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CN104936621A - 抗IL-13受体α2抗体和抗体-药物缀合物 - Google Patents

抗IL-13受体α2抗体和抗体-药物缀合物 Download PDF

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CN104936621A
CN104936621A CN201380057103.5A CN201380057103A CN104936621A CN 104936621 A CN104936621 A CN 104936621A CN 201380057103 A CN201380057103 A CN 201380057103A CN 104936621 A CN104936621 A CN 104936621A
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CN
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antibody
seq
antigen
cancer
light chain
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D·马
F·金
L·G·奇思蒂亚科娃
P·萨普拉
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Original Assignee
Pfizer Inc
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Abstract

本文公开了抗IL-13-Rα2抗体和抗体药物缀合物及制备和使用所述抗体和抗体药物缀合物的方法。

Description

抗IL-13受体α2抗体和抗体-药物缀合物
技术领域
本发明涉及抗IL-13受体α2(IL-13-Rα2)抗体和用于癌症治疗的抗体-药物缀合物。
序列表
本申请含有序列表，其通过EFS提交并通过引用整体并入本申请。
背景技术
高水平IL-13-Rα2已在多种肿瘤细胞中被鉴定，包括胰腺、乳腺、卵巢和恶性胶质瘤。相比之下，只有一些类型的正常组织表达IL-13-Rα2，并且仅在低水平表达。过去十年癌症治疗有所改善，手术、放疗和化疗是主要的治疗选择。这些治疗能够延长存活和/或缓解许多患者的症状，但对许多患者不可能治愈。仍存在对癌症其他的治疗选择的显著需要。
因此，抗IL-13-Rα2抗体-药物缀合物符合在各种表达IL-13-Rα2的肿瘤细胞治疗中尚未满足的临床需求，其能显示出对表达IL-13-Rα2的肿瘤细胞的临床有效的细胞毒性效果，特别是不对不表达IL-13-Rα2的细胞显示不期望的效果。
发明概述
本发明提供抗IL-13-Rα2抗体-药物缀合物和用于癌症治疗的方法。
本发明提供特异性结合人IL-13-Rα2的分离的抗体或抗原结合片段，其中抗体包含：包含SEQ ID NO:1重链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:5轻链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的分离的抗体或抗原结合片段，其中抗体包含：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:2；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:3；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:4；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:6；(d)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:7；以及，(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:8。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体还包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:5的轻链可变区氨基酸序列。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体包含重链，所述重链含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列，并且其中所述分离的抗体包含轻链，所述轻链含有SEQ ID NO:51氨基酸序列的。
本发明进一步提供抗体-药物缀合物，其包含与特异性结合人IL-13-Rα2的抗体或其抗原结合片段缀合的细胞毒性剂。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的抗体-药物缀合物，其中所述缀合物具有分子式：Ab-(L-D)p，其中(a)Ab是本发明的抗体或其抗原结合片段；(b)L-D是接头-药物部分，其中L是接头，D是药物；以及(c)p是1至约8的整数。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的抗体-药物缀合物，其中接头选自马来酰亚胺己酰基(maleimidocaproyl)(mc)和马来酰亚胺己酰基-Val-Cit-PABA(vc)。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的抗体-药物缀合物，其中接头-药物部分具有如实施例14中所示的命名为vc-0101或mc-3377的分子式。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO:1重链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；以及，(b)包含SEQ ID NO:5轻链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:2；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:3；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:4；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:6；(d)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:7；以及，(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:8。
本发明进一步提供抗体-药物缀合物，其中L-D选自vc-0101、mc-3377、mc-0131、MalPeg-6121、MalPeg-0131、mc-6121、vc-3906、vc-6780、mc-8261、mc3906和MalPeg-8261。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13-Rα2的抗体-药物缀合物，其中所述缀合物利用在改造的半胱氨酸残基上的位点特异性缀合并且具有分子式：Ab-(L-D)p，或其药物学可接受的盐，其中，(a)Ab是抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1所示重链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3；轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5所示轻链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及改造的Fc区，所述改造的Fc区包含选自SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的至少一对氨基酸取代；或改造的Fc区以及至少一个改造的轻链恒定区，所述改造的轻链恒定区选自L443C(SEQ ID NO:28)、Q347C(SEQ IDNO:29)、kK183C(SEQ ID NO:31)、L443C/kA111C(SEQ ID NO:28和30)、L443C/kK183C(SEQ ID NO:28和31)、Q347C/kA111C(SEQ ID NO:29和30)以及Q347C/kK183C(SEQ ID NO:29和31)；(b)L-D是接头-药物部分，其中L是接头，D是药物；以及(c)p是1至约8的整数。
本发明进一步提供上述抗体-药物缀合物，其利用在改造的半胱氨酸残基上的位点特异性缀合，其中接头-药物部分具有如实施例14中所示的命名为vc-0101或mc-3377的分子式，或其药物学可接受的盐或溶剂化物形式，并且p是约4的整数。
本发明进一步提供本发明的抗体-药物缀合物，其利用多功能抗体缀合物(MAC)技术，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人IL-13Rα2，其中抗体在SEQ ID NO:52所示的轻链恒定区(LC)的185位具有突变D185A，并且抗体通过接头共价缀合至至少一个药物部分，所述接头与SEQID NO:49的LC的K188的侧链连接；其中药物部分具有如实施例13中所示的命名为0101或3377的分子式，或其药物学可接受的盐或溶剂化物形式，并且p是整数，其范围的下限可选自约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9和约2.0，其范围的上限可选自约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5。在一些方面，p是约2。
本发明进一步提供药物组合物，其包含本发明的抗体-药物缀合物和药物学可接受的载体。
本发明进一步提供治疗有需要的患者中表达IL-13-Rα2的癌症的方法，包含向所述患者施用本发明的抗体-药物缀合物。
本发明进一步提供治疗表达IL-13-Rα2的癌症的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食管癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和睾丸癌。
更具体地，本发明提供治疗表达IL-13-Rα2的癌症的方法，其中所述癌症选自肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、恶性胶质瘤和黑素瘤。
本发明进一步提供用于治疗的本发明的抗体-药物缀合物。
本发明进一步提供本发明的抗体-药物缀合物在制备治疗用药物中的用途。
本发明进一步提供本发明的抗体-药物缀合物的用途，其中所述用途是治疗表达IL-13-Rα2的癌症。
本发明进一步提供编码IL-13-Rα2抗体的核酸，包含所述核酸的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。
本发明进一步提供生产IL-13-Rα2抗体的方法，其中所述方法包含培养包含上述载体的宿主细胞，并从细胞培养物中回收抗体。
本发明进一步提供生产IL-13-Rα2抗体-药物缀合物的方法，包含：(a)将选自马来酰亚胺己酰基和马来酰亚胺己酰基-Val-Cit-PABA的接头与选自0101和3377的药物连接产生接头-药物部分；(b)将所述接头-药物部分与上述从细胞培养物中回收的抗体缀合；以及，(c)纯化抗体-药物缀合物。
本发明进一步提供分离的抗体，其与本发明的抗体或其抗原结合片段竞争特异性结合人IL-13-Rα2。
本发明进一步提供抗体-药物缀合物，其包含特异性结合人IL-13-Rα2的本发明的抗体或其抗原结合片段。
本发明进一步提供预测患癌症的受试者是否会对本发明的抗体-药物缀合物应答的方法，包含：确定来自受试者的所述癌症的生物样品是否表达hIL-13-Rα2。
本发明进一步提供确定生物样品中的hIL-13-Rα2水平的方法，包含以下步骤：使用本发明的抗体在免疫测定中测试来自疑似患有癌症的受试者的样品；确定所述样品上的hIL-13-Rα2的细胞表面水平；以及，将hIL-13-Rα2的细胞表面水平与参考受试者或标准水平比较。
本发明进一步提供治疗表达IL-13-Rα2的癌症的方法，所述方法包含：确定生物样品中的hIL-13-Rα2水平，其包含以下步骤：使用本发明的抗体在免疫测定中测试来自疑似患有癌症的受试者的样品；确定所述样品上的hIL-13-Rα2的细胞表面水平；将hIL-13-Rα2的细胞表面水平与正常参考受试者或标准水平比较；以及施用本发明的抗体-药物缀合物。
附图说明
图1：嵌合抗体ch07和ch08与hIL-13-Rα2而非hIL-13Rα1的结合特异性。
图2A和图2B：ch07、ch08和抗体MAB614及ab27414具有不同的IL-13Rα2结合表位。
图2C：Biacore分析表明ch07和ch08缺乏结合竞争。
图3：ch07和ch08是非中和抗体。
图4A–4G：SEQ ID NO:1–55。
发明详述
本发明提供抗用于癌症治疗的IL-13-Rα2抗体-药物缀合物。为了更容易理解本发明，首先定义某些术语和通用技术。
本发明中所用的所有氨基酸缩写均为美国专利商标局所接受的，如37C.F.R.§1.822(d)(1)所规定。
除非本文另有限定，所用的与本发明相关的科技术语应当具有本领域技术人员通常理解的含义。另外，除非文中另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交相关的所用术语及其技术是本领域熟知和通常使用的。
除非另有说明，本发明的方法和技术通常按照本领域熟知的常规方法进行，并如遍及本发明所引用和讨论的各种概括和更具体的参考文献中所述。参见例如Sambrook J.& Russell D.Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.(2002)；Harlow和Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；以及Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John & Sons,Inc.(2003)。
“抗体”或“Ab”是能通过至少一个抗原识别位点特异性结合标靶标，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子，该抗原识别位点位于所述免疫球蛋白分子的可变区。文中所使用的术语“抗体”不仅包含完整的多克隆或单克隆抗体，还包含其任意抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链、包含抗体的融合蛋白质及任何其他含有抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修饰构型，例如但不限于，scFv、单结构域抗体(例如鲨鱼和骆驼抗体)、maxibody、minibody、胞内抗体、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、v-NAR和bis-scFv(参见例如Hollinger and Hudson,2005,Nature Biotechnology 23(9):1126-1136)。抗体包括任何类型的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其亚型)，且所述抗体不需要具有任何特定类型。根据抗体的重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同类型。有五种主要的免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几个类型可进一步被分成亚型(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单元结构及三维构型是周知的。
术语“分离的”指基本上脱离其天然环境的分子。例如，分离的抗体是基本上不含细胞材料或其他来自该细胞的蛋白或其所来源的组织来源。
术语抗体的“抗原结合片段”用于本文指完整抗体的一或多种片段，其保留与给定抗原(例如靶IL-13Rα2)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能能通过完整抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”中包含的结合片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和由VH及CH1结构域组成的Fd片段、由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,1989 Nature 341:544-546)，以及分离的互补决定区(CDR)。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链(VL)的可变区或抗体重链(VH)的可变区。如本领域所知，重链及轻链的可变区各由四个框架区(FR)组成，该四个框架区由三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)又名高变区所连接。如果期望受试者可变区变体，尤其是在CDR区外(即框架区内)具有氨基酸残基的取代，可通过将受试者可变区与其他抗体(其在与受试者可变区相同的规范类中含有CDR1和CDR2序列)的可变区比较，鉴定适合的氨基酸取代，优选保守氨基酸取代(Chothia and Lesk,J Mol Biol 196(4):901-917,1987)。当选择受试者CDR侧翼的FR时，例如当人源化或优化抗体时，优选来自在相同的规范类中含有CDR1和CDR2序列的抗体的FR。
可变区的“CDR＂是位于可变区内的氨基酸残基，其根据卡巴(Kabat)定义、柯西亚(Chothia)定义、卡巴及柯西亚的累积定义、AbM定义、接触定义和/或构形定义，或本领域众所周知的任何CDR确定方法加以识别。抗体CDR可能被鉴定为最先由卡巴等人所定义的超变区。参见例如Kabat等人,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,PublicHealth Service,NIH,Washington D.C.。CDR的位置也可能被鉴定为最先由柯西亚等人所描述的结构性环结构。参见例如Chothia等人,Nature342:877-883,1989。其它鉴定CDR的方法包括“AbM定义”，该方法为卡巴法及柯西亚法的折衷，是源自利用Oxford Molecular的AbM抗体模型软件(现为)，或如MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745,1996所述的基于抗原接触观察的CDR的“接触定义”。在此处称为CDR的“构形定义”的另一方法中，CDR的位置可能被鉴定为对抗原结合造成焓贡献的残基。见例如Makabe等人,Journal ofBiological Chemistry,283:1156-1166,2008。其它CDR边界定义仍可能不严格遵守上述方法中之一，但将与至少部分的卡巴CDR重叠，不过它们可能根据特定残基或残基群或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验结果被缩短或延长。此处所使用的CDR可能指由本领域已知的任何方法(包括多种方法的组合)所定义的CDR。此处所使用的方法可利用根据任意这些方法所定义的CDR。以包含超过一种CDR的任何给定实施方式而言，CDR可根据任意的卡巴、柯西亚、延长、AbM、接触和/或构形定义加以定义。
术语“IgG Fc区”、“Fc区”、“Fc结构域”和“Fc”在本文可互换使用，指IgG分子的部分，其对应于通过IgG分子的木瓜蛋白酶消化获得的可结晶的片段。Fc区由通过二硫键连接的IgG分子的两个重链的C末端一半组成。其不具有抗原结合活性，但含有碳水化合物部分以及补体和Fc受体(包括FcRn受体)结合位点(见如下)。Fc片段含有完整的第二恒定结构域CH2(人IgG1的残基231-340，根据Kabat计数系统)和第二恒定结构域CH3(残基341-447)。
术语“工程化Fc多肽”、“工程化Fc区”和“工程化Fc”和“Fc”在本文可互换使用，指Fc多肽或其部分，其包含至少一个突变，例如氨基酸取代，引入缀合位点。优选地，所述突变引入半胱氨酸，取代该位置处天然存在的氨基酸残基，突变在此产生用于一个部分与Fc缀合的反应位点(例如反应性巯基)。
术语“单克隆抗体”或“mAb”是指来自单拷贝或克隆，包括例如任意真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而并非藉此制备其的方法。优选地，本发明的单克隆抗体存在于同源或实质性同源的群体中。
“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体形式，其为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中源自接受者的互补决定区(CDR)的残基被源自非人物种(捐赠者抗体)诸如具有期望的特异性、亲和性及能力的小鼠、大鼠或兔的CDR的残基所取代。
“人抗体”或“完全人抗体”是指来自携带人抗体基因的转基因小鼠或来自人细胞的那些抗体。
术语“嵌合抗体”意在指其中的可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一个物种的抗体，例如其中可变区序列来自小鼠抗体并且恒定区序列来自人抗体的抗体。
“治疗剂”是对癌细胞或活化免疫细胞显示细胞毒性、细胞生长抑制和/或免疫调制效果的试剂。治疗剂的实例包括细胞毒性剂、化疗剂、细胞生长抑制剂和免疫调制剂。
“化疗剂”是用于癌症治疗的化合物。
“细胞毒性效果”指排除、消灭和/或杀死靶细胞。“细胞毒性剂”指对细胞具有细胞毒性和/或细胞生长抑制效果的试剂。
“细胞生长抑制效果”指抑制细胞增殖。“细胞生长抑制剂”指对细胞具有细胞生长抑制效果，由此抑制特定细胞亚群的生长和/或扩展的试剂。
“抗体-药物缀合物”或“ADC”指抗体或其抗体片段，包括结合IL-13Rα2并与细胞毒性、细胞生长抑制和/或治疗剂缀合的抗体衍生物。
“抗IL-13Rα2抗体-药物缀合物”指抗IL-13Rα2抗体或其抗原结合片段，如本文所述与细胞毒性药物(D)通过接头(L)连接。
“接头(L)”描述了抗体与药物的直接或间接连接。接头与mAb的结合可通过多种方式实现，例如通过表面赖氨酸，与氧化碳水化合物还原性偶联，以及通过由还原链间二硫键释放的半胱氨酸残基。各种ADC连接系统是本领域已知的，包括腙-、二硫-和基于肽的连接。
“药物(D)”是具有生物学或可检测活性的任意物质，例如治疗剂、可检测标记、结合剂等，以及药物前体(prodrug)，其在体内代谢成活性剂。术语药物、药物部分、有效负载(payload)和化合物可互换使用。
“L-D”是由细胞毒性药物(D)与接头(L)连接产生的接头-药物部分。
术语“表位”是指能够被抗体在抗体的一或多个抗原结合区域识别和结合的分子部分。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成并且具有特定的三维结构特征和特定的电荷特征。本文所用术语“抗原性表位”定义为抗体可特异性结合(如可通过本领域内熟知的任何方法例如通过常规免疫测定法确定的)的多肽部分。“非线性表位”或“空间表位”包含被特异于该表位的抗体结合的抗原性蛋白中的非连续多肽(或氨基酸)。一旦抗原上的期望的表位确定，可以产生针对该表位的抗体，例如使用本说明书中描述的技术。在发现过程中，抗体的产生和表征可阐明关于期望的表位的信息。由该信息，继而可以竞争性筛选结合相同表位的抗体。实现这一点的方式是进行竞争和交叉竞争研究以发现与其他抗体竞争或交叉竞争的抗体，例如竞争结合抗原的抗体。
本文所用术语“结合亲和力(KD)”意在指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。KD是解离速率(Kd)，又名“解离速率(Koff)”，与结合速率(Ka)，或“结合速率(Kon)”的比率。因此，KD等于Koff/Kon并表示为摩尔浓度(M)。KD越小，结合亲和力越强。因此，1μM的KD表明与1nM的KD相比为弱结合亲和力。抗体的KD值可使用本领域熟知的方法确定。确定抗体KD的一种方法是使用表面等离子体共振，通常使用生物传感器系统例如系统。
本文所用术语“特异性结合”是指抗体与IL-13-Rα2抗原之间的结合，并且抗体以小于约30nM的KD(由表面等离子体共振(SPR)在25℃确定)结合IL-13-Rα2抗原。
本文所用“药物学可接受的盐”是指分子或大分子的药物学可接受的有机或无机盐。
术语“效能”是生物学活性的量度并可命名为IC50，或需要如实施例15所述抑制IL-13-Rα2阳性细胞系50％的生长的针对抗原IL-13-Rα2的抗体或抗体药物缀合物的抑制性浓度。
“EC50”是结合能力的量度并定义为需要在基线和最大值之间产生半数响应的抗体或抗体-药物缀合物的半数最大有效浓度。
本文所用短语“有效量”或“治疗有效量”是指实现期望的治疗结果必需(施用的剂量、时间段和方式)的量。有效量至少是对受试者产生治疗益处必需的活性剂的最小量，但低于毒性量。
本文所用关于本发明抗体的生物活性的术语“抑制”或“中和”是指抗体实质性对抗、阻止、防止、抑制、减缓、破坏、消除、停止、减少或逆转例如被其抑制的，包括但不限于生物学活性的进展或严重性的能力。
本文所用关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合部位以充分类似于第二抗体或其抗原结合部位的结合的方式与表位结合，使得第二抗体存在时第一抗体与其关联(cognate)表位的结合的结果相较于第二抗体不存在时第一抗体的结合是可检测地降低。或者，该情况可为但不一定是当第一抗体存在时，第二抗体与其表位的结合亦可检测地降低。也就足说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，但第二抗体不抑制所述第一抗体与其相应表位的结合。然而，当各抗体不论以相同、较高或较低程度可检测地抑制另一抗体与其同源表位或配体结合时，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”与其相应表位的结合。本发明包含竞争及交叉竞争抗体。不论所述竞争或交叉竞争所藉以发生的机制为何(例如立体阻碍、构象变化、或与共同表位或其部分结合)，本领域技术人员将了解根据文中所提供的教示，该竞争和/或交叉竞争抗体包含且可用于文中所公开的方法中。
本文所用术语“多核苷酸”或“核酸分子”意在包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
编码本发明抗体的多核苷酸可以包括以下：仅变体编码序列，变体编码序列和其他编码序列例如功能性多肽，或信号或分泌序列或前蛋白(pro-protein)序列；抗体编码序列以及非编码序列，例如内含子或抗体编码序列的5’和/或3’的非编码序列。术语“编码抗体的多核苷酸”包括多核苷酸，其包括额外的变体编码序列以及包括额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。本领域已知为特定宿主细胞/表达系统优化的多核苷酸序列可容易地获自期望蛋白的氨基酸序列(参见GENEART AG,Regensburg,Germany).
“宿主细胞”包括可为或已是用于导入多核苷酸插入物的载体的接受者的个别细胞或细胞培养。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，且因为天然、意外或蓄意突变使该后代不一定与原始亲代细胞(在形态学或基因组DNA互补性上)完全相同。宿主细胞包括以本发明的多核苷酸在体内转染的细胞。
术语“载体”是指构建体，其能在宿主细胞中传送并优选地表达感兴趣的一或多个基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质体、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体、包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体及某些真核细胞诸如生产细胞。
术语“表达控制序列”是指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，诸如组成型或诱导型启动子或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作连接。
编码本发明抗体的多核苷酸通常包括与抗体编码序列可操作连接的表达控制多核苷酸序列，包括本领域已知的天然相关或异源启动子区。优选地，表达控制序列是能转化或转染真核宿主细胞的载体内的真核启动子系统，但也可使用原核宿主细胞的控制序列。一旦载体整合入合适的宿主细胞系，宿主细胞在适合表达核苷酸序列，以及按照需要，适合抗体收集和纯化的条件下繁殖。优选的真核细胞系包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞或人胚肾细胞系。最优选的宿主细胞是CHO细胞系。
抗体
本发明的抗体可用本领域熟知的技术生产，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这些技术的组合或其他本领域已知的技术(参见例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45:1628-50(1999)和Fellouse,F.A.等人,J.MoI.Biol.,373(4):924-40(2007))。
下表1和2描述了本发明抗体的优选CDR。
表1
表2
本发明的一个实施方案包括抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)轻链可变区，包含：
i)具有选自SEQ ID NO:6和14的氨基酸序列的LCDR1；
ii)具有选自SEQ ID NO:7和15的氨基酸序列的LCDR2；以及
iii)具有选自SEQ ID NO:8和16的氨基酸序列的LCDR3；以及
b)重链可变区，包含：
i)具有选自SEQ ID NO:2和10的氨基酸序列的HCDR1；
ii)具有选自SEQ ID NO:3和11的氨基酸序列的HCDR2；以及
iii)具有选自SEQ ID NO:4和12的氨基酸序列的HCDR3。
本发明的优选抗体或其抗原结合片段包含：
a)LCVR，包含：SEQ ID NO:6的LCDR1，SEQ ID NO:7的LCDR2，和SEQ ID NO:8的LCDR3；以及
b)HCVR，包含：SEQ ID NO:2的HCDR1，SEQ ID NO:3的HCDR2，和SEQ ID NO:4的HCDR3。
本发明的另一优选抗体或其抗原结合片段包含：
a)LCVR，包含：SEQ ID NO:14的LCDR1，SEQ ID NO:15的LCDR2，和SEQ ID NO:16的LCDR3；以及
b)HCVR，包含：SEQ ID NO:10的HCDR1，SEQ ID NO:11的HCDR2，和SEQ ID NO:12的HCDR3。
本发明的优选单克隆抗体在本文中被称为hu08(人源化抗IL-13-Rα2IgG1抗体)；以及hu07(人源化抗IL-13-Rα2IgG1抗体)。编码mAb hu08和hu07的氨基酸序列的SEQ ID NO如下表3所示：
表3
mAb LC HC LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3
hu08 51 50 5 6 7 8 1 2 3 4
hu07 53 52 41 14 15 16 48 10 11 12
本发明的一个实施方案是抗体或其抗原结合片段，其特异性结合与包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗体相同的IL-13Rα2表位，所述第一氨基酸序列与SEQ ID NO:1至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述第二氨基酸序列与SEQ ID NO:5至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
本发明的另一个实施方案是抗体或其抗原结合片段，其特异性结合与包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗体相同的IL-13Rα2表位，所述第一氨基酸序列与SEQ ID NO:48至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述第二氨基酸序列与SEQ ID NO:41至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合IL-13Rα2，并且抗体或其抗原结合片段竞争性抑制包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗体的结合，所述第一氨基酸序列与SEQ ID NO:1至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述第二氨基酸序列与SEQ IDNO:5至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合IL-13Rα2，并且抗体或其抗原结合片段竞争性抑制包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗体的结合，所述第一氨基酸序列与SEQ ID NO:48至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述第二氨基酸序列与SEQ IDNO:41至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
本发明的代表性材料于2012年11月6日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。具有ATCC登录号PTA-13304的载体是编码命名为hu08-VLv1.0的人抗IL-13抗体轻链可变区的多核苷酸，具有ATCC登录号PTA-13305的载体是编码命名为hu08-VHv1.0的人抗IL-13抗体重链可变区的多核苷酸。这些保藏物是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(布达佩斯条约)的规定进行。这确保自保藏日开始30年内维持该保藏物为活的培养物。该保藏物将依照布达佩斯条约的规定由ATCC提供，且将受限于辉瑞(Pfizer,Inc.)与ATCC的合约，该合约确保当提出相关美国专利或公开任何美国或外国专利申请时(以先到者为主)，该保藏物的培养子代可永久且不受限制地供公众使用，且确保由美国专利商标专员依据35U.S.C.第122节及该专员所依据的法则(包括37C.F.R.第1.14节，特别参照886OG638)确定获得该子代者的可得性。
药物部分与抗体的缀合
药物部分具有，或经修饰包括可与抗体上的缀合点反应的基团。例如，药物部分可通过烷基化(例如在抗体的ε-氨基赖氨酸或N末端)、氧化碳水化合物的还原胺化、羟基和羧基之间的酯交换、氨基或羧基的酰胺化以及与硫醇缀合而连接。在一些实施方案中，每个抗体分子缀合的药物部分的数量p的平均范围是1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。在一些实施方案中，p的平均范围是2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。在其他实施方案中，p的平均数是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，p的平均范围是约1至约8、约1至约7、约1至约6、约1至约5、约1至约4、约1至约3或约1至约2。在一些实施方案中，p的平均范围是约2至约8、约2至约7、约2至约6、约2至约5、约2至约4或约2至约3。对于可用于缀合的化学作用的实例，参见例如CurrentProtocols in Protein Science(John Wiley & Sons,Inc.),Chapter 15(ChemicalModifications of Proteins)。
接头
药物部分可通过接头与抗体连接。适合的接头包括例如可切割和不可切割的接头。可切割的接头通常在胞内条件下易于切割。适合的可切割接头包括例如可被胞内蛋白酶，例如溶酶体蛋白酶或胞内体蛋白酶切割的肽接头。在示例性实施方案中，接头可以是二肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头，马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苄氧羰基(vc)接头。另一种接头是磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)。磺基-smcc缀合通过马来酰亚胺基发生，所述马来酰亚胺基与巯基(thiols,-SH)反应，而其磺基-NHS酯与伯胺(见于赖氨酸和蛋白或肽的N末端)反应。另一种接头是马来酰亚胺己酰基(mc)。其他适合的接头包括在特定pH或pH范围可水解的接头，例如腙接头。其他适合的可切割接头包括二硫化物接头。接头可与抗体共价结合，以致抗体必需在胞内降解从而释放药物，例如mc接头等等。
本发明优选的接头是马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苄氧羰基(vc)和马来酰亚胺己酰基(mc)。
改造的Fc多肽
之前报道据推测存在于抗体重链的CH2或CH3结构域上，或轻链恒定区上，或其他可接近的某些残基适于用例如半胱氨酸取代天然野生型氨基酸，因此可用于改造能够与各种试剂缀合的位点(参见美国临时专利申请USSN 61/580169，通过引用并入本文)。
氨基酸修饰可通过本领域已知的任意方法进行并且许多这些方法是本领域技术人员熟知并且常规的。例如，但不限于，氨基酸取代、缺失和插入可使用任意熟知的基于PCR的技术实现。氨基酸取代可通过定点诱变进行(参见例如Zoller和Smith,1982,Nucl.Acids Res.10:6487-6500；以及Kunkel,1985,Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:488)。
在一些实施方案中，本发明改造的Fc多肽可用于制备抗体或其抗原结合片段，这样抗体或其抗原结合片段包含改造的Fc区，其可用于在改造的残基(即与野生型未修饰Fc相比的取代氨基酸)处缀合很多部分。
在一些实施方案中，本发明改造的κ轻链恒定多肽可用于制备抗体或其抗原结合片段，这样抗体或其抗原结合片段包含改造的CL区(其包含氨基酸突变)或其部分，其可用于在改造的氨基酸残基处缀合很多部分。
本发明的IL-13-Rα2抗体可包括改造的Fc多肽，其中选自母系、天然或野生型抗体的抗体重链位置347、392、398、422和443的1、2或更多个氨基酸(其中恒定区的编号系统是Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA,以后称为"Kabat")中规定的EU指数)被其他氨基酸(包括天然和非天然/合成氨基酸)取代。
应当理解，Fc多肽中的单取代，例如半胱氨酸残基，通常导致显示所得IgG抗体中的两个对应残基，这缘于IgG抗体分子的同型二聚体性质。因此，本发明所得改造的IgG抗体可显示用于药物或化合物缀合的至少1、2、3、4或更多个反应基团。在一个实施方案中，一或多个取代是使用半胱氨酸残基，所得改造的抗体可显示用于药物或化合物缀合的至少1、2、3、4或更多个巯基。
在其他实施方案中，本发明的改造的Fc多肽在选自抗体重链位置347、392、398、422和443包含一或多个取代，其中恒定区的编号系统是Kabat等人中规定的EU指数(如前述)。
在一些实施方案中，本发明的改造的Fc多肽包含至少一对选自以下的氨基酸取代：(a)SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及(b)SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的改造的Fc多肽包含一个选自以下的取代：(a)SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及(b)SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
改造的Cκ多肽
本发明的IL-13-Rα2抗体可以包括改造的抗体轻链恒定区(LC)或其部分，其中选自母系、天然或野生型抗体的抗体轻链位置111、183或188的1、2或3个氨基酸(其中轻链恒定区的编号系统是Kabat等人(1991,NIHPublication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA,以后称为"Kabat")中规定的Kabat编号系统)被其他氨基酸(包括天然和非天然/合成氨基酸)取代。。
在一些实施方案中，本发明的改造的LC多肽包含一或多个选自以下的取代：(a)SEQ ID NO:30的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及(c)SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在其他实施方案中，由于许多抗体的二聚性(例如IgG包含两个轻链和两个重链，每个重链包含Fc多肽)，本发明的抗体可包含至少一个改造的Fc多肽，并可还包含至少一个改造的轻链恒定多肽，从而提供至少两个位点特异性缀合位点，一个在Fc多肽中，另一个在CL多肽中。本发明优选的抗体(其包含至少一个改造的Fc多肽和至少一个改造的轻链恒定区多肽)选自L443C/kA111C(SEQ ID NO:28和30)、L443C/kK183C(SEQ ID NO:28和31)、Q347C/kA111C(SEQ ID NO:29和30)以及Q347C/kK183C(SEQ IDNO:29和31)。
MAC缀合技术
术语多功能抗体缀合物，或MAC指本文限定的抗体或其抗原结合部分通过恒定κ区共价缀合至至少一个对靶显示生物学效应的药物部分。优选地，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54或SEQ ID NO:55的K90和H91，并且药物部分缀合在K90。MAC技术之前在WO2012/007896和USSN 61/584,675中描述，其通过引用并入本文。
药物部分显示对靶的生物学效应，并且可以是肽、小分子、蛋白质、核酸分子、毒素、适配体或抗原结合抗体或其片段。药物部分可以是具有针对靶细胞的细胞毒性的药物。在一些方面，细胞毒素属于一类已知为阿里他汀(auristatin)的化合物中。代表性的阿里他汀为本文实施例13中所述的化合物0101和3377。
药物部分与抗体轻链恒定区的反应特别期望最小化或防止对抗体Fc部分与Fc受体(例如FcγR和FcRn)的结合或抗体与其相应靶的结合的任何干扰。相反，相应药物部分与抗体Fc部分的缀合可减少抗体体内半衰期和/或其与免疫系统(效应物功能)相互作用的能力。药物部分在抗体重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的缀合有减少抗体与其同源物结合的风险。
MAC技术的优势之一是根据试剂和反应条件(尤其是接头抗体的离去基团酯和摩尔比)，本发明的组合物和样品可用相对于限定数量的抗体的限定数量的药物部分产生。当平衡药物部分和抗体的相对反应性和治疗窗口时，这尤其有用。而且，在一些情况下，增加每个抗体的药物部分的数量超出某阈值不会导致增加的靶结合或治疗效果。因此能够控制每个抗体缀合的药物部分的数量是有用的，并且由此指导缀合的定位，从而使Fc或组合位点干扰最小化。因此，在一些情况下，允许减少缀合的本发明的方面可以是有利的，优选仅修饰单个赖氨酸残基，例如hu08LC恒定区的K90，SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55。另外，尽管缀合至K90是可靠并有力的，但缀合至其他抗体表面赖氨酸(每个具有轻微不同的反应性和pI)可导致缀合抗体的异质样品，其能在不适合或不定期的时间，例如在流通期间和通过抗体识别将药物部分递送至靶之前释放缀合分子。
本发明的另一方面是发现野生型恒定κ链(SEQ ID NO:55)D77的某些突变改善K90位点对药物缀合的易接近性和/或反应性。另外，本发明提供κ链位置45的V/A和位置83的A/L的已知多态性(产生3个经鉴定的人恒定κ多态性Km(1):V45/L83、Km(1,2):A45/L83和Km(3)A45/V83)。相应地，本发明提供包含SEQ ID NO:53的MAC。在一些方面，本发明提供具有Km(3)多态性的MAC，其中κ恒定区选自SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54和SEQID NO:55。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13Rα2的抗体，其中所述抗体具有SEQ ID NO:52所示的LC恒定区，所述LC恒定区在位置80具有赖氨酸残基(K80)，并且在位置77的丙氨酸残基被天冬氨酸残基取代(D77A)。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13Rα2的抗体，其中所述抗体具有SEQ ID NO:53所示的LC恒定区，其中位置45是V或A，位置83是A或L，位置77选自A、G、I、V、L、R、S、T、Q、P、N、M、H和W。在一些方面，位置45是V，位置83是L。在SEQ ID NO:53的一些方面，位置77选自A、G、I、V、L、R、S、T、Q、P、N、M、H和W。可对SEQID NO:53中的位置45和83的残基可变性进行选择，以便仅提供Km(1)、Km(1,2)和Km(3)多态性的任意一个、两个或所有三个。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13Rα2的抗体，其中所述抗体具有SEQ ID NO:54所示的LC恒定区，其中位置77选自A、G、I、V、L、R、S、T、Q、P、N、M、H和W。
本发明进一步提供特异性结合人IL-13Rα2的抗体，其中所述抗体具有SEQ ID NO:55所示的LC恒定区。
癌症治疗
癌症，包括但不限于特征在于不可控的细胞生长的肿瘤、转移或其他疾病或病症，可通过施用本发明的抗体-药物缀合物进行治疗或预防。
示例性抗IL-13-Rα2 ADC可用于治疗癌症，其中IL-13-Rα2相对于正常(例如非癌组织)表达或过表达。根据本文所述方法，表达IL-13-RΑ2的癌症的治疗或预防可通过向需要该治疗的受试者施用有效量的抗IL-13-Rα2ADC来实现。在一些实施方案中，可施用与细胞毒性剂缀合的抗IL-13-Rα2全长抗体或其抗原结合片段或其衍生物。在一些示例性实施方案中，本发明的ADC会(i)结合表达IL-13-Rα2的癌细胞，以及(ii)显示细胞毒性或细胞生长抑制效应，例如抑制表达IL-13-Rα2的癌细胞的增殖，或杀死表达IL-13-RΑ2的癌细胞。
在其他实施方案中，抗IL-13-Rα2 ADC与其他治疗剂共同施用，或与其他治疗剂先后施用。在一些实施方案中，抗IL-13-Rα2 ADC与化疗药物，包括标准治疗化疗药物共同施用，或先后施用。
在一些实施方案中，其他治疗剂可以是待治疗的特定疾病的标准治疗制剂，或是作为待治疗的特定疾病的救助方案一部分的制剂。抗癌剂和化疗方案包括例如抗癌抗体，其包括例如抗CD52抗体(例如阿仑单抗)、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)以及抗CD40抗体(例如SGN40)；化疗方案，其包括例如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春花新碱和强的松)；CVP(环磷酰胺、长春花新碱和强的松)；RCVP(利妥昔单抗+CVP)；RCHOP(利妥昔单抗+CHOP)；RICE(利妥昔单抗+异环磷酰胺、脱羧铂氨、依托泊苷)；RDHAP(利妥昔单抗+地塞米松、阿糖胞苷、顺式铂氨)；RESHAP(利妥昔单抗+依托泊苷、甲泼尼龙、阿糖胞苷，顺式铂氨)；吉西他滨；长春花新碱、强的松和蒽环类的组合治疗，有或无门冬酰胺酶；柔红霉素、长春花新碱、强的松和门冬酰胺酶的组合治疗；替尼泊苷和Ara-C(阿糖胞苷)的组合治疗；氨甲蝶呤和甲酰四氢叶酸的组合治疗；博来霉素、阿霉素、依托泊苷、氮芥、强的松、长春花碱和长春花新碱的组合治疗；小分子抑制剂；以及蛋白酶抑制剂包括例如硼替佐米。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向需要的患者施用有效量的抗IL-13-Rα2 ADC并联合放疗，以及任选地其他治疗剂。在一些实施方案中，抗IL-13-Rα2 ADC与抗癌剂(例如化疗剂)和/或放疗共同或先后施用。在一些实施方案中，化疗剂或放疗在施用本发明的化合物之前或之后至少1小时、5小时、12小时、1天、1周、1个月、几个月(例如多达3个月)施用。
本发明的ADC可以是用于施用的药物组合物形式(其配制为适于选择的施用模式)以及药物学可接受的稀释剂或赋形剂形式，例如缓冲液、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂、载体等等。Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton Pa.,18th ed.,1995提供成型工艺的概要，其为医师普遍知晓。
这些药物组合物可通过本领域已知的实现癌症治疗的一般目的的任意方式施用。优选的施用途径是不经肠道的，本文指包括但不限于以下的施用模式：静脉内、肌内、腹膜内、皮下和节间注射及灌注。施用剂量将取决于受者的年龄、健康和体重，同步治疗种类(如果有)，治疗频率和期望效果的性质。
本发明范围内的组合物包括所有组合物，其中ADC以有效获得癌症治疗的期望的医疗效果的量存在。由于不同患者的个体需求会有差异，确定所有成分的有效量的最佳范围是具有普通技术的临床医生的能力范围。
诊断
本发明的抗体或抗体片段也可用于体外或体内检测生物样品中的hIL-13-Rα2。在一个实施方案中，本发明的抗hIL-13-Rα2抗体用于确定组织或来自组织的细胞中的hIL-13-Rα2水平。在一个优选实施方案中，所述组织是疾病组织。在一个优选的方法实施方案中，所述组织是肿瘤或其活组织。在一个优选的方法实施方案中，组织或其活组织先从患者切除，然后可用本发明的抗体或抗体片段在免疫测定中确定组织或活组织中的hIL-13-Rα2水平。组织或其活组织可冷冻或固定。相同的方法可用于确定hIL-13-Rα2蛋白的其他性质，例如其细胞表面水平，或细胞定位。
上述方法可用于诊断已知或疑似患有癌症的受试者的癌症，其中所述患者中测量的hIL-13-Rα2水平与正常参考受试者或标准比较。所述方法可用于确定肿瘤是否表达hIL-13-Rα2，其可表明该肿瘤会对本发明的抗体-药物缀合物治疗反应良好。优选地，肿瘤是肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、恶性胶质瘤和黑素瘤癌症，或hIL-13-Rα2过表达的其他癌，以及其中hIL-13-Rα2显著表达的有待确定的其他癌症。
本发明的一个实施方案是治疗表达IL-13-Rα2的癌症的方法，所述方法包含：确定生物样品中的hIL-13-Rα2水平，其包含以下步骤：获得来自疑似患有癌症的受试者的样品；使用本发明的抗体在免疫测定中测试所述样品；确定所述样品上的hIL-13-Rα2的细胞表面水平；将hIL-13-Rα2的细胞表面水平与正常参考受试者或标准水平比较；以及向所述受试者施用本发明的抗体-药物缀合物。
本发明进一步提供单克隆抗体、人源化抗体及其表位结合片段，其进一步标记用于研究或诊断应用。在优选实施方案中，所述标记是放射性标记、荧光团、生色团、显像剂或金属离子。
还提供诊断方法，其中所述标记抗体或其表位结合片段施用于疑似患有癌症的受试者，并测量或监测标记在受试者体内的分布。
试剂盒
本发明还包括试剂盒，例如包含描述的细胞毒性缀合物和使用细胞毒性缀合物杀死特定细胞类型的说明书。说明书可包括在体外、体内或离体使用细胞毒性缀合物的用法说明。通常地，试剂盒会有含有细胞毒性缀合物的区室。细胞毒性缀合物可以是低压冻干形式、液体形式或可经调整包括在试剂盒中的其他形式。试剂盒也可含有按照试剂盒中的说明书执行所述方法所需的额外元件，例如复溶低压冻干粉末的灭菌溶液，在向患者施用前与细胞毒性缀合物组合的额外试剂，以及辅助向患者施用缀合物的工具。
之前或后续实施例中引用的所有出版物和专利文献通过引用整体并入本文，如同每个单独表示。
本发明将参考后续实施例进一步描述，然而，应当理解的是，本发明不限于这些实施例。
用于执行本发明的特定方面的后续实施例仅出于示例性目的提供，无意于以任意方式限制本发明的范围。
实施例1
鼠抗IL-13Rα2抗体mu07和mu08的产生和评估
在小鼠中用人IL-13Rα2抗原和免疫标准方法制备抗hIL-13Rα2抗体。(Zhang,C.,Antibody Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,vol.901,DOI 10.1007/978-1-61779-931-0_7,Springer Science+BusinessMedia,LLC 2012)。两种鼠抗体mu07和mu08经鉴定结合A375细胞，一种黑素瘤细胞系，其在细胞表面内源表达高水平的IL-13Rα2。
ADC中抗体的一个重要特征是与其受体结合后快速内化。在与A375细胞在37℃孵育1小时后，对抗体mu07和mu08进行评估并发现其分别内化38％和31％。
实施例2
鼠抗IL-13Rα2抗体mu07和mu08的可变区
使用cDNA合成系统(Clontech Laboratories Inc.ofMountain View,Calif.)克隆mu07和mu08抗IL-13Rα2抗体重链和轻链可变区，随后经PCR扩增。通过标准技术合成cDNA，并使用与IIA寡核苷酸序列退火的引物和小鼠恒定区特异性引物(小鼠κ轻链和小鼠IgG1重链)以及PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen,Carlsbad,CA.)，经PCR扩增cDNA。重链和轻链可变区PCR产物亚克隆入pCR4-TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)，并确定核酸序列。
mu07和mu08重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25的氨基酸残基和SEQ ID NO:23的氨基酸残基所示。mu07和mu08轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:24所示。
实施例3
嵌合抗体ch07和ch08的结合特异性和结合动力学
使用本领域已知的方法构建嵌合抗体07和08(ch07和ch08)，其具有鼠重链和轻链可变区序列与人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区。为了评估ch07和ch08的结合活性和特异性，使用重组hIL-13-Rα2和hIL-13Rα1(IL-13细胞因子受体)进行标准直接ELISA方案。通过辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgGKappa检测结合。图1的结果表明两种嵌合抗体都能特异性结合hIL-13Rα2，但不结合hIL-13Rα1。ch07和ch08的ED50分别是0.15nM和0.076nM。
为了评估ch07和ch08抗体的结合动力学，在T100或T200装置上使用人Fab捕获试剂盒(GE Healthcare)进行SPR(表面等离子体共振)实验。使用T100评估软件版本2.0，以1:1 Langmuir结合模型分析所有数据。
Ka、Kd和KD示于表5。pH7.4时，ch07和ch08与hIL-13-Rα2的结合亲和力均在pM范围内，分别为648pM和964pM。ch07从hIL-13-Rα2上的解离比ch08慢约2倍。pH6.0时，ch07和ch08与hIL-13-Rα2的结合亲和力均在低nM范围内。ch07和ch08的解离速率非常相似。pH6.0时比pH7.4时的KD更高缘于较慢的结合速率。
表5 嵌合抗体ch07和ch08的动力学分析
Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
ch07-pH 7.4 3.61E+05 2.34E-04 6.48E-10
ch07-pH 6.0 6.43E+04 3.37E-04 5.24E-9
ch08-pH 7.4 4.32E+05 4.16E-04 9.64E-10
ch08-pH 6.0 7.12E+04 3.81E-04 5.36E-9
实施例4
抗体ch07和ch08的结合表位
进行竞争ELISA以检测ch07和ch08是否具有不同的结合表位。在竞争ELISA实验之前，ch07和ch08被生物素化。通过直接标准ELISA确定生物素化的ch07(biotin-ch07)和ch08(biotin-ch08)的EC50。对于竞争ELISA，将位于PBS中的50ul 2μg/mL重组hIL-13-Rα2于4℃过夜包被在96孔板上。然后按照标准ELISA方案封闭并清洗平板。3倍系列稀释的ch07和ch08(2x终浓度)分别与恒定量的biotin-ch07(图2A)或biotin-ch08(图2B)混合，并添加到平板，室温孵育1小时。通过1:5000的HRP缀合的链霉亲和素经1小时检测生物素化的嵌合抗体的结合量。结果如图2所示。未标记的嵌合ch07与biotin-ch07竞争结合hIL-13-Rα2，而未标记的ch08未显示竞争迹象(图2A)。当相同设置的抗体用于与biotin-ch08竞争时，获得相似的结果(图2B)。这明确证实抗体ch07和ch08具有不同的IL-13Rα2结合表位。
还用两种商业化可购的抗体，单克隆小鼠IgG1，MAB614(R&D Systems)和单克隆小鼠IgG1，ab27414(Abcam)进行竞争ELISA。图2A和图2B显示，两种商业化抗体均不与biotin-ch07或biotin-ch08竞争结合IL-13Rα2，表明抗体ch07和ch08具有与两种商业化抗体不同的结合表位。
该结果经BiaCore实验确证。使用胺偶联化学反应将约100RUhIL-13-Rα2固定在CM5芯片上。ch07(100nM和200nM)和ch08(100nM和200nM)以10ul/min的流速经150s先后通过hIL-13-Rα2实验通道和对照通道注射。当100nM ch07注射入固定的hIL-13Rα2时，达到50RU。当ch07浓度增加至200nM时，RU不再增加，表明hIL-13-Rα2上的ch07结合位点饱和。当注射入100nM ch08时，增加100RU。该阳性结合信号表明两种抗体缺乏竞争。结果进一步确证抗体ch07和ch08具有不同的结合表位(图2C)。
实施例5
ch07和ch08中和研究
为了评估ch07和ch08能否中和IL-13的功能，进行竞争ELISA。抗Flag抗体包被于96孔板上并4℃孵育过夜。然后按照标准ELISA方案封闭并清洗平板。3倍系列稀释的小鼠抗体、嵌合抗体、阳性对照裸IL-13Rα2和阴性对照hIL-21R与恒定量的生物素化IL-13Rα2-Fc(4x ED50)和恒定量的IL-13(4x ED50)在室温下孵育1小时。100ul复合物添加至ELISA板，并在室温孵育1小时。通过1:5000的HRP缀合的链霉亲和素经1小时检测biotin-IL-13-Rα2的结合量。结果如图3所示。抗体07和08(鼠和嵌合形式)均不与IL-13竞争IL-13-Rα2结合位点，而裸IL-13Rα2与生物素化IL-13Rα2竞争。这表明抗体07和08(鼠和嵌合形式)是非中和性抗体。
实施例6
mu08人源化
使用DP-54和DPK9作为人受体框架对单克隆鼠抗体mu08(Seq ID NO:23和24)进行人源化。通过有或无回复突变的CDR移植制备人源化08抗体(hu08)。使用Kabat方案鉴定鼠mu08抗体的CDR。
通过将mu08的CDR直接移植到人DP-54框架区上，构建hu08重链可变区(VH版本1.0)。通过在框架DP-54的位置A40T、G42D、G44R和N83S处的回复突变制备版本1.1。v1.0和v1.1均克隆入含有hIgG1恒定区的pSMED2载体。编码人源化hu08重链可变区的核苷酸序列是v1.0的SEQID NO:17和v1.1的SEQ ID NO:20。编码hu08重链可变区的氨基酸序列是v1.0的SEQ ID NO:1和v1.1的SEQ ID NO:19。
通过将鼠mu08的CDR直接移植到人DPK9框架区上，构建hu08轻链可变区(VK版本1.0)。通过在框架区DPK9的位置K39I、S60D、T72S、T73F和T74I的回复突变制备版本1.1。v1.0和v1.1均克隆入含有hIgKappa恒定区的pSMEN3载体。编码hu08轻链可变区的核苷酸序列是v1.0的SEQID NO:18和v1.1的SEQ ID NO:22。编码hu08轻链可变区的氨基酸序列是v1.0的SEQ ID NO:5和v1.1的SEQ ID NO:21。
实施例7
人源化hu08的表征
通过标准直接ELISA评估与重组hIL-13-Rα2结合的人源化hu08。重组hIL-13-Rα2包被于96孔板上。系列稀释的与版本1.0和1.1的重链和轻链组合的嵌合抗体或人源化抗体，例如hu08 v1.0HC/1.0LC、hu08 v1.0HC/v1.1LC、hu08 v1.1HC/v1.0LC和hu08 v1.1HC/v1.1LC添加至平板并在室温下孵育1-2小时。通过HRP缀合的山羊抗人Ig Kappa检测结合。结果如下表6所示，其表明所有四种人源化抗体的组合均能结合重组hIL-13-Rα2，并且ED50与ch08类似。
进行标准FACS(荧光激活细胞分选)分析以评估抗体与细胞表面IL-13Rα2的结合活性。用含1％牛血清白蛋白和0.001％叠氮化钠的冰冷的PBS清洗A375细胞。用系列稀释的抗体hu08 v1.0和hu08 v1.1例如hu08v1.0HC/1.0LC、hu08 v1.0HC/v1.1LC、hu08 v1.1HC/v1.0LC和hu08 v1.1HC/v1.1LC于4℃孵育细胞30分钟，然后用磷脂酰乙醇胺标记的山羊抗人IgG染色，在含4％多聚甲醛的PBS中固定，并在(BD Biosciences)上分析。数据与和重组受体的结合一致并表明所有4种组合与细胞表面抗原的结合与ch08类似(表6)。
进行竞争ELISA以评估hu08 1.0和hu08 v1.1是否与ch08竞争结合IL-13-Rα2。将PBS中的50ul 2μg/mL重组hIL-13-Rα2于4℃过夜包被在96孔板上。然后按照标准ELISA方案封闭并清洗板。3倍系列稀释的ch08、hu08 1.0和hu08 v1.1以及阴性对照ch07(2x终浓度)与生物素化的ch08(2xEC50)混合。50μl抗体和biotin-ch08的混合物添加至平板并在室温下孵育1小时。通过HRP缀合的链霉亲和素检测结合的biotin-ch08量。结果如表6所示。所有4种人源化抗体的组合类似于嵌合抗体ch08，与生物素化ch08竞争，表明hu08 1.0和hu08 v1.1保留与ch08相同的结合表位并具有与可溶和细胞表面IL-13-Rα2相似的亲和力。
表6
hu08 v1.0HC/v1.0LC和hu08 v1.1HC/v1.1LC经扩增产生纯化蛋白。两种抗体均在HEK293F悬浮细胞中瞬时表达。令人惊讶的是，与ch08产量相比，08的人源化使抗体产量提高了5-6倍(表7)。
表7
抗体名称 表达水平(ug/ml)
ch08 15
hu08v1.0/1.0 89.6
hu08v1.1/1.1 72.3
蛋白或蛋白结构域的热稳定性与蛋白或蛋白结构域的整体稳定性之间存在直接相关。蛋白或蛋白结构域的较高熔点经常提供改善的可制造性和更长的储藏期限/稳定性。通过差示扫描量热法(DSC)检测ch08和hu08(v 1.0和v1.1)的热稳定性。使用标准方案在MicroCal VP-DSC装置上进行DSC引起的嵌合和人源化抗体的热解折叠。两种人源化抗体hu08 v1.0/1.0和hu08 v1.1/1.1均显示比嵌合版本ch08较高的Tm2(Fab)(表8)。这表明cu08的人源化改善该抗体的热稳定性。
表8
在T100上如上所述进行hu08抗体的结合动力学，结果示于表9。
表9
抗体 抗原 pH ka(1/Ms)on kd(1/s)off KD(nM)
hu08 v1.0 hIL-13Rα2 7.4 9.75E+04 2.46E-04 2.52E-09
hu08 v1.0 hIL-13Rα2 6.0 5.29E+04 2.34E-04 4/42E-09
实施例8
mu07人源化
使单克隆鼠抗体mu07人源化的总体策略与实施例6中所述的mu08的策略相同。通过将mu07的CDR直接移植到人DP-54框架区上，构建人源化hu07重链可变区(VH版本1.0)。通过在框架DP-54的不同位置的回复突变制备版本1.1-1.5。所有版本均克隆入含有hIgG1恒定区的pSMED2载体。
通过将mu07的CDR直接移植到人DPK9框架区上，构建hu07轻链可变区(VK版本1.0)。通过在框架DP-54的不同位置的回复突变制备版本1.1-1.7(表10)。所有版本均克隆入含有hIg Kappa恒定区的pSMEN3载体。编码hu07可变区的氨基酸序列的SEQ ID号如表10所列。
表10
实施例9
人源化hu07的表征
为了评价各种版本hu0的结合/竞争性能，用19种hu07重链和轻链的组合在COS-1M6细胞中进行瞬时转染。包括6种重链和3种轻链：嵌合重链，人源化v1.0-1.5重链，嵌合轻链和人源化v1.0-1.1轻链。转染后2天收获条件培养基(CM)并使用本领域已知的方案，通过标准ELISA进行与重组IL-13-Rα2的直接结合，通过基于细胞的ELISA(使用A375细胞)进行细胞表面受体结合，以及与生物素化ch07的竞争ELISA。
基于来自CM的最初筛选数据，选择重链v1.5进行进一步研究。重链v1.5与嵌合、人源化v1.0和v1.1轻链配对。表11总结了hu07抗体的结合活性、竞争性能和细胞毒性。与嵌合轻链Kc配对的hu07v1.5显示与嵌合抗体相似的ED50和IC50。当该重链v1.5与轻链v1.0和v1.1配对时，在A375细胞上的竞争活性和重组蛋白减少。
表11
hu07重链v1.5用于轻链优化。在COS-1M6细胞中进行10种hu07重链和轻链组合的瞬时转染。重链v1.5与嵌合轻链和人源化版本v1.0-1.7配对。收获CM并用于实验以通过ELISA确定与重组hIL-13α2(rhIL-13α2)的结合亲和力，并通过竞争ELISA确定与生物素化ch07的竞争活性。数据表明重链v1.5和轻链v1.7的组合最优。用纯化蛋白确证该结果(表12)。
表12
ED50(nM)rhIL-13Rα2 IC50(nM)竞争ELISA平板
ch07 0.39 2.21
hu07Hv1.5/kv1.7 0.39 7.7
实施例10
ch07、hu07、ch08和hu08的种属交叉反应性
通过RT-PCR从猕猴(cyno)睾丸和脂肪组织分离猕猴IL-13-Rα2(胞外结构域(ECD))和跨膜结构域(TM)。猕猴IL-13-Rα2的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示。人和猕猴IL-13Rα2之间的相同性为94％。
将与Flag标签在C末端融合的猕猴IL-13Rα2 ECD/TM结构域克隆入pSMED2表达载体。用含有cyno-IL-13-Rα2的质粒和pSMED2载体(作为转染试剂对照)瞬时转染HEK293悬浮细胞。72小时后收获细胞并进行FACS分析。测试4种抗体，包括ch07、ch08、hu08v1.0/1.0和hu08v1.1/1.1。用藻红蛋白标记的山羊抗人或小鼠IgG检测在细胞表面cyno-IL-13-Rα2上的结合。数据显示ch07、ch08、hu08v1.0/1.0和hu08v1.1/1.1能够与细胞表面cyno-IL-13-Rα2结合并具有相似的结合亲和力(ED50)(表13)。
表13
抗体 ED50(nM)
ch07 1.494
ch08 1.814
hu08v1.0/1.0 1.961
hu08v1.1/1.1 2.141
通过直接ELISA评估hu07和hu08与小鼠IL-13-Rα2的结合。人和小鼠IL-13-Rα2氨基酸水平的相同性约为64％。重组mIL-13-Rα2或hIL-13-Rα2(作为阳性对照)包被于96孔板上。纯化的嵌合ch07和ch08经系列稀释并添加于抗原包被的平板。通过HRP缀合的山羊抗人IgGFc特异性二抗检测结合的抗体。mIL-13-Rα2结合无可检测信号，而与阳性对照hIL-13-Rα2的结合强烈，表明hu07和hu08不与鼠mIL-13Rα2交叉反应。
实施例11
与表达IL13R-α2的人细胞系的结合
将表达IL13R-α2抗原的细胞系和阴性对照细胞以每孔200,000个细胞的密度铺于96孔深孔板并保持在冰上。将在含3％牛血清白蛋白BSA的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中的制备的小鼠单克隆抗体mu07或mu08添加至平板，终浓度10μg/mL。然后将平板在冰上孵育1小时，随后清洗2次。将PE(藻红蛋白)缀合的山羊抗小鼠IgG Fc二抗添加至孔中。4℃孵育30分钟后，继而在FACScanTM(BD Biosciences)上通过FACS分析平均荧光强度。
表14中的数据表明mu07和mu08抗体与来自不同疾病迹象的不同组IL-13R-α2阳性细胞系结合。
表14
实施例12
内化
抗体内化是在表达IL-13-Rα2的细胞中递送ADC细胞毒性的关键特征。使用mu07和mu08抗体以及阳性对照小鼠单克隆抗体(ab27414)在4种细胞系(PC3MM2、A375、Hs766T和H460R)上检测抗体与IL-13-Rα2结合后的内化。抗体(10μg/mL)与不同细胞在冰上孵育1小时，通过用冷培养基清洗两次，去除未结合的抗体。于37℃孵育细胞培养平板。细胞样品固定15分钟和4小时。不同时间点的内化百分比如表15所示。数据表明mu07和mu08易于内化入表达IL-13-Rα2的细胞。
表15
实施例13
化合物0101和3377的合成
根据美国专利申请13/670,612描述的方法制备化合物0101和3377，其通过引用并入本文。
化合物0101的实验(示意图#54)
2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-yl)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-yl}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-yl]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#54)的制备
步骤1、N-[(9H-芴-9-yl甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-yl)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-yl}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-yl]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#53)的合成。根据一般程序D，利用二氯甲烷(20mL,0.1M)和N,N-二甲基酰胺(3mL)中的#32(2.05g,2.83mmol,1eq.)、胺#19(2.5g,3.4mmol,1.2eq.)、HATU(1.29g,3.38mmol,1.2eq.)和三乙胺(1.57mL,11.3mmol,4eq.)合成粗制的期望的材料，通过硅胶层析(梯度0％至55％位于庚烷中的丙酮)纯化，产生固体#53(2.42g,74％)。LC-MS：m/z 965.7[M+H+]，987.6[M+Na+]，保留时间＝1.04分钟；HPLC(方案A)：m/z 965.4[M+H+]，保留时间＝11.344分钟(纯度>97％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)，假定为旋转异构体混合物，特征信号：δ7.86-7.91(m,2H)，[7.77(d，J＝3.3Hz)和7.79(d,J＝3.2Hz)，总1H]，7.67-7.74(m,2H)，[7.63(d，J＝3.2Hz)和7.65(d，J＝3.2Hz)，总1H]，7.38-7.44(m,2H)，7.30-7.36(m,2H)，7.11-7.30(m,5H)，[5.39(ddd，J＝11.4,8.4,4.1Hz)和5.52(ddd，J＝11.7,8.8,4.2Hz)，总1H]，[4.49(dd，J＝8.6,7.6Hz)和4.59(dd,J＝8.6,6.8Hz)，总1H]，3.13，3.17，3.18和3.24(4s，总6H)，2.90和3.00(2br s，总3H)，1.31和1.36(2brs，总6H)，[1.05(d，J＝6.7Hz)和1.09(d，J＝6.7Hz),总3H]。
步骤2、2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-yl)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-yl}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-yl]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#54)的合成
根据一般程序A，利用位于二氯甲烷(10mL,0.07M)中的#53(701mg,0.726mmol)合成粗制期望的材料，通过硅胶层析(梯度：0％至55％位于庚烷中的丙酮)纯化。用乙醚和庚烷稀释残留，并在真空中浓缩以产生白色固体#54(406mg,75％)。LC-MS：m/z 743.6[M+H+]，保留时间＝0.70分钟；HPLC(方案A)：m/z 743.4[M+H+]，保留时间＝6.903分钟，(纯度>97％)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)，假定为旋转异构体混合物，特征信号：δ[8.64(br d，J＝8.5Hz)和8.86(br d，J＝8.7Hz)，总1H]，[8.04(br d，J＝9.3Hz)和8.08(br d，J＝9.3Hz)，总1H]，[7.77(d，J＝3.3Hz)和7.80(d，J＝3.2Hz)，总1H]，[7.63(d，J＝3.3Hz)和7.66(d，J＝3.2Hz)，总1H]，7.13-7.31(m,5H)，[5.39(ddd，J＝11,8.5,4Hz)和5.53(ddd，J＝12,9,4Hz)，总1H]，[4.49(dd，J＝9,8Hz)和4.60(dd，J＝9,7Hz)，总1H]，3.16，3.20，3.21和3.25(4s，总6H)，2.93和3.02(2br s，总3H)，1.21(s，3H)，1.13和1.13(2s，总3H)，[1.05(d，J＝6.7Hz)和1.10(d，J＝6.7Hz)，总3H]，0.73-0.80(m，3H)。
化合物3377的实验(示意图#115)
N,2-二甲基丙氨酰-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羰基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-yl}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺-三氟乙酸盐(#115)的制备。
步骤1、N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-芴-9-yl甲氧基)羰基]-L-缬氨酰}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰}吡咯烷-2-yl]-3-甲氧基-2-甲基丙酰}-L-苯丙氨酰甲酯(#113)的合成。向氮气条件下位于75mL二氯甲烷中的二聚酸#5(12.1g，23.0mM)和#67(11.5g，23.0mM)的搅拌混合物中添加HATU(10.8g，27.6mM)，随后添加Hunig’s碱(12.1mL,69.0mM)。在室温下搅拌反应15小时。反应浓缩为较小体积，用乙酸乙酯吸收并用1NHCl清洗2次。然后用盐水清洗有机层，通过硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。继而通过硅胶层析(梯度：0％至70％位于庚烷中的丙酮)纯化，产生白色固体#113(12.3g,62％)。LC-MS(方案Q)：m/z 855.3[M+H+]，877.2[M+Na+]，保留时间＝2.32分钟；HPLC(方案R)：/z 855.5[M+H+]，保留时间＝9.596分钟(纯度>97％)。
步骤2、N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(L-缬氨酰)氨基]庚酰}吡咯烷-2-yl]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酰甲酯(#114)的合成。根据一般程序A，利用#113(12g,14mmol,1eq.)，二氯甲烷(60mL,0.24M)和二乙胺(40mL,390mM)合成白色/浅黄色固体#114(5.9g,67％)，之后通过硅胶层析(梯度：0％至25％位于二氯甲烷中的甲醇)纯化。LC-MS(方案Q)：m/z 633.0[M+H+]，保留时间＝1.19分钟。HPLC(方案A)：/z 633.5[M+H+]，保留时间＝7.142分钟(纯度>98％)。
步骤3、N,2-二甲基内氨酰-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羰基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-yl}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺-三氟乙酸盐(#115)的合成。向位于10mL二氯甲烷中的N-[(9H-芴-9-yl甲氧基)羰基]-N,2-二甲基氨基(167mg,0.493mM)、#114(260mg,0.411mM)和HATU(188mg,0.493mM)的搅拌混合物中添加Hunig’s碱(0.14mL,0.82mM)。在室温下搅拌反应1小时和20分钟。反应减少。向粗制材料中添加THF(9mL)，并向该搅拌混合物中添加溶解于3mL水中的氢氧化锂(49.2mg,2.06mM)。在室温下搅拌反应4小时。反应经浓缩，继而通过中等压力反相C18层析(梯度：5％至45％于乙腈中的水，每相中含0.02％TFA)纯化白色固体#115(218mg,64％)。LC-MS(方案Q)：m/z 718.7[M+H+]，740.6[M+Na+]，保留时间＝1.21分钟。HPLC(方案A，45℃)：m/z 718.4[M+H+]，保留时间＝6.903分钟。
实施例14
抗IL-13-Rα2 ADC的制备
本发明的ADC可使用具有与化合物结合的反应位点的接头部分，并导入具有与抗体的反应位点的另一接头部分而制备。在一方面，接头具有反应位点，其具有与在抗体单元例如抗体上存在的亲核基团反应的亲电子基团。抗体上的有用的亲核基团包括但不限于巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子与接头上的亲电子基团反应并形成与接头的共价键。有用的亲电子基团包括但不限于马来酰亚胺和卤乙酰胺基团。
接头具有反应位点，其具有与抗体单元上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体单元上的亲电子基团提供与接头连接的便利的位点。抗体上的有用的亲电子基团包括但不限于醛基和酮基羰基。接头的亲核基团的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并形成与抗体的共价键。接头上的有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、硫代缩氨基脲、联氨羧酸酯和芳酰肼。
用于本文，“mc-”指：
用于本文，“vc-”指：
通过用三(2-羧乙基)磷酸(TCEP)部分还原单抗随后将还原的半胱氨酸残基与期望的马来酰亚胺结尾的接头-有效负载反应制备抗IL-13-Rα2ADC。特别地，通过添加位于100mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液)(pH 7.0)的2.2摩尔过量的三(2-羧乙基)磷酸(TCEP)和1mM二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，于37℃经2h部分还原hu08。然而向反应混合物中添加期望的接头-有效负载，接头-有效负载/mAb摩尔比为7.0马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苄氧羰基-阿里他汀-0101[vc-0101，参见以下])，或7.0马来酰亚胺己酰基-阿里他汀-3377[mc-3377，参见以下]，并在15％v/v二甲基乙酰胺(DMA)存在时于25℃另外反应1h。在1h孵育期后，添加N-己基顺丁烯二酰亚胺(对于vc-0101和mc-3377为3倍过量)以对未反应的巯基加帽，然后反应15分钟，随后添加6倍过量的L-Cys以消除任意未反应的接头-有效负载。反应混合物在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中于4℃透析过夜，并通过SEC(AKTA explorer,Superdex 200 10/30 GLcolumn)纯化。ADC通过尺寸排阻层析(SEC)表征纯度，疏水作用色谱(HIC)和液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESI MS)计算药物-抗体比率(负载)。通过UV分光光度计确定蛋白浓度。
mc-3377(通过半胱氨酸残基与抗体X缀合)
vc-0101(通过半胱氨酸残基与抗体X缀合)
实施例15
体外细胞毒性测定
表达IL-13-Rα2抗原的细胞系和阴性对照细胞系与增加浓度的抗IL-13-Rα2 ADC培养。4天后，测定每种培养物的活力。通过逻辑非线性回归计算IC50值并以ng Ab/mL呈现。优选的接头有效负载是vc-0101和mc-3377。
人源化抗IL-13Rα2抗体hu08与表16中提供的各种接头-有效负载缀合。抗体药物缀合物根据美国专利申请13/670,612中记载的方法制备，其通过引用整合入本文，对应的名称和实验性化学合成示意编号如表16所示。
表16
ADC接头-有效负载 对应的ADC接头-有效负载#
hu08-vc-0101 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC-#54
hu08-mc-3377 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-#115
hu08-mc-0131 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-0#118
hu08-Malpeg-6121 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_MalPeg6C2-#117
hu08-Malpeg-0131 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-0#118
hu08-mc-6121 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-#117
hu08-vc-3906 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC-#226
hu08-vc-6780 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC-#112
hu08-mc-8261 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-#69
hu08-mc-3906 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-#226
hu08-MalPeg-8261 IL13Rα2-AB08-v1010-hG1-(C)_MalPeg6C2-#69
huIgG8.8-vc-0101 huIgG8.84-mcValCitPABC-#54
huIgG8.8-mc-3377 huIgG8.84-mc-#115
另外，如实施例21所述并根据标准方案制备突变版本的hu08(hu08MAC)。化合物0101与可切割接头缀合以形成结构：
并且此后根据本文所述技术与hu08MAC缀合以形成hu08MAC-0101。
数据证实与6种不同的阿里他汀(auristatin)有效负载缀合的抗IL-13-Rα2抗体hu08v1.0/1.0有效针对测试的IL-13-Rα2阳性细胞系(PC3MM2和A375)，其具有1.1至4.9ng Ab/mL或7.3-32.7pM的IC50(表17)。另外，hu08MAC-0101有效针对两种测试的IL-13-Rα2阳性细胞系(PC3MM2和A375)，其具有7.9ng Ab/mL的IC50。所有ADC对IL-13-Rα2阴性细胞系H460均无活性，并且不与IL-13-Rα2结合的对照ADChIgG8.8-vc-0101和hIgG8.8-mc-3377对任意测试的细胞系均无活性。
表17
实施例16
皮下异种移植模型
用PC3MM2或A375肿瘤细胞皮下注射雌性无胸腺小鼠(裸鼠)。具有约0.2至0.8g晚期肿瘤的小鼠(n＝8至10只小鼠/处理组)按照q4dx4由静脉施用生理盐水(媒介)、具有接头-有效负载vc-0101、vc-6780、vc-3906、mc-8261、mc-0131、mc-6121、mc-3377、MalPeg-8261、MalPeg-0131、MalPeg-6121和MalPeg-3906的hu08v1.0/1.0ADC，以及与vc-0101或mc-3377缀合的非结合抗体(hIgG8.8)，剂量为2或3mg抗体/kg。基于抗体含量确定ADC剂量。至少每周一次测量肿瘤，其尺寸按mm3＝0.5x(肿瘤宽度2)x(肿瘤长度)计算。
表18所列的体内效力结果示出不同的测试ADC的一系列抗肿瘤活性。潜能的相对顺序为hu08-vc-0101>hu08-vc-6780≥hu08-mc-0131>hu08-mc-6121>hu08-mc-3906>hu08-MalPeg-0131>hu08-MalPeg-6121>hu08-MalPeg-3906>hu08-mc-8261。
表19中的数据表明3mg/kg的ADC hu08-vc-0101和hu08-mc-3377能有效降低PC3MM2中的肿瘤生长。与因大尺寸肿瘤(一些动物>2500mm3)在第15天终止的媒介对照组相比，第76天时，hu08-vc-0101和hu07-mc-3377分别有8只中的5只或8只中的3只动物无可测量肿瘤。与媒介对照组类似，3mg/kg hIgG8.8-vc-0101和10mg/kg hIgG8.4-mc-3377的不相关ADC对照组因组内的大尺寸肿瘤而分别在第15天和第19天终止。这些结果证实hu08-vc-0101和hu07-mc-3377的显著治疗效力(一些动物被治愈)是IL-13-Rα2靶介导的。
表18
GT＝因大肿瘤尺寸终止组
表19
GT＝因大肿瘤尺寸终止组
表20a中的数据表明hu08-vc-0101和hu08-mc-3377的ADC在3mg/kg时在使用A375细胞的第二个体内异种移植模型中有效。媒介对照组和hIgG8.8-vc-0101与hIgG8.8-mc-3377的不相关ADC对照组因大肿瘤尺寸而分别在第19、22、27天终止。用3mg/kg的hu08-vc-0101和hu08-mc-3377处理造成所有动物中的肿瘤消退并提供显著的存活优势。用hu08-mc-3377处理第19-22天的所有动物中均未观察到可测量的肿瘤。尽管一些肿瘤复发，但在第71天有10只动物中的5只没有可测量的肿瘤。用hu08-vc-0101处理组检测100天，在第19-100天有8只动物没有可测量的肿瘤。这些结果证实hu08-vc-0101和hu08-mc-3377对IL-13-Rα2阳性肿瘤强的抗肿瘤活性。
表20a
GT＝因大肿瘤尺寸终止组
表20b和20c中的数据表明ADC hu08-vc-0101和hu08-mc3377在三分之一的使用HEY-C2卵巢癌细胞系体内异种移植模型中有效。媒介对照组和阴性ADC对照组的hIgG8.8-vc0101(3mg/kg和10mg/kg)及hIgG8.8-mc-3377(10mg/kg)因大肿瘤尺寸终止，标示为GT。以1、3和10mg/kg剂量水平的hu08-vc-0101和hu08-mc-3377处理提供剂量依赖性应答。用3mg/kg hu08-vc-0101处理的9只动物中的5只和用10mg/kghu08-vc-0101处理的9只动物中的7只存活至研究结束(第103天)。相似地，用3mg/kg hu08-vc-3377处理的9只动物中的5只和用10mg/kghu08-vc-3377处理的9只动物中的9只存活至研究结束(第103天)。
表20b
表20c
GT＝因大肿瘤尺寸终止组
实施例17
半胱氨酸突变产生位点特异性缀合
进行接头-有效负载与抗体的位点特异性缀合，以改善同种药物负载并避免具有改变的抗原结合或改变的药物动力学的ADC亚群，这些常见于传统缀合方法。一种该位点特异性缀合方法是在靶抗体氨基酸序列中的特定位点引入半胱氨酸残基。之前已经鉴定出重链恒定区和轻链恒定区中的一些氨基酸位置(参见美国专利申请61/580,169)并在hu08v1.0/1.0抗体的特定氨基酸位置被半胱氨酸残基取代。所有半胱氨酸突变均基于pSMED-hu08v1.0和pSEMN3-hu08v1.0通过定点诱变或重叠PCR构建。以下是源自hu08v1.0/1.0的半胱氨酸突变体列表及对应的SEQ ID号(表21)。
表21
实施例18
半胱氨酸突变体的表征
在自由293表达培养基(Invitrogen,calsdad,CA)中的瞬时转染的HEK293悬浮细胞培养物或CHO细胞培养物稳定株中表达hu08v1.0/1.0的半胱氨酸突变体。在标准条件下通过蛋白A(ProA)层析从细胞培养基中分离抗体。使用配备30,000MWCO膜的Millipore旋转管对柱级分进行富集和浓缩。然后将蛋白上样于用pH 7.2的PBS-CMF平衡的尺寸排阻柱(Superdex200)。使用配备30,000MWCO膜的Millipore旋转管对峰值级分进行富集和浓缩，并最终通过0.22um过滤器进行过滤。来自瞬时表达的数据示于表22，来自CHO细胞稳定株的数据示于表23。野生型hu08v1.0/1.0及其半胱氨酸衍生物在ProA捕获后具有类似的终产量和纯度，SEC后纯度达99％，并在2-3轮冷冻和融化后稳定。该数据证实与hu08v1.0/1.0相比，半胱氨酸突变体保留其表达属性和纯化性能。
表22
抗体名称 终产量(mg/L) 纯度(ProA捕获) 纯度(SEC) F/T 2-3轮
hu08v1.0/1.0 26.5 97％ ND 稳定
hu08v1.0/1.0-L443C 56.0 94％ 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-Q347C 30.0 97％ 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-A111C 52.8 96.4％ 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-K183C 44.4 97.0％ 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-K188C 27.9 96.2％ 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-K392C/L443C 28.0 85.0％ 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-V422C/L443C 40.5 99.7％ ND 稳定
hu08v1.0/1.0-Q347C/A111C 31.4 96.6％ 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-L443C/A111C 43.7 ND 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-Q347C/K183C 29.0 97.2％ 99％ 稳定
hu08v1.0/1.0-L443C/K183C 57.0 ND 99％ 稳定
表23
抗体名称 终产量(mg/L) 纯度(ProA捕获) 纯度(SEC) F/T 2-3轮
hu08v1.0/1.0-Q347C 26.74 94.0％ 99.0％ 稳定
hu08v1.0/1.0-K392C/L443C 38.33 89.0％ 99.0％ 稳定
hu08v1.0/1.0 91.0 95％ 99.0％ 稳定
hu08v1.0/1.0半胱氨酸突变体的结合性能
通过标准ELISA和竞争ELISA评价半胱氨酸突变体与hIL-13-Rα2的结合性能。结果表明，所有的半胱氨酸突变体均具有与野生型hu08v1.0/1.0相似的ED50(表23)。该结论得到使用生物素化ch08的竞争ELISA的证实。表24证实，所有的半胱氨酸突变体均具有与野生型hu08相似的IC50，表明结合亲和力与野生型hu08相同。ch07用作阴性对照。
表24
ED50(nM) IC50(nM)
hu08 0.11 2.01
hu08/L443C 0.10 2.25
hu08/L443C/K392C 0.09 2.10
hu08/L443C/V422C 0.09 2.17
hu08/L443C/kA111C 0.12 2.32
hu08/L443C/kK183C 0.11 2.45
hu08/Q347C 0.10 2.07
hu08/Q347C/kA111C 0.10 2.44
hu08/Q347C/kK183C 0.13 2.41
hu08/kA111C 0.22 4.07
hu08/kK183C 0.11 2.47
hu08/kK188C 0.18 2.73
hu08/kD185A 0.108 2.364
ch07 0.10 2.11
hu08v1.0/1.0半胱氨酸突变体的热稳定性
使用MicroCal的装配自动进样器的Capillary-DSC系统(Northampton,MA)，通过毛细管差示扫描量热法(DSC)对抗IL-13-Rα2半胱氨酸突变体单抗的热稳定性进行分析。使用标准方案。记录样品细胞和参考细胞之间的热容量差，并在Origin7.0软件(OriginLab,Northampton,MA)中使用与3个热跃迁适应的非-2状态模型(non-2 states model fit to 3 thermal transitions)进行分析。并在样品和参考细胞中使用PBS缓冲液产生基线热图，用于减去与蛋白变性无关的任何系统热。表25中的结果显示2种单半胱氨酸突变体抗体和3种双半胱氨酸突变体抗体具有与母系hu08v1.0/1.0类似的Tm。
表25
hu08v1.0/1.0半胱氨酸突变体ADC的热稳定性
野生型hu08v1.0/1.0和5种半胱氨酸突变体如美国临时专利申请61/580,169所述与vc-0101缀合。通过差示扫描量热法(DSC，详见上述)测量所有ADC的热稳定性。如下表26所示，野生型hu08v1.0/1.0 vc-0101缀合物的Tm1显著低于(≥5℃)其裸抗体(参见表8)。ADC的Tm2比裸抗体低约1-2℃，而Tm3类似。对于hu08v1.0/1.0半胱氨酸突变体，vc-0101缀合物的Tm1、Tm2和Tm3与其对应裸抗体类似或略低(≤1-2℃)(参见表25)。这表明缀合后半胱氨酸突变体比野生型抗体更加热稳定。
表26
与vc-0101缀合的hu08v1.0/1.0半胱氨酸突变体的血浆和谷胱甘肽稳定性
用于谷胱甘肽稳定性的样品制备：30μg于PBS中的hu08-vc-0101 ADC或hu08-半胱氨酸突变体-vc-0101 ADC与谷胱甘肽(GSH)溶液混合，产生终浓度0.5mM的GSH。0.5mM GSH中的ADC和对照ADC(0mM GSH)在37℃孵育并在第0、3和6天采样。TCEP(三(2-羧乙基)磷酸)用于还原。
用于小鼠血浆稳定性的样品制备：90μg于PBS中的ADC样品与小鼠血浆混合，用20％MPER(哺乳动物蛋白提取试剂)1:1稀释。ADC/血浆样品于37℃孵育并在第0、1和2天取等分并用生物素化的重组hIL-13-Rα蛋白免疫沉淀。用0.15％甲酸溶液洗脱ADC，并用浓缩的Tris HCl缓冲液中和至pH 7.8。样品通过添加PNGaseF(肽：N-糖苷酶F)去糖基化并用TCEP还原。
LC/MS分析过程：通过添加含10％乙腈的0.1％甲酸溶液对ADC/血浆和ADC/GSH稳定性样品等分进行酸化，然后在与Water Xevo G2 Q-TOF质谱仪偶联的Agilent 1100 capillary HPLC上进行LC/MS分析。用0.1％甲酸溶液将分析物上样于Zorbax Poroshell 300SB C8柱(0.5mm×75mm，保持在80℃)，并用20–40％缓冲液B(80％乙腈，18％1-丙醇，2％水，0.1％甲酸)的梯度以20μl/min流速经5.5分钟洗脱。以设置为3.3kV的毛细管电压通过阳性、灵敏度模式进行质谱检测。用MassLynx中的MaxEnt 1函数进行数据分析，基于以下公式，强度用作荷载计算：
荷载＝2*[LC1/(LC0+LC1)]+2*HC1/(HC0+HC1+HC2)]+4*HC2/(HC0+HC1+HC2)。
hu08及其与vc-0101缀合的半胱氨酸突变体的ADC(来自表26)接受血浆和GSH稳定性测定。结果证实，来自半胱氨酸突变体的ADC比来自传统缀合技术的ADC更稳定(表27)。
表27
实施例19
半胱氨酸突变体ADC的体外细胞毒性测定
用增加浓度的与vc-0101或mc-3377缀合的hu08v1.0/1.0半胱氨酸突变体培养表达IL-13-Rα2抗原的细胞系或IL-13-Rα2阴性细胞系H460。4天后，评定每种培养物的生存力。通过逻辑非线性回归计算IC50值并以ng/mL呈现(表28a和28b)。
表28a
表28b
实施例20
半胱氨酸突变体ADC的皮下异种移植模型
用PC3MM2肿瘤细胞皮下注射雌性无胸腺小鼠(裸鼠)。具有约0.2至0.5g晚期肿瘤的小鼠(n＝8至10只小鼠/处理组)以1.5或4.5mg/kg的单剂量由静脉施用生理盐水(媒介)、半胱氨酸突变体L443C-vc-0101、K392C/L443C-vc-0101、L443C/K183C-vc-0101、Q347C-vc-0101或hAB-vc-0101，或3、6和12mg/kg的L443C-mc-3377、K392C/L443C-mc-3377、L443C/K183C-mc-3377。基于抗体含量确定所有ADC剂量。至少每周一次测量肿瘤，其尺寸(mm3±SEM)按mm3＝0.5x(肿瘤宽度2)x(肿瘤长度)计算。
表29中数据表明，与媒介对照组相比，1.5mg/kg和4.5mg/kg的L443C-vc-0101、K392C/L443C-vc-0101、L443C/K183C-vc-0101和hu08-vc-0101均抑制PC3MM2异种移植的生长。L443C/K183-vc-0101是实验中所测试的最强力化合物，其4.5mg/kg的剂量水平具有在组终止前最长70天的监测时间。
表29
GT＝因大肿瘤尺寸终止组
表30中的数据表明，与媒介对照组相比，1.5mg/kg和4.5mg/kg的Q347C-vc-0101和Q347C/K183C-vc-0101均抑制PC3MM2异种移植的生长。另外，数据证实与媒介对照组相比，1.5mg/kg的hu08MAC-0101抑制PC3MM2异种移植的生长。Q347C/K183C-vc-0101是实验中所测试的最强力化合物，其4.5mg/kg的剂量水平具有最长77天的监测时间。这些结果表明，位点特异性vc-0101缀合物与野生型hu08-vc-0101缀合物效力类似或更优。
表30
GT＝因大肿瘤尺寸终止组
表31a和b中的数据表明，与媒介对照组相比，L443C-mc-3377、K392C/L443C-mc-3377、L443C/K183C-mc-3377和hu08-mc-3377以剂量依赖方式造成肿瘤退化。L443C/K183C-mc-3377是实验中所测试的最强力化合物，与其他化合物相比，其12mg/kg的剂量水平具有小的平均肿瘤尺寸。另外，用12mg/kg的L443C/K183C-mc3377处理组的8只动物中有6只在第60天时无可测量肿瘤。
表31a
表31b
GT＝因大肿瘤尺寸终止组
实施例21
使用MAC技术的位点特异性缀合
制备包含抗体或其抗原结合片段的多功能抗体缀合物(MAC)的方法之前已有记载(WO2012/007896和美国专利61/584,675)。本发明的一个方面是使用抗体或其抗原结合片段制备特异性结合人IL-13Rα2的MAC，其中所述抗体在SEQ ID NO:52所示的LC的第185位具有突变D185A，并且该抗体通过与SEQ ID NO:49所示的LC的K188侧链结合的接头与至少一种药物部分共价缀合；所述方法包含：使用PFP(五氟苯酚)酯共价连接药物部分，并使形成的效应物部分-接头-离去基团复合物与抗体在约3.5:1至约4.5:1药物部分:抗体的摩尔比反应。在一些方面，所述摩尔比是约3.7:1至约4.3:1。本文所述MAC命名为hu08MAC-0101并包含SEQ ID NO:52所示的LC的突变D185A；以及药物部分0101(实施例13)，其与SEQ ID NO:52所示的LC的第188位置处的赖氨酸残基(K188)的侧链缀合。hu08MAC-0101的体外活性示于表17(实施例15)。PC3MM2异种移植模型的体内活性示于表30(实施例20)。

Claims (28)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人IL-13-Rα2，其中所述抗体包含：重链可变区以及轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:1的CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5的CDR1、CDR2和CDR3。
2.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人IL-13-Rα2，其中所述抗体包含：
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:2；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:3；
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:4；
(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:6；
(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:7；以及
(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:8。
3.权利要求2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体还包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列。
4.权利要求2或3的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体还包含SEQ ID NO:5的轻链可变区氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
6.权利要求1-5任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
7.抗体-药物缀合物，包含与权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合片段缀合的细胞毒性剂。
8.具有分子式Ab-(L-D)p的抗体-药物缀合物，其中：
(a)Ab是权利要求1-6任一项的分离的抗体或其抗原结合片段；
(b)L-D是接头-药物部分，其中L是接头，D是药物；以及
(c)p是从1至约8的整数。
9.权利要求8的抗体-药物缀合物，其中L-D选自vc-0101和mc-3377。
10.权利要求8或9的抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1重链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及，(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5轻链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3。
11.权利要求8-10任一项的抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:2；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:3；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:4；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:6；(d)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:7；以及，(f)轻链CDR3，其包含SEQID NO:8。
12.具有分子式Ab-(L-D)p的抗体-药物缀合物，其中：
(a)Ab是权利要求1-6任一项的分离的抗体或其抗原结合片段；
(b)L-D是接头-药物部分，vc-0101；以及
(c)p是从1至约4的整数。
13.具有分子式Ab-(L-D)p的抗体-药物缀合物，其中：
(a)Ab是权利要求1-6任一项的分离的抗体或其抗原结合片段；
(b)L-D是接头-药物部分，mc-3377；以及
(c)p是从1至约4的整数。
14.药物组合物，包含权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求7-13任一项的抗体-药物缀合物以及药物学可接受的载体。
15.治疗有需要的患者中表达IL-13-Rα2的癌症的方法，包含向所述患者施用权利要求7-13任一项的抗体-药物缀合物。
16.权利要求15的方法，其中所述癌症选自肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、恶性胶质瘤和黑素瘤。
17.权利要求7-13任一项的抗体-药物缀合物，用于治疗。
18.权利要求7-13任一项的抗体-药物缀合物在制备治疗用药物中的用途。
19.权利要求17或18的用途，其中所述用途是治疗表达IL-13-Rα2的癌症。
20.权利要求19的用途，其中所述癌症选自肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、恶性胶质瘤和黑素瘤。
21.核酸，编码权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合片段。
22.载体，包含权利要求21的核酸。
23.宿主细胞，包含权利要求22的载体。
24.生产抗体的方法，包含培养权利要求23的宿主细胞，并从细胞培养物中回收抗体。
25.生产权利要求9的抗IL-13-Rα2抗体-药物缀合物的方法，包含：
(a)将选自马来酰亚胺己酰基和马来酰亚胺己酰基-Val-Cit-PABA的接头与药物连接；
(b)将所述接头-药物部分与权利要求24的从细胞培养物中回收的抗体缀合；以及
(c)纯化抗体-药物缀合物。
26.分离的抗体，其与权利要求1-6任一项的抗体或其抗原结合片段竞争特异性结合人IL-13-Rα2。
27.预测患癌症的受试者是否会对权利要求7-13任一项的抗体-药物缀合物应答的方法，包含：确定来自受试者的所述癌症的生物样品是否表达人IL-13-Rα2。
28.确定生物样品中的人IL-13-Rα2水平的方法，其包含以下步骤：
(a)使用权利要求1-6任一项的抗体在免疫测定中测试来自疑似患有癌症的受试者的样品；
(b)确定所述样品上的人IL-13-Rα2的细胞表面水平；以及
(c)将人IL-13-Rα2的细胞表面水平与参考受试者或标准水平比较。
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