BRPI0211726B1 - processo para produzir uma planta de algodão ou célula ou tecido ou semente de uma planta de algodão transgênica tolerante a glufosinato compreendendo um evento elite ee-gh1 - Google Patents

Abstract

"plantas de algodão tolerantes a herbicida e métodos para produção e identificação das mesmas". a invenção pertence a plantas de algodão transgênicas, material de planta e sementes, caracterizadas por alojar um evento de transformação específico, particularmente pela presença de um gene codificando uma proteína que confere tolerância a herbicida, em uma localização específica no genoma do algodão. as plantas de algodão da invenção combinam o fenótipo tolerante a herbicida com um desempenho agronômico ideal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE ALGODÃO OU CÉLULA OU TECIDO OU SEMENTE DE UMA PLANTA DE ALGODÃO TRANSGÊNICA TOLERANTE A GLUFOSINATO COMPREENDENDO UM EVENTO ELITE EE-GH1".

Campo da Invenção Esta invenção se refere a plantas de algodão transgênicas, material de planta e sementes, caracterizadas por alojar um evento de transformação específico, particularmente pela presença de um gene codificando uma proteína que confere tolerância a herbicida, em uma localização específica no genoma do algodão. As plantas de algodão da invenção combinam o fenótipo tolerante a herbicida com um desempenho agronômico, estabilidade genética e adaptabilidade a diferentes campos genéticos equivalentes à linhagem de algodão não-transformado na ausência de pressão de erva daninha.

Todos os documentos citados aqui estão por meio deste incorporados aqui por referência.

Fundamento da Invenção A expressão fenotípica de um transgene em uma planta é determinada igualmente pela estrutura do gene em si e pela sua localização no genoma da planta. Ao mesmo tempo a presença do transgene em diferentes localizações no genoma influenciará o fenótipo global da planta de diferentes modos. A introdução agronomicamente ou industrialmente bem-sucedida de uma característica comercialmente interessante em uma planta por manipulação genética pode ser um procedimento longo dependente de diferentes fatores. As transformação e regeneração atuais de plantas geneticamente transformadas são apenas a primeira de uma série de etapas de seleção, as quais incluem caracterização genética extensiva, reprodução, e avaliação das experiências de campo. A fibra de algodão é o único produto têxtil mais importante mundialmente. Cerca de 80 milhões de acres de algodão são colhidos anualmente através do globo. O algodão é a quinta maior colheita nos Estados Unidos em termos de acres de área de produção, com mais de 15 milhões de acres plantados em 2000. Espécies de erva daninha primárias para o algodão são Ipomoea sp. (Ipoméia), Amaranthus spp. (anserina), Cyperus spp. (junça), Xanthium spp. (cardo) e Sorghum spp. (johnsongrass). Antes da introdução de herbicidas de folhas amplas que podem ser empregados em campo de cultivo de algodão, cultivadores empregavam aplicações pós-emergência controladas de herbicidas não-seletivos tomando cuidado para não contactar as plantas da safra em crescimento. Como isto requer uma diferença em altura entre as ervas daninhas e a plantação, isto não é sempre possível. Especialmente para pequenos algodoeiros, esta prática é consumidora de tempo e danifica potencialmente à colheita. O gene bar (Thompson e outros, 1987, EMBO J 6:2519-2523; Deblock e outros, 1987, EMBO J. 6:2513-2518) é um gene codificando a enzima fosfinotricina acetil transferase (PAT), o qual, quando expresso em uma planta, confere resistência aos compostos herbicidas fosfinotricina (também chamados glufosinato) ou bialafos (veja também por exemplo as patentes U.S., 5.646.024 e 5.561.236) e sais e isômeros ópticos destes. Fosfinotricina controla ervas daninhas de folhas amplas incluindo ipoméia e tem uma ampla abertura de aplicação.

Transformação genética bem-sucedida de algodão tem sido obtida por vários métodos incluindo infecção por Agrobacterium de explantes de algodão (Firoozabady e outros, 1987, Plant Molecular Biology 10:105-116; Umbeck e outros 1987, Bio/Technology 5:263-266 e em WO 00/71733, US 5.004.863, e US 5.159.135), bem como transferência direta de gene por bombardeio de microprojétil de tecidos de algodão meristemático (Finer e Mc Mullen, 1990, Plant Cell Reports, 5:586-589; McCabe e Martinell, 1993, Bio/Technology 11:596-598, W092/15675, EPO 531 506). Eficiência de transformação aumentada para transformação por Agrobacterium tem sido relatada empregando-se os métodos descritos por Hansen e outros (1994, Proc. Nat. Acad. Sei. 91: 7603 - 7607), Veluthambi e outros (1989, Journal of Bacteriology 171: 3696 - 3703) e WO 00/71733.

Diferentes métodos para regeneração de plantas de algodão têm sido também descritos (WO 89/05344, US 5.244.802, US 5.583.036, WO 89/12102, WO 98/15622, e WO 97/12512).

Entretanto, os documentos anteriores falham para ensinar ou sugerir a presente invenção.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a uma planta de algodão trans-gênica, ou semente, células ou tecidos destas, compreendendo, estavel-mente integrado em seu genoma, um cassete de expressão o qual compreende um gene de tolerância a herbicida compreendendo a seqüência de codificação do gene bar (tal como descrita no Exemplo 1.1 neste), a qual é tolerante a herbicida e, na ausência de pressão de erva daninha, tem um desempenho agronômico que é substancialmente equivalente à isolina não transgêníca. Sob pressão de erva daninha e o apropriado tratamento com Liberty®, a planta terá um fenótipo agronômico superior comparado à planta não-transgênica.

Em uma modalidade da invenção, a planta ou semente de algodão, células ou tecidos destas, compreende o cassete de expressão de pGSV71 (tal como descrito no Exemplo 1.1, Tabela 1 anexos). Na modalidade preferida da invenção a planta ou semente de algodão, células ou tecidos destas compreendem evento de elite EE-GH1.

Em outra modalidade da invenção, a planta ou semente de algodão transgêníca, células ou tecidos destas, compreende: (i) evento EE-GH1 em seu genoma; ou (ii) evento EE-GH1 com a condição de que o gene bar empregado no evento seja substituído com uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza ao complemento do gene bar sob condições rigorosas.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma planta de algodão transgêníca, semente, células ou tecidos desta, o DNA genômico da qual é caracterizado pelo fato de que, quando analisado em um protocolo de identificação de PCR tal como descrito aqui, empregando-se dois iniciadores direcionados para a região de flanqueamento 5’ ou 3’ de EE-GH1 e o DNA estrangeiro, respectivamente, produz um fragmento que é específico para EE-GH1. De preferência os iniciadores são direcionados contra a região de flanqueamento 5’ na SEQ ID NO: 1 e no DNA estrangeiro respectivamente; mais preferivelmente, os iniciadores compreendem a se-qüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 respectivamente, e produzem um fragmento de DNA de entre 250 e 290 bp, de preferência de cerca de 269 bp.

Semente de referência compreendendo o evento de elite da invenção foi depositada na ATCC sob número de acessão PTA-3343. Dessa forma, uma modalidade preferida da invenção é a semente compreendendo o evento de elite EE-GH1 depositada como número de acessão PTA-3343 da ATTC, a qual desenvolver-se-á em uma planta de algodão resistente ao glufosinato. A semente de depósito ATCC número PTA-3343, que é um lote de semente consistindo em cerca de 50% de sementes não-transgênicas e 50% de sementes transgênicas hemizigotas para o transgene, compreendendo o evento de elite da invenção, que desenvolver-se-á em plantas tolerantes a glufosinato. A semente pode ser semeada e as plantas em crescimento podem ser tratadas com PPT ou Liberty® tal como descrito aqui para obter-se 100% de plantas tolerantes a glufosinato, compreendendo o evento de elite da invenção. A invenção também refere-se a células, tecidos, pro-gênie, e descendentes de uma planta compreendendo o evento de elite da invenção desenvolvida a partir da semente depositada na ATCC tendo número de acesso PTA-3343. A invenção também refere-se a plantas obteníveis por propagação de e /ou reprodução com uma planta de algodão compreendendo o evento de elite da invenção desenvolvido a partir da semente depositada na ATCC tendo número de acesso PTA-3343. A invenção também refere-se a plantas, sementes, células ou tecidos compreendendo uma seqüência de DNA estrangeiro, de preferência um gene de tolerância a herbicida tal como descrito aqui, integrado no DNA cromossômico em uma região que compreende a seqüência de DNA da planta de SEQ ID NO: 1 e /ou SEQ ID NO: 4, mais particularmente que compreende a seqüência de DNA de SEQ ID NO: 5, ou uma seqüência que hibridiza sob condições rigorosas a uma seqüência que é complementar a uma seqüência compreendendo a seqüência de DNA da planta de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 e /ou SEQ ID NO: 5. A invenção também fornece um processo para produção de uma célula transgênica de uma planta de algodão, o qual compreende inserir uma molécula de DNA recombinante em uma região do DNA cromossômico de uma célula, tecido ou calosidade de algodão que compreenda a seqüên-cia de DNA da planta de SEQ ID NO: 1 e /ou SEQ ID NO: 4, ou que compreenda uma seqüência que hibridize sob condições rigorosas a uma se-qüência que é complementar a uma seqüência compreendendo a seqüência de DNA da planta de SEQ ID NO: 1 e /ou SEQ ID NO: 4. A invenção também refere-se a um método para identificação de uma planta transgênica, ou células ou tecidos desta, compreendendo o evento de elite EE-GH1 cujo método é baseado na identificação da presença de seqüências de DNA de caracterização ou aminoácidos codificados por tais seqüências de DNA na planta, células ou tecidos transgênicos. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, tais seqüências de DNA de caracterização são seqüências de 15 bp, de preferência 20 bp, mais preferivelmente 30 bp ou mais as quais compreendem o sítio de inserção do evento, isto é igualmente uma parte do DNA estrangeiro e uma parte do ge-noma do algodão (ou a região de flanqueamento 5’ ou 3’) contíguas com este, permitindo a identificação específica do evento de elite.

De acordo com outro aspecto da invenção, seqüências de DNA são descritas compreendendo o sítio de inserção do evento e suficiente comprimento de polinucleotídeos de ambos o DNA genômico do algodão e o DNA estrangeiro (transgene), a fim de ser útil como iniciador ou sonda para a detecção de EE-GH1. De preferência, tais seqüências compreendem pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico do algodão e um número similar de nucleotídeos do DNA estrangeiro (transgene) de EE-GH1 com estas em cada lado do sítio de inserção respectivamente. Mais preferivelmente, tais seqüências de DNA compreendem pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico do algodão e um número similar de nucleotídeos do DNA estrangeiro contíguos com o sítio de inserção na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.

De acordo com outro aspecto preferido da invenção, o método para identificação de uma planta transgênica, ou células ou tecidos desta, compreendendo o evento de elite EE-GH1, compreende a amplificação de uma seqüência de um ácido nucléico presente em amostras biológicas, empregando-se uma reação de cadeia de polimerase, com pelo menos dois iniciadores, um dos quais reconhece o DNA da planta na região de flanque-amento 5’ ou 3’ de EE-GH1, o outro que reconhece uma seqüência no DNA estrangeiro. De preferência, o DNA genômico é analisado empregando-se iniciadores que reconhecem uma seqüência na região de flanqueamento 5’ de EE-GH1 da planta, mais preferivelmente na seqüência de DNA da planta em SEQ ID NO: 1, e uma seqüência no DNA estrangeiro, respectivamente. Especialmente preferível, o DNA genômico é analisado de acordo com o protocolo de identificação de PCR descrito aqui por meio do qual o iniciador reconhecendo uma seqüência na região de flanqueamento 5’ compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2. Particularmente, o iniciador reconhecendo uma seqüência na região de flanqueamento 5’ compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e o iniciador reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, de modo que o fragmento amplificado seja um fragmento de preferência entre 250 e 290 bp, mais preferivelmente entre 260 e 270 bp, o mais preferivelmente de cerca de 269 bp.

Desta maneira, a presente invenção refere-se à planta transgê-nica, células ou tecidos desta os quais podem ser identificados de acordo com os métodos de identificação para EE-GH1 acima descritos. A presente invenção refere-se a métodos para identificação do evento de elite EE-GH1 em amostras biológicas, cujos métodos são baseados em iniciadores ou sondas que especificamente reconhecem a seqüência de flanqueamento 5’ e /ou 3’ de EE-GH1. Em uma modalidade preferida da invenção estes métodos são baseados em iniciadores ou sondas que reconhecem uma seqüência na SEQ ID NO: 1 e /ou SEQ ID NO: 4, mais particularmente iniciadores ou sondas compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 2. De acordo com outra modalidade da invenção tais métodos são baseados em iniciadores ou sondas que reconhecem uma seqüência de caracterização de EE-GH1, que é uma seqüência de DNA compreendendo 0 sítio de inserção do evento, incluindo nucleotídeos suficientes do DNA de flanqueamento 5’ ou 3’ e do DNA estrangeiro contíguo com este a fim de ser diagnóstico para o evento. Mais particularmente, tais métodos são baseados em seqüências compreendendo nucleotídeos suficientes do DNA de flanqueamento 5’ ou 3’ e do DNA estrangeiro contíguo com este de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4. Tais métodos são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, o método descrito por Lyamichev e outros (1999, Nature Biotechn 17: 292 - 296). A presente invenção também refere-se às seqüências de flanqueamento específicas de EE-GH1 descritas aqui, as quais podem ser empregadas para desenvolver métodos de identificação específicos para EE-GH1 em amostras biológicas. Mais particularmente, a invenção refere-se às regiões de flanqueamento 5’ e /ou 3’ de EE-GH1, as quais podem ser empregadas para o desenvolvimento de iniciadores e sondas específicos bem como aos iniciadores e sondas específicos desenvolvidos a partir das seqüências de flanqueamento 5’ e /ou 3’ de EE-GH1 e o sítio de inserção adjacente a estas. A invenção também refere-se a métodos de identificação para a presença de EE-GH1 em amostras biológicas baseados no uso de tais iniciadores ou sondas específicos. A invenção por conseguinte também refere-se a um kit para identificação do evento de elite EE-GH1 em amostras biológicas, compreendendo o kit pelo menos um iniciador ou sonda que especificamente reconhece a região de flanqueamento 5’ ou 3’ de EE-GH1.

De preferência o kit da invenção compreende, além de um iniciador que especificamente reconhece a região de flanqueamento 5’ ou 3’ de EE-GH1, um segundo iniciador que especificamente reconhece uma se-qüência no DNA estrangeiro de EE-GH1, para uso em um protocolo de identificação de PCR. De preferência, o kit da invenção compreende dois (ou mais) iniciadores específicos, um dos quais reconhece uma seqüência na região de flanqueamento 5’ de EE-GH1, mais preferivelmente uma seqüência na região de DNA da planta de SEQ ID NO: 1, e um outro que reconhece uma seqüência no DNA estrangeiro. Especialmente preferível, o iniciador reconhecendo a sequência de DNA da planta na região de flan-queamento 5’ compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2. Particularmente, o iniciador reconhecendo a seqüência de DNA da planta na região de flanqueamento 5’ compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e o iniciador reconhecendo o DNA estrangeiro compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 descritas aqui.

De acordo com uma outra modalidade, a invenção refere-se a um kit para identificação do evento de elite EE-GH1 em amostras biológicas, cujo kit compreende pelo menos um iniciador ou sonda específico tendo uma seqüência que corresponde (ou é complementar a) uma seqüência que hibridiza sob condições rigorosas a uma região de caracterização ou específica de EE-GH1. De preferência a seqüência da sonda corresponde a uma região específica compreendendo parte do DNA estrangeiro e parte da região de flanqueamento 5’ ou 3’ (DNA da planta) de EE-GH1 contígua com esta. Mais preferivelmente a sonda específica compreende (ou é complementar a) uma seqüência que hibridiza sob condições rigorosas a uma seqüência de 15 a 30 nucleotídeos atravessando o sítio de inserção na região 5’ ou 3’ do DNA estrangeiro na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4. Especialmente preferível a sonda específica compreende (ou é complementar a) uma seqüência que hibridiza sob condições rigorosas a uma seqüência de 9 nucleotídeos de DNA de planta e um número similar de nucleotídeos do DNA estrangeiro contíguo com o sítio de inserção, nas seqüências de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4. De acordo com uma modalidade particular, um tal iniciador compreende uma seqüência que é idêntica a uma seqüência de 9 nucleotídeos de DNA de planta e um número similar de nucleotídeos do DNA estrangeiro contíguo com o sítio de inserção, nas seqüências de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.

Os métodos e kits abrangidos pela presente invenção podem ser empregados para diferentes propósitos tais como, mas não limitados aos seguintes: identificar EE-GH1 em plantas, material de planta ou em produtos tais como, mas não limitados a alimento, ou produtos de alimentação (frescos ou processados) compreendendo ou derivados de material de planta; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser empregados para identificar material de planta transgênica para propósitos de segregação entre material transgênico e não-transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos ou kits da presente invenção podem ser empregados para determinar a qualidade (isto é porcentagem de material puro) de material de planta compreendendo EE-GH1. A presente invenção também refere-se a um método para localizar plantas compreendendo evento de elite EE-GH1 em seu genoma na introdução em diferentes lavouras.

Deve ser entendido que modalidades particulares da invenção estão descritas pelas reivindicações dependentes citadas aqui.

Breve Descrição da Figura A seguinte descrição detalhada, dada a título de exemplo, mas não pretendida para limitar a invenção a modalidades específicas descritas, pode ser compreendida em conjunção com a Figura acompanhante, incorporada aqui por referência, na qual: Fia. 1. Análise de PCR de outros eventos e evento de elite EE-GH1 empregando-se o protocolo de identificação de PCR de EE-GH1.

Seqüência de carga do gel: faixa 1, marcador de peso molecular (escada de 100 bp), faixa 2, amostra de DNA de uma planta de algodão compreendendo o evento transgênico EE-GH1, faixa 3, amostras de DNA de uma planta de algodão compreendendo outro evento transgênico, faixa 4, DNA de algodão do tipo selvagem, faixa 5, tipo selvagem + 1 cópia do digesto de pGSV71-BamHI (controle positivo), faixa 6, controle negativo (nenhum padrão), faixa 8, marcador de peso molecular (escada de 100 bp). Descrição Detalhada de Modalidades Preferidas O termo "gene" tal como empregado aqui refere-se a qualquer seqüência de DNA compreendendo diversos fragmentos de DNA operavel-mente ligados tais como uma região promotora, uma região não-traduzida 5’ (a 5’UTR), uma região de codificação (a qual pode ou não codificar para uma proteína), e uma região 3’ não-traduzida (3’UTR) compreendendo um sítio de poliadenilação. Tipicamente em células de planta, a 5’UTR, a região de codificação e a 3’UTR são transcritas em um RNA do qual, no caso de um gene de codificação de proteína, a região de codificação é traduzida em uma proteína. Um gene pode incluir fragmentos de DNA adicionais tais como, por exemplo, íntrons. Tal como empregado aqui, um local genético é a posição de um dado gene no genoma de uma planta. O termo "quimérico" quando referindo-se a uma seqüência de DNA ou gene é empregado para referir-se ao fato de que a seqüência de DNA ou gene compreende pelo menos dois fragmentos de DNA funcionalmente relevantes (tais como promotor, 5’UTR, região de codificação, 3’UTR, íntron) que não estão naturalmente associados um com o outro e /ou originam-se, por exemplo, de diferentes fontes. "Estrangeiro" referindo-se a uma seqüência de DNA ou gene com respeito a uma espécie de planta é empregado para indicar que a seqüência de DNA ou gene não é naturalmente encontrada naquela espécie de planta, ou não é naturalmente encontrada naquele local genético naquela espécie de planta. O termo "DNA estrangeiro" será empregado aqui para referir-se a uma seqüência de DNA tal como ela incorporou no genoma de uma planta como resultado de transformação. O "DNA de transformação” tal como empregado aqui refere-se a uma molécula de DNA recombinante empregada para a transformação. O DNA de transformação geralmente compreende pelo menos um "gene de interesse" (por exemplo um gene quimérico) o qual é capaz de conferir uma ou mais características específicas à planta transformada. O termo "molécula de DNA recombinante" é empregado para exemplificar e assim pode incluir uma molécula de ácido nucléico isolada que pode ser DNA e que pode ser obtida por meio de procedimentos recombinantes ou outros.

Tal como empregado aqui o termo "transgene" refere-se a um gene de interesse (ou a totalidade do DNA estrangeiro) tal como incorporado no genoma de uma planta. Uma "planta transgênica" refere-se a uma planta compreendendo pelo menos um transgene no genoma da totalidade de suas células. O DNA estrangeiro presente nas plantas da presente invenção compreenderão de preferência um gene de tolerância a herbicida, mais es- pecificamente um gene 35S-foar como o gene de interesse.

Um gene de "tolerância a herbicida" tal como empregado aqui refere-se a um gene que toma a planta tolerante a um herbicida. Um exemplo de um gene de tolerância a herbicida é gene compreendendo uma se-qüência codificando a enzima fosfinotricina acetil transferase, que destoxifi-ca fosfinotricina, sob o controle de um promotor constitutivo. Mais especificamente, no evento de elite da presente invenção o gene de tolerância a herbicida compreende a seqüência de codificação do gene de resistência bialafos {bar) de Streptomyces hygroscopicus (Thompson e outros (1987) EMBO J 6: 2519-2523) sob controle do promotor de 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor (Odell e outros, (1985), Nature 313: 810-812), também referido como "35S-bar" aqui. A expressão do gene 35S-bar confere tolerância aos compostos herbicidas fosfinotricina ou bialafos ou glufosinato, ou mais geralmente, inibidores de glutamina sintase, ou sais ou isômeros ópticos destes que serão geralmente referidos como "tolerância a glufosinato" aqui.

Por hibridização sob "condições rigorosas" pretende-se as condições de hibridização convencionais tais como descritas por Sambrook e outros (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que por exemplo podem compreender as seguintes etapas: 1) imobilização de fragmentos de DNA ge-nômico de planta em um filtro, 2) pré-hibridização do filtro durante 1 a 2 horas a 42°C em 50% formamida, 5 X SSPE, 2 X reagente de Denhardt e 0,1% SDS, ou durante 1 a 2 horas a 68°C em 6 X SSC, 2 X reagente de Denhardt e 0,1% SDS, 3) adição da sonda de hibridização que foi rotulada, 4) incubando durante 16 a 24 horas, 5) lavando o filtro durante 20 minutos em temperatura ambiente em 1X SSC, 0,1% de SDS, 6) lavando o filtro três vezes durante 20 minutos cada a 68°C em 0,2 X SSC, 0,1% de SDS, e 7) expondo o filtro durante 24 a 48 horas a filme de raio X a -70°C com uma análise de intensificação. A incorporação de uma molécula de DNA recombinante no ge-noma da planta tipicamente resulta de transformação de uma célula, tecido ou calo (ou de outra manipulação genética). O sítio particular de incorpora- ção é ou aleatório ou está em uma localização predeterminada (se um processo de integração alvejada for empregado). O DNA introduzido no genoma da planta como um resultado de transformação de uma célula ou tecido da planta com um DNA recombi-nante ou "DNA de transformação" é a seguir referido como "DNA exógeno" compreendendo um ou mais "transgenes". Desse modo, o DNA exógeno pode compreender igualmente DNA recombinante, bem como recentemente introduzido, DNA reorganizado da planta. Entretanto o termo "DNA de planta" no contexto da presente invenção referir-se-á ao DNA da planta que é geralmente encontrado no mesmo locus genético na planta do tipo selvagem. O DNA exógeno pode ser caracterizado pela localização e a configuração no sítio de incorporação da molécula de DNA recombinante no genoma da planta. O sítio no genoma da planta onde um DNA recombinante foi inserido é também referido como o "sítio de inserção" ou "sítio alvo". A inserção do DNA recombinante no genoma da planta pode ser associada com uma deleção de DNA de planta, referida como "deleção do sítio alvo". A "região de flanqueamento" ou "seqüência de flanqueamento" como aqui empregado refere-se a uma seqüência de pelo menos 20 bp, preferivelmente pelo menos 50 bp, e até 5000 bp do genoma da planta que é localizado ou imediatamente a montante de e contíguo com ou imediatamente a jusante de e contíguo com o DNA exógeno. Os procedimentos de transformação induzindo à integração aleatória do DNA exógeno resultarão em transfor-mantes com diferentes regiões de flanqueamento, que são características e únicas para cada transformante. Quando o DNA recombinante presente em uma planta é introduzido em uma planta diferente através de cruzamento tradicional, seu sítio de inserção no genoma da planta, ou suas regiões de flanqueamento geralmente não serão alteradas (a parte de alterações ocasionais devido a mutações ou cruzamento e transposons). Uma "região de inserção" como aqui empregado refere-se à região correspondendo à região de pelo menos 40 bp, preferivelmente pelo menos 100 bp, e até mais do que 10.000 bp, abrangidos pela seqüência que compreende a região de flan- queamento a montante e/ou a jusante de um DNA exógeno no genoma da planta (não-transformado) (e incluindo o sítio de inserção e possível deleção do sítio alvo). Levando em consideração menores diferenças devido à mutações dentro de uma espécie, uma região de inserção reterá pelo menos 85%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, e o mais preferivelmente 100% de identidade de seqüência com a seqüência compreendendo as regiões de flanqueamento a montante e ajusante do DNA exógeno em uma dada planta daquela espécie. A expressão de um gene de interesse refere-se ao fato de que o gene confere sobre a planta uma ou mais características fenotípicas (por exemplo, tolerância a herbicida) que foram pretendidas serem conferidas pela introdução da molécula de DNA recombinante - o DNA de transformação - empregado durante a transformação (com base na estrutura e funcionamento de parte ou o todo do(s) gene(s) de interesse).

Um "evento" é definido como um locus genético (artificial) que, como um resultado de construção genética, transporta um DNA exógeno compreendendo pelo menos uma cópia do(s) gene(s) de interesse (também referido como um evento de transformação). Um evento é caracterizado fe-notipicamente pela expressão dos transgenes. No nível genético, um evento é parte da constituição genética de uma planta. No nível molecular, um evento é caracterizado pelo mapa de restrição (por exemplo, como determinado por Southern blotting) e/ou pelas seqüências de flanqueamento a montante e/ou a jusante do DNA exógeno, e/ou a configuração molecular do DNA exógeno compreendendo os transgenes. Usualmente quando transformando uma célula de planta, tecido ou calo com um DNA de transformação, uma multidão de eventos é gerada, cada da qual é única.

Um "evento de elite", como aqui empregado, é um evento que é selecionado do grupo de eventos obtido por transformação com o mesmo DNA de transformação ou por recruzamento com plantas obtidas por tal transformação, com base na expressão fenotípica e estabilidade dos transgenes e na ausência de impacto negativo sobre as características agronômicas da planta compreendendo-o (isto é, evento de transformação selecio- nado). Desse modo, os critérios para seleção de evento de elite são um ou mais, preferivelmente dois ou mais, vantajosamente todos os seguintes : a) que a presença do DNA exógeno na planta não compreende outras características desejadas da planta, tal como aquelas referentes ao desempenho agronômico ou valores comerciais; b) que o evento é caracterizado por uma configuração molecular bem-definida que é estavelmente herdada e para a qual ferramentas diagnosticas apropriadas para controle da identidade podem ser desenvolvidas; c) que o(s) gene(s) de interesse mostra(m) uma expressão apropriada e espacial estável e fenotípica temporal em condição homozigota do evento, em um nível comercialmente aceitável em uma faixa de condições ambientais nas quais as plantas transportando o evento são prováveis de serem expostas em uso agronômico normal.

Prefere-se que o DNA exógeno seja associado com uma posição no genoma da planta que permita a introgressão nas bases genéticas comerciais desejadas. O estado de um evento como um evento de elite é confirmado pela introgressão do evento de elite em diferentes bases genéticas relevantes e observando a concordância com um, dois ou todos os critérios, por exemplo, a), b) e c) acima.

Um "evento de elite" desse modo refere-se a um locus genético compreendendo um DNA exógeno, que responde aos critérios acima descritos. Uma planta, material de planta ou progênie tal como sementes pode compreender um ou mais eventos de elite em seu genoma. Desse modo, quando referindo-se a uma planta, célula ou tecido de semente compreendendo o evento de elite EE-GH1 em seu genoma, uma planta, célula ou tecido de planta é pretendido que compreenda o DNA exógeno aqui descrito (compreendendo o gene 35S-bar) integrado em seu genoma no sítio de integração aqui descrito.

As ferramentas para identificar um evento de elite ou a planta ou material de planta compreendendo um evento de elite, ou produtos que compreendem material de planta compreendendo o evento de elite são ba- seados nas características genômicas específicas do evento de elite, tal como, um mapa de restrição da região genômica compreendendo o DNA exógeno, os marcadores moleculares ou a seqüência da(s) região(ões) de flanqueamento do DNA exógeno.

Uma vez que uma ou ambas as regiões de flanqueamento do DNA exógeno foram seqüenciadas, iniciadores e sondas podem ser desenvolvidos que especificamente reconhecem esta (estas) seqüência (s) no ácido nucléico (DNA ou RNA) de uma amostra por meio de uma técnica biológica molecular. Por exemplo, um método de PCR pode ser desenvolvido para identificar o evento de elite em amostras biológicas (tal como amostras de planta, material de planta ou produtos compreendendo material de planta). Uma tal PCR é baseada em pelo menos dois "iniciadores" específicos, um reconhecendo uma seqüência dentro da região de flanqueamento 5’ ou 3' do evento de elite, e o outro reconhecendo uma seqüência dentro do DNA exógeno. Os iniciadores preferivelmente têm uma seqüência dentro de 15 e 35 nucleotídeos que sob condições de PCR otimizada "especificamente reconhecem" uma seqüência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento de elite e o DNA exógeno do evento de elite, respectivamente, a fim de que um fragmento específico ("fragmento de integração") seja amplificado de uma amostra de ácido nucléico compreendendo o evento de elite. Isto significa que apenas o fragmento de integração alvejado, e nenhuma outra seqüência (daquele tamanho) no genoma da planta ou DNA exógeno, seja amplificado sob condições de PCR otimizada. Preferivelmente, o fragmento de integração tem um comprimento dentre 50 e 500 nucleotídeos, o mais preferivelmente dentre 100 e 350 nucleotídeos. Preferivelmente, os iniciadores específicos têm uma seqüência que é entre 80 e 100% idêntica a uma seqüência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3’ do evento de elite e o DNA exógeno do evento de elite, respectivamente, contanto que as más comparações também permitam identificação específica do evento de elite com estes iniciadores sob condições de PCR otimizada. A faixa de más comparações permissíveis, entretanto, pode ser facilmente determinada experimentalmente e é conhecida de uma pessoa versada na técnica. Como a seqüência dos iniciadores e sua seqüência reconhecida no genoma são únicas para o evento de elite, a amplificação do fragmento de integração ocorrerá apenas em amostras biológicas compreendendo (o ácido nucléico de) o evento de elite. Preferivelmente, quando executando uma PCR para identificar a presença de EE-GH1 em amostras conhecidas, um controle é incluído de um grupo de iniciadores com os quais um fragmento dentro de um "gene de rotina" (housekeeping gene) da espécie de planta do evento pode ser amplificado. Os genes de rotina são genes que são expressos na maioria dos tipos de célula e que são relacionados com atividades metabóiicas básicas comuns à todas as células. Preferivelmente, o fragmento amplificado do gene de rotina é um fragmento que é maior do que o fragmento de integração amplificado. Dependendo das amostras a serem analisadas, outros controles podem ser incluídos.

Os protocolos de PCR padrão são descritos na técnica, tal como em "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2a Edição, 1999). As condições óticas para a PCR, incluindo a seqüência dos iniciadores específicos, são especificadas em um "protocolo de identificação de PCR" para cada evento de elite. É entretanto entendido que diversos parâmetros no protocolo de identificação de PCR podem precisar ser ajustados para condições de laboratório específicas, e podem ser modificados ligeiramente para obter resultados similares. Por exemplo, o uso de método diferente para a preparação de DNA pode requerer o ajuste de, por exemplo, a quantidade de iniciadores, polimerase e condições de recozimento empregadas. Similarmente, a seleção de outros iniciadores pode ditar outras condições ideais para o protocolo de identificação. Estes ajustes entretanto serão evidentes para a pessoa versada na técnica, e são portanto detalhadas em manuais de aplicação de PCR correntes tal como aquele acima citado.

Altemativamente, os iniciadores específicos podem ser empregados para amplificar um fragmento de integração que pode ser empregado como uma "sonda específica" para identificar EE-GH1 em amostras biológicas. Contactar o ácido nucléico de uma amostra biológica, com a sonda, sob condições que permitem a hibridização da sonda com seu fragmento cor- respondente no ácido nucléico, resulta na formação de um ácido nucléi-co/híbrido de sonda. A formação deste híbrido pode ser detectada (por exemplo, rotulagem do ácido nucléico ou sonda), pelo que a formação deste híbrido indica a presença de EE-GH1. Tais métodos de identificação com base na hibridização com uma sonda específica (ou em um veículo de fase sólida ou em solução) foram descritos na técnica. A sonda específica é preferivelmente uma sequência que, sob condições otimizadas, hibridiza especificamente para uma região compreendendo parte da região de flanquea-mento 5' ou 3' do evento de elite e também compreendendo parte do DNA exógeno contíguo com ela (a seguir também referido como uma "região específica" do evento). Dependendo do método empregado, uma tal sonda específica pode compreender uma seqüência de entre 15 e 30 bp ou de entre 50 e 500 bp, preferivelmente de 100 a 350 bp que hibridizam sob condições rigorosas para a seqüência de nucleotídeo (ou o complemento de tal seqüência) de uma região específica. Preferivelmente, a sonda específica compreenderá uma seqüência de cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos idênticos contíguos (ou complementares) para uma região específica do evento de elite. Mais preferivelmente uma tal sonda compreende pelo menos 9 nucleotídeos idênticos a (ou complementares à região de flanquea-mento 3' ou 5' e um número similar de nucleotídeos no DNA exógeno contíguo com ele. Mais preferivelmente, uma tal sonda compreende pelo menos 9 nucleotídeos idênticos (ou complementares à região de flanqueamento 3’ ou 5' e um número similar de nucleotídeos no DNA exógeno contíguo com ela de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.

Um "mapa de restrição" como aqui empregado refere-se a um grupo de padrões de Southern blot obtidos após divagem do DNA genômico da planta (e/ou o DNA exógeno compreendido nela) com uma enzima de restrição particular, ou grupo de enzimas de restrição e hibridização com uma sonda compartilhando similaridade de seqüência com o DNA exógeno sob condições de rigorosidade padrão. As condições de rigorosidade padrão como aqui empregadas referem-se às condições para hibridização descritas aqui ou às condições de hibridização convencionais como descrito por Sambrook e outro (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que por exemplo podem compreender as seguintes etapas: 1) imobilização dos fragmentos de DNA genômicos da planta sobre um filtro, 2) pré-hibridização do filtro durante 1 a 2 horas a 42°C em 50% de formamida, 5 X SSPE, 2 X reagente de Denhardt e 0,1% de SDS, ou durante 1 a 2 horas a 68°C em 6 X SSC, 2 X reagente de Denhardt e 0,1% de SDS, 3) adição da sonda de hibridização que foi rotulada, 4) incubação durante 16 a 24 horas, 5) lavagem do filtro durante 20 minutos em temperatura ambiente em 1 X SSC, 0,1% de SDS, 6) lavagem do filtro três vezes durante 20 minutos cada uma a 68°C em 0,2 x SSC, 0,1% de SDS, e 7) exposição do filtro durante 24 a 48 horas ao filme de raio X a -70°C com uma análise de intensificação.

Devido aos sítios de restrição (endógenos) presentes em um genoma de planta antes da incorporação do DNA exógeno, a inserção de um DNA exógeno alterará o mapa de restrição específico daquele genoma. Desse modo, um transformante ou progênie particular deste pode ser identificada por um ou mais padrões de restrição específicos.

Alternativamente, as plantas ou material de planta compreendendo um evento de elite pode ser identificada por teste de acordo com um protocolo de identificação de PCR. Esta é uma PCR que especificamente reconhece o evento de elite. Essencialmente, um grupo de iniciadores de PCR é desenvolvido o qual reconhece a) uma seqüência dentro da seqüên-cia de flanqueamento 3' ou 5' do evento de elite e b) uma seqüência dentro do DNA exterior, que iniciadores amplificam um fragmento (fragmento de integração) de preferência entre 100 e 300 nucleotídeos. De preferência, um controle é incluído de um grupo de iniciadores os quais amplificam um fragmento dentro de um gene de rotina da espécie de planta (de preferência um fragmento o qual é maior que o fragmento de integração amplificado). As condições ideais para o PCR, incluindo a seqüência dos iniciadores específicos são especificadas em um protocolo de identificação de PCR.

Outros métodos para identificação de plantas, material de planta ou produtos compreendendo material de planta compreendendo evento de elite EE-GH1 são também considerados. Estes métodos incluem todos os métodos baseados na detecção da seqüência de DNA exterior e seqüên-cia(s) de flanqueamento do evento de elite com uma sonda específica. Mais particularmente, tecnologias baseadas em chip, tais como aquelas descritas por Hacia e outros 1996 (Nat Genet 14(4):441-447) e Shoemaker e outros 1996 (Nat Genet 14(4):450-456) são contempladas. Estes métodos permitem segregação de moléculas alvo como séries de alta densidade por uso de séries de sonda fixa ou por rotulagem dos genes com oligonucleotídeos, após o qual eles podem ser exibidos por hibridização. Altemativamente, terceiro método de detecção de onda, tais como aqueles descritos por Lyami-chev e outros (1999, acima) são contemplados. A identificação da(s) proteína(s) codificada(s) pelo DNA exterior do evento de elite pode ser feita por métodos de detecção de proteína clássicos descritos na técnica, tais como aqueles baseados em propriedades eletromagnéticas ou cromatográficas da proteína ou a detecção por anticorpos monoclonais específicos (como descrito em "Guide to protein purificati-on, Murray P. Deutscher editor).

Um "kit" como usado aqui se refere a um grupo de reagentes para o propósito de execução do método da invenção, mais particularmente, a identificação do evento de elite EE-GH1 em amostras biológicas. Mais particularmente, uma modalidade preferida do kit da invenção compreende pelo menos um ou dois iniciadores específicos, como descrito acima. Opcionalmente, o kit pode também compreender qualquer outro reagente descrito aqui no protocolo de identificação de PCR.

Alternativamente, de acordo com outra modalidade desta invenção, o kit pode compreender uma sonda específica, como descrito acima, que especificamente hibridiza com ácido nucléico de amostras biológicas para identificar a presença de EE-GH1 nisto. Opcionalmente, o kit pode também compreender qualquer outro reagente (tal como mas não limitado a tampão de hibridização, rótulo) para identificação de EE-GH1 em amostras biológicas, usando a sonda específica. O kit da invenção pode ser usado, e seus componentes podem ser especificamente ajustados, para propósitos de controle de qualidade (por exemplo, pureza de lotes de semente), detecção do evento de elite no material de planta ou material compreendendo ou derivado de material de planta, tal como mas não limitado a comida ou produtos de alimentação. A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um evento de elite em algodão, EE-GH1, para as plantas compreendendo este evento, a prole obtida a partir destas plantas e para as células de planta, ou material de planta derivado a partir deste evento. As plantas compreendendo o evento de elite EE-GH1 foram obtidas por meio de transformação com pGSV71 como descrito no exemplo 1.

As plantas de algodão ou material de planta compreendendo EE-GH1 podem ser identificadas de acordo com o protocolo de identificação de PCR descrito para EE-GH1 no Exemplo 4 aqui. Resumidamente, DNA de genoma de algodão é amplificado por PCR usando um iniciador que especificamente reconhece uma seqüência dentro da sequência de flanqueamento 5’ ou 3' de EE-GH1, particularmente o iniciador com a seqüência de SEQ ID NO: 2, e um iniciador que reconhece uma seqüência no DNA exterior, particularmente o iniciador com a seqüência de SEQ ID NO: 3. Os iniciadores de DNA de algodão endógenos são usados como controles. Se o material de planta produz um fragmento entre 250 e 290 bp, de preferência de cerca de 269 bp, a planta de algodão é determinada para alojar o evento de elite EE-GH1.

As plantas alojando EE-GH1 são caracterizadas por sua tolerância de glufosinato, que no contexto da presente invenção inclui que plantas são tolerantes ao herbicida Liberty®. A tolerância a Liberty® pode ser testada de diferentes maneiras. O método de pintura da folha como descrito aqui, é mais útil quando se deseja identificar ambas plantas resistentes e sensitivas, mas não necessita matar as unidades sensíveis. Alternativamente, tolerância pode ser testada por aplicação de vaporização de Liberty®. Os tratamentos de vaporização deveríam ser feitos entre os estágios de folha V3 e V4 para melhores resultados. As plantas tolerantes são caracterizadas pelo fato que a vaporização das plantas com pelo menos 200 gramas de ingrediente ativo / hectare (g.a.i./ha), de preferência 400 g.a.i./ha, e possivelmente até 1600 g.a.i./ha (4X a taxa de campo normal), não mata as plantas. Uma aplicação de radiodifusão deveria ser aplicada a uma taxa de 793,72 g - 963,87 g (28-34 onças) de Liberty®. Isso é melhor para aplicar a um volume de 75,71 I (20 galões) de água por acre usando um bocal de tipo leque plano enquanto ao mesmo tempo que tendo cuidado para não direcionar aplicações de spray diretamente para dentro do vórtice das plantas para evitar queima de tensoativos nas folhas. O efeito de herbicida deveria aparecer dentro de 48 horas e ser nitidamente visível dentro de 5-7 dias.

As plantas alojando EE-GH1 podem também ser caracterizadas pela presença em suas células de fosfinotricina acetil transferase como determinado por um ensaio de PAT (De Block e outros, 1987, supra).

As plantas alojando EE-GH1 podem, por exemplo, ser obtidas a partir de sementes depositadas ao ATCC sob número de acesso PTA-3343, que contenha 50% de núcleos que são hemizigoto para o evento de elite. Tais plantas podem ser também propagadas para introduzir o evento de elite da invenção em outros cultivos da mesma espécie de planta. As sementes selecionadas obtidas a partir destas plantas contêm o evento de elite estavelmente incorporado em seu genoma. A invenção também refere-se a plantas derivadas a partir do número de acesso de ATCC PTA-334, compreendendo EE-GH1. O termo "derivado a partir de" aqui indica que as plantas estão relacionadas, isto é elas são ambas progênie (direta ou de duas ou mais gerações) do mesmo transformante por cruzamento.

As plantas alojando EE-GH1 são também caracterizadas por ter características agrônomas que são comparáveis a variedades comercialmente disponíveis de algodão nos Estados Unidos, na ausência de pressão de erva daninha e uso de Liberty® para controle de erva daninha. Foi observado que a presença de um DNA exterior na região de inserção do genoma de planta de algodão descrito aqui, confere características fenotípicas e moleculares particularmente interessantes às plantas compreendendo este evento. Mais especificamente, a presença do DNA exterior nesta região particular no genoma destas plantas, resulta em plantas que mostram uma ex- pressão fenotípica estável do gene de interesse sem comprometer de forma significativa qualquer aspecto da desejada performance agrônoma das plantas. Dessa forma, a região de inserção, correspondente a uma seqüên-cia compreendendo o DNA de planta de SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 4, mais particularmente uma seqüência correspondente a SEQ 10 NO: 5, mais particularmente o sítio de inserção de EE-GH1 nisto, é mostrado ser particularmente adaptado para a introdução de um gene(s) de interesse. Mais particularmente, a região de inserção de EE-GH1 (correspondente a uma seqüência DNA de pelo menos 40 bp no genoma de algodão dentro de SEQ ID NO: 5), ou uma seqüência de pelo menos 40 bp que hibridiza sob condições rigorosas para o complemento da seqüência de SEQ ID NO: 5, é particularmente adaptada para a introdução de DNA exterior compreendendo um gene de tolerância de herbicida, expressão de garantia de cada um destes genes na planta sem comprometimento da performance agrônoma.

Uma molécula de DNA recombinante pode ser especificamente inserida em uma região de inserção por métodos de inserção visados. Tais métodos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica e compreendem, por exemplo, recombinação homóloga usando uma recombinase tal como, mas não limitado à FLP recombinase de Saccharomyces cerevisiae (aplicação de PCTP publicada WO 99/25821), a CRE recombinase de fago P1 de Escheríchia coli (aplicação de PCT publicada WO 99/25840), a recombinase de pSR1 de Saccharomyces rouxii (Araki e outros 1985, J Mol Biol 182:191-203), o sistema de Gin/gix de fago Mu (Maeser e Kahlmann, 1991, Mol Gen Genetics 230:170-176) ou o sistema de recombinação de fago lambda (tal como descrito na Patente U.S. 4.673.640).

Como usado aqui, "identidade de seqüência" em relação a se-qüências de nucleotídeo (DNA ou RNA), refere-se ao número de posições com nucleotídeos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos na menor das duas seqüências. O alinhamento das duas seqüências de nucleotídeo é desempenhado pelo algoritmo de Wilbur e Lipmann (Wilbur e Lipmann, 1983, Proc Nat Acad Sei USA 80:726) usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e um "gap pe- nalty" de 4. A interpretação e análises assistidas por computador de dados de seqüência, incluindo alinhamento de seqüência como descrito acima, podem, por exemplo, ser convenientemente desempenhados usando os programas da Wisconsin Package (da Genetics Computer Group, Inc). As seqüências são indicadas como "essencialmente similares" quando tais se-qüências têm uma identidade de seqüência de pelo menos cerca de 75 %, particularmente pelo menos cerca de 80 %, mais particularmente pelo menos cerca de 85 %, muito particularmente cerca de 90 %, especialmente cerca de 95 %, mais especialmente cerca de 100 %, muito especialmente são idênticos. É claro que quando seqüências de RNA são ditas serem essencialmente similares ou têm um certo grau de identidade de seqüência com seqüências de DNA, timina (T) na seqüência de DNA é considerada igual à uracila (U) na seqüência de RNA. "Complementar a" como usado aqui refere-se à complementaridade entre os nucleotídeos A e T (U), e G e C em seqüências de nucleotídeo.

Como usado aqui, uma "amostra biológica" é uma amostra de uma planta, material de planta ou produtos compreendendo material de planta. O termo "planta" é destinado a abranger algodão (tal como mas não limitado a Gossypium hirsutum) tecidos de planta, em qualquer estágio de maturidade, assim como quaisquer células, tecidos, ou órgãos tomados a partir de ou derivados a partir de qualquer planta semelhante, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células simples, gametas, culturas de célula, culturas de tecido ou protoplastos. "Material de planta", como usado aqui refere-se a material que é obtido ou derivado a partir de uma planta. Os produtos compreendendo material de planta referem-se a comida, alimento ou outros produtos que são produzidos usando material de planta ou podem ser contaminados por material de planta. É entendido que, no contexto da presente invenção, tais amostras biológicas são de preferência testadas para a presença de ácidos nucléicos específica para EE-GH1, implicando na presença de ácidos nucléicos nas amostras. Dessa forma os métodos referidos aqui para identificação de evento de elite EE-GH1 em amostras biológicas, de preferência referem-se à identificação em amostras biológicas de ácidos nucléicos que compreendem o evento de elite.

Como usado aqui "compreendendo" é para ser interpretado como especificação da presença das características especificadas, números inteiros, etapas ou componentes como referido a, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas ou componentes, ou grupos destes. Dessa forma, por exemplo, um ácido nu-cléico ou proteína compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ou ami-noácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que as unidades de fato citadas, isto é, ser embutidos em uma proteína ou ácido nucléico maior. Um gene quimérico compreendendo uma seqüência de DNA que é funcionalmente ou estruturalmente definido, pode compreender se-qüências adicionais che DNA, etc.

Os seguintes exemplos descrevem o desenvolvimento e características de plantas de algodão alojando o evento de elites EE-GH1 assim como o desenvolvimento de ferramentas para a identificação de evento de elite EE-GH1 em amestras biológicas. A menos que de outra forma declarada, todas técnicas de DNA recombinante são reailizadas de acordo com protocolos padrão como descrito em Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Coldl Spring Harbour Laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Os materiais padrões e métodos para trabalho molecular de planta são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Cray publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications, UK.

Na descrição e exemplos, referência é feita às seguintes se- qüências: SEQ ID NO: 1: seqüência compreendendo a região de flanqueamento 5' SEQ ID NO: 2: iniciador GHI06 SEQ ID NO: 3: iniciador GHI05 SEQ ID NO: 4: seqüência compreendendo a região de flanqueamento 3’ SEQ ID NO: 5: região de inserção SEQ ID NO: 6: plasmídeo pGSV71 SEQ ID NO: 7: plasmídeo pRVA44 SEQ ID NO: 8 iniciador MDB327 SEQ ID NO: 9: iniciador MLD015 SEQ ID NO: 10: iniciador MLD016 SEQ ID NO: 11: iniciador MDB612 SEQ ID NO: 12: iniciador MDB053 SEQ ID NO: 13: iniciador MDB356 SEQ ID NO: 14: iniciador DPA017 SEQ ID NO: 15: iniciador MLD019 SEQ ID NO: 16: seqüência compreendendo supressão do sítio alvo SEQ ID NO: 17: iniciador GHI01 SEQ ID NO: 18: iniciador GHI02 Exemplos Exemplo 1: Transformação de algodão com um gene de tolerância à herbicida 1.1. Construção do DNA quimérico compreendendo o gene bar sob o controle de um promotor constitutivo.

Um plasmídeo pGSV71 foi construído seguindo procedimentos padrão. A seqüência dos elementos genéticos do plasmídeo pGSV71 é dada na tabela 1 (SEQ ID NO: 6): Tabela 1. Posições de nucleotídeo dos elementos genéticos em PGSV71 Continuação... 1.2. Transformação de Gossypium hirsutum O tecido de algodão de plantas Coker312 foi transformado com pGSV71 usando transformação de Agrobacterium (US 5.986.181) e regenerado em plantas em veículos apropriados.

As plantinhas pequenas iniciadas nos veículos de regeneração seletivos foram transferidas para novo veículo para germinação (todo o veículo é livre de hormônio). As plantas foram então transferidas para câmaras de crescimento ou para as estufas. A seleção foi realizada em fosfinotricina (PPT) em todos os estágios exceto a regeneração das plantinhas, que foi realizada na ausência de PPT para acelerar o crescimento. Isto resultou em um grupo de transfor-mantes primários (plantas da geração TO).

Exemplo 2: Desenvolvimento de eventos 2.1. Desenvolvimento das linhagens carregando a característica do evento Brotos TO foram transferidos para o solo das estufas e as plantas foram avaliadas quanto à tolerância ao glufosinato e quanto à presença da enzima PAT com um PAT ELISA (Steffens Biotèchnische Analysen GmbH, Ebringen, Alemanha).

Plantas T1 a T3 foram germinadas na estufa e testadas quanto à tolerância Liberty® em uma taxa de 2x (vaporizando-se 0,1656 mL/m2 (56 oz/ha)). Plantas positivas foram testadas quanto à expressão do gene bar usando o ensaio Pat como descrito por Deblock e outro 1987 (EMBO J. 6: 2513-2518). A presença do DNA exógeno e número de cópia foi verificada por análise de Southern blot. O DNA genômico total foi isolado de 1 g do tecido da folha de acordo com o método CETAB de Doyle e outro (1987, Phytochem. Bull. 19:11) e digerido com enzima de restrição EcoRI.

As sondas tal como as seguintes foram usadas para análise Southern: Sonda "bar": digestão de Kpnl-Bgll de 474 bp do plasmídeo pDE110 (WO 92/09696) 'Sonda "35S": digestão de Ncol-Munl de 892 bp de plasmídeo pRVA44 (SEQ ID NO: 7) As plantas T2 foram também avaliadas quanto às características fenotípicas gerais comparadas às linhagens isogênicas não-transgênicas. Em gerações mais recentes, as linhagens paras as quais nenhuma penalidade no fenótipo ou rendimento agronômico foi observada quanto à presença do transgene em condição hemizigoto ou homozigoto, quando comparada aos tipos selvagens foram selecionadas. O material T4 foi germinado no campo e testado sob as condições do campo quanto à tolerância Liberty® de acordo com horários diferentes.

Em gerações mais recentes, as plantas foram comparadas às variedades comerciais para o campo, qualidade da fibra e dados do mape- amento da planta. Características agronômicas, tal como altura da planta, altura em nodo, retenção do casulo de algodão, posição, vigor, tamanho da fibra, resistência da fibra e produção de fiapos de tecido foram avaliadas.

Foi determinado que um evento realizado igualmente ou melhor do que os controles comparáveis e que para este evento a produção foi dependente da base em vez da presença do transgene. 2.2. Seleção de um evento elite Este procedimento de seleção, produziu um evento elite que exibiu expressão ideal do gene bar 35S, isto é tolerância ao amônio de glu-fosinato, sem penalizar na produção de desempenho agronômico. Este evento elite foi denominado EE-GH1. 2.3. Teste de EE-GH1 em variedades de algodão com diferentes bases genéticas e em locais diferentes O evento selecionado foi introduzido em diferentes bases genéticas comerciais, incluindo FM989, FM 832, FM958, e FM966 e resultados de experiências em campo de quatro locais diferentes foram comparados. As plantas foram vaporizadas com 1600 g.a.i./há, usando tratamentos diferentes (1x3-5 estágio da folha, 4x, 3-5 estágio da folha, 1x+1x, 3-5 estágio da folha, 4x+4x, 3-5 estágio da folha, 0 como controle).

Surgimento de muda e avaliação do vigor para o evento elite foi muito boa.

Nenhum dano visível como um resultado da aplicação de herbicida nunca foi observado depois da aplicação independente da taxa ou estágio de desenvolvimento no momento da aplicação. Não existiram efeitos prejudiciais na morfologia ou hábito de desenvolvimento de plantas por aplicação de herbicida.

Além disso, o evento teve folha normal, morfologia do casulo de algodão e flor, excelente fertilidade, e não mostrou doença ou suscetibilida-de de inseto anormal em bases genéticas múltiplas. Durante a introgressão em múltiplas bases genéticas nenhum problema aberrante ou anormalidades foram observadas em quatro gerações. 2.4. Análise genética do locus A estabilidade genética da inserção para o evento EE-GH1 foi verificada por análise fenotípica e molecular nas plantas de progênie em várias gerações.

Análises de Southern blot de plantas da geração T1, T2 e T3 foram comparadas quanto ao evento EE-GH1. Os padrões obtidos constataram serem idênticos nas diferentes gerações. Isto prova que a configuração molecular do DNA exógeno em EE-GH1 foi estável. O evento EE-GH1 exibiu segregação Mendelian para o transge-ne como um locus genético único em pelo menos três gerações subse-qüentes indicando que a inserção é estável.

Exemplo 3: Caracterização do evento elite EE-GH1. 3.1 Análise genética e molecular a fundo do local Logo que o evento EE-GH1 foi identificado como um evento em que a expressão do transgene bem como desempenho agronômico total foi ideal, o locus do transgene foi analisado em detalhe sobre um nível molecular. Isto incluiu o seqüenciamento das regiões de flanqueamento do transgene. A seqüência das regiões flanqueando o transgene inserido no evento EE-GH1 foi determinada usando o protocolo TAIL-PCR como descrito por Liu e outro (1995, Plant J. 8(3): 457 - 463) a) Determinação da reaião de flanqueamento 5’ Os iniciadores usados foram: Por meio do qual N=A,C,T ou g; S=C ou g; W=A ou T O fragmento amplificado usando MDB327-GHI05 foi 1200 bp aproximadamente que foi seqüenciado (5’flanq.: SEQ ID NO: 1). A seqüên-cia entre pares de base 1 e pares de base 677 compreendeu o DNA da planta, ao mesmo tempo que a seqüência entre pares de base 678 e pares de base 850 correspondeu ao DNA de pGSV71. b) Determinação da região de flanaueamento 3’ Os iniciadores usados foram : Por meio do qual: N=A,C,T ou g; S=C ou g; W = A ou T O fragmento amplificado usando MDB612-DPA017 foi 400 bp aproximadamente, a seqüência completa da qual foi determinada (SEQ ID NO: 4). A seqüência entre nucleotídeo 1 e 179 corresponde ao T-DNA, ao mesmo tempo que a seqüência entre nucleotídeo 180 e 426 corresponde ao DNA da planta. cl Identificação da delecão do sítio alvo Usando iniciadores correspondendo às seqüências dentro das regiões de flanqueamento do transgene em Gossypium hirsutum tipo selvagem como um padrão, o sítio de inserção do transgene foi identificado.

Os seguintes iniciadores foram usados: Seqüência (5'-*3') Posição em flan- Posição em flan- queamento 5' queamento 3' (SEQ ID NO:1) (SEQ ID NO:4) GHI06 TTg.CAC.CAT.CTA.gCT.CAC. 815-»795 — TC (SEQ ID NO:2) MLD019 CAA.gAT.gCg.AgC.AAC.TAT.g — 285->266 T (SEQ ID NO:15) Isto produziu um fragmento de 200 bp (SEQ ID NO: 16) em que 85 a 122 bp correspondem a uma deleção de sítio alvo.

Desse modo, a região de inserção (SEQ ID NO: 5) como se-qüenciada compreende: 1-677: região de flanqueamento 5’ 1a 677 pares de base de SEQ ID NO: 1 678-714: deleção do sítio alvo 85a122bpdeSEQIDNO:16 715-916: região de flanqueamento 3’ 180 a 426 bp de SEQ ID NO: 4 3.2. Análise genética do locus A estabilidade genética da inserção foi verificada por análise fenotípica e molecular em plantas de progênie em várias gerações.

Análises de Southern blot em plantas com tolerância à glufosi-nato de plantas de algodão de EE-GH1 da geração T0, T, e T2 foram comparadas e foram constatadas serem idênticas. Isto prova que a configuração molecular do transgene em plantas contendo EE-GH1 foi estável. O evento EE-GH1 exibiu segregação Mendelian para o transgene como um locus genético único em pelo menos três gerações subse-qüentes indicando que a inserção é estável.

Sobre a base dos resultados acima, EE-GH1 foi idêntico a um evento elite.

Exemplo 4: Desenvolvimento dos instrumentos diagnósticos para controle de identidade.

Um protocolo de Identificação de PCR de evento Elite EE-GH1 foi desenvolvido para identificar a presença de EE-GH1 em plantas, material de planta ou amostras biológicas.

Protocolo de identificação de Reação de Cadeia de polimerase de evento Elite EE-GH1.

Um funcionamento de teste, com todos os controles apropriados, tem de ser realizado antes de tentar avaliar os desconhecidos. O protocolo apresentado pode requerer a otimização para componentes que podem se diferirem entre rótulos (preparação de DNA padrão, DNA polimerase Taq, qualidade dos iniciadores, dNTP’s, termociclizador, etc.). A amplificação da seqüência endógena desempenha um papel fundamental no protocolo. Ela tem que atingir PCR e termociclar as condi- ções que amplificam as quantidades equimolares de ambas, a seqüência endógena e transgênica em um padrão de DNA genômico transgênico padrão. Quando o fragmento endógeno alvejado não é amplificado ou quando as seqüências alvejadas não são amplificadas com as mesmas intensidades de manchamento de brometo de etídio, como avaliadas por eletroforese de gel de agarose, a otimização das condições de PCR podem ser requeridas. DNA Padrão O DNA padrão é preparado de acordo com o método CTAB descrito por Doyle e Doyle (1987, Phytochem. Bull. 19: 11). Quando usando DNA preparado com outros métodos, um funcionamento de teste utilizando quantidades diferentes de padrão deve ser realizada. Usualmente 50 ng de DNA padrão genômico produz os melhores resultados.

Controles negativos e positivos designados Os seguintes controles negativos e positivos devem ser incluídos em um funcionamento de PCR: - Um controle de Mistura Principal (controle de DNA negativo). Isto é uma PCR em que nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o resultado esperado, nenhum produto de PCR, é observado, isto indica que o coquetel de PCR não foi contaminado com DNA alvo. - Um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico conhecida por conter as seqüências transgênicas). Amplificação bem-sucedida deste controle positivo demonstra que PCR foi determinada sob condições que permitem a amplificação das seqüências alvo. - Um controle de DNA tipo selvagem. Isto é uma PCR em que o DNA padrão fornecido é DNA genômico preparado de uma planta não-transgênica. Quando o resultado esperado, nenhuma amplificação do produto de PCR de transgene porém amplificação do produto de PCR endógeno, é observado, isto indica que não há amplificação base de transgene de-tectável em uma amostra de DNA genômico.

Iniciadores Os seguintes iniciadores, que especificamente reconhecem o transgene e uma seqüência de flanqueamento de EE-GH1 são usados: Os iniciadores alvejando uma seqüência endógena são sempre incluídos no coquetel de PCR. Estes iniciadores servem como um controle interno em amostras desconhecidas e no controle positivo de DNA. Um resultado positivo com o par de iniciador endógeno demonstra que existe um DNA amplo de qualidade adequada na preparação de DNA genômico para o produto de PCR a ser gerado. Os iniciadores endógenos usados são: GHI01: 5’-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3’ (SEQ ID NO: 17) (Gene de álcool desidrogenase Acc. NO: AF036569,1070-^1090 GHI02: 5’-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg-3’ (SEQ ID NO: 18) (Gene de álcool desidrogenase Acc. NO: AF036569, 1515-^-1495) Fragmentos amplificados Os fragmentos amplificados esperados na reação de PCR são: Para par de iniciador GHI01-GHI02: 445 bp (controle endógeno) Para par de iniciador GHI05-GHI06: 269 bp (EE-GH1 Elite Event) Condições de PCR A mistura de PCR para reações de 50 μΙ contém : 5 μΙ de DNA padrão 5 μΙ de Tampão de Amplificação 10x (fornecido com polimerase Taq) 1 μΙ de 10 mM de dNTP’s 0,5 μΙ de GHI01 (10 pmoles / μΙ) 0,5 μΙ de GHI02 (10 pmoles / μΙ) 1 μΙ de GHI05 (10 pmoles / μΙ) 1 μΙ de GHI06 (10 pmoles / μΙ) 0,2 μΙ de DNA polimerase Taq (5 unidades / μΙ) água até 50 μΙ O perfil de termociclagem a ser seguido para resultados ideais é o seguinte: 4 min. a 95°C Seguido por: 1 min. a 95°C

1 min. a 57°C 2 min. a 72°C para 5 ciclos Seguido por: 30 sec. a 92°C 30 sec. a 57°C 1 min. a 72°C Para 25 ciclos Seguido por: 5 minutos a 72°C

Análise de gel de agarose Entre 10 e 20 μΙ das amostras seriam aplicados em um gel de agarose a 1,5% (tampão de Tris-borato) com um marcador de peso molecular apropriado (por exemplo, PHARMACIA de graduação 100 bp). Validação dos resultados Os dados de amostras de DNA de planta transgênica dentro de um funcionamento de PCR simples e um coquetel de PCR simples não seria aceitável exceto 1) o controle de DNA positivo mostra os produtos de PCR esperados (fragmentos transgênicos e endógenos), 2) o controle negativo de DNA é negativo para amplificação de PCR (nenhum fragmento) e 3) o controle de DNA tipo selvagem mostra o resultado esperado (amplificação de fragmento endógeno).

As faixas mostrando quantidades visíveis dos produtos de PCR endógeno e transgênico dos tamanhos esperados, indicam que a planta correspondente da qual o DNA padrão genômico foi preparado, tem herdado o evento de elite EE-GH1. As faixas não mostrando quantidades visíveis do produto de PCR transgênico e mostrando quantidades visíveis do produto de PCR endógeno, indicam que a planta correspondente da qual o DNA padrão genômico foi preparado, não compreende o evento elite. As faixas não mostrando as quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênicos e en-dógenos, indicam que a qualidade e /ou quantidade do DNA de genômico não permitiu um produto de PCR ser gerado. Estas plantas não podem ser classificadas. A preparação de DNA de genômico seria repetida e um novo funcionamento de PCR, com os controles apropriados, tem de ser executado. Uso de protocolo de PCR discriminante para identificar EE-GH1 O material de folha de algodão de plantas compreendendo eventos transgênicos diferentes (amostras 1 a 4) foi testado de acordo com o protocolo acima descrito. As amostras de algodão tipo selvagem foram tomadas como controles negativos.

Os resultados da análise de PCR são ilustrados na Figura 1. A amostra 1 é reconhecida como compreendendo o evento elite EE-GH1. Todas as outras linhagens de teste não compreendem este evento elite. Exemplo 5: Introaressão de EE-GH1 em cultivadores preferidos O evento elite EE-GH1 é introduzido por novo cruzamento repetido nas seguintes lavouras de algodão comerciais: FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 e FM958. É observado que a introgressão do evento elite nestas lavouras não influenciam significantemente quaisquer das características agronômicas ou fenotípicas desejáveis destas lavouras (nenhuma resistência à ligação) ao mesmo tempo que a expressão do transgene, como determinado por tolerância ao glufosinato, alcança os níveis comercialmente aceitáveis. Isto confirma o estado do evento EE-GH1 como um evento elite.

Como usado nas reivindicações abaixo, exceto de outra maneira claramente indicado, o termo "planta" é pretendido para abranger tecidos de planta, em qualquer estágio de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos, ou órgãos tirados ou derivados de qualquer tal planta incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células simples, gametas, cultura de células, culturas de tecido ou protoplastos. A semente de referência compreendendo o evento elite EE-GH1 foi depositada como EE-GH1 em ATCC (10801 Uversity Blvd., Manassas, VA 20110-2209) em 26 de Abril, 2001, sob ATCC número de acesso PTA- 3343.

Como usado nas reivindicações abaixo, exceto de outra maneira claramente indicado, o termo "planta" é pretendido para abranger tecidos de planta, em qualquer estágio de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos, ou órgãos tirados ou derivados de qualquer tal planta incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células simples, gametas, células de cultura, culturas de tecido ou protoplastos. A descrição acima da invenção é pretendida para ilustrar e não limitar. Várias alterações ou modificações nas modalidades descritas, podem ocorrer por aqueles versados na técnica. Estas podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da invenção.

Claims (1)

1. Processo para produzir uma planta de algodão ou célula ou tecido ou semente de uma planta de algodão transgênica tolerante a glufosinato compreendendo um evento elite, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir uma molécula de DNA recombinante, a referida molécula de DNA recombinante compreendendo a sequência codificante do gene de resistência a bialafos {bar) de Streptomyces hygroscopicus sob controle do promotor de 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor, em uma região de DNA cromossômico de algodão compreendendo a sequência de DNA de SEQ ID NO: 5, através de cruzamento de plantas alojando o referido evento elite no genoma para introduzir o referido evento elite em outras cultivares da mesma espécie de planta, e (b) semear as sementes obtidas do referido cruzamento, e tratar as plantas em crescimento com glufosinato para obter plantas tolerantes a glufosinato compreendendo o referido evento elite, sendo que o referido evento elite compreende a referida molécula de DNA recombinante integrada no DNA cromossômico em uma região que compreende a sequência de DNA de SEQ ID NO: 5, em que a sequência da região flanqueadora 5’ e o transgene contíguo à mesma compreende a sequência de SEQ ID NO:1, e em que a sequência da região flanqueadora 3’ e o transgene contíguo à mesma compreende a sequência de SEQ ID NO:4, e sendo que as referidas plantas alojando um evento elite podem ser obtidas de sementes que foram depositadas no ATCC sob número de acesso ATCC PTA-3343.