcacgctta aaaataataa aagcagactt 3000

gacctgatag tttggctgtg agcaattatg tgcttagtgc atctaacgct tgagttaagc 3060

cgcgccgcga agcggcgtcg gcttgaacga attgttagac attatttgcc gactaccttg 3120

gtgatctcgc ctttcacgta gtggacaaat tcttccaact gatctgcgcg cgaggccaag 3180

cgatcttctt cttgtccaag ataagcctgt ctagcttcaa gtatgacggg ctgatactgg 3240

gccggcaggc gctccattgc ccagtcggca gcgacatcct tcggcgcgat tttgccggtt 3300

actgcgctgt accaaatgcg ggacaacgta agcactacat ttcgctcatc gccagcccag 3360

tcgggcggcg agttccatag cgttaaggtt tcatttagcg cctcaaatag atcctgttca 3420

ggaaccggat caaagagttc ctccgccgct ggacctacca aggcaacgct atgttctctt 3480

gcttttgtca gcaagatagc cagatcaatg tcgatcgtgg ctggctcgaa gatacctgca 3540

agaatgtcat tgcgctgcca ttctccaaat tgcagttcgc gcttagctgg ataacgccac 3600

ggaatgatgt cgtcgtgcac aacaatggtg acttctacag cgcggagaat ctcgctctct 3660

ccaggggaag ccgaagtttc caaaaggtcg ttgatcaaag ctcgccgcgt tgtttcatca 3720

agccttacgg tcaccgtaac cagcaaatca atatcactgt gtggcttcag gccgccatcc 3780

actgcggagc cgtacaaatg tacggccagc aacgtcggtt cgagatggcg ctcgatgacg 3840

ccaactacct ctgatagttg agtcgatact tcggcgatca ccgcttccct catgatgttt 3900

aactttgttt tagggcgact gccctgctgc gtaacatcgt tgctgctcca taacatcaaa 3960

catcgaccca cggcgtaacg cgcttgctgc ttggatgccc gaggcataga ctgtacccca 4020

aaaaaacagt cataacaagc catgaaaacc gccactgcgc cgttaccacc gctgcgttcg 4080

gtcaaggttc tggaccagtt gcgtgagcgc atacgctact tgcattacag cttacgaacc 4140

gaacaggctt atgtccactg ggttcgtgcc ttcatccgtt tccacggtgt gcgtcacccg 4200

gcaaccttgg gcagcagcga agtcgaggca tttctgtcct ggctggcgaa cgagcgcaag 4260

gtttcggtct ccacgcatcg tcaggcattg gcggccttgc tgttcttcta cggcaagtgc 4320

tgtgcacgga tctgccctgg cttcaggaga tcggaagacc tcggccgtcc gggcgcttgc 4380

cggtggtgct gaccccggat gaagtggttc gcatcctcgg ttttctggaa ggcgagcatc 4440

gtttgttcgc ccagcttctg tatggaacgg gcatgcggat cagtgagggt ttgcaactgc 4500

gggtcaagga tctggatttc gatcacggca cgatcatcgt gcgggagggc aagggctcca 4560

aggatcgggc cttgatgtta cccgagagct tggcacccag cctgcgcgag cagggatcga 4620

tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg 4680

aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct 4740

ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga 4800

gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca 4860

ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc 4920

tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg 4980

accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca 5040

cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc 5100

tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg 5160

ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg 5220

ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg 5280

cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc 5340

ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca 5400

ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg 5460

cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga 5520

cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt 5580

cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga 5640

tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct 5700

aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat 5760

gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac 5820

cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc 5880

gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg 5940

gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc 6000

gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg 6060

gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc 6120

ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc 6180

acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc 6240

ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc 6300

acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa 6360

cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc 6420

atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc 6480

gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca 6540

tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg 6600

tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt 6660

aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa 6720

aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt 6780

tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag 6840

cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct 6900

gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga 6960

ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc 7020

ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca 7080

accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat 7140

ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta 7200

cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg 7260

ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg 7320

ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa 7380

gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg 7440

gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt 7500

gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg 7560

gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg 7620

caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg 7680

ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt 7740

caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt 7800

gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca 7860

ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg 7920

ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa 7980

aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 8040

gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac 8100

tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 8160

tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca 8220

aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 8280

cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg 8340

acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc 8400

gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 8460

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 8520

ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa 8580

ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 8640

cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 8700

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 8760

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 8820

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 8880

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 8940

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 9000

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 9060

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 9120

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 9180

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 9240

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 9300

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 9360

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 9420

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tccggaaaac gcaagcgcaa agagaaagca 9480

ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag 9540

cgaaccggaa ttgcc 9555

<210>7

<211>4182

<212>DNA

<213>人工序列：质粒pRVA44

<400>7

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatacctg caggcaattg gtacctacgt atgcatggcg cgccatatgc ccgggccctg 240

tacagcggcc gcgttcctac gcagcaggtc tcatcaagac gatctacccg agtaacaatc 300

tccaggagat caaatacctt cccaagaagg ttaaagatgc agtcaaaaga ttcaggacta 360

attgcatcaa gaacacagag aaagacatat ttctcaagat cagaagtact attccagtat 420

ggacgattca aggcttgctt cataaaccaa ggcaagtaat agagattgga gtctctaaaa 480

aggtagttcc tactgaatct aaggccatgc atggagtcta agattcaaat cgaggatcta 540

acagaactcg ccgtgaagac tggcgaacag ttcatacaga gtcttttacg actcaatgac 600

aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag cacgacactc tggtctactc caaaaatgtc 660

aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag gataatttcg 720

ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcgaaag gacagtagaa 780

aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cattcaagat 840

gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 900

gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc cactgacgta 960

agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca 1020

tttcatttgg agaggacacg ctgaaatcac cagtctctct ctataaatct atctctctct 1080

ctataaccat ggacccagaa cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc gaggcggaca 1140

tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc aacttccgta 1200

ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg gagcgctatc 1260

cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg ggcccctgga 1320

aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc ccccgccacc 1380

agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct gaagtccctg gaggcacagg 1440

gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga cccgagcgtg cgcatgcacg 1500

aggcgctcgg atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag cacgggaact 1560

ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc cgtccggtcc 1620

tgcccgtcac cgagatctga tctcacgcgt ctaggatccg aagcagatcg ttcaaacatt 1680

tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 1740

tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 1800

agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 1860

atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 1920

gaagatcctc tagagcgatc gcaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 1980

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 2040

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 2100

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 2160

gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 2220

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 2280

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 2340

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 2400

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 2460

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 2520

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaaag ctcacgctgt aggtatctca 2580

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 2640

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 2700

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 2760

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 2820

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 2880

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 2940

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 3000

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 3060

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 3120

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 3180

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 3240

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 3300

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 3360

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 3420

acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 3480

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 3540

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 3600

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 3660

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 3720

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 3780

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 3840

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 3900

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 3960

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 4020

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 4080

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 4140

cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 4182

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列：引物MDB327

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(16)

<223>″n″＝a，c，t或g；″s″＝c或g；″w″＝a或t

<400>8

ntgaggwtcn wgtsat 16

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列：引物MLD015

<400>9

tggttcctag cgtgagccag tg 22

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列：引物MLD016

<400>10

agctgctgct cttgcctctg t 21

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列：引物MDB612

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(16)

<223>″n″＝a，c，t或g；＂s″＝c或g；″w″＝a或t

<400>11

ngtgctswga nawgat 16

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列：引物MDB053

<400>12

catgacgtgg gtttctggca gc 22

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列：引物MDB356

<400>13

aatcctgttg ccggtcttgc g 21

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列：引物DPA017

<400>14

gattagagtc ccgcaattat ac 22

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列：引物MLD019

<400>15

caagatgcga gcaactatgt 20

<210>16

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列：包含靶位点缺失的序列

<400>16

tcttggacca caattttgag cttttcattt tctattttga ggataatagt ttattccctc 60

aaggaactat tcaactgagc ttaatatctc aatttttttt aacatatgac tataagtatc 120

ctccaaatat ttaaaaagaa tatcaccatt atccgaatct tctttaaaat ctgttagaac 180

acggtttgga atagtggtag 200

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列：引物GHI01

<400>17

aacctaggct gctgaaggag c 21

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列：引物GHI02

<400>18

caactcctcc agtcatctcc g 21

Claims

1、在基因组中包含事件EE-GH1的转基因棉花植物或其种子、细胞或组织。

2、如权利要求1所述的转基因棉花植物或其种子、细胞或组织，当利用分别包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的核苷酸序列的两个引物，采用EE-GH1原种事件鉴定方法进行分析时，其基因组DNA产生250至290bp的DNA片段。

3、如权利要求2所述的棉花植物或其种子、细胞或组织，其中所述DNA片段是约269bp的片段。

4、通过对生长自保藏在ATCC、保藏号为PTA-3343的种子的棉花植物进行繁殖和/或育种所获得的棉花植物或其种子、细胞或组织。

5、作为保藏在ATCC、保藏号PTA-3343的种子的子代的棉花植物、其种子、细胞或组织。

6、鉴定生物样品中原种事件EE-GH1的方法，该方法包括：用特异识别SEQ ID NO：3中EE-GH1的5’侧翼区或SEQ ID NO：4中EE-GH1的3’侧翼区的引物或探针检测EE-GH1特异区。

7、如权利要求6所述的方法，所述方法包括利用聚合酶链式反应，用至少两个引物从所述生物样品中存在的核酸扩增100至350bp的DNA片段，其中一个引物识别EE-GH1的5’或3’侧翼区，另一个引物识别EE-GH1的外源DNA内的序列。

8、如权利要求7所述的方法，其中所述一个引物识别SEQ ID NO：3的5’侧翼区内的序列，而所述另一引物识别EE-GH1的外源DNA内的序列。

9、如权利要求8所述的方法，其中所述识别EE-GH1的5’侧翼区内序列的引物包含SEQ ID NO：2的序列。

10、如权利要求6到9任一项所述的方法，其中所述识别外源DNA内序列的引物包含SEQ ID NO：1的序列。

11、鉴定生物样品中EE-GH1的方法，该方法包括用在严格条件下能与SEQ ID NO：3中EE-GH1的5’侧翼序列或SEQ ID NO：4中EE-GH1的3’侧翼序列内的序列杂交的特异引物或探针检测EE-GH1特异区。

12、鉴定包含原种事件EE-GH1的转基因植物或其细胞或组织的方法，该方法包括根据PCR鉴定法，利用两个分别具有SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的核苷酸序列的引物进行聚合酶链式反应来确定基因组DNA是否可以用于扩增250至290bp的DNA片段。

13、鉴定生物样品中原种事件EE-GH1的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个PCR引物或探针，所述PCR引物或探针识别SEQ ID NO：3中EE-GH1的5’侧翼区内序列或SEQ ID NO：4中EE-GH1的3’侧翼区内序列。

14、如权利要求13所述的试剂盒，其中所述至少一个PCR引物识别SEQ ID NO：3中植物DNA内的序列。

15、如权利要求14所述的试剂盒，其中所述识别SEQ ID NO：3中植物DNA内的序列的引物包含SEQ ID NO：2的序列。

16、如权利要求13到15所述的试剂盒，其还包含识别EE-GH1的外源DNA内序列的至少第二PCR引物或探针。

17、如权利要求16所述的试剂盒，其中所述识别EE-GH1的外源DNA内序列的引物包含SEQ ID NO：1的序列。

18、验证种子纯度的方法，该方法包括：在种子样品中，用特异识别SEQ ID NO：3中EE-GH1的5’侧翼区内序列或SEQ ID NO：4中EE-GH1的3’侧翼区内序列的特异性引物或探针检测EE-GH1特异的DNA序列。

19、筛选存在EE-GH1的种子的方法，该方法包括：在种批样品中，用特异识别SEQ ID NO：3中EE-GH1的5’侧翼区内序列或SEQ ID NO：4中EE-GH1的3’侧翼区内序列的特异性引物或探针检测EE-GH1特异的DNA序列。

20、保藏在ATCC、保藏号为PTA-3343的种子。

21、包含原种事件EE-GH1的棉花种子，保藏在ATCC、保藏号为PTA-3343并包含所述事件的标准种子。

22、来源于权利要求21的种子并包含原种事件EE-GH1的棉花植物、其细胞或组织或植物材料。

23、转基因棉花植物、种子、细胞或组织，其基因组DNA包含在含有至少40bp如下序列的区域整合进入染色体DNA的转基因，所述序列在严格条件下能与SEQ ID NO：5的序列的互补序列杂交。

24、生产转基因棉花植物或棉花植物的细胞或组织的方法，所述方法包括：向对应于至少40bp如下序列的棉花染色体DNA区域中引入重组DNA分子，其中所述序列在严格条件下能与SEQ ID NO：5的序列的互补序列杂交；和，任选地，从转化的棉花细胞或组织再生棉花植物。

25、如权利要求24所述的方法，其中所述重组DNA分子包含除草剂抗性基因。

26、通过权利要求24或25所述的方法获得的棉花植物或其细胞或组织。

27、转基因棉花植物或其种子、细胞或组织，其

i)在基因组中包含事件EE-GH1；或

ii)包含事件EE-GH1，但前提是用在事件中的bar基因被在严格条件下能与bar基因的互补序列杂交的核酸序列置换。

28、可以利用一套引物从棉花核酸样品扩增的DNA分子，其中第一引物包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4内序列互补的15到30个核苷酸的序列，第二引物包含与所述玉米核酸样品中存在的外源DNA互补的序列。

29、如权利要求28所述的DNA分子，其可以利用一套引物从棉花核酸样品扩增产生，其中第一引物包含SEQ ID NO：2，第二引物包含SEQ IDNO：3。

30、包含权利要求28或29的DNA的检测试剂盒。

31、从玉米组织分离的DNA分子，其包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：4的序列。

32、一种DNA分子，其包含与如下序列相同或互补的序列，该序列具有位于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4中所含插入位点的两侧并与所述插入位点邻近的植物DNA和外源DNA的9个核苷酸。