CN109563479A - 作为新型生物制剂递送平台的工程化的无核细胞和细胞外囊泡 - Google Patents

Abstract

本发明基于基因工程化的诱导多能干细胞(iPSC)的发现，所述基因工程化的诱导多能干细胞(iPSC)产生了一种或更多种治疗性实体，例如抗体和核酸，所述治疗性实体当被施用至受试者时将治疗或预防疾病。本发明还将EMV技术和iPSC技术相结合，建立了一种强有力的新型药物递送平台。

Description

作为新型生物制剂递送平台的工程化的无核细胞和细胞外 囊泡

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年5月25日提交的第62/341,243号美国临时专利申请的权益，该美国临时专利申请通过引用并入本文用于所有目的，如同在本文完全阐述一样。

政府权益

本发明根据由国家卫生研究院授予的批准号HL130676在政府资助下完成的。政府在本发明中具有一定的权利。

发明背景

人诱导多能干细胞(iPSC)与能够在培养物中无限扩增同时保持其完整的发育潜力的胚胎干细胞(ESC)高度相似，已经容易地从患者的体细胞和具有独特遗传背景的供体获得。已经显示了利用改良的方法例如通过非整合质粒载体将人类血液单核细胞和成纤维细胞重编程为iPSC的最新研究进展。成功重编程的iPSC缺乏在成人体细胞中发现的以及与细胞特化/成熟或疾病状态相关的表观遗传标记或特征。例如，来自I型糖尿病(主要是表观遗传或非突变疾病)患者成纤维细胞的重编程的iPSC与衍生自正常对照的iPSC表现相似，甚至在它们的成熟后代例如分化后的胰腺细胞和血管细胞中也是如此。由于这一独特特性和其他独特特性，人类iPSC为多种疾病的细胞疗法提供了无限和前所未有的自体细胞类型来源(在iPSC中具有或没有基因修正)。在过去几年里，科学家还开发了一种高度确定成分的培养基，以在涂有重组人玻连蛋白(替代饲养细胞或基质胶)的标准细胞培养瓶上扩增人类iPSC。确定成分的细胞培养基被称为E8，其基于DMEM和F12基础培养基，且不含任何血清或动物蛋白：在E8培养基中只含有4种人类或重组来源的多肽(胰岛素、转铁蛋白、bFGF和TGFβ1)。有证据表明，在大量培养后，E8培养物维持了人类iPSC的多能性和基因组稳定性。由于最近的这一发现，在高度确定成分的且临床上兼容的培养条件下有效地扩增人类iPSC不再是一个主要障碍。高度确定成分的且有效的iPSC培养系统还使得分析独特的蛋白、RNA和代谢物的组容易得多，从而使能够获得独特且具有多能性能力的人类iPSC。

对由动物细胞释放的脂质双层细胞外囊泡的研究领域与iPSC领域无关。尺寸为50-200nm(称为外泌体)或尺寸为200nm-1μm(通常称为微囊泡)的这些细胞外囊泡是膜结合的且无核的。它们可包含mRNA、微小RNA和蛋白。在本专利申请中，此类外泌体和微囊泡将被统称为EMV(其他人称其为EV或MV)。

已经在诸如血浆和血清的生物流体中以及在培养的许多动物细胞的条件培养基中发现了EMV。例如，在常用的胎牛血清(FBS)中发现高水平的EMV。在人类血浆和血清中发现的EMV可能会对细胞间通讯具有很大影响。必须鉴定新型IPSC和EMV的治疗应用以治疗或预防疾病。

发明概述

本发明基于基因工程化的iPSC的发现，所述基因工程化的iPSC产生了一种或更多种治疗性实体，例如抗体、核酸、融合蛋白和肽，这些治疗性实体当被施用至受试者时将治疗或预防疾病。本发明还将EMV技术和iPSC技术相结合，建立了一种强有力的新型药物递送平台。EMV由表达一种或更多种治疗性实体的本发明的基因工程化的iPSC产生。然后将含有一种或更多种治疗性实体的本发明的EMV施用至受试者以治疗或预防疾病。

本发明的一个实施方案是衍生自体细胞，优选地成人体细胞(其优选地为血液单核细胞)的诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞在HBB基因座的控制下表达治疗性实体。诱导多能干细胞能够形成外泌体，包括无核红细胞、血小板和/或较小微囊泡。本发明的工程化的诱导多能干细胞能够在HBB基因座的控制下表达包括治疗性蛋白或治疗性微小RNA(miR)的治疗性实体。当被施用至受试者时，治疗性蛋白或治疗性微小RNA能够治疗或预防疾病。本发明的适合的治疗性实体包括表达治疗性蛋白的任何基因或表达微小RNA的核酸序列，所述基因或所述核酸序列可通过靶向插入置于本发明的诱导多能干细胞中的HBB基因座的控制之下。实例包括编码选自由以下组成的组的蛋白的基因：靶向人类IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)的sc-mAb、靶向VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)的sc-mAb、OCT4(八聚体结合转录因子4)、阻断PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的单链单克隆抗体或其组合。微小RNA治疗性实体的实例为Mir-302/367。优选的是，本发明的工程化的诱导多能干细胞产生包含一种或更多种治疗性实体，特别是以上描述的蛋白或微小RNA的无核红细胞。

本发明的另一个实施方案是一种生成无核红细胞的方法，所述方法包括以下步骤：培养本发明的诱导多能干细胞；以及从所述诱导多能干细胞生成无核红细胞。该方法优选地包括以下步骤：收集包含一种或更多种治疗性实体的无核红细胞，并将其置于输注装置中，以使得所述无核红细胞能够被施用至受试者。

本发明的另一个实施方案是一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的诱导多能干细胞、本发明的无核红细胞或二者及药学上可接受的载体。

本发明的另一个实施方案是一种治疗或预防受试者的癌症的方法，该方法包括将有效量的药物组合物施用至受试者，该药物组合物包含含有治疗性实体的诱导多能干细胞、无核红细胞或其组合，所述治疗性实体诸如例如预防或治疗癌症的靶向人类IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)的sc-mAb。

本发明的另一个实施方案是一种治疗或预防受试者的缺血性视网膜病变的方法，该方法包括将有效量的药物组合物施用至受试者，该药物组合物包含含有治疗性实体的诱导多能干细胞、无核红细胞或其组合，所述治疗性实体诸如例如可以预防或治疗癌症的Mir-302/367、Myr-AKT或其组合。

本发明的另一个实施方案是一种诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞在HBB基因座的控制下表达治疗性实体。优选的是，诱导多能干细胞形成外泌体，优选地尺寸范围为1μm或更小的外泌体，尽管在一些应用中，大于1μm的外泌体可以是优选的。如上所述，本发明的诱导多能干细胞被工程化为表达一种或更多种治疗性实体，例如蛋白或核酸序列，例如微小RNA，该治疗性实体当被施用至受试者时能够治疗或预防疾病。合适的治疗性实体在上文和本说明书中描述。本发明的工程化的诱导多能干细胞优选产生包含一种或更多种治疗性实体的无核外泌体。

本发明的另一个实施方案是一种生成含有治疗性实体的外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：培养本发明的诱导多能干细胞；以及生成外泌体。

本发明的另一个实施方案是一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的诱导多能干细胞、本发明的外泌体或其组合以及药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可用于治疗或预防例如受试者的疾病例如癌症或缺血性视网膜病变的方法中，该方法包括将有效量的本发明的药物组合物施用至受试者。

本发明的另一个实施方案是一种制备用于药物递送的无核红细胞的方法，所述方法包括以下步骤：提供衍生自血液单核细胞的诱导多能干细胞，该诱导多能干细胞在HBB基因座的控制下表达治疗性实体；生成包含治疗性实体的无核红细胞；以及收集无核红细胞并将其置于输注装置中。

本发明的另一个实施方案是一种药物递送方法，其包括：提供衍生自血液单核细胞的诱导多能干细胞，该诱导多能干细胞在HBB基因座的控制下表达治疗性实体；从诱导多能干细胞生成包含治疗性实体的无核红细胞；以及将无核红细胞施用至受试者。

本发明的另一个实施方案是一种治疗或预防受试者的心血管疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明的药物组合物施用至受试者，该药物组合物包含无核红细胞，所述无核红细胞包含阻断PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的单链单克隆抗体的治疗性实体。

术语“HBB”指的是β球蛋白，也称为血红素β，血红蛋白β，或者优选血红蛋白亚基β，其是一种球蛋白。HBB蛋白由基因HBB产生。人类HBB DMA序列的一个实例是NCBI数据库基因ID：3043，集合体GRCb38.p7，且人类HBB蛋白序列的一个实例是NCBI数据库登录号CAG46711.1。

术语“基因座控制区”或“LCR”，例如HBB基因的基因座控制区，指的是长程顺式调控元件，所述长程顺式调控元件增强在远端染色质位点处的连锁基因的表达。它以拷贝数依赖性的方式发挥作用并是组织特异性的，如β球蛋白基因在红系细胞中的选择性表达所示。

术语“Sc-mAb”指的是单链单克隆抗体。

术语“受试者”指的是对其执行本文所描述的方法的任何个体或患者。一般来说，受试者为人类，但如本领域技术人员所理解的，受试者可以是动物。因此，其他动物，包括哺乳动物诸如啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物包括牛、马、山羊、绵羊、猪等，以及灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)也被包括在受试者的定义中。

附图简述

图1A和1B说明了iPSC衍生的红细胞中与HBB偶联的异源蛋白(GFP)表达。(A)在HBB基因座的控制下标记物基因(GFP)的靶向插入而不破坏HBB蛋白的产生。参见靶向外显子1(1)的CRISPR指导RNA(gRNA)介导的基因组的细节。三个HBB外显子中的编码序列(CDS)用较大的方框表示，而外显子1和3中非翻译的5'和3'序列用附加的较小方框表示。自剪切(self-cleavable)T2A肽符合读框地连接HBB、CDS和GFP报告物基因。(B)从人类iPSC分化的人类红细胞中的GFP表达的直方图。GFP靶向的iPSC的GFP表达(用绿色曲线表示)具有平均荧光强度(MFI)为60，而未修饰iPSC的GFP表达用黑色表示，其MFI为7。

图2显示了释放微囊泡和外泌体的细胞，以及摄取这些膜结合的细胞外囊泡的受体细胞的图。MVE指的是多囊泡胞内体。

图3说明了EMV在再生医学中的治疗性应用。不同的EMV货物诸如ATP和其他小分子、受体诸如VEGFR2、现有蛋白和RNA，可被转移到受体细胞中，并引发一系列的生物刺激。

图4A和4B说明了通过超速离心法纯化和浓缩(30倍)后，来自人类iPSC BC1系的EMV的表征。(A)1:50稀释后用NanoSight分析EMV的尺寸分布和数量。红条表示一个SD范围。(B)通过TEM得到的EMV的代表性图像。双层膜封闭的EMV是明显的。

图5A到5F说明了EMV的FACS分析。(A)使用人类血小板富集的血浆设置门控窗口。红色：血小板；蓝色：残留细胞(>3.2μm)。(B)来自BCl iPSC的EMV。(C)用钙黄绿素AM(红色)染色显示EMV为代谢活性的。(D).CD9和CD63表面染色在大部分EMV中为阳性。(E-F)来自BC1-GFP iPSC的EMV的分析。BC1-GFP EMV(E)与BC1EMV(B)具有相似的尺寸分布，但在大部分EMV(绿色，图F)中GFP信号呈阳性。

图6A到6C说明了检测到的萤光素酶活性。(A)用萤火虫萤光素酶(fluc)基因稳定转导BC1iPSC。将各种细胞数量(100-500)的收集到的有活力的BC1(蓝色)和BC1-fluc(红色)放置在96孔板的每个孔中(n＝3)。然后，在每个孔中加入含有D萤光素的溶液。在15分钟内测量每秒的光子计数。(B)将从BC1或BC1-fluc iPSC收集并浓缩后的EMV用类似的方法测量。(C)在向NSG小鼠(右)的右眼中注射EMV后通过Xenogen进行活体IVIS成像。左侧是经过模拟处理的小鼠。一天后，两只动物通过ip注射D萤光素并成像。

图7A到7B说明了来自人类iPSC的EMV被EC的摄取和对EC的生长刺激。(A)将PKH26标记的人类iPSC衍生的EMV与EC一起孵育，并在经过彻底洗涤后成像。将PKH26荧光(红色)的图像与相衬图像叠加。(B)EC的EMV刺激。在96孔板的含有2000EC的孔中添加EMV或对照E8培养基(ctrl)，一式三份，在第2天和第4天通过WST-1测定(OD450)测量EC生长。

发明详述

人类红细胞(通常称为红血球或RBC)是高度特化的缺乏细胞核的小细胞(5μm)，并且能够在体内循环120天。它们被广泛用于在用于治疗慢性或急性贫血的输注药物中使用。人们普遍认为，来自年轻供体的年轻血液或血浆可能对患有年龄相关疾病的患者具有治疗作用；事实上，存在几个正在进行的临床试验。然而，获得大量的遗传匹配的供体的血液或血浆而不引发免疫排斥反应，特别是在反复或长期输注之后不引发免疫排斥反应是一项挑战。最近，从成人干/祖细胞(HSPC)培养人类红细胞，并被成功地输回至正常供体。然而，这种方法受到目前无法扩增人HSPC的限制，扩增人HSPC是制造产业规模的红细胞所必需的。本发明使用衍生自成人体细胞诸如血液单核细胞的人类诱导多能干细胞(iPSC)来生成无核红细胞。体外生成的红细胞表达高水平的血红蛋白、缺乏MHC膜蛋白和细胞核，并有效地与氧结合。此外，进行在CRIPSR-Cas9系统辅助下的精确的基因修饰，以修正患者iPSC中的突变，然后再将其分化为功能性红细胞。

本发明是一种新型药物递送平台，其在工程化的iPSC和衍生自工程化的iPSC的体外形成的红细胞被施用至受试者之后以及在它们在受试者的身体内经过它们的长生命周期的循环期间，从所述工程化的iPSC和所述体外形成的红细胞递送一种或更多种治疗性实体，诸如多肽或核酸。基因工程方法(1)被用于本发明以制备除了携带氧的红细胞的治疗性益处之外具有增加的生物功能的更好的红细胞。为了递送分泌的蛋白或核酸，并达到治疗效果，认为在输注期间使用的典型RBC输注装置中仅需要存在本发明工程化的红细胞的一部分。除了红细胞外，可以制备其他无核的膜封闭的囊泡，如血小板(1μm)或较小微囊泡(<1μm)或外泌体，如果它们被证明对某些应用而言是更好选择的话。无核细胞囊泡的来源可以是自体的，或来自具有所需基因修饰的IPSC系。

本发明工程化的无核细胞囊泡，诸如红细胞、血小板或较小微囊泡，是一种用于各种类型的生物制剂的优化和持续递送的新型平台，其作为治疗疾病诸如癌症和慢性疾病的疗法。本发明的治疗性实体可以是治疗性蛋白生物制剂，包括细胞因子、酶、抗体和可溶性诱饵受体，其在治疗疾病中越来越多地被使用，其通常比化学药物具有更高的特异性和降低的毒性。然而，将这些蛋白生物制剂递送至患者的正确部位以获得优化和持续的剂量通常是一个挑战。经静脉注射递送的大部分多肽生物制剂在体内的寿命通常短暂，并且通常需要重复施用。基于我们最近的进展，利用来自基因修饰后的人类iPSC的体外生成的且呈生理量的治疗性红细胞，开发了一种新型生物制剂递送平台。

将开发表达靶向NSG免疫缺陷小鼠中的人类肿瘤异种移植物的可溶性或膜结合蛋白的人类红细胞。在CRISPR-Cas9介导的HBB基因中的突变的修正后，将首先由人类iPSC体外生成红细胞，HBB基因编码成熟形式的血红蛋白β亚基，突变则导致镰状细胞病和β-地中海贫血。利用靶向外显子1的经验证的指导RNA，产生了在HBB基因(图1A)的基因座控制区的控制下表达(标志物)蛋白GFP的iPSC。选择HBB基因座是因为HBB是红系细胞后期前5种高表达基因之一。GFP标志物基因仅在后期红细胞中表达(图1B)。为证明可行性，选择了可以通过靶向IGF-1R(1型胰岛素样生长因子受体)的单链单克隆抗体(sc-mAB)消除的肿瘤模型，IGF-1R在许多实体肿瘤和恶性血液病中高度表达。更重要的是，1GF-1R已经被证明是几种致癌基因的转化能力所必需的。因此，已经制备了包括阻断这种表面蛋白的sc-mAb的多种试剂也就不足为奇了。例如，Amgen制备了用于多种转移性癌症的Ganitumab(AMO 479)。尽管Amgen在2012年8月放弃了使用用于转移性胰腺癌的Ganitumab的III期试验，但仍然进行了一项通过将化疗与Ganitumab相结合治疗新诊断的转移性尤文肉瘤的试验(NCT02306161)。在几项研究中，研究者仍使用经验证的试剂靶向这种具有吸引力的表面蛋白。如图1所示，此类蛋白与GFP相似，可以被工程化到iPSC细胞中，以建立包含治疗性实体的治疗性iSPC、血小板、微囊泡和无核红细胞。随后，治疗性iSPC、血小板、微囊泡和无核红细胞可以被施用至受试者以递送一种或更多种治疗性实体，以用于治疗或预防疾病的目的。

本发明的治疗性iSPC、血小板、微囊泡和无核红细胞可用于治疗或预防癌症。众所周知，肿瘤和血液癌症在血管丰富的微环境中生长，尽管癌细胞可能比正常细胞远更耐受低氧条件。肿瘤相关的新的血管生成(neo-angiogenesis)或新的血管发生(neo-vasculogenesis)是肿瘤生长的标志。尽管在过去二十年里，已经广泛尝试利用生物制剂靶向肿瘤相关的新的血管生成或新的血管发生，但成功是有限的。一个原因可能是生物制剂在静脉注射后寿命通常短暂。使用本发明的工程化的红细胞导致能够更有效地递送这些蛋白生物制剂，并获得优化和持续的剂量。本发明工程化的红细胞的独特安全优势之一是它们缺乏细胞核(和复制能力)，并因此是不致瘤的。这对于新型癌症疗法至关重要。

然而，在必要时，这种使用本发明工程化的红细胞或其他无核生物囊泡的方法可有助于在受试者中递送治疗性实体诸如阿柏西普或阿仑单抗(LEMTRADA)。这种使用工程化的红细胞的策略对于治疗心血管疾病和疟疾特别引人注目。在必要时，可以在本发明的诱导多能干细胞中简单地表达编码阿利库单抗的cDNA，所述阿利库单抗是一种阻断PCSK9和降低LDL胆固醇的新型单链单克隆抗体。

从体外产生的红细胞表达分泌的蛋白

将采用一种策略以在红细胞中表达治疗性实体，如所示的，将GFP基因置于人类iPSC中的HEB基因座中，并在体外产生的来自iPSC的红细胞中表达GFP(图1)。分泌的蛋白的第一选择是靶向人类IGF1R的sc-mAb，其在许多实体肿瘤和恶性血液病中高度表达。抗IGF1R cDNA部分将被插入靶向载体(替代GFP cDNA)并靶向到HEB基因座中。这将利用靶向HBB的经验证的指导RNA和Cas9表达载体来执行，以靶向有效生成红细胞的已建立的iPSC系(1)。我们可以将另外的特征添加至靶向cDNA，例如制备具有作为标签的GFP或萤光素酶的融合蛋白以便简单地跟踪生产和循环，或制备具有功能蛋白的融合蛋白来增强抗肿瘤作用。对于后者，我们的第一选择是白细胞介素12(IL-12)，其是一种多效性细胞因子，具有强大的免疫刺激和抗肿瘤活性，但当被全身递送时对宿主有毒性。可以将编码IL-12p35和p40亚基的单cDNA(从InvivoGen可得)与抗IGF1R cDNA符合读框地融合。通过测量标签(GFP、萤光素酶或IL-12)，我们将监测循环中或表达高水平IGF1R的移植的肿瘤中的分泌的蛋白的水平。

治疗性蛋白的第二(或另外的)选择是编码靶向VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)的sc-mAb的现有cDNA，其能够阻断肿瘤的血管生成或血管发生。总体方法与我们以上针对在工程化的人类红细胞中靶向分泌的抗IGF1R sc-mAb的方法相似。可以利用破坏SH2B3(LNK)基因可以进一步促进红系细胞产生的最新进展。CRISPR-Cas9系统适合于靶向多个基因(通过简单地将另外的指导RNA添加至新靶)，并且更有效地破坏基因。我们可以通过指导RNA将Cas9作为核糖蛋白复合物递送到iPSC，而不是递送大的质粒DNA来表达Cas9蛋白。通过这种方法，我们能够将多个指导RNA递送至靶向的多个位点，并且还可以降低Cas9相关的毒性和减少脱靶。要注意的是，这种方法的优选的最终产物是包含一种或更多种治疗性实体的无核红细胞。

治疗性EMV的建立

本发明侧重于从人类iPSC大量产生的EMV。我们将使用本发明的衍生自iPSC的表达一种或更多种治疗性实体的治疗性EMV。本发明的治疗性或工程化的EMV作为递送囊泡，用于将天然和异源蛋白/RNA转移至受试者，以用于治疗目的(图3)。

人类iPSC在高度确定培养条件下产生大量EMV

使用无异源体系、无BSA的E8培养基并使用重组人类玻连蛋白底物培养和扩增人类iPSC。在贴壁或悬浮培养条件下，人类iPSC在3天内扩增2:10-12倍，但在完全确定培养条件下还获得具有非整合质粒载体的新的人类iPSC。通过非整合质粒载体，我们检查了从多种人类iPSC包括衍生自正常成人供体的BC1系的EMV产生，全面表征了基因组完整性以及用于分化多种细胞类型。

在标准培养条件下，我们每天收集iPSC的条件培养基。通过标准差速离心以首先去除细胞碎片和聚集体来纯化EMV，以及随后进行以100,000xg的超速离心同时浓缩EMV(9)。在洗涤及以100,000xg重新旋转后，将经旋转的EMV重悬在PBS(或其他缓冲液或培养基)中。我们使用标准方法来分析这些纯化和浓缩的EMV。

我们使用NanoSight仪器(使用405nm激光的NS500)进行纳米颗粒跟踪分析，基于其布朗运动估计个体EMV的直径，如图4所示。发现，人类iPSC产生包含多个尺寸群体的大量EMV，其包括100nm处的主峰(图4a)。通过使用透射电子显微术(TEM，图4b)的可视化证实了EMV的膜封闭性质。

利用30倍浓缩的EMV(60.5x 10⁹/ml)，我们估计从1ml人类iPSC条件培养基中纯化的EMV分别含有约7ng和4ng的总蛋白和RNA。

通过NanoSight，通过来自多种人类iPSC系的EMV还获得了类似的数据：在任何浓缩步骤前，我们始终观察到EMV密度为2-4×10⁹/ml。这比从其他细胞类型诸如人类脐静脉内皮细胞(HUVEC，2.2×10⁷/ml)收集的EMV要高得多。来自人类骨髓衍生的MSC的总EMV颗粒浓度与来自iPSC的总EMV颗粒浓度相似。然而，标准人类MSC培养基含有10％FBS，如我们和许多其他研究人员在过去15年中一直使用的。要注意的是，在体外，来自所有来源的EMV比其亲本活细胞要稳定得多：它们可以在4℃短期储存数周，或在-20℃或-80℃长期储存，而不需要低温保存试剂诸如DMSO。这种独特的特性(可能是因为EMV的小尺寸)在临床应用中提供了超过活细胞的显著优势。

来自人类iPSC的EMV的表征

利用流式细胞术(FACS)分析小细胞囊泡诸如红细胞和血小板，我们使用FACS分析仪LSR II对从人类iPSC收集的EMV进行分析(图5)。使用前向散射(FSC-A)和侧向散射(SSC-A)的优化设置，我们可以分辨出EMV与血小板(1μm)和细胞(>3.2-10μm)。

通过FACS分析，来自人类iPSC的多数EMV的尺寸具有与重组慢性毒(110nm)的前向散射相似的前向散射(与尺寸有关)。它们小于血小板和残留细胞(图5a)，以及3.2μm的校准珠(数据未显示)。EMV为代谢阳性的并是封闭的，因为它们经细胞质酯酶底物钙黄绿素AM染色呈阳性(图5c)。

30x浓缩的EMV通过多种特异性单克隆抗体来染色，以检测多种蛋白抗原的表面表达。我们发现，由人类iPSC产生的大多数EMV表达CD9和CD63(图5d)，它们是EMV和iPSC中的已知表面标志物。检测到CD81、MHC-I类(HLA-ABC)和E-钙粘蛋白(数据未显示)的表达，以及已知在人类iPSC(和ESC)中表达的其他质膜蛋白。个体EMV中抗原水平的强度低于个体细胞中的强度，这可能是由于EMV的直径较小和抗原数量较少。

使用FACS分析以确定在细胞质中异位表达GFP标志物基因的BC1iPSC的EMV是否也包含GFP蛋白(图5e-f)。在我们制备的该BC1-GFP iPSC系中，由CAG组成型启动子控制的GFP转基因被整合在基因组中，并在细胞质中以高水平表达。EMV的尺寸分布(以及总颗粒数)在来自BC1-GFP的EMV和来自亲本BC1iPSC的EMV之间非常相似(图5e)。然而，只有来自BC1-GFPiPSC的EMV表现出明显的绿色荧光(图5f)。

我们已经利用最近改进的基于质谱的蛋白组学开始系统地分析人类iPSC衍生的EMV的蛋白含量。初步分析反映出膜蛋白诸如CD81、CD90和VEGFR2的存在，这些膜蛋白已知存在于人类ESC和iPSC中。然而，还检测到细胞质蛋白以及其次核酸蛋白例如OCT4。除了在iPSC衍生的EMV中检测RNA的基于PCR的方法以外，我们还通过RNA-Seq分析进行mRNA和小RNA诸如微小RNA(miR)的系统分析。通过总RNA的RNA-seq的初步分析确定了OCT4、p-肌动蛋白和miR-302/367簇mRNA存在于iPSC衍生的EMV中。

来自人类iPSC的EMV缺乏基因组DNA但含有RNA

对于该分析，我们使用从经过100倍浓缩后的BC1-GFP iPSC收集的EMV。将EMV裂解物直接用作用于PCR的DNA模板的来源，或用作用于逆转录(RT)的RNA来源，然后进行PCR。在定量PCR反应中使用三对特异性引物，包括P-肌动蛋白、GAPDH，和GFP基因(39)。尽管在RT-PCR后检测到转录物，我们在灵敏的检测条件(-1拷贝基因组DNA)下未检测到三种基因的DNA。

来自人类iPSC的EMV可以转移作为货物的异源蛋白的另外的证据。

为了改进货物转移的灵敏性，我们使用在稳定整合慢病毒载体后组成型表达萤火虫萤光素酶(fluc)的BC1iPSC系。酶fluc在其底物D萤光素、ATP和O₂存在下催化光子生成反应。D萤光素在体内和体外都能够容易地穿透动物细胞膜。

使用20μl来自BC1-fluc iPSC细胞的100x浓缩的EMV，并与含有D萤光素的100μl溶液一起孵育(图6a、b)。观察到fluc萤光素酶活性相当于500个活细胞中的萤光素梅活性。尽管难以确定每个EMV的准确的fluc萤光素酶的量(因为与细胞中相比，EMV中的ATP和O₂水平可能截然不同)，但结果仍然显示了EMV为膜封闭的，且含有ATP(为代谢活性的)。

此外，将来自BCl-fluc iPSC细胞的高达80μl浓缩的EMV(约100x)注射至NSG小鼠眼球后静脉中，仅对右眼注射(小鼠面朝下)。一天后，监测到在腹膜内D萤光素施用15分钟后fluc活性的存在(图6c)。清楚的是，仅在处理动物的注射的右眼中观察到fluc活性(以及可能地尾部和腿部循环中的低水平)。

在活的受体动物中非侵入性地和连续地监测静脉注射或更为局部的注射后的fluc标记的EMV和细胞的命运。GFP+和fluc+EMV数据一起表明，我们可以通过在人类iPSC细胞质中产生异源蛋白，利用EMV将所述异源蛋白递送至靶细胞中。

人类iPSC的EMV被人类内皮细胞的摄取以及对人类内皮细胞生长的刺激(图7)

EMV能够影响体外和体内的生物活性吗？使用内皮细胞(EC)诸如HUVEC和iPSC衍生的EC作为靶细胞。为了非侵入性地和可视地优化EMV被EC的摄取，将纯化的EMV用亲脂性PKH26染料标记，该染料可以整合到EMV的双层脂质膜中，并发出红色荧光。

在用PKH26细胞膜标记试剂盒(Sigma)标记纯化的EMV(同样通过超速离心浓缩100倍)后，通过凝胶过滤柱排除3000Da的小分子以去除游离形式的PKH26染料。将来自人类iPSC的PKH26标记的EMV添加至EC培养的培养基中。在孵育二十个小时后，对EC进行彻底洗涤并通过荧光显微术可视化(图7a)。明显的是，PKH26标记的EMV被EC内化，并且特别地见于核周膜区域和其他膜富集的区域(其中膜结合的PHK26表现出最强的信号)。

受到摄取结果的鼓励，监测了用来自iPSC的EMV或浓缩的培养基对照处理的EC的生长(图7b)。在添加EMV后的2天或4天，通过标准WST-1细胞生长测定监测EC的生长。最初在第2天观察到明显的增强作用，并在第4天增强作用更加明显。结合其他初步数据，检测到的来自人类iPSC的EMV的生物活性鼓励我们对EMV进行系统的表征，并研究其体内潜能。

尽管EMV领域的许多研究人员正致力于研究含有蛋白和RNA的EMV是否可以是监测病理过程的更好的生物标志物，但是本发明侧重使用从干细胞诸如iPSC产生的人类EMV作为用于转移天然和异源蛋白/RNA以及用于治疗目的的递送囊泡。从细胞中释放的无核EMV提供了一种不同的无细胞方法，其与使用病毒样颗粒或其他膜封闭的纳米颗粒用于在体内递送生物制剂的正在进行的研究互补。

到目前为止，关于人类EMV的治疗性应用的出版物大多使用衍生自骨髓、脂肪、脐带或分化的iPSC的人类MSC。后两种类型的MSC被越来越多地使用，因为它们具有较强且较长时间的细胞增殖，和/或可以产生更多的EMV。直到最近，人类MSC是最容易培养和扩增的非转化的人类细胞类型(至少在提供营养和细胞外基质蛋白的10％FBS的存在下)。另外的特征，例如作为营养因子的丰富来源、独特的免疫抑制活性以及广泛尝试的多种细胞疗法的临床试验，也可促使MSC作为EMV的来源而盛行。虽然使用人类MSC衍生的EMV追随正在进行的进展并在我们的研究中将它们用作重要对照以进行比较对我们来说很重要，本发明侧重于人类iPSC衍生的EMV的相对未被开发的用途。

人类iPSC以及由培养中的人类iPSC生成的EMV具有几种独特的特征。除了iPSC可以在确定的E8培养基(无血清且无异源体系)中容易地被扩增以及它们产生大量EMV的关键技术优势之外，iPSC还具有另外的独特生物特性。它们在培养中具有极强的自我更新能力，同时维持它们的多能性。它们表达独特的mRNA和蛋白诸如OCT4的集合，所述独特的mRNA和蛋白诸如OCT4的集合也存在于衍生的EMV中。类似地，人类iPSC和衍生的EMV还包含具有独特生物功能的独特miR，诸如miR-302/367簇。我们将研究EMV介导的自我更新和重编程调控因子诸如OCT4和miR-302/367(作为内源形式或衍生自人类iPSC的过表达形式)的转移的能力，以在受伤后或在疾病状态下“再生(rejuvenate)”体细胞诸如EC。

人类iPSC(以及ESC)还具有独特的代谢活性。将人类体细胞重编程为iPSC，导致线粒体DNA含量的收缩，以及氧化磷酸化向糖酵解的转变。结果，人类iPSC中活性氧(ROS)的内源水平要远远低于其他细胞类型诸如培养中的MSC中的水平。

人类EMV，特别是来自具有基因修饰的人类iPSC的EMV，是一种用于通过无核细胞外囊泡递送生物制剂的新方法。凭借我们在人类iPSC的精确基因组编辑和基因修饰方面的专业知识，我们能够制备出携带由亲本人类iPSC中的过表达产生的异源蛋白和RNA的基因增强的EMV。与我们所研究的其他无核(和细胞外)囊泡(例如尺寸为1μm且只能由哺乳动物中的巨核细胞制备的血小板)相比，我们已经确定了EMV可以由包括人类iPSC在内的几乎任何细胞类型形成。如我们报道的，可以生成来自人类iPSC的EMV，而无需冗长的分化过程(21天)以生成巨核细胞，并且随后生成前血小板。我们设想，人类iPSC衍生的EMV作为无核生物制剂，提供了一种“细胞”疗法的新形式，而不需要输注或移植具有过度增殖和形成癌症风险的有核细胞。

来自人类iPSC和MSC的EMV的特性和生物活性

在任何浓缩步骤之前，始终观察到EMV密度为-2-4×10⁹/ml每日收集的来自次汇合的人类iPSC和MSC的上清液(条件培养基)。但是，难以确定MSC衍生的EMV的准确数量，因为我们使用包含10％FBS的标准MSC培养基，其会贡献大量的牛EMV，并且在批次之间不同。相比之下，我们用不含任何动物蛋白或血清/血浆的高度确定的E8培养基培养人类iPSC。对于人类MSC，我们将首先在E8培养基中过夜培养后(洗涤以减少残留的FBS成分后)收集EMV。如果在E8培养基中收集到的总的MSC-EMV数量太低(5-10倍)或者仍然存在太多的牛EMV(？:占总数的10％)，发明人将使用美国生命技术公司(Life Technologies)的StemPro MSC/SF培养基(而不使用FBS或人类血浆血小板裂解物但包含BSA组分V)或者无异源体系的培养基。

发明人采用标准方法分析纯化/浓缩之前和之后(在确定的培养基中收集的)来自人类iPSC和MSC的EMV，并描述了初步数据(图4-7)。另外的测定包括采用流式细胞术测量来自人类iPSC和MSC的EMV的表面磷脂酰丝氨酸(PS，一种炎症信号)和ROS的水平。对于后者，我们将用二氯萤光素-二乙酸酯(DCFDA)或MitoSox孵育EMV及其亲本细胞。可选地，我们也将使用二氢罗丹明(DHR)，如我们之前在嗜中性粒细胞研究中所使用的，尤其是如果我们需要分析GFP标记的EMV的话。我们将确定iPSC衍生的EMV中的内源ROS水平是否确实比MSC衍生的EMV中的低得多，这可能是因为iPSC主要使用糖酵解的事实。

如果即使在浓缩后EMV的数量对于该项目来说还是太低，我们将探索简单方法来促进从人类MSC和iPSC的EMV产生。我们将从简单的手段诸如改变氧含量(从20％改变至5％)、向培养物中添加ATP等开始。如有必要，我们将对小分子(霍普金斯临床化合物库中的3600个)或Sigma的LOPAC(1280个化合物)进行小规模筛选，这两者都在霍普金斯的ChemCore设施中可得。采用96孔板阅读器的基于fluc的测定(图6)将使我们能够快速筛选从在96孔板中培养的处理细胞(一式三份)中收集的EMV。我们将选择显著提高EMV产量(2:5x)而不会提高ROS水平的处理。一旦建立了用于由人类MSC以及iPSC大规模产生EMV的基本培养条件，我们还将对EMV及其亲本细胞进行RNA-seq和蛋白组学分析。连同来自其他供体的MSC和iPSC，对衍生自iPSC(BC1和E2)的EMV中的RNA表达与衍生自同一供体的MSC的EMV中的RNA表达进行直接比较，将减少不同人类供体之间因基因多态性导致的变化性。

观察到人类iPSC衍生的EMV促进了人类内皮细胞(EC)诸如HUVEC和iPSC衍生的EC的生长(图7)。已充分确定，EC培养基中存在的VEGF对于EC的存活和增殖至关重要，EC表达VEGF受体2(VEGFR2，又称为KDR和FLK1)。在初步研究中，人类iPSC衍生的EMV也表达了VEGFR2，其在20种人类iPSC和ESC中也有表达。为了测试EMV介导受体诸如VEGFR2的转移并从而刺激EC生长的假设，我们将进行以下实验并且使用与我们之前使用的相同的HUVEC和iPSC衍生的EC，以及人类视网膜内皮细胞(HREC，与我们将随后描述的眼部疾病模型相关)。我们将进行功能丧失和功能获得实验。对于功能丧失实验，发明人将敲除或敲低人类iPSC中的VEGFR2表达。VEGFR2表现出对于人类iPSC和ESC的生长是不必要的(我们的未公开的数据)。我们还将揭示人类iPSC上VEGFR2受体的不存在对于EMV的形成是否是必需的。如果不是必需的，发明人将使用VEGFR2阴性的EMV用于与EC一起孵育，以检查所述EMV对EC生长的刺激活性。作为另外的阴性对照，我们将使用来自对于VEGFR2表达应为阴性的MSC的EMV。

对于功能获得实验，我们将在人类iPSC中过表达人类VEGFR2基因(基于Addgene质粒#54298编码的VEGFR2-mEmerald RFP融合蛋白)，如我们之前在人类iPSC中使用GFP和fluc报告物基因所进行的。将用我们之前使用的特异性抗体通过FACS确定EMV中VEGFR2表达的水平。我们可能能够通过监测mEmerald RFP来监测VEGFR2向靶EC的转移。

微小RNA(miR)是18-24个核苷酸(nt)长的非编码RNA，其作为较长RNA前体(pri-miR或pre-miR)由RNA聚合酶II或III启动子的合成。它们与多个基因的mRNA中存在的部分互补序列(18-nt或更短)结合，裂解mRNA或抑制其翻译。最近的研究表明，miR在人类ESC和iPSC的自我更新和体细胞重编程中发挥重要作用。其中，miR-302/367簇在人类ESC中高度表达，但是在成体体细胞诸如HUEVC和成纤维细胞中的表达要低得多。该miR簇的过表达可以促进人类ESC和iPSC的生长，并且促进体细胞重编程为iPSC。在人类ESC和iPSC中，miR-302/367簇通过下调BNIP3L/Nix阻断细胞周期抑制剂并攻克了细胞凋亡。在缺乏miR-302/367的体细胞中，表达4种重编程因子(OCT4、SOX2、KLF4和Myc)以及其他重编程处理(例如加入丁酸盐)显著激活了由包含OCT4和SOX2结合位点的内源Pol II启动子的pri-miR-302/367RNA的转录。这与很多人观察到的结果(即miR-302/367的过表达能够促进体细胞类型的重编程，甚至在丁酸盐不存在的情况下)一致。

我们的初步的RNA-seq分析和基于PCR的测定表明，miR-302/367簇及其五个成熟的家族成员miR-302a、302b、302c、302d和miR-367在iPSC衍生的EMV中大量表达，如在亲本iPSC中一样。因为miR-302/367成员的表达水平在成体(非转化的)体细胞诸如EC和成纤维细胞中非常低(44-45；49-50)，我们认为iPSC衍生的EMV通过以下方式刺激了EC生长：1)转移成熟miR-302/367成员并通过靶向多个mRAN来发挥生物功能；和/或2)经由iPSC特异性因子诸如OCT4激活内源miR-302/367的基因表达(RNA和蛋白)，其在iPSC衍生的EMV中也被检测到。我们将能够区分这两种可能性并且估计每条途径(外源与内源MiR-302/367作用)的重要性，尽管可能是两者的组合起作用。

为了确定EC中(内源)miR-302/367簇成员的表达水平，我们将使用对EMV递送的成熟miR成员中不存在的序列部分特异性的引物通过PCR测量前体(pri-miR和pre-miR)RNA的水平。来自人类iPSC的RNA将被用作阳性对照，并且未处理的EC将被用作阴性对照。通过使用在miR-302/367启动子的控制下的fluc报告物可以进一步确认内源miR-302/367簇的表达的刺激。如果内源miR-302/367的激活可忽略不计，则我们将侧重研究外源miR-302/367(成熟)成员的生物作用，尤其是在EMV递送至EC后立即进行该研究。此外，EMV递送的外源miR-302/367(成熟)成员的生物功能可以使用其中miR-302/367簇被诱导地抑制的人类ESC和iPSC进行进一步评估。所需的试剂包括诱导敲除miR-302/367簇的人类iPSC系，基于fluc的启动子报告物，以及过表达miR-302和miR-367成熟形式的表达载体。

上述所获得的知识对于设计实验和时间进程以缩小miR-302/367介导的翻译抑制的主要靶mRNA的范围将是重要的。之前报道的靶mRNA包括编码以下的mRNA：细胞周期进程抑制剂，以及TGFβ/激活素/节点和PI3K/AKT通路的组分和调节剂。当我们分析miR-302/367对多个细胞周期抑制剂的蛋白水平的影响时，我们还在EMV处理后通过标准方法分析细胞周期状态。除了细胞周期调控之外，我们还侧重miR-302/367对这两条关键信号传导通路的影响。我们观察到在TGFβ/激活素/节点信号传导通路的抑制剂SB431542的存在下，EMV对EC生长的另外的刺激，SB431542本身防止EC衰老并刺激其生长。因此，抑制TGFβ/激活素/节点信号传导通路不太可能是miR-302/367对EC刺激的关键靶。miR-302/367对PBK/AKT信号传导通路的直接作用可能是细胞环境依赖性的。在PTEN mRNA的3'UTR中存在用于miR-302家族的规范化的完美种子结合位点，PTEN mRNA是已知在受体激活后普遍增强细胞存活和增殖(包括EC)的PBK/AKT信号传导通路的一种负抑制剂。我们将还能够通过下列转基因方法调节miR-302/367和PBK./AKT信号传导的轴线。

我们已经证明，我们可以在人类iPSC中过表达编码细胞质蛋白诸如GFP和fluc的mRNA，其然后作为货物被包装到EMV中，并被被动递送至靶细胞的细胞质中。我们将能够过表达膜蛋白诸如VEGFR2，其将被包装到EMV中，并且被水平转移至靶细胞的膜。我们将能够在EMV中过表达其他异源蛋白，尤其是通过将它们拴系至细胞膜，以在EMV和靶细胞中积累至高浓度。为了建立用于多种蛋白的这样的稳健平台，我们将采用通过基因工程将异源蛋白拴系至豆蔻酰化(myr)信号肽的方法，其使蛋白能够被锚定在内质膜上。受体激活后，细胞质AKT蛋白被豆蔻酰化，移动靠近内膜，并且被脂质依赖性PB激酶激活。为了在人类iPSC中表达myr-AKT蛋白，我们将首先使用从Addgene可得的(用于慢病毒载体pCDH-puro-myr-HA-Aktl的质粒#48969)表达myr-HA-AKTl融合蛋白(同时加HA标签)的现有载体。转基因仅包含AKTJ编码序列，并且对靶向AKT1mRNA中的3'UTR的miR-302/367的可能抑制是耐受的。myr-AKT1蛋白的表达可以通过EMV增强EC的存活和生长。如果需要，我们可使用具有类似生化功能的AKT2基因的编码序列。

我们还将使用表达miR-302成熟成员和miR-367的过表达载体。基于可得的表达载体，我们将在人类iPSC中共表达miR-302b(与其他miR-302成员共享相同的靶序列)和miR-367成熟形式。当需要时，我们还将采用CRISPR-Cas9技术在人类iPSC中进行基因敲除，其在我们之前的研究中被使用。生成基因修饰的EMV的能力不仅将进一步增强我们的机理研究，还增强EMV的所需生物功能。建立的原理和方法还应可适用于在EC和iPSC中以低水平表达的其他miR诸如促血管生成的miR-132，以及编码免疫原性蛋白的多种mRNA。我们已经开发了一项可靠且有效的技术，用于将RNA(甚至是蛋白)转染到胶体EMV中，并且我们还能够将外源生物制剂(蛋白和RNA)直接递送至EMV中。

我们将浓缩且纯化的EMV通过静脉(经眼球后静脉)注射到一只眼内，如我们在图6c中进行的，或者通过玻璃体内注射。在接下来的3天以及然后在第6-7天和第14天将每天对所有小鼠进行活体成像。我们还可以改变Xenogen IVIS成像系统的设置，以聚焦在动物的头部并且区分两只不同眼中的信号。我们将建立NSG 15只小鼠中EMV生物分布的基线，然后我们将使用基因增强的EMV例如过表达miR-302/367和/或myr-AKT的能够促进EC生长和刺激血管生成的EMV。可能的是，通过玻璃体内注射的EMV将比静脉注射的EMV在眼内停留更长时间并且局部产生更强的信号。然而，静脉注射后EMV分布的成像也是重要的，其为评估EMV在循环系统中的存在(PK/PD)及其在不同器官中的迁移和积聚偏好提供对照。采用我们开发的基于FACS的测定(图5)以及人类特异性抗体诸如识别人类CD9和CD63的抗体，通过努力测量静脉注射后小鼠血液中的人类EMV将支持了fluc成像结果。

即使发明人在7-14天后不再检测到fluc信号，我们将通过肉眼密切监测被注射的动物长达4个月。主要的目的是检查EMV注射的安全性。如果出现负面作用，动物核心的小鼠病理学家将进行病理学检查。

如果我们在EMV递送例如通过玻璃体内注射的递送后检测到被注射眼中的fluc信号，我们将进行更强有力的体内生物研究。首先将重点放在EC和脉管系统上。随后，还将采用表达miR-302/367和/或myr-AKT的EMV进行类似的实验。

首先，我们将使用很多眼科研究人员常用的经过验证的小鼠模型。我们基于实验和未来的临床试验考虑因素选择该眼部疾病模型。一次对一只眼进行眼部治疗提供了评估安全性和有效性方面的若干优势，包括未治疗的眼是一个理想的对照的事实。眼部注射和治疗需要较少数量的EMV。眼也被认为是免疫豁免部位，其对与培养产生的细胞或EMV相关的新抗原具有降低的免疫反应。

包括糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变(ROP)在内的缺血性视网膜病变是美国和全球范围内导致失明的主要原因。氧诱导的视网膜病变(OIR)的小鼠模型是经过充分研究的缺血性视网膜病变模型。这是因为OIR模型享有人类患者中的缺血和病理性视网膜前NV的特征。病理性视网膜前NV可导致适应不良的反应，并且在人类中最终可导致玻璃体出血和牵拉性视网膜剥离，其可导致失明。

在该小鼠模型中，将新生小鼠在出生后第7天(P7)用75％氧气处理持续5天。在第12天，当小鼠回到正常氧气状态(常氧)时，无血管视网膜明显。在这一阶段，血管损失触发典型的低氧反应以及产生血管和促血管生成因子诸如VEGF，这继而导致在P12观察到的异常内皮细胞增殖以及在P17观察到病理性视网膜前NV。明显的是，在P12和P17之间，视网膜确实出现一定程度的修复性血管生成，只是量不大，这使得仍然存在显著的视网膜缺血，其导致病理性视网膜前NV。在该OIR模型中(以及在包括糖尿病视网膜病变和ROP在内的相应的人类缺血性视网膜病变中)是高度期望的，如果可以发生缺血性视网膜的更大程度的修复性血管生成，这将改进正常视网膜组织的恢复，减少视网膜缺血并且随后产生促血管生成因子，并减少病理性视网膜前NV。我们将从PIO开始将EMV通过玻璃体内注射到被治疗动物的一个眼内。随后将在P12、P17和P25监测同一动物的被治疗眼和未治疗眼中的作用，并且与对照动物组(无高氧处理)比较。如果需要，我们将在P12再次注射EMV。我们还将测试基因增强的EMV(例如过表达Mir-302/367或Myr-AKT的EMV)，将其与来自人类iPSC和MSC的未修饰EMV进行比较。将根据建立的方案，比较由各种EMV治疗的眼的脉管系统。

本公开内容的实施方案涉及用于使用本发明的包含治疗性实体的诱导多能干细胞、无核红细胞或无核外泌体(统称为本发明的治疗剂)治疗和/或预防疾病诸如例如癌症、缺血性视网膜病变或心血管疾病的方法和/或组合物。在某些实施方案中，用本发明的一种或更多种治疗剂治疗患有一种或更多种这类疾病的个体。在一个具体实施方案中，为患有缺血性视网膜病变的个体提供包含微小RNA Mir-302/367、Myr-AKT(豆蔻酰化的AKT活性形式)的诱导多能干细胞、无核红细胞或无核外泌体或其组合，以治疗或预防缺血性视网膜病变。

在本公开内容的特定实施方案中，给予个体除了一种或更多种本发明的治疗剂之外的用于治疗或预防疾病的剂。当采用与一种或更多种本发明的治疗剂的组合疗法时，可以在给予一种或更多种本发明的治疗剂之前、同时和/或之后给予另外的疗法。

药物制剂

本发明的药物组合物包含有效量的一种或更多种本发明的治疗剂，所述治疗剂溶解或分散在药学上可接受的载体中。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用于动物，诸如例如视情况而定施用于人时不会产生不良作用、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含至少一种或更多种本发明的治疗剂或另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员所熟知的，如由Remington:The Science andPractice of Pharmacy,2nd Ed.LipP.incott Williams and Wilkins,2005示例的，其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，将理解的是，制剂应满足如FDA机构的生物标准(FDA Office of Biological Standards)所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括任何及全部溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、保鲜剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、如将由本领域普通技术人员已知的这类物质及其组合物(参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329，其通过引用并入本文)。构思了任何常规载体在药物组合物中的使用，除非其与活性成分不相容。

一种或更多种本发明的治疗剂可以包括不同类型的载体，这取决于其是否以固体、液体或气雾剂形式被施用，以及其是否需要是无菌的以用于这样的施用途径如注射。本发明的组合物可以通过静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部(topically)、肌内、皮下、粘膜、口服、局部(topically)、局部(locally)、吸入(例如雾化吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注浸润靶细胞、经由导管、经由灌洗、以乳状物形式、以脂质组合物形式(例如脂质体)或者通过如将由本领域普通技术人员已知的其他方法或者以上方式的任意组合进行施用(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990，其通过引用并入本文)。

一种或更多种本发明的治疗剂可以被配制成以游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白组合物的游离氨基形成的盐，或者与无机酸诸如例如盐酸或磷酸或者与诸如醋酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁或者诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。配制之后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以诸如为治疗有效的量被施用。制剂可以以多种剂型容易地被施用，例如被配制用于肠胃外施用的剂型诸如可注射溶液、或者用于向肺部递送的气雾剂、或者被配制用于消化器官(alimentary)施用的剂型诸如药物释放胶囊等。

此外，根据本公开内容，适于施用的本发明的组合物在具有或不具有惰性稀释剂的情况下在药学上可接受的载体中提供。载体应当是可同化的，并包括液体、半固体，即糊剂或固体载体。任何常规培养基、剂、稀释剂或载体在可施用组合物中使用或在实践本发明方法中使用是合适的，除非其对受体或包含其的组合物的疗效产生不利影响。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填料等或其组合。组合物还可以包含各种抗氧化剂，以减缓一种或更多种成分的氧化。此外，防止微生物的作用可通过防腐剂诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合)来实现。

根据本发明，组合物以任何方便且实用的方式与载体组合，即，通过溶解、悬浮、乳化、掺和、包封、吸收等。对于本领域技术人员来说，这类程序是常规的。在本发明的具体实施方案中，组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以以任何方便的方式诸如研磨进行。在混合过程中，还可加入稳定剂，以保护组合物免于损失治疗活性，即，在胃内变性。用于在组合物中使用的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸类诸如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物诸如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。

在另外的实施方案中，本发明可以涉及药用脂质媒介物组合物的使用，该组合物包含一种或更多种本发明的治疗剂、一种或更多种脂质和水性溶剂。如本文所使用的，术语“脂质”将被定义为包括特征在于不溶于水并且用有机溶剂可提取的宽范围物质中的任一种物质。本领域技术人员熟知这一大类的化合物，并且本文所使用的术语“脂质”并不局限于任何特定的结构。实例包括含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即由人类设计或生产)。然而，脂质通常是一种生物物质。生物脂质在领域中是熟知的，并包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类、溶血脂、糖鞘脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质、聚合脂质及其组合。当然，除本文具体描述的化合物之外的被本领域技术人员称为脂质的化合物也被本发明的组合物和方法涵盖。

本领域普通技术人员将熟悉可被采用以将组合物分散在脂质媒介物中的一系列技术。例如，一种或更多种本发明的治疗剂可以被分散在含有脂质的溶液中、可用脂质溶解、可用脂质乳化、可与脂质混合、可与脂质组合、可与脂质共价键合、作为悬液包含在脂质中、包含在胶束或脂质体中或与其络合，或另外通过本领域普通技术人员所知的任何方式与脂质或脂质结构缔合。分散可以或可以不导致形成脂质体。

施用至动物患者的本发明的组合物的实际剂量可根据物理和生理因素诸如体重、状况严重程度、待治疗疾病的类型、先前或并行的治疗干预措施、患者特发病和施用途径确定。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可根据受试者的反应而有所不同。不管怎样，负责施用的从业人员将确定组合物中的活性成分浓度，以及用于个体受试者的适合剂量。

在某些实施方案中，药用组合物可以包含，例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可构成约2％至约75％之间的单位重量，或约25％至约60％之间，以及其中可得出的任何范围。当然，每种治疗有用的组合物中活性化合物的量可以以这样的方式制备，使得可以获得以任何给定的单位剂量化合物的合适的剂量。制备此类药物制剂领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品货架期以及其他药理学考虑的因素，并因此各种剂量和治疗方案可以是期望的。

在其他非限制性实例中，剂量也可包括每次施用从约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重到约1000mg/kg/体重或更多，以及其中可得出的任何范围。在根据本文所列数值可得出的范围的非限制性实例中，基于上述数值，可以施用约5mg/kg/体重到约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重到约500毫克/kg/体重等的范围。

消化器官用组合物和制剂

在本公开内容的一个实施方案中，一种或更多种本发明的治疗剂被配制成以经消化器官途径给药。消化器官途径包括其中组合物直接接触消化道的所有可能施用途径。具体而言，本文所公开的药物组合物可以口服给药、口腔施用、直肠施用或舌下施用。因此，可用惰性稀释剂或用可内化的可食用载体来配制这些组合物，或者这些组合物可以被封闭在硬壳或软壳明胶胶囊内，或它们可被压成片剂，或它们可直接掺入到饮食食物中。

在某些实施方案中，活性化合物可掺入有赋形剂，并以可消化片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片(wafer)等形式使用(Mathiowitz等人，1997年；Hwang等人，1998年；美国专利号5,641,515；5,580,579和5,792,451；每一个通过引用整体明确并入本文)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可包含下列物质：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，诸如例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，诸如例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，诸如例如硬脂酸镁；甜味剂，诸如例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，诸如例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂、柑橘调味剂等。当剂量单位形式为胶囊时，除上述类型物质之外，其可含有液体载体。各种其他物质可以作为包衣存在或另外修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以涂覆有虫胶、糖或两者。当剂型为胶囊时，除上述类型物质之外，其可以含有诸如液体载体的载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可被肠溶包衣。肠溶包衣防止组合物在pH值为酸性的胃或肠上部发生变性。参见例如美国专利号5,629,001。到达小肠后，小肠内的碱性pH使包衣溶解，并允许组合物释放并被特化细胞例如肠上皮细胞和派尔斑M细胞(Peyer’s patch M cell)所吸收。糖浆或酏剂可以包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味例如樱桃或柑橘口味。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何物质应当是药物纯的，并且以所采用的量是基本无毒的。此外，活性化合物可以被掺入到持续释放制剂和制品中。

口服施用的本公开内容的组合物可以可选地掺入有一种或更多种赋形剂以呈漱口水、洁齿剂、口含片、口腔喷雾剂或口腔舌下施用的制剂的形式。例如，可以将所需量的活性成分掺入适当的溶剂，诸如硼酸钠溶液(朵贝尔溶液)中制备漱口水。可选地，可将活性成分掺入口服溶液诸如含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的口服溶液中，或分散在洁齿剂中，或以治疗有效量添加到可以包含水、粘合剂、研磨剂、调味剂、起泡剂和保湿剂的组合物中。可选地，组合物可被塑造成片剂或溶液形式，其可被放在舌下或以其他方式在口中溶解。

适合于其他消化器官施用方式的另外的制剂包括栓剂。栓剂是具有各种重量和形状、通常含药的、用于插入直肠的固体剂型。插入后，栓剂在腔流体中软化、溶化或溶解。一般情况下，对于栓剂，传统载体可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可由含有例如以约0.5％至约10％且优选约1％至约2％的量的活性成分的混合物形成。

肠胃外组合物和制剂

在另外的实施方案中，一种或更多种本发明的治疗剂可经肠胃外途径被施用。如本文中使用的，术语“肠胃外”包括避开消化道的途径。具体而言，本文所公开的药物组合物可以例如通过但不限于静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内被施用，美国专利号6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158；5,641,515；以及5,399,363(每个专利通过引用整体明确并入本文)。

作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在水中、合适地与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)混合来制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂，以防止微生物的生长。适于可注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利5,466,468，其通过引用整体明确并入本文)。在所有情况下，形式必须是无菌的、并且必须是流体以便存在易于注射的能力。它必须在生产和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况中通过维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在很多情况下，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

对于以水性溶液形式进行的肠胃外施用，例如，如果需要，应当对溶液进行适当缓冲，并用充足的盐水或葡萄糖使液体稀释剂首先实现等渗。这些特定水性溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，可以被采用的无菌水性介质将是本领域技术人员根据本公开内容所已知的。例如，可以将一个剂量溶解到等渗NaCl溶液中，并且添加皮下灌注术流体或注射在提议的输注部位(参见，例如，"Remington's PharmaceuticalSciences"15th Edition,第1035-1038和1570-1580页)。取决于待被治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。不管怎样，负责施用的人员将会确定用于个体受试者的适合剂量。此外，对于人体施用而言，制剂应当满足如IFDA机构的生物制品标准所要求的无菌性、致热原性以及一般安全性和纯度标准。

无菌可注射溶液通过将所需量的活性化合物掺入适当的溶剂中，然后通过过滤法除菌制备，所述溶剂根据需要具有以上枚举的其他成分中的若干种。一般情况下，分散体通过将各种经灭菌的活性成分掺入到无菌媒介物中制备，所述媒介物含有基本分散介质和来自以上枚举的成分中的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从之前的活性成分的无菌过滤的溶液中产生活性成分加任何另外所需成分的粉末。在具有或没有稳定剂的情况下，将粉状组合物与液体载体诸如水或盐水溶液组合。

其他药物组合物和制剂

在本发明的其他优选实施方案中，本发明的活性化合物或一种或更多种本发明的治疗剂可被配制用于通过各种其他途径施用，例如，局部(即经皮)施用、粘膜施用(鼻内、阴道等)和/或吸入。

用于局部施用的药物组合物可包括被配制用于给药应用的活性化合物，诸如软膏、糊剂、乳膏或散剂。软膏包括用于局部应用的所有油性、吸附性、乳剂性和水溶性基剂的组合物，而乳膏和洗剂是指仅包括乳剂性基剂的组合物。局部施用的药物可含有渗透促进剂，以促进活性成分通过皮肤的吸附。合适的渗透促进剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮和月桂氮卓酮。对于用于局部应用的组合物而言，可能的基剂包括聚乙二醇、羊毛脂、冷膏和凡士林以及任何其他合适的吸收性、乳剂性或水溶性软膏基剂。必要时，局部制剂还可包含乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂，以保存活性成分和提供均匀的混合物。本发明的组合物的经皮施用还可包括使用“贴剂”。例如，贴剂可以以预定速率和以连续的方式经过固定的时间段提供一种或更多种活性物质。

在某些实施方案中，药物组合物可通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他气雾剂递送媒介物进行递送。用于将组合物经鼻内气雾喷雾直接递送至肺部的方法以描述于例如美国专利号5,756,353和5,804,212(每个通过引用整体明确并入本文)中。同样，使用鼻内微颗粒树脂(Takenaga等人，1998年)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利号5,725,871，其通过引用整体明确并入本文)的药物递送在药学领域也是众所周知的。同样，以聚四氟乙烯支持基质的形式的经粘膜药物递送被描述于美国专利号5,780,045(其通过引用整体明确并入本文)。

术语气雾剂指分散在液化或加压气体喷射剂中的精细分离的固体或液体颗粒的胶体系统。本发明用于吸入的典型气雾剂将由活性成分在液体喷射剂中的悬液或在液体喷射剂与合适溶剂的混合物中的悬液组成。合适的喷射剂包括烃和烃醚。合适的容器将根据喷射剂的压力要求而不同。气雾剂的施用将根据受试者的年龄、体重以及症状的严重程度和反应而不同。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，在此通过引用并入本文，其程度与每一个参考文献单独且明确地指定通过引用并入，并在本文中完整地阐述一样。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求书的上下文中)使用术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”以及类似的指称对象，除非本文中另有说明或上下文中有明显的矛盾，否则均应被解释为既包括单数也包括复数。除非另有说明，术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，意为“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文数值范围的表述仅旨在作为单独引用落在该范围内各个单独数值的缩略方法，并且每个单独数值都包含在本说明书内，如同其在本文中单独引用一样。本文中所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指明或因与上下文明显矛盾而另外规定。除非另有要求，使用本文规定的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)仅仅是为了更好地举例说明本发明，而并不限制本发明的范围。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求的要素对本发明的实施是必不可少的。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读上述描述后，对于本领域普通技术人员而言，这些优选实施方案的变化可能会变得明显。发明人期望本领域技术人员适当地利用这些变化，并且发明人希望本发明在本文中没有具体说明的情况下得到实施。相应地，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另有说明或上下文另有明确抵触外，本发明包含上述所有可能变化的要素的任何组合。

Claims (26)

1.一种衍生自血液单核细胞的诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞在HBB基因座的控制下表达治疗性实体。

2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞形成无核红细胞。

3.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞，其中所述治疗性实体是蛋白或微小RNA(miR)，所述治疗性实体当被施用至受试者时能够治疗或预防疾病。

4.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞，其中所述治疗性实体是选自由以下组成的组的蛋白：靶向人类IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)的sc-mAb、靶向VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)的sc-mAb、OCT4(八聚体结合转录因子4)、阻断PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的单链单克隆抗体、Myr-AKT(豆蔻酰化的AKT活性形式)或其组合。

5.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞，其中所述治疗性实体为微小RNA Mir-302/367。

6.一种衍生自根据权利要求1所述的诱导多能干细胞的无核红细胞，所述无核红细胞包含治疗性实体。

7.根据权利要求6所述的无核红细胞，其中所述治疗性实体选自由以下组成的组：靶向人类IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)的sc-mAB、靶向VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)的sc-mAb、微小RNA Mir-302/367、Myr-AKT(豆蔻酰化的AKT活性形式)、OCT4(八聚体结合转录因子4)、阻断PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的单链单克隆抗体或其组合。

8.一种生成无核红细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

培养根据权利要求1-5所述的诱导多能干细胞；以及

从包含治疗性实体的诱导多能干细胞中生成无核红细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，所述方法包括以下步骤：

收集所述无核红细胞并将其置于输注装置中。

10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-5所述的诱导多能干细胞或根据权利要求6-7所述的无核红细胞，以及药学上可接受的载体。

11.一种利用诱导多能干细胞或无核红细胞治疗或预防癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

将有效量的根据权利要求1所述的诱导多能干细胞、根据权利要求6所述的无核红细胞或其组合施用至被认为患有癌症或会患癌症的受试者，其中所述治疗性实体是靶向人类IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)的sc-mAb；以及

治疗或预防受试者的癌症。

12.一种利用诱导多能干细胞或无核红细胞治疗或预防缺血性视网膜病变的方法，所述方法包括以下步骤：

将有效量的根据权利要求1所述的诱导多能干细胞、根据权利要求6所述的无核红细胞施用至被认为患有缺血性视网膜病变或会患缺血性视网膜病变的受试者，其中所述治疗性实体是微小RNA Mir-302/367、Myr-AKT(豆蔻酰化的AKT活性形式)或其组合；以及

治疗或预防受试者的缺血性视网膜病变。

13.一种诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞在HBB基因座的控制下表达治疗性实体。

14.根据权利要求13所述的诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞形成外泌体。

15.根据权利要求13所述的诱导多能干细胞，其中所述外泌体具有尺寸范围为1μm或更小。

16.根据权利要求13所述的诱导多能干细胞，其中所述治疗性实体是蛋白或核酸序列，所述治疗性实体当被施用至受试者时能够治疗或预防疾病。

17.根据权利要求13所述的诱导多能干细胞，其中所述治疗性实体是选自由以下组成的组的蛋白：靶向人类IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)的sc-mAb、靶向VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)的sc-mAb或其组合。

18.根据权利要求13所述的诱导多能干细胞，其中所述治疗性实体是选自由以下组成的组的蛋白：微小RNA Mir-302/367、Myr-AKT(豆蔻酰化的AKT活性形式)或其组合。

19.一种衍生自根据权利要求1所述的诱导多能干细胞的无核外泌体，所述无核外泌体包含治疗性实体。

20.一种生成包含治疗性实体的外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：

培养根据权利要求13-18所述的诱导多能干细胞；以及

从所述诱导多能干细胞生成外泌体。

21.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求13-18所述的诱导多能干细胞或根据权利要求19所述的外泌体，以及药学上可接受的载体。

22.一种利用诱导多能干细胞或无核外泌体治疗或预防癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

将有效量的根据权利要求13所述的诱导多能干细胞、根据权利要求19所述的无核外泌体或其组合施用至被认为患有癌症或会患癌症的受试者；以及

治疗或预防受试者的癌症。

23.一种利用诱导多能干细胞或无核外泌体治疗或预防缺血性视网膜病变的方法，所述方法包括以下步骤：

将有效量的根据权利要求13所述的诱导多能干细胞、根据权利要求19所述的无核外泌体或其组合施用至被认为患有缺血性视网膜病变或会患缺血性视网膜病变的受试者；以及

治疗或预防受试者的癌症。

24.一种制备用于药物递送的红细胞的方法，所述方法包括：

提供源自血液单核细胞的诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞在HBB基因座的控制下表达治疗性实体；

生成包含所述治疗性实体的无核红细胞；以及

收集所述无核红细胞并将其置于输注装置中。

25.一种药物递送方法，所述方法包括：

提供源自血液单核细胞的诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞在HBB基因座的控制下表达治疗性实体；

生成包含所述治疗性实体的无核红细胞；以及

将所述无核红细胞施用至受试者。

26.一种利用诱导多能干细胞或无核红细胞治疗或预防心血管疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

将有效量的根据权利要求1所述的诱导多能干细胞或根据权利要求5所述的无核红细胞施用至被认为患有心血管疾病或会患心血管疾病的受试者，其中所述治疗性实体为阻断前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)的单链单克隆抗体；以及

治疗或预防受试者的心血管疾病。