MXPA04001108A

MXPA04001108A - Plantas de algodon tolerantes a herbicidas y metodos para producir e identificar las mismas.

Info

Publication number: MXPA04001108A
Application number: MXPA04001108A
Authority: MX
Inventors: Gwyn Jefferson
Original assignee: Bayer Bioscience Nv
Priority date: 2001-08-06
Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2005-02-17
Also published as: US7834168B2; EP1417312B1; US7442504B2; ATE524550T1; CN1551920A; AU2002333260B2; WO2003013224A3; BR122014009174B1; AR036209A1; BRPI0211726B1; US20090087853A1; WO2003013224A2; US20030097687A1; EP1417312A2; AR100107A2; US6818807B2; CN100523190C; BR0211726A; ES2373434T3; AR100106A2

Abstract

Esta invencion se refiere a plantas, material vegetal y semillas de algodon transgenicas, caracterizados por contener un evento de transformacion especifico, en particular por la presencia de un gen codificador de una proteina que confiere tolerancia a herbicidas, en una ubicacion especifica del genoma de algodon. Las plantas de algodon de la invencion combinan el fenotipo de tolerancia a herbicidas con caracteristicas de rendimiento agronomico.

Description

PLANTAS DE ALGODON TOLERANTES A HERBICIDAS Y METODOS PARA PRODUCIR E IDENTIFICAR LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a plantas, material vegetal y semillas de algodón transgénicas, caracterizados por contener un evento de transformación específico, en particular por la presencia de un gen codificador de una proteína que confiere tolerancia a herbicidas, en una ubicación específica del genoma de algodón. Las plantas de algodón de la invención combinan el fenotipo de tolerancia a herbicidas con características de rendimiento agronómico, estabilidad genética y capacidad de adaptación a diferentes antecedentes genéticos equivalentes a la línea de algodón no transformada en ausencia de presión por malezas. Todos los documentos citados aquí se incorporan en el presente documento a modo de referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La expresión fenotípica de un transgén en una planta está determinada tanto por la propia estructura del gen como por su ubicación en el genoma vegetal. Al mismo tiempo, la presencia del transgén en diferentes ubicaciones del genoma afectará el fenotipo general de la planta de diversas maneras. La introducción exitosa desde un punto de vista agronómico o industrial de una característica comercialmente interesante en una planta mediante manipulación genética puede ser un procedimiento largo que depende de diferentes factores. La transformación y la regeneración reales de plantas genéticamente transformadas sólo es el primero de una serie de pasos de selección, que incluyen la caracterización, la cría y la evaluación genéticas extensivas para experimentos en el campo. La fibra de algodón es el textil individualmente más importante a escala mundial. Anualmente, se cosechan 32.37 millones de hectáreas de algodón aproximadamente en todo el mundo. El algodón ocupa el quinto lugar en los E.U.A. en términos de la superficie de producción, con más de 6.07 millones de hectáreas sembrados en 2000. Las especies de malezas más importantes para el algodón son Ipomea sp. (maravilla), Amaranthus spp. (chual), Cyperus ssp. (cebollín), Xanthium spp. (azolla) y Sorghum spp. (alepo). Antes de la introducción del uso de herbicidas para hojas anchas en un campo de algodón en crecimiento, los cultivadores usaban herbicidas de post-emergencia, dirigidos y no selectivos sin tener en cuenta el contacto con las plantas de cultivo. Dado que esto requiere una diferencia de alturas entre las malezas y el cultivo, no siempre era posible el uso de este tipo de herbicidas. En especial cuando se trata de algodón de poca altura, esta práctica requiere mucho tiempo y puede ser potencialmente nociva para los cultivos.

El gen bar (Thompson et al, 1987, EMBO J 6: 2519-2523; Deblock et al. 1987, EMBO J. 6: 2513-2518) es un gen que codifica la enzima fosfinotricinacetilo transferasa (PAT), que cuando se expresa en una planta, confiere resistencia a los compuestos herbicidas fosfinotricina (también denominada glufosinato) o bialafos (véase también, por ejemplo, las patente de E.U.A. No. 5,646,024 y 5,561 ,236) y las sales y los isómeros ópticos de los mismos. La fosfinotricina controla las malezas de hojas anchas, incluyendo maravillas, y tienen un amplio espectro de aplicación. Se ha logrado una transformación genética de algodón con buenos resultados utilizando una cantidad de métodos incluyendo infección por Agrobacterium de explantes de algodón (Firoozabady et al. 1987, Plant Molecular Biology 10 105-1 16; Umbeck eta I. 1987, Bio/Technology 5: 263-266 y en WO 00/71733, E.U.A. 5,004,863 y patente 5,159,135), así como transferencia directa de genes mediante bombardeo con partículas de los tejidos meristemáticos de algodón (Finer y Me Mullen, 1990, Plant Cell Reports, 5: 586-589; McCabe y Martinell, 1993, Bio/Tecnology 11 : 596-598, WO 92/15675, EP0 531 506). Se ha descrito una mayor eficacia de transformación con Agrobacterium usando los métodos descritos por Hansen et al. (1994, Proc. Mat. Acad. Sci. 91 : 7603-7607) Veluthambi et al. (1989, Journal of Bacteriology 171 : 3696-3703) y WO 00/71733. También se ha descrito otros métodos de regeneración de plantas de algodón (WO89/0534, E.U.A., 5,244,802, E.U.A. 5,583,036, WO89/12102, WO98/15622 y WO97/12512).

Sin embargo, en los documentos citados no se describen los temas concernientes a la presente invención. La presente invención se relaciona con una planta de algodón transgénica, o semillas, células o tejidos de la misma, que contienen, integrado de forma estable en su genoma, un cassette de expresión que contiene un gen de tolerancia a herbicidas que comprende la secuencia de codificación del gen bar (descrito aquí en el ejemplo 1.1 ), que es tolerante a herbicidas y, en ausencia de presión por malezas, tiene un rendimiento agronómico que es sustancialmente equivalente a la isolínea no transgénica. Bajo presión de malezas y el tratamiento apropiado con Liberty™, la planta presenta un fenotipo agronómico superior en comparación con la planta no transgénica. En una modalidad de la invención, la planta de algodón, o semillas, células o tejidos de lamisma, comprende el cassette de expresión del pGSV71 (como se describe en el ejemplo 1.1 , cuadro 1 , en este documento). En una modalidad preferida de la invención, la planta de algodón, o semillas, células o tejidos de la misma comprenden el evento de élite EE-HG1. En otra modalidad de la invención, la planta de algodón transgénica, o semillas, células o tejidos de la misma, comprenden: (i) el evento EE-GH1 en su genoma; o (ii) el evento EE-GH1 siempre que el gen bar usado en el evento se sustituya por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza con el complemento del gen bar bajo condiciones severas.

Más específicamente, la presente invención se relaciona con una planta de algodón transgénica, con semillas, células o tejidos de la misma, cuyo ADN genómico está caracterizado por el hecho que, cuando se analiza mediante un protocolo de identificación por PCR como se describe aquí, usando dos cebadores dirigidos a la región flanqueadora 5' o 3' del EE-GH1 y el ADN extraño, respectivamente, permite obtener un fragmento que es específico del EE-GH1. Preferentemente, los cebadores están dirigidos contra la región flanqueadora 5' de la SEQ IN No.: 1 y el ADN extraño, respectivamente; más preferentemente, los cebadores comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 2 y SEQ ID No.: 3, respectivamente y permiten obtener un fragmento de ADN que comprende entre 250 y 290 bp, con preferencia de 269 bp aproximadamente. Las semillas de referencia que contienen un evento de élite de la invención fueron depositadas en ATCC con el número de acceso PTA-3343. Por consiguiente, una modalidad preferida de la invención es una semilla que comprende el evento de élite EE-GH1 depositado en ATCC con el número de acceso PTA-3343, que se desarrollará en una planta de algodón resistente a glufosinato. La semilla del número de depósito PTA-3343 en ATCC, que pertenece a un lote de semillas que consiste de un 50% aproximadamente de granos no transgénicos y un 50% de granos transgénicos hemicigotas para el transgén, que comprende el evento de élite de la invención, se desarrollará en plantas tolerantes a glufosinato. La semilla se puede sembrar y las plantas en crecimiento se pueden tratar con PPT o Liberty™ como se describe aquí para obtener un 100% de plantas tolerantes a glufosinato que comprenden el evento de élite de la invención. La invención se relaciona además con células, tejidos, la progenie y los descendientes de una planta que comprende el evento de élite de la invención cultivados a partir de la semilla depositada en ATTC con el número de acceso PTA-3343. La invención se relaciona además con plantas que pueden obtener por propagación y/o cría a partir de una planta de algodón que contiene al evento de élite de la invención cultivada a partir de la semilla depositada en ATCC con el número de acceso PTA-3343. La invención se relaciona además con plantas, semillas, células o tejidos que comprende una secuencia de ADN extraño, preferentemente un gen de tolerancia a herbicidas como se describe aquí, integrada en el ADN cromosómico en una región que comprende la secuencia de ADN vegetal de la SEQ ID No.: 1 y/o de la SEQ ID No. 4, en particular que comprende la secuencia de ADN de la SEQ ID No.: 5 o una secuencia que se hibridiza bajo condiciones severas con una secuencia complementaria de una secuencia que comprende la secuencia de ADN vegetal de la SEQ ID No.: 1 , la SEQ ID No.: 4 y/o la SEQ IN No.: 5. La invención provee también un procedimiento para producir una célula transgénica de una planta de algodón, que comprende la inserción de una molécula de ADN recombinante en la región del ADN cromosómico de una célula, tejido o callo de algodón que contiene la secuencia de ADN vegetal de la SEQ IN No.: 1 y/o la SEQ IN No.: 4, o que comprende una secuencia que se hibridiza bajo condiciones severas con una secuencia complementaria de una secuencia que contiene la secuencia de ADN vegetal de la SEQ IN No.: 1 y/o de la SEQ IN No.: 4. La invención se relaciona además con un método para identificar una planta transgénica, o células o tejidos de la misma, que contiene al evento de élite EE-GH1 , donde dicho método se basa en identificar la presencia de las secuencias de ADN características, o las secuencias de aminoácidos codificadas por dichas secuencias de ADN, en la planta, las células o los tejidos transgénicos. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, dichas secuencias de ADN características son secuencias de 15 bp, preferentemente de 20 bp, más preferentemente de 30 a bp o más que comprenden el sitio de inserción del evento, es decir tanto una parte de ADN extraño como la parte del genoma de algodón (ya sea la flanqueadora región 5' ó 3') contigua con la misma, que permite una identificación específica del evento de élite. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se describen secuencias de ADN que comprenden el sitio de inserción del evento y una longitud suficiente de polinucleótidos, tanto del ADN genómico de algodón como del ADN extraño (transgén), para que sean de utilidad como cebadores o sondas destinadas a la detección del EE-GH1. Preferentemente, dichas secuencias comprenden por lo menos 9 nucleótidos del ADN genómico de algodón y una cantidad similar de nucleótidos del ADN extraño (transgén) del EE-GH1 a ambos lados del sitio de inserción, respectivamente. Más preferentemente, dichas secuencias de ADN comprenden por lo menos 9 nucleótidos del ADN genómico de algodón y una cantidad similar de nucleótidos del ADN extraño contiguo del sitio de inserción en la SEQ ID No.: 1 o SEQ ID No.: 4. De acuerdo con otro aspecto preferido de la invención, el método para identificar una planta transgénica, o células o tejidos de la misma, que comprende el evento de élite EE-GH1 , comprende amplificar una secuencia de un ácido nucleico presente en muestras biológicas, usando la reacción en cadena de la polimerasa, con por lo menos dos cebadores, uno de los cuales permite reconocer el ADN vegetal de la región flanqueadora 5' ó 3' del EE-GH1 , el otro permite reconocer la secuencia del ADN extraño. Preferentemente, el ADN genómico se analiza usando cebadores que reconocen una secuencia de la región flanqueadora 5' del EE-GH1 , más preferentemente de la secuencia de ADN vegetal representada en la SEQ ID No.: 1 , y una secuencia de ADN extraño, respectivamente. Se prefiere especialmente analizar el ADN genómico utilizando el protocolo de identificación por PCR que se describe en este documento, por el cual el cebador que reconoce la secuencia de la región flanqueadora 5' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.; 2. En particular, el cebador que reconoce una secuencia de la región flanqueadora 5' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.: 2 y el cebador que reconoce la secuencia de ADN extraño comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.: 3, de modo que el fragmento amplificado comprende preferentemente entre 250 y 290 bp, más preferentemente entre 260 y 270 bp, más preferentemente aún 269 bp. Por consiguiente, la presente invención se relaciona con una planta transgénica, con células o tejidos de la misma, que se pueda identificar de acuerdo con los métodos de identificación descritos previamente por la presencia del EE-GH1. La presente invención se relaciona con métodos para identificar el evento de élite EE-GH1 en muestras biológicas, donde dichos métodos se basan en cebadores o sondas que reconocen específicamente la secuencia flanqueadora 5' y/o 3' del EE-GH1. En una modalidad preferida de la invención estos métodos se basan en cebadores o sondas que reconocen la secuencia de la SEQ ID No.: t y/o SEQ ID No.; 4, más especialmente cebadores o sondas que comprenden la secuencia de la SEQ ID No.: 2. De acuerdo con otra modalidad de la invención dichos métodos se basan en cebadores o sondas que reconocen una secuencia de EE-GH1 característica, que es una secuencia de ADN comprende el sitio de inserción del evento, incluyendo nucleótidos suficientes del ADN flanqueador 5' ó 3' y el ADN extraño contiguo del mismo, para que sea diagnóstica del evento. Más particularmente, dichos métodos se basan en secuencias que comprenden nucleótidos suficientes del ADN flanqueador 5' ó 3' y del ADN extraño contiguo del mismo de la SEQ ID No.: 1 o de la SEQ ID No.; 4. Dichos métodos son conocidos en el arte e incluyen, pero sin limitaciones, el método descrito por Lyamichev et al. (1999, Nature Biotech 17: 292-296).

La presente invención se relaciona además con las secuencias flanqueadoras específicas del EE-GH1 que se describen, aquí, que se pueden usar para desarrollar métodos de identificación específicos del EE-GH1 en muestras biológicas. Más particularmente, la invención se relaciona con las regiones flanqueadoras 5' y/o 3' del EE-GH1 , que se pueden usar para desarrollar cebadores y sondas específicas, así como cebadores y sondas específicas desarrolladas a partir de las secuencias flanqueadoras 5' y/o 3' del EE-GH1 y el sitio de inserción adyacente de las mismas. La invención se relaciona además con métodos para identificar la presencia del EE-GH1 en muestras biológicas basadas en el uso de dichos cebadores o sondas específicos. Por consiguiente, la invención también se relaciona con un juego de elementos [kit] para identificar el evento de élite EE-GH1 en muestras biológicas, donde dicho juego de elementos comprende por lo menos un cebador o sonda capaz de reconocer específicamente la región flanqueadora 5' ó 3' del EE-GH1. Preferentemente, el juego de elementos de la invención comprende, además un cebador capaz de reconocer específicamente una secuencia del ADN extraño del EE-GH1 , para su uso en un protocolo de identificación con PCR. Preferentemente, el juego de elementos de la invención comprende dos (o más) cebadores específicos, uno de los cuales reconoce una secuencia de la región flanqueadora 5' del EE-GH1 , más preferentemente una secuencia de la región de ADN vegetal de la SEQ ID No.: 1 , y otro que reconoce una secuencia del ADN extraño. Se prefiere especialmente que el cebador capaz de reconocer la secuencia de ADN vegetal de la región flanqueadora 5' comprenda la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.; 2. En particular, el cebador capaz de reconocer la secuencia de ADN vegetal de la región flanqueadora 5' comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.: 2 y el cebador capaz de reconocer el ADN extraño comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.: 1 , descritas en este documento. De acuerdo con una modalidad adicional, la invención se relaciona con un juego de elementos para identificar el evento de élite EE-GH1 en muestras biológicas, donde dicho juego de elementos comprende por lo menos un cebador o sonda específica cuya secuencia corresponde (o es complementaria de) a una secuencia que se hibridiza bajo condiciones severas con una región específica o características del EE-GH1. Preferentemente, la secuencia de la sonda corresponde a una región específica que comprende parte del ADN extraño y parte de la región flanqueadora 5' ó 3' (ADN vegetal) del EE-GH1 contiguo al mismo. Más preferentemente, la sonda específica comprende (o es complementaria de) una secuencia que se hibridiza bajo condiciones severas con una secuencia de 15 a 30 nucleótidos que abarca el sitio de inserción en la región 5' ó 3' del ADN extraño de la SEQ ID No.: 1 o SEQ ID No.: 4. Con mayor preferencia, la sonda específica comprende (o es complementaria de) una secuencia que se hibridiza bajo condiciones severas con una secuencia de 9 nucleótidos de ADN vegetal y una cantidad similar de nucleótidos del ADN extraño contiguos al sitio de inserción, dentro de las secuencias de la SEQ ID No.:1 o la SEQ ID No.: 4. De acuerdo con una modalidad particular, dicho cebador comprende una secuencia que es idéntica a la secuencia de 9 nucleótidos del ADN vegetal y una cantidad similar de nucleótidos del ADN extraño contiguos al sitio de inserción, dentro de las secuencias de la SEQ ID No.: 1 o la SEQ ID No.; 4. Los métodos y juegos de elementos abarcados por la presente invención se pueden usar para diferentes propósitos tal como, pero son limitaciones, los que se mencionan a continuación: para identificar el EE-GH1 en plantas, en material vegetal o en productos tal como, pero sin limitaciones, productos alimentarios o alimentos para animales (frescos o procesados) que comprenden o derivan del material vegetal; además, o como alternativa, los métodos y juegos de elementos de la presente invención se pueden usar para identificar el material vegetal transgénico a los efectos de determinar la segregación del material transgénico y no transgénico; además, o como alternativa, los métodos y juegos de elementos de la presente invención se pueden usar para determinar la calidad (es decir el porcentaje de material puro) del material vegetal que contiene al evento EE-GH1. La presente invención se relaciona además con un método para efectuar un seguimiento de las plantas que contienen el evento de élite EE-GH1 en su genoma después de su introducción diferentes cultivares.

Se debe tener en cuenta que las modalidades particulares de la invención están descritas en las reivindicaciones subordinadas citadas en este documento. DESCRIPCION BREVE DE LA FIGURA La siguiente descripción detallada, que se ofrece a modo de empleo pero que no pretende limitar la invención a las modalidades específicas descritas, se comprenderá mejor con relación a la figura adjunta, que se incorpora a modo de referencia en este documento, donde: fig. 1 análisis por PCR de otros eventos y del evento de élite EE- GH1 utilizando el protocolo de identificación por PCR del EE-GH1. Secuencias cargadas en el gel: calle 1 , marcador del peso molecular (marcador para 100 bp), calle 2, muestra de ADN de una planta de algodón que contiene al evento transgénico EE-GH1 , calle 3, muestras de ADN de una planta de algodón que contiene otro evento transgénico, calle 4, ADN de algodón de tipo silvestre, calle 5, tipo silvestre + 1 copia de la digestión con BamHI del pGSV71 (control positivo), calle 6, control negativo (sin templado), calle 8, marcador del peso molecular (marcador para 100 bp).

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS El término "gen", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier secuencia de ADN que comprende numerosos fragmentos de ADN ligados operativamente entre sí, tal como región promotora, una región no traducida 5' (la UTR 5'), la región de codificación (que puede, o no, codificar una proteína) y una región no traducida 3' (UTR 3') que comprende un sitio de poliadenilación. Típicamente, en las células vegetales, la UTR 5', la región de codificación y la UTR 3' se transcriben en un ARN por el cual, en el caso de un gen que codifica una proteína, la región de codificación se traduce en una proteína. El gen puede incluir fragmentos de ADN adicionales tal como, p. Ej., intrones. El locus del gen, tal como se utiliza aquí, es la posición de un gen dado en el genoma de la planta. El término "quimérico", con referencia a un gen o a una secuencia de ADN, se utiliza aquí para hacer referencia al hecho que el gen o la secuencia de ADN comprende por lo menos dos fragmentos de ADN funcionalmente importantes (tal como un promotor, una UTR 5', la región de codificación, una UTR 3', un intrón) que no están asociados naturalmente entre sí y/o que provienen, por ejemplo, de fuentes diferentes. El término "extraño" con referencia a un gen o a una secuencia de ADN de una especie vegetal se utiliza para indicar que dicho gen o secuencia de ADN no está presente en la naturaleza en dicha especie vegetal o que no se encuentra en la naturaleza en dicho locus genético de dicha especie vegetal. El término "ADN extraño" se usa aquí para hacer referencia a una secuencia de ADN tal como se ha incorporado en el genoma de una planta como resultado de una transformación. El "ADN transformante", tal como se utiliza aquí, se refiere a la molécula de ADN recombinante usada para la transformación. El ADN transformante comprende habitualmente por lo menos un "gen de interés" (por ejemplo, un gen quimérico) capaz de conferir una o varias características específicas a la planta transformada. El término "molécula de ADN recombinante" se usa a modo de ejemplo y por consiguiente puede incluir una molécula aislada de ácido nucleico que puede ser ADN y se puede obtener por recombinación u otros procedimientos. Tal como se utiliza aquí, el término "transgén" se refiere al gen de interés (o todo el ADN extraño) que se incorporó en el genoma de una planta que comprende por lo menos un transgén en el genoma de todas las células. El ADN extraño presente en las plantas de la presente invención comprenderá preferentemente un gen de tolerancia a herbicidas, más específicamente el gen 35S-6arcomo gen de interés. Un gen de "tolerancia a herbicidas", tal como se utiliza aquí, e refiere a un gen por el cual una planta se vuelve tolerante a un herbicida. Un ejemplo de un gen de tolerancia a herbicidas es un gen que comprende una secuencia codificadora de la enzima fosfinotricinacetilo transferasa, que detoxifica la fosfinotricina, bajo el control de un promotor constitutivo. Más específicamente, en el evento de élite de la presente invención el gen de tolerancia a herbicidas comprende ia secuencia de codificación del gen de resistencia a bialafos (bar) de Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) EMBO J 6: 2519-2523) bajo el control del promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (Odell et al., (1985), Nature 313: 810-812), también denominado "35S-bar" en este documento. La expresión del gen 35S-£>ar confiere tolerancia a los compuestos herbicidas fosfinotricina o bialafos o glufosinato o, en general, a los inhibidores de la glutamina sintetasa, o las sales o isómeros ópticos de los mismos, que en general se denominan de "tolerancia a glufosinato" en este documento. La hibridación bajo "condiciones severas" se refiere a una hibridación bajo las condiciones de hibridación convencionales descritas por Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que puede comprender, p. Ej., los siguientes pasos: 1 ) inmovilizar fragmentos de ADN genómico vegetal sobre un filtro, 2) prehibridizar el filtro durante 1 a 2 horas a 42°C en formamida 50% SSPE 5 X, reactivo de Denhardt 2 X y DS 0.1 % o durante 1 a 2 horas a 68°C en SSC 6 x, reactivo de Denhart 2 X y SDS 0.1 %, 3)añadir la sonda de hibridación que está marcada, 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro durante 20 min a temperatura ambiente en SSC 1X, SDS 0.1 %, 6) lavar el filtro tres veces durante 20 minutos por vez a 68°C en SSC 0.2 X, SDS 0.1 % y 7) exponer el filtro durante 24 a 48 horas a una película de rayos X a -70°C con una pantalla intensificadora.

La incorporación de una molécula de ADN recombinante en el genoma vegetal es, típicamente, el resultado de una transformación de una célula, tejido o callo (o de otra manipulación genética). El sitio de incorporación particular es aleatorio o está en una ubicación predeterminada (si se utiliza un procedimiento de integración dirigido). El ADN introducido en el genoma vegetal como resultado de la transformación de la célula o el tejido vegetal con un ADN recombinante o "ADN transformante" se denomina, de aquí en adelante, "ADN extraño" que comprende uno o varios "transgenes". Por consiguiente, el ADN extraño puede contener tanto ADN recombinante como el ADN recién introducido y reordenado de la planta. Sin embargo, en el contexto de la presente invención el término "ADN vegetal" se refiere al ADN vegetal que habitualmente se encuentra en el mismo locus genético en la correspondiente planta de tipo silvestre. El ADN extraño se puede caracterizar por la ubicación y la configuración en el sitio de incorporación de la molécula de ADN recombinante en el genoma de la planta. El sitio en el genoma de la planta donde se ha insertado el ADN recombinante también se denomina "sitio de inserción" o "sitio blanco". La inserción del ADN recombinante en el genoma vegetal se puede asociar con una supresión del ADN vegetal, denominada "supresión del sitio blanco". La "región flanqueadora" o "secuencia flanqueadora", tal como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia de por lo menos 20 bp, preferentemente por lo menos 50 bp y hasta 5000 bp del genoma ubicados ya sea inmediatamente 5" y contiguo del ADN extraño. Los procedimientos de transformación que conducen a una integración aleatoria del ADN extraño darán como resultado transformantes con diferentes regiones flanqueadoras, que son características y únicas para cada transformante. Cuando el ADN recombinante presente en una planta transgénica se introduce en una planta diferente por medio de un cruzamiento tradicional, en general no cambia el sitio de inserción o las regiones flanqueadoras en el genoma de la planta (además de los cambios ocasionales debidos a mutaciones o entrecruzamientos y transposones). La "región de inserción", tal como se utiliza aquí, se refiere a una región que corresponde a por lo menos 40 bp, preferentemente por lo menos 100 bp y hasta más de 10000 bp, comprendida por la secuencia que contiene la región flanqueadora 5' y/o 3' del ADN extraño en el genoma vegetal (no transformado) (y que incluye el sitio de inserción y los posibles sitios de supresión). Teniendo en cuenta las diferencias menores debidas a mutaciones dentro de una especie dada, la región de Inserción va a retener por lo menos un 85%, preferentemente un 90%, más preferentemente un 95% y con mayor preferencia un 100% de identidad de secuencia con la secuencia que contiene las regiones flanqueadoras 5' y 3' del ADN extraño en una planta dada de dicha especie. La expresión del gen de interés se refiere al hecho que dicho gen confiere a la planta una o varias características fenotípicas (por ejemplo tolerancia a herbicidas) que se querían obtener mediante la introducción de la molécula de ADN recombinante, el ADN transformante, utilizada durante la transformación (sobre la base de la estructura y función de parte o todo el o los genes de interés). Un "evento" se define como un locus genético (artificial) que, como resultado de una manipulación mediante ingeniería genética, lleva un ADN extraño que comprende por lo menos una copia del o de los genes de interés (también denominado evento de transformación). El evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión de los transgenes. A nivel genético, el evento forma parte de la estructura genética de una planta. A nivel molecular, el evento se caracteriza por su mapa de restricción (determinado, por ejemplo, por transferencia southern) y/o por las secuencias flanqueadoras 5' y/o 3' del ADN extraño y/o la configuración molecular del ADN extraño que comprende los transgenes. Habitualmente, cuando se transforma una célula, tejido o callo vegetal con un ADN transformante, se generan múltiples eventos, cada uno de los cuales es único. Un "evento de élite", tal como se utiliza aquí, es un evento que se selecciona entre un grupo de eventos obtenidos por transformación con el mismo ADN transformante o por retrocruza con plantas obtenidas con dicha transformación, basado en la expresión fenotípica y la estabilidad de los transgenes y la ausencia de un impacto negativo sobre las características agronómicas de la planta que lo contiene (es decir, el evento de transformación seleccionado). Por consiguiente, los criterios para la selección de un evento de élite comprenden uno o varios, con preferencia dos o más mejor todos los que se enumeran a continuación: Que la presencia del ADN extraño en la planta no comprometa otras características deseadas de la planta, tal como las que se relacionan con el rendimiento agronómico o el valor comercial; Que el evento se caracterice por una configuración molecular bien definida de herencia estable y para la cual sea posible desarrollar las herramientas de diagnóstico apropiadas para controlar su identidad; Que el o los genes de interés presenten una expresión fenotípica espacial y temporal apropiada y estable en la condición homocigota del evento, a un nivel aceptable para uso comercial es un rango de las condiciones ambientales a las cuales el evento estará expuesto con un uso agronómico normal. Se prefiere que el ADN extraño esté asociado con una posición en el genoma de la planta que permita su introducción en los antecedentes genéticos comerciales deseados. El estado de un evento como evento de élite se confirma con la introducción del evento de élite en diferentes antecedentes genéticos importantes y la observación de su cumplimiento con uno, o todos los criterios, por ejemplo a), B) y c), mencionados previamente. Un "evento de élite" se refiere entonces a un locus genético que comprende un ADN extraño, que responde a los criterios enumerados anteriormente. Una planta, material vegetal o pregenie, tal como semillas, puede comprender uno o varios de los eventos de élite en su genoma. Por consiguiente, cuando se hace referencia a una planta, semilla, células o tejido que comprende el evento de élite EE-GH1 en su genoma, dicha planta, semilla, célula o tejido comprende ADN extraño que se describe aquí (que contiene el gen 35S-bar) integrado en su genoma en el sitio de integración que se describe en este documento. Las herramientas desarrolladas para identificar un evento de élite o la planta o el material vegetal que comprende un evento de élite o los productos que comprende un material vegetal que contiene al evento de élite se basan en las características genómicas específicas de dicho evento de élite, tal como, un mapa de restricción específico de la región genómica que comprende al ADN extraño, marcadores moleculares o la secuencia de la o las regiones flanqueadoras del ADN extraño. Una vez que se han secuenciado una o ambas regiones flanqueadoras de ADN extraño, se pueden desarrollar cebadores y sondas que reconocen específicamente dichas secuencias en el ácido nucleico (ADN o ARN) de la muestra por medio de una técnica de biología molecular. Por ejemplo, se puede desarrollar un método por PCR para identificar el evento de élite en muestras biológicas (tal como muestras de plantas, material vegetal o productos que comprenden al material vegetal). Dicha PCR se basa en por lo menos dos "cebadores" específicos, uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueadora 5' o 3' del evento de élite y otro que reconoce una secuencia del ADN extraño. La secuencia de los cebadores comprende preferentemente entre 15 y 35 nucleótidos que bajo condiciones PCR optimizadas "reconocen específicamente" una secuencia dentro de la región flanqueadora 5' o 3' del evento de élite y del ADN extraño del evento de élite, respectivamente, de modo tal que se amplifica un fragmento específico ("fragmento de integración") a partir de la muestra de ácido nucleico que contiene al evento de élite. Esto significa que solamente se amplifica el fragmento de integración buscado y ninguna otra secuencia (de dicho tamaño) del genoma de la planta o de ADN extraño, bajo las condiciones de PCR optimizadas. Preferentemente, la longitud del fragmento de integración comprende entre 50 y 500 nucleótidos, más preferentemente entre 100 y 350 nucleótidos. Se prefiere que la secuencia de los cebadores específicos sea entre un 80 y 100% idéntica a la secuencia perteneciente a la región flanqueadora 5' o 3' del evento de élite y del ADN extraño del evento de élite, respectivamente, con las faltas de coincidencia que aún permitan una identificación específica de dicho evento de élite con estos cebadores bajo las condiciones de PCR optimizadas. El rango de faltas de coincidencia permitidas se puede determinar, sin embargo, con facilidad con la experimentación conocida por el especialista en el arte. Dado que la secuencia de los cebadores y la secuencia reconocida en el genoma son únicas para el evento de élite, en las muestras biológicas solamente se amplificará el fragmento de integración que comprende (el ácido nucleico) el evento de élite. Al llevar a cabo la PCR para identificar la presencia del EE-GH1 en muestras desconocidas se prefiere incluir un control que comprende un conjunto de cebadores que permita amplificar un fragmento de un "gen de mantenimiento" de la especie vegetal del evento. Los genes de mantenimiento so genes que se expresan en la mayoría de los tipos celulares y que están relacionados con las actividades metabólicas básicas que son comunes a todas las células. Preferentemente, el fragmento amplificado del gen de mantenimiento es un fragmento que es más grande que el fragmento de integración amplificado. Se pueden incluir otros controles según el tipo de muestra a analizar. Los protocolos de PCR estándar se describen en el arte, tal como en "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Bio-chemicals, 2* Edición, 1999). Las condiciones óptimas para la PCR, incluyendo la secuencia de los cebadores específicos, se especifican en un "protocolo de identificación por PCR" para cada evento de élite. Se debe tener en cuenta, no obstante, que tal vez sea necesario ajusfar la cantidad de parámetros en el protocolo de identificación por PCR a las condiciones específicas del laboratorio y se pueden modificar ligeramente con el fin de obtener resultados similares. Por ejemplo, para usar un método diferente para preparar el ADN tal vez sea necesario ajustar la cantidad de cebadores, polimerasa y condiciones de alineamiento utilizadas. De manera similar, la selección de otros cebadores puede implicar el uso de otras condiciones óptimas para el protocolo de identificación por PCR. Estos ajustes serán, sin embargo, evidentes para el especialista en el arte y se describen con mayor detalle en los manuales de aplicación de PCR actuales, tal como el citado previamente. Como alternativa, se pueden usar cebadores específicos para amplificar un fragmento de integración que se pueda utilizar como "sonda específica" en la identificación del EE-GH1 en muestras biológicas. El contacto del ácido nucleico de una muestra biológica con la sonda, bajo condiciones que permiten la hibridación de la sonda con su correspondiente fragmento en el ácido nucleico, da como resultado la formación de un híbrido de ácido nucleico/sonda. Se puede detectar la formación de este híbrido (por ejemplo, marcando el ácido nucleico o la sonda), con lo cual la formación de dicho híbrido es indicativa de la presencia del EE-GH1. Dichos métodos de identificación basados en la hibridación con una sonda específica (ya sea sobre un transportador en fase sólida o en solución) están descritos en el arte. La sonda específica es preferentemente una secuencia que se hibridiza específicamente, bajo condiciones óptimas, con una región que comprende parte de la región flanqueadora 5' o 3' del evento de élite y que también comprende parte del ADN extraño contiguo del mismo (de aquí en adelante, también denominado "región específica" del evento). Según el método usado, dicha sonda específica puede comprender una secuencia de entre 15 y 30 bp o de entre 50 y 500 bp, con preferencia entre 100 y 350 bp que se hibridiza, bajo condiciones severas, con la secuencia de nucleótidos (o el complemento de dicha secuencia) de una región específica. Preferentemente, la sonda específica comprenderá una secuencia de entre 15 y 100 nucleótidos contiguos idénticos (o complementarios) de una región específica del evento de élite. Más preferentemente dicha sonda comprende por lo menos 9 nucleótidos idénticos (o complementarios) de la región flanqueadora 3' o 5' y una cantidad de nucleótidos similar en el ADN extraño contiguo de la misma.

Más preferentemente, dicha sonda comprende por lo menos 9 nucleotidos idénticos (o complementarios) de la región flanqueadora 3' o 5' y una cantidad de nucleotidos similar en el ADN extraño contiguo de la misma de la SEQ ID No. 1 o la SEQ ID No. 4. Un "mapa de restricción", tal como se utiliza aquí, se refiere a un conjunto de patrones de transferencia Southern obtenidos después de clivar el ADN genómico vegetal (y/o el ADN extraño conteñido en el mismo) con una enzima de restricción particular o un conjunto de enzimas de restricción y de hibridación con una sonda que comparte similitud de secuencia con el ADN extraño bajo condiciones severas estándar. Las condiciones severas estándar, tal como se mencionan aquí, se refieren a las condiciones de hibridación descritas aquí o a las condiciones de hibridación convencionales descritas por Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que puede comprender, p. ej., los siguientes pasos: 1 ) inmovilizar fragmentos de ADN genómico vegetal sobre un filtro, 2) prehibridizar el filtro durante 1 a 2 horas a 42°C en formamida 50%, SSP 5 X, reactivo de Denhardt 2 X y SDS 0.1 % o durante 1 a 2 horas a 68°C en SSC 6 X, reactivo de Denhardt 2 X y SDS 0.1 %, 3) agregar la sonda de hibridación que ha sido marcada, 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro durante 20 min. a temperatura ambiente en SSC 1X, SSD 0.1 % 6) lavar el filtro tres veces durante 20 min. Por vez a 60°C en SSC 0.2 X, SDS 0.1 % y 7) exponer el filtro durante 24 a 48 horas a una película de rayos X a -70°C con una pantalla intensificadora.

Debido a la presencia de sitios de restricción (endógenos) en el genoma de la planta antes de incorporar el ADN extraño, la inserción de dicho ADN extraño alterará el mapa de restricción específico de dicho genoma. Por consiguiente, es posible identificar un transformante particular, o la progenie derivada del mismo, utilizando uno o varios patrones de restricción específicos. Como alternativa, es posible identificar plantas o material vegetal que comprenden un evento de élite mediante una prueba acorde con el protocolo de identificación por PCR. Esta es por PCR que reconoce específicamente el evento de élite. Esencialmente, se desarrolla un conjunto de cebadores para PCR que reconoce a) una secuencia dentro de la secuencia flanqueadora 3' o 5' del evento de élite y b) una secuencia dentro del ADN extraño, donde dichos cebadores amplifican un fragmento (fragmento de integración) que comprende, como preferencia, entere 100 y 300 nucleótidos. Preferiblemente, se incluye un control compuesto de un conjunto de cebadores que amplifican un fragmento perteneciente a un gen de mantenimiento de dicha especie vegetal (preferentemente un fragmento mayor que el fragmento de integración amplificado). Las condiciones óptimas para la PCR, incluyendo la secuencia de los cebadores específicos, están especificadas en el protocolo de identificación por PCR. También se consideran otros métodos para identificar plantas, material vegetal que contiene el evento de élite EE-GH1. Estos métodos incluyen todos los métodos basados en la detección de la secuencia de ADN extraño y de la o las secuencias flanqueadoras de evento de élite con una sonda específica. Más particularmente, se prevé el uso de tecnologías basadas en chips, tal como los que describen Hacia et al. 1996 (Nat Genet 14(4): 441 -447) y Shoemaker et al. 1996 (Nat Genet 14(4): 450-456). Estos métodos permiten la segregación de las moléculas blanco como ordenamientos de alta densidad mediante el uso de ordenamientos fijos de sondas o de la marcación de los genes con oligonucleótidos, después de lo cual pueden ser examinados por hibridación. Como alternativa, se pueden emplear los métodos de detección de Third Wave Technologies, tal como los que describen Lyamichev et al. (1999, supra). La identificación de la o las proteínas codificadas por el ADN extraño del evento de élite se puede llevar a cabo utilizando los métodos clásicos de detección de proteínas que se describen en el arte, tal como los que se basan en las propiedades cromatográficas o electromagnéticas de la proteína, o la detección utilizando anticuerpos monoclonales específicos (como se describe en "Guide to protein purification, Murray P. Deutscher, editor"). Un "juego de elementos", tal como se utiliza aquí se refiere a un conjunto de reactivos destinados al método de la invención, más particularmente, la identificación del evento de élite EE-GH1- e muestras biológicas. En particular, una modalidad preferida del juego de elementos de la invención comprende por lo menos uno o dos cebadores específicos, descritos previamente. Optativamente, el juego de elementos puede comprender además cualquier otro reactivo que se describa aquí en el protocolo de identificación por PCR. Como alternativa, de acuerdo con otra modalidad de esta invención, el juego de elementos puede comprender una sonda específica, descrita previamente, que se hibridiza específicamente con el ácido nucleico de muestras biológicas con el fin de identificar la presencia del EE-GH1 en las mismas. Optativamente, el juego de elementos puede comprender además cualquier otro reactivo (tal como, pero sin limitaciones, soluciones amortiguadoras de hibridación, marcas) para identificar el EE-GH1 en muestras biológicas, utilizando para ello la sonda específica. El juego de elementos de la invención se puede utilizar, y los componentes del mismo se pueden ajusfar específicamente, a los efectos del control de calidad (por ejemplo, la pureza de lotes de semillas), de la detección del evento de élite en material vegetal o material que comprende o deriva de material vegetal, tal como pero sin limitaciones alimentos o productos alimentarios. La presente invención se relaciona con el desarrollo de un evento de élite en algodón, EE-GH1 , con las plantas que comprenden este evento, con la progenie obtenida de estas plantas y con las células vegetales o el material vegetal derivado de este evento. Las plantas que comprenden el evento de élite EE-GH1 se obtuvieron por transformación con el pGSV71 como se describe en el ejemplo 1. Las plantas de algodón o el material vegetal que comprende el EE-GH1 se puede identificar de acuerdo con el protocolo de identificación por PCR que se describe aquí para EE-GH1 en el ejemplo 4. Brevemente, se amplifica ADN genómico de algodón por PCR usando un cebador que reconoce específicamente una secuencia perteneciente a la secuencia flanqueadora 5' o 3' del EE-GH1 , en particular un cebador con la secuencia de la SEQ ID N°: 2, y un cebador capaz de reconocer una secuencia en el ADN extraño, en particular un cebador con la secuencia de la SEQ ID N°: 3. Se utilizan cebadores de ADN endógeno de algodón como controles. Si el material vegetal permite obtener un fragmento que comprende entre 250 y 290 bp, con preferencia de 269 bp aproximadamente, se determinan que la planta de algodón contiene al evento de élite EE-GH1. Las plantas que contienen al EE-GH1 se caracterizan por su tolerancia a glufosinato, que en el contexto de la presente invención incluye las plantas que son tolerantes al herbicida Liberty™. La tolerancia a Liberty™ se puede evaluar de diferentes maneras. El método de pintar las hojas que se describe aquí es el método de mayor utilidad cuando se desea identificar plantas tanto resistentes como sensibles pero no se desea matar las que son sensibles. Como alternativa, es posible evaluar la tolerancia mediante una aplicación por rociado de Liberty™. Los tratamientos con rociado se debe r3alizar entre las etapas foliares V3 y V4 para obtener los mejores resultados. Las plantas tolerantes se caracterizan por el hecho de que el rociado de las plantas con por lo menos 200 gramos de ingrediente activo/hectárea (g.k.a./ha), preferentemente 400 g.i.a./ha y posiblemente hasta 1600 g.i.a./ha (4X la dosis normal a campo), no mata las plantas. Se debe utilizar una aplicación a voleo con una dosis de 28-37 02 de Liberty . Es mejor la aplicación de un volumen de 20 galones de agua por acre con una tobera de tipo abanico plano y tomando la precaución de no dirigir las aplicaciones directamente al verticilo de las plantas con el fin evitar que el tensioactivo queme las hojas. El efecto del herbicida se deberá observar dentro de las 48 horas y estar claramente visibles dentro de los 5-7 días. Las plantas que contienen el EE-GH1 se pueden caracterizar además por la presencia de sus células de la fosfinotricinacetilo transferasa determinado con el ensayo PAT (De Block et al, 1987, supra). Las plantas que contienen el EE-GH1 se pueden obtener, por ejemplo, a partir de las semillas depositadas en ATTC con el número de acceso PTA-3343, que contienen un 50% de granos hemicigotas para el evento de élite. Dichas plantas se pueden propagar con el fin de introducir el evento de élite de la invención en otros cultivares de la misma especie vegetal. Semillas seleccionadas obtenidas de estas plantas contienen el evento de élite incorporado de forma estable en el genoma de la misma. La invención se relaciona además con plantas derivadas del ATCC número de acceso PTA-334, que contienen al evento EE-GH1. El término "derivado de" indica aquí que las plantas están relacionadas, es decir que son la progenie (directa o de dos o más generaciones) del mismo tranformante obtenida por cruzamiento. Las plantas que contienen el EE-GH1 también poseen características agronómicas comparables a las variedades de algodón disponibles comercialmente en los E.U.A., en ausencia de presión por malezas y del uso de Liberty™ para el control de malezas. Se ha observado que la presencia de un ADN extraño en la región de inserción del genoma de algodón de la planta que aquí se describe, confiera características moleculares y fenotípicas particularmente interesantes a las plantas que contienen al evento. Más específicamente, la presencia del ADN extraño en esta región particular del genoma de estas plantas da como resultado plantas que presentan una Oexpresión fenotípica estable del gen de interés sin comprometer significativamente ninguno de os aspectos de rendimiento agronómico deseados de las plantas. Por consiguiente, se ha demostrado que la región de inserción, correspondiente a una secuencia que comprende el ADN vegetal de la SEQ ID N° 1 y/o de la SEQ ID N°: 4, más particularmente una secuencia correspondiente a la SEQ ID N°: 5, en particular el sitio de inserción del EE-GH1 en la misma es especialmente adecuada para introducir el o los genes de interés. Más particularmente, la región de inserción del EE-GH1 (correspondiente a una secuencia de ADN de por lo menos 40 bp en el genoma de algodón dentro de la SEQ ID NO: 5) o una secuencia de por lo menos 40 bp que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de la SEQ ID N°: 5, es de especial utilidad para introducir el ADN extraño que comprende un gen de tolerancia a herbicidas, asegurando la expresión de cada uno de estos genes en la planta sin comprometer el rendimiento agronómico.

Se puede insertar una molécula de ADN recombinante específicamente en la región de inserción mediante el uso de métodos de inserción direccionados. Dichos métodos son bien conocidos por los especialistas en el arte y comprenden, por ejemplo, una recombinación homologa utilizando una recombinasa tal como, pero sin limitaciones, la FLP recombinasa de Saccharp,uces cerevisiae (solicitud publicada de PCT WO 99/25821 ), la CRE recombinasa del fago P1 de Escherichia coli (solicitud publicada de PCT WO 99/25840), la recombinasa del pSR1 de Saccharomyces rouxii (Araki et al. 1985, J Mol Biol 182: 191-203), el sistema de fagos Mu Gin/gix (Maeser y Klahmann, 1991 , Mol Gen Genetics 230: 170-176) o el sistema de recombinación de fagos lambda (tal como el que se describe en la Patente de EE.UU. No: 4.673.640). Tal como se utiliza aquí, la "identidad de secuencia" con respecto a secuencias de nucleótidos (ADN o ARN), se refiere a la cantidad de posiciones con nucleótidos idénticos dividido por la cantidad de nucleótidos de la más corta de las dos secuencias. La alineación de las dos secuencias de nucleótidos se efectúa con el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmann, 1983, Proc Nat Acad Sci EE.UU. 80: 726) usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una restricción para la falta de coincidencia de 4. El análisis asistido por ordenador y la interpretación de los datos de secuencia, incluyendo la alineación de secuencia mencionada, se puede llevar a cabo convenientemente utilizando, por ejemplo, los programas del Paquete de Wisonsin (de Genetics Computer Group, Inc). Las secuencias son "esencialmente similares" cuando dichas secuencias tienen una identidad de secuencia de por lo menos un 75% aproximadamente, en particular de por lo menos un 80% aproximadamente, más particularmente de por lo menos un 85% aproximadamente, más particularmente aún de un 90% aproximadamente, en especial de un 95% aproximadamente, más especialmente del 100% aproximadamente, en especial cuando son idénticas. Resulta claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o que tienen un cierto grado de identidad de secuencia con las secuencias de ADN, se considera que la tímida (T) en la secuencia de ADN es igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. El término "complementario de", tal como se utiliza aquí, se refiere a la complementariedad entre los nucleótidos A y T (U) y G y C en las secuencias de nucleótidos. Tal como se utiliza aquí, una "muestra biológica" es una muestra de una planta, material vegetal o de productos que comprenden un material vegetal. El término "planta" abarca tejidos de plantas de algodón (tal como, pero sin limitaciones, Gossypium hirsutum), en cualquier etapa de madurez, así como cualquier célula, tejido u órgano tomado o derivado de cualquier de dichas plantas, incluyendo, sin limitaciones, todas las semillas, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametas, cultivos de células, cultivos de tejidos o protoplastos. El "material vegetal", tal como se utiliza aquí, se refiere a un material obtenido o derivado de una planta. Los productos que comprenden un material vegetal se relacionan con alimentos, productos alimentarios u otros productos que son producidos utilizando un material vegetal o que pueden ser contaminados por un material vegetal. Se debe tener en cuenta que, en el contexto de la presente invención, en dichas muestras biológicas se examina preferentemente la presencia de los ácidos nucleicos específicos del EE-GH1 , que sugiere la presencia de ácidos nucleicos en las muestras. Por consiguiente los métodos aquí descritos para identificar el evento de élite EE-GH1 en muestras biológicas, se relacionan preferentemente con la identificación en dichas muestras biológicas de ácidos nucleicos que comprenden el evento de élite. Tal como se utiliza aquí, el término "que comprende" especifica la presencia de las características, números enteros, pasos o componentes a las cuales hace referencia, pero no descarta la presencia o adición de una o varias características, números enteros, pasos o componentes, o grupos de los mismos. Por consiguiente, por ejemplo, un ácido nucleico o una proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que las mencionadas específicamente, es decir, puede estar embebido en un ácido nucleico o una proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ADN que se ha definido funcional o estructuralmente, puede comprender secuencias de ADN adicionales, etc. Los siguientes ejemplos describen el desarrollo y las características de plantas de algodón que contienen eventos de élite EE-GH1 , así como el desarrollo de herramientas para la identificación del evento de élite EE-GH1 en muestras biológicas. A menos que se indique lo contrario, todas las técnicas de ADN recombinante se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos estándar que se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Cúrrente Protocols, EEUU. Los materiales y métodos estándar para el trabajo con moléculas vegetales se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. En la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias: SEQ ID No. 1 : secuencia que comprende la región flanqueadora 5' SEQ ID No: 2: cebador GH106 SEQ ID No: 3: cebador GHI05 SEQ ID No. 4: secuencia que comprende la región flanqueadora 3' SEQ ID No: 5: región de inserción SEQ ID No: 6: plásmido pGSV71 SEQ ID No: 7: plásmido pRVA44 SEQ ID No: 8: cebador MDB327 SEQ ID No: 9: cebador MLD015 SEQ ID No: 10: cebador MLD016 SEQ ID No: 11 : cebador MDB612 SEQ ID No: 12: cebador MDB053 SEQ ID No: 13: cebador MDB356 SEQ ID No: 14: cebador DPA017 SEQ ID No: 15: cebador MLD019 SEQ ID No: 16: secuencia que comprende la supresión del sitio blanco SEQ ID No: 17: cebador GHI01 SEQ ID No: 18: cebador GHI02 EJEMPLOS EJEMPL0 1 Transformación de algodón con un gen de tolerancia a herbicidas 1.1. Construcción del ADN quimérico que comprende al gen bar bajo el control de un promotor constitutivo se construyó el plásmido pGSV71 utilizando los procedimientos estándar. La secuencia de los elementos genéticos del plásmido pGSV71 se muestran en la tabla 1 (SEQ ID No: 6): CUADRO 1 Posiciones de los nucleotidos de los elementos genéticos en el pGSV71 1.2. Transformación de Gossypium hirsutum se transformó tejido de algodón de plantas CoKer312 con el pGSV71 usando la técnica de transformación con Agrobacterium (Patente de EE.UU. No: 5.986.181 ). y se regeneró en plantas sobre los medios apropiados. Las pequeñas plántulas iniciadas sobre los medios de regeneración selectivos fueron transferidas a medio nuevo para su germinación (todos los medios están libres de hormonas). Las plántulas fueron transferidas luego a cámaras de crecimiento o a invernadero. La selección se realizó sobre fosfinotricina (PPT) en todas las etapas excepto la regeneración de plántulas, que se efectuó en ausencia de PPT con el fin de acelerar el crecimiento. Esto dio como resultado un conjunto de transformantes primarios (plantas de la generación TO).

EJEMPLO 2 Desarrollo de los eventos 2.1. Desarrollo de líneas que presentan la característica del evento Se transfirieron brotes TO a tierra en invernadero y las plantas fueron examinadas por su tolerancia a glufosinato y por la presencia de la enzima PAT con un ensayo ELIS PAT(Steffens Biotechnishe Analysen GmbH, Ebringen, Alemania). Las plantas T1 y T3 se cultivaron en invernadero y fueron evaluadas por su tolerancia a Liberty™ a una dosis de 2x (mediante rociado de 56 oz/ha). En las plantas positivas se evaluó la expresión del gen bar usando el ensayo Pat descrito por Deblock et al. 1987 (EMBO J. 6: 2513-2518). La presencia del ADN extraño y la cantidad de copias se verificó mediante análisis por transferencia Southern. Se aisló ADN genómico total a partir de 1g de tejido foliar de acuerdo con el método CETAB de Doile et al. (1987, Phytochem. Bull. 19:1 1 ) y se dirigió con la enzima de restricción EcoRI. Se utilizaron sondas como las que se describen a continuación para el análisis Southern: Sonda "bar": digestión con Kpnl-Bgll de 474 bp del plásmido pDE1 0 (WO 92/09696) Sonda "35S": digestión con Ncol-Munl de 892 bp del plásmido pRVA44 (SEQ ID NO: 7) En las plantas T2 también se evaluaron las características fenotípicas generales en comparación con líneas isogénicas no transgénicas. En generaciones posteriores, se seleccionaron las líneas en las cuales no se observaron restricciones negativas sobre el fenotipo o el rendimiento agronómico examinadas por la presencia del transgén, ya sea en estado hemicigota u homocigota, en comparación con el tipo silvestre. El material T4 se cultivó a campo y se evaluó con diferentes programas por su tolerancia a Liberty™ bajo condiciones de campo. En generaciones posteriores, las plantas se compararon con las variedades comerciales por el rendimiento, calidad de fibras y datos de mapeo de las plantas. Se evaluaron las características agronómicas, tal como altura de las plantas, altura hasta el nodo, retención de cápsulas, capacidad de mantenerse en pie, vigor, longitud de fibras, resistencia de fibras y rendimiento de fibras.

Se determinó que un evento presentaba un rendimiento igual o mejor que los controles comparables y que para este evento el rendimiento dependía de los antecedentes antes que la presencia del transgén. 2.2. Selección de un evento de élite Este procedimiento de selección permitió obtener un evento de élite que presentaba una expresión óptima del gen 35S-bar, es decir tolerancia al glufosinato de amonio, sin restricciones en el rendimiento agronómico ni en el rendimiento general. Este evento de élite se denominó EE-GHI. 2.3. Evaluación del EE-GH1 en variedades de algodón con diferentes antecedentes genéticos y en diferentes ubicaciones El evento seleccionado se introdujo en diferentes antecedentes genéticos comerciales, incluyendo FM989, FM 832, FM958 y FM966 y se compararon los resultados de las pruebas de campo de cuatro ubicaciones diferentes. Las plantas se rociaron con 1600 g.i.a./ha, usando diferentes tratamientos (1x etapa de 3-5 hojas, 4x, etapa de 3-5 hojas, 1x+1x, etapa de 3-5 hojas, 4x+4x, etapa de 3-5 hojas, 0 como control). Las calificaciones de emergencia de plantines y vigor para el evento de élite eran muy buenas. Nunca se observaron daños visibles como resultado de la aplicación del herbicida después del tratamiento independientemente de la dosis o la etapa del desarrollo en el momento de la aplicación. No se observaron efectos nocivos sobre la morfología o los hábitos de crecimiento e las plantas debidos a la aplicación del herbecida. Aún más, el evento presentaba una morfología de hojas, flores y cápsulas normales, una excelente fertilidad y no mostraba susceptibilidad anormal a insectos o a enfermedades en múltiples antecedentes genéticos. Durante la introducción en múltiples antecedentes genéticos no se observaron problemas o anomalías aberrantes en cuatro generaciones. 2.4. Análisis genético del locus Se comprobó la estabilidad genética del inserto para el evento EE-GH1 mediante análisis molecular y fenotípica en las plantas de la progenie sobre varias generaciones. Se compraron los análisis de transferencia Southern de plantas de las generaciones T1 , T2, y T3 para el evento EE-GH1. Se encontró que los patrones obtenidos eran idénticos en las diferentes generaciones. Esto prueba el hecho que la configuración molecular del ADN extraño en el EE-GH1 era estable. El evento EE-GH1 presentaba una segregación mendeliana para el transgén como un locus genético individual en por lo menos tres generaciones sucesivas indicativo de la estabilidad del inserto.

EJEMPLO 3 Caracterización del evento de élite EE-GH1 3.1 Análisis molecular y genético en profundidad del locus Una vez identificado el evento como un evento con el cual la expresión del transgén, así como el rendimiento agronómico general, era óptima, se analizó con detalle el locus del transgén a nivel molecular. Esto incluyó la secuenciación de las regiones flanqueadoras del trasngen. La secuencia de las regiones que flanquean el transgén insertado en el evento EE-GHI se determinó utilizando el protocolo de PCR-TAIL [PCR-COLA] descrito por Liu er a/. (1995, Plant J. 8(3): 457-463). a) Determinación de la región flanqueadora 5' Los cebadores utilizados fueron: Donde N = A, C, T o g; S = C o g; w = A o T El fragmento que se amplificó usando MDB327-GHI05 era de aproximadamente 1200 bp y luego se secuenció (extremo 5': SEQ ID NO: 1 ).

La secuencia entre el bp 1 y el bp 677 comprendía ADN vegetal, en tanto la secuencia entre el bp 678 y el bp 850 correspondía al ADN del pGSV71. b) Determinación de la región flanqueadora 3' Los cebadores utilizados fueron: Donde: N = A, C, T o g; S = C o g; W = A o T El fragmento se amplificó usando MDB612-DPA017 era de aproximadamente 400 bp, y se determinó la secuencia completa de la misma (SEQ ID No.: 4). La secuencia entre los nucleótidos 1 y 179 corresponden al ADN-T, en tanto la secuencia entre los nucleótidos 180 y 426 corresponde al ADN vegetal. c) Identificación de la supresión del sitio blanco Se identificó el sitio de inserción del transgén utilizando los cebadores correspondientes a secuencias de las regiones fianqueadoras del transgén sobre Gossypium hirsutum de tipo silvestre como templado. Se utilizaron los siguientes cebadores: Secuencia (5' ? 3') Posición en Posición en el el extremo extremo 3' 51 (SEQ ID (SEQ ID No.: No.: 1) 4) GHI06 TTg.CAC.CAT.CTA.gCT.CAC.TC 815 ? 795 (SEQ ID NO: 2) MLD019 CAA.gAT.gCg.AgC.AAC.TAT.Gt 285 ? 266 (SEQ ID NO: 15) Esto permitió obtener un fragmento de 200 bp (SEQ ID No. en el cual los bp 85 a 122 corresponden a una supresión del sitio blanco. Por consiguiente, la región de inserción (SEQ ID No secuenciada comprende: 1 -677: Región flanqueadora 5' bp 1 a 677 de la SEQ ID No: 1 678-714: Supresión del sitio blanco bp 85 a 122 de la SEQ ID No: 16 715-916 Región blanqueadora 3' bp 180 a 426 de la SEQ ID No: 4 3.2 Análisis genético del locus Se comprobó la estabilidad genética del inserto mediante análisis molecular y fenotípico en plantas de la progenie de varias generaciones.

Se compararon los análisis Southern de plantas tolerantes a glufosinato entre plantas de algodón EE-GH1 de las generaciones T0, Ti y T2 y se encontró que eran idénticos. Esto prueba que la configuración molecular del transgén en las plantas que contenían EE-GH1 era estable. El evento EE-GH1 presentaba una segregación mendeliana para el transgén como un locus genético individual en por lo menos tres generaciones sucesivas, lo cual indica que el inserto es estable.

Sobre la base de los resultados anteriores el EE-GH1 se identificó como un evento de élite.

EJEMPLO 4 Desarrollo de herramientas de diagnóstico para controlar la identidad Se desarrolló un protocolo de identificación por PCR para el evento de élite EE-GH1 con el fin de identificar la presencia del EE-GH1 en plantas, material vegetal o muestras biológicas.

Protocolo de identificación por reacción en cadena de la polimeraza del evento de élite EE-GH1 Se tuvo que realizar una corrida de prueba, con todos los controles apropiados, antes de intentar el examen de los desconocidos. Es posible que el protocolo presentado requiera alguna optimización debido a diferencias entre los laboratorios de los componentes (preparación del ADN templado, ADN Taq polimerasa, calidad de los cebadores, dNTP, termociclador, etc.). La amplificación de la secuencia endógena cumple una función clave en el protocolo. Es necesario alcanzar las condiciones de PCR y termociclado que permiten amplificar cantidades equimolares de la secuencia endógena y transgénica en un templado de ADN genómico transgénico conocido. Si no se amplifica el fragmento endógeno buscado o si no se amplifican las secuencias buscadas con las mismas intensidades de coloración con bromuro de etidio, a juzgar por electroforesis sobre gel de agarosa, es necesario efectuar una optimización de las condiciones de la PCR.

ADN templado El ADN templado se preparó de acuerdo con el método CTAB descrito por Doyle y Doyle (1987, Phytochem. Bull. 19:1 1 ). Cuando se utiliza ADN preparado con otros métodos, se recomienda efectuar una corrida de prueba utilizando distintas cantidades de templado. Los mejores resultados se obtienen habitualmente con 50 ng de templado de ADN genómico.

Controles positivos v negativos asignados En la corrida de PCR se recomienda incluir los siguientes controles positivos y negativos: - Control Master Mix (control de ADN negativo). Esta es una PCR en la cual no se añade ADN a la reacción. Cuando se observa el resultado esperado, es decir, ningún producto de la PCR, es indicativo que el cóctel de la PCR no estaba contaminado con el ADN blanco. - Un control de ADN positivo (una muestra de ADN genómico conocida por contener las secuencias transgénicas). La amplificación exitosa de este control positivo demuestra que la PCR se corrió bajo condiciones que permiten amplificar las secuencias blanco.

- Un control de ADN de tipo silvestre. Esta es una PCR en la cual el ADN templado provisto es ADN genómico preparado a partir de una planta no transgénica. Cuando se observa el resultado esperado, es decir, ninguna amplificación del producto de PCR del transgén sino amplificación del producto de PCR endógeno, es indicativo que no hay una amplificación basal detectable del transgén en la muestra de ADN genómico.

Cebadores Se utilizaron los siguientes cebadores, que reconocen específicamente al transgén y a la secuencia flanqueadora de EE-GH1 : En el cóctel de la PCR siempre se incluyen cebadores para la secuencia endógena. Esos cebadores sirven como un control interno en las muestras desconocidas y en el control de ADN positivo. Un resultado positivo con el par de cebadores endógenos demuestra que hay suficiente ADN de la calidad adecuada en la preparación de ADN genómico para el producto de PCR a generar. Los cebadores endógenos utilizados son: GHI01 ; 5'-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3' (SEQ ID NO: 17) (gen de la alcohol deshidrogenasa, N° Acc: AF036569, 1515?1495) Fragmentos amplificados Los fragmentos amplificados esperados de la reacción de PCR son: Para el par de cebadores GHI01-GHI02: 445 bp (control endógeno) Para el par de cebadores GHI05-GHI06: 269 bp (evento de élite EE-GH1 ) Condiciones de la PCR La mezcla para la PCR para reacciones de 50 µ? contiene los siguientes elementos: 5 µ? de ADN templado 5 µ? de solución amortiguadora para amplificación 10x (suministrada con la Taq polimerasa) 1 µ? de dNTP 10 mM 0.5 µ? de GHI01 ( 0 pmoles/µ?) 0.5 µ? GHI02 (10 pmoles/µ?) 1 µ? GHI05 (10 pmoles^l) 1 µ? GHI06 (10 pmoles/µ?) 0.2 µ? de ADN Taq polimerasa (5 unidades/µ?) agua hasta completar 50 µ? El perfil del termociclado para obtener resultados óptimos es como sigue: 4 min a 95°C Seguido de: 1 min a 95°C 1 min a 57°C 2 min a 72°C durante 5 ciclos Seguido de: 30 seg a 92°C 30 seg a 57°C 1 min a 72°C Durante 25 ciclos Seguido de: 5 minutos a 72°C Análisis sobre gel de aqarosa Se debe aplicar entre 10 y 20µ? de las muestras para PCR sobre un gel de agarosa 1.5% (solución amortiguadora de Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo, el marcador de 100 bp de PHARMACIA).

Validación de los resultados Los datos de las muestras de ADN de las plantas transgénicas de una sola corrida de PCR y con un solo cóctel de PCR no son aceptables a menos que 1 ) el control de ADN positivo permite obtener los productos esperados de la (fragmentos transgénicos y endógenos), 2) el control de ADN negativo sea negativo para la amplificación por PCR (ningún fragmento) y 3) el control de ADN de tipo silvestre permite obtener el resultado esperado (amplificación del fragmento endógeno). Las calles o líneas que muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgénicos y endógenos de los tamaños esperados, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN genómico templado ha heredado el evento de élite EE-GH1. Las calles que no muestran cantidades visibles del producto de PCR transgénico y que muestran cantidades visibles del producto de PCR transgénico y que muestran cantidades visibles del producto de PCR endógeno, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN genómico templado, no comprende al evento de élite. Las calles que no muestran cantidades visibles de los productos de PCR endógenos y transgénicos, indican que la calidad y/o cantidad de ADN genómico no permitió generar un producto con la PCR. Estas plantas no se pueden calificar. Se debe repetir la preparación de ADN genómico y levar a cabo una nueva corrida de PCR utilizando los controles apropiados.

Uso de un protocolo de PCR discriminatorio para identificar el EE-GH1 Se evaluó material de hojas de algodón proveniente de plantas que comprendían diferentes eventos transgénicos (muestras 1 a 4) de acuerdo con el protocolo descrito previamente. Se tomaron muestras de algodón de tipo silvestre como controles negativos. Los resultados de los análisis por PCR se ilustran en la figura . Se reconoce que la muestra 1 comprende el evento de élite EE-GH1. Las demás líneas evaluadas no comprenden este evento de élite.

EJEMPLO 5 Introducción del EE-GH1 en cultivares preferidos El evento de élite EE-GH1 se introdujo mediante repetidas retrocruzas en los siguientes cultivares de algodón comerciales: FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 y FM958. Se observó que la introducción del evento de élite en estos cultivares no afecta significativamente ninguna de las características fenotípicas o agronómicas de estos cultivares (no hay arrastre por ligamiento), en tanto la expresión del transgén, determinada por la tolerancia a glufosinato, cumple con los niveles aceptables para uso comercial. Esto confirma el estado del evento EE-GH1 como un evento de élite. Tal como se utiliza más adelante e/i las reivindicaciones, y a menos que se indique claramente lo contrario, el término "planta" abarca tejidos vegetales, en cualquier etapa de madurez, así como cualquier célula, tejido u órgano tomado o derivado de cualquiera de dichas plantas incluyendo, pero sin limitaciones, toda las semillas, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametas, cultivos de células, cultivos de tejidos o protoplastos. Las semillas de referencia que comprenden el evento de élite EE-GH1 se depositaron como EE-GH1 en ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) el 26 de abril, 2001 , con el número de acceso ATCC, PTA-3343. En las siguientes reivindicaciones, y a menos que se indique claramente lo contrario, el término "planta" abarca tejidos vegetales, en cualquier etapa de madurez, así como cualquier célula, tejido u órgano tomado o derivado de cualquiera de dichas plantas incluyendo, pero sin limitaciones, todas las semillas, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametas, cultivos de células, cultivos de tejidos o protoplastos. Esta descripción de la invención solamente se ofrece a modo ilustrativo y no limitante de la misma. Los especialistas en el arte comprenderán que es posible efectuar numerosos cambios modificaciones en las modalidades descritas. Dichos cambios o modificaciones en las modalidades descritas. Dichos cambios y modificaciones se pueden efectuar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Aventis CropScience N.V. <120> PLANTAS DE ALGODON TOLERANTES A HERBICIDAS Y METODOS PARA PRODUCIR E IDENTIFICAR LAS MISMAS <130 EE-GH1 <150> US 09/921,922 <151> 2001-08-06 <160> 18 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 850 <212> ADN <213> Artificial: secuencia que comprende la región flangueadora 5' <400> i aaaggggatg agattgaatg ttaccttatc aacaaaagga gttgtagctc atggaacaac 60 aatagtcttt tccacggaaa cctagatgat gtttctccaa tgcttgataa atctttaaca 120 ttgtcatcat aagttgcaac ctcatgtttc acacaagcat caatcaaatg ttgatcttca 180 ttactaaaat gtgcttgatc cttccttaca caaatctacc tatgttgtgg tattttgttc 240 tattcatcat tctaacaagt tttgcaattg agttgaactt cttccaatct cgtatcagcc 300 tataatagtg gggtctaata tgtccatttt tcccacaata atgacatata atctttctaa 360 agcttttatt ctctgcctta tgatgaaaag aacccaaatc tttaacttta acaaaaataa 420 gatgagcgat aggttcttca cctttattga tgtaaccaag tcctctatgg catggttcaa 480 ttctcattga agccaaaatt tcatgaaact tctcacattg gcctctaaac ttcttcaaga 540 tagcctttgc accatctagc 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tcttagtatt agcacattct aattttaagt gaaacaatcc cttacattca taacattgaa tatccttcta tcatctcaca gcacga <210> 5 <211> 961 <212> ADN <213> Gossypium hirsutum: región de inserción <400> 5 aaaggggatg agattgaatg ttaccttatc aacaaaagga gttgtagctc atggaacaac aatagtcttt tccacggaaa cctagatgat gtttctccaa tgcttgataa atctttaaca ttgtcatcat aagttgcaac ctcatgtttc acacaagcat caatcaaatg ttgatcttca ttactaaaat gtgcttgatc cttccttaca caaatctacc tatgttgtgg tattttgttc tattcatcat tctaacaagt tttgcaattg agttgaactt cttccaatct cgtatcagcc 300 tataatagtg gggtctaata tgtccatttt tcccacaata atgacatata atctttctaa 360 agcttttatt ctctgcctta tgatgaaaag aacccaaatc tttaacttta acaaaaataa 420 gatgagcgat aggttcttca cctttattga tgtaaccaag tcctctatgg catggttcaa 480 ttctcattga agccaaaatt tcatgaaact tctcacattg gcctctaaac ttcttcaaga 540 tagcctttgc accatctagc tcactcttgg ttgttttcaa aacatcatcc gtttcttgga 500 ccacaatttt gagcttttca ttttctattt tgaggataat agtttattcc ctcaaggaac 660 tattcaactg agcttaaatc tcaatttttt ttaacatatg actataagta tcctccaaat 720 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gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 8160 tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca 8220 aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 8280 cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg 8340 acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc 8400 gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 8460 gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 8520 ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa 8580 ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 8640 cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 8700 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 8760 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 8820 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 8880 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 8940 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 9000 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 9060 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 9120 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 9180 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 9240 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 9300 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 9360 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 9420 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tccggaaaac gcaagcgcaa agagaaagca 9480 ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag 9540 cgaaccggaa ttgcc 9555 <210> 7 <211> 4182 <212> ADN <213> Artificial: plásmido o pRVA44 <400> 7 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatacctg caggcaattg gtacctacgt atgcatggcg cgccatatgc ccgggccctg 240 tacagcggcc gcgttcctac gcagcaggtc tcatcaagac gatctacccg agtaacaatc 300 tccaggagat caaatacctt cccaagaagg ttaaagatgc agtcaaaaga ttcaggacta 360 attgcatcaa gaacacagag aaagacatat ttctcaagat cagaagtact attccagtat 420 ggacgattca aggcttgctt cataaaccaa ggcaagtaat agagattgga gtctctaaaa 480 aggtagttcc tactgaatct aaggccatgc atggagtcta agattcaaat cgaggatcta 540 acagaactcg ccgtgaagac tggcgaacag ttcatacaga gtcttttacg actcaatgac 600 aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag cacgacactc tggtctactc caaaaatgtc 660 aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag gataatttcg 720 ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcgaaag gacagtagaa 780 aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cattcaagat 840 gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 900 gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc cactgacgta 960 5 agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca 1020 tttcatttgg agaggacacg ctgaaatcac cagtctctct ctataaatct atctctctct 1080 ctataaccat ggacccagaa cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc gaggcggaca 1140 tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc aacttccgta 1200 ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg gagcgctatc 1260 cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg ggcccctgga 1320 ,0w aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc ccccgccacc 1380 agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct gaagtccctg gaggcacagg 1440 gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga cccgagcgtg cgcatgcacg 1500 aggcgctcgg atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag cacgggaact 1560 ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc cgtccggtcc 1620 tgcccgtcac cgagatctga tctcacgcgt ctaggatccg aagcagatcg ttcaaacatt 1680 5 tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 1740 tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 1800 agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 1860 atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 1920 gaagatcctc tagagcgatc gcaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 1980 gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 2040 0 cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 2100 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 2160 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 2220 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 2280 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 2340 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 2400 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 2460 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 2520 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaaag ctcacgctgt aggtatctca 2580 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 2640 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 2700 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 2760 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 2820 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 2880 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 2940 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 3000 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 3060 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 3120 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 3180 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 3240 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcágcaataa ' 3300 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 3360 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 3420 acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 3480 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 3540 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 3600 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 3660 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 3720 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 3780 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactc caag gatcttaccg ctgttgagat 3840 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 3900 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 3960 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 4020 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 4080 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 4140 cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 4182 <210> 8 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial: cebador MDB327 <220> <221> . caract_misc <222> (1) .. (16) <223> "n" = a,c,t o g; "s" = c o <400> 8 ntgaggwtcn wgtsat 16 <210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> .Artificial: cebador MLD015 <400> 9 tggttcctag cgtgagccag tg <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial: cebador MLD016 <400> 10 agctgctgct cttgcctctg t <210> 11 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial: cebador MDB612 <400> 11 ngtgctswga nawgat 16 210> 12 211> 22 212> ' ADN 213> Artificial: cebador MDB053 400> 12 atgacgtgg gtttctggca <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial: cebador DB356 <400> 13 aatcctgttg ccggtcttgc g 21 <210> 14 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial: cebador DPA017 <400> 14 gattagagtc ccgcaattat ac 22 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial: cebador MLD019 <400> 15 caagat'gcga gcaactatgt 20 <210> 16 <211> 200 <212> ADN <213> Artificial: secuencia que comprende la supresión del sitio blanco <210> 17 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial: cebador GHI01 <400> 17 aacctaggct gctgaaggag c 21 <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial: cebador GHI02 <400> 18 caactcctcc agtcatctcc g 21

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. - Una planta de algodón transgénica, o semillas, células o tejidos de la misma, caracterizados porque comprenden el evento EE-GH1 en su genoma.

2. - La planta de algodón transgénica, o semillas, células o tejidos, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizados además porque el ADN genómico de los cuales, cuando se analiza utilizando un protocolo de identificación de eventos de élite para EE-GH1 con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3, respectivamente, produce un fragmento de ADN que comprende entre 250 y 290 bp.

3. - La planta de algodón, o semillas, células o tejidos de la misma, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados además porque dicho fragmento de ADN es un fragmento de 269 bp aproximadamente.

4. - Una planta de algodón, o semillas, células o tejidos de la misma, caracterizados porque se obtuvieron por propagación y/o cría de una planta de algodón cultivada a partir de las semillas depositadas en ATCC con el número de acceso PTA-3343.

5. - Una planta de algodón, o semillas, células o tejidos de la misma, caracterizados porque son la progenie de las semillas depositadas en ATCC con el número de acceso PTA-3343.

6. - Un método para identificar el evento de élite EE-GH1 en muestras biológicas, caracterizado dicho método porque comprende detectar una región específica del EE-GH1 con un cebador o una sonda que reconoce específicamente la región flanqueadora 5' de la SEQ ID NO: 3 o la región flanqueadora 3' de la EQ ID NO: 4 del EE-GH .

7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado dicho método además porque comprende amplificar un fragmento de ADN de entre 100 y 350 bp proveniente de un ácido nucleico presente en dichas muestras biológicas usando la reacción en cadena de la polimerasa con por lo menos dos cebadores, uno de los cuales reconoce la región flanqueadora 5' o 3' de EE-GH1 y el otro reconoce una secuencia del ADN extraño del EE-GH1.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho primer cebador reconoce una secuencia dentro de la región flanqueadora 5' de la SEQ ID NO: 3 y dicho otro cebador reconoce una secuencia dentro del ADN extraño del EE-GH1. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho cebador que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueadora 5' del EE-GH1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2. 10.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado además porque dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN extraño comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1. 1 1.- Un método para identificar el EE-GH1 en una muestra biológica, caracterizado dicho método porque comprende detectar una región específica del EE-GH1 con un cebador o una sonda específica que se hibridiza bajo condiciones severas con una secuencia dentro de la secuencia flanqueadora 5' de la SEQ ID NO: 3 ó dentro de la secuencia flanqueadora 3' de la SEQ ID NO: 4 del EE-GH1. 12. - Un método para identificar una planta transgénica, o células ó tejidos de la misma, que comprende el evento de élite EE-GH1 , caracterizado porque comprende establecer si el ADN genómico se puede usar, de acuerdo con un protocolo de identificación por PCR, para amplificar un fragmento de ADN de entre 250 y 290 bp, utilizando una reacción en cadena de la poiimerasa con dos cebadores que tienen las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y de la SEQ ID NO: 2, respectivamente. 13. - Un juego de elementos para identificar el evento de élite EE-GH1 en muestras biológicas, caracterizado dicho juego porque comprende por lo menos un cebador o sonda para PCR que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueadora 5' de la SEQ ID NO: 3 ó de la región flanqueadora 3' de la SEQ ID NO: 4 correspondientes al EE-GH1. 14.- El juego de elementos de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho al menos un cebador para PCR reconoce una secuencia del ADN vegetal en la SEQ ID NO: 3. 15 - El juego de elementos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho cebador que reconoce una secuencia del ADN vegetal en la SEQ ID NO: 3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. 16. - El juego de elementos de conformidad con las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado además porque comprende adicionalmente por lo menos un segundo cebador o sonda para PCR que reconoce una secuencia del ADN extraño correspondiente al EE-GH1. 17. - El juego de elementos de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho cebador que reconoce una secuencia del ADN extraño del EE-GH1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1. 18.- Un método para confirmar la pureza de semillas, caracterizado dicho método porque comprende detectar una secuencia de ADN específica del EE-GH1 con un cebador o sonda específica que reconoce específicamente una secuencia dentro de la región flanqueadora de 5' de la SEQ ID NO: 3 ó de la región flanqueadora 3' de la SEQ ID NO: 4 del EE-GH1 , en muestras de semillas. 19.- Un método para examinar la presencia del EE-GH1 en semillas, caracterizado dicho método porque comprende detectar una secuencia de ADN específica del EE-GH1 con un cebador o una sonda específica que reconoce específicamente la secuencia de la región flanqueadora 5' de la SEQ ID NO: 3 o la región flanqueadora 3' de la SEQ ID NO: 4 del EE-GH1 , en muestras de lotes de semillas. 20. - Una semilla caracterizada porque está depositada en ATCC con el número de acceso PTA-3343. 21. - Una semilla de algodón que comprende el evento de élite EE-GH1 , caracterizada la semilla de referencia que comprende dicho evento porque ha sido depositada en ATCC con el número de acceso PTA-3343. 22. - Una planta de algodón, células o tejidos o material vegetal de la misma, caracterizados porque comprenden el evento de élite EE-GH1 , derivado de la semilla de la reivindicación 21. 23. - Plantas de algodón transgénicas, semillas, células o tejidos, caracterizadas porque su ADN genómico comprende un transgén integrado al ADN cromosómico en una región que comprende una secuencia de por lo menos 40 bp que se hibridiza bajo condiciones severas con una secuencia que es complementaria de la secuencia de la SEQ ID NO: 5. 24. - Un procedimiento para producir una planta de algodón transgénica, o células o tejidos de una planta de algodón, caracterizado dicho procedimiento porque comprende introducir una molécula de ADN recombinante en una región del ADN cromosómico del algodón correspondiente a una secuencia de por lo menos 40 bp que se hibridiza bajo condiciones severas con una secuencia que es complementaria de la secuencia de ia SEQ ID NO: 5 y, optativamente, regenerar una planta de algodón a partir de las células o tejidos de algodón transformados. 25. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha molécula de ADN recombinante comprende un gen de resistencia a herbicidas. 26. - Una planta o célula o tejido de una planta de algodón, caracterizados además porque se obtienen mediante el procedimiento de las reivindicaciones 24 ó 25. 27. - Una planta de algodón transgénica, o semillas, células o tejidos de la misma, caracterizados porque comprenden: (i) el evento EE-GH1 en su genoma; o (ii) el evento EE-GH1 con la condición que el gen bar utilizado en el evento sea sustituido por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza con el complemento del gen bar bajo condiciones severas. 28. - Una molécula de ADN, caracterizada porque se puede amplificar a partir de una muestra de ácido nucleico de algodón usando un conjunto de cebadores, el primero de los cuales comprende una secuencia que tiene entre 15 y 30 nucleótidos complementarios de una secuencia dentro de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 4, el segundo de los cuales comprende una secuencia complementaria del ADN extraño presente en dicha muestra de ácido nucleico de algodón. 2

9. - La molécula de algodón de ADN de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque se puede amplificar a partir de una muestra de ácido nucleico de algodón, usando un conjunto de cebadores, el primero de los cuales comprende la SEQ ID NO: 2, el segundo de los cuales comprende la SEQ ID NO: 3. 30.- Un juego de elementos para detección, caracterizado porque comprende el ADN de la reivindicación 28 ó 29. 31.- Una molécula de ADN aislada de tejido de algodón, caracterizada porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 ó de la SEQ ID NO: 4. 32.- Una molécula de ADN, caracterizada porque comprende una secuencia que es idéntica o complementaria de una secuencia de 9 nucleótidos del ADN vegetal y del ADN extraño ubicada a cada lado y contigua al sitio de inserción contenido en la SEQ ID NO: 1 ó en la SEQ ID NO: 4.