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CN112203679A - Il-6抗体及其融合构建体和缀合物 - Google Patents

Il-6抗体及其融合构建体和缀合物 Download PDF

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CN112203679A
CN112203679A CN201980029875.5A CN201980029875A CN112203679A CN 112203679 A CN112203679 A CN 112203679A CN 201980029875 A CN201980029875 A CN 201980029875A CN 112203679 A CN112203679 A CN 112203679A
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CN
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antibody
polymer
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sequence
conjugate
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雷切尔·D·雅各布森
费尔南多·科雷亚
梁宏
D·维克多·派尔罗斯
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KO DA Pharmaceutical Co Ltd
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KO DA Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明提供了结合IL‑6的拮抗性抗体，其与VEGF Trap的融合蛋白以及它们中任何一个的缀合物，以及使用它们的方法。抗IL‑6抗体可以单独或与其他治疗剂组合使用来治疗疾病。

Description

IL-6抗体及其融合构建体和缀合物
通过引用并入任意优先权申请
在与本申请一起提交的申请数据表中标识了国外或国内优先权权利要求的任意和所有申请在此基于37 CFR§1.57通过引用并入。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以名为KDIAK044.txt的文件提供，其于2019年3月1日创建，其大小为395,430字节。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
生物样品保藏声明
在一些实施方案中，提供了抗IL-6抗体、其融合物和缀合物，根据布达佩斯条约在____日以编号____将它们保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中。
这些保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》及其实施细则(《布达佩斯条约》)的条款进行的。这样可确保自保藏之日起30年内维持该保藏。保藏将由ATCC根据《布达佩斯条约》的条款提供，并受到申请人与ATCC之间的协议的约束，这样可确保在发布相关美国专利或向公众公开任何美国或外国专利申请(以先到期者为准)后，向公众永久且不受限制地提供保藏，并确保向由美国专利和商标授权专员根据35 U.S.C.§122和《专员细则》(包括37C.F.R.§1.14)确定的人提供保藏。保藏的生物材料的可获得性不应解释为违反任何政府根据其专利法授予的权利实施发明的许可。
技术领域
本发明大体上涉及与IL-6和/或VEGF结合的融合构建体。
背景技术
血管内皮生长因子A(VEGF-A)是一种信号蛋白，介导促血管生成功能，例如内皮细胞存活、增殖、迁移和细胞-细胞通透性。已证明其活性可促进视网膜疾病的进展，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病性黄斑水肿(DME)中的脉络膜新生血管生成(CNV)。已证明抑制VEGF-A信号传导是阻止新生血管视网膜疾病进展的有效手段(Ferrara等人，Retina，2006)。已经开发出多种治疗分子来抑制VEGF功能。其中，抗VEGF单克隆抗体如雷珠单抗(Ranibizumab)和贝伐单抗已被证明是对抗病理性血管生成的安全有效的治疗方法。最近，已证明重组生产的VEGFR融合蛋白，例如起到了VEGF“trap”作用的Aflibercept(Eylea)和康柏西普(中国)，比其抗体竞争者更有效，更持久。
炎症与视网膜疾病的发病机制有关，抗炎疗法如类固醇已有效治疗葡萄膜炎和糖尿病性黄斑水肿(DME)。有关眼睛炎症和感染的详细研究表明，难治性/慢性葡萄膜炎患者的眼内液中促炎性细胞因子白介素-6(IL-6)显著升高，并且在动物模型中抑制IL-6会抑制葡萄膜炎的发作。在DME和视网膜静脉阻塞的患者中也发现了高眼内液IL-6水平。此外，在新生血管性AMD的眼睛中的Bruch膜表面上可以看到慢性炎症细胞，据报道，患有AMD的患者的血清IL-6水平升高。有趣的是，还观察到了IL-6能够刺激有缺陷的血管生成。除类风湿性关节炎等自身免疫性疾病外，抗IL-6治疗已显示可有效治疗葡萄膜炎和葡萄膜黄斑水肿。
发明内容
在一些方面，提供了与聚合物缀合的、特异性结合IL-6的分离的拮抗抗体。
在一些方面，提供了一种分离的拮抗抗体。该抗体包含重链氨基酸可变区，其包含表1A中的重链；和轻链氨基酸可变区，其包含表1B中的轻链。
在一些方面，提供了一种分离的拮抗抗体。该抗体包含：重链可变区(VH)，所述VH包含VH的VH互补决定区一(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3，其具有选自表1A中的CDR的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，所述VL包含VL的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其具有选自表1B中的CDR的氨基酸序列。
在一些方面，提供了一种结合IL-6的分离的拮抗抗体。该抗体包含基于EU编号的以下突变中的至少一种：L234A、L235A和G237A。
在一些方面，提供了一种结合IL-6的分离的拮抗抗体。该抗体包含：CDRH1，即表1A中的CDRH1；CDRH2，即表1A中的CDRH2；CDRH3，即表1A中的CDRH3；CDRL1，即表1B中的CDRL1；CDRL2，即表1B中的CDRL2；CDRL3，即表1B中的CDRL3；以下突变(EU编号)中的至少一种：L234A、L235A和G237A；以及以下突变(EU编号)中的至少一种：Q347C或L443C。
在一些方面，提供了一种融合蛋白，其包含所述分离的拮抗抗体；和VEGF结合蛋白的片段。
在一些方面，提供了一种缀合物，其包含本文所述分离的拮抗抗体中的任意一种和聚合物。聚合物与抗体共价连接。
在一些方面，提供了一种缀合物。该缀合物包含本文提供的融合蛋白和聚合物，其中聚合物与融合蛋白共价连接。
在一些方面，提供了一种分离的细胞系，其产生所述分离的拮抗抗体或所述融合蛋白。
在一些方面，提供了一种分离的核酸，其编码所述分离的拮抗抗体或所述融合蛋白。
在一些方面，提供了一种重组表达载体。该载体包含编码本文提供的这些构建体中的任意一种的核酸。
在一些方面，提供了一种宿主细胞，其包含本文提供的表达载体。
在一些方面，提供了一种生产IL-6拮抗抗体或其融合蛋白的方法。该方法包括：将重组产生分离的拮抗抗体或融合蛋白的细胞系在产生该抗体的条件下培养；并回收该抗体。
在一些方面，提供了一种药物组合物。其包含本文提供的分离的拮抗抗体或融合蛋白和/或缀合物，以及药学上可接受的载体。
在一些方面，提供了一种治疗或预防有此需要的患者的疾病的方法。该方法包括向患者施用本文提供的分离的拮抗抗体或融合蛋白和/或缀合物。
在一些方面，提供了一种治疗或预防有此需要的患者的疾病的方法。该方法包括：确定IL-6和/或VEGF活性过度活跃的患者；向该患者施用本文提供的分离的拮抗抗体或融合蛋白和/或缀合物。
在一些方面，提供了一种融合蛋白，其包含IL-6VH、IL-6VL、IL-6Fc和VEGF Trap，其中VEGF Trap以下列方式之一与IL-6融合：1)与包含IL-6VH的重链的N-末端融合；或2)在包含IL-6VH的重链的铰链区之间且在CH1结构域之后融合。
在一些方面，提供了一种分离的拮抗性IL-6抗体，其包含重链氨基酸可变区，所述重链氨基酸可变区包含具有SEQ ID NO：7-13、19-27、89、90、256-262中的至少一个的序列的重链；和轻链氨基酸可变区，所述轻链氨基酸可变区包含具有SEQ ID NO:91-93、28-30中的至少一个的序列的轻链。
在一些方面，提供了一种分离的拮抗剂IL-6抗体，该抗体包含：重链可变区(VH)，其包含3个互补决定区：VH(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3，其具有来自SEQ ID NO：256中列出的CDR的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其具有选自SEQID NO：91-93中列出的CDR的氨基酸序列。
在一些方面，提供了一种结合IL-6的分离的拮抗抗体。该抗体包含基于EU编号的以下突变中的至少一种：L234A、L235A和G237A。
在一些实施方案中，提供了一种结合IL-6的分离的拮抗抗体，并且其包含：CDRH1，即SEQ ID NO：172中的CDRH1；CDRH2，即SEQ ID NO：173中的CDRH2；CDRH3，即SEQ ID NO：174中的CDRH3；CDRL1，即SEQ ID NO：199中的CDRL1；CDRL2，即SEQ ID NO：200中的CDRL2；CDRL3，即SEQ ID NO：201中的CDRL3；以下突变(EU编号)中的至少一种：L234A、L235A和G237A；以及以下突变(EU编号)中的至少一种：Q347C或L443C。
在一些方面，提供了一种融合蛋白，其包含：本文提供的任何一种的分离的拮抗抗体(包括其片段)和VEGF Trap。
在一些方面，提供了一种缀合物，其包含：本文提供的分离的拮抗抗体中的任意一种(包括片段)；和聚合物，其中聚合物与抗体共价连接。
在一些方面，提供了一种缀合物，其包含本文提供的融合蛋白；和聚合物，其中聚合物与融合蛋白共价连接。
在一些方面，提供了VEGFR-抗IL-6双重抑制剂。该VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含抗IL 6抗体和抗VEGF trap(VEGFR1/2)的trap抗体融合物，其中该双重抑制剂包含在VEGFR序列内的至少一个点突变以减少VEGFR蛋白的裂解。
在一些方面，提供了一种蛋白质构建体，其包含：至少3个重链CDR；至少3个轻链CDR；VEGF trap序列；和接头序列，其中每个序列选自图18-25中的相应序列或选自本文的表格(包括例如0.1A、0.1B、1A、1B、0.2A和0.2B)中的相应序列。
在一些方面，提供了一种融合蛋白，其包含IL-6VH；IL-6VL；IL-6Fc；和VEGF Trap，其中融合蛋白改变HUVEC增殖。在一些实施方案中，改变HUVEC增殖即为抑制VEGF/IL6介导的增殖。
在一些方面，提供了一种融合蛋白，其包含与SEQ ID NO：263至少80％相同且与SEQ ID NO：117至少80％相同的序列，其中融合蛋白还与聚合物缀合。
在一些方面，提供了一种结合IL-6的分离的拮抗抗体。该抗体包含基于EU编号的以下突变中的至少一种：L234A、L235A和G237A。
在一些方面，提供了一种结合IL-6的分离的拮抗抗体，该抗体包含：CDRH1，即SEQID NO：172中的CDRH1；CDRH2，即SEQ ID NO：173中的CDRH2；CDRH3，即SEQ ID NO：174中的CDRH3；CDRL1，即SEQ ID NO：199中的CDRL1；CDRL2，即SEQ ID NO：200中的CDRL2；CDRL3，即SEQID NO：201中的CDRL3；以下突变(EU编号)中的至少一种：L234A、L235A和G237A；以及以下突变(EU编号)中的至少一种：Q347C或L443C。
在一些方面，所述VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含选自SEQ ID NO：7-13、89、90和/或256-262的抗IL-6重链可变区序列。
在一些方面，所述VEGFR-抗IL-6双重抑制剂的VEGF trap序列选自SEQ ID No：145、15、16或17中的至少一个。
在一些方面，所述接头序列是SEQ ID NO：18。
在一些方面，提供了抗IL-6分子的重链序列，其选自SEQ ID NO：19-27中的至少一个，或至少包括SEQ ID NO：89、90、256-262之一的序列。
在一些方面，提供了抗IL-6分子的轻链序列，其至少包含来自SEQ ID NO：76-84中的至少一个的1、2或3个轻链CDR。
在一些方面，提供了抗IL-6分子的重链序列，其至少包含来自SEQ ID NO：49-75中的至少一个的1、2或3个重链CDR。
在一些方面，提供了一种VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其包含来自SEQ ID NO：85-88中的至少一个的VEGFR-Fc序列。
在一些方面，提供了一种VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其包含SEQ ID No：7-13、145、15-17、18-84中的任意一个或多个的一个或多个序列。
在多方面的实施方案中，提供了一种VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其包含IL-6VH；IL-6VL；IL-6Fc；VEGF Trap；和接头。在一些实施方案中，IL-6VH包含来自SEQ ID NO：19-27、31-39、89、90或256-262中的任一个的IL6 VH序列的序列。在一些实施方案中，IL-6VL包含来自SEQ ID No：28-30或91-93中的任一个的IL6 VL序列的序列。在一些实施方案中，Fc包含来自SEQ ID NO：40-48中的任一个的Fc序列的序列。在一些实施方案中，VEGF Trap包含来自SEQ ID NO：145、15、16或17中的任一个的VEGF trap序列的序列。
在一些方面，提供了一种融合蛋白，其包含IL-6VH；IL-6VL；IL-6Fc；和VEGF Trap，其中所述融合蛋白改变HUVEC增殖。在一些实施方案中，改变HUVEC增殖即为抑制VEGF/IL6介导的增殖。
在一些方面，提供了一种融合蛋白，其包含与SEQ ID NO：263至少80％相同且与SEQ ID NO：117至少80％相同的序列。所述融合蛋白还与聚合物缀合。在一些实施方案中，所述融合蛋白与SEQ ID NO：263至少95％相同，并且与SEQ ID NO：117至少95％相同。在一些实施方案中，该蛋白质至少包含a)SEQ ID NO：172、173、174、199、200和201，或b)SEQ IDNO：172、173、174、199、200和/或201中的1、2或3个氨基酸的取代，其中所述取代是保守取代。
在一些方面，本文提供的任何一个的抗体包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
在一些方面，本文提供的任何一个的融合蛋白包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
在一些方面，本文提供的任何一个的缀合物包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
在一些方面，本文提供的任何一个的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
在一些方面，本文提供的任何一个的蛋白质包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
附图的简要说明
图1描绘了IL-6的序列。
图2A显示了化合物L。
图2B显示了化合物K。
图2C显示了由R3707合成OG1802。
图2D显示了OG1786。
图2E显示了从OG1550合成OG1546。
图2F显示了由OG1546和OG1563合成OG1784。
图2G显示了由OG1784合成OG1405。
图2H显示了由OG1405合成OG 1785。
图2I显示了从OG1785合成OG1786。
图2J显示了OG1801。
图2K显示了OG1802。
图2L显示了化合物E。
图3描绘了抗体选择和优化的流程图。
图4描绘了ELISA数据，其显示抗IL-6mAb与IL-6结合，但不与IL-6/IL-6R复合物结合，并且抗IL-6mAb抑制IL-6/IL-6R复合物的形成。
图5描绘了IL-6-Ab的重链可变区和轻链可变区的一些实施方案。CDR的实施方案显示在方框区域中。这些序列也可以用于IL-6Ab-VEGF Trap融合构建体中。
图6描绘了IL-6-VEGF Trap融合蛋白的一些实施方案。VEGF Trap结构域位于紧接在可变结构域之前的N末端(左)，或位于抗体的Fab区和铰链区之间(右)。
图7描绘了传感图和表格，其证明双重抑制剂分子VEGFR-抗IL-6和抗IL-6-VEGFR以与抗VEGF抗体OG1950和Eylea相似的亲和力与VEGF-A结合。因此，VEGF trap的位置不会改变其对其靶标的亲和力。
图8描绘了单独的或组合的VEGF-A和IL-6与双重抑制剂结合的传感图。将混合靶标的IL-6传感图与理论曲线(单独的IL-6和VEGF-A传感图的总和)进行比较。结果显示，理论曲线和实验曲线重叠，这定性地表明两个靶标都可以与双重抑制剂分子结合，而不会影响彼此的结合。
图9描绘了来自多种ELISA IL-6测定的OD450nm结果。在桥接ELISA中(上)，两种双重抑制剂都将btVEGF桥接至IL-6，这表明两种构型都可以与两个靶标结合。EC50 VEGFTrap-抗IL-6＝0.079nM，抗IL-6-VEGF Trap＝0.026nM。Eylea和抗IL-6用作阴性对照。图9还显示了IL-6/IL-6R复合物ELISA的结果(中)。双重抑制剂和抗IL-6在相同程度上抑制IL-6/IL-6R复合物的形成。IC50值：抗IL-6＝0.36nM，VEGFTrap-抗IL-6＝0.47nM，抗IL-6-VEGFTrap＝0.32nM。Eylea用作阴性对照。图9还显示了VEGF/VEGFR竞争性ELISA的结果(下)。双重抑制剂、Eylea和OG1950在不同程度上抑制VEGF与VEGFR的结合。Eylea和抗IL-6-VEGF Trap构建体相当(4.24nM vs.4.53nM)，而VEGF Trap-抗IL-6构建体要好约2倍(1.74nM)，OG1950具有优于其他抑制剂的最大抑制作用(1.55nM)。
图10描绘了用于制备抗体缀合物的方法的一些实施方案(其也可以应用于Ab-Trap或Trap-Ab缀合物)。尽管作为一种抗体来描述，但是本领域技术人员将理解，在本文中，图10中的Ab描述可以替换为trap融合物(如图6所示)。为了简单起见，在融合trap的语境中本文所述的通用抗体既表示作为抗体的选项又表示作为融合物配置的选项(当然，除非已将其描述为融合物)。
图11A-11B描绘了
Figure BDA0002756846400000091
Plus2标准品、抗IL-6、抗IL-6-VEGFR和VEGFR-抗IL-6的SDS-PAGE条带。图11C描绘了VEGFR-抗IL6的缀合物构建体，其是与基于磷酸胆碱的聚合物缀合的抗IL-6与抗VEGF(VEGFR1/2)的融合物。
图12描绘了转移至PVDF膜、N末端埃德曼测序的结果，其显示裂解产物具有相同的N末端序列(LTHRQT)，这表明裂解位点位于VEGF trap区。
图13A-B描绘了
Figure BDA0002756846400000092
Plus2标准品和19种VEGF trap构建体的SDS-PAGE条带。
图13C-13E描绘了VEGF_trap_变体_1、VEGF_trap_变体_2和VEGF_trap_变体_3的序列表。
图13F-13G描绘了
Figure BDA0002756846400000101
Plus2标准品和4个VEGF trap变体(包括VEGFR_变体_3，其具有双点突变T94I和H95I)的SDS-PAGE条带。
图14A-14F描绘了Biacore测定结果和对VEGF-A的亲和力的测量。
图15描绘了基于细胞的VEGF刺激的VEGFR报告子测定。
图16A描绘了对VEGF/IL6介导的人脐静脉内皮细胞(“HUVEC”)小管形成的抑制的测定。
图16B-16C描绘了小管形成测定的不同参数的统计学数据。
图17描绘了HUVEC增殖测定的结果。
图18示出了抗IL-6重链可变区序列的实施方案。CDR用下划线标出。
图19示出了VEGF trap序列的多种实施方案。序列之间变化的部分以粗体和下划线标示。
图20示出了接头(GS)序列实施方案的一些实施方案。它可以作为两个重复Gly-Gly-Gly-Gly-Ser接头(GS)出现。
图21示出了抗IL-6分子的重链序列的一些实施方案。CDR用下划线标出。图21包括图21A和图21B，其提供了所示序列内CDR的多种实施方案。
图22示出了抗IL-6分子的轻链序列的一些实施方案。CDR用下划线标出。图22包括图22A和图22B，其提供了所示序列内CDR的多种实施方案。
图23示出了抗IL-6分子的重链序列的一些实施方案。CDR用下划线标出。图23包括图23A和图23B，其提供了所示序列内CDR的多种实施方案。
图24A-24B示出了图21-23的CDR的组合的一些实施方案。
图25示出了VEGFR-Fc序列变体的一些实施方案。序列之间变化的部分以粗体和下划线标示。
图26A-26C示出了亲和力结合数据。
图27描绘了VEGFR-抗IL6序列的一些实施方案的序列。CDR(由Kabat所定义)用下划线标出。灰色部分指示VEGFR构建体。粗体文本表示接头部分。突变L234A、L235A、G237A和L443C(EU编号)用双下划线标出。这些部分的每一个都可以交换为本文提供的其他相应部分(例如，可选的接头或CDR等)。
图28描绘了VEGFR-抗IL6还原(Cys-脱帽)反应产物的SDS-PAGE。泳道如下：1.VEGFR-抗IL6；2.VEGFR-抗IL6–完全还原(TCEP)；3.Novex sharp预染蛋白标准品；4.VEGFR-抗IL6+30x TCEP，起始点；5.VEGFR-抗IL6+30x TCEP，30分钟后；6.VEGFR-抗IL6+30x TCEP，60分钟后；7.VEGFR-抗IL6TCEP处理，更换缓冲液；8.VEGFR-抗IL6+15x dHAA，起始点；9.VEGFR-抗IL6+15x dHAA，30分钟后；10.VEGFR-抗IL6+15x dHAA，60分钟后；11.脱帽的VEGFR-抗IL6；12.脱帽的VEGFR-抗IL6，完全还原(TCEP)；凝胶：NuPAGE Bis-Tris 4-12％蛋白量：4μg/泳道；30x TCEP＝30倍摩尔过量TCEP 15x dHAA ＝15倍摩尔过量dHAA。
图29描绘了VEGFR-抗IL6-OG1802缀合物CEX色谱的SDS-PAGE。非还原性凝胶：NuPAGE Bis-Tris 4-12％。缓冲液A：20mM醋酸钠，pH 5.5。缓冲液B：20mM醋酸钠pH 5.5，500mM NaCl。泳道如下：1.VEGFR-抗IL6；2.VEGFR-抗IL6-OG1802(负载)；3.Novex sharp预染蛋白标准品；4.流通；5.Chase；6.30％缓冲液B–等分试样1；7.30％缓冲液B–等分试样2；8.30％缓冲液B–等分试样3；9.30％缓冲液B-等分试样；10.40％缓冲液B–等分试样1；11.40％缓冲液B–等分试样2；12.40％缓冲液B–等分试样3；13.40％缓冲液B–等分试样4；14.60％缓冲液B–等分试样1；15.60％缓冲液B–等分试样2；16.60％缓冲液B–等分试样3；17.100％缓冲液B–strip。泳道6-13显示蛋白缀合的材料，由于尺寸大，缀合物不能穿透凝胶。泳道14-17显示可能包含聚集的、缀合的和非缀合的蛋白质材料的蛋白质混合物。
图30描绘了蛋白质-聚合物缀合物与非缀合蛋白质材料的SDS-PAGE。凝胶分析表明，将生物缀合物(泳道3)与VEGFR-抗IL6参考标准品(泳道2)进行比较时，重链和轻链条带强度比例分别为57％和96％，这表明每个VEGFR-抗IL6分子均存在一个OG1802聚合物。还原凝胶为：NuPAGE Bis-Tris 4-12％。还原凝胶为：NuPAGE Bis-Tris 4-12％。
图31描绘了VEGFR-抗IL6-OG1802的SEC-MALS。用集成尺寸排阻色谱(Shodex-SB806M-HQ)和光散射法(MALS)测定VEGFR-抗IL6缀合物的分子量。上图。色谱图显示存在单个洗脱峰。没有其他峰和肩峰，这表明在缀合和随后的CEX分离步骤后，没有聚集体和降解的物质。下图。所选峰的蛋白质缀合物分析显示，VEGFR-抗IL6-OG1802生物缀合物的实验测量平均分子量(Mw)为983kDa。该值来自一个VEGFR-抗IL6分子(Mw约189kDa)和一种OG1802聚合物(Mw约794kDa)的缀合。
图32描绘了VEGFR-抗IL6 CEX色谱的结果。凝胶：Novex 8-16％Tris-甘氨酸(还原条件)，M＝
Figure BDA0002756846400000122
Plus2标准品。泳道D12-F11对应于色谱图上指示的以不同缓冲液B浓度等分的样品。示出了完整的(I)和裂解的(C)重链。在Porus XS色谱柱中，缓冲液A为20mM磷酸钠pH 6，缓冲液B为20mM磷酸钠pH 6，1M NaCl。
图33描绘了VEGFR-抗IL6 HIC色谱的结果。凝胶：Novex 8-16％Tris-甘氨酸/还原条件，M＝
Figure BDA0002756846400000121
Plus2标准品。L＝VEGFR-抗IL6的完整形式和裂解形式的混合物(上样)。其余泳道对应于色谱图上指示的以不同缓冲液B浓度等分的样品。示出了完整的(I)和裂解的(C)重链。在Hi Trap Butly HP柱中，缓冲液A为：20mM磷酸钠pH 6，1M硫酸铵。缓冲液B为：20mM磷酸钠pH 6。
图34描绘了VEGF/VEGFR竞争性ELISA的结果。
图35描绘了IL6/IL6R复合物ELISA的结果。
图36描绘了基于细胞的VEGF刺激的VEGFR报告子测定的结果。
图37描绘了脂多糖刺激的HUVEC中的小管形成。
图38描绘了脂多糖刺激的HUVEC中的小管形成。
图39描绘了脂多糖刺激的HUVEC中的小管形成。
图40A描绘了对VEGF/IL6介导的HUVEC增殖的抑制。
图40B描绘了随着每孔细胞数量的增加对HUVEC增殖的抑制。
具体实施方式
为了直接减少驱动新生血管视网膜病症的发病机制的并发的炎症和缺陷血管生成，本文提出了设计的分子，其同时阻断促炎细胞因子IL-6和促血管生成信号蛋白VEGF的功能。这些分子由与(2)VEGF受体(VEGFR)的两个VEGF结合结构域融合的(1)抗IL-6单克隆抗体组成。抗IL-6部分特异性结合IL-6并抑制其与IL-6受体(IL-6R)的相互作用。VEGFTrap部分包括两个VEGF结合结构域(VEGFR1结构域2、VEGFR2结构域3)的融合物，它们充当VEGF trap，阻止VEGF与VEGF受体结合。另外，在一些实施方案中，这些双重抑制剂分子中的每一个在其C末端配备有未配对的半胱氨酸，其可以与延长半衰期的基于磷酸胆碱的生物聚合物缀合。
除非另有说明，否则本文提供的各种实施方案将采用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术以下文献中有充分的解释，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)。
除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：术语“分离的分子”是指这样一种分子(其中该分子是例如多肽、多核苷酸或抗体)，由于其起源或衍生来源，该分子(1)不与在其天然状态下伴随其的天然缔合组分相缔合，(2)基本上不含来自同一来源(例如物种、表达其的细胞、文库等)的其他分子，(3)由不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源系统的细胞系统中表达的分子将是与其天然缔合组分“分离的”。使用本领域公知的纯化技术，通过分离也可以使分子基本上不含天然缔合组分。分子纯度或均质性可以通过本领域众所周知的多种方法来测定。例如，可以使用本领域众所周知的技术，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色以使多肽可视化，来测定多肽样品的纯度。为了某些目的，可以通过使用HPLC或本领域熟知的其他纯化方法来提供更高的分离度。
如本文所用，除非另外指定，否则术语“IL-6”或“IL6”是指人IL-6。在一些实施方案中，还可以考虑其他形式的IL-6，并将通过具体提及其他生物来指定，例如犬、猫、马和牛。一种示例性人IL-6为UniProt收录号P05231。
本文所描述的抗IL-6抗体或其他生物制品通常以分离的形式提供。这意味着抗体通常为至少50％w/w纯的干扰蛋白和其他污染物(由于其生产或纯化而产生的)，但不排除抗体可能与旨在促进其使用的药学上可接受的赋形剂组合。有时，抗体为至少60、70、80、90、95或99％w/w纯的干扰蛋白和污染物(来自生产或纯化)。通常，抗体(或抗体缀合物)是纯化后剩余的主要大分子物质。
“抗体”是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标，例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且除非另有说明，否则还包括与完整抗体竞争特异性结合的任何抗原结合部分、包含抗原结合部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗原结合部分包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、结构域抗体(dAb，例如鲨鱼抗体和骆驼科抗体)、包括互补决定区(CDR)的片段、单链可变片段抗体(scFv)、大抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、胞内抗体(intrabody)、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv，以及包含免疫球蛋白的至少一部分的多肽，免疫球蛋白的该部分足以赋予与多肽特异性抗原结合的特性。抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且该抗体不必是任何特定类别。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白主要分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独地或组合地。如本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成，并促成了抗体的抗原结合位点的形成。如果需要主题(subject)可变区的变体，特别是在CDR区以外(即框架区中)的氨基酸残基进行取代，则可以通过将主题可变区与其他抗体的可变区进行比较来鉴定适当的氨基酸取代，优选保守氨基酸取代，这种其他抗体包含与主题可变区在同一标准(canonincal)分类中的CDR1和CDR2序列(Chothia和Lesk,J Mol Biol 196(4):901-917,1987)。
在某些实施方案中，通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来完成CDR的明确描述和鉴定包含抗体结合位点的残基。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来完成，例如X射线晶体学。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来鉴定或估计CDR区。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来鉴定或估计CDR区。这种方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、IMGT方法(Lefranc等人,2003Dev Comp Immunol.27:55-77)、计算程序例如Paratome(Kunik等人,2012,Nucl Acids Res.W521-4)、AbM定义和构象定义。
Kabat定义是用于编号抗体中残基的标准，并且通常用于鉴定CDR区。参见，例如，Johnson&Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28:214-8。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑了某些结构环区域的位置。参见，例如，Chothia等人,1986,J.Mol.Biol.,196:901-17；Chothia等人,1989,Nature,342:877-83。AbM定义使用由牛津分子集团(Oxford Molecular Group)制作的一套集成计算机程序程序，用于对抗体结构进行建模。参见，例如，Martin等人,1989,Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272；“AbMTM,AComputer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,”Oxford,UK；Oxford Molecular有限公司。AbM定义使用知识数据库和从头计算方法的组合，从一级序列建模抗体的三级结构，例如PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198中Samudrala等人,1999,“Ab Initio Protein Structure Prediction Using aCombined Hierarchical Approach”的描述。接触定义是基于对可用的复合晶体结构的分析。参见，例如，MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.,5:732-45。对于另一种方法，在本文称为CDR的“构象定义”，可以将CDR的位置鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基。参见，例如，Makabe等人,2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166。还有其他CDR边界定义可能并不严格遵循上述方法之一，但仍会与Kabat CDR的至少一部分重叠，但是它们可能根据预测或实验发现特定残基或残基组不会显著影响抗原结合，而缩短或延长。如本文所用，CDR可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。本文使用的方法可以利用根据这些方法中的任何一种定义的CDR。对于包含一个以上CDR的任何给定实施方案，可以根据Kabat、Chothia、扩展的、IMGT、Paratome、AbM和/或构象定义中的任何一种或以上的任何组合来定义CDR。
如本领域已知的，抗体的“恒定区”是指抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，单独地或组合地。
如本文所用，“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点，具有高度特异性。此外，与多克隆抗体制剂(其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler和Milstein,1975,Nature256:495描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过例如U.S.Pat.No.4,816,567中描述的重组DNA方法来制备。单克隆抗体也可以从例如使用McCafferty等人,1990,Nature348:552-554中描述的技术制备的噬菌体文库中分离。如本文所用，“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，它们是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，它们含有最少限度的衍生自非人免疫球蛋白的序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人类物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔子)的CDR的残基所替代。人源化抗体可包含在受体抗体或导入的CDR或框架序列中均不存在，但被包括在内以进一步完善和优化抗体性能的残基。
“人抗体”具有这样的氨基酸序列，其对应于由人产生的抗体的氨基酸序列，和/或已使用本文公开的任何用于制备人抗体的技术制备。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列衍生自一种物种而恒定区序列衍生自另一种物种的抗体，例如其中可变区序列衍生自小鼠抗体，而恒定区序列衍生自人抗体的抗体。术语“表位”是指能够在一个或多个抗体的抗原结合区被抗体识别并结合的分子的那部分。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链之类的分子的表面基团组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在一些实施方案中，表位可以是蛋白质表位。蛋白质表位可以是线性的或构象的。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点均沿蛋白质的一级氨基酸序列线性出现。“非线性表位”或“构象表位”包括对该表位特异性的抗体所结合的抗原蛋白质内的非连续多肽(或氨基酸)。如本文所用，术语“抗原表位”定义为抗体可以特异性结合的抗原的一部分，如通过本领域众所周知的任何方法，例如通过常规免疫测定法所确定的。一旦确定了抗原上所需的表位，就可以例如使用本说明书中描述的技术产生针对该表位的抗体。或者，在探索过程中，抗体的产生和表征可阐明有关理想表位的信息。然后，从该信息可以竞争性地筛选结合相同表位的抗体。实现此目的的一种方法是进行竞争研究和交叉竞争研究，以发现彼此竞争或彼此交叉竞争与IL-6结合的抗体，例如，竞争与抗原结合的抗体。
如本文使用的关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合部分以足够类似于第二抗体或其抗原结合部分的结合方式与表位结合，使得与不存在第二抗体的情况下第一抗体的结合相比，在存在第二抗体的情况下第一抗体与其同源表位的结合结果被可检测地降低。或者可以是这种情况：在存在第一抗体的情况下，第二抗体与其表位的结合也被可检测地降低，但并非必须如此。即，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位或配体的结合的情况下，无论程度相同、更大或更小，该抗体都被称为彼此“交叉竞争”与其各自表位的结合。本发明包括竞争性抗体和交叉竞争性抗体。无论发生这种竞争或交叉竞争的机制是什么(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其一部分结合)，基于本文提供的教导，技术人员应理解，这种竞争抗体和/或交叉竞争抗体被涵盖在内并且可用于本文公开的方法。
如本文所用，当平衡解离常数等于或小于20nM，优选小于约6nM，更优选小于约1nM，最优选小于约0.75nM时，抗体与IL-6“相互作用”。在一些实施方案中，抗体的亲和力在400至800pM之间，例如450-700或500-600pM。
IL-6拮抗抗体包括阻断、拮抗、抑制或降低(至任何程度，包括显著程度)IL-6生物学活性(例如与IL-6R结合、IL-6/IL-6R复合物与gp130结合、Stat3的磷酸化和激活、细胞增殖以及刺激IL-6介导的炎症或促血管生成途径)的抗体。为了本公开的目的，将明确地理解，术语“IL-6拮抗抗体”涵盖所有先前鉴定的术语、标题、功能状态和特征，由此IL-6本身、IL-6生物学活性或生物活性的后果，以任何有意义的程度被大大消除、减少或抵消。在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体与IL-6结合。本文提供了IL-6拮抗抗体的实例。
与表位“优先结合”或“特异性结合”(本文可互换使用)的抗体是本领域众所周知的术语，并且确定这种特异性或优先结合的方法也是本领域众所周知的。如果一个分子与特定细胞或物质的反应或缔和比与其他细胞或物质更频繁和/或更快和/或持续时间更长和/或亲和力更高，则该分子被认为表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体与靶标结合比与其他物质结合的亲和力(affinity)更高和/或亲合力(avidity)更高和/或更容易和/或持续时间更长，则该抗体与该靶标“特异性结合”或“优先结合”。例如，与一种IL-6表位特异性或优先结合的抗体是与该表位的结合比与其他IL-6表位或非IL-6表位的结合亲和力更高和/或亲合力更高和/或更容易和/或持续时间更长的抗体。通过阅读该定义还应理解，例如，与第一靶标特异性地或优先结合的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性地或优先地与第二靶标结合。这样，“特异性结合”或“优先结合”并不一定需要(尽管可以包括)排他性地结合。通常，但并非必须，提及结合是指优先结合。
如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)，更优选地至少90％纯，更优选地至少95％纯，还更优选地至少98％纯，最优选地至少99％纯的材料。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于引入多核苷酸插入物的载体的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然、偶然或故意的突变，该后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或基因组DNA补体方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
如本领域中已知的，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是通常将人IgG重链Fc区定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230至其羧基末端的延伸。Fc区中的残基编号是如Kabat.Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中的EU索引的编号。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域CH2和CH3。如本领域已知的，Fc区可以以二聚体或单体形式存在。
如本领域中所使用的，“Fc受体”和“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，其主要区别在于其胞质结构域。在Ravetch和Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel等人,1994,Immunomethods,4:25-34；和de Haas等人,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中对FcR进行了综述。“FcR”还包括新生受体FcRn，它负责母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,1976,J.Immunol.,117:587；和Kim等人,1994,J.Immunol.,24:249)。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种效应子功能。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调等。此类效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合，并且可以使用本领域已知的各种测定法来评估此类抗体效应子功能。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区，但保留了天然序列Fc区的至少一种效应子功能的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中，具有约1至约10个氨基酸取代，优选约1至约5个氨基酸取代。本文的变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的序列同一性，最优选与其具有至少约90％的序列同一性，更优选与其具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的序列同一性。
如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。
如本文所用，“IL-6和/或VEGF相关病症”包括例如眼部病症和全身性病症。眼部病症包括诸如以下的眼部病症：眼炎性疾病巩膜炎、非增生性糖尿病性视网膜病、增生性糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿的预防、增生性糖尿病性视网膜病的预防、湿性年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性的预防、干性年龄相关性黄斑变性、眼或视网膜血管的静脉、动脉或其他阻塞(伴有或不伴有视网膜水肿)、前和后葡萄膜炎、葡萄膜性黄斑水肿和眼内肿瘤。与IL-6相关的病症还包括由于IL-6与IL-6R或可溶性IL-6R(sIL-6R)相互作用而导致IL-6活性水平升高的疾病。在一些实施方案中，本文提供的任何一种或多种融合蛋白和/或本文提供的任何一种或多种缀合物可用于治疗或预防任何一种或多种与IL-6和/或VEGF相关的病症。在一些实施方案中，这些病症包括会影响眼睛的全身性疾病，例如格雷夫氏病(Grave’s disease)或视神经脊髓炎；或不影响眼睛的全身性疾病，例如多发性硬化症、类风湿关节炎。在一些实施方案中，这些病症包括CAR-T或类似的免疫肿瘤疗法后的细胞因子释放综合征。
此外，抗IL6分子可以消除用抗PD-1/PD-L1分子治疗后观察到的IL-6表达的诱导(Tsukamoto等人,Cancer Res；2018 78(17)；5011–22)。还已经显示，VEGF信号传导阻断可以改善抗PD-L1治疗(Allen等人,Sci Transl Med 2017April 12:9(385))。因此，这些双重抑制剂可以与PD-1/PDL-1调节剂和/或其他免疫检查点抑制剂联合使用，以协同治疗癌症。其他病症可能包括胶质母细胞瘤中的脑水肿，其中抗IL6疗法可能对抗VEGF治疗显示出额外的益处。其他病症包括具有实体瘤的那些。
如本文所用，“缓解”是指与不施用IL-6抗体、IL-6抗体-VEGF Trap融合物、IL-6抗体的缀合物和/或IL-6抗体-VEGF Trap融合物的缀合物相比，一种或多种症状的减轻或改善。“缓解”还包括缩短或减少症状的持续时间。
如本文所用，“VEGF Trap”或类似术语表示VEGF结合结构域(VEGFR1结构域2、VEGFR2结构域3)。该片段使蛋白质可以用作VEGF trap，从而防止VEGF与细胞学表达的VEGF受体结合。表1C中提供了此序列的实例。在一些实施方案中，VEGF Trap仅包含VEGFR1结构域2、VEGFR2结构域3。Trap蛋白的各种实施方案是本领域已知的，并且可见于例如U.S.Pub.No.20150376271，关于各种VEGF Trap实施方案(其是VEGFR蛋白或其片段)及其融合物，该专利的整体通过引用并入本文。在一些实施方案中，术语“VEGF Trap”或类似术语是指全长细胞外区域或其任何部分，或来自不同VEGF受体的可拮抗至少一种VEGF和VEGFR之间的信号传导的部分的组合。
如本文所用，“IL-6抗体-VEGF Trap融合物”、“IL-6抗体-VEGF Trap”、“Ab IL-6-VEGF Trap”、“抗IL-6-VEGF Trap”、“VEGFR-抗IL6”、“VEGFR-抗IL-6”、“VEGF Trap-抗-IL6抗体融合物(TAF)”、“VEGF Trap-IL6”、“VEGFR IL-6”、“IL6-VEGFR”或类似术语或相反术语(例如“VEGF Trap-IL-6Ab”、“VEGF Trap-IL-6抗体融合物”等)表示IL-6抗体与VEGF Trap之间的融合物。在图6中描绘了多种实施方案。一般性使用时，两个术语的顺序可以互换。当特定使用时，两个术语的顺序表示构建体中元件的相对位置。术语“Ab-Trap”、“IL-6Ab-VEGF Trap”、“Ab IL-6-VEGF Trap”或“Ab IL-6-Trap”或“抗IL-6VEGF Trap”、“Trap-Ab”、抗IL-6-VEGFR、抗IL6-VEGFR或其他类似术语或相反术语(例如“VEGF Trap-IL-6Ab”、“VEGFTrap-IL-6抗体融合物”等)表示Ab与VEGF结合蛋白的相关结构域融合以提供VEGF trap的布置方式。如上所述，VEGF结合蛋白的这一部分是防止VEGF与VEGF受体结合的部分。如本文所述，Trap和抗体部分的布置(顺序)可以改变。因此，除非另外明确地或通过上下文指示，否则本文中使用的关于Ab-Trap(或II-6/VEGF Trap等)融合物的短语表示针对抗体和Trap的位置的所有公开的实施方案。因此，除非另有说明，否则短语Ab-Trap(或Il-6/VEGF Trap等)表示图6中的左侧实施方案、图6中的右侧实施方案以及图6中的两种实施方案。因此，为了方便起见，一般性语言表示为公开所有三个选项。如果具体指出了取向，则可以例如通过陈述“布置”可以为：Trap-Ab、Trap IL-6Ab、VEGF Trab Ab IL-6、VEGF Trab Ab IL6中的一种来指出。类似地，将理解，一些本发明实施例的上下文中分子的特定取向或布置由实施例的上下文指出。对于本文提供的融合蛋白的所有讨论，明确考虑了两种布置方式(替代地和组合地)。另外，由于顺序，应理解的是，短语IL-6Ab在融合蛋白的语境中使用时，既包括抗体是连续的选项(图6左侧)，也包括TRAP位于Ab内的选项(图6右侧)。同样，术语“Ab”或“抗体”在融合蛋白语境中使用(或其他类似术语)时，涵盖所有三个选项(图6的左侧、图6的右侧和两种选项)，除非另有说明。在一些实施方案中，VEGF Trap以下列方式之一与IL-6融合：与包含IL-6VH的重链的N末端融合；或在包含IL-6VH的重链的铰链区之间且在CH1结构域之后融合。Ab、抗体、“抗”或其他类似术语的命名在名称中表示抗体或其片段时没有区别。“Il-6”或“IL6”或“IL-6”的名称之间没有区别。如本文所用，当提及具有IL-6的融合构建体时，术语“VEGF”、“VEGFR”、“VEGF Trap”、“VEGFR Trap”可互换使用。当与IL-6融合物布置分开使用时，这些术语可能具有不同的含义，这将取决于所讨论术语的语境。
如本文所用，术语“生物聚合物”表示聚合物已经与目的蛋白质连接。该术语也可以描述为蛋白质的“缀合”形式。可以对本文所述的所有蛋白质进行此操作。因此，对于本文提供的所有这样的IL-6Ab和IL-6抗体-VEGF Trap，考虑了IL-6Ab生物聚合物和IL-6抗体-VEGF Trap生物聚合物。另外，还提供了VEGF Trap生物聚合物。
如本文所用，“拮抗性抗体”表示阻断该抗体所结合的分子的一种或多种功能或活性的抗体。
如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任何一种或多种有益或期望结果的量。在更具体的方面，有效量预防、减轻或改善疾病的症状，和/或延长所治疗的受试者的存活。对于预防性用途，有益或期望结果包括消除或降低风险、减轻严重程度或延缓疾病的发作，包括疾病、其并发症以及在疾病发展过程中出现的中间病理表型的生化、组织学和/或行为症状。对于治疗用途，有益或期望结果包括诸如以下的临床结果：减轻疾病(例如AMD，包括但不限于干性AMD和湿性AMD)的一种或多种症状、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、增强另一种药物的作用和/或延缓患者AMD的进展。有效剂量可以一次或多次施用。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接地进行预防或治疗的量。如在临床情况中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以与另一种药物、化合物或药物组合物结合达到或不达到。因此，如果(与一种或多种其他剂结合)可以达到或达到了期望的结果，则在施用一种或多种治疗剂的情况下可以认为是“有效剂量”，可以认为一种单一剂以有效量被给予。
以有效方案施用抗IL-6抗体是指延迟病症发作、降低病症严重性、抑制病症进一步恶化和/或缓解病症的至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果患者已经患有病症，则该方案可以称为治疗有效方案。如果患者相对于一般群体处于高患病风险但尚未发现症状，则该方案可以被称为预防有效方案。在一些情况下，相对于同一患者的历史对照或以往经历，可以在该个体患者中观察到治疗功效或预防功效。在其它情况下，相对于未治疗患者的对照群体，可在临床前或临床试验中在经治疗的患者群体中证明治疗功效或预防功效。
以有效方案施用抗IL-6-VEGF Trap是指延迟病症发作、降低病症严重性、抑制病症进一步恶化和/或缓解病症的至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果患者已经患有病症，则该方案可以称为治疗有效方案。如果患者相对于一般群体处于高患病风险但尚未发现症状，则该方案可以被称为预防有效方案。在一些情况下，相对于同一患者的历史对照或以往经历，可以在该个体患者中观察到治疗功效或预防功效。在其它情况下，相对于未治疗患者的对照群体，可在临床前或临床试验中在经治疗的患者群体中证明治疗功效或预防功效。
物质的“生物半衰期”是药代动力学参数，它指定了将物质引入生物体后从生物体中除去一半物质所需的时间。
术语“预防(preventing或prevent)”是指(a)防止病症发生(b)延迟病症的发作或病症的症状发作，或(c)减慢现有病况的进展。除非另有说明，否则“预防”并不要求绝对禁止该事件的发生。
“个体”或“受试者”是哺乳动物或鸟类，更优选地是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物(例如牛、猪、马、鸡等)、运动动物、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠和大鼠。
如本文所用，“载体”是指能够在宿主细胞中递送并且优选地表达一种或多种目的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、封装在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞(如生产细胞)。
如本文所用，“表达控制序列”是指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。
如本文所用，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括，当与活性成分组合时，允许该成分保持生物学活性，并且与受试者的免疫系统无反应性的任何材料。实例包括但不限于任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(例如油/水乳剂)、各种类型的润湿剂、洗涤剂(例如防止聚结的聚山梨酯20)和糖(如作为防冻剂的蔗糖)。用于气雾剂或肠胃外施用的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理盐水(0.9％)。通过众所周知的常规方法配制包含此类载体的组合物(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,A.Gennaro编辑,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版.Mack Publishing,2000)。
如本文所用，术语“kon”是指抗体(或生物缀合物)与抗原缔合的速率常数。具体地，使用全长抗体和/或Fab抗体片段(即单价)和IL-6来测量速率常数(kon和koff)和平衡解离常数。
如本文所用，术语“koff”是指抗体(或生物缀合物)从抗体/抗原复合物解离的速率常数。
如本文所用，术语“KD”是指抗体-抗原(或生物缀合物-抗原)相互作用的平衡解离常数。
本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述了)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“大约X”的描述包括对“X”的描述。数字范围包括定义该范围的数字。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人类和其他受试者(包括哺乳动物)。
为了将氨基酸取代分类为保守的或非保守的，将氨基酸做如下分组：第I组(疏水性侧链)：met、ala、val、leu、ile；第II组(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；第III组(酸性侧链)：asp、glu；第IV组(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；第V组(影响链取向的残基)：gly、pro；和第VI族(芳族侧链)：trp、tyr、phe。保守取代涉及在同一种类的氨基酸之间的取代。将这些种类中一个种类的成员交换为另一个种类的成员构成非保守取代。
用通过Kabat编号惯例(用于可变区)或通过EU编号(用于恒定区)最大程度比对的抗体序列，确定序列同一性百分比。在比对之后，如果将主题抗体区(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区进行比较，则主题抗体区和参考抗体区之间的序列同一性百分比为主题抗体区和参考抗体区中相同氨基酸占据的位置数除以两个区的比对位置的总数，并乘以100以转换为百分比，其中未计数空位。其它序列的序列同一性可以通过使用算法，如威斯康星州麦迪逊市575科学博士，遗传计算机组，威斯康星遗传学软件包版本7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI)中的BESTFIT、FASTA和TFASTA，使用默认空位参数，或通过检查，和最佳比对(即，在比较窗口中产生最高序列相似性百分比)来确定。序列同一性百分比是通过以下步骤计算的：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中出现相同残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的总的位置数(即窗口尺寸)，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
术语“抗体依赖性细胞毒性”或ADCC是诱导细胞死亡的机制，其取决于包覆有抗体的靶细胞(即，具有结合的抗体的细胞)与具有细胞溶解活性的免疫细胞(也称为效应细胞)的相互作用。这种效应细胞包括自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。ADCC由与细胞结合的抗体的Fc区与免疫效应细胞(例如嗜中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞)上的Fcγ受体(特别是FcγRI和FcγRIII)之间的相互作用触发。根据介导的效应细胞类型，通过吞噬作用或细胞溶解来消除靶细胞。包覆有抗体的靶细胞的死亡是效应细胞活性的结果。
人源化抗体是基因工程抗体，其中将来自非人“供体”抗体的CDR接枝到人“受体”抗体序列中(参见例如Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539,Carter,US 6,407,213,Adair,US 5,859,205 6,881,557,Foote,US 6,881,557)。受体抗体序列可以是例如成熟人抗体序列、这些序列的复合物、人抗体序列的共有序列或胚系区(germlineregion)序列。因此，人源化抗体是一些或全部CDR完全或基本上来自供体抗体，可变区框架序列和恒定区(如果存在)完全或基本上来自人抗体序列的抗体。类似地，人源化重链的至少一个、两个、通常全部三个CDR完全或基本上来自供体抗体重链，重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在)基本上来自人重链可变区框架序列和恒定区序列。类似地，人源化轻链的至少一个、两个、通常全部三个CDR完全或基本上来自供体抗体轻链，轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在)基本上来自人轻链可变区框架序列和恒定区序列。不同于纳米抗体和dAb，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当人源化抗体中的CDR与非人抗体中的相应CDR之间至少85％、90％、95％或100％的相应残基(如Kabat所定义的)相同时，该人源化抗体中的CDR基本上来自该非人抗体中的相应CDR。当至少85％、90％、95％或100％的相应残基(由Kabat定义)相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区基本上分别来自人可变区框架序列或人恒定区。
尽管人源化抗体通常并入了来自小鼠抗体的所有六个CDR(优选由Kabat定义)，但也可以用不到所有CDR来制备抗体(Pascalis等人,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等人,Journal of Molecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi等人,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura等人,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。
嵌合抗体是其中非人抗体(例如小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链恒定区和重链恒定区组合的抗体。这样的抗体基本上或完全保留了小鼠抗体的结合特异性并且具有约三分之二的人序列。
镶饰抗体(veneered antibody)是一种人源化抗体，它保留了非人抗体的一些(通常是所有)CDR和一些非人可变区框架残基，但是用人抗体序列相应位置的残基取代了可能对B细胞或T细胞表位有贡献的其他可变区框架残基，例如暴露的残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)。结果得到这样的抗体：其中CDR完全或基本上来自非人抗体，且通过取代使非人抗体的可变区框架与人更加相似。人抗体可以从人中分离，或者由人免疫球蛋白基因的表达(例如，在转基因小鼠中、体外或通过噬菌体展示)产生。产生人抗体的方法包括以下的三源杂交瘤(trioma)方法：Oestberg等人,Hybridoma 2:361-367(1983)；Ostberg，美国专利号4,634,664；和Engleman等人，美国专利4,634,666，use oftransgenic mice including human immunoglobulin genes(参见，例如Lonberg等人,W093/12227(1993)；US 5,877,397,US 5,874,299,US 5,814,318,US 5,789,650,US 5,770,429,US 5,661,016,US 5,633,425,US 5,625,126,US 5,569,825,US 5,545,806,Nature 148,1547-1553(1994),Nature Biotechnology 14,826(1996),Kucherlapati,WO91/10741(1991))和噬菌体展示方法(参见，例如Dower等人,WO 91/17271和McCafferty等人,WO 92/01047,US 5,877,218,US 5,871,907,US 5,858,657,US 5,837,242,US 5,733,743和US 5,565,332)。
“聚合物”是由许多重复的亚基组成的分子。亚基，有时也称为“单体”，可以相同或不同。有天然和合成聚合物。DNA、蛋白质和复杂的碳水化合物是天然聚合物的实例。聚苯乙烯和聚丙烯酰胺是合成聚合物的实例。由单个单体的重复单元组成的聚合物称为均聚物。由两种或更多种单体组成的聚合物称为共聚物，有时也称为杂聚物。其中某些单体类型聚集在一起的共聚物有时称为嵌段共聚物。聚合物可以是直链或支链的。当聚合物分支时，有时将具有共同起源的聚合物链称为聚合物臂。
“引发剂”是能够用作底物的化合物，使用本文所述的单体或共聚单体(comonomer)可以在其上进行一种或多种聚合。聚合可以是常规的自由基聚合或优选地可控/“活性”自由基聚合，例如原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂-终止(RAFT)聚合或硝基氧介导的聚合(NMP)。聚合可以是“假”可控聚合，例如退化转移。适用于ATRP的引发剂包含一个或更多个不稳定键，该不稳定键可以被均裂以形成引发剂片段I(能够引发自由基聚合的基团)，以及自由基清除剂I’(其与聚合物增长链的自由基反应以可逆地终止聚合)。自由基清除剂I’通常是卤素，但也可以是有机部分，例如腈。在本发明的一些实施方案中，引发剂含有一个或多个2-溴异丁酸酯基团作为经由ATRP聚合的位点。
“化学接头”是指将两个基团(例如半衰期延长部分与蛋白质)连接在一起的化学部分。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头可以是可水解的、可酶解的、pH敏感的、光不稳定的或二硫化物接头等。其它接头包括同型双功能(homobifunctional)接头和异型双功能(heterobifunctional)接头。“连接基团”是一种官能团，它能够形成由一个或多个与生物活性剂连接的键组成的共价连接。非限制性实例包括WO2013059137的表1中所示的那些(通过引用并入本文)。
术语“反应性基团”是指在合适的反应条件下能够与另一化学基团反应以形成共价键(即，共价反应性)的基团，并且通常表示与另一种物质的连接点。反应性基团为诸如马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯的部分，它能够与不同部分上的官能团进行化学反应以形成共价键。反应性基团通常包括亲核体、亲电体和可光活化基团。
如本文所用，“磷酸胆碱”，也表示为“PC”，是指以下结构：
Figure BDA0002756846400000301
其中*表示连接点。磷酸胆碱是两性离子基团，并且包括盐(如内盐)及其质子化和脱质子化形式。
如本文所用，“基于磷酸胆碱的聚合物”是含有磷酸胆碱的聚合物。“含两性离子的聚合物”是指含有两性离子的聚合物。
含有聚(丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)的聚合物是指含有2-(丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯作为单体的聚合物。
含有聚(甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)的聚合物是指含有2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯作为单体的聚合物。
如本文所用，在聚合物的语境中，“分子量”可以表示为数均分子量或重均分子量或峰位分子量。除非另有说明，本文中所有提及的分子量是指峰位分子量。这些分子量测定，即数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和峰位分子量(Mp)的测定，可以使用尺寸排阻色谱或其它液相色谱技术测量。也可以使用测量分子量值的其它方法，例如使用端基分析或测量依数性(例如凝固点降低、沸点升高或渗透压)以确定数均分子量，或使用光散射技术、超速离心或粘度测定法来确定重均分子量。在本发明的优选实施方案中，通过SEC-MALS(尺寸排阻色谱-多角度光散射)测量分子量。本发明的聚合试剂通常是多分散的(即聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)。多分散指数(PDI)提供了一种测量聚合物在混合物中的分散性的量度。PDI由公式Mw/Mn给出。在这方面，同质蛋白的PDI为1.0(Mn与Mw相同)。通常，聚合物的PDI将高于1.0。根据本发明的聚合物优选具有相对低的多分散指数(PDI)值，例如，例如通过SEC-MALS判断，其小于约1.5。在其他实施方案中，多分散指数(PDI)更优选在约1.4至约1.2的范围内，还更优选小于约1.15，并且还更优选小于约1.10，再更优选小于约1.05，并且最优选小于约1.03。
如本文所用，“受保护的”、“受保护形式”、“保护基团”和“保护性基团”是指存在防止或阻断分子中特定化学反应性官能团在某些反应条件下的反应的基团(即保护基团)。保护基团根据所保护的化学反应基团的类型以及要使用的反应条件和分子中其他的反应性基团或保护基团的存在(如果有的话)而不同。合适的保护基团包括例如Greene等人的论文，“Protective Groups In Organic Synthesis,”第3版，John Wiley and Sons,Inc.,New York,1999中记载的那些。
如本文所用，“烷基”是指具有指定碳原子数的直链或支链的饱和脂族基团。例如，C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基包括但不限于：庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可包括任何数目的碳，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6个碳。
上文和下文中提及的与有机基团或化合物有关的术语“低级”分别定义可以为支链或非支链的化合物或基团，其具有多达且包括7个碳原子，或优选多达且包括4个碳原子，和(如非支链的)一个或两个碳原子。
如本文所用，“亚烷基”是指如上定义连接至少两个其它基团的烷基，即二价烃基。连接到亚烷基的两个部分可以连接到亚烷基的相同原子或不同原子。例如，直链亚烷基可以是-(CH2)n二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。
烷基、烯基、亚烷基、杂烷基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的取代基可以是选自但不限于以下的各种基团中的一种或多种：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-halogen、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和–NO2，其数量范围为1到(2m’+1)，其中m’是这种基团中的碳原子总数。R’、R”、R”’和R””各自独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳烷基。当R’和R”连接至相同的氮原子时，它们可以与氮原子组合形成5元环、6元环或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。
如本文所用，“烷氧基”是指烷基与氧原子连接形成基团-O-R，其中R是烷基。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可以进一步被本文所述各种取代基取代。例如，烷氧基可以被卤素取代以形成“卤代烷氧基”。
如本文所用，“羧基烷基”是指被羧基取代的烷基(如本文所定义)。术语“羧基环烷基”是指被羧基取代的环烷基(如本文所定义)。术语烷氧基烷基是指被烷氧基取代的烷基(如本文所定义)。本文使用的术语“羧基”是指羧酸及其酯。
如本文所用，“卤代烷基”是指其中一些或所有氢原子被卤素原子取代的如上定义的烷基。卤素(卤代)优选地表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟苯基等。术语“全氟”定义为所有可用的氢均被氟取代的化合物或基团。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基，全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。卤代烷基也可以称为卤取代的烷基，例如氟取代的烷基。
如本文所用，在本发明的上下文中，“细胞因子”是可在免疫反应和炎症反应中参与细胞-细胞通讯的一组蛋白信号分子的成员。细胞因子通常是质量为约8-35kDa的小的水溶性糖蛋白。
如本文所用，“环烷基”是指含约3至12、3至10、3至7或3至6个碳原子的饱和的单环或多环脂族环系统。当环烷基由两个或更多个环组成时，这些环可以通过稠环或螺环结构连接在一起。当环烷基由三个或更多个环组成时，这些环也可以连接在一起形成桥环结构。单环包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。双环和多环环包括例如双环[1.1.1]戊烷、双环[2.1.1]庚烷、降莰烷、十氢化萘和金刚烷。例如，C3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降莰烷。
如本文所用，“环内(endocyclic)”是指包含环状环结构的一部分的原子或原子组。
如本文所用，“环外(exocyclic)”是指连接但不限定环状环结构的原子或原子组。
如本文所用，“环状烷基醚”是指具有3个或4个环内碳原子和1个环内氧原子或硫原子的4元或5元环状烷基(例如，氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩)；或具有1个或2个环内氧或硫原子的6元至7元环状烷基(例如四氢吡喃、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、四氢噻喃、1,3-二噻烷、1,4-二噻烷、1,4-氧硫杂环己烷)。
如本文所用，“烯基”是指具有至少一个双键的2至6个碳原子的直链或支链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基还可以具有2至3、2至4、2至5、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6和5至6个碳。
如本文所用，“亚烯基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的烯基，即二价烃基。与亚烯基连接的两个部分可以连接到亚烯基的相同原子或不同原子。亚烯基包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、异亚丙烯基、亚丁烯基、异亚丁烯基、仲亚丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。
如本文所用，“炔基”是指具有至少一个三键的2至6个碳原子的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基还可以具有2至3、2至4、2至5、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6和5至6个碳。
如本文所用，“亚炔基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的炔基，即二价烃基。连接到亚炔基的两个部分可以连接到亚炔基的相同原子或不同原子。亚炔基包括但不限于亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚仲丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。
如本文所用，“环亚烷基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的环烷基，即二价烃基。连接到环亚烷基的两个部分可以连接到环亚烷基的相同原子或不同原子。环亚烷基包括但不限于环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基和环亚辛基。
如本文所用，“杂环烷基”是指具有3个环成员至约20个环成员和1个至约5个例如N、O和S的杂原子的环系。也可以使用其他杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂环包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吗啉代、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、二氢吲哚基、奎宁环基和1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基。
如本文所用，“杂环亚烷基”是指连接至少两个其它基团的如上所定义的杂环烷基。连接到杂环亚烷基的两个部分可以连接到杂环亚烷基的相同原子或不同原子。
如本文所用，“芳基”是指含有6至16个碳原子的单环或多环(例如稠合双环、三环或更大的)芳族环组合体。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基，优选苯基。芳基可以被一个、两个或三个基团单取代、双取代或三取代，所述基团选自烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧-C2-C3-亚烷基，所有这些基团任选地进一步被取代，例如如上文所定义；或1-萘基或2-萘基；或1-菲基或2-菲基。亚烷基二氧基是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如亚甲二氧基或亚乙二氧基。氧-C2-C3-亚烷基也是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如氧亚乙基或氧亚丙基。氧-C2-C3-亚烷基-苯基的实例为2,3-二氢苯并呋喃-5-基。
优选地，芳基为萘基、苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单取代或双取代的苯基，特别是苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或双取代的苯基，特别是苯基。
作为R的取代苯基的实例为例如4-氯苯-1-基、3,4-二氯苯-1-基、4-甲氧基苯-1-基、4-甲基苯-1-基、4-氨基甲基苯-1-基、4-甲氧基乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟乙基-(甲基)-氨基甲基苯-1-基、3-氨基甲基苯-1-基、4-N-乙酰基氨基甲基苯-1-基、4-氨基苯-1-基、3-氨基苯-1-基、2-氨基苯-1-基、4-苯基-苯-1-基、4-(咪唑-1-基)苯基、4-(咪唑-1-基甲基)苯-1-基、4-(吗啉-1-基)-苯-1-基、4-(吗啉-1-基甲基)-苯-1-基、4-(2-甲氧基乙基氨基甲基)-苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)-苯-1-基、4-(噻吩基)-苯-1-基、4-(3-噻吩基)-苯-1-基、4-(4-甲基哌嗪-1-基)-苯-1-基和杂环中任选地被取代的4-(哌啶基)-苯基和4-(吡啶基)-苯基。
如本文所用，“亚芳基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的芳基。连接到亚芳基的两个部分被连接到亚芳基的不同原子。亚芳基包括但不限于亚苯基。
如本文所用，“亚芳基-氧基”是指如上定义的亚芳基，其中与亚芳基连接的部分之一通过氧原子连接。亚芳基-氧基包括但不限于亚苯基-氧基。
类似地，芳基和杂芳基的取代基是多样的并且选自：-卤素、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R”、-SR’、-R’、-CN、-NO2、-CO2R’、-CONR’R”、-C(O)R’、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR”C(O)2R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-N3、-CH(Ph)2，全氟(C1-C4)烷氧基和全氟(C1-C4)烷基，数量范围为从0到芳族环系上的开放化合价的总数；并且其中R’、R”和R”’独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CH2)q-U-的取代基替代，其中T和U独立地为-NH-、-O-、-CH2-或单键，且q为0至2的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基替代，其中A和B独立地为-CH2-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，且r为1至3的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键代替。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CH2)s-X-(CH2)t-的取代基替代，其中s和t独立地为0-3的整数，X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。-NR’-和-S(O)2NR’-中的取代基R’选自氢或未取代的(C1-C6)烷基。
如本文所用，“杂芳基”是指包含5至16个环原子的单环或稠合双环或三环芳族环组合体，其中1至4个环原子是N、O或S的杂原子。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基或任何其它被例如烷基、硝基或卤素取代(尤其是单取代或双取代)的基团。吡啶基表示2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，有利地表示2-吡啶基或3-吡啶基。噻吩基表示2-噻吩基或3-噻吩基。喹啉基优选代表2-喹啉基、3-喹啉基或4-喹啉基。异喹啉基优选代表1-异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基。苯并吡喃基、苯并硫代吡喃基分别优选代表3-苯并吡喃基或3-苯并硫代吡喃基。噻唑基优选代表2-噻唑基或4-噻唑基，最优选代表4-噻唑基。三唑基优选为1-三唑基、2-三唑基或5-(1,2,4-三唑基)。四唑基优选为5-四唑基。
优选地，杂芳基为吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻吩基、噁唑基、吲唑基或任何被取代的(特别是单取代或二取代的)所述基团。
术语“杂烷基”是指具有1至3个例如N、O和S的杂原子的烷基。也可以使用其他杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂烷基可以包括醚、硫醚、烷基-胺和烷基-硫醇。
术语“杂亚烷基”是指连接至少两个其它基团的如上所定义的杂烷基。连接到杂亚烷基的两个部分可以连接到杂亚烷基的相同原子或不同原子。
如本文所用，“亲电体”是指一种离子或原子或原子集合，其可以是离子的，具有亲电中心，即寻找电子，能够与亲核体反应的中心。亲电体(或亲电试剂)是通过从其反应搭档(reaction partner)(亲核体)接受两个成键电子而与该反应搭档形成键的试剂。
如本文所用，“亲核体”是指一种离子或原子或原子集合，其可以是离子的，具有亲核中心，即寻求亲电中心或能够与亲电体反应的中心。亲核体(或亲核试剂)是通过提供两个成键电子与其反应搭档(亲电体)形成键的试剂。“亲核基团”是指与反应性基团反应之后的亲核体。非限制性实例包括氨基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基等。
如本文所用，“马来酰亚胺基”是指具有以下结构的吡咯-2,5-二酮-1-基：
Figure BDA0002756846400000381
其在与巯基(例如硫代烷基)反应时形成具有如下结构的-S-马来酰亚胺基：
Figure BDA0002756846400000382
其中“·”表示马来酰亚胺基团的连接点，
Figure BDA0002756846400000383
表示硫醇的硫原子与原始的含巯基基团的其余部分的连接点。
为了本发明的目的，在蛋白质和多肽中出现的“天然存在的氨基酸”为L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和/或L-缬氨酸。在蛋白质中出现的“非天然存在的氨基酸”为除了那些记载为天然存在的氨基酸以外的任何氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D异构体，以及天然存在的氨基酸的D异构体和L异构体的混合物。对于其它氨基酸，例如4-羟脯氨酸、锁链素、异锁链素、5-羟赖氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、3-甲基组氨酸，虽然其发现于天然存在的蛋白质中，但为了本发明的目的，被认为是蛋白质中出现的非天然存在的氨基酸，因为它们通常通过mRNA的核糖体翻译以外的手段引入。
如本文所用，涉及聚合物的几何形状、架构或整体结构时，“线性”是指具有单个聚合物臂的聚合物。
如本文所用，涉及聚合物的几何形状、架构或整体结构时，“支化(branched)”是指具有从包含在引发剂内的芯结构延伸的2个或更多个聚合物“臂”的聚合物。引发剂可以用于原子转移自由基聚合(ATRP)反应。支化聚合物可具有2个聚合物链(臂)、3个聚合物臂、4个聚合物臂、5个聚合物臂、6个聚合物臂、7个聚合物臂、8个聚合物臂、9个聚合物臂或更多个聚合物臂。每个聚合物臂从聚合物引发位点延伸。每个聚合物引发位点是可通过加入单体增长聚合物链的位点。例如但不限于，使用ATRP，引发剂上的聚合物引发位点通常是经历由过渡金属化合物(如卤化亚铜)催化的可逆氧化还原过程的有机卤化物。优选地，该卤化物为溴。
如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指可以包含在本发明的组合物中并且对患者没有显著不利的毒理学作用并且被FDA批准或可批准用于治疗用途(特别是在人类中)的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖等。
如本文所用，“OG1786”是用于聚合物合成的9-臂引发剂，结构如图2D所示，图2D描述了OG1786与三氟乙酸的盐形式。根据本发明，OG1786可以用作其他盐或游离碱。
如本文所用，“OG1801”是约(+/-15％)750kDa的聚合物(通过Mn或Mp)，其使用单体HEMA-PC使用OG1786作为引发剂进行ATRP合成而制备。OG1801的结构如图2J所示。
如本文所用，“OG1802”是添加了马来酰亚胺功能团的OG1801，其结构如图2K所示，其中n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9各自是整数(正数)(从0直到约3000)，使得聚合物的总分子量为(Mw)750,000±15％道尔顿。当使用术语OG1802修饰蛋白质术语(例如VEGF trap或抗IL-6抗体)时，表示该蛋白质是缀合蛋白。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在发生冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。在整篇说明书和权利要求书中，单词“包括”或诸如“包含”或“含有”的变体将被理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数形式应包括复数，复数形式应包括单数。术语“如”或“例如”之后的任何示例并不意味着穷举或限制。
短语“一种”实体是指一种或多种该实体；例如，一种化合物是指一种或多种化合物或至少一种化合物。因此，术语“一种”、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。
如本文所用，“约”是指在不同仪器、样品和样品制备物之间进行的测量中可能看到的偏差。
如本文所用，当描述时，CDR位置遵循其在可变结构域中的出现顺序。例如，重链位置可以描述为S35H或G66D。如本文所用，当描述时或当指出以EU编号时，Fc位置遵循EU编号。例如，抗体的突变可以描述为L234A或L235A，其将根据EU编号。也可以根据本文提供的特定SEQ ID或序列内的指定位置来定义位置。
多角度光散射(MALS)是分析大分子的技术，其中激光撞击在分子上，光的振荡电场在其内部引起振荡偶极子。该振荡偶极子将重新辐射光并且可以使用例如WyattminiDawn TREOS的MALS检测器来测量。辐射光的强度取决于在大分子中诱导的偶极子的大小，其反过来与大分子的极化性成比例，诱导的偶极子越大，因此散射光的强度越大。因此，为了分析来自这种大分子溶液的散射，人们应该知道它们相对于周围介质(例如溶剂)的极化性。这可以通过使用Wyatt Optilab T-rEX差示折射计测量溶液折射率n的变化Δn，与分子浓度变化Δc，通过测量dn/dc(＝Δn/Δc)值来确定。MALS测定采用的两个摩尔重量参数为数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)，其中多分散指数(PDI)等于Mw除以Mn。SEC还可以测定另一种平均分子量，峰位分子量Mp，其定义为SEC的最高峰的分子量。
PDI用作聚合物和生物缀合物的分子量分布宽度的量度，所述生物缀合物衍生自离散蛋白质与多分散生物聚合物(例如，OG1802)的缀合。对于蛋白质样品，其多分散指数接近1.0，因为它是翻译产物，其中溶液中的每个蛋白质分子预期具有几乎相同的长度和摩尔质量。相反，由于生物聚合物的多分散性质，其中聚合过程中合成了不同长度的聚合物链，因此将样品的PDI确定为其分子量窄分布的质量属性之一是非常重要的。
尺寸排阻色谱(SEC)是一种色谱技术，其中溶液中的分子根据它们的大小而分开。通常，施加水性溶液以将样品输送通过填充有各种孔径的树脂的柱。期望在分析物通过柱时，树脂对分析物呈惰性，并且分析物基于其独特的尺寸和所选柱的孔径特征而彼此分离。
将SEC与MALS或SEC/MALS偶联可提供摩尔质量和大小(均方根半径)的精确分布，而不是依赖于一组SEC校准用标准。与传统的柱校准方法相比，这种类型的布置具有许多优点。由于测量每种洗脱级分的光散射和浓度，因此可以独立于洗脱位置而确定摩尔质量和大小。这对于具有非球形大分子的物种尤其重要，例如生物聚合物(OG1802)或生物缀合物；这些物种通常不会以可能由一组柱校准标准品描述的方式洗脱。
在一些实施方案中，SEC/MALS分析包括具有Alliance 2695溶剂递送模块的Waters HPLC系统和配备有Shodex SEC-HPLC柱(7.8×300mm)的Waters 2996光电二极管阵列检测器。它与Wyatt miniDawn TREOS和Wyatt Optilab T-rEX差示折射计在线连接。Waters的Empower软件可以用于控制Waters HPLC系统，Wyatt的ASTRA V 6.1.7.16软件可用于从Wyatt miniDawn TREOS获取MALS数据，从T-rEX检测器获取dn/dc数据，并使用A280吸光度信号从Waters 2996光电二极管阵列探测器获取质量回收率数据(mass recoverydata)。SEC可以在1xPBS pH 7.4中在样品注射后以1ml/min进行，可以通过ASTRA软件分析MALS和RI信号以测定绝对摩尔质量(Mp，Mw，Mn)和多分散指数(PDI)。此外，计算还涉及聚合物和蛋白质的输入dn/dc值，分别为0.142和0.183。对于生物缀合物dn/dc值，使用下式，基于聚合物和蛋白质的加权MW计算dn/dc，为约0.148：
缀合物dn/dc＝0.142x[MW聚合物/(MW聚合物+MW蛋白)]+0.183x[MW蛋白/(MW聚合物+MW蛋白)]
当通过SEC-MALS测量的OG1802的MW聚合物约为800kDa，通过SEC-MALS测量的抗IL-6的MW蛋白约为145kDa时，通过SEC-MALS测量的生物缀合物的预期总分子量约为1000kDa。抗IL-6VEGF Trap或VEGF Trap-抗IL-6的MW蛋白为约192kDa，生物缀合物的预期总分子量为1000-1100kDa。
尽管在本文中描述了示例性的方法和材料，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。材料、方法和示例仅是说明性的，而无意于进行限制。
I.IL-6拮抗抗体、IL-6AB-VEGF TRAP和/或其缀合物
本文提供了阻断、抑制或降低(包括显著降低)IL-6生物学活性(包括由IL-6介导的下游事件)的抗IL-6抗体。在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体将具有本文提供的一个或多个CDR序列。
在一些实施方案中，分离的拮抗抗体特异性结合IL-6。
在一些实施方案中，抗体优选以抑制IL-6信号传导功能的方式与IL-6反应。在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体特异性结合灵长类动物IL-6。
可用于本发明的抗体可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异缀合抗体、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分(例如结构域抗体)的融合蛋白、人源化抗体以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型(包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体以及共价修饰的抗体)。抗体可以是鼠源、大鼠源、人源或任何其他来源的抗体(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，抗体包含表1A、1B、0.1和/或0.2或图5中所示的重链氨基酸可变区。在一些实施方案中，分离的拮抗抗体包含重链可变区(VH)，所述VH包含VH的VH互补决定区一(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3，其具有表1A、1B、0.1和/或0.2所示的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，所述VL包含VL的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其具有所述表所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体。该抗体包含重链恒定结构域，该重链恒定结构域包含降低效应子功能的一个或多个突变。在一些实施方案中，该一个或多个突变降低与补体级联有关的抗体的效应子功能，例如，补体级联的激活降低。在一些实施方案中，效应子功能的降低为至少约50％。
在一些实施方案中，提供了与IL-6特异性结合的分离的拮抗抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体包含突变L234A、L235A和G237A(基于EU编号)。在一些实施方案中，分离的拮抗抗体包含突变L234A、L235A和G237A。在一些实施方案中，具有突变的分离的拮抗抗体与FCγ受体或C1q的结合最小。在一些实施方案中，具有L234A、L235A和G237A突变的分离的拮抗抗体与FCγ受体或C1q的结合最小。在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中突变位于以下氨基酸位置(EU编号)中的一个或多个：E233、L234、L235、G236、G237、A327、A330和P331。在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中突变选自由以下组成的组：E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S和P331S。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体。重链恒定结构域还包含通过重组DNA技术引入的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，半胱氨酸残基选自由以下组成的组：Q347C和L443C(EU编号)。在一些实施方案中，半胱氨酸残基为L443C(EU编号)。
在一些实施方案中，抗体包含以下所有三个突变(EU编号)L234A、L235A和G237A，并且抗体包含L443C(EU编号)。在一些实施方案中，抗体是人IgG1，并且抗体的重链恒定结构域包含降低免疫介导的效应子功能的一个或多个突变。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗抗体，其结合人IL-6上的表位，该表位与包含表1A和1B和/或11.3中任一个或多个中的氨基酸序列的抗体所识别的表位相同或重叠。在一些实施方案中，提供了具有cys并且通过该半胱氨酸与聚合物连接的IL-6抗体(如本文的式17所示)。
在一些实施方案中，提供了一种结合IL-6的分离的拮抗抗体。在一些实施方案中，与IL-6结合的分离的拮抗抗体包含一条重链，该重链包含表1A、1B、0.1和/或0.2所示的氨基酸序列，具有或没有C末端赖氨酸；和一条轻链，该轻链包含表1A、1B、0.1和/或0.2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种结合IL-6的分离的拮抗抗体。该抗体包含VH，该VH包含表1A、1B、0.1和/或0.2中所示的氨基酸序列，或与其至少90％相同且在CDR以外的残基中具有氨基酸取代的序列。在一些实施方案中，所述抗体包含以下一种或多种：HCDR1：在图5中，HCDR2：在图5中，HCDR3：在图5中；LCDR1：在图5中，LCDR2：在图5中，LCDR3：在图5中，例如1、2、3、4、5或全部6个CDR。
在一些实施方案中，提供了一种与IL-6结合的抗体，其中该抗体包含CDRH1(其是表1A、1B、0.1和/或0.2中的CDRH1)，CDRH2(其是表1A、1B、0.1和/或0.2中的CDRH2)，CDRH3(其是表1A、1B、0.1和/或0.2中的CDRH3)，CDRL1(其是表1A、1B、0.1和/或0.2中的CDRL1)，CDRL2(其是表1A、1B、0.1和/或0.2中的CDRL2)，CDRL3(其是表1A、1B、0.1和/或0.2中的CDRL3)，以下突变中的至少一种：L234A、L235A和G237A(基于EU编号)，以及以下突变中的至少一种：Q347C或L443C(基于EU编号)。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体。所述抗体的重链可变区包含三个互补决定区(CDR)，它们包含表1A中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中抗体的轻链可变区包含三个互补决定区(CDR)，它们包含表1B中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含图5中的一个或多个已确定序列，例如，一个或多个CDR(包括2、3、4、5或6个用框标示的CDR)和/或整个重链和轻链可变区。
在一些实施方案中，分离的拮抗性抗IL-6抗体包含重链可变区(VH)，该VH包含三个CDR，这三个CDR包含表1A所示的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区(VL)包含三个CDR，这三个CDR包含表1B所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体。VH包含表1A中所示的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区包含三个CDR，这三个CDR包含表1B中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中抗体包含VL，该VL包含表1B中所示的氨基酸序列，或其变体，该变体在CDR以外的氨基酸中具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中抗体包含VH，该VH包含表1A中所示的氨基酸序列，或其变体，该变体在CDR以外的氨基酸中具有数个氨基酸取代。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗抗体，其中抗体包含重链，该重链包含表1A所示的氨基酸序列，以及C末端赖氨酸；和轻链，该轻链包含表1B所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗抗体，其中抗体包含重链，该重链包含表1A所示的氨基酸序列，不具有C末端赖氨酸；和轻链，该轻链包含表1B所示的氨基酸序列。
IL-6拮抗抗体可以通过本领域已知的任何方法来制备。生产人和小鼠抗体的通用技术是本领域已知的和/或在本文中描述。
可以使用本领域已知的方法鉴定或表征IL-6拮抗抗体，从而检测和/或测量IL-6生物活性的降低、改善或中和。在一些实施方案中，通过将候选抗体与IL-6孵育并监测与IL-6R的结合或IL-6/IL-6R与gp130的结合和/或伴随的IL-6生物学活性的降低或中和来鉴定IL-6拮抗抗体。结合测定可以用例如纯化的IL-6多肽，或用天然表达IL-6多肽的细胞(例如多种细胞株)或经转染以表达IL-6多肽的细胞进行。在一个实施方案中，结合测定是竞争性结合测定，其中评估了候选抗体与已知IL-6拮抗抗体竞争IL-6结合的能力。该测定可以以多种形式进行，包括ELISA形式。
初步鉴定后，可以通过已知用于测试目标生物活性的生物测定进一步证实和完善候选IL-6拮抗抗体的活性。在一些实施方案中，使用体外细胞测定来进一步表征候选IL-6拮抗抗体。
可以使用本领域众所周知的方法表征IL-6拮抗抗体。例如，一种方法是鉴定其结合的表位或“表位图谱(mapping)”。本领域中有许多方法可用于为蛋白质上表位的位置绘制图谱和表征蛋白质上表位的位置，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，例如Harlow和Lane,Using Antibodies,aLaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1999第11章所描述的。在另一个实例中，表位图谱可用于确定IL-6拮抗抗体所结合的序列。IL-6拮抗抗体的表位图谱可从各种来源商购获得，例如，Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219PH Lelystad,The Netherlands)。表位可以是线性表位，即包含在单个氨基酸片段中，或者可以是氨基酸的三维相互作用形成的构象性表位，其不一定包含在单个片段中。不同长度(例如，至少4-6个氨基酸长)的肽可以是分离的或合成的(例如，重组地)，并且可以与IL-6拮抗抗体一起用于结合测定。在另一个实例中，可以通过使用源自IL-6序列的重叠肽并通过IL-6拮抗抗体确定结合，在系统筛选中确定与IL-6拮抗抗体结合的表位。根据基因片段表达测定，将编码IL-6的开放阅读框随机地或通过特定的遗传构建体片段化，并确定表达的IL-6片段与待测抗体的反应性。基因片段可以例如通过PCR产生，然后在放射性氨基酸存在下体外转录并翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的IL-6片段的结合。某些表位还可以通过使用噬菌体颗粒(噬菌体库)或酵母(酵母展示)表面上展示的大型随机肽序列文库进行鉴定。或者，可以以简单结合测定测试已定义的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在另一个实例中，可以进行抗原诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定表位结合所需的、足够的和/或必需的残基。例如，可以使用突变IL-6进行丙氨酸扫描诱变实验，在突变IL-6中，IL-6多肽的多种残基已经被丙氨酸替代。通过评估抗体与突变IL-6的结合，可以评估特定IL-6残基对抗体结合的重要性。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中抗体以约0.01pM至约10nM的亲和力结合人IL-6。在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中抗体以约0.1pM至约2nM的亲和力结合人IL-6。在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中抗体以约0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000pM的亲和力结合人IL-6。
IL-6拮抗抗体对IL-6的结合亲和力(KD)可以为约0.001至约200nM。在一些实施方案中，结合亲和力是约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、约60pM、约50pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM、约2pM或约1pM中的任何一个。在一些实施方案中，结合亲和力小于约250nM、约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、约50pM、约20pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM、约0.5pM、约0.1pM、约0.05pM、约0.01pM、约0.005pM或约0.001pM中的任何一个。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中抗体在37度以至少5.0E-03的koff结合人IL-6。在一些实施方案中，koff为5E-04。在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性抗IL-6抗体，其中抗体在37度以优于5.0E-04的koff结合人IL-6。
在一些实施方案中，结合亲和力可以通过缔合常数(ka)、解离常数(kd)和达到半数最大结合能力的分析物浓度(KD)中的一项或多项来定义。在一些实施方案中，ka的范围可以从约0.50E+05至约5.00E+08。在一些实施方案中，kd的范围可以从约0.50E-06到约5.00E-03。在一些实施方案中，KD的范围可以从约0.50E-12至约0.50E-07。
在一些实施方案中，提供了包含本文公开的任何抗体的药物组合物。在一些实施方案中，提供了包含本文公开的任何缀合物的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物是液体。在一些实施方案中，药物组合物的内毒素水平小于约0.2EU/ml。在一些实施方案中，药物组合物是液体，并且内毒素水平小于约0.2EU/ml。在一些实施方案中，药物组合物是液体，并且内毒素水平小于约2.0、1、0.5、0.2EU/ml。在一些实施方案中，例如在玻璃体内注射中，内毒素极限为0.01-0.02EU/注射/眼。
一些实施方案提供了以下任何一种，或包含具有如表1A和1B中所示的部分轻链序列和部分重链序列的抗体或其变体的组合物(或药物组合物)。在表1A和1B中，带下划线的序列是本文提供的CDR序列的一些实施方案。
表1A。
表1A抗IL-6重链可变区序列。CDR用下划线标出。
Figure BDA0002756846400000481
Figure BDA0002756846400000491
表1B。抗IL-6轻链可变区序列。CDR用下划线标出。
Figure BDA0002756846400000492
在一些实施方案中，抗体不具有以下表1E(包括表1E1、表1E2和/或表1E3)CDR中的一个或多个(或任何一个)。
表1E1
Figure BDA0002756846400000501
表1E2
Figure BDA0002756846400000502
表1E3
Figure BDA0002756846400000511
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含一种抗体或其变体，该抗体具有表1A、1B、0.1和/或0.2中提供的任何选项的部分或完整的轻链序列和部分或完整的重链序列。在一些实施方案中，抗体(或其结合片段)可以包括表1A、1B、0.1和/或0.2中提供的任何一个或多个CDR。在一些实施方案中，抗体(或其结合片段)可以包括表1A、1B、0.1和/或0.2中提供的任何三个或更多个CDR。在一些实施方案中，抗体(或其结合片段)可以包括表1A、1B、0.1和/或0.2中提供的所有六个CDR。在一些实施方案中，重和/或轻链可以是本文提供的任何一种或多种其他抗体构建体，包括例如图5、18和/或21-24以及表0.1、0.2、1A和/或1E中提供的那些。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含一种抗体，该抗体具有表1A、1B、0.1和/或0.2中提供的任何选项的部分或完整的轻链CDR序列和部分或完整的重链CDR序列。
在一些实施方案中，还提供了IL-6拮抗抗体的CDR部分。CDR区的确定完全在本领域技术范围内。应当理解，在一些实施方案中，CDR可以是IMGT和Paratome CDR的组合(也称为“组合的CDR”或“延伸的CDR”)。CDR的确定完全在本领域技术范围内。在一些实施方案中，CDR是IMGT CDR。在其他实施方案中，CDR是Paratome CDR。在其他实施方案中，CDR是延伸的、AbM、构象的、Kabat或Chothia CDR。在具有一个以上CDR的实施方案中，CDR可以是IMGT、Paratome、延伸的、Kabat、Chothia、AbM，构象CDR或其组合中的任何一种。在一些实施方案中，也可以使用其他CDR定义。在一些实施方案中，仅使用上述定义的2、3、4、5、6或7个之间共有的残基(导致较短的序列)。在一些实施方案中，可以使用以上定义的2、3、4、5、6或7个中的任何残基(导致较长的序列)。
在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体包含表1A、1B、0.1和/或0.2所示的任何一个重链可变区的三个CDR。在一些实施方案中，抗体包含表1A、1B、0.1和/或0.2所示的任何一个轻链可变区的三个CDR。在一些实施方案中，抗体包含表1A中所示的任何一个重链可变区的三个CDR，和表1B中所示的任何一个轻链可变区的三个CDR。在一些实施方案中，CDR是以下表0.1(包括表0.1A和/或0.1B)或0.2(包括表0.1A和/或0.1B)中指定的一个或多个：
表0.1A抗IL-6重链CDR序列。
Figure BDA0002756846400000521
Figure BDA0002756846400000531
表0.1B抗IL-6重链CDR序列。Kabat
Figure BDA0002756846400000532
Figure BDA0002756846400000541
表0.2A抗IL-6轻链CDR序列。
Figure BDA0002756846400000542
表0.2B抗IL-6轻链CDR序列。
Figure BDA0002756846400000543
在一些实施方案中，用于结合IL-6的抗体可以是包括表1A、1B、0.1和/或0.2中的一个或多个序列的抗体。在一些实施方案中，用于结合IL-6的抗体可以是包括表1A、1B、0.1和/或0.2中的三个或更多个序列的抗体。在一些实施方案中，用于结合IL-6的抗体可以是包含表1A、1B、0.1和/或0.2中的任一个的六个序列的抗体。在一些实施方案中，与IL-6结合的抗体可以是与包含表1A、1B、0.1和/或0.2中的任一个的6个指定CDR的抗体竞争结合的抗体。
在一些实施方案中，抗体可以与VEGF Trap序列连接或融合。在一些实施方案中，该Trap序列可以如表1C所示。在一些实施方案中，该序列与表1C所示的序列至少80％相同，例如与1C所示的序列至少80、85、90、95、96、97、98、99％相同。在一些实施方案中，本文可以采用美国专利公开号20150376271中的任何VEGF Trap分子。在一些实施方案中，VEGF Trap序列以下列方式之一与IL-6融合：与包含IL-6VH的重链的N末端融合(图6左)，或在包含IL-6VH的重链的铰链区之间且在CH1结构域之后融合(图6右)。除非另外指定，否则对于本文提供的其中讨论了任何Ab-Trap融合物的实施方案，均考虑了替代方案中的两个选项以及一起使用。在一些实施方案中，术语“Trap”是指全长细胞外区域或其任何部分，或来自不同VEGF受体的部分的组合，其可以拮抗至少一种VEGF和VEGFR之间的信号传导。优选地，细胞外trap段包括来自VEGFR-1、-2或-3之一的至少一个结构域，更优选地至少两个连续的结构域，例如D2和D3。任选地，细胞外结构域包括来自至少两种不同VEGFR的至少一个结构域。优选的细胞外结构域包含或基本上由VEGFR-1的D2和VEGFR-2的D3组成。
表1C.VEGFR1结构域2和VEGFR2结构域3融合序列
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(SEQ ID NO:114)
在一些实施方案中，IL-6Ab VEGF Trap构建体可以具有表1D中提供的任何序列。在一些实施方案中，构建体可以与表1D中的序列具有至少例如80、85、90、95、96、97、98、99％或更高的同一性。在一些实施方案中，除了抗体IL-6结构域不包含表1E中的一个或多个CDR之外，融合蛋白可以符合那些百分比。在一些实施方案中，融合蛋白是包含图5中的一个或多个已确定序列的融合蛋白，例如，一个或多个CDR(包括2、3、4、5或6个用框标示的CDR)和/或整个重链和轻链可变区，以及VEGF Trap序列(例如，表1C)。在一些实施方案中，这些序列可以直接彼此融合。在一些实施方案中，可以使用一个或多个柔性连接序列或部分。连接序列可以位于Ab序列和VEGF Trap序列之间。这些序列的长度可以是5至30个氨基酸。在一些实施方案中，连接序列可以包括约4∶1比例的G和S。在一些实施方案中，接头包括以下序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：115)。在一些实施方案中，可以使用任何柔性接头。在一些实施方案中，Il-6 Ab的Fc部分是IgG1。
表1D。
双抑制剂分子的重链序列和轻链序列。CDR在重链和轻链中标有下划线，VEGFTRAP序列以黑色粗体显示，Gly-ser接头用斜体表示。
Figure BDA0002756846400000561
Figure BDA0002756846400000571
Figure BDA0002756846400000581
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为了表达本文提供的抗IL-6抗体和/或IL-6VEGF Trap，可以首先获得编码所述VH和VL区的DNA片段。也可以使用本领域技术人员已知的标准方法将各种修饰，例如突变、缺失和/或添加引入DNA序列。例如，可以使用标准方法进行诱变，例如PCR介导的诱变，其中将突变的核苷酸引入PCR引物中，使得PCR产物包含所需的突变或定点诱变。
本发明包括对本文所示的可变区的修饰。例如，本发明包括这样的抗体，所述抗体包含功能上等同的可变区和CDR(它们不会显著影响其性质)，以及具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。例如，可以使氨基酸序列突变以获得对IL-6具有期望的结合亲和力的抗体。多肽的修饰是本领域的常规实践，在此无需详细描述。修饰的多肽的实例包括具有氨基酸残基的保守取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的多肽，它们不显著有害地改变功能活性，或者使多肽对其配体的亲和力成熟(增强)，或使用化学类似物。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端融合，长度范围从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶或多肽，其增加抗体在血液循环中的半衰期。
取代变体去除了抗体分子中的至少一个氨基酸残基，并且在其位置插入了不同的残基。取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑框架区改变。保守取代显示在表0.4中的“保守取代”标题下。如果这样的取代导致生物学活性的改变，则可能引入了更实质性的改变(在表0.4中命名为“示例性取代”，或者如以下参考氨基酸类别进一步描述的)，并筛选产物。
表0.4-氨基酸取代
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抗体生物学特性的实质性修饰是通过选择取代来实现的，这些取代在维持以下性质方面作用有显著差异：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如β-折叠或螺旋构象；(b)靶位点上分子的电荷或疏水性；或(c)大部分侧链。天然存在的残基根据常见的侧链特性分为几类：
(1)非极性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)极性无电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的(带负电荷的)：Asp、Glu；
(4)碱性的(带正电荷的)：Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
通过将其中一个类别的成员替换为另一个类别来进行非保守取代。
例如，可以进行的一种取代类型是改变抗体中的一个或多个半胱氨酸，其对另一残基例如但不限于丙氨酸或丝氨酸具有化学反应性。例如，可以存在非典型(non-canonical)半胱氨酸的取代。可以在可变结构域的CDR或框架区或抗体的恒定区中进行取代。在一些实施方案中，半胱氨酸是典型的。也可以用丝氨酸(通常是)取代不参与维持抗体的恰当构型的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反，可将半胱氨酸键添加至抗体以改善其稳定性，特别是当抗体是抗体片段如Fv片段时。
也可以例如在重链和/或轻链的可变结构域中对抗体进行修饰，例如以改变抗体的结合特性。可变区的变化可以改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，在CDR结构域内进行不超过1至5个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，在CDR结构域内进行不超过1至3个保守氨基酸取代。例如，可以在一个或多个CDR区中进行突变，以增加或减少抗体对IL-6的KD、增加或减少koff或改变抗体的结合特异性。定点诱变的技术是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人和Ausubel等人，同上。
根据一方面，IL-6拮抗抗体的IgG结构域可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。根据另一方面，IgG结构域可以是复合物，其中恒定区由以上同种型中的一个以上形成(例如，来自IgG2或IgG4的CH1区，来自IgG1的铰链区、CH2和CH3区)。在选择同种型时，本领域已知人类同种型IgG1和IgG3具有补体介导的细胞毒性，而人类同种型IgG2和IgG4具有差的或没有补体介导的细胞毒性。在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体同种型是IgG1。
轻链恒定区可以是人λ或κ。在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体具有人κ轻链恒定区。
人恒定区在不同个体之间显示出同种异型变异(allotypic variation)和同族同种异型变异(isoallotypic variation)，即恒定区在一个或多个多态性位置在不同个体中可以不同。同族同种异型与同种异型的不同之处在于，识别同族同种异型的血清与一种或多种其他同种型的非多态性区域结合。提及人恒定区包括具有任何天然同种异型或占据天然同种异型中的多态性位置的残基的任何置换或多达3、5或10个取代以减少或增加效应子功能的恒定区，如下所述。
轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸，例如重链的C-末端赖氨酸，可能在一部分或全部分子中缺失或衍生化。
可以在恒定区进行取代以减少或增加效应子功能，例如补体介导的细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(参见，例如Winter等人,US专利号5,624,821；Tso等人,US专利号5,834,597；和Lazar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005,2006)或延长在人中的半衰期(参见，例如Hinton等人,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。
在一些实施方案中，本文提供的IL-6拮抗抗体包括降低补体介导的细胞毒性的一种或多种取代。取决于突变的性质，可以通过或不通过降低Fc受体结合，来实现补体介导的细胞毒性的降低。补体介导的细胞毒性降低但Fc受体降低很少或没有降低的抗体可以在不激活补体的情况下实现所需的iC3b的Fc介导的吞噬作用，这可能会导致副作用。已知降低人恒定区中补体介导的细胞毒性的示例性突变包括在位置241、264、265、270、296、297、322、329和331(通过EU编号)的突变。据报道，位置318、320和322的突变可降低小鼠抗体中的补体激活。丙氨酸是在突变恒定区占据这些位置的优选残基。已使用的一些示例性人突变包括人IgG3中的F241A、V264A、D265A、V296A、N297A、K322A和P331S，以及人IgG1中的D270A或E、N297Q、K322A、P329A和P331S(EU编号)。
在此，与其他地方一样，EU编号方案用于对抗体恒定区中的氨基酸进行编号。当在本文中提及可变区中的残基时(除非另外指定)，残基编号是根据可变结构域(或，如果指定，则为SEQ ID NO)的。在位置234、235、236和/或237的任意位置或全部位置上的取代可以降低对Fcγ受体，特别是FcγRI受体的亲和力，并且还可以降低补体结合和活化(参见，例如，US 6,624,821WO/2009/052439)。在234、235和237位的丙氨酸取代可以降低效应子功能，特别是在人IgG1的情况下。任选地，人IgG2中的234、236和/或237位被丙氨酸取代，而位置235被谷氨酰胺取代。(参见，例如，US 5,624,821)以减少Fc受体结合。增加半衰期的示例性替代包括位置250处的Gln和/或位置428处的Leu。根据本发明的一个方面，当所提供的抗IL-6抗体具有人IgG1同种型时，优选该抗体在恒定区具有至少一个突变。优选地，该突变可以降低恒定区的补体固定或激活。在本发明特别优选的方面，抗体具有在位置E233、L234、L235、G236、G237、A327、A330和P331(EU编号)的一个或多个突变。更优选地，突变构成以下中的一种或多种：E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S和P331S(EU编号)。在最优选的实施方案中，人IgG1具有以下突变L234A、L235A和G237A(通过EU编号)。
缀合物
IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap的半衰期可以通过“半衰期延长部分”或“半衰期延长基团”的连接来延长，这些术语在本文中可以互换使用，用来指与一个或多个氨基酸侧链官能团相连的一个或多个化学基团，例如-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2或一个或多个N-和/或O-聚糖结构，并且当与蛋白质/肽缀合时，可以增加这些蛋白质/肽在体内的循环半衰期。延长半衰期部分的实例包括本文所述的聚合物，特别是两性离子单体的聚合物，例如HEMA-磷酸胆碱、PEG、生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)(HAP)、透明质酸(HA)、肝素前体聚合物(HEP)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、25白蛋白、类弹性蛋白(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽、FcRn结合肽及其任意组合。
在一些实施方案中，抗体与含磷酸胆碱的聚合物缀合。在一些实施方案中，抗体与含有聚(丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)的聚合物(例如含有至少一种丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱单体，例如2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(即，2-甲基丙烯酰基-2'-三甲基磷酸乙基铵)的丙烯酸的聚合物)缀合。
在一些实施方案中，抗体和/或抗体VEGF Trap融合物与水溶性聚合物缀合，水溶性聚合物是指可溶于水的聚合物。水溶性聚合物的溶液可以透射由过滤后的相同溶液所透射的光的至少约75％，更优选至少约95％。以重量计，水溶性聚合物或其链段可以在水中至少约35％、至少约50％、约70％、约85％、约95％或100％(以干聚合物的重量计)可溶。
在一个实施方案中，半衰期延长部分可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯通过蛋白质的游离氨基与IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap缀合。与胺基靶向缀合的试剂可以随机地对赖氨酸的ε-胺基、N-末端氨基酸的α-胺基和组氨酸的δ-胺基作出反应。
然而，本发明的IL-6拮抗抗体具有许多可用于聚合物缀合的胺基。因此，聚合物与游离氨基的缀合可能负面影响抗体与表位结合的能力。
在另一个实施方案中，使用任意合适的硫醇反应性化学方法(包括但不限于马来酰亚胺化学方法)，或将聚合物酰肼或聚合物胺与事先氧化后的IL-6拮抗抗体和/或IL-6AbVEGF Trap的碳水化合物部分的偶联，将半衰期延长部分偶联至一个或多个游离SH基团。马来酰亚胺偶联的使用是本发明的特别优选的实施方案。偶联优选发生在天然存在的或通过基因工程引入的半胱氨酸处。
在一些实施方案中，通过位点定向诱变，将聚合物与引入IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap的半胱氨酸残基共价连接。在一些实施方案中，可以使用IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap的Fc部分中的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，WO 2013/093809、US7,521,541、WO 2008/020827、US 8,008,453、US 8,455,622和US2012/0213705(对于所有目的，通过引用并入本文)提供了将半胱氨酸残基引入Fc区的位点。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是针对人IgG重链的Q347C和L443C(通过Kabat的EU编号)。在一些实施方案中，通过定向诱变添加的用于随后聚合物连接的半胱氨酸是L443C。在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体与聚合物的化学计量比为1：1。换句话说，缀合物基本上由如下分子组成：每个分子包含一分子的IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap，其与一分子的聚合物缀合。在一些实施方案中，偶联可发生在一个或多个赖氨酸上。
在一些实施方案中，缀合物包含与IL-6特异性结合的分离的拮抗抗体，或IL-6AbVEGF Trap与聚合物缀合。在一些实施方案中，该聚合物包含两性离子单体。在一些实施方案中，两性离子单体是(不限于此)HEMA-磷酸胆碱、PEG、生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)(HAP)、透明质酸(HA)、肝素前体聚合物(HEP)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、25白蛋白、类弹性蛋白(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽或FcRn结合肽。在一些实施方案中，包含两性离子单体的聚合物是半衰期延长部分。
在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap可以连接半衰期延长部分。在一些实施方案中，半衰期延长部分是两性离子聚合物，但可以选择性地使用PEG或下面讨论的其他半衰期延长剂。在一些实施方案中，两性离子聚合物由具有磷酸胆碱基团的单体形成。在一些实施方案中，单体是2-(丙烯酰氧基乙基)-2′-(三甲基铵乙基)磷酸酯。在一些实施方案中，单体是2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。
在一些实施方案中，与IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap缀合的聚合物具有至少2或3个或更多个臂。一些聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个臂。在一些实施方案中，聚合物具有3、6或9个臂。在一些实施方案中，该聚合物有9个臂。在一些实施方案中，聚合物的峰位分子量在300,000至1,750,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的峰位分子量在500,000至1,000,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的峰位分子量在600,000至800,000Da之间。
在一些实施方案中，提供了拮抗性抗IL-6抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap与聚合物的缀合物。在一些实施方案中，通过尺寸排阻色谱法-多角度光散射法(以下称为“SEC-MALS”)测得，聚合物的峰位分子量在300,000至1,750,000道尔顿之间。在一些实施方案中，通过SEC-MALS测得，聚合物的峰位分子量在500,000至1,000,000道尔顿之间。在一些实施方案中，通过SEC-MALS测得，聚合物的峰位分子量在600,000至800,000道尔顿之间。
在一些实施方案中，可以将半衰期延长部分与本文提供的IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap的天然存在的半胱氨酸残基缀合。在一些实施方案中，将半衰期延长部分缀合至通过位点定向诱变添加的半胱氨酸。在一些实施方案中，通过使用重组DNA技术添加半胱氨酸，以将肽SGGGC或CAA添加到轻链或重链的C末端。在一些实施方案中，将肽添加到重链上。在一些实施方案中，通过重组DNA技术引入的半胱氨酸残基选自(EU编号)Q347C和L443C。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其具有IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap以及药学上可接受的赋形剂。
IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap(或本文提供的其他构建体)可通过重组表达产生，包括(i)通过基因工程产生重组DNA，(ii)通过例如但不限于转染、电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞中，(iii)培养转化的细胞，(iv)表达抗IL-6抗体，例如组成型或诱导表达，和(v)分离抗IL-6抗体，例如从培养基中分离或通过收获转化的细胞，以便(vi)获得纯化的抗IL-6抗体。
在一些实施方案中，提供了包含抗IL-6抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap和聚合物的缀合物(以及本文提供的其他构建体，例如生物缀合物)。抗体和/或Ab-Trap是本文公开的抗体和/或Trap中的任何一种。在一些实施方案中，该抗体是IgG。在一些实施方案中，抗体是IgA、IgE、IgD或IgM。在一些实施方案中，聚合物与巯基共价键合。在一些实施方案中，聚合物与半胱氨酸残基的巯基共价键合。在一些实施方案中，聚合物与重链上的半胱氨酸残基的巯基共价键合。在一些实施方案中，聚合物与IgG重链上的半胱氨酸残基的巯基共价键合。在一些实施方案中，抗体在第347或443位(EU编号)包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，聚合物与在347或443位(EU编号)的半胱氨酸残基的巯基共价键合。
IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap可通过在合适的原核或真核宿主系统中表达来制备，所述原核或真核宿主系统的特征在于产生药理学上可接受的抗IL-6抗体分子。真核细胞的实例是哺乳动物细胞，例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hip和HepG2。其他合适的表达系统是原核细胞(例如，具有pET/BL21表达系统的大肠杆菌)、酵母细胞(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或巴斯德毕赤酵母系统(Pichia pastoris system))和昆虫细胞。在一些实施方案中，提供了产生本文公开的任何抗体和/或Ab-Trap的分离的细胞系。在一些实施方案中，分离的细胞系选自(不限于此)CHO、k1SV、XCeed、CHOK1SV、GS-KO中的一种或多种。
在一些实施方案中，提供了编码本文公开的任何抗体和/或Ab-Trap的分离的核酸。在一些实施方案中，提供了包含所述分离的核酸的重组表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体。
各种各样的载体可用于制备IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap，并且可选自真核和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒，例如但不限于，preset、pet和pad，其中用于原核表达载体的启动子包括但不限于lac、trc、trp、recA或araBAD中的一种或多种。用于真核表达的载体的实例包括但不限于：(i)用于在酵母中表达，载体例如但不限于pAO、pPIC、pYES或pMET，使用启动子例如但不限于AOX1、GAP、GAL1或AUG1；(ii)用于在昆虫细胞中表达，载体例如但不限于pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，使用启动子例如但不限于PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh，和(iii)用于在哺乳动物细胞中表达，载体例如但不限于pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，以及在一方面衍生自病毒系统的载体，所述病毒系统例如但不限于痘苗病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒或逆转录病毒，使用启动子例如但不限于CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白。
在一些实施方案中，提供了一种生产IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap的方法。在一些实施方案中，该方法包括在产生和回收抗体的条件下，培养重组生产本文公开的任何抗体和/或Ab-Trap的细胞系。在一些实施方案中，提供了一种生产IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap的方法。在一些实施方案中，该方法包括在生产和回收抗体和/或IL-6AbVEGF Trap的条件下，培养包含编码该抗体和/或Ab-Trap的核酸的细胞系，该抗体和/或Ab-Trap包含重链和轻链，其中重链包含表1A所示的氨基酸序列，轻链包含表1B所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap的重链和轻链在单独的载体上编码。在一些实施方案中，抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap的重链和轻链在同一载体上编码。
根据本发明的另一方面，提供了用于合成两性离子聚合物-IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap缀合物的方法，所述缀合物具有一种或多种功能剂和一个或多个聚合物臂，其中每个聚合物臂具有一个或多个单体单元，其中至少一个单元具有两性离子。例如，这种方法可以具有以下步骤：
a.提供具有一个或多个单体聚合位点的引发剂和具有胺基的第一接头，其中所述引发剂是三氟乙酸盐；
b.提供一种或多种适合聚合的单体，其中至少一种单体是两性离子单体；
c.使单体与引发剂反应以形成一个或多个聚合物臂，每个臂对应于单体聚合的位点，以提供具有带有胺基的第一接头的引发剂-聚合物缀合物；
d.提供具有至少第二和第三反应性基团的第二接头；
e.将第二接头的第二和第三反应性基团中的一个与引发剂-聚合物缀合物的第一接头的胺基偶联，以提供具有一个或多个未在偶联步骤中使用的反应性基团的接头-引发剂-聚合物缀合物；和
f.将一种或多种功能剂与接头-引发剂-聚合物部分的一个或多个未反应的反应性基团偶联，以提供聚合物-功能剂缀合物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其包含与IL-6特异性结合的分离的拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap和含磷酸胆碱的聚合物。在一些实施方案中，聚合物与抗体和/或Ab-Trap共价键合。在一些实施方案中，聚合物与抗体和/或Ab-Trap非共价键合。
在一些实施方案中，提供了一种缀合物，其包含抗IL-6抗体和/或IL-6Ab VEGFTrap和含磷酸胆碱的聚合物。在一些实施方案中，聚合物在抗体可变区之外与抗体共价键合。在一些实施方案中，提供了一种缀合物，其包含抗IL-6抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap和含磷酸胆碱的聚合物。该聚合物在抗体可变区之外的半胱氨酸处与抗体共价键合。在一些实施方案中，提供了一种缀合物，其包含抗IL-6抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap和含磷酸胆碱的聚合物，其中该聚合物在抗体可变区之外的半胱氨酸处与抗体共价键合，其中所述半胱氨酸是通过重组DNA技术添加的。在缀合物的一些实施方案中，聚合物包含2-(甲基丙烯酰氧基)乙基(2-(三甲基氨基)乙基)磷酸酯(MPC)单体。
根据本发明的另一个方面，提供了一种方法，其中在聚合物合成后添加共轭基团(例如马来酰亚胺)。有时将其称为“扣合策略(snap-on strategy)”或“通用聚合物策略”。参见，例如，美国专利申请号14/916,180(公开为美国专利申请公开号20160199501)，其全部内容通过引用结合于此。在一些实施方案中，使用单个引发剂部分进行大规模聚合物合成。因此，可以开发用于扩大最佳聚合物合成的条件。然后可以通过“扣合”各种类型的接头使这类聚合物适应各种类型的功能剂。例如，如果期望将较大的功能剂与本发明的聚合物缀合，例如抗体甚至Fab片段，则可以将较长的接头序列扣合到聚合物上。相反，较小的功能剂可能需要相对较短的接头序列。
在所述方法的一些实施方案中，引发剂具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个用于聚合物引发的位点。在一些实施方案中，引发剂具有约3个、约6个或约9个用于聚合物引发的位点。
根据本发明的另一方面，第二接头具有第二、第三、第四、第五和第六反应性基团。更优选地，第二接头仅具有第二和第三反应性基团。
根据本发明的一个方面，每个聚合物臂具有约20至约2000个单体单元。优选地，每个臂具有约100至500个单体单元或约500至1000个单体单元或约1000至1500个单体单元或约1500至2000个单体单元。
根据本发明的一个方面，聚合物-官能剂缀合物的峰位分子量为约100,000至1,500,000Da。优选地，聚合物-官能剂缀合物的峰位分子量为约200,000至约300,000Da、约400,000至约600,000Da或约650,000至约850,000Da。
根据本发明的另一方面，第一接头优选为烷基、取代的烷基、亚烷基、烷氧基、羧基烷基、卤代烷基、环烷基、环烷基醚、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、环亚烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、芳基、亚芳基、亚芳基-氧基、杂芳基、氨基、酰胺基或其任何组合。更优选地，第一接头具有下式：
Figure BDA0002756846400000881
其中m为1至10。在一些实施方案中，第一个接头具有上式(式(1))，并且m为4。
在一些实施方案中，引发剂优选包括选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0002756846400000882
其中X选自由NCS、F、Cl、Br和I组成的组。更优选地，式(2)、式(3)和/或式(4)中的X为Br。
在一些实施方案中，单体选自由以下组成的组：
Figure BDA0002756846400000891
Figure BDA0002756846400000901
其中R7是H或C1-6烷基，并且t是1至6。
更优选地，单体选自由以下组成的组：2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)和2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。
最优选地，单体是2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。
第二接头部分优选包含具有以下结构的活化的酯：
Figure BDA0002756846400000902
其中R8选自由以下组成的组：
Figure BDA0002756846400000903
并且R9是
Figure BDA0002756846400000904
其中p为1至12。
在本发明更优选的实施方案中，聚合物具有9个臂，m为2-4，R9为
Figure BDA0002756846400000911
其中p为4至15。更优选地，m为4且p为12。
在一些实施方案中，可自由基聚合的单体是
Figure BDA0002756846400000912
其中R1是H或C1-6烷基，R2、R3、R4相同或不同且是H或C1-4烷基，并且X和Y相同或不同且是1-6的整数。在一些实施方案中，式(12)中，R1、R2、R3和R4各自为甲基，并且X和Y各自为2。
在一些实施方案中，可自由基聚合的单体是
Figure BDA0002756846400000921
其中R1是H或C1-6烷基，R2和R3相同或不同且是H或C1-4烷基，R4是PO4-、SO3-或CO2-，并且X和Y相同或不同且是1-6的整数。在一些实施方案中，在式(13)中，R1、R2和R3为甲基，R4为PO4-且X和Y各自为2。
在一些实施方案中，单体是
Figure BDA0002756846400000922
其中R1是H或C1-6烷基，R2、R3和R4相同或不同且是H或C1-4烷基，R5是PO4-、SO3-或CO2-，并且X和Y相同或不同且是1-6的整数。在一些实施方案中，在式(14)中，R1、R2、R3和R4为甲基，R5为PO4-，并且X和Y为2。
当聚合物要通过半胱氨酸(或其他指定的残基)缀合时，该聚合物可以直接或间接连接至该残基(例如，使用中间引发剂和/或间隔基等)。
在一些实施方案中，含磷酸胆碱的聚合物包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵)乙基磷酸酯(MPC)单体，如下所示：
Figure BDA0002756846400000931
使得聚合物包含以下重复单元：
Figure BDA0002756846400000932
其中n是自1至3000的整数，波浪线表示聚合物中单体单元之间的连接点。
在一些实施方案中，聚合物具有三个或更多个臂，或用包含三个或更多个聚合物引发位点的引发剂合成。在一些实施方案中，聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个臂，或者用包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个聚合物引发位点的引发剂合成。更优选地，聚合物具有3、6或9个臂，或者用包含3、6或9个聚合物引发位点的引发剂合成。在一些实施方案中，聚合物具有9个臂，或者用包含9个聚合物引发位点的引发剂合成。
在一些实施方案中，添加的聚合物的分子量在约300,000至约1,750,000Da(SEC-MAL)之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约500,000至约1,000,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约600,000至约900,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约750,000至约850,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约800,000至约850,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约750,000至约800,000Da之间。
在一些实施方案中，本文所描述的任意抗体和/或Ab-Trap均可进一步与聚合物缀合以形成生物缀合物。生物缀合物的分子量(总共，SEC-MAL)可在约350,000至2,000,000道尔顿之间，例如在约450,000至1,900,000道尔顿之间，在约550,000至1,800,000道尔顿之间，在约650,000至1,700,000道尔顿之间，在约750,000至1,600,000道尔顿，在约850,000至1,500,000道尔顿之间，在约900,000至1,400,000道尔顿之间，在约950,000至1,300,000道尔顿之间，在约900,000至1,000,000道尔顿之间，在约1,000,000至1,300,000道尔顿之间，在约850,000至1,300,000道尔顿之间，在约850,000至1,000,000道尔顿之间，以及在约1,000,000至1,200,000道尔顿之间。在一些实施方案中，生物缀合物的分子量在约350,000至1,900,000道尔顿之间。
在一些实施方案中，抗体和/或Ab-Trap缀合物是纯化的。在一些实施方案中，在抗体和/或Ab-Trap缀合物方面的聚合物是多分散的，即聚合物PDI不是1.0。在一些实施方案中，PDI小于1.5。在一些实施方案中，PDI小于1.4。在一些实施方案中，PDI小于1.3。在一些实施方案中，PDI小于1.2。在一些实施方案中，PDI小于1.1。在一些实施方案中，缀合物PDI等于或小于1.5。
在一些实施方案中，抗体和/或Ab-Trap缀合物具有与聚合物键合的抗IL-6免疫球蛋白G(IgG)，该聚合物包含MPC单体，其中抗IL-6重链的序列在表1A中，并且抗IL-6轻链的序列在表1B中，并且其中抗体和/或Ab-Trap仅在C442处与聚合物键合。在一些实施方案中，聚合物具有9个臂并且分子量在约600,000至约1,000,000Da之间。
在一些实施方案中，抗体和/或Ab-Trap缀合物具有与聚合物键合的抗IL-6免疫球蛋白G(IgG)，该聚合物包含MPC单体，其中抗IL-6重链的序列包括在表1A中，并且抗IL-6轻链的序列包括在表1B中，并且其中抗体仅在C443处(EU编号)与聚合物键合。在一些实施方案中，聚合物具有9个臂并且分子量在约600,000至约1,000,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物具有9个臂，并且聚合物的分子量在约600,000至约900,000Da之间。
在一些实施方案中，抗体缀合物具有以下结构：
Figure BDA0002756846400000951
其中：抗IL-6抗体的每条重链用字母H表示，抗IL-6抗体的每条轻链用字母L表示(在某些实施方式中，其可以进一步与Ab-Trap布置连接，如图6所示)；该聚合物通过C443(EU编号)的巯基与抗IL-6抗体(和/或Ab-Trap)键合，该键在一条重链上描述；PC是，
Figure BDA0002756846400000961
其中曲线表示与聚合物其余部分连接的点；其中X＝a)OR，其中R＝H、甲基、乙基、丙基、异丙基，b)H，或c)任意卤素，包括Br；并且n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9相同或不同，使得n1、n2、n3、n4、n5、n6、n6、n7、n8和n9的总和为2500±10％。在一些实施方案中，n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9相同或不同，并且是自0至3000的整数。在一些实施方案中，n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9相同或不同，并且是自0至500的整数。在一些实施方案中，X＝OR，其中R是糖、氨基烷基、以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和C1-C24烷基、不饱和C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷氧基羰基、烷氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧磺酰基、羧基、氰基和卤代烷基，包括多卤代烷基、--CO--O--R7、羰基--CCO--R7、--CO--NR8R9、--(CH2)n--COOR7、--CO--(CH)n--COOR7、--(CH2)n--NR8R9、酯、烷氧羰基、芳氧羰基，其中n是1至6的整数，其中每个R7、R8和R9分别选自由以下组成的组：氢原子、卤素原子、以下残基的单取代、多取代或未取代变体：饱和C1-C24
ú
Figure BDA0002756846400000964
摧健
Figure BDA0002756846400000963
氧基、芳氧基羰氧基、基羰氧基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷氧基羰基、烷氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧磺酰基、羧基、氰基和卤代烷基包括多卤代烷基、5元环和6元环。在一些实施方案中，式17可以是融合蛋白的一部分，其将进一步包括表1C的一些或全部序列，以制备IL-6Ab VEGF Trap融合蛋白。在一些实施方案中，图27中的融合物可以在式17中使用，其中融合物取代了所描绘的抗体。
在一些实施方案中，抗体缀合物具有以下结构：
Figure BDA0002756846400000971
其中：
抗体的每条重链用字母H表示，抗IL-6抗体的每条轻链用字母L表示(在某些实施方式中，其可以进一步与Ab-Trap布置连接，如图6所示)
聚合物通过C443(EU编号)的巯基与抗体键合，该键在一条重链上描绘；
PC是
Figure BDA0002756846400000972
其中曲线表示与聚合物其余部分连接的点，其中X＝a)OR，其中R＝H、甲基、乙基、丙基、异丙基，b)H，或c)任何卤化物，包括Br；并且
n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9相同或不同，使得n1、n2、n3、n4、n5、n6、n6、n7、n8和n9的总和为2500±15％。在一些实施方案中，n1、n2、n3、n4、n5、n6、n6、n7、n8和n9之和为约1500至约3500±10％至约20％。在一些实施方案中，图27中的融合物可以在式17中使用，其中融合物取代了所描绘的抗体。
在一些实施方案中，抗体和/或Ab-Trap缀合物存在于液体制剂中。在一些实施方案中，抗体和/或Ab-Trap缀合物与药学上可接受的载体组合。
在一些实施方案中，抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)重链的同种型是IgG1，并具有CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，轻链同种型是κ。
在一些实施方案中，抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)的IgG1结构域具有一个或多个突变来调节效应子功能，例如ADCC、ADCP和CDC。在一些实施方案中，IgG1突变会降低效应子功能。在一些实施方案中，用于效应子功能突变的氨基酸包括(EU编号)E233X、L234X、L235X、G236X、G237X、G236X、D270X、K322X、A327X、P329X、A330X、A330X、P331X和P331X，其中X是任意天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，突变包括以下中的一种或多种：E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S和P331S(EU编号)。在一些实施方案中，抗IL-6重链具有以下突变(EU编号)：L234A、L235A和G237A。在一些实施方案中，相对于天然人IgG1序列的效应子功能突变数目不超过10。在一些实施方案中，相对于天然人IgG1序列的效应子功能突变数目不超过5、4、3、2或1。在一些实施方案中，抗体(和/或IL-6Ab-VEGFTrap)的Fcγ结合力和/或补体C1q结合力降低，使得抗体引起效应子功能的能力降低。这对于眼科适应症/病症尤其有利。
在一些实施方案中，抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)包含以下氨基酸突变中的一种或多种：L234A、L235A、G237A和L443C(EU编号，或SEQ ID NO：170中的451A、452A和454A，和660C，如图27中双下划线所示)。
在一些实施方案中，抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab VEGFTrap)是人免疫球蛋白G(IgG1)或其一部分。
在一些实施方案中，IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)包含重链恒定结构域，该重链恒定结构域包含降低免疫介导的效应子功能的一种或多种突变。
在一些实施方案中，抗IL-6重链具有通过重组DNA技术作为突变添加的半胱氨酸残基，其可用于缀合半衰期延长部分。在一些实施方案中，突变为Q347C(EU编号)和/或L443C(EU编号)。在一些实施方案中，突变为L443C(EU编号)。在一些实施方案中，抗体与聚合物的化学计量比为1：1；换句话说，缀合物的一个抗体分子与一个聚合物分子缀合。
抗IL-6抗体的半衰期可以通过连接“半衰期延长部分”或“半衰期延长基团”来延长。半衰期延长部分包括可以与所讨论的生物学药物一起在框内表达的(或根据情况化学缀合的)肽和蛋白质，和可以与一个或多个氨基酸侧链或末端官能团(例如-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2，或一种或多种N-和/或O-聚糖结构)连接或缀合的各种聚合物。半衰期延长部分通常起到增加生物学药物的体内循环半衰期的作用。
肽/蛋白质半衰期延长部分的实例包括Fc融合(Capon DJ,Chamow SM,MordentiJ,等人Designing CD4 immunoadhesions for AIDS therapy.Nature.1989.337:525-31)、人血清白蛋白(HAS)融合(Yeh P,Landais D,Lemaitre M,等人Design of yeast-secretedalbumin derivatives for human therapy:biological and antiviral properties ofa serum albumin-CD4 genetic conjugate.Proc Natl Acad Sci USA.1992.89:1904-08)、羧基末端肽(CTP)融合(Fares FA,Suganuma N.Nishimori K,等人Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionicgonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit.Proc Natl Acad SciUSA.1992.89:4304-08)、非精确重复肽序列(XTEN)融合的遗传融合(Schellenberger V,Wang CW,Geething NC,等人A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner.Nat Biotechnol.2009.27:1186-90)、弹性蛋白样肽(ELP化)(MCpherson DT,Morrow C,Minehan DS,等人Productionand purification of a recombinant elastomeric polypeptide,G(VPGVG19-VPGV,fromEscheriachia coli.Biotechnol Prog.1992.8:347-52)、人转铁蛋白融合(Prior CP,LaiC-H,Sadehghi H等人Modified transferrin fusion proteins.专利WO2004/020405.2004)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS化)(Skerra A,Theobald I,SchlapskyM.Biological active proteins having increased in vivo and/or vitro stability.专利WO2008/155134A1.2008)、同型氨基酸聚合物(HAP化)(Schlapschy M,Theobald I,Mack H,等人Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amiNO：acidpolymer:effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life.Protein Eng Des Sel.2007.20:273-84)和明胶样蛋白(GLK)融合(Huang Y-S,WenX-F,Zaro JL,等人Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating-factor by fusion with gelatin-like protein polymer.EurJ.Pharm Biopharm.2010.72:435-41)。
聚合物半衰期延长部分的实例包括聚乙二醇(PEG)、支化PEG、
Figure BDA0002756846400001001
(Warwick Effect Polymers；Coventry、UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟乙基淀粉(HES)、羟烷基淀粉(HAS)、碳水化合物、多糖、普鲁兰多糖(pullulane)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基甲酰胺)(PHF)、两性离子聚合物、含磷酸胆碱的聚合物和包括MPC、聚(Glyx-Sery)、透明质酸(HA)、肝素前体(Heparosan)聚合物(HEP)、Fleximer、葡聚糖和聚唾液酸(PSA)的聚合物。
在一个实施方案中，半衰期延长部分可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯通过蛋白质的游离氨基与抗体缀合。与胺基靶向缀合的试剂可以随机地对赖氨酸的ε-胺基、N-末端氨基酸的α-胺基和组氨酸的δ-胺基作出反应。
然而，本文公开的抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)可具有许多可用于聚合物缀合的胺基。因此，聚合物与游离氨基的缀合可能负面影响抗体蛋白与IL-6(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)结合的能力。
在一些实施方案中，使用任意合适的硫醇反应性化学方法(包括但不限于马来酰亚胺化学方法)，或将聚合物酰肼或聚合物胺与事先氧化后的抗体的碳水化合物部分的偶联，将半衰期延长部分偶联至一个或多个游离SH基团。在一些实施方案中，使用马来酰亚胺偶联。在一些实施方案中，偶联发生在天然存在的或通过基因工程引入的半胱氨酸处。
在一些实施方案中，提供了抗体和用作半衰期延长剂的高MW聚合物的缀合物。在一些实施方案中，缀合物包含与两性离子聚合物偶联的抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)，其中所述聚合物由一种或多种单体单元形成，并且其中至少一种单体单元具有两性离子基团。在一些实施方案中，两性离子基团是磷酸胆碱。
在一些实施方案中，单体单元之一是HEMA-PC。在一些实施方案中，聚合物由单一单体合成，所述单体是HEMA-PC。
在一些实施方案中，一些抗体(和/或IL-6Ab VEGFTrap)缀合物具有2、3或更多个聚合物臂，其中单体是HEMA-PC。在一些实施方案中，缀合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个聚合物臂，其中单体是HEMA-PC。在一些实施方案中，缀合物具有3、6或9个臂。在一些实施方案中，缀合物具有9个臂。
在一些实施方案中，聚合物-抗体(和/或聚合物-IL-6Ab-VEGFTrap)缀合物的聚合物部分的分子量在100,000和1,500,000Da之间。在一些实施方案中，缀合物的聚合物部分的分子量在500,000和1,000,000Da之间。在一些实施方案中，缀合物的聚合物部分的分子量在600,000和800,000Da之间。在一些实施方案中，缀合物的聚合物部分的分子量在600,000和850,000Da之间并且具有9个臂。当考虑与聚合物缀合的抗体的分子量时，分子量将是蛋白质的分子量(包括与其缔合的任意碳水化合物部分)与聚合物的分子量的加和。
在一些实施方案中，抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab VEGF Trap)具有HEMA-PC聚合物，由Mw测量的所述HEMA-PC聚合物分子量在约100kDa和1650kDa之间。在一些实施方案中，由Mw测量的聚合物的分子量在约500kDa和1000kDa之间。在一些实施方案中，由Mw测量的聚合物的分子量在约600kDa至约900kDa之间。在一些实施方案中，由Mw测量的聚合物的分子量为750或800kDa±15％。
在一些实施方案中，聚合物由具有一个或多个聚合物引发位点的、适合于ATRP的引发剂制备。在一些实施方案中，聚合物引发位点具有2-溴异丁酸酯位点。在一些实施方案中，引发剂具有3个或更多个聚合物引发位点。在一些实施方案中，引发剂具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个聚合物引发位点。在一些实施方案中，引发剂具有3、6或9个聚合物引发位点。在一些实施方案中，引发剂具有9个聚合物引发位点。在一些实施方案中，引发剂是OG1786。
抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)可以通过重组表达制备，包括(i)通过基因工程产生重组DNA，(ii)通过例如但不限于转染、电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞中，(iii)培养转化的细胞，(iv)表达抗体，例如组成型或诱导表达，和(v)分离抗体，例如从培养基中分离或通过收获转化的细胞，以便(vi)获得纯化的抗体。
抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)可以通过在合适的原核或真核宿主系统中表达来制备，所述原核或真核宿主系统的特征在于产生药理学上可接受的抗体分子。真核细胞的实例是哺乳动物细胞，例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hip和HepG2。其他合适的表达系统是原核细胞(例如，具有pET/BL21表达系统的大肠杆菌)、酵母细胞(酿酒酵母和/或巴斯德毕赤酵母系统)和昆虫细胞。
多种载体可用于制备本文公开的抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)，并选自真核表达载体和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒，例如但不限于，preset、pet和pad，其中用于原核表达载体的启动子包括但不限于lac、trc、trp、recA或araBAD中的一种或多种。用于真核表达的载体的实例包括：(i)用于在酵母中表达，载体例如但不限于pAO、pPIC、pYES或pMET，使用启动子例如但不限于AOX1、GAP、GAL1或AUG1；(ii)用于在昆虫细胞中表达，载体例如但不限于pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，使用启动子例如但不限于PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh，和(iii)用于在哺乳动物细胞中表达，载体例如但不限于pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，以及在一方面衍生自病毒系统的载体，所述病毒系统例如但不限于痘苗病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒或逆转录病毒，使用启动子例如但不限于CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白。
在一些实施方案中，每个蛋白质至少有一个聚合物。在一些实施方案中，蛋白质与聚合物的比例为1：4至1：6。在一些实施方案中，蛋白质(Ab)与聚合物的比例为1：5摩尔比。在一些实施方案中，蛋白质的量为5、4、3、2或约2.4mg/ml。
在一些实施方案中，聚合物和抗体组合后的纯化进一步包括阳离子交换柱。
在一些实施方案中，由于聚合物本身的存在，与IL-6拮抗抗体和/或IL-6Ab VEGFTrap相连的聚合物的存在可以提供更高的效价。在一些实施方案中，当与肝素结合结构域结合使用时，聚合物的存在(例如在VEGF中)会产生具有更高效价的共轭分子。在一些实施方案中，如以下实施例中提供的HUVEC数据所示，该分子在血管生成方面是优越的。在一些实施方案中，这是共轭分子性质上的差异，而不仅仅是程度的差异(例如，将缀合物与未缀合的分子进行比较)。此外，如在以下实施例中的HUVEC增殖测定所示，在一些实施方案中，聚合物的存在提供了协同抑制作用。
另外，在一些实施方案中，随着细胞密度增加(例如，从4,000增加到6,000)，缀合物的效价也可以提高。
在一些实施方案中，使用的缀合物的量(以蛋白质重量计)大于50mg/ml。它可以是例如55、60、65、70或更高的mg/ml(以预缀合蛋白的重量计)。
蛋白质与聚合物的缀合方法
在一些实施方案中，提供了制备治疗性蛋白质-半衰期延长部分缀合物的方法，其具有以下步骤：将治疗性蛋白质与半衰期延长部分缀合以提供治疗性蛋白质-半衰期延长部分缀合物，所述治疗性蛋白质具有通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基，所述半衰期延长部分具有选自由以下组成的组的巯基特异性反应基团：马来酰亚胺、乙烯基砜、邻二硫吡啶和碘乙酰胺。
在一些实施方案中，提供了制备抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)缀合物的方法。如图10所示，该方法包括用30倍摩尔过量的TCEP还原剂还原蛋白质(图10)。还原后，将抗体氧化以产生脱帽的抗体，其中抗体中天然存在的轻链和重链链间和链内二硫键形成，但重链位置L443C(EU编号)上的工程化半胱氨酸仍然保持脱帽(图10)。然后通过添加赋形剂并添加2-10倍摩尔过量的马来酰亚胺生物聚合物来缀合抗体。(图10)。生物聚合物通过共价硫醚键连接到抗体(图10)。缀合后，纯化抗体缀合物，去除未缀合的抗体和聚合物(图10)。在蛋白质是Ab-Trap的实施方案中，可以使用抗体上的相同位置并且采用相同的方法。
上述蛋白质和方法也可以变化。因此，在一些实施方案中，提供了制备缀合蛋白(其不必是抗体或抗IL-6抗体)的方法。该方法包括还原蛋白质中的一个或多个半胱氨酸以在溶液中形成脱帽蛋白质。在将所述一个或多个半胱氨酸还原后，将脱帽蛋白质再氧化以恢复还原蛋白质中的至少一个二硫键，同时确保蛋白质中的工程化半胱氨酸残基保持游离硫醇形式以在溶液中形成再氧化的脱帽蛋白质。然后向溶液中加入至少一种赋形剂。赋形剂减少聚合物诱导的蛋白质沉淀。在添加赋形剂后，将聚合物添加到溶液中，其在工程化半胱氨酸残基处与再氧化的脱帽蛋白缀合以形成缀合蛋白。
在一些实施方案中，摩尔过量的还原剂可以改为起作用的任意量。在一些实施方案中，可以使用10、20、30、40、50、60、70、80、90倍摩尔过量的还原剂(不必所有实施方案都是TCEP)。在一些实施方案中，还原剂可以是3,3',3”-膦三基三(苯-1-磺酸)三钠(TPPTS)。在一些实施方案中，可以使用任意抗体(治疗性或其他)。在一些实施方案中，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍摩尔过量的马来酰亚胺生物聚合物。在一些实施方案中，存在对于聚合物而言过量的脱帽蛋白。在一些实施方案中，还原蛋白质的量小于聚合物的量。在一些实施方案中，还原蛋白的量为聚合物的量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％。在一些实施方案中，使用的聚合物是蛋白质的10-15倍。在一些实施方案中，还原抗体的量大于聚合物的量。在一些实施方案中，聚合物的量大于还原抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)的量。
在一些实施方案中，纯化步骤是任选的。
在一些实施方案中，制备抗体缀合物(和/或Ab-Trap)的方法包括将抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)与含磷酸胆碱的聚合物缀合。在一些实施方案中，所述方法包括将抗IL-6抗体与含磷酸胆碱的聚合物缀合的步骤。抗IL-6抗体包含通过重组DNA技术添加的氨基酸残基。在一些实施方案中，所添加的氨基酸残基是半胱氨酸残基。在一些实施方案中，将半胱氨酸残基添加到抗体的可变区之外。可以将半胱氨酸残基添加到抗体的重链或轻链中。
在一些实施方案中，聚合物包含含磷酸胆碱的聚合物或由其组成。在一些实施方案中，含磷酸胆碱的聚合物包含选自由以下组成的组的巯基特异性反应基团：马来酰亚胺、乙烯基砜、邻二硫吡啶和碘乙酰胺。在一些实施方案中，含磷酸胆碱的聚合物上的巯基特异性反应基团与抗IL-6抗体上的半胱氨酸残基反应以制备抗体(和/或IL-6Ab VEGF Trap)缀合物。
在一些实施方案中，待缀合的蛋白质可以是抗体、抗体蛋白质融合物(例如IL-6Ab-VEGF Trap)或其结合片段。在一些实施方案中，蛋白质不是抗体，而是酶、配体、受体或其他蛋白质或其突变体或变体。在一些实施方案中，天然蛋白质含有至少一个二硫键和至少一个非天然半胱氨酸。
在一些实施方案中，赋形剂可以是酸或碱。在一些实施方案中，赋形剂是去污剂、糖或带电荷的氨基酸。在一些实施方案中，赋形剂有助于在与聚合物缀合期间将蛋白质保持在溶液中。在一些实施方案中，在将聚合物添加到含有蛋白质的溶液之前，将赋形剂添加到含有蛋白质的溶液中。
在一些实施方案中，反应在约pH 5至约pH 9之间的水性条件下发生。在一些实施方案中，反应在pH 6.0至8.5之间、6.5至8.0之间或7.0至7.5之间发生。
在一些实施方案中，聚合物在2-37摄氏度下与蛋白质缀合。在一些实施方案中，缀合在0-40摄氏度、5-35摄氏度、10-30摄氏度和15-25摄氏度发生。
在一些实施方案中，可使本文所述的缀合蛋白与离子交换介质或疏水相互作用色谱或亲和色谱介质接触以进行纯化(以从未缀合的蛋白中去除缀合的蛋白)。在一些实施方案中，离子交换介质、疏水相互作用色谱/或亲和色谱介质将缀合的蛋白质与非缀合的游离聚合物和非缀合的再氧化的脱帽蛋白质分离。
在一些实施方案中，本文所述和图10中概述的方法涉及能够促进和/或维持溶解度体系的赋形剂。在一些实施方案中，该方法允许溶液维持意欲相互作用的两种组分的溶解度。这可以包括蛋白质和聚合物的溶解度，然后也包括终端缀合物的溶解度。在一些实施方案中，在不使用赋形剂方法的情况下，问题可能是虽然蛋白质可溶，但当加入生物聚合物时，溶液(例如蛋白质)的溶解度下降并且从溶液中析出(crash)/沉淀出来。当然，当蛋白质析出时，其不能有效地与生物聚合物缀合。因此，可以使用赋形剂来维持在生物聚合物存在下蛋白质的溶解度，因此两者可以偶联形成蛋白质缀合物(或如图10中所示，抗体缀合物)。这也允许保持缀合物的溶解度。
在一些实施方案中，本文公开的聚合物可包含以下中的一种或多种：两性离子、磷酸胆碱或PEG接头，所述PEG接头将聚合物分支点的中心桥接至马来酰亚胺官能团。在一些实施方案中，可以通过本文提供的方法将本文提供的任意聚合物添加至蛋白质。
在一些实施方案中，本文提供的任意蛋白质可以通过本文提供的一种或多种方法与本文提供的任意聚合物缀合。
在一些实施方案中，本文提供的方法允许进行较大规模的加工以制备和纯化蛋白质和/或抗体缀合物。在一些实施方案中，所用体积为至少1升，例如1、10、100、1,000、5,000、10,000升或更多。在一些实施方案中，制备的和/或纯化的抗体缀合物的量可以是0.1、1、10、100、1000或更多克。
在一些实施方案中，治疗性蛋白质可以是本文所述的任意抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)，其具有通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，抗IL-6抗体重链具有以下CDR：CDRH1：在表1A中；CDRH2：在表1A中；和CDRH3：在表1A中。重链还可以在84位(通过连续编号)具有精氨酸(R)。在一些实施方案中，抗IL-6轻链具有以下CDR：CDRL1：在表1B中；CDRL2：在表1B中；和CDRL3：在表1B中。
在一些实施方案中，抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)包括IgG1。在一些实施方案中，重链具有一个或多个突变以调节效应子功能。在一些实施方案中，突变是针对以下氨基酸位置中的一个或多个(EU编号)：E233、L234、L235、G236、G237、A327、A330和P331。在一些实施方案中，突变选自由以下组成的组：E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S和P331S(EU编号)。在一些实施方案中，突变是(EU编号)L234A、L235A和G237A。
在一些实施方案中，通过重组DNA技术添加至治疗性蛋白质的半胱氨酸残基不应参与Cys-Cys二硫键配对。在此方面，治疗性蛋白质可以是二聚体。因此，例如，完整的抗IL-6抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)具有两条轻链和两条重链。如果将Cys残基引入到例如重链中，则完整抗体将在相同位置具有两个这样引入的半胱氨酸，并且存在这些半胱氨酸残基将形成链内二硫键的可能性。如果引入的半胱氨酸残基形成Cys-Cys二硫键或具有这样做的倾向，那么引入的Cys残基将不能用于缀合。本领域已知如何避免重链和轻链中将导致链内二硫键配对的位置。参见，例如，美国专利申请号2015/0158952。
在一些实施方案中，通过重组DNA技术引入的半胱氨酸残基选自由(EU编号)Q347C和L443C组成的组。在一些实施方案中，半胱氨酸残基是L443C(EU编号)。在一些实施方案中，抗体的重链具有表1A中所示的氨基酸序列并且轻链具有表1B中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，巯基特异性反应基团是马来酰亚胺。
在一些实施方案中，半衰期延长部分选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、支化PEG、
Figure BDA0002756846400001081
(Warwick Effect Polymers；Coventry、UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟乙基淀粉(HES)、羟烷基淀粉(HAS)、碳水化合物、多糖、普鲁兰多糖(pullulane)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基甲酰胺)(PHF)、两性离子聚合物、含磷酸胆碱的聚合物和包含2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基磷酸铵(MPC)的聚合物。
在一些实施方案中，半衰期延长部分是两性离子聚合物。在一些实施方案中，两性离子是磷酸胆碱，即含磷酸胆碱的聚合物。在一些实施方案中，聚合物由MPC单元组成。
在一些实施方案中，MPC聚合物具有三个或更多个臂。在一些实施方案中，MPC聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个臂。在一些实施方案中，MPC聚合物具有3、6或9个臂。在一些实施方案中，MPC聚合物具有9个臂。在一些实施方案中，聚合物用包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12或更多个聚合物引发位点的引发剂合成。
在一些实施方案中，MPC聚合物的分子量在约300,000至1,750,000Da之间。在一些实施方案中，MPC聚合物的分子量在约500,000至1,000,000Da之间或在约600,000至900,000Da之间。
在一些实施方案中，制备治疗性蛋白质-半衰期延长部分缀合物的方法具有如下额外步骤：在产生还原型半胱氨酸巯基的条件下，使治疗性蛋白质与硫醇还原剂接触。如上所述，优选地，通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基是不配对的，即不参与Cys-Cys链内二硫键或基本上不参与这种键合。然而，已知不参与这种Cys-Cys二硫键合并且可自由缀合的Cys残基与培养基中的游离半胱氨酸反应形成二硫化物加合物。参见，例如，WO 2009/052249。如此衍生的半胱氨酸将不可用于缀合。为了从二硫化物加合物中释放新添加的半胱氨酸，用还原剂例如二硫苏糖醇处理纯化后的蛋白质。然而，用还原剂进行的这种处理将还原治疗性蛋白质中的所有半胱氨酸残基，包括天然半胱氨酸，其中许多参与链间和链内Cys-Cys二硫键。天然Cys-Cys二硫化物通常对蛋白质稳定性和活性至关重要，应对其进行重建。在一些实施方案中，重建所有天然(例如，链间和链内)Cys-Cys二硫化物。
为了重建天然链间和链内二硫化物残基，在还原以除去半胱氨酸二硫化物加合物后，将治疗性蛋白质暴露于氧化条件和/或氧化剂一段规定的时间，例如过夜。在一些实施方案中，过夜暴露环境空气可用于实现天然二硫键的重建。在一些实施方案中，使用氧化剂来恢复天然二硫化物。在一些实施方案中，氧化剂选自由CuSO4水溶液和脱氢抗坏血酸(DHAA)组成的组。在一些实施方案中，氧化剂是DHAA。在一些实施方案中，所用DHAA的范围为5-30当量。在一些实施方案中，所述范围为10-30当量。在一些实施方案中，所述范围为15当量。
在一些实施方案中，硫醇还原剂选自由以下组成的组：3,3',3”-膦三基三丙酸(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、硼氢化钠(NaBH4)、氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、β-巯基乙醇(BME)、半胱氨酸盐酸盐、3,3',3”-膦三基三(苯-1-磺酸)三钠TPPTS和半胱氨酸。在一些实施方案中，硫醇还原剂是TCEP。
在一些实施方案中，硫醇还原剂浓度相对于治疗性蛋白质浓度为1至100倍摩尔过量。在一些实施方案中，硫醇还原剂浓度相对于治疗性蛋白质浓度为20至50倍摩尔过量。在一些实施方案中，在氧化治疗性蛋白质之前，在与治疗性蛋白质孵育后，除去硫醇还原剂。
在一些实施方案中，用于将治疗性蛋白质与半衰期延长部分缀合的方法还具有以下步骤：在缀合后纯化治疗性蛋白质缀合物。在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的技术纯化治疗性蛋白质缀合物：离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱或其组合。
在一些实施方案中，治疗性蛋白质缀合物相对于未缀合的治疗性蛋白质保留至少20％的生物学活性。在一些实施方案中，治疗性蛋白质缀合物相对于未缀合的治疗性蛋白质保留至少50％的生物学活性。在一些实施方案中，治疗性蛋白质缀合物相对于天然治疗性蛋白质保留至少90％的生物学活性。
在一些实施方案中，相对于未缀合的治疗性蛋白质，治疗性蛋白质缀合物的半衰期增加。在一些实施方案中，相对于未缀合的治疗性蛋白质，治疗性蛋白质缀合物的半衰期增加至少1.5倍。在一些实施方案中，相对于未缀合的治疗性蛋白质，治疗性蛋白质缀合物的半衰期增加至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。
在一些实施方案中，将治疗性蛋白质与半衰期延长部分缀合的方法中的两性离子聚合物是具有两性离子基团的可自由基聚合的单体，并且该方法还具有使可自由基聚合的两性离子单体在聚合介质中聚合以提供聚合物的步骤，该介质包括：可自由基聚合的两性离子单体；过渡金属催化剂Mt (q-1)+，其中Mt是过渡金属，q是金属的较高氧化态，q-1是金属的较低氧化态，其中金属催化剂以Mt(q-1)+X’(q-1)形式的盐提供，其中X'是反离子或基团，或者其中过渡金属催化剂通过提供处于其较高氧化态的非活性金属盐Mt q+X’q与还原剂一起原位提供，所述还原剂能够将过渡金属从非活性的氧化态还原为活性的还原态；配体；和引发剂。
为了起到ATRP过渡金属催化剂的作用，过渡金属应该具有由一个电子隔开的、至少两个易于达到的氧化态，较高氧化态和较低氧化态。在ATRP中，可逆的氧化还原反应导致过渡金属催化剂在较高氧化态和较低氧化态之间循环，而聚合物链在具有增长链端和休眠链端之间循环。参见，例如，美国专利号7,893,173。
在一些实施方案中，可自由基聚合的两性离子单体选自由以下组成的组：
Figure BDA0002756846400001111
其中R1是H或C1-6烷基，ZW是两性离子，n是1-6的整数。
在一些实施方案中，可自由基聚合的单体是
Figure BDA0002756846400001121
其中R1是H或C1-6烷基，R2、R3、R4相同或不同且是H或C1-4烷基，并且X和Y相同或不同且是1-6的整数。在一些实施方案中，在式(12)中，R1、R2、R3和R4各自为甲基，并且X和Y各自为2。
在一些实施方案中，可自由基聚合的单体是
Figure BDA0002756846400001122
其中R1是H或C1-6烷基，R2和R3相同或不同且是H或C1-4烷基，R4是PO4-、SO3-或CO2-，并且X和Y相同或不同且是1-6的整数。在一些实施方案中，在式(13)中，R1、R2和R3各自为甲基，R4是PO4-，并且X和Y各自为2。
在一些实施方案中，单体是
Figure BDA0002756846400001131
其中R1是H或C1-6烷基，R2、R3和R4相同或不同且是H或C1-4烷基，R5是PO4-、SO3-或CO2-，并且X和Y相同或不同且是1-6的整数。在一些实施方案中，在式(14)中，R1、R2、R3和R4为甲基，R5是PO4-，并且X和Y是2。
在一些实施方案中，过渡金属Mt选自由以下组成的组：Cu、Fe、Ru、Cr、Mo、W、Mn、Rh、Re、Co、V、Zn、Au和Ag。在一些实施方案中，金属催化剂以Mt(q-1)+X’(q-1)形式的盐提供。Mt (q-1)+选自由以下组成的组：Cu1+、Fe2+、Ru2+、Cr2+、Mo2+、W2+、Mn3+、Rh3+、Re2+、Co+、V2+、Zn+、Au+和Ag+，并且X’选自由以下组成的组：卤素，C1-6烷氧基，(SO4)1/2、(PO4)1/3、(R7PO4)1/2、(R72PO4)，三氟甲磺酸酯，六氟磷酸酯，甲磺酸酯，芳基磺酸酯，CN和R7CO2，其中R7是H或直链或支链C1-6烷基，其可被卤素取代1至5次。在一些实施方案中，Mt (q-1)+是Cu1+并且X’是Br。
在一些实施方案中，原位提供Mt (q-1)+。在一些实施方案中，Mt q+Xq是CuBr2。在一些实施方案中，还原剂是无机化合物。在一些实施方案中，还原剂选自由以下组成的组：低氧化水平的硫化合物、亚硫酸氢钠、含金属离子的无机盐、金属、水合肼和这些化合物的衍生物。在一些实施方案中，还原剂是金属。在一些实施方案中，还原剂是Cu0。
在一些实施方案中，还原剂是有机化合物。在一些实施方案中，有机化合物自由以下组成的组：烷基硫醇、巯基乙醇、或易于烯醇化的羰基化合物、抗坏血酸、乙酰丙酮酸酯、樟脑磺酸、羟基丙酮、还原糖、单糖、葡萄糖、醛，以及这些有机化合物的衍生物。
在一些实施方案中，配体自由以下组成的组：2,2'-联吡啶、4,4'-二-5-壬基-2,2'-联吡啶、4,4-二壬基-2,2'-联吡啶、4,4',4”-三(5-壬基)-2,2':6',2”-三联吡啶、N,N,N',N',N”-五甲基二亚乙基三胺、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺、三(2-二甲基氨基乙基)胺、N,N-双(2-吡啶基甲基)十八烷基胺、N,N,N',N'-四[(2-吡啶基)甲基]乙二胺、三[(2-吡啶基)甲基]胺、三(2-氨基乙基)胺、三(2-双(3-丁氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺、三(2-双(3-(2-乙基己氧基)-3-氧代丙基)氨基乙基)胺、和三(2-双(3-十二烷氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺。在一些实施方案中，配体是2,2'-联吡啶。
在一些实施方案中，引发剂具有以下结构：
Figure BDA0002756846400001141
其中R1是亲核反应性基团，R2包含接头，并且R3包含具有以下结构的聚合物合成引发剂部分：
Figure BDA0002756846400001142
其中R4和R5相同或不同且选自由以下组成的组：烷基、取代的烷基、亚烷基、烷氧基、羧基烷基、卤代烷基、环烷基、环烷基醚、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、环亚烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、芳基、亚芳基、亚芳基-氧基、杂芳基、氨基、酰氨基或其任意组合；Z是卤素或CN；并且s是1至20之间的整数。
在一些实施方案中，式(23)中的Z是Br并且R4和R5各自是甲基。在一些实施方案中，式(22)中的R1选自由以下组成的组：NH2-、OH-和SH-。
在一些实施方案中，式(22)中的R2是烷基、取代的烷基、亚烷基、烷氧基、羧基烷基、卤代烷基、环烷基、环烷基醚、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、环亚烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、芳基、亚芳基、亚芳基-氧基、杂芳基、氨基、酰氨基或其任意组合。在一些实施方案中，式(22)中的R2是
Figure BDA0002756846400001151
其中X和Y相同或不同且是1-20的整数。在一些实施方案中，X和Y各自为4。
在一些实施方案中，式(22)中的R3是
Figure BDA0002756846400001152
其中R6、R7和R8相同或不同且选自由以下组成的组：
Figure BDA0002756846400001153
Figure BDA0002756846400001161
其中Z是NCS、F、Cl、Br或I。在一些实施方案中，式(26)、式(27)和/或式(28)中的Z为Br，式(25)中的R6、R7和R8各自为
Figure BDA0002756846400001162
Figure BDA0002756846400001171
在一些实施方案中，引发剂具有以下结构：
Figure BDA0002756846400001172
其中A和B相同或不同且是2至12的整数，并且Z是任意卤素，例如Br。在一些实施方案中，在式(30)中，A和B各自为4。
在一些实施方案中，该方法还具有使聚合物与马来酰亚胺试剂反应以提供具有末端马来酰亚胺的聚合物的步骤。在一些实施方案中，马来酰亚胺化合物是
Figure BDA0002756846400001181
还可以在框架区或恒定区中进行修饰或突变以增加IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)的半衰期。参见，例如，PCT公布号WO 00/09560。也可以在框架区或恒定区中进行突变以改变抗体的免疫原性，提供与另一分子共价或非共价结合的位点，或改变诸如补体固定、FcR结合和抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性之类的性质。在一些实施方案中，在框架区或恒定区内进行不超过1至5个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，在框架区或恒定区内进行不超过1至3个保守氨基酸取代。根据本发明，单一抗体可以在可变结构域的CDR或框架区中的任何一个或多个中或在恒定区中具有突变。
修饰还包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其他翻译后修饰的多肽，例如，用不同的糖进行的糖基化、乙酰化和磷酸化。抗体在其恒定区的保守位置被糖基化(Jefferis和Lund,1997,Chem.Immunol.65:111-128；Wright和Morrison,1997,TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等人,1996,Mol.Immunol.32:1311-1318；Wittwe和Howard,1990,Biochem.29:4175-4180)和糖蛋白部分之间的分子内相互作用，从而影响糖蛋白的构象和所呈现的三维表面(Jefferis和Lund,supra；Wyss和Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7:409-416)。寡糖还可基于特定的识别结构使给定的糖蛋白靶向某些分子。还已经报道了抗体的糖基化会影响抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。尤其是，据报道由其中四环素调节β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII)(催化两等分的GlcNAc的形成的糖基转移酶)表达的CHO细胞所产生的抗体具有改进的ADCC活性(Umana等人,1999,Nature Biotech.17:176-180)。
抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在都会产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸，但是也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)连接。
向抗体(和/或Ab-Trap)添加糖基化位点可以方便地通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)来实现。也可以通过向原始抗体的序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或对其进行取代来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。
也可以改变抗体(和/或Ab-Trap)的糖基化模式而不改变基础核苷酸序列。糖基化很大程度上取决于用于表达抗体的宿主细胞。由于用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白(例如抗体)的细胞类型很少是天然细胞，因此可以预期抗体的糖基化模式的变化(参见，例如Hse等人,1997,J.Biol.Chem.272:9062-9070)。
除了选择宿主细胞之外，在抗体(和/或Ab-Trap)的重组生产过程中影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养物密度、氧合、pH，纯化方案等。已经提出了多种方法来改变在特定宿主生物中实现的糖基化模式，包括引入或过表达参与寡糖生产的某些酶(美国专利号5,047,335；5,510,261和5,278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可以例如使用内切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3从糖蛋白中酶促除去。另外，可以对重组宿主细胞进行基因工程改造，使其在加工某些类型的多糖时有缺陷。这些和类似技术是本领域众所周知的。
本文提供的一些实施方案可以用作具有炎症成分的炎性视网膜疾病和/或视网膜囊泡疾病的治疗剂。除血管生成外，炎症还与这些视网膜疾病的发病机理有关。抗炎疗法(例如类固醇)已有效治疗葡萄膜炎(一系列以眼内炎症为典型特征的疾病)和糖尿病性黄斑水肿(DME)。同样，IL-6的基因遗传多态性与2型糖尿病患者中较高的PDR发生率相关。而且，据报道AMD、DR和RVO的疾病进展与血清和/或眼内IL-6水平升高有关。此外，在患有新生血管性AMD的人的眼睛中，在Bruch膜表面上可以看到慢性炎症细胞。IL-6与DME患者的抗VEGF治疗耐药有关。一般认为，这在一定程度上是IL-6介导的VEGF表达上调[参考]以及在VEGF抑制剂存在下发生的由IL-6信号传导介导的更直接的VEGF非依赖性血管生成功能的间接结果。在一些实施方案中，这些病况中的任何一种或多种可以通过本文提供的一种或多种组合物治疗和/或预防。
图11C示出了生物缀合物的构建体的一些实施方案，该生物缀合物是与基于磷酸胆碱的生物聚合物缀合的VEGF trap(VEGFR1/2)和抗IL-6抗体的Trap-抗体融合物(TAF)。在一些实施方案中，抗VEGF/抗IL-6生物缀合物可以具有1.0MDa的分子量，具有6.0mg的临床剂量。生物缀合物中抗VEGF部分的当量摩尔剂量可以是雷珠单抗临床剂量的6倍，而眼半衰期可以是雷珠单抗的3-5倍。CH代表恒定重链，CL代表恒定轻链，Fab代表与抗原结合的片段，Fc代表可结晶的片段，VEGFR代表血管内皮生长因子受体，VH代表可变重链，VL代表可变轻链，*是CDR区。当量值显示为相对于雷珠单抗的倍数变化。
可以采用抗IL-6抗体/VEGF trap(VEGFR1/2)的多种序列布置，或以不同的布置提供。图21示出了可能的抗IL-6重链可变区序列的一些实施方案。CDR带下划线。
根据VEGF trap变体和改良的抗IL-6抗体决定簇(paratope)的结果，设计并制备了两种不同构型的216个分子，它们包括如图19、20、21、22和23所示的序列的组合。对于第一种构型(VEGFR-抗IL-6)，VEGF trap(如图19的序列1A-1D所示)位于蛋白质的开头，然后是两个重复的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser接头(GS)(如图20的序列2A所示)，它将trap连接到抗IL-6重链(如图21的序列3A-3I所示)的N末端。这些构建体可以与图22的序列4A-4C所列的轻链配对。在一些实施方案中，VEGF trap(来自图19)可与本文提供的任何图或表中所示的任何抗IL-6轻链和/或重链组合。
在一些实施方案中，本文提供的任何VEGF trap变体可以与本文提供的任何IL-6抗体的重链和轻链序列配对，并且可以被本文提供的任何聚合物进一步修饰。在一些实施方案中，本文提供的任何VEGF trap变体可以与本文提供的任何IL-6抗体的重链和轻链可变序列配对，并且可以被本文提供的任何聚合物进一步修饰。在一些实施方案中，本文提供的任何VEGF trap变体可以与本文提供的任何IL-6抗体的重链和轻链3个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)配对，并且可以被本文提供的任何聚合物进一步修饰。在一些实施方案中，IL-6-VEGF trap融合物包含图27中的组件。
在一些实施方案中，抗IL-6-VEGF trap(或双重抑制剂、融合蛋白或其缀合物)的序列包括SEQ ID NO：169(作为轻链)，SEQ ID NO：170(作为重链)，其通过接头与VEGFRtrap融合。在一些实施方案中，抗IL-6-VEGF trap(或双重抑制剂、或其融合蛋白或缀合物)的序列与包含SEQ ID NO：169和170的分子至少80％相同，包括例如与SEQ ID NO：170和169的组合具有至少85、90、95、96、97、98、99％或更高的同一性。在一些实施方案中，抗IL-6-VEGF trap(或其缀合物)的序列与包含SEQ ID NO：169的分子至少80％相同，并且与包含SEQ ID NO：170的分子至少80％相同，包括例如，与SEQ ID NO：170具有至少85、90、95、96、97、98、99％或更高的同一性，并且与169具有至少85、90、95、96、97、98、99％或更高的同一性。在一些实施方案中，CDR保持与如本文提供的抗IL-6抗体的任何CDR所述的(包括SEQ IDNO：170和169中的那些)一样，而序列的其余部分(重链和轻链、重链和轻链可变区和/或完整融合序列(例如SEQ ID NO 169和170)允许发生变化，以使完整序列与原始序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％或更高的同一性。在一些实施方案中，CDR可以变化1、2或3个保守性改变，而序列的其余部分(重链和轻链、重链可变区和轻链可变区和/或完整融合序列(例如SEQ ID NO 169和170)允许发生变化，以使完整序列与原始序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％或更高的同一性。在一些实施方案中，trap序列(图27或图19中以灰色显示的序列)可以保留至少80、85、90、95、96、97、98、99或更高的百分比同一性，并且CDR可以变化1、2或3个保守性改变，而序列的其余部分(重链和轻链、重链可变区和轻链可变区和/或完整融合序列(例如SEQ ID NO 169和170)允许发生变化，以使完整序列与原始序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％或更高的同一性。
在一些实施方案中，融合蛋白(或双重抑制剂)或其缀合物包含1、2、3、4、5或全部6个本文提供的CDR。在一些实施方案中，融合蛋白或其缀合物至少包括SEQ ID NO：49、50和51(或具有1、2或3个保守性取代的变体)。在一些实施方案中，融合蛋白(或双重抑制剂)或其缀合物至少包括SEQ ID NO：172、173和174(或具有1、2或3个保守性取代的变体)。在一些实施方案中，融合蛋白或其缀合物包括至少SEQ ID NO：49、50和51(或具有1、2或3个保守性取代的变体)和至少SEQ ID NO：172、173和174(或具有1、2或3个保守性取代的变体)。在一些实施方案中，这6个CDR(或其变体)包含在人抗体框架区中。在一些实施方案中，CDR在本文提供的任何抗体或其变体的框架区内，所述变体与本文提供的重链可变区和/或轻链可变区(包括但不限于表1A中为重链提供的那些和表1B中为轻链提供的那些)具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或更高的百分比同一性。在一些实施方案中，融合蛋白(或双重抑制剂)或其缀合物包括至少SEQ ID NO：49、50和51(或具有1、2或3个保守性取代的变体)和至少SEQ ID NO：172、173和174(或具有1、2或3个保守性取代的变体)，并且这些CDR(包括变体)将替代表1D中的一个或多个序列中的CDR或表1D中的变体中的CDR(其中，不考虑表1D中的CDR，其余序列与表1D中含重链部分和含轻链部分具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高的同一性)。因此，在一些实施方案中，这6个CDR(及其变体)不仅可以替代表1中指出的序列的CDR，而且可以替代其变体。在一些实施方案中，排除了表1E(包括1A1、1E2和1E3)中提供的CDR作为可能的变体中的CDR的选项。在一些实施方案中，抗体(包括其片段)与具有图27中所示的重链可变区和轻链可变区的抗体至少80％相同，同时保留了图27中的特定CDR(因此在该实施方案中CDR部分内没有变化)。
在一些实施方案中，提供了分离的拮抗性IL-6抗体。它可以包含重链氨基酸可变区，其包含具有SEQ ID NO：7-13、19-27、89、90、256-262中的至少一个的序列的重链；和轻链氨基酸可变区，其包含具有SEQ ID NO：91-93、28-30中的至少一个的序列的轻链。
在一些实施方案中，提供了一种分离的拮抗性IL-6抗体，该抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含3个互补决定区：VH(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3，它们具有来自SEQ ID NO：256中列出的CDR的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，它们具有选自由SEQ ID NO：91-93中列出的CDR组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了结合IL-6的分离的拮抗抗体。该抗体包含基于EU编号的以下突变中的至少一种：L234A、L235A和G237A。
在一些实施方案中，提供了结合IL-6的分离的拮抗抗体，所述抗体包含CDRH1，即SEQ ID NO：172中的CDRH1；CDRH2，即SEQ ID NO：173中的CDRH2；CDRH3，即SEQ ID NO：174中的CDRH3；CDRL1，即SEQ ID NO：199中的CDRL1；CDRL2，即SEQ ID NO：200中的CDRL2；CDRL3，即SEQ ID NO：201中的CDRL2；以下突变中的至少一种(EU编号)：L234A、L235A和G237A；以及以下突变(EU编号)中的至少一种：Q347C或L443C。
在一些实施方案中，VEGFR-抗-IL-6双重抑制剂包含选自SEQ ID NO：7-13、89、90和/或256-262的抗IL-6重链可变区序列。
在一些实施方案中，VEGFR-Anti-IL-6双重抑制剂的VEGF trap序列选自SEQ IDNo：145、15、16或17中的至少一个。
在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO：18。
在一些实施方案中，抗IL-6分子的重链序列选自SEQ ID NO：19-27中的至少一个，或至少包括SEQ ID NO：89、90、256-262中的一个的序列。
在一些实施方案中，抗IL-6分子的轻链序列包含来自SEQ ID NO：76-84中至少一个的至少1、2或3个轻链CDR。
在一些实施方案中，抗IL-6分子的重链序列包含来自SEQ ID NO：49-75中至少一个的至少1、2或3个重链CDR。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含来自SEQ ID NO：85-88中至少一个的VEGFR-Fc序列。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含SEQ ID No：7-13、145、15-17、18-84中的任何一个或多个的一个或多个序列。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含IL-6VH；IL-6VL；IL-6Fc；VEGFtrap和接头。在一些实施方案中，IL-6VH包含来自SEQ ID NO：19-27、31-39、89、90或256-262中任一个的IL6 VH序列的序列。在一些实施方案中，IL-6VL包含来自SEQ ID No：28-30或91-93中任一个的IL6 VL序列的序列。在一些实施方案中，Fc包含来自SEQ ID NO：40-48中任一个的Fc序列的序列。在一些实施方案中，VEGF Trap包含来自SEQ ID NO：145、15、16或17中任一个的VEGF trap序列的序列。
在一些实施方案中，提供了一种融合蛋白，其包含IL-6VH；IL-6VL；IL-6Fc和VEGFTrap，其中融合蛋白改变了HUVEC增殖。在一些实施方案中，改变HUVEC增殖即为抑制VEGF/IL6介导的增殖。
在一些实施方案中，提供了一种融合蛋白，其包含与SEQ ID NO：263至少80％相同并且与SEQ ID NO：117至少80％相同的序列。该融合蛋白进一步与聚合物缀合。在一些实施方案中，该融合蛋白与SEQ ID NO：263至少95％相同，并且与SEQ ID NO：117至少95％相同。在一些实施方案中，该蛋白质至少包含a)SEQ ID NO：172、173、174、199、200和201，或b)SEQID NO：172、173、174、199、200和/或201中1、2或3个氨基酸的取代，其中所述取代是保守性取代。
在一些实施方案中，本文提供的任何构建体均可包括在VEGFR序列的94和/或95位上的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述突变可以是T94I和H95I。在一些实施方案中，这减少了VEGFR蛋白的任何裂解(如以下实施例中详述)。
在一些实施方案中，(其中取向是抗IL-6-VEGFR)，重链的可变结构域和恒定结构域(如图23的序列5A-5I的重链—Fab所示)与VEGF trap(如图19的序列1A-1D所示)通过GS接头(如图20的序列2A所示)连接，然后Fc结构域(如图23的序列5A-5I的重链—Fc所示)与VEGF trap的C末端融合。因此，VEGF trap被夹在抗体Fab区和Fc区之间。在一些实施方案中，这些构建体可以与图22的序列4A-4C上列出的轻链配对。
图19示出了VEGF trap序列的一些实施方案。序列之间的变化用下划线标出并以粗体突出显示。在一些实施方案中，本文提供的任何融合构建体可以包括本说明书中或本说明书的任何附图中提供的任何突出显示和粗体变体。
图20示出了双重复Gly-Gly-Gly-Gly-Ser接头(GS)序列的一些实施方案。在一些实施方案中，可以使用一个以上单元的序列(例如，可以使用两个(对于双重复)、三个或更多)。在一些实施方案中，可以采用其他接头序列。在一些实施方案中，可以采用替代的接头序列。
图21示出了抗IL-6分子的一些实施方案的重链序列。CDR用下划线标出。在一些实施方案中，可以使用本文中的任何序列代替作为本说明书中的融合构建体一部分的其他重链序列。
图22示出了抗IL-6分子的轻链序列的一些实施方案。CDR用下划线标出。在一些实施方案中，可以使用本文的任何序列代替作为本说明书中的融合构建体一部分的其他轻链序列。
图23示出了抗IL-6分子的重链(分为Fab和Fc)序列的一些实施方案。CDR用下划线标出。在一些实施方案中，可以使用本文中的任何序列代替作为本说明书中的融合构建体一部分的其他重链序列。
图24A-24B示出了图21-23的CDR的组合。图24A示出了如图21和23所定义的重链CDR序列。图24B示出了如图22所定义的轻链CDR序列。在一些实施方案中，不同于在构建体中使用整个重链和/或轻链可变区，可以仅使用本文提供的一个或多个附图中的CDR。
在一些实施方案中，VEGFR-Fc trap融合物是工程化IgG1框架的一部分。除了VEGFR-抗IL-6和抗IL-6-VEGFR构建体之外，还可以提供抗VEGF(VEGFR-Fc)分子，其包含具有耐裂解变体的VEGF trap(如上所述)和工程化的IgG1 Fc结构域(如图25的序列6A-6D所示)。这些分子的Fc结构域可以包含L234A、L235A和G237A取代，这些取代可以使效应子功能最小化，还可以包含L443C，L443C可以与基于延长半衰期的磷酸胆碱的生物聚合物进行位点特异性缀合(残基位置遵循EU编号)。图25示出了VEGFR-Fc序列变体的一些实施方案。序列的变化用下划线标出并以粗体突出显示。注意，这些变化和/或组合可以提供一种生物治疗剂，其进一步优于和/或替代目前在疗法中使用的其他化合物。
如图26A-26C所示，VEGFR-Fc和Eylea以相似的亲和力与VEGF结合。图26A示出了VEGFR-Fc的Biacore测定。图26B示出了Eylea的Biacore测定。图26C示出了VEGFR-Fc和Eylea的实验结果(Ka、Kd、KD和Rmax)。
在一些实施方案中，在图18-23和25中任何一个或多个中指定的氨基酸序列的任何一个或多个序列可以调换为本文提供的任何其他实施方案的对应结构中，或用本文提供的任何其他序列交换。例如，图13C-13E、19或25内的任何序列可与图18、21或23的任何IL-6重链，与本文提供的任何接头(例如，图20)，以及与任何轻链(图22)一起使用。在一些实施方案中，构建体是VEGFR-抗IL-6构型，并且其包含与接头(例如，图20，序列2A)连接，与IL-6重链序列(例如，图21，序列3A或3B)连接，与轻链序列(例如，图22，序列4A)连接的序列1A-1D(图19)之一的组合。在一些实施方案中，序列1A-1D(图19)中的任何一个可以与接头(图20)组合，与抗IL-6重链序列(图21，序列3A-3I)组合，与抗IL-6轻链序列(图22，序列4A-4C)组合。在一些实施方案中，本文提供的构建体的任何特定单元的任何其他相应序列可以替换成或代替这些单元中的任何一个。
在一些实施方案中，双重抑制剂可提供一种或多种协同结果。在一些实施方案中，双重抑制剂要比作为单一疗法(例如IL-6疗法和VEGF疗法相结合)施用的每个部分协同更好。在一些实施方案中，如增殖测定结果所示，组合的VEGFR-IL-6构建体可提供协同结果(例如，其中双重抑制剂对HUVEC增殖具有明显作用，HUVEC增殖是血管生成的重要组成部分，而Eylea和抗IL-6均未发生任何变化)。因此，在一些实施方案中，提供了用于控制HUVEC增殖的方法，从而采用本文提供的VEGFR-抗IL-6构建体。
在其他实施方案中，融合构建体通过同时实现VEGFTrap结果和抗IL-6结果而简单地提供相加益处。
在一些实施方案中，可以将本文提供的一个或多个表格中的任何一个或多个组分组合在一起，以使得产生VEGFR-抗IL-6构建体或使得产生抗IL-6-VEGFR构建体。在一些实施方案中，该构建体还将包含Fc区。在一些实施方案中，Fc区可以是人Fc区。
在一些实施方案中，单独的CDR(带有或不带有任何特定框架部分)可以用作抗体部分。因此，本文提供的任何表格或图中的每条链或每对链(重链和轻链)中的任何一个或多个(例如3或6个)CDR可与任何其他组分(VEGFR和/或接头)组合使用。本文提供的任何IL-6构建体的CDR和/或1、2或3个重链CDR)可以与本文提供的任何一个或多个VEGFR序列相组合。在一些实施方案中，本文提供的任何IL-6构建体的任何重链和/或轻链可变区可以与本文提供的任何一个或多个VEGFR序列相组合。在一些实施方案中，也可以提供任何接头在最终构建体中。
在一些实施方案中，也可以提供编码本文提供的一种或多种氨基酸序列的任何核酸序列(例如，分离地、在载体内或在细胞内等)。
在一些实施方案中，用于缀合以形成生物缀合物的任何一种或多种聚合物可以与本文提供的任何VEGFR-IL6构建体相组合。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3A或3B)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1A-1D(图19)。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合是与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3A)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1A(图19)。在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合是与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3A)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1B(图19)。在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合是与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3A)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1C(图19)。在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合是与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3A)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1D(图19)。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合是与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3B)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1A(图19)。在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合是与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3B)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1B(图19)。在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合是与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3B)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1C(图19)。在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6组合是与接头(图20中的2A)连接，与重链(图21中的3B)连接，与图22中的轻链4A缔合的VEGFR的序列1D(图19)。
在一些实施方案中，任何IL-6抗体序列均可与本文提供的任何VEGFR序列一起使用。在一些实施方案中，任何1、2、3、4、5或6个CDR(1、2或3个轻链和1、2或3个重链)抗IL-6序列均可与任何VEGFR布置一起使用。
在一些实施方案中，可以使用任何抗IL-6抗体的轻链和/或重链，其具有表18.1-18.4中任何一个或多个中提供的任何一个或多个点突变。在一些实施方案中，融合构建体使用抗IL-6构建体，该抗IL-6构建体在表18.1-18.4中任何一个或多个所标识的任何一个或多个位置处具有点突变。在一些实施方案中，所改变的位置是在相关图中用下划线和粗体显示改变的残基的位置。在一些实施方案中，构建体包括重链中的变化和轻链中的变化，其中重链中的变化包括S35H、G66D、L100A或L100S中的一种或多种，轻链中的变化包括M32L、M50D、N52S或M88Q中的一种或多种。CDR位置在描述时遵循其在可变结构域中的出现顺序(例如S35H、G66D…)。Fc位置在描述时遵循EU编号(例如L234A、L235A…)。在一些实施方式中，构建体(例如，抗Il-6的抗体和/或IL-6VEGF Trap和/或IL-6VEGF Trap生物缀合物(与本文提供的一种或多种生物聚合物缀合))在重链和轻链中包含以下的1、2、3、4、5、6、7或8个：重链中的S35H、G66D、L100A和/或L100S，以及轻链中的M32L、M50D、N52S和/或M88Q。在一些实施方案中，这些点突变可用于本文提供的任何Il抗体或含有Il-6抗体的构建体。
如本领域技术人员将理解的，本文提供了多种构建体。通常，这些构建体可分为：抗Il-6抗体，和/或抗IL-6VEGF Trap(抗体与VEGF Trap的融合物)，和/或IL-6VEGF Trap生物缀合物(与一种或多种本文提供的生物聚合物的融合物)，和/或VEGF Trap构建体，和/或VEGF Trap生物聚合物。因此，本文提供的任何分离的组分(及其变体)可以单独使用或彼此结合使用。在一些实施方案中，这些组(抗Il-6抗体，和/或抗IL-6VEGF Trap(抗体与VEGFTrap的融合物)，和/或IL-6VEGF Trap生物缀合物(与一种或多种本文提供的生物聚合物的融合物)，和/或VEGF Trap构建体，和/或VEGF Trap生物聚合物)中的任何一个的构建体可用于本文提供的任何方法或其他组合物。例如，这些选择中的任何一种可以用于关于IL-6VEGF Trap疗法和/或IL-6疗法和/或IL-6VEGF Trap生物缀合物描述的任何治疗方法。应当理解，根据本文详述的组分的性质，对于每种治疗，每种构建体的特征和性质可以是不同的。因此，本文关于例如细胞系、核酸、疗法和其他实施方案的描述不仅针对抗IL-6-VEGFTrap和/或其生物缀合物，而且针对抗体(例如，其片段)、抗体-生物缀合物和VEGF Trap构建体，它们与抗IL-VEGF Trap和/或生物缀合物不同。例如，在一些实施方案中，IL-6的任何点突变(或其组合)可以在抗体(或其结合片段)中使用以用于治疗，该治疗仅基于抗体而不是基于抗体和VEGF trap的布置。因此，VEGF Trap和IL-6抗体的点突变不限于融合布置的情况(尽管确实提供了这一点)，因为它还描述了与融合布置不同的此类构建体(及其用途和制备方法)。并非单独重复所有这样的实施方案，要注意的是，对一种布置(抗Il-6抗体，和/或抗IL-6VEGF Trap(抗体与VEGF Trap的融合物)，和/或IL-6VEGF Trap生物缀合物(与一种或多种本文提供的生物聚合物的融合物)，和/或VEGF Trap构建体，和/或VEGF Trap生物聚合物)的任何这样的描述都适用并确认对于所有其他这样的布置(抗Il-6抗体，和/或抗IL-6VEGF Trap(抗体与VEGF Trap的融合物)，和/或IL-6VEGF Trap生物缀合物(与一种或多种本文提供的生物聚合物的融合物)，和/或VEGF Trap构建体，和/或VEGF Trap生物聚合物)的选项。
在一些实施方案中，预期将任何VEGF Trap构建体用作组合物、组分或疗法，包括例如本文提供的实施方案的图13C-13E、19和25中的那些。
在一些实施方案中，预期将任何抗IL-6抗体构建体用作组合物、组分或疗法，包括例如本文提供的实施方案的表1A和1E以及图5、18、21、22、23和24中的那些。
在一些实施方案中，融合蛋白在VEGF Trap序列的第94位、在VEGF Trap序列的第95位或在VEGF Trap序列的T94I和H95I处包含突变。
在一些实施方案中，提供了VEGFR-抗IL-6双重抑制剂。VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含抗IL 6抗体和VEGF(VEGFR1/2)trap的trap抗体融合物，其中该双重抑制剂在VEGFR序列内包含至少一个点突变，以降低VEGFR序列的裂解。在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6双重抑制剂的分子量为1.0MDa。
在一些实施方案中，VEGR-抗IL-6双重抑制剂为炎性视网膜疾病提供了疗法。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包括重链恒定区、轻链恒定区、抗原结合片段区、可结晶片段(Fc)区、血管内皮生长因子受体(VEGFR)区、重链可变区、轻链可变区和CDR区。
在一些实施方案中，抗IL-6重链可变区序列可以选自图18的选项VI、VII、VIII、IX、X、XI或XII。
在一些实施方案中，VEGF trap序列可选自图19的选项1A、1B、1C或1D中的至少一种。
在VEGR-抗IL-6双重抑制剂的一些实施方案中，抗IL-6分子的重链序列可以选自图21的选项3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H或3I中的至少一种。
在VEGFR-抗IL-6双重抑制剂的一些实施方案中，抗IL-6分子的轻链序列包含来自图24B的选项4A、4B或4C中的至少一种的至少1、2或3个轻链CDR。
在VEGFR-抗IL-6双重抑制剂的一些实施方案中，抗IL-6分子的重链序列包含来自图24A的选项5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H或5I中的至少一种的至少1、2或3个重链CDR。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含来自图25的选项6A、6B、6C或6D中至少一种的VEGFR-Fc序列。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含图18-25中的一个或多个序列。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含IL-6VH、IL-6VL、IL-6Fc、VEGFTrap和接头。在一些实施方案中，IL-6VH包含来自图21或23中IL6VH序列的序列。在一些实施方案中，IL-6VL包含来自图22中IL6 VL序列的序列。在一些实施方案中，Fc包含来自图23中的Fc序列的序列。在一些实施方案中，VEGF Trap包含来自VEGF trap序列的序列。
在一些实施方案中，提供了一种蛋白质构建体，其包含：至少3个重链CDR；至少3个轻链CDR；VEGF trap序列；和一个接头序列，其中每个序列选自图18-25中的序列。
在一些实施方案中，提供了一种融合蛋白，其包含：IL-6VH、IL-6VL、IL-6Fc、VEGFTrap，并且其中该融合蛋白改变HUVEC增殖。在一些实施方案中，每个序列均选自图18-25中的序列。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明还提供了编码本文所述的任何抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)(包括抗体片段和修饰的抗体)的多核苷酸。在另一方面，本发明提供了制备本文所述的任何多核苷酸的方法。可以通过本领域已知的方法制备和表达多核苷酸。因此，本发明提供了编码本文提供的任何IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)的多核苷酸，或包含该多核苷酸的组合物，包括药物组合物。
与任何这样的序列互补的多核苷酸也包括在本发明中。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子并以一对一的方式对应于DNA分子的HnRNA分子，和不含内含子的mRNA分子。本发明的多核苷酸内可以(但不必)存在另外的编码或非编码序列，并且多核苷酸可以(但不必)与其他分子和/或支持材料连接。
多核苷酸可以包含天然序列(即编码抗体或其片段的内源序列)或可以包含该序列的变体。多核苷酸变体包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得相对于天然免疫反应性分子，所编码的多肽的免疫反应性不会降低。通常可以如本文所述评估对所编码的多肽的免疫反应性的影响。变体优选地与编码天然抗体或其片段的多核苷酸序列具有至少约70％的同一性，更优选至少约80％的同一性，再更优选至少约90％的同一性，最优选至少约95％的同一性。
当如下所述将两个多核苷酸或多肽序列进行比对以获得最大对应时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列相同，则称它们为“同一的”。通常通过在比较窗口上比较两个序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性，来进行两个序列之间的比较。如本文所用，“比较窗”是指至少约20个通常为30至约75个或40至约50个连续位置的片段，其中可以在将两个序列最佳比对之后，将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
可以使用默认参数，使用生物信息学软件(
Figure BDA0002756846400001331
Inc.,Madison,WI)的
Figure BDA0002756846400001332
套件中的
Figure BDA0002756846400001333
程序，对序列进行最佳比对，以进行比较。该程序嵌入了以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,Amodel of evolutionarychange in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure,National BiomedicalResearch Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymologyvol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,CABIOS5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of NumericalTaxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。
优选地，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性的百分比”，其中与参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的一部分可包含20％或更少，通常5％至15％或10％至12％的添加或缺失(即，缺口)，以实现两个序列的最佳比对。百分比通过如下方法计算：通过确定两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基出现的位置数，得到匹配位置数，将匹配位置数除以参考序列中的位置总数(即窗口大小)，然后将结果乘以100，得出序列同一性的百分比。
变体也可以或作为替代方案与天然基因或其部分或补体基本上同源。这样的多核苷酸变体能够在中等严格条件下与编码天然抗体的天然存在的DNA序列(或互补序列)杂交。
合适的“中等严格条件”包括在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中进行预洗涤；在50℃-65℃，5X SSC下杂交过夜；然后在65℃下用含0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC分别洗涤两次，每次20分钟。
如本文所用，“高严格条件”或“高严格性条件”是指：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃下使用0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺，与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，与750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，在42℃下，或(3)使用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt溶液，超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖(在42℃)，在42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中在55℃洗涤，然后在55℃下用含EDTA的0.1x SSC进行高严格洗涤。技术人员将认识到如何根据需要调节温度、离子强度等，以适应诸如探针长度等因素。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸是本发明特别考虑的。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是由于一种或多种突变(例如核苷酸的缺失、添加和/或替换)而改变的内源基因。所得的mRNA和蛋白质可以(但不必)具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。
本发明的多核苷酸可以使用化学合成、重组方法或PCR获得。多核苷酸化学合成方法是本领域众所周知的，因此在此无需详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来制备所需的DNA序列。
为了使用重组方法制备多核苷酸，可以将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体中，然后可以将该载体引入合适的宿主细胞中进行复制和扩增，如本文进一步讨论的。可以通过本领域已知的任何方式将多核苷酸插入宿主细胞中。通过直接摄取、内吞、转染、F-交配或电穿孔，通过引入外源多核苷酸，来转化细胞。一旦引入，外源多核苷酸则可以作为非整合载体(例如质粒)维持在细胞内或整合到宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可以通过本领域熟知的方法从宿主细胞中分离。参见，例如，Sambrook等人，1989。
或者，PCR能够复制DNA序列。PCR技术是本领域公知的，并描述在美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202中，以及PCR：The Polymerase ChainReaction,Mullis等人编辑,Birkauswer Press,Boston,1994。
通过在适当的载体中使用分离的DNA并将其插入适当的宿主细胞中，可以获得RNA。当细胞复制并且DNA被转录成RNA时，然后可以使用本领域技术人员众所周知的方法分离RNA，例如Sambrook等人，1989(同上)所述。
合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以选自本领域可获得的大量克隆载体。尽管所选择的克隆载体可能会根据打算使用的宿主细胞而有所不同，但可用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可能具有特定限制性核酸内切酶的单一靶标，和/或可能携带可用于选择包含该载体的克隆的标记基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK++)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体例如pSA3和pAT28。这些克隆载体和许多其他克隆载体可从商业供应商处获得，例如BioRad、Strategene和Invitrogen。
还提供了表达载体。表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其包含根据本发明的多核苷酸。不言而喻，表达载体必须能在宿主细胞中以附加体或染色体DNA的组成部分形式进行复制。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、粘粒和PCT公开号WO 87/04462中公开的表达载体。载体组件通常可以包括但不限于以下一种或多种：信号序列；复制起点；一种或多种标记基因；合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)。为了表达(即翻译)，通常还需要一个或多个翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
含有目的多核苷酸的载体可以通过许多合适的方式中的任何一种引入宿主细胞中，包括电穿孔，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂质转染；和感染(例如，其中载体是传染剂量，例如痘苗病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常将取决于宿主细胞的特征。
本发明还提供了包含本文所述的任何多核苷酸的宿主细胞。能够过表达异源DNA的任何宿主细胞都可以用于分离编码目的抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。也参见PCT公开号WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)和酵母菌(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。优选地，宿主细胞表达cDNA的水平以比宿主细胞中相应的内源性目的抗体或蛋白(如果存在的话)高约5倍，更优选地高10倍，甚至更优选地高20倍。通过免疫测定或FACS筛选用于与IL-6特异性结合的宿主细胞。可以鉴定出过表达目的抗体或蛋白质的细胞。
表达载体可用于指导IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)的表达。本领域技术人员熟悉表达载体的施用以获得外源蛋白体内表达。参见，例如，美国专利号6,436,908；6,413,942；和6,376,471。表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、口服施用、粒子枪或导管插入施用以及局部施用。在另一个实施方案中，将表达载体直接施用于交感神经干或神经节，或施用于冠状动脉、心房、心室或心包膜。
也可以使用含有表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗性组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术描述于例如Findeis等人,Trends Biotechnol.,1993,11:202；Chiou等人,Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff编辑,1994；Wu等人,J.Biol.Chem.,1988,263:621；Wu等人,J.Biol.Chem.,1994,269:542；Zenke等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:3655；Wu等人,J.Biol.Chem.,1991,266:338。在基因治疗方案中，对于局部施用，以约100ng至约200mg DNA的范围施用含多核苷酸的治疗性组合物。在基因治疗方案中，也可以使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg至约100μg DNA的浓度范围。可以使用基因递送媒介物来递送治疗性多核苷酸和多肽。基因递送媒介物可以是病毒或非病毒来源的(一般参见，Jolly,Cancer Gene Therapy,1994,1:51；Kimura,Human Gene Therapy,1994,5:845；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1:185；和Kaplitt,Nature Genetics,1994,6:148)。可以使用内源性哺乳动物或异源启动子来诱导此类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成性的或调控的。
用于递送所需多核苷酸并在所需细胞中表达的基于病毒的载体是本领域众所周知的。示例性的基于病毒的媒介物包括但不限于重组逆转录病毒(参见，例如PCT公布号WO90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；U.S.专利号5,219,740和4,777,127；GB专利号2,200,651；和EP专利号0 345 242)、基于α病毒的载体(例如，Sindbis病毒载体、Semliki森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))以及腺相关病毒(AAV)载体(例如，参见PCT公开号WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。可以采用与杀死的腺病毒连接的DNA的施用，如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147中所述。
也可以使用非病毒递送媒介物和方法，包括但不限于单独的与杀死的腺病毒相连接或不连接的聚阳离子缩合DNA(参见，例如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147)；配体连接的DNA(参见，例如Wu,J.Biol.Chem.,1989,264:16985)；真核细胞递送媒介物细胞(参见，例如，U.S.专利号5,814,482；PCT公布号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；和WO97/42338)以及与细胞膜核电荷中和或融合。也可以使用裸露的DNA。示例性的裸露DNA导入方法描述于PCT公布号WO 90/11092和U.S.专利号5,580,859。可以充当基因递送媒介物的脂质体描述于U.S.专利号5,422,120；PCT公布号WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；和EP 0524968。其他方法描述于Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14:2411中，和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91:1581中。
组合物
本发明还提供了药物组合物，其包含有效量的本文所述的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)缀合物。本文还描述了此类组合物的实例以及如何配制。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)和/或抗体(和/或Ab-Trap)缀合物。在其他实施方案中，IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)识别人IL-6。在其他实施方案中，IL-6拮抗抗体是人抗体。在其他实施方案中，IL-6拮抗抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，IL-6拮抗抗体包含恒定区，该恒定区不会触发不需要的或不希望的免疫反应，例如抗体介导的裂解或ADCC。在其他实施方案中，IL-6拮抗剂(和/或IL-6Ab-VEGF trap)包含抗体的一个或多个CDR(例如一个、两个、三个、四个、五个，或者在一些实施方案中，所有六个CDR)。
应当理解，组合物可以包含一种以上的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF trap)(例如，识别IL-6的不同表位的IL-6抗体的混合物)。其他示例性组合物包含一种以上的识别相同表位的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)，或结合IL-6的不同表位的不同种类的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF trap)。在一些实施方案中，组合物包含识别IL-6的不同变体的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)的混合物。另外，在一些实施方案中，组合物还可以或替代地包含一种以上VEGF Trap。这些替代的VEGF Trap部分可以包括VEGFTrap部分的不同序列，只要这些部分至少具有如本文所述的相同或相似的功能即可。
用于本发明的组合物可以以冻干制剂或水溶液的形式进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and practice of Pharmacy 20thEd.,2000,Lippincott Williams和Wilkins编辑K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所述剂量和浓度下对受体无毒，并且可以包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚山梨酯、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文进一步描述了药学上可接受的赋形剂。
适于肠胃外施用的药物组合物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液基本等渗的溶质的水性和非水性无菌注射溶液；和可包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。可用于可注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，使用前仅需加入所携带的无菌液体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。药物组合物可以是基本上等渗的，意味着渗透压为约250-350mOsm/kg水。
药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、添味剂、盐(本发明的物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。除本发明的物质外，它们还可以含有治疗活性剂。本发明的药物组合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合使用。此类赋形剂可以包括但不限于盐水、缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、葡萄糖、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。
本发明的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)、IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)缀合物和药物组合物可以单独使用或与其他化合物(例如治疗性化合物或分子，例如抗炎药、止痛药或抗生素)组合使用。这种与其它化合物一起的施用可以是同时的、分开的或相继的。组分可以以试剂盒的形式制备，试剂盒可以适当包括说明书。
预防或治疗眼科病症的方法
在一些实施方案中，抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)和抗体(和/或IL-6Ab-VEGFTrap)缀合物可用于各种应用包括但不限于治疗性治疗方法。
在一些实施方案中，提供了一种用于治疗眼病例如AMD的方法。在一些实施方案中，治疗受试者的AMD的方法包括向有此需要的受试者施用有效量的包含本文所述的任何抗IL-6抗体或IL6 Ab-VEGF Trap的组合物(例如药物组合物)。如本文所用，AMD包括干性AMD和湿性AMD。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的AMD的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的包含如本文所述的IL-6拮抗抗体或IL-6Ab-VEGFTrap或其缀合物的组合物。在一些实施方案中，IL-6抗体和/或IL-6Ab VEGF Trap和/或其缀合物可用于治疗和/或预防和/或降低以下疾病的风险：湿性或新生血管性黄斑变性、湿性或新生血管性年龄相关性黄斑变性、干性年龄相关性黄斑变性、眼和/或视网膜血管的静脉、动脉或其他阻塞(伴有或不伴有视网膜水肿)、前和后葡萄膜炎、葡萄膜炎性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、增生性糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、非增生性糖尿病性黄斑水肿和眼内肿瘤。在一些实施方案中，抗体或IL-6Ab-VEGFTrap可用于：(i)VEGF疗法耐药的患者，(ii)由于其他潜在病理如纤维化、伤口愈合和萎缩的进展，而对抗VEGF药物失去疗效的患者；和/或(iii)由于需要频繁玻璃体内注射而导致治疗不足的患者。
在一些实施方案中，提供了一种用于治疗诸如全身性疾病的眼病的方法。在一些实施方案中，可以通过本文提供的方法和组合物治疗影响眼睛的全身性疾病，例如格雷夫氏病或视神经脊髓炎，或不影响眼睛的全身性疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，本文提供的组合物可以与免疫调节剂例如PD-1/PDL-1组合用于肿瘤学适应症。
在一些实施方案中，本文描述的方法进一步包括用一种或多种其他形式的疗法来治疗受试者的步骤。在一些实施方案中，其他形式的疗法是其他AMD疗法，包括但不限于
Figure BDA0002756846400001411
激光光凝固术或玻璃体内注射例如
Figure BDA0002756846400001412
或
Figure BDA0002756846400001413
关于本文描述的所有方法，提及IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)也包括包含一种或多种其他试剂的组合物。这些组合物可进一步包含合适的赋形剂，例如药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂，它们是本领域众所周知的。本发明可以单独使用或与其他治疗方法组合使用。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防有此需要的患者的疾病的方法。在一些实施方案中，该方法包括向患者施用本文公开的任何分离的拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)。在一些实施方案中，该方法包括向患者施用本文公开的任何缀合物。在一些实施方案中，该方法包括向患者施用本文公开的任何组合物。在一些实施方案中，该方法包括鉴定具有极度活跃的IL-6活性的患者，并向该患者施用本文公开的任何分离的拮抗抗体。在一些实施方案中，该方法包括鉴定具有极度活跃的IL-6活性的患者，并向该患者施用本文公开的任何缀合物。在一些实施方案中，该方法包括鉴定具有极度活跃的IL-6活性的患者，并向该患者施用本文公开的任何组合物。在一些实施方案中，作为升高的IL-6活性的替代或补充，患者具有升高的VEGF活性。
在一些实施方案中，病症选自由以下组成的组：湿性或新生血管性黄斑变性、湿性或新生血管性年龄相关性黄斑变性、干性年龄相关性黄斑变性、眼和/或视网膜血管的静脉、动脉或其他阻塞(伴有或不伴有视网膜水肿)、前和后葡萄膜炎、葡萄膜炎性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、增生性糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、非增生性糖尿病性黄斑水肿和眼内肿瘤。
在一些实施方案中，分离的抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)、缀合物(和/或IL-6Ab-VEGF Trap-缀合物)、组合物或其组合的施用频率不超过每月一次。在一些实施方案中，分离的抗体、缀合物、组合物或其组合的施用频率不超过每两个月一次。在一些实施方案中，分离的抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)、缀合物(和/或IL-6Ab-VEGF Trap-缀合物)、组合物或其组合的施用频率不超过每三个月一次。在一些实施方案中，分离的构建体(例如，具有或不具有聚合物的Ab或Ab-Trap)的施用频率在每年一次至每两个月一次之间。在一些实施方案中，治疗可以是抗体的单次应用。在一些实施方案中，治疗可以根据结果的需要或期望进行尽可能多次的抗体应用。
可以通过任何合适的途径将IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)或其缀合物施用给受试者。对于本领域技术人员而言显而易见的是，本文描述的实例并非旨在限制，而是用于说明可用技术。因此，在一些实施方案中，按照已知方法将IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)施用给受试者，例如静脉内施用，例如推注或通过在一段时间内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、经皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内，通过吹入、鞘内、口服、吸入或局部途径。施用可以是全身性的，例如静脉内施用，或局部的。用于液体制剂的可商购的喷雾器(包括喷射喷雾器和超声喷雾器)可用于给药。可以直接雾化液体制剂，冻干粉可以在重构后雾化。或者，可以使用碳氟化合物制剂和定量吸入器将IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)雾化，或作为冻干研磨粉末吸入。
在一些实施方案中，本文公开的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)、IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)缀合物以及药物组合物可用于预防或治疗眼部疾病或病况。如此使用，通常将缀合物配制为适合以下施用方式并通过以下方式施用：眼部、眼内、和/或玻璃体内注射、和/或近巩膜(juxtascleral)注射、和/或眼球筋膜下(subtenon)注射、和/或脉络膜上腔(suprachoroidal)注射和/或以滴眼剂和/或软膏的形式局部施用。这样IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)、IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)缀合物和组合物可以通过多种方法递送，例如作为允许化合物缓慢释放到玻璃体中的装置和/或贮库(depot)进行玻璃体内递送，包括例如Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton,和Pearson,editors,Taylor&Francis(March 2006)的参考文献中描述的那些。在一个实例中，装置可以是微型(a minimum)和/或矩阵(a matrix)和/或被动扩散系统和/或封装单元(encapsulated cell)的形式，其可长时间释放化合物(Intraocular DrugDelivery,Jaffe,Jaffe,Ashton,和Pearson,editors,Taylor&Francis(March 2006))。在治疗中或作为预防剂时，活性剂可作为可注射组合物向个体施用，例如作为无菌水性分散液，优选等渗的或基本等渗的。
用于眼、眼内或玻璃体内施用的制剂可以通过本领域已知的方法使用本领域已知的成分制备。适当渗透到眼睛中对于有效治疗是理想的。与可以局部给药的眼前疾病不同，视网膜疾病值得采用更具针对性的方法。滴眼剂和软膏很少渗透到眼后部，并且血眼屏障阻碍全身施用的药物渗透到眼组织中。在一些实施方案中，选择的用于治疗视网膜疾病(例如AMD和CNV)的药物递送方法为直接玻璃体内注射。在一些实施方案中，玻璃体内注射以取决于患者的状况以及所递送的药物的性质和半衰期的间隔进行重复。
对于向哺乳动物特别是人类施用，对于全身施用而言，预期活性剂的剂量为0.01mg/kg体重，通常为约1mg/kg。对于需要局部施用(例如玻璃体内、脉络膜上、眼周等)的眼部疾病，剂量通常为0.1mg/眼/剂至10mg/眼/剂或更高。在一些实施方案中，剂量为100ul/剂/眼。在一些实施方案中，可以使用针头来给药。针头可以是例如30规格的1/2英寸针头或27G或29G的1/2英寸针头。医师可以确定最适合个体的实际剂量，其取决于包括个体的年龄、体重、性别和反应，所治疗的疾病或病症以及所治疗个体的年龄和状况在内的因素。上述剂量是平均情况的示例。当然，可存在需要更高或更低剂量的情况。
该剂量可以适当重复(例如每周一次、每两周一次、每月一次、每季度一次)。如果发生副作用，则可以根据正常临床实践减少给药的量和/或频率。在一个实施方案中，药物组合物可以每一至三十天施用一次。
根据本发明，本发明的IL-6拮抗剂抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)可通过在患者体内表达这样的多肽来使用，即基因疗法。使核酸(任选地包含在载体中)进入患者细胞有两种主要方法：体内和离体。对于体内递送，将核酸直接注射到患者体内，通常在需要治疗性蛋白质的部位，即需要治疗性蛋白质的生物活性的部位。对于离体治疗，移除患者的细胞，将核酸引入到这些分离的细胞中，并将修饰的细胞直接施用于患者，或者例如，包封在多孔膜中，多孔膜会植入到患者体内(参见，例如，美国专利号4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸引入到活细胞中。这些技术根据核酸是在体外转移到培养细胞中，还是在体内在转移到预期宿主的细胞中而变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。转导涉及复制缺陷型重组病毒(优选逆转录病毒)颗粒与细胞受体的结合，然后将颗粒所含的核酸引入到细胞中。用于离体递送基因的常用载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒载体(例如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒I或腺病毒相关病毒(AAV))和基于脂质的系统(用于脂质介导的基因转移的有用脂质是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol；参见，例如Tonkinison等人，Cancer Investigation,14(1):54-65(1996))的转染。用于基因疗法的最优选的载体是病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。病毒载体如逆转录病毒载体包括至少一种转录启动子/增强子或(多个)基因座限定元件，或通过其他方式(例如可变剪接、核RNA输出或信使RNA的翻译后修饰)控制基因表达的其他元件。另外，病毒载体如逆转录病毒载体包括核酸分子，当在编码治疗性蛋白质的基因的存在下转录时，该核酸分子与其可操作地连接并起到翻译起始序列的作用。此类载体构建体还包括包装信号，长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)或其部分，以及适合于所用病毒的正链和负链引物结合位点(如果它们尚未存在于病毒载体中)。另外，这种载体通常包括信号序列，用于从其位于其中的宿主细胞分泌PRO多肽。优选地，用于该目的的信号序列是哺乳动物信号序列，最优选地是治疗性蛋白质的天然信号序列。任选地，载体构建体还可以包括指导多腺苷酸化的信号，以及一个或多个限制性位点和翻译终止序列。举例来说，此类载体通常包括5'LTR，tRNA结合位点，包装信号，第二链DNA合成的起点，和3'LTR，或它们的一部分。可以使用非病毒的其他载体，例如阳离子脂质体、聚赖氨酸和树枝状大分子。
在一些情况下，期望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸源，所述靶向靶细胞的试剂例如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体，靶细胞上受体的配体等。在使用脂质体的情况下，结合与内吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如，对特定细胞类型具有嗜性的衣壳蛋白或其片段，针对在周期中经历内化的蛋白质的抗体，以及靶向细胞内定位并增强细胞内半衰期的蛋白质。受体介导的内吞作用技术描述于例如Wu等人，J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)；和Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3410-3414(1990)。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述，参见Anderson等人，Science,256:808-813(1992)。还参见WO 93/25673和其中引用的参考文献。
合适的基因疗法和制备逆转录病毒颗粒和结构蛋白的方法可见于例如美国专利号5,681,746中。
在一些实施方案中，提供了用于治疗或预防哺乳动物眼部疾病的方法，其中施用编码IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)的核酸分子。
在一些实施方案中，这些IL6/VEGF双重抑制剂分子可用于治疗眼部病症，例如眼炎性疾病巩膜炎、非增生性糖尿病性视网膜病、增生性糖尿病性视网膜病(PDR)、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿的预防、增生性糖尿病性视网膜病的预防、湿性年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性的预防、葡萄膜炎、葡萄膜炎性黄斑水肿。
VEGFR-抗IL6治疗剂还可用于治疗影响眼睛的全身性疾病，例如格雷夫氏病或视神经脊髓炎，或不影响眼睛的全身性疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎。
这些分子还可用于在CAR-T或类似的免疫肿瘤疗法后治疗细胞因子释放综合征。另外，抗IL6分子可以消除用抗PD-1/PD-L1分子治疗后观察到的IL-6表达的诱导(Tsukamoto等人，2018)。此外，VEGF信号传导阻断也可以改善抗PD-L1治疗(Allen等人，2017)。因此，这些双重抑制剂可以与免疫检查点抑制剂(例如PD-1/PDL-1调节剂)结合使用，以协同治疗癌症。除此之外，VEGF抑制将提供额外的益处。这种方法的另一种应用可以用于胶质母细胞瘤的脑水肿，其中抗IL6疗法可能对抗VEGF疗法显示出额外的益处。该生物聚合物还可以增加组织分布，这对于穿透实体瘤将是有益的。
在一些实施方案中，缀合物(或各种蛋白质)可用于预防本文提供的任何一种或多种病症。
制剂
通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000)混合，来制备根据本发明使用的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)和IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)缀合物的治疗性制剂，以用于以冻干制剂或水溶液的形式储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对受体无毒，并且可以包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
通过本领域已知的方法制备含有IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)和/或IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)缀合物的脂质体，例如描述于Epstein,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang,等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；和U.S.Pat.Nos.4,485,045和4,544,545的方法。美国专利号5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来制备特别有用的脂质体。通过具有确定孔径的过滤器挤出脂质体，以制备具有所需直径的脂质体。
也可以将活性成分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或大乳剂中。这样的技术在Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)中公开。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为定型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌滤膜的过滤来完成。治疗性IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)和/或抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)缀合物组合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶。在一些实施方案中，将所述抗体和/或抗体缀合物组合物放入注射器中以提供预填充的注射器。
在一些实施方案中，组合物是无热原的组合物，其基本上不含内毒素和/或相关的热原物质。内毒素包括限制在微生物内部，仅在微生物分解或死亡时才释放的毒素。热原物质还包括来自细菌和其他微生物外膜的诱发发热的热稳定物质。如果对人施用，这两种物质都会引起发烧、低血压和休克。由于潜在的有害影响，必须从静脉内施用的药物溶液中去除哪怕少量的内毒素。对于诸如IV或IP的全身注射，美国食品药品监督管理局(“FDA”)为静脉内药物应用设定了上限，为在一个小时内每千克体重每剂量5个内毒素单位(EU)(TheUnited States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。当以每千克体重几百或几千毫克的量施用治疗性蛋白质时(如目标蛋白质(例如抗体)就是这种情况)，甚至必须去除哪怕痕量的有害且危险的内毒素。在一些实施方案中，组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg，或小于5EU/mg，或小于1EU/mg，或小于0.1EU/mg，或小于0.01EU/mg，或小于0.001EU/mg。在一些实施方案中，本文提供的组合物或方法允许0.1EU/眼/注射。在一些实施方案中，本文提供的组合物或方法允许0.05EU/眼/注射。在一些实施方案中，本文提供的组合物或方法允许0.02EU/眼/注射。在一些实施方案中，本文提供的组合物或方法允许0.01EU/眼/注射。
根据本发明的组合物可以是单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
为了制备诸如片剂的固体组合物，将主要活性成分与药物载体(例如常规压片成分，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其他药物稀释剂(例如水)混合，以形成包含本发明化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均质混合物的固体预制剂组合物。当将这些预制剂组合物称为均相时，是指活性成分均匀地分散在整个组合物中，从而可以容易地将组合物再分为同等有效单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这种固体预制剂组合物再分为上述类型的单位剂型，其包含约0.1至约500mg的本发明的活性成分。可以将新组合物的片剂或丸剂包衣或以其他方式混合以提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内剂量和外剂量组分，后者为前者之上的包封形式。这两种组分可以由肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括多种聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的混合物。
合适的表面活性剂特别包括非离子型试剂，例如聚山梨酯或聚氧乙烯山梨聚糖(例如TweenTM 20、40、60、80或85)和其他山梨聚糖(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.01％至5％的表面活性剂，并且可以为0.01至0.02％或0.1至2.5％(聚山梨酯20或80)。将理解的是，如果需要，可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的媒介物。
可以使用可商购的脂肪乳剂如NTRALIPIDTM、LIPOSYNTM、INFONUTROLTM、LIPOFUNDINTM和LIPIPHYSANTM制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可以溶解在油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，并在与磷脂(例如鸡蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成乳剂。应当理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳剂的张度。合适的乳剂通常将包含多达20％的油，例如5％至20％。脂肪乳剂可以包含0.1至1.0μm，特别是0.1至0.5μm的脂肪滴，并且具有5.5至8.0的pH。
乳剂组合物可以是通过将IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合制备的那些。
用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可以包含如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过口服或鼻呼吸途径施用以产生局部或全身作用。可以通过使用气体将组合物(优选地，在无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物)雾化。雾化的溶液可以直接从雾化装置中呼吸，或者可以将雾化装置连接到面罩、面帐或间歇性正压呼吸机上。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的装置施用，优选地经口或经鼻施用。
试剂盒
本发明还提供了包含本文所述的任何或所有抗体的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个容器，其包含本文所述的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)或缀合物以及根据本文所述的本发明的任何方法使用的说明书。通常，这些说明书包括对用于上述治疗方法的IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)或缀合物的施用的描述。在一些实施方案中，提供了用于产生单剂量施用单位的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可以既包含具有干燥蛋白质的第一容器，又包含具有水性制剂的第二容器。在某些实施方案中，包括了含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干粉注射器(lyosyringe))的试剂盒。
在一些实施方案中，抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。有关使用IL-6拮抗抗体(和/或IL-6Ab-VEGF Trap)或缀合物的说明，通常包括有关预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、成批包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面说明，但是机器可读的说明(例如，磁性或光学存储磁盘上携带的说明)也是可以接受的。
本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。还考虑了与特定装置(例如预装注射器、吸入器、鼻腔给药装置(例如雾化器)或输液装置例如微型泵)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是IL-6拮抗抗体或缀合物。容器可进一步包含第二药物活性剂。
试剂盒可以任选地提供其他成分，例如缓冲液和解释性信息。在一些实施方案中，试剂盒可以包括一个额外的注射器和针头用于给药注射器的回注。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。
提供以下实施例仅用于说明性目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文中示出和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
实施例
尽管抗血管内皮生长因子(VEGF)生物药物在治疗新生血管性视网膜疾病方面取得了治疗成功，但由于(i)VEGF疗法耐药的患者，(ii)由于其他潜在病理如纤维化、伤口愈合和萎缩而对抗VEGF药物失去疗效的患者，(iii)由于需要频繁玻璃体内注射而导致治疗不足的患者，仍存在未满足的需求。以下是有关旨在抑制VEGF和IL-6两者的新型双特异性生物制剂的结果。
方法设计了双重抑制剂，并通过表面等离振子共振(SPR)表征了它们与各自靶标的结合亲和力。通过如下方法来测试分子的功能方面：(1)ELISA试验，其目标是竞争性阻断每个靶标与其各自受体，(2)可以进行VEGF和/或IL-6刺激的原代人类视网膜微血管内皮细胞(HRMVEC)增殖试验，并且(3)可以进行三维原代细胞共培养试验，来评估对芽生式血管生成(angiogenic sprouting)的抑制作用。
IL-6Ab-VEGF Trap构建体以pM亲和力与VEGF和IL-6结合。每个靶标的结合动力学独立于另一个靶标的存在，表明两个靶标可以同时结合而不受干扰。这些分子与它们的每个靶标的结合抑制了与它们各自同源受体的相互作用。
当在生物聚合物缀合物平台中结合时，这些双重抑制剂分子为视网膜疾病的下一代治疗和预防提供了进一步的治疗剂。
实施例1-抗体的产生和筛选
方法/结果：
抗IL-6
本实施例概述了抗IL-6和抗VEGF双重抑制剂分子的构建，该双重抑制剂分子包含工程化人IgG1框架中的IL-6抗体和与抗VEGF trap融合的IgG1 Fc结构域。这些分子的Fc结构域包含使效应子功能最小化的L234A、L235A和G237A取代，以及允许与延长半衰期的基于磷酸胆碱的生物聚合物进行位点特异性缀合的L443C(残基位置遵循EU编号)。
在大肠杆菌中进行文库扫描诱变，然后在哺乳动物系统中进行定点诱变，使工程化人IgG1框架中的抗IL-6抗体决定簇亲和力成熟。在大肠杆菌中实现了含有重链Fab和轻链Fab与抗IL-6CDR序列的双重表达质粒系统的构建。图3描绘了该过程的流程图，该过程产生了图5中的抗体重链可变区和轻链可变区。
构建了Fab文库，该文库包含所有71个CDR位置的随机单点突变，但由于与Cys、Met和Asn相关的化学不稳定性，不包括对这些氨基酸的取代。利用96孔板形式的小规模表达来筛选Fab文库。将含有随机单点突变的大肠杆菌菌落(TG1细胞，Zymo Research)挑入96孔板(1.5mL)中，并在30℃在LB Amp+2％葡萄糖中生长过夜。第二天，通过除去100μL培养物并添加100μL 30％甘油，创建一个单独的96孔板，然后保存在-80℃。将剩余的培养物离心20分钟，然后重悬于1.5mL含1mM IPTG的LB Amp中，在30℃诱导蛋白表达。5小时后，将细胞离心，重悬于500μL HBS-EP+缓冲液中，并通过一个冷冻/融化循环裂解。将裂解液离心30分钟，然后真空过滤(200μL)到圆底96孔板中进行Biacore分析。
使用Biacore T200(GE Healthcare)在25℃下测定抗IL-6Fab的亲和力。将CM5芯片用EDC和NHS激活，将重组人IL-6(R&D Systems)稀释到pH 5的10mM乙酸钠中，至0.1mg/mL的浓度，并注入激活的芯片上。通过使用针对每个芯片通道的可变流动时间，获得三个范围的抗原密度(100-150RU，300-400RU，400-600RU)，然后用乙醇胺封闭。以50μL/min的速度注入96孔过滤培养物裂解液的上清液120秒。使用解离曲线(300秒)与单指数衰减曲线的拟合来确定解离速率(koff)。在每个样品结合和解离循环后的60秒钟内，以50μL/min的速度注入10mM甘氨酸(pH 1.7)溶液使芯片表面再生。与野生型相比显示出相似或提高的koff值的克隆被送出进行DNA测序以鉴定突变。
从总共71个CDR残基位置中，筛选数据显示15个残基对IL-6结合至关重要，不能被其他任何氨基酸取代。可容许(tolerable)位置的取代产生了与亲本分子相似的koff值(表1.1)。随后将大部分这些单个替换引入到完整重链和轻链的基因中，克隆到哺乳动物表达载体中，所述表达载体共转染到3ml的Expi293细胞培养物中以生产蛋白质。在第五天，将这些培养物离心，并收集含有分泌抗体的上清液，并将其在HBS-EP+运行缓冲液(1∶20的比例)中稀释。点突变见表1.1-1.6
表1.1
重链CDR1
G26 F27 T28 F29 S30 P31 F32 A33 M34 S35
F crit_ crit_
L crit_ crit_
I crit_ crit_
V 4.05E-03 crit_ 5.41E-03 crit_
S 3.75E-03 3.93E-03 crit_ crit_
P 4.18E-03 crit_ crit_
T crit_ crit_
A 3.96E-03 crit_ crit_
Y 3.90E-03 5.11E-03 3.52E-03 crit_ crit_
H 5.24E-03 crit_ crit_ 3.92E-03
Q crit_ crit_ 3.54E-03
K 4.08E-03 crit_ crit_
D crit_ crit_
E 4.28E-03 crit_ crit_
W 3.69E-03 crit_ crit_ 3.97E-03
R 3.81E-03 3.94E-03 crit_ crit_
G 4.01E-03 3.77E-03 crit_ 5.25E-03 crit_
表格显示了定义CDR中每个可容许取代的koff值(s-1)。总体而言，突变体呈现出与亲本分子相似的koff(4.94E-03±7.67E-04)。对IL-6结合至关重要且不容许替代的残基表示为“crit”。
表1.2
重链CDR2
Figure BDA0002756846400001541
表格显示了定义CDR中每个可容许取代的koff值(s-1)。总体而言，突变体呈现出与亲本分子相似的koff(4.94E-03±7.67E-04)。对IL-6结合至关重要且不容许替代的残基表示为“crit”。
表1.3
重链CDR3
Figure BDA0002756846400001551
表格显示了定义CDR中每个可容许取代的koff值(s-1)。总体而言，突变体呈现出与亲本分子相似的koff(4.94E-03±7.67E-04)。对IL-6结合至关重要且不容许替代的残基表示为“crit”。
表1.4
轻链CDR1
S24 A25 S26 I27 S28 V29 S30 Y31 M32 Y33
F 5.94E-03 5.10E-03 6.18E-03
L 5.93E-03 5.43E-03 4.92E-03
I 4.12E-03
V 4.16E-03 4.55E-03
S 4.80E-03
P 3.97E-03
T 4.79E-03
A 6.54E-03
Y
H 4.27E-03
Q
K 4.16E-03 4.41E-03
D
E 4.51E-03
W 5.69E-03 3.98E-03
R
G 3.94E-03 6.77E-03 5.11E-03
表格显示了定义CDR中每个可容许取代的koff值(s-1)。总体而言，突变体呈现出与亲本分子相似的koff(4.94E-03±7.67E-04)。对IL-6结合至关重要且不容许替代的残基表示为“crit”。
表1.5
轻链CDR2
Figure BDA0002756846400001561
表格显示了定义CDR中每个可容许取代的koff值(s-1)。总体而言，突变体呈现出与亲本分子相似的koff(4.94E-03±7.67E-04)。对IL-6结合至关重要且不容许替代的残基表示为“crit”。
表1.6
轻链CDR3
M88 C89 W90 S91 G92 Y93 P94 Y95 T96
F crit_ crit_ crit_ crit_
L crit_ crit_ crit_ crit_ 4.78E-03
I crit_ crit_ crit_ crit_ 6.08E-03 4.23E-03
V 4.95E-03 crit_ crit_ crit_ crit_ 5.04E-03
S 6.01E-03 crit_ crit_ crit_ crit_
P crit_ crit_ crit_ crit_
T crit_ crit_ crit_ crit_
A 4.79E-03 5.85E-03 crit_ 5.59E-03 crit_ crit_ crit_
Y crit_ crit_ crit_ crit_
H crit_ crit_ crit_ crit_
Q crit_ crit_ crit_ crit_
K crit_ 5.49E-03 crit_ crit_ crit_
D crit_ crit_ crit_ crit_
E crit_ crit_ crit_ crit
W crit_ crit_ crit_ crit_
R crit_ crit_ crit_ crit_
G crit_ crit_ crit_ crit_ 4.62E-03
表格显示了定义CDR中每个可容许取代的koff值(s-1)。总体而言，突变体呈现出与亲本分子相似的koff(4.94E-03±7.67E-04)。对IL-6结合至关重要且不容许替代的残基表示为“crit”。
使用Biacore T200在25℃下测量这些单一突变分子与IL-6的结合动力学。通过以10μL/min的速率注入1∶20稀释的细胞上清液60秒，将抗体捕获在蛋白质A芯片(GE)上。使五种浓度(0.56、1.67、5、15和45nM)的IL-6以30μL/min的流速流过捕获的抗体60秒，并以单循环动力学Biacore分析形式解离180秒。通过以50μL/min的流速注入10mM甘氨酸(pH 1.7)60秒来再生传感器芯片。适用时，在37℃下使用相似的测定设置监测纯化的抗体样品与IL-6之间的相互作用。对于此设置，将1μg/mL的纯化抗体以10μL/min的速度注射到蛋白质A芯片上25-28秒。使用BIAevaluation软件(GE)对上清液和纯化的样品进行数据分析。将所有传感图减去双参照，并使用1：1Langmuir结合模型拟合。
从测试的所有单点突变(表1.7)来看，重链CDR2(抗体可变结构域的顺序编号)的G66D突变导致亲和力显著提高(相对于野生型，KD降低了约2倍：分别为6.95x10-11M和1.58x10-10M)。保留G66D，诱变剩下的、可能具有制造相关化学不稳定性的重链和轻链CDR残基(Cys、Met、Asn)。基于此前提，生成了包括三重突变的两个重链变体(表1.9)：I)M34I/G66D/I108V，II)M34W/G66D/I108V，和包括三重和四重突变的三个轻链变体(表1.10)：III)M32L/M50D/N52S/M88Q，IV)M32L/M50A/N52S/M88Q，V)M32L/M50D/M88Q(残基位置遵循抗体可变重链的顺序编号)。我们使用针对单点突变所描述的相同Biacore分析设置，评估了IL-6与这些变体中所有可能组合的结合。我们的发现表明，这些突变抵消了单点G66D突变的影响，同时使与IL-6的亲和力更接近亲本CDR序列(表1.8)。基于这些结果，将这些改造的CDR并入抗IL-6和IL-6Ab-VEGF Trap的设计中。
表1.7
Figure BDA0002756846400001581
Figure BDA0002756846400001591
Figure BDA0002756846400001601
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Figure BDA0002756846400001671
Figure BDA0002756846400001681
抗IL-6单点突变的Biacore动力学。在25℃获得先前样品(sup)的数据，并在纯化之后在37℃获得数据。将选择为在最终CDR组合(表4)处的突变用斜体表示。将在细菌筛选中不容许突变的CDR位置表示为关键的(critical)。
表1.8
Figure BDA0002756846400001682
抗IL-6CDR变体的Biacore动力学。在25℃下从细胞培养上清液(sup)获得动力学数据并在37℃下从纯化样品获得动力学数据。重链和轻链CDR突变分别显示在左侧和右侧(重/轻)。表中列出了捕获、kon(ka)、koff(kd)速率和解离常数。
表1.9.抗IL-6重链可变区序列。CDR的一些实施方案标有下划线。
Figure BDA0002756846400001683
Figure BDA0002756846400001691
表1.10.抗IL-6轻链可变区序列。CDR的一些实施方案标有下划线。
Figure BDA0002756846400001692
实施例2
抗IL-6AB VEGF TRAP分子的设计与构建
IL-6Ab-VEGF Trap的VEGF结合部分由VEGFR1结构域2和VEGFR2结构域3之间的融合物组成(表2.0)。这种融合物起着VEGF trap的作用，阻止VEGF与细胞VEGF受体结合。
表2.0.VEGF TRAP序列
Figure BDA0002756846400001693
测试了含有两种不同构型的VEGF trap的12种构建体(表2.1)。在第一种构型中，VEGF trap位于蛋白质的开头，然后是重复序列的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser接头(GS)，该接头将VEGF trap连接到抗IL-6重链的N末端(VEGF Trap-抗IL-6；表2.1，分子A-F)。在第二种构型中，重链的可变结构域和恒定结构域(Fab区)通过GS接头与VEGF Trap连接，然后将Fc结构域融合到VEGF trap的C末端。因此，在该构型中，VEGF trap被夹在抗体Fab和Fc区之间(抗IL-6-VEGFTrap；表2.1，分子G-L)。
表2.1.双重抑制剂分子的重链和轻链序列。CDR的一些实施方案在重链和轻链中都标有下划线，VEGF TRAP序列为粗体，Gly-ser接头为斜体(并加粗)。
Figure BDA0002756846400001701
Figure BDA0002756846400001711
Figure BDA0002756846400001721
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Figure BDA0002756846400001831
Figure BDA0002756846400001841
Biacore(设置如前一节所述)动力学数据表明，尽管所有变体之间的KD值都是相当的，但上清液样品的捕获值却有不同(表2.2)。该参数对溶液中存在的抗体的数量敏感，这表明由于不同的CDR组成，这些分子之间的蛋白质表达水平存在差异。另一方面，所测试的两个VEGF Trap位置对动力学数据没有显著影响。监测表达水平的实验(数据未显示)显示，与VEGF Trap-抗IL-6构型相比，IL-6-VEGF Trap构型的表达产率高约20％。初步的Biacore数据还表明，抗IL-6-VEGF Trap构型与VEGF同源物——胎盘生长因子(PLGF)的结合更紧密(数据未显示)。
表2.2.
双重抑制剂变体A-L与IL-6结合的Biacore动力学数据。在25℃下从细胞培养上清液(sup)获得动力学数据并在37℃下从纯化样品获得动力学数据。列出了捕获、kon(ka)、koff(kd)速率和解离常数。
Figure BDA0002756846400001842
Figure BDA0002756846400001851
实施例3
通过Biacore分析双重抑制剂与VEGF的结合
为了评估不同的双重抑制剂构型与VEGF的结合动力学，进行了一系列Biacore分析，以测量这些分子之间的亲和力。在含有1mg/mL BSA的HBS-EP+缓冲液中，在37℃下测量了结合动力学。在蛋白质A芯片(GE)上以10μL/min的速度捕获抗VEGF试剂(VEGF Trap-抗IL-6(5μg/mL)、抗IL-6-VEGF Trap(5μg/mL)、OG1950(1μg/mL)和Eylea(0.5μg/mL)，持续25秒，使五种浓度的VEGF-A165(0.19、0.56、1.67、5、15nM)以30μL/min的速度流过捕获的抗体，持续120秒，并解离30分钟。通过以50μL/min的流速注入10mM甘氨酸(pH 1.7)60秒来再生传感器芯片表面。所有传感图减去双参照，并使用1：1Langmuir结合模型拟合。
数据显示，双重抑制剂分子中的VEGF trap组分与VEGF-A紧密结合，而与构型无关。抗IL-6分子组分似乎并未影响VEGF-A与VEGF trap的结合，因为双重抑制剂分子对VEGF的亲和力与另一种基于VEGF trap的分子(Eylea)相似。(图7)
IL-6和VEGF-A与双重抑制剂分子的结合
执行了Biacore分析以直接监测IL-6和VEGF-A的双重结合。在蛋白质A芯片(GE)上以10μL/min的速度捕获双重抑制剂分子(2μg/mL)，持续25秒，使五种浓度的IL-6和/或VEGF-A165(0.19、0.56、1.67、5、15nM)以30μL/min的速度分别或混合流过捕获的抗体，持续120秒，然后解离30分钟。通过以50μL/min的流速注入10mM甘氨酸(pH 1.7)60秒来再生传感器芯片表面。所有数据均减去双参照，并使用各个IL-6和VEGF-A传感图的总和来创建理论曲线，并将其与混合样品的传感图进行比较。
结果表明，理论曲线和实验曲线几乎是重叠的，这有力地支持了一个模型，在该模型中，两个靶标均与双重抑制剂分子结合而不影响它们各自的相互作用。(图8)
抗IL-6结合IL-6/IL-6-R复合物ELISA
IL-6/IL-6R复合物可以与膜结合受体gp130结合，而这种三聚体复合物能够刺激IL-6信号传导，例如细胞增殖和VEGF的上调。抑制IL-6结合IL-6R或IL-6/IL-6R结合gp130均会阻断IL-6介导的下游信号传导通路。为了确定抗IL-6抗体是否阻断这些结合事件中的任何一种，首先建立了ELISA来评估当IL-6与IL-6受体复合时抗IL-6抗体是否可以结合IL-6。
用100μl的1μg/ml重组人IL-6R(R&D Systems)包被Nunc MaxiSorp ELISA过夜。将10nM IL-6(R&D Systems)与抗IL-6的3倍系列稀释液(终浓度为30nM降至10pM)混合。封闭并洗涤后，将混合物加入到IL-6R包被的板中。该测定还通过以下操作进行：首先将IL-6R包被的板用10nM IL-6孵育，洗涤，然后添加抗IL-6抗体。对于这两种方法，用抗人IgG HRP抗体检测结合的抗体/IL-6复合物，并用TMB(KPL)显影10分钟。在SpectraMax Plus读板器(Molecular Devices)上测量450nM的吸光度，并使用GraphPad Prism软件针对抗体浓度作图，并用非线性回归曲线进行拟合。
用100μl的1μg/ml重组人IL-6(R&D Systems)包被Nunc MaxiSorp ELISA过夜。进行了抗IL-6的3倍系列稀释(R&D Systems；终浓度为30nM降至10pM)，并将溶液添加到封闭的IL-6包被的板上。用抗人IgG HRP抗体检测抗体/IL-6复合物，并用TMB(KPL)显影10分钟。在SpectraMax Plus读板器(Molecular Devices)上测量450nM的吸光度，并使用GraphPadPrism软件针对抗体浓度作图，并用非线性回归曲线进行拟合。
在测试的条件下，此处描述的抗IL-6抗体与IL-6特异性结合，但当IL-6与IL-6受体复合时则抗IL-6抗体不与IL-6特异性结合，这表明该抗体和IL-6R在IL-6上具有一个共同的表位。结果如图4所示。
竞争性IL-6/IL-6R ELISA
然后进行ELISA以确定抗IL-6抗体和IL-6/VEGF双重抑制剂是否阻断IL-6与IL-6R的结合。
用100μl的1μg/ml的抗IL-6/IL-6R复合物抗体(R&D Systems；IL-6/IL-6RDuoSet)包被Nunc MaxiSorp ELISA过夜。将板在2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS-吐温(PBST)溶液中封闭2小时。封闭期间，在室温下孵育6nM的IL-6(R&D Systems)、1nM的IL-6R(R&DSystems)和双重抑制剂或单臂对照的8点、3倍稀释系列(从30nM开始)。然后在洗涤步骤之后将该混合物添加至ELISA板。1小时后，将板洗涤并与生物素化的抗IL-6/IL-6R抗体(R&DDuoset)一起孵育。用链霉亲和素-HRP(1：2000稀释；R&D Systems)检测IL-6/IL-6R复合物，并使用TMB试剂(KPL)显影10分钟。在SpectraMax Plus读板器(Molecular Devices)上测量450nM的吸光度，并使用GraphPad Prism软件针对抗体浓度作图，并用非线性回归曲线进行拟合。
在这些条件下，抗IL-6抗体和IL-6/VEGF双重抑制剂与IL-6R有效竞争与IL-6的结合，因此抑制了IL-6/IL-6R的相互作用。双重抑制剂分子的IC50值相当(抗IL-6＝0.36nM，VEGF Trap-抗IL-6＝0.47nM，抗IL-6-VEGF Trap＝0.32nM)，表明该分子构型不影响IL-6结合或抑制。Eylea用作阴性对照。(图9)
竞争性VEGF/VEGFR ELISA
为了评估VEGF trap的功能，通过竞争性ELISA测试了IL-6/VEGF双重抑制剂阻断VEGF与其受体(VEGFR)结合的能力。
用100μl的1μg/ml的重组人VEGFR-Fc(R&D Systems)包被Nunc MaxiSorp ELISA过夜。将板在2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS-吐温(PBST)溶液中封闭2小时。封闭期间，将100pM生物素化的VEGF(btVEGF；R&D Systems)与浓度增加的抗IL-6-VEGF Trap、VEGF Trap-抗IL-6或二价抗VEGF抗体OG1950一起孵育。用链霉亲和素-HRP(1：2000稀释；R&D Systems)检测结合的bt-VEGF，并使用TMB试剂(KPL)显影10分钟。在SpectraMax Plus读板器(Molecular Devices)上测量450nM的吸光度，并使用GraphPad Prism软件针对抗体浓度作图，并用非线性回归曲线进行拟合。
在这些条件下，IL-6/VEGF双重抑制剂可与VEGF结合并抑制其与其受体结合。与VEGF trap位于抗IL-6抗体的Fab和Fc结构域之间的分子相比，当VEGF trap位于抗IL-6抗体的N末端时，VEGF抑制的效力高大约2.5倍(IC50分别为1.74nM vs.4.53nM)，这可能是因为化合价从2个结合位点变为了1个结合位点。结果如图9所示。
实施例4
IL-6-VEGF桥接ELISA
为了确保双重抑制剂可以同时与IL-6和VEGF结合，使它们进行桥接ELISA，其中它们首先与板结合的IL-6相互作用，然后与生物素化的VEGF(btVEGF)一起孵育。通过链霉亲和素HRP检测到btVEGF表明，IL-6结合的分子也能够结合btVEGF。
用100μl的1μg/ml的重组人IL-6(Tonbo Sciences)包被Nunc MaxiSorp ELISA过夜。将板在2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS-吐温(PBST)溶液中封闭2小时。封闭期间，将100pMbtVEGF与浓度增加的抗IL-6-VEGF Trap、VEGF Trap-抗IL-6或二价抗VEGF抗体OG1950(作为阴性对照)一起孵育。用链霉亲和素-HRP(1：2000稀释；R&D Systems)检测结合的btVEGF，并使用TMB试剂(KPL)显影10分钟。在SpectraMax Plus读板器(Molecular Devices)上测量450nM的吸光度，并使用GraphPad Prism软件针对抗体浓度作图，并用非线性回归曲线进行拟合。
该测定证实，IL-6/VEGF双重抑制剂同时结合IL-6和btVEGF。抗IL-6和VEGF Trap的取向具有稍微可变的结合，在这些条件下，抗IL-6-VEGF Trap的取向更有利(EC50 VEGFTrap-抗IL-6＝0.079nM和抗IL-6-VEGF Trap＝0.026nM)。Eylea和抗IL-6用作阴性对照。结果如图9所示。
实施例5
路线1 OG1802的合成。
合成OG1802的第一路线如下。首先，如下合成具有图2A所示结构的TFA/胺盐引发剂(化合物L)。
首先，如下合成具有图2B所示结构的化合物K。在氮气下200mL圆底烧瓶中放入化合物J(OG1563)(1.9g，2.67mmol，3.3当量)
Figure BDA0002756846400001891
和化合物E(0.525g，0.81mmol，1.0当量)(见图2L)，随后加入二甲基甲酰胺(10mL)，然后加入二异丙基乙胺(2.5mL，14.6mmol，18当量)。使用冰浴将烧瓶冷却至0℃。在约6分钟内向其中加入丙基膦酸酐溶液(50重量％的乙酸乙酯溶液，2.5mL，4.04mmol，5当量)。
将反应温热至室温并搅拌15分钟。加入水(20mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和乙酸乙酯(100mL)淬灭反应。分离有机层，水层用乙酸乙酯(75mL)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)、0.5M柠檬酸水溶液(40mL)、水(25mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并在真空下浓缩。残余物不用进一步纯化而直接使用，得到2.0g(0.80mmol，99％)的化合物K。
1H NMR(400MHz DMSO-d6):δ＝1.36(s,9H,OCCH3),1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J＝7.2Hz,6H,CCH2CH2NH),2.98(d,J＝5.6Hz,6H,CCH2NH),3.04(q,J＝6.0Hz,2H,OCH2CH2NH),3.18(s,2H,OCH2C),3.3-3.37(m,8H,CH2),3.47-3.55(m,12H,CH2),3.58(s,6H,OCH2C),3.87(s,6H,O＝CCH2O),4.27(s,18H,CCH2OC＝O),6.74(br t,1H,CH2NHC＝O),7.69(t,J＝6.8Hz,3H,CH2NHC＝O),7.84(t,J＝6.0Hz,3H,CH2NHC＝O)。
LC-MS(ES,m/z):[(M+2H-boc)/2]+计算值(C84H136Br9N7O33+2H-Boc)/2＝1196.6；实测值1196.6
接下来，如下合成化合物L(图2A)：在氮气下向100mL圆底烧瓶中加入化合物K(2.0g，0.8mmol)、二氯甲烷(10mL)，然后加入三氟乙酸(5mL)。将反应在室温搅拌30分钟。将反应物在真空下浓缩。用二氯甲烷(10mL)稀释反应物，并真空浓缩。使用乙腈(10mL)溶解残留物，通过注射器过滤器(Acrodisc CR25，PN 4225T)过滤，并加载到制备型HPLC柱上，并用60％乙腈的水溶液(含0.1％三氟乙酸)洗脱，直至98％乙腈(含0.1％三氟乙酸)。合并含有产物的试管，在真空下浓缩，冷冻并置于冻干机上。得到990mg(0.4mmol，2个步骤50％)化合物L，为白色粉末。
1H NMR(400MHz DMSO-d6):δ＝1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J＝7.2Hz,6H,CCH2CH2NH),2.97-3.0(m,8H,CCH2NH和OCH2CH2NH),3.17(s,2H,OCH2C),3.3(q,6H,CH2CH2NHC＝O),3.4-3.59(m,20H,CH2),3.87(s,6H,O＝CCH2O),4.27(s,18H,CCH2OC＝O),7.69-7.84(m,9H,CH2NHC＝O和NH3+两者)。
LC-MS(ES,m/z):[(M+2H)/2]+计算值(C84H136Br9N7O33+2H)/2＝1196.6；实测值1197.4。
接下来，将化合物L(图2A)用作引发剂来合成MPC聚合物。引发剂通常以约100mg/mL的DMF储备液形式制备。将引发剂和配体(2,2'-联吡啶)引入Schlenk管中。使用干冰/丙酮混合物将所得溶液冷却至-78℃，并在真空下脱气10分钟。将试管重新充满氩气，并在氩气下，将催化剂(CuBr，除非另有说明)引入到Schlenck管中(引发剂/催化剂(CuBr)/配体上的溴原子摩尔比保持在1/1/2)。溶液立即变成深棕色。密封Schlenk管，并立即用短周期的真空/氩气吹扫。通过将在氮气保护下的手套式操作箱中制备的一定量的单体与200标准酒精度(200proof)脱气乙醇混合，来制备HEMA-PC溶液。将单体溶液滴加到Schlenk管中(通过套管)(并通过轻微搅拌使其均匀)。温度保持在-78℃。对反应混合物施加完全真空至少10至15分钟，直到从溶液冒泡停止。然后将试管重新充满氩气并温热至室温。搅拌溶液，随着聚合的进行，溶液变得粘稠。3至8小时后或放置过夜后，将反应物直接暴露于空气中从而将Cu(I)氧化为Cu(II)，将反应淬灭，混合物变为蓝绿色，然后使其通过硅胶柱，以去除铜催化剂。通过旋转蒸发浓缩收集的溶液，并将所得混合物用四氢呋喃沉淀或用水渗析，然后冷冻干燥，得到一种能自由流动的白色粉末。下表5.0列出了使用化合物L作为引发剂的聚合物的聚合物数据。
表5.0
Figure BDA0002756846400001911
接下来，将马来酰亚胺Mal-PEG4-PFP酯扣合(如图2C所示)到上文提到的750kDa的聚合物上以得到OG1802。将聚合物R3707(使用L作为引发剂制备的750kDa聚合物，515mg)放入20mL的小瓶中，并使用乙醇(4.0mL)在搅拌40分钟后溶解。向其中加入4-甲基吗啉在乙腈(22uL)中的1％溶液。在单独的小瓶中，将Mal-PEG4-PFP(1.97mg)溶解在乙腈(1.0mL)中，并将该溶液在室温下历时约2分钟添加到聚合物溶液中，并将所得溶液搅拌过夜。反应物先后用0.1％三氟乙酸水溶液(2mL)(pH～5)和水(～12mL)稀释，通过注射器过滤器(AcrodiscSupor，PN 4612)过滤，并均匀地放入3个Amicon离心膜透析管中(30,000mwco)。将试管用水稀释并混合(各约5mL)，放入离心机(rpm 3200)中25分钟。去除滤液进行分析，同时将保留物用水稀释并混合(～10mL/管)。离心步骤再重复5次，然后除去保留物并放入小瓶中。用水冲洗Amicon膜管(每管2x～2mL)，并与保留物合并。通过注射器过滤器(Acrodisc Supor，PN4612)过滤保留物溶液，冷冻并置于冻干机上。得到485mg白色粉末。
实施例6-引发剂OG1786的合成
OG1786是用于聚合物合成的九臂引发剂，作为前体用于OG1802合成。每个臂用2-溴异丁酸酯终止，2-溴异丁酸酯能够在ATRP下引发聚合。如图2D所示，OG1786是三氟乙酸(TFA)的盐。OG1786的制备如下。首先，将OG1550与TFA(三氟乙酸)反应以生产OG1546，如图2E所示。
在配备有磁力搅拌棒和加料漏斗的1L圆底烧瓶中，加入OG1550(14.8g)、甲基叔丁基醚(MTBE)(350ml)和水(30ml)。搅拌混合物以溶解OG1550，然后在冰浴中冷却。在90分钟内向该混合物中滴加三氟乙酸(4.9ml)的水(90ml)溶液。加完后，将混合物再搅拌15分钟，然后从冰浴中移出，使其温热至室温。将混合物搅拌(从冰浴中移出后)另外4-5小时，直到tlc显示剩余约5％的起始原料，并且水溶液的pH在3至4之间(pH试纸)。
使混合物分层。用水(30ml)洗涤MTBE层。合并水层，然后将水层用MTBE(150ml)萃取。用水(30ml)洗涤该第二MTBE相。合并的水层用第三部分的MTBE(100ml)洗涤。第三MBTE相用水(25ml)洗涤。再次合并水层(～250ml，pH～4，通过pH试纸)。
通过冻干收集产物。得到11.5g白色固体。这种材料极易吸湿，因此最好在氮气下处理。通过LCMS确认产物。
然后使制备的OG1546与OG1563反应以得到OG1784(如图2F所示)。
在装备有搅拌棒的氮气下的250ml烧瓶中，添加OG1546(吸湿性的，9.0g)，随后添加N,N-二甲基甲酰胺(110ml)。将混合物在室温搅拌直至所有OG1546溶解(约15分钟)，然后加入OG1563(29.9g)，并将混合物再搅拌3分钟直至OG1563也溶解。将所得溶液在冰浴中冷却，并在3分钟内加入N,N-二异丙基乙胺(37.6ml)，然后在5分钟内逐滴滴加50％的丙基膦酸酐(T3P)的乙酸乙酯(34.5ml)溶液(T3P添加是放热的)。在添加完T3P后，将烧瓶从冷却浴中移出并使其达到室温。然后每隔5分钟取样一次以进行LCMS分析。反应显示出非常浅的黄色/棕褐色。
20分钟后，将反应再次在冰浴中冷却，并加入5ml水。然后将混合物从冷却浴中移出，再加入50ml水，然后加入50ml 0.5M柠檬酸，然后加入乙酸异丙酯(300ml)。使混合物分层。用另外的乙酸异丙酯(150ml)萃取水相(～300ml)。用于HPLC测试的水相为AQ1。合并的有机层用柠檬酸水溶液(115ml，65mM，其为15ml的0.5M柠檬酸加100ml水的混合物)洗涤，水相为AQ2
Figure BDA0002756846400001931
有机相用水/饱和氯化钠(100ml/25ml)洗涤，水相为AQ3(pH～3)。最后，有机相用饱和氯化钠(100ml)洗涤，水相为AQ4。所有AQ级分均未包含任何重要产物(未提供数据)。有机相通过LCMS确认产物。将产物用硫酸钠(80g)干燥、过滤并用乙酸异丙酯(75ml)冲洗，并在旋转蒸发仪上浓缩成棕褐色油(33.2g)。将粗品在氮气下储存过夜。
第二天，使粗产物达到室温，然后溶于乙腈/水(46ml/12ml)中，并使用HPLC滤盘(Cole-Parmer PTFE 0.2μm，产品号02915-20)过滤。将滤液分成三等份，并分三批纯化。
将滤液加载到用50％乙腈/水平衡的RediSep Rf Gold C18色谱柱(275g，SN 69-2203-339，批号24126-611Y)上。使用下面的梯度(溶剂A：水，溶剂B：乙腈)以100ml/min洗脱该物质。所有相关的级分通过HPLC检查。将判定为足够纯的级分合并(来自所有三次试验)，并在旋转蒸发仪上浓缩(浴温保持在约20℃)，然后在二氯甲烷(100ml)和水(5ml)/饱和氯化钠(25ml)之间分层。用二氯甲烷(2×30ml)将水层再萃取两次。合并的有机层用硫酸钠(35g)干燥、过滤、用DCM(30ml)冲洗并浓缩。通过LCMS方法确认产物和纯度。表6.0列出了R5172和R5228批次的分离收率和纯度。
表6.0
Figure BDA0002756846400001941
接下来，由OG1784制备OG1405，如图2G所示。在配备有磁力搅拌棒的500ml圆底烧瓶中加入OG1784(20.9g)，然后加入二氯甲烷(50ml)，然后加入三氟乙酸(20ml)。将混合物在室温搅拌，HPLC分析显示在23分钟内完全脱保护。将混合物在旋转蒸发仪上浓缩，再溶解于二氯甲烷(25ml)中并再次浓缩，然后再溶解于乙腈(25ml)中并再次浓缩。通过LCMS确认产物。由上面得到的物质(OG1405，34.5g，假定定量产量为21.0g)在下一步中用作粗油。无需纯化。
接下来，使OG1405与OG1402反应以制备OG1785，如图2H所示。在配备有搅拌棒的氮气下的500ml烧瓶中，放入OG1402(5.5g)，然后放入乙腈(70ml)，然后放入N,N-二异丙基乙胺(26.3ml)和T3P溶液(参见上文)(7.9ml)。将该溶液在室温下搅拌30分钟，然后在冰水浴中冷却，并加入OG1405(由上述得到的粗油，34.5g)的乙腈(70ml)溶液。将该混合物温热至室温。20分钟后，将反应在冰水浴中冷却，并用水(5ml)淬灭。然后使用旋转蒸发仪在真空下浓缩混合物至一半体积。取样用于LCMS。
再加入水(50ml)，然后加入0.5M柠檬酸(75ml)和乙酸异丙酯(175ml)。使混合物在5分钟内分层。用另外的乙酸异丙酯(50mL)萃取水层。合并的有机层用柠檬酸水溶液(0.13M，30ml，由10ml的0.5M柠檬酸和20ml水组成)洗涤。然后将有机层用饱和氯化钠(25ml)和水(25ml)的混合物洗涤，然后最后用饱和氯化钠(25ml)洗涤。然后将它们用硫酸钠(124g)干燥、过滤并用乙酸异丙酯(30ml)冲洗，并在旋转蒸发仪上浓缩成棕褐色油(27.3g)。取样用于LCMS分析。
将油溶解在乙腈/水(3：1，15ml/5ml)中，通过HPLC滤盘(Cole-Parmer PTFE膜0.2μm，产品编号02915-20)过滤，并分成三个相等的部分，每部分分别如下纯化。
将各部分加载到用50％溶剂B(乙腈)/50％溶剂A(水)平衡的Redi-Sep Gold C18色谱柱(275g，SN–69-2203-339，批号241234-611W)上。然后通过反相HPLC用溶剂A：水/溶剂B：乙腈梯度纯化该物质。合并适当的级分，并在二氯甲烷(150ml)和水(5ml)/饱和氯化钠(25ml)之间分层。将水相用二氯甲烷(2×50ml)萃取两次。合并的有机层用硫酸钠(60g)干燥、过滤并用二氯甲烷(40ml)冲洗并浓缩。通过各种分析方法(包括LCMS)确认结构和纯度：OG1785以泡沫状固体分离(R5329，19.0g，83％收率，95.1％纯度(a/a 210nm)，在4℃的氮气下存储。
接下来，使用三氟乙酸(TFA)去除OG1785上的叔丁氧羰基保护基，以得到OG1786，如图2I所示。
实施例7-聚合物OG1801的合成
首先由引发剂OG1786制备聚合物OG1801。OG1801具有胺官能团，它在聚合物合成过程中(比马来酰亚胺)更稳定。为了合成聚合物OG1801，使用了ATRP的改进版，其中，通过向Cu(II)中添加金属铜来原位生成铜物质(Cu(I))。根据单体(HEMA-PC)OG47的批次投入量以及目标分子量(MW)计算反应所需的起始原料和试剂。
在手套式操作箱中称取50g单体OG47，并在室温下添加200mL脱气的EtOH以溶解单体；取样进行单体浓度测试。在500mL烧瓶中称取Cu(II)、Bpy、Cu(0)；用氩气吹扫，同时向烧瓶中加入单体溶液；用塞子密封烧瓶，并抽真空25分钟，直到没有气泡为止。反应物的颜色逐渐从浅绿色变为深绿色，然后变为浅棕色。在手套式操作箱中称取约200mg引发剂OG1786，并在室温下溶解于约2000uL DMF，制备100mg/mL储备液；取样进行引发剂浓度和纯度测试；将引发剂溶液加入氩气下的烧瓶中。反应溶液变为深棕色，随着时间的流逝开始变稠；将体系密封，并使反应历时2天。
然后制备OG1801以添加马来酰亚胺，并如下去除催化剂(铜)：使用预装的
Figure BDA0002756846400001961
Rf正相硅胶柱去除催化剂。基于反应混合物中铜的量选择柱的尺寸。例如，使用330g色谱柱(目录号69-2203-330，色谱柱尺寸330g，CV＝443mL)用于50g批次的OG1801。因为EtOH是洗脱溶剂，所有连接均使用聚四氟乙烯管。
除去铜后，将所有级分分批转移至圆底烧瓶中，并通过旋转蒸发仪在45-50℃下减压蒸发EtOH至干。在此步骤中，监测从冷凝中收集到的EtOH量，以确保EtOH的去除率>90％。将该聚合物溶解在250mL的WFI中，并使用0.2μm的过滤器过滤。得到约150mg/mL的澄清至浅黄色聚合物溶液。该溶液可以在使用前在2-8℃下保存多达3个月。
实施例8-聚合物OG1802的合成
基于OG1801的批次投入量来计算反应中所需的起始原料和试剂。接头是3-马来酰亚胺基丙酸，NHS酯。向50g聚合物溶液(～150mg/mL)中加入30ml0.5M磷酸钠(在WFI中，pH8)。搅拌1分钟；用pH试纸测得pH为8.0。称取204.8mg的接头，并溶解在4.1mL的DMF中，制成50mg/mL的储备液。在强烈搅拌下，每分钟向聚合物溶液中逐滴添加815uL接头溶液。花费5分钟时间添加了4095uL的接头溶液。在室温下反应30分钟。用20mL 5％乙酸淬灭反应，使最终pH值为5。使用1L真空过滤器(0.2um)过滤溶液。
然后按以下方式纯化OG1802(图2K所示)：使用Milipore错流盒在水性体系中进行聚合物纯化。首先将聚合物溶液浓缩至250mL(～200mg/mL)。从储库中添加新鲜的WFI，并将新鲜WFI进料的流速调整为与渗透液相同(～2mL/min)。UF/DF设定在2-8℃过夜。通常使用2.5L的WFI(相对于聚合物溶液的体积比为10倍)。收集保留物样品以进行纯度测试。目标纯度>98％。用0.2μM 1L滤瓶过滤聚合物溶液。缀合前，聚合物溶液可在2-8℃下保存多达3个月。
实施例9-替代的磷酸胆碱聚合物
如下所述合成HEA-PC聚合物。与上述甲基丙烯酸酯HEMA-PC不同，HEA-PC(2-(丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯)为丙烯酸酯类，具有以下结构：
Figure BDA0002756846400001971
将HEA-PC聚合为实施例5中所示的引发剂(为化合物L)。
表9.0
Figure BDA0002756846400001972
Figure BDA0002756846400001981
通过将2.2mg引发剂溶解在11μl的干燥DMF中来制备200mg/mL的引发剂的储备溶液，并通过将4.6mg的Me6TREN溶解在23μL的干燥DMF中来制备200mg/ml的配体溶液。将8.25μl的引发剂的储备溶液和13.6μl的配体溶液倒入试管中。在-78℃下脱气5分钟，然后重新充满氩气，并添加1.2mg的CuBr。脱气并再次充满氩气。在-78℃下将HEA-PC的甲醇储备溶液(称出0.461g的HEA-PC并将其溶于0.5mL的甲醇中)添加到反应器内部的溶液中。用200μl甲醇冲洗小瓶，然后在-78℃下将其加入反应器中，然后加入0.5mL蒸馏水，然后加入200μl水。彻底脱气，直到看不见鼓泡且所有异质性消失(固体颗粒溶解或消失)。再充满4psi的氩气，让反应在室温下进行一小时。反应物已经很粘稠。使反应进行约一小时。加入联吡啶的甲醇溶液(5mg在0.5μL中)。加入另外的2-3ml甲醇，并使催化剂在4℃下氧化过夜。通过1H NMR测定的转化率估计为94％。
第二天，将聚合物透析并使用Shodex SB806M_HQ柱(7.8x300mm)在1x PBS pH 7.4中以1ml/min进行SEC/MALS分析，得到PDI为1.157，Mn为723.5kDa，Mp为820.4kDa，Mw为837.2kDa(透析前PDI为1.12，Mn＝695kDa，Mp＝778kDa)。接下来，将马来酰亚胺官能团添加到聚合物中，使得它可以与蛋白质缀合。
接下来，如实施例20中所示，将马来酰亚胺Mal-PEG4-PFP(参见上述实施例20)酯扣合到HEA-PC聚合物上。然后，可以将得到的马来酰亚胺官能化的HEA-PC聚合物与巯基缀合，如本文针对HEMA-PC聚合物所讨论的。
还使用具有以下结构的单体2-(丙烯酰基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯(Am-PC)制备丙烯酰胺PC聚合物：
Figure BDA0002756846400001991
使用Am-PC进行采用具有以下结构的三臂引发剂(TFA盐)的聚合反应：
Figure BDA0002756846400001992
Am-PC聚合物的合成如下进行：
表9.1
Figure BDA0002756846400002001
通过将9mg的Me6TREN溶解在45uL干燥DMF中来制备200mg/mL配体的储备溶液。将19.7uL所述储备溶液添加到反应容器中。通过将6.5mg的物质溶于32.5uL的DMF中，制备200mg/mL的引发剂的储备溶液。向上述配体中添加11uL引发剂储备溶液。脱气5分钟。加入1mg的CuBr。通过将4mg CuBr2溶解在20μL的DMF中来制备200mg/mL的CuBr2的储备溶液。将0.5g单体(AmPC)加入到1mL甲醇(缓慢溶解/粘稠溶液)中，然后加入1uL的CuBr2的储备溶液。将单体溶液滴加到上述反应混合物中。用1mL水冲洗。将反应混合物彻底脱气(冻融)。使反应进行24小时。
之后，可以对Am-PC聚合物进行透析。通过SEC/MALS测定上述聚合物的分子量：Mn为215kDa，Mp：250kDa，PDI为1.17。通过1H NMR估计转化率为94％。如上文针对HEMA-PC和HEA-PC所讨论的，可以将马来酰亚胺官能团添加至Am-PC聚合物。如上所述，可以将马来酰亚胺官能化的Am-PC聚合物与蛋白质缀合。
实施例10-用于计算化合物中游离马来酰亚胺的逆向Ellman分析
在向聚合物OG1801中添加马来酰亚胺官能团以形成OG1802后(参见上文)，使用Ellman分析法确定样品中的功能性马来酰亚胺的量，表示为官能百分比(即可缀合的)。硫醇将Ellman试剂(DTNB)转化为TNB-，然后在中性和碱性pH值的水中转化为TNB2-，其发出黄色(在412nm处测量)。用半胱氨酸建立标准曲线。由于马来酰亚胺与硫醇反应，因此该测定法实际上测量了残留的硫醇(半胱氨酸)。以(原始硫醇-聚合物添加马来酰亚胺后剩余的硫醇)/(原始硫醇)的摩尔比来计算抑制，并表示为百分比，其中百分比越高，马来酰亚胺官能度越高。
测定中使用的试剂：使用从62.5μM至2μM的半胱氨酸来制备标准曲线。通过将粉末溶解在1xPBS pH7.4(反应缓冲液)中并充分混合来制备聚合物储备溶液。将等摩尔的聚合物和半胱氨酸溶液混合并使其在27℃下反应30分钟。将150μM的DTNB溶液添加到半胱氨酸标准液和聚合物/半胱氨酸反应中，并在27℃下显色5分钟。在Spectramax读板器上读取412nm处的OD，并使用Softmax Pro软件和半胱氨酸标准曲线计算抑制百分比。
实施例11-抗IL-6-VEGF trap分子的纯化和脱帽(decap)
可以将重链和轻链克隆到表达质粒中，并转染到CHO细胞中。可以使细胞在合适的培养基中生长并收获。可以使用蛋白A亲和柱捕获和洗脱来纯化抗体(或者Ab-Trap)。抗体(或者Ab-Trap)位置443处的半胱氨酸(L443C(EU编号))残基通常被细胞培养基中的化学物质“加帽”或氧化，因此无法缀合。就这一点而言，可以对纯化的抗体(或者Ab-Trap)进行脱帽(即还原)程序以去除帽，并使游离的(即不参与Cys-Cys二硫键的)半胱氨酸残基与聚合物的马来酰亚胺官能团缀合。可以通过在环境温度下将纯化的抗体(或者Ab-Trap)蛋白与30x摩尔过量的还原剂(例如TCEP(3,3',3”-膦三基三丙酸)、3,3',3”-膦三基三(苯-1-磺酸)三钠(TPPTS)或类似的物质)混合，来进行脱帽反应。还原反应可以通过SDS-PAGE监测。还原后，可以使用Pellicon XL Ultrafiltration Cassette用20mM Tris pH7.5、100mMNaCl、0.5mM TCEP缓冲液交换抗体(或者Ab-Trap)的缓冲液，以去除帽。然后可以在相同的缓冲液交换设置中，用20mM Tris pH7.5、100mM NaCl除去TCEP试剂。然后可以在环境温度下使用15x摩尔过量的氧化剂DHAA(脱氢抗坏血酸)将还原的抗体(或者Ab-Trap)重新氧化1小时，该重新氧化反应再次通过SDS-PAGE分析进行监测。然后可以在相同的缓冲液交换设置中，用20mM Tris pH7.5、100mM NaCl去除DHAA试剂。
实施例12A-抗体(或者Ab-Trap)与MPC聚合物的缀合
脱帽的抗体(或者Ab-Trap)可以与聚合物OG1802缀合以产生生物缀合物。使用过量的OG1802(3-20倍摩尔过量)。可以通过阳离子交换HPLC色谱法监测缀合反应，并使其接近完成。抗体(或者Ab-Trap)缀合物可以通过阳离子交换色谱纯化，并通过超滤/渗滤(UF/DF)将缓冲液交换为制剂缓冲液。抗体(或者Ab-Trap)缀合物可以如上所述进行色谱纯化。
实施例12B--VEGFR-抗IL6与OG1802的缀合反应
VEGFR-抗IL6与OG1802的缀合过程涉及两个步骤：初始还原反应以去除半胱氨酸S保护基(脱帽)，然后通过马来酰亚胺-半胱氨酸化学过程与生物聚合物OG1802缀合。脱帽是通过首先用30x摩尔过量的3,3',3”-膦三基三丙酸(TCEP)将VEGFR-抗IL6还原(30-60分钟)，然后将缓冲液交换成20mM Tris-HCl pH7.5、100mM NaCl以去除半胱氨酸帽和TCEP(图28)。或者，也可以使用其他还原剂，如3',3”-膦三基三(苯磺酸)三钠盐(TPPTS)进行脱帽步骤。
然后，用15x摩尔过量的脱氢抗坏血酸(dHAA)将还原的VEGFR-抗IL6氧化(30-60分钟)，然后将缓冲液交换成20mM Tris pH 7.5、100mM NaCl以除去氧化剂(图28)。脱帽程序的累计产率为89％(TCEP还原–94％，dHAA氧化–95％)。
通过将终浓度为2.4mg/mL(或12.5μM)的VEGFR-抗IL6与5x摩尔过量的pH 8.0的生物聚合物OG1802混合来完成缀合过程。缀合过程在2-8℃下进行2至3天。通过阳离子交换色谱(CEX)和Poros XS树脂，使用含有20mM乙酸钠pH 5.5的缓冲液中的递增盐浓度(0-500mMNaCl)的不连续梯度，从未缀合的物质中纯化缀合的VEGFR-抗IL6(图29)。将含有生物缀合物VEGFR-抗IL6-OG1802的级分合并，将缓冲液交换成pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。缀合效率约为60％(由非还原SDS-PAGE和ImageJ分析确定)。从初始蛋白质材料到生物缀合物的累计产率约为27％。
SDS-PAGE(图30)和SEC-MALS(图31)分析表明，一个VEGFR-抗IL6分子(约189kDa)与一个OG1802聚合物分子(约794kDa)缀合，产生了约983kDa的生物缀合物。通过将10μg(蛋白质质量)以1mL/min的流速注入预先用PBS缓冲液平衡的符合光散射(miniDAWN TREOS)和折射率(Optilab T-rEX)检测器(Wyatt Technology)的尺寸排阻色谱柱(Shodex-SB806M-HQ)中，来进行SEC-MALS实验。在ASTRA 7(Wyatt Technology)中进行数据和蛋白质缀合物分析。
实施例13–VEGF Trap裂解鉴定和去除
如图11A和11B所示，源自ExpiCHO-S细胞的蛋白A纯化的VEGFR-抗IL-6和抗IL-6-VEGFR还原产物的SDS-PAGE显示出意想不到的条带，其大小取决于构建体的取向。这些条带表明，在生产过程中一部分双重抑制剂分子经历了裂解。在该实施例中，VEGFR-抗IL6对应于配对的重链分子和轻链，重链分子包含序列1A-2A-3H，轻链包含序列4A。抗IL-6VEGFR对应于配对的重链和轻链，重链包含序列5H(Fab)-2A-1A-5H(Fc)，轻链包含序列4A。
如图12所示，将这些蛋白条带转移到PVDF膜上，并通过Edman的N末端测序(Procise 494HT仪器)对蛋白条带的前六个残基进行测序。结果表明，裂解产物具有相同的N末端序列(93LTHRQT)，其位于VEGF trap区的VEGFR1结构域2内。
图13A和13B显示了在裂解位点侧翼区域的突变的结果(K89TNY/LTHR96)，该突变将破坏蛋白质裂解，同时保持蛋白质的整体稳定性和与VEGF结合的特性。这些突变是基于序列保守性选择的，为此，使用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)进行了序列相似性搜索和VEGFR1结构域2序列与哺乳纲内的蛋白质同源物之间的比对。根据其BLAST E值得分选择了500个最佳匹配。从包含500个序列的初始簇(簇_1)中，选择每个物种的最佳评分序列，将其缩减为一组106个代表性序列(簇_2)。基于在簇_2中观察到的裂解位点侧翼区域内的序列变化，得到了16个抗IL-6-VEGFR单点突变体并评估了蛋白裂解。这些突变最初仅引入抗IL-6-VEGFR构建体中，因为其在裂解产物和完整产物之间显示出更好的颗粒离析(size separation)，这应归于它们的分子量差异(～35kDa)。
图13A和13B示出了抗IL-6VEGFR突变体的SDS-PAGE结果，表明在裂解位点进行修饰倾向于减少裂解产物的量(箭头所示)。突变T94I和H95I(残基编号基于在VEGF trap序列上的位置)显著减少了VEGF trap裂解。具体地，图13A和13B显示，大多数突变减少了蛋白裂解，并且图13C所示的突变T94I(VEGFR_变体_1)和图13D所示的H95I(VEGFR_变体_2)具有更显著的作用。随后如图13E所示，将单点突变(T94I，H95I)和双点突变(T94I/H95I，VEGFR_变体_3)引入VEGFR-抗IL-6构建体中。图13C指示了T94I的位置(带下划线)。图13D指示了H95I的位置(带下划线)。图13E指示了T94I和H95I的位置(带下划线)。如图13F和13G所示，SDS-PAGE显示，观察到了类似的蛋白质裂解减少，并且当引入双重突变时，这种作用进一步增强。
实施例14–通过Biacore分析双重抑制剂VEGFR突变体与VEGF的结合
图14A至图14F示出了用于确定抗VEGF剂与VEGF之间的亲和力的一系列Biacore测定的结果。使用Biacore T200(GE Healthcare)在37℃的含1mg/mL BSA的HBS-EP+缓冲液中测量分子之间的结合动力学。将抗VEGF剂(VEGFR-抗IL-6(5μg/mL)、VEGFR_变体_1-抗IL-6(5μg/mL)、VEGFR_变体_2-抗IL-6(5μg/mL)、VEGFR_变体_3-抗IL-6(5μg/mL)和Eylea(3μg/mL))以10μL/min的速度在蛋白质A芯片(GE)上捕获25秒，使五种浓度的VEGF-A165(0.19、0.56、1.67、5、15nM)以30μL/min的流速流过捕获的抗体120秒，并解离60分钟。通过以50μl/min的流速注入10mM甘氨酸(pH 1.7)60秒来再生传感器芯片表面。所有传感图均减去双参照，并使用1：1Langmuir结合模型拟合。图14A-14F显示了引入单点突变T94I(VEGFR_变体_1-抗IL-6)、H95I(VEGFR_变体_2-抗IL-6)和双重突变T94I/H95I(VEGFR_变体_3-抗IL-6)最低程度地影响与VEGF的结合。从图14F中可以看出，传感图表明双重抑制剂分子VEGFR-抗IL-6和变体与Eylea一样紧密结合VEGF-A。在该实施例中，VEGFR-抗IL6分子对应于VEGFR变体(序列1A-1D)，其经由GS接头(序列2A-3H)与抗IL-6部分融合，所述接头与含有序列4A的轻链配对。
实施例15–基于细胞的VEGF刺激的VEGFR报告子测定
图15提供了基于细胞的VEGF刺激的VEGFR报告子测定结果。如上所述，双重抑制剂VEGFR-抗IL6阻断了VEGF结合VEGFR，并以与Eylea相同的程度刺激下游信号传导(IC500.18nM vs.0.11nM)，而抗IL-6抗体则没有任何作用。
对于实验，将Promega KDR/VEGF HEK293复苏-使用(thaw-and-use)细胞(CS181405；Promega)解冻并添加到4.6mL测定培养基(10％FBS的DMEM溶液)中。将25μL细胞转移至96孔板的每个孔中。将VEGF(终浓度为500pM)与抑制剂的10点、1：3系列稀释液(从100nM(终浓度)开始)混合，并孵育30分钟，然后向平板细胞中添加50μL。6小时后，将75μL制备的Bio-Glo试剂(Promega)添加到细胞中，并在室温下孵育3-10分钟。在iD3读板器(Molecular Devices)上测量发光。将相对发光单位归一化为每条曲线的最低抑制剂浓度，并使用GraphPad Prism软件绘制具有标准误差的重复平均值对抗体浓度对数的图形，并与非线性回归曲线进行拟合。在该实施例中，VEGFR-抗IL6对应于配对的重链分子和轻链，重链分子包含序列1A-2A-3H，轻链包含序列4A。
实施例16–HUVEC小管形成测定
图16A-16C示出了HUVEC小管形成测定的结果。
在添加了1x牛脑提取物内皮细胞生长套件(ATCC；生长培养基)的血管基础培养基中，在5％CO2中于37℃培养第2或3代HUVEC细胞。一旦细胞达到70％融合，就使用胰蛋白酶(0.05％；ATCC)将细胞从平板消化，将0.75x10^6个细胞接种在T25烧瓶中的生长培养基中。第二天，将培养基换为测定培养基(2％FBS的血管基础培养基溶液)。6小时后，将5μg/ml钙黄绿素AM直接添加到培养基中，并在37℃下孵育30分钟。同时，将200μL预解冻的Matrigel(生长因子降低；Corning)添加到8孔玻璃载玻片的每个孔中，并在37℃下孵育30分钟。在孵育过程中，将25nM的每种抑制剂(终浓度)与3nM VEGF(R&D)、12.5nM IL6(Tonbo)和25nMIL6R(Tonbo)(均为终浓度)混合。钙黄绿素AM孵育30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次，然后用胰蛋白酶消化。将收获的细胞以1,500xg离心3分钟，然后以500,000个细胞/mL的密度重悬于测定培养基中。然后将100μL细胞与100μL制备的抑制剂/复合溶液混合，然后转移至Matrigel包被的载玻片上，并孵育过夜。第二天，在EVOS荧光显微镜(Life Technologies)上使用10倍物镜和GFP滤镜对小管成像。每种情况至少拍摄2张代表性图像，然后使用用于ImageJ的Angiogenesis Analyzer插件(NIH)进行分析，该插件可评估和量化20个小管网络形成参数。
图16A-16C示出了来自4个独立实验的带有标准误差的平均值数据。使用非配对双尾学生t-检验从4个独立实验的所有重复样本中确定了统计学显著性。如图16C所示，与对照相比，VEGFR-抗IL6显著抑制20个参数中的17个血管生成参数。相比之下，Eylea抑制20个参数中的4个，而抗IL-6抑制20个参数中的7个。如图16B中的星号所示，VEGFR-抗IL6在抑制20个参数中的12个参数方面明显优于Eylea和抗IL-6。此外，t-检验统计数据如图16C所示。在该实施例中，VEGFR-抗IL6对应于配对的重链分子和轻链，重链分子包含序列1A-2A-3H，轻链包含序列4A。
在一些实施方案中，VEGFR-抗IL6构建体可提供协同机制，以改善特定高危(at-risk)人群中的疗效和持久性。高危人群包括糖尿病性视网膜病或一种或多种炎性视网膜疾病的高危人群或被诊断为糖尿病性视网膜病或一种或多种炎性视网膜疾病的人群。
实施例17–HUVEC增殖测定
图17示出了HUVEC增殖测定的结果。将HUVEC细胞(第2-5代)在37度在5％CO2中在补充有1x牛脑提取物内皮细胞生长套件(ATCC；生长培养基)中培养。一旦细胞达到70％融合，就使用胰蛋白酶(0.05％；ATCC)将细胞从培养板消化，并将3500个细胞/孔接种到96孔明胶包被的培养板的中间60个孔中的100uL的测定培养基(补充有L-谷氨酰胺、抗坏血酸、硫酸乙酰肝素、氢化可的松和1％FBS的血管基础培养基)(Corning)中。饥饿24小时后，用与抑制剂的10-点、1:3稀释系列(从100nM开始)混合的VEGF(1.5nM)、IL-6(5nM)和IL6R(10nM)刺激细胞。当彼此独立添加时，这些浓度的VEGF和IL-6诱导次最大水平的(sub-maximallevel)增殖，但当组合时显示出协同生长曲线。48小时后，根据制造商的说明，使用CellTiterBlue试剂(Promega)在iD3读板器(Molecular Devices)上测量细胞活力。对于吸光度测量，确定A570/A605的比率，并针对每次重复将数据相对于对照(无抑制剂)细胞归一化。对于每个重复，将荧光测量值(555ex/605em)相对于对照细胞归一化。
如图17所示，使用GraphPad Prism软件将归一化的值绘图，为带有标准误差的重复实验的平均值对抗体浓度，并用非线性回归曲线拟合。
从图17中可以看出，VEGFR-抗IL6双重抑制剂阻断了IL-6和VEGF对HUVEC增殖的协同刺激，而在这种条件下，Eylea和抗Il-6均不影响HUVEC的生长。
实施例18–改进的抗IL-6抗体决定簇的产生
在本实施例中描述了改进的抗IL-6抗体决定簇的产生。Biacore动力学结果示于表18.1、18.2、18.3和18.4中。
为了在工程化的人IgG1框架上提供优异的抗IL-6抗体决定簇，使G66D(CDR2)重链突变体亲和力成熟。首先，构建了含有位置S35、I51、T63和T65处的随机单点突变的G66D全重链文库，由于与Cys、Met和Asn相关的化学不稳定性，不包括对Cys、Met和Asn的取代。根据在细菌和哺乳动物筛选中观察到的这四个位置的突变耐受性，而选择了这四个位置。将含有重链突变的哺乳动物表达载体与轻链野生型和变体M32L/M50D/N52S/M88Q共转染到3mLExpi293细胞培养物中，孵育5天。将这些培养物离心，并收集含有分泌抗体的上清液，并在HBS-EP+运行缓冲液中稀释(1:20的比例)。
下表18.1-18.4中提供了各种构建体和所得的动力学性质。
表18.1
抗IL-6重链双重突变体的Biacore动力学
Figure BDA0002756846400002091
表18.2
具有诱变轻链的抗IL-6重链双重突变体的Biacore动力学
Figure BDA0002756846400002101
表18.3
抗IL-6重链三重突变体的Biacore动力学
Figure BDA0002756846400002111
表18.4
与诱变轻链配对的抗IL-6重链三重突变体的Biacore动力学
Figure BDA0002756846400002112
使用Biacore T200在37℃下测量了这些突变分子与IL-6的结合动力学。通过以10μL/min的速度注入1:20细胞上清液稀释液60秒，将抗体捕获在蛋白质A芯片(GE)上。使五种浓度(0.56、1.67、5、15和45nM)的IL-6以30μL/min的流速流过捕获的抗体60秒，并以单循环动力学Biacore分析形式解离180秒。通过以50μl/min的流速注入10mM甘氨酸(pH 1.7)60秒来再生传感器芯片。当适用时，在37℃下使用相似的测定设置来监测纯化的抗体样品与IL-6之间的相互作用。对于此设置，将1μg/mL的纯化抗体以10μL/min的速度注射到蛋白质A芯片上25秒钟。使五种浓度(0.56、1.67、5、15和45nM)的IL-6以30μL/min的流速流过捕获的抗体60秒，并以单循环动力学Biacore分析形式解离1800秒。通过以50μl/min的流速注入10mM甘氨酸(pH 1.7)60秒来再生传感器芯片。使用BIAevaluation软件(GE)对上清液和纯化的样品进行数据分析。所有传感图减去双参照，并使用1：1Langmuir结合模型拟合。
如表18.1和18.2所示，S35H G66D双突变重链相对于野生型重链在捕获水平上增加了大约两倍，这表明蛋白质表达增强。根据所配对的轻链，该突变体还表现出亲和力的少量增加(轻链为野生型：约2倍，轻链为M32L/M50D/N52S/M88Q：约1.3倍)。表18.1示出了针对抗IL-6重链双重突变体的LC野生型Biacore动力学的G66D优化。获得了纯化前样品(上清)和纯化后的样品的数据(均在37℃下获得)。表18.2示出了与诱变的轻链配对的抗IL-6重链双重突变体的LC突变体Biacore动力学的G66D优化。获得了纯化前样品(上清)和纯化后的样品的数据(均在37℃下获得)。
因此，选择该双重突变体作为另一轮的起点，如对于G66D筛选回合所述，将CDR3的取代耐受位置Q99和L100随机诱变，表达并评估IL-6结合。如表18.3和18.4所示，如捕获水平所指示的，与野生型相比，Ala、Ser、Gly、Thr、Gln、Lys的L100取代表现出优异的表达。因此，选择这些突变体用于纯化和IL-6结合评估。如表18.3和18.4所示，对纯化的材料的亲和力测量也显示出优异的IL-6结合。基于这些结果，如图18所示，将这些另外的修饰的CDR引入抗IL-6和抗VEGF双重抑制剂分子的设计中。
表18.3示出了针对抗IL-6重链三重突变体的G66D/S35H重链修饰配对LC野生型Biacore动力学。获得了纯化前样品(上清)和纯化后的样品的数据(均在37℃下获得)。表18.4示出了与诱变的轻链配对的抗IL-6重链三重突变体的G66D/S35H重链修饰配对LC突变体Biacore动力学。获得了纯化前样品(上清)和纯化后的样品的数据(均在37℃下获得)。
实施例19—抗IL-6抗VEGF双重抑制剂变体
根据VEGF trap变体和优异的抗IL-6抗体决定簇的结果，设计了两种不同构型的216个分子，它们由如图19、20、21、22和23所示的序列组合组成。对于第一种构型(VEGFR-抗IL-6)，VEGF trap(如图19的序列1A-1D所示)位于蛋白质的开头，然后是两个重复的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser接头(GS)(如图20的序列2A所示)，它将trap连接到抗IL-6重链(如图21的序列3A-3I所示)的N末端。这些构建体可以与图22的序列4A-4C所列的轻链配对。在第二种构型(抗IL-6-VEGFR)中，重链的可变结构域和恒定结构域(如图23的序列5A-5I的重链—Fab所示)与VEGF trap(如图19的1A-1D所示)通过GS接头(如图20的序列2A所示)连接，然后Fc结构域(如图23的序列5A-5I的重链—Fc所示)与VEGF trap的C末端融合。因此，VEGFtrap被夹在抗体Fab区和Fc区之间。
图19示出了VEGF trap序列。序列的变化用下划线标出并以粗体突出显示。图20示出了两个重复Gly-Gly-Gly-Gly-Ser接头(GS)序列。图21示出了抗IL-6分子的重链序列。CDR用下划线标出。图22示出了抗IL-6分子的轻链序列。CDR用下划线标出。图23示出了抗IL-6分子的重链序列(分为Fab和Fc)。CDR用下划线标出。
在一些实施方案中，VEGF trap的任何选择(其中其夹在抗体Fab区和Fc区之间)均可以与图22的序列4A-4C所列出的轻链配对。因此，在一些实施方案中，图19中概述的构建体(VEGFR序列)可用于本文提供的任何VEGF trap布置，或单独使用。
实施例20-VEGFR-trap Fc融合物与VEGF之间的结合动力学
抗IL-6抗IL-6图26A-26C示出了用于确定抗VEGF剂与VEGF之间的亲和力的Biacore测定的结果。在含有1mg/mL BSA的HBS-EP+缓冲液中，在37℃下使用Biacore T200测量了结合动力学。在蛋白质A芯片(GE)上以10μL/min的速度捕获VEGFR-Fc(1μg/mL)和Eylea(1μg/mL)，持续25秒，使五种浓度的VEGF-A165(0.19、0.56、1.67、5、15nM)以30μL/min的速度流过捕获的抗VEGF分子，持续120秒，并解离30分钟。通过以50μL/min的流速注入10mM甘氨酸(pH 1.7)60秒来再生传感器芯片表面。所有传感图减去双参照，并使用1：1Langmuir结合模型拟合。如图26A-26C所示，VEGFR-Fc和Eylea以相似的亲和力与VEGF结合。在这个实施例中，VEGFR-Fc包含序列6A。
实施例21--除去裂解产物
如实施例13中所讨论的，VEGFR-抗IL6在VEGF trap区的VEGFR1结构域2处呈现较小程度的裂解。在蛋白A纯化步骤之后，我们开发了两种正交色谱方法来从裂解的物质中分离完整蛋白：i)阳离子交换(CEX)和ii)疏水相互作用(HIC)。
对于CEX方法，将VEGFR-抗IL6蛋白A洗脱液的溶液pH调整为6，然后将其注入预先用20mM磷酸钠pH 6平衡的Porous XS色谱柱中。完整蛋白质的离子强度比裂解物质要低，并且在离子强度递增的线性梯度内(0-1M氯化钠)几乎被完全分离(图32)。合并富含完整蛋白质的级分，总回收率约为57％。
对于HIC方法，将富含裂解物质的VEGFR-抗IL6完整蛋白的混合液注入预先用20mM磷酸钠pH 6、500mM-1M硫酸铵平衡的Butyl HP柱中。完整蛋白和裂解蛋白在离子强度递减的线性梯度(1-0M硫酸铵)内分离，其中完整蛋白质的离子强度比裂解物质要低，并且可以根据合并的级分部分或完全分离(图33)。
实施例22--通过KinExA测量的VEGFR抗IL6与IL6和VEGF-A的亲和力
使用动力学排斥分析
Figure BDA0002756846400002141
3200系统(Sapidyne Instruments Inc.，Boise，ID)测量溶液中VEGFR-抗IL6或VEGFR-抗IL6-OG1802(其蛋白质成分如图27所示)与VEGF或IL6之间的平衡结合亲和力和动力学。使用包被有VEGF或IL6的Azlactone珠子从VEGFR-抗IL6或VEGFR-抗IL6-OG1802和VEGF或IL6的平衡样品中捕获一部分游离的VEGFR-抗IL6或VEGFR-抗IL6-OG1802。用荧光标记的多克隆抗人抗体(Alexa 647山羊，抗人IgG)检测捕获的双重抑制剂分子。
在递增的双重抑制剂浓度及其对应的VEGF滴定系列稀释度(在括号中表示)下，由2-3个滴定曲线，确定了双重抑制剂分子与VEGF之间的亲和力，具体如下：I)VEGFR-抗IL6：1nM(20nM，2倍稀释，12个稀释液)3.5小时孵育；50pM(500pM，2倍稀释，14个稀释液)2.5小时孵育；10pM(1nM，2倍稀释，13个稀释液)23小时孵育；II)VEGFR-抗IL6-OG1802：2nM(30nM，2倍稀释，12个稀释液)45min孵育；100pM(15nM，2倍稀释，14个稀释液)6小时孵育；7.5pM(1nM，2倍稀释，14个稀释液)48小时孵育。在以下条件下用IL6进行了类似的测量：III)VEGFR-抗IL6：1nM(20nM，2倍稀释，13个稀释液)7小时孵育；10pM(1nM，2倍稀释，13个稀释液)42小时孵育；100pM(1nM，2倍稀释，13个稀释液)2.5小时孵育；IV)VEGFR-抗IL6-OG1802：1nM(22.5nM，2倍稀释，13个稀释液)5.5小时孵育；100pM(22.5nM，2倍稀释，14个稀释液)12小时孵育。
直接从动力学测量实验中确定双重抑制剂分子与VEGF或IL6之间的结合速率(onrate，kon，M-1s-1)(每个分析对具有1-2条曲线)，而根据以下等式计算解离速率(off rate，koff，s-1)：koff＝Kd x kon。对包含i)100pM VEGFR-AntiIL6和86.4pM VEGF，ii)217pM VEGFR-AntiIL6-OG1802和200pM VEGF，iii)100pM VEGFR-AntiIL6和84.3pM IL6，iv)1000pMVEGFR-AntiIL6和900pM IL6的四种制剂进行了测量。
所有测量均在37℃下使用1x PBS运行缓冲液(pH 7.4)和在含1mg/mL BSA的1xPBS(pH 7.4)中制备的样品完成。使用KinExA Pro软件4.3.11进行数据分析。
在测试的条件下，VEGFR-抗IL6-OG1802以与VEGFR-抗IL6相当的方式与VEGF和IL6结合，VEGFR-抗IL6和VEGF的Kd值为2.10pM，VEGFR-抗IL6-OG1802和VEGF为1.02pM，VEGFR-抗IL6和IL6为21.10pM，VEGFR-抗IL6-OG1802和IL6为12.10pM(参见表22.1和22.2)。
表22.1 VEGF
Figure BDA0002756846400002161
表22.2–IL-6
Figure BDA0002756846400002162
VEGFR-抗IL6和VEGFR-抗IL6-OG1802对于IL6和VEGF的测量亲和力均在误差范围内，因此这些结果表明生物聚合物不影响双重抑制剂与其靶标的结合。
实施例23--VEGF/VEGFR竞争性ELISA
如实施例3中所述进行该测定。在该测定中，VEGFR-抗IL6、VEGFR-抗IL6-OG1802(如图27所示)和Eylea均以不同程度抑制VEGF与VEGFR的结合(图34)。与VEGFR-抗IL6(IC50＝1.98nM)和Eylea(IC50＝1.38nM)相比，VEGFR-抗IL6-OG1802显示出更好的抑制作用(IC50＝0.99nM)。此外，VEGFR-抗IL6的最大抑制作用优于Eylea，而VEGFR-抗IL6-OG1802的最大抑制作用更为显著(VEGFR-抗IL6-OG1802＝79.5％，VEGFR-抗IL6＝67.0％，而Eylea＝49.6％)。这些数据表明，将生物聚合物OG1802添加到VEGFR-抗IL6中产生了VEGF结合VEGFR的额外抑制能力。因此，生物聚合物增加了分子的功能。
实施例24--IL-6/IL-6R竞争性ELISA
如实施例3中所述进行该测定。
在这些条件下，VEGFR-抗IL6-OG1802以与VEGFR-抗IL6相当的方式有效阻断了IL-6/IL-6R相互作用，其中VEGFR-抗IL6的IC50值为0.26nM，VEGFR-抗IL6-OG1802的IC50为0.23nM(图35)。这些结果表明，生物聚合物不改变双重抑制剂对IL6与其受体结合的抑制作用。Eylea用作阴性对照。
实施例25--基于细胞的VEGF刺激的VEGFR报告子测定：
如实施例15所述进行该测定。
在测试条件下，VEGFR-抗IL6-OG1802以与VEGFR-抗IL6和Eylea相当的方式抑制VEGF刺激的VEGFR报告子细胞，其中平均IC50值分别为0.35±0.10nM、0.51±0.07nM和0.35±0.03nM(图36)。VEGR-抗IL6-OG1802(蛋白质成分如图27所示)和Eylea可能比VEGFR-抗IL6适度地更有效，但这并不是一个重要发现，并且属于测定误差范围之内。我们可以从这些数据得出结论，生物缀合物与其蛋白前体类似地抑制VEGFR2信号传导。
实施例26--脂多糖刺激HUVEC中的小管形成：
将第2代HUVEC细胞在补充有1x牛脑提取物内皮细胞生长套件(ATCC；生长培养基)的血管基础培养基中于5％CO2中在37度培养。一旦细胞达到70％融合，就使用胰蛋白酶(0.05％；ATCC)将细胞从平板中消化，将0.75x10^6个细胞接种在T25烧瓶中的生长培养基中。
第二天，将培养基换为测定培养基(2％FBS的血管基础培养基溶液)。6小时后，将5μg/ml钙黄绿素AM直接添加到培养基中，并在37度孵育30分钟。
同时，将200μl预融化的Matrigel(生长因子减少；康宁)添加到8孔玻璃腔室玻片的每个孔中，并在37度下孵育30分钟。
在孵育过程中，将抑制剂(终浓度37.5nM)与脂多糖(LPS；Sigma；1ug/ml终浓度)混合。
钙黄绿素AM孵育30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次，然后用胰蛋白酶消化。将收获的细胞以1,500xg离心3分钟，然后以500,000个细胞/ml的密度重悬于测定培养基中。然后将150μL细胞与100μL制备的抑制剂/复合溶液混合，然后转移至Matrigel包被的载玻片中，孵育过夜。
第二天，在EVOS荧光显微镜(Life Technologies)上使用10倍物镜和GFP滤镜对小管成像。对于每种情况至少拍摄2张代表性图像，然后使用用于ImageJ的AngiogenesisAnalyzer插件(NIH)进行分析，该插件可评估和量化20个小管网络形成参数。
使用非配对双尾学生t-检验从独立实验的所有重复样本中确定了统计学显著性。
在这些条件下，相对于对照，VEGFR-抗IL6在统计学上显著抑制20个血管生成参数中的15个，而相对于对照处理的细胞，Eylea显著抑制20个中的5个，抗IL6抑制20个中的3个。总体上，所有被Eylea或抗IL6影响或显著影响的参数(一个除外)均被VEGFR-抗IL6显著抑制。另外，有几个参数，VEGFR-抗IL6的抑制作用显著优于Eylea(7/20)和抗IL6(10/20)，其中3个VEGFR-抗IL6的抑制作用显著优于Eylea和抗IL6两者。(图37、图38和11)
VEGFR-抗IL6-OG1802有效抑制HUVEC小管形成，有趣的是，VEGFR-抗IL6-OG1802与VEGFR-抗IL6相比，在20个参数中的9个方面显示出抑制增加的趋势。(图39)。这表明，VEGFR-抗IL6-OG1802比其未缀合的对应物具有更多优势。
实施例27--HUVEC增殖测定：
如实施例17所述进行该测定。
在测试条件下，VEGFR-抗IL6-OG1802(蛋白质成分如图27所示)以与VEGFR-抗IL6相当的方式抑制VEGF/IL6刺激的HUVEC增殖，而Eylea没有作用(图40A)。
有趣的是，当在实验开始时每孔接种不同密度的细胞时，相对于VEGFR-抗IL6，VEGFR-抗IL6-OG1802显示出增加的功效。如图40B所示，在每孔2,000个细胞时，VEGFR-抗IL6和VEGFR-抗IL6-OG1802显示出几乎相同的HUVEC增殖抑制。在每孔4,000个细胞时，VEGFR-抗IL6-OG1802的最大抑制作用比VEGFR-抗IL6略好(分别为40％vs.30％)，在每孔6,000个细胞时，VEGFR-抗IL6-OG1802相对于对照抑制增殖到25％，而VEGFR-抗IL6没有作用。
如以上实施例中所示，在不受理论限制的情况下，似乎生物聚合物有助于将其蛋白质对应物递送至板和细胞的表面。这使药物能够主要抑制最有可能激活细胞信号转导的VEGF和IL6的库，并避免被悬浮在液相中较高且不太可能影响细胞信号转导的VEGF和IL6所饱和。随着细胞数量的增加，这种作用会更加明显，因为需要更多的药物才能作用于更多的细胞。因此，在一些实施方案中，缀合物提供了优异的产物，因为它可以帮助分子的分布。
上文或下文所引用的所有专利申请、网站、其它出版物、登录号等通过引用整体并入本文用于所有目的，其程度如同具体地单独指出每个单独文献通过引用并入本文。如果序列的不同版本与不同时间的保藏号相关联，则指的是在本申请的有效申请日时与保藏号相关联的版本。有效申请日指的是实际申请日或涉及保藏号的优先权申请的申请日(如适用)中较早的一个。同样地，如果在不同时间公开了出版物、网站等的不同版本，则指的是在本申请的有效申请日时最近公布的版本，除非另有说明。本发明的任意特征、步骤、元素、实施方式或方面均可以与任意其它特征、步骤、元素、实施方式或方面组合使用，除非另有明确说明。尽管为了清楚和理解的目的通过说明和实施例的方式对本发明进行了详细的描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。
序列表
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<120> IL-6抗体及其融合构建体及其缀合物
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<151> 2018-09-06
<160> 269
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln
1 5 10 15
Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu
20 25 30
Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met
35 40 45
Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro
50 55 60
Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu
65 70 75 80
Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr
85 90 95
Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg
100 105 110
Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys
115 120 125
Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala
130 135 140
Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met
145 150 155 160
Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
180
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 3
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> trap
<400> 4
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Ile His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
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Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
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His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
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<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> trap
<400> 5
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
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Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
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Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu
115 120 125
Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His
130 135 140
Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser
145 150 155 160
Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg
165 170 175
Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr
180 185 190
Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200
<210> 6
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> trap
<400> 6
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Ile Ile Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ser Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Val Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gln Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Lys Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> trap
<400> 14
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 15
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> trap
<400> 15
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Ile His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 16
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> trap
<400> 16
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg
165 170 175
Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr
180 185 190
Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200
<210> 17
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> trap
<400> 17
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Ile Ile Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Trp Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Leu Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Cys Ser Pro Gly Lys
450
<210> 20
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ser Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Leu Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Val Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Ile His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 21
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Ser Pro Phe Ala
20 25 30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Arg Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 22
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Leu Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 23
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
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Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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<223> 抗体
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Lys
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<223> 抗体
<400> 25
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<223> 抗体
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<213> 人工序列
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<223> 抗体
<400> 29
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<223> 抗体
<400> 30
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<210> 31
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 抗体
<400> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 32
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 35
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Ile Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Val Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 36
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Ile Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gln Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
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<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Lys Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
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<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 39
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Pro Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 40
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Asp Val Ser His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
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65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 41
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 41
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
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165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
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195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 42
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 43
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 43
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 44
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 44
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 45
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 45
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 46
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 46
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 47
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 47
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 48
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 48
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
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50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
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100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
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195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
1 5 10
<210> 50
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 50
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1 5 10 15
Val Thr Asp
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 51
Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 52
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
1 5 10
<210> 53
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 53
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
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<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 54
Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 抗体
<400> 55
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
1 5 10
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<211> 19
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 56
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
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<220>
<223> 抗体
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<223> 抗体
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Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
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Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
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Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
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Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 80
Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser
1 5 10
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<211> 9
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<220>
<223> 抗体
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Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
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Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
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Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser
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<220>
<223> 抗体
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Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 85
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp
35 40 45
Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly
50 55 60
Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg
115 120 125
Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser
130 135 140
Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val
165 170 175
Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys
195 200 205
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro
210 215 220
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
225 230 235 240
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
245 250 255
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
260 265 270
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
275 280 285
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
290 295 300
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
305 310 315 320
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
325 330 335
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
340 345 350
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Val Met His Glu Ala Leu
405 410 415
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
420 425 430
<210> 86
<211> 432
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 86
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Ile His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Tyr Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
420 425 430
<210> 87
<211> 432
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 87
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Leu Thr Ile
85 90 95
Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly
100 105 110
Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg
115 120 125
Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser
130 135 140
Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val
165 170 175
Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Met Thr Lys Lys Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
420 425 430
<210> 88
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 88
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Leu Asp Thr Leu
35 40 45
Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile
50 55 60
Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
65 70 75 80
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Ile Ile Arg Gln
85 90 95
Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu
100 105 110
Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu
115 120 125
Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His
130 135 140
Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser
145 150 155 160
Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg
165 170 175
Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Thr Lys
180 185 190
Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr
195 200 205
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe
210 215 220
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
225 230 235 240
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
245 250 255
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
260 265 270
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
275 280 285
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
290 295 300
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
305 310 315 320
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
325 330 335
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
340 345 350
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
355 360 365
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
370 375 380
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
385 390 395 400
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
405 410 415
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
420 425 430
<210> 89
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
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Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 91
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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<210> 92
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 92
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Asp Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 93
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Asp Asp Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 94
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser
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<220>
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<400> 98
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 99
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 100
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 100
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
1 5 10 15
Val Thr Asp
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 101
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 102
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Trp Ser
1 5 10
<210> 103
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 103
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
1 5 10 15
Val Thr Asp
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 104
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 105
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 106
Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 107
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 108
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 109
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 110
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 111
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 112
Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 113
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 114
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 115
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 116
<211> 666
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 116
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys Gly Lys
660 665
<210> 117
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 117
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 118
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 118
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 119
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 119
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 120
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 120
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 121
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 121
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 122
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 122
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
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100 105 110
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 123
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Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 129
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
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Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
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<211> 213
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<400> 139
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 140
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 141
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 141
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 142
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 142
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 143
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 143
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 144
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 144
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 145
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> trap
<400> 145
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 146
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 146
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 147
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 147
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 148
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 148
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 149
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 149
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 150
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 150
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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180 185 190
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195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 151
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 151
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
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Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
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Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
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610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 152
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 152
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 153
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 153
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
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Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
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180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
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Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
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Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
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Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
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Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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645 650 655
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210
<210> 155
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 155
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 156
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<223> 融合体
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660
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 158
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 160
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu
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<213> 人工序列
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<400> 161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val
225 230 235 240
Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
245 250 255
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
260 265 270
Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
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Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
290 295 300
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
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Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val
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Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
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Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
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Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
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Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
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Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
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Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
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Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
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Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
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Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 171
Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 172
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 172
Pro Phe Ala Met His
1 5
<210> 173
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 173
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 174
Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 175
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 175
Pro Phe Ala Met His
1 5
<210> 176
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 176
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
<210> 177
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 177
Gln Ser Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 178
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 178
Pro Phe Ala Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 179
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 180
Gln Gly Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 181
Pro Phe Ala Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 182
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 183
Gln Thr Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 184
Pro Phe Ala Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 185
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 186
Gln Val Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 187
Pro Phe Ala Met His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 188
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 189
Gln Gln Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 190
Pro Phe Ala Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 191
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 192
Gln Lys Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 193
Pro Phe Ala Ile Ser
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 194
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 195
Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 196
Pro Phe Ala Trp Ser
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 197
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Asp
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 198
Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 199
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 200
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 201
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 202
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 203
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 204
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 205
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
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<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 206
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 207
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 208
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 209
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
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Val Thr Asp
<210> 210
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 210
Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 211
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
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Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
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<210> 212
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 212
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
1 5 10 15
Val Thr Asp
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 213
Ala Arg Gln Ser Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 214
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 215
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
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Ala Arg Gln Gly Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
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Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
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Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
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Val Thr Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
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Ala Arg Gln Thr Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 220
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
1 5 10
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 221
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
1 5 10 15
Val Thr Asp
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 222
Ala Arg Gln Val Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 223
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 224
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
1 5 10 15
Val Thr Asp
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 225
Ala Arg Gln Gln Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 226
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 227
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
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Val Thr Asp
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 228
Ala Arg Gln Lys Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 229
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Ile Ser
1 5 10
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 230
Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr
1 5 10 15
Val Thr Asp
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 231
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 232
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Trp Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 233
Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp
1 5 10 15
Thr Val Thr Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 234
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 235
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 抗体
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Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Ser Leu Ala Ser
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 237
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 238
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 239
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 240
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 241
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210> 242
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 242
Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 243
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 243
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 244
Pro Phe Ala Met Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 245
Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 246
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 246
Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 247
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 247
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 248
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 248
Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 249
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 249
Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 250
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 250
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser
1 5 10
<210> 251
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 251
Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp
1 5 10 15
Thr Val Thr Gly
20
<210> 252
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 252
Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 253
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 253
Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 254
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 254
Leu Leu Ile Tyr Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 255
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 255
Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 256
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 256
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 119
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 257
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 258
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Gly Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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<211> 119
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 259
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 119
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 261
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体
<400> 262
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Lys Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 263
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 263
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1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
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Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
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Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
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305 310 315 320
Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
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420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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645 650 655
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660
<210> 264
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 264
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35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
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180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
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Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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<210> 265
<211> 664
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<220>
<223> trap
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His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
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Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
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Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
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Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
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Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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<210> 266
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 266
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val
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Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
245 250 255
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
260 265 270
Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
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645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 267
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 267
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val
225 230 235 240
Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
245 250 255
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
260 265 270
Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
275 280 285
Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
290 295 300
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
305 310 315 320
Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val
325 330 335
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
355 360 365
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
370 375 380
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
385 390 395 400
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
405 410 415
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
420 425 430
Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 268
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 268
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ala Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val
225 230 235 240
Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
245 250 255
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
260 265 270
Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
275 280 285
Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
290 295 300
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
305 310 315 320
Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val
325 330 335
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
355 360 365
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
370 375 380
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
385 390 395 400
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
405 410 415
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
420 425 430
Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660
<210> 269
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合体
<400> 269
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
225 230 235 240
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
245 250 255
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp
260 265 270
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
545 550 555 560
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly Lys
660

Claims (88)

1.与聚合物缀合的、特异性结合IL-6的分离的拮抗抗体。
2.IL-6的分离的拮抗抗体，其包含：
重链氨基酸可变区，所述重链氨基酸可变区包含重链，所述重链具有SEQ ID NO：7-13、19-27、89、90、256-262中的至少一个的序列；和
轻链氨基酸可变区，所述轻链氨基酸可变区包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO：91-93、28-30中的至少一个的序列。
3.IL-6的分离的拮抗抗体，其包含：重链可变区(VH)，所述VH包含3个互补决定区：VH(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3，其具有来自SEQ ID NO：256中列出的CDR的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，所述VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其具有选自由SEQ ID NO：91-93中列出的CDR组成的组的氨基酸序列。
4.结合IL-6的分离的拮抗抗体，其中所述抗体包含基于EU编号的以下突变中的至少一种：L234A、L235A和G237A。
5.结合IL-6的分离的拮抗抗体，所述抗体包含：
CDRH1，即SEQ ID NO：172中的CDRH1；
CDRH2，即SEQ ID NO：173中的CDRH2；
CDRH3，即SEQ ID NO：174中的CDRH3；
CDRL1，即SEQ ID NO：199中的CDRL1；
CDRL2，即SEQ ID NO：200中的CDRL2；
CDRL3，即SEQ ID NO：201中的CDRL2；
以下突变中的至少一种(EU编号)：L234A、L235A和G237A；以及
以下突变(EU编号)中的至少一种：Q347C或L443C。
6.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的拮抗抗体，其中所述抗体以约10pM至约1nM的亲和力结合人IL-6。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的拮抗抗体，其中重链恒定结构域还包含通过重组DNA技术引入的半胱氨酸残基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的拮抗抗体，其中所述半胱氨酸残基选自由Q347C和L443C(EU编号)组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的拮抗抗体，其中所述半胱氨酸残基是L443C(EU编号)。
10.一种融合蛋白，其包含：
权利要求1至9中任一项所述的分离的拮抗抗体；和
VEGF Trap。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述VEGF Trap位于
1.包含IL-6VH的重链的N-末端；或者
2.在包含IL-6VH的重链的铰链区之间且在CH1结构域之后。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述VEGF Trap位于包含IL-6VH的重链的N-末端。
13.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述VEGF Trap在包含IL-6VH的重链的铰链区之间且在CH1结构域之后。
14.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中VEGF结合结构域包含VEGFR1结构域2和VEGFR2结构域3。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中VEGF结合结构域由SEQ ID NO：114的序列组成。
16.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中VEGF结合结构域用作VEGF trap，防止VEGF与细胞表达的VEGF受体结合。
17.一种缀合物，其包含：
(a)权利要求1至9的分离的拮抗抗体中的任一种；和
(b)聚合物，其中所述聚合物与所述抗体共价连接。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其中所述聚合物包括含磷酸胆碱的聚合物。
19.根据权利要求17所述的缀合物，其中所述聚合物包含两性离子单体，其中所述两性离子单体选自由以下组成的组：HEMA-磷酸胆碱、PEG、生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)、羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)(HAP)、透明质酸(HA)、肝素前体聚合物(HEP)、Fleximer、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、25白蛋白、类弹性蛋白(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽和FcRn结合肽。
20.一种缀合物，其包含：
权利要求10至16中任一项所述的融合蛋白；和
聚合物，其中所述聚合物与所述融合蛋白共价连接。
21.根据权利要求20所述的缀合物，其中所述聚合物包括含磷酸胆碱的聚合物。
22.根据权利要求20所述的缀合物，其中所述聚合物包含两性离子单体，其中所述两性离子单体选自由以下组成的组：HEMA-磷酸胆碱、PEG、生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)、羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)(HAP)、透明质酸(HA)、肝素前体聚合物(HEP)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、25白蛋白、类弹性蛋白(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽和FcRn结合肽。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物包含2-(甲基丙烯酰氧基)乙基(2-(三甲基氨基)乙基)磷酸酯(MPC)单体。
24.根据权利要求17-22中任一项所述的缀合物，其中，如通过尺寸排阻色谱-多角度光散射(下文称为“SEC-MALS”)所测量的，所述聚合物的峰位分子量在300,000至1,750,000道尔顿之间。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的缀合物，其中，如通过SEC-MALS所测量的，所述聚合物的峰位分子量在500,000至1,000,000道尔顿之间。
26.根据权利要求22所述的缀合物，其中，如通过SEC-MALS所测量的，所述聚合物的峰位分子量在600,000至800,000道尔顿之间。
27.根据权利要求17-26中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物具有2个或更多个臂。
28.根据权利要求17-27中任一项所述的缀合物，其中所述聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个臂。
29.根据权利要求28所述的缀合物，其中所述聚合物具有9个臂。
30.根据权利要求17-29中任一项所述的缀合物，其中所述抗体是IgG。
31.根据权利要求30所述的缀合物，其中所述聚合物与IgG重链上的半胱氨酸残基的巯基共价键合。
32.根据权利要求17-31中任一项所述的缀合物，其中所述抗体在347或443位(EU编号)包含半胱氨酸残基。
33.根据权利要求32所述的缀合物，其中所述聚合物与347或443位(EU编号)的半胱氨酸残基的巯基共价键合。
34.根据权利要求17-33中任一项所述的缀合物，其中，所述抗体进一步与聚合物缀合以形成生物缀合物，并且其中所述生物缀合物的分子量在约350,000至1,900,000道尔顿之间。
35.根据权利要求17-34中任一项所述的缀合物，其中，多分散指数(PDI)等于或小于1.5。
36.根据权利要求17-35中任一项所述的缀合物，其中
所述聚合物具有9个臂；并且
所述聚合物的分子量在约600,000至约900,000Da之间。
37.根据权利要求17-36中任一项所述的缀合物，其包含以下结构：
Figure FDA0002756846390000051
其中：
抗IL-6抗体的每条重链用字母H表示，抗IL-6抗体的每条轻链用字母L表示；
所述聚合物通过C443(EU编号)的巯基与所述抗体键合，该键描绘在一条重链上；
PC是
Figure FDA0002756846390000052
其中曲线表示与聚合物其余部分连接的点，其中X＝a)OR，其中R＝H、甲基、乙基、丙基、异丙基，b)H，或c)任何卤素，包括Br；并且
n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9相同或不同，使得n1、n2、n3、n4、n5、n6、n6、n7、n8和n9的总和为2500±15％，
其中，如果缀合物包含VEGF Trap，则VEGF Trap融合至：
a)重链的N-末端；或者
b)重链的铰链区和Fab区之间(在CH1结构域之后)。
38.根据权利要求37所述的缀合物，其中，如果缀合物包含VEGF Trap，则其依次包含VEGFR1结构域2，然后是VEGFR2-结构域3。
39.一种分离的细胞系，其产生权利要求1-9中任一项所述的分离的拮抗抗体或权利要求10-16中任一项所述的融合蛋白。
40.根据权利要求39所述的分离的细胞系，其中所述细胞系选自由以下组成的组：CHO、k1SV、XCeed、CHOK1SV和GS-KO。
41.一种分离的核酸，其编码权利要求1-9中任一项所述的分离的拮抗抗体或权利要求10-16中任一项所述的融合蛋白。
42.一种重组表达载体，其包含权利要求41所述的核酸。
43.一种宿主细胞，其包含权利要求42所述的表达载体。
44.一种生产IL-6拮抗抗体或其融合蛋白的方法，所述方法包括：
将重组生产权利要求1-9中任一项所述的分离的拮抗抗体或权利要求10-16中任一项所述的融合蛋白的细胞系在生产所述抗体的条件下培养；以及回收所述抗体。
45.一种药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的分离的拮抗抗体或权利要求10-16中任一项所述的融合蛋白和/或权利要求17-38中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的载体。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述组合物是液体并且其内毒素水平小于约0.2EU/ml。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其中所述组合物是液体并且其内毒素水平小于约2.0、1、0.5或0.2EU/ml。
48.一种用于治疗或预防有此需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用权利要求1-9中任一项所述的分离的拮抗抗体或权利要求10-16中任一项所述的融合蛋白和/权利要求17-38中任一项所述的缀合物。
49.一种治疗或预防有此需要的患者的疾病的方法，所述方法包括：
鉴定具有极度活跃的IL-6和/或VEGF活性的患者；和
向所述患者施用权利要求1-9中任一项所述的分离的拮抗抗体或权利要求10-16中任一项所述的融合蛋白和/或权利要求17-38中任一项所述的缀合物。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述疾病是眼部病症。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述眼部病症是以下中的至少一种：湿性或新生血管性黄斑变性；湿性或新生血管性年龄相关性黄斑变性；干性年龄相关性黄斑变性；眼和/或视网膜血管的静脉、动脉或其他阻塞，伴有或不伴有视网膜水肿；前和后葡萄膜炎；葡萄膜炎性黄斑水肿；糖尿病性视网膜病；非增生性糖尿病性视网膜病；糖尿病性黄斑水肿；非增生性糖尿病性黄斑水肿预防；眼炎性疾病巩膜炎；和眼内肿瘤。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体、融合蛋白或缀合物的施用频率不超过每月一次。
53.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体、融合蛋白或缀合物的施用频率不超过每两个月一次。
54.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体、融合蛋白或缀合物的施用频率不超过每三个月一次。
55.根据权利要求49-54中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体、融合蛋白或缀合物的施用频率在每年一次至每两个月一次之间。
56.一种融合蛋白，其包含：
IL-6VH
IL-6VL
IL-6Fc；
VEGF Trap，
其中所述VEGF Trap以下列方式之一与IL-6融合：
1.与包含IL-6VH的重链的N-末端融合；或者
2.在包含IL-6VH的重链的铰链区之间且在CH1结构域之后融合。
57.根据权利要求56所述的融合蛋白，其中，如果缀合物包含VEGF Trap，则其依次包含VEGFR1结构域2，然后是VEGFR2-结构域3。
58.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其在VEGF Trap序列的位置94处包含突变。
59.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其在VEGF Trap序列的位置95处包含突变。
60.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其在VEGF Trap序列中包含突变T94I和/或H95I。
61.VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中所述VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包含抗IL 6抗体和抗VEGF trap(VEGFR1/2)的trap抗体融合物，其中所述双重抑制剂在VEGFR序列内包含至少一个点突变以降低VEGFR蛋白的裂解。
62.根据权利要求61所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中所述VEGFR-抗IL-6双重抑制剂的分子量为1.0MDa。
63.根据权利要求61所述的VEGR-抗IL-6双重抑制剂，其中所述VEGFR-抗IL-6双重抑制剂为炎性视网膜疾病提供疗法。
64.根据权利要求61所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其包含重链恒定区、轻链恒定区、抗原结合片段区、可结晶片段(Fc)区、血管内皮生长因子受体(VEGFR)区、重链可变区以及轻链可变区。
65.根据权利要求64所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中抗IL-6重链可变区序列选自选项SEQ ID NO：7-13、89、90和/或256-262。
66.根据权利要求64-65中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中VEGF trap序列选自SEQ ID NO：145、15、16或17中的至少一个。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中接头序列是SEQ ID NO：18。
68.根据权利要求64-67中任一项所述的VEGR-抗IL-6双重抑制剂，其中抗IL-6分子的重链序列选自SEQ ID NO：19-27中的至少一个，或至少包括SEQ ID NO：89、90、256-262中的一个的序列。
69.根据权利要求64-68中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中抗IL-6分子的轻链序列包含来自SEQ ID NO：76-84中至少一个的至少1、2或3个轻链CDR。
70.根据权利要求64-69中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中抗IL-6分子的重链序列包含来自SEQ ID NO：49-75中至少一个的至少1、2或3个重链CDR。
71.根据权利要求64-70中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其包含来自SEQ IDNO：85-88中至少一个的VEGFR-Fc序列。
72.根据权利要求64-71中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其包含SEQ ID No：7-13、145、15-17、18-84中任意一个或多个中的一个或多个序列。
73.根据权利要求72所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其包括：
IL-6VH；
IL-6VL；
IL-6Fc；
VEGF Trap；和
接头。
74.根据权利要求73所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中所述IL-6VH包含来自SEQID NO：19-27、31-39、89、90或256-262中任一个中的IL6 VH序列的序列。
75.根据权利要求73或74所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中所述IL-6VL包含来自SEQ ID No：28-30或91-93中任一个中的IL6 VL序列的序列。
76.根据权利要求73-75中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中所述Fc包含来自SEQ ID NO：40-48中任一个中的Fc序列的序列。
77.根据权利要求73-76中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中所述VEGFTrap包含来自SEQ ID NO：145、15、16或17中任一个中的VEGF trap序列的序列。
78.一种蛋白质构建体，其包含：
至少3个重链CDR；
至少3个轻链CDR；
VEGF trap序列；和
接头序列，其中每个序列选自图18-25中的相应序列。
79.一种融合蛋白，其包含：
IL-6VH；
IL-6VL；
IL-6Fc；和
VEGF Trap，
其中所述融合蛋白改变HUVEC增殖。
80.根据权利要求79所述的融合蛋白，其中改变HUVEC增殖是抑制VEGF/IL6介导的增殖。
81.一种融合蛋白，其包含与SEQ ID NO：263至少80％相同并且与SEQ ID NO：117至少80％相同的序列，其中所述融合蛋白进一步与聚合物缀合。
82.根据权利要求80所述的融合蛋白，其中融合蛋白与SEQ ID NO：263至少95％相同，并且与SEQ ID NO：117至少95％相同。
83.根据权利要求80或81所述的融合蛋白，其中所述蛋白至少包含a)SEQ ID NO：172、173、174、199、200和201，或b)SEQ ID NO：172、173、174、199、200和/或201中1、2或3个氨基酸的取代，其中所述取代是保守取代。
84.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
85.根据权利要求10-16、56-60或79-81中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
86.根据权利要求17-38中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
87.根据权利要求61-77中任一项所述的VEGFR-抗IL-6双重抑制剂，其中所述VEGFR-抗IL-6双重抑制剂包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
88.根据权利要求78所述的蛋白质，其中所述蛋白质包括a)SEQ ID NO：169和170的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO：169至少80％相同且与SEQ ID NO：170至少80％相同的氨基酸序列。
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