CN101267836A - 单剂量cd20特异性结合分子的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供使用单剂量CD20特异性结合分子来治疗涉及异常B细胞活性的疾病的材料和方法。

Description

单剂量CD20特异性结合分子的用途

[0001]本申请要求于2005年7月25日申请的美国临时专利申请号60/702,498和2006年7月27日申请的美国临时专利申请号60/702,875的优先权益，所述专利申请各自通过引用结合到本文中。

发明领域

[0002]本发明提供使用单剂量CD20特异性结合分子来治疗涉及异常B细胞活性的疾病的材料和方法。

发明背景

[0003]人体免疫系统的通常作用是保护机体免受外来物质和病原体的损害。免疫系统保护机体的一种方式是通过产生称为B淋巴细胞或B细胞的特化细胞。B细胞产生抗体，抗体与外来物质或病原体结合并在某些情况下介导对外来物质或病原体的破坏。

[0004]在某些情况下，人体免疫系统、尤其是人体免疫系统B淋巴细胞出错，就会生病。多种癌症都涉及不受控制的B细胞增殖。还有多种自身免疫性疾病也涉及B细胞产生的抗体，这些抗体并不是与外来物质和病原体结合，而是与机体部分结合。另外，还有多种自身免疫性和炎性疾病在其病理过程中涉及B细胞，例如通过将不适当的B细胞抗原呈递给T细胞或通过涉及B细胞的其它途径。例如，易患自身免疫性疾病的B细胞缺陷型小鼠就不会患上自身免疫性肾病、脉管炎或产生自身抗体。(Shlomchik等，J Exp.Med.1994，180：1295-306)。有趣的是，当进行实验性诱发时，同样的易患自身免疫性疾病、但具有B细胞而在产生免疫球蛋白方面有缺陷的小鼠却会患上自身免疫性疾病(Chan等，J Exp.Med.1999，189：1639-48)，这表明B细胞在自身免疫性疾病发生方面扮演的角色整体不可或缺。

[0005]B细胞可以根据其细胞表面分子而鉴定。CD20是第一个用单克隆抗体鉴定的人B-细胞谱系特异性表面分子。它是非糖基化的疏水性35kDa B细胞跨膜磷蛋白，其氨基端和羧基端都位于胞内。Einfeld等，EMBO J.1988，7：711-17。所有正常成熟B细胞都表达CD20，但前体B细胞或浆细胞却不表达CD20。尚未鉴定出CD20的天然配体，而CD20在B细胞生物学中的功能也尚未完全了解。

[0006]抗CD20单克隆抗体影响B细胞的活力和生长。(Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986，83：4494-98)。CD20的广泛交联可引起B淋巴瘤细胞系的细胞凋亡(Shan等，Blood 1998，91：1644-52)，已经报道CD20与细胞表面的交联可增加信号转导的数量并增强信号转导的动力学，正如测定细胞底物的酪氨酸磷酸化所检测的那样。(Deans等，J.Immunol.1993，146：846-53)。因此，除了因补体和ADCC机制所致的细胞耗竭(cellular depletion)之外，Fc-受体与CD20单克隆抗体在体内结合也可通过CD20交联而促使恶性B细胞凋亡，这与以下理论是一致的：在SCID小鼠模型中对人淋巴瘤的CD20治疗有效性取决于Fc-受体与CD20单克隆抗体的结合(Funakoshi等，J.Immunotherapy1996，19：93-101)。CD20多肽中多个跨膜结构域的存在(Einfeld等，EMBO J.1988，7：711-17；Stamenkovic等，J.Exp.Med.1988，167：1975-80；Tedder等，J.Immunol.1988，141：4388-4394)，在抗体结合后阻止CD20内化，这被认为是B细胞恶性肿瘤治疗的重要特征，当将鼠CD20单克隆抗体1F5注射到患有B细胞淋巴瘤的患者时，导致恶性细胞的显著耗竭并导致部分临床反应(Press等，Blood 1987，69：584-91)。

[0007]因为正常成熟B细胞也表达CD20，所以正常B细胞因抗CD20抗体治疗而耗竭(Reff等，Blood 1994，83：435-445)。然而，在治疗完成之后，正常B细胞可从CD20阴性B细胞前体中再生；因此，用抗CD20治疗的患者不会经受明显的免疫抑制。

[0008]CD20由B细胞来源的恶性细胞表达，包括B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。前B细胞恶性肿瘤(例如急性成淋巴细胞性白血病)不表达CD20。因此，CD20是治疗B细胞淋巴瘤、CLL和病因涉及B细胞的其它疾病的良好靶标。其它B细胞障碍包括自身免疫性疾病，其中自身抗体是在B细胞分化成浆细胞时产生的。

[0009]各研究小组已经研究了抗CD20抗体治疗B细胞相关疾病的用途。一种治疗包括用于治疗B细胞淋巴瘤的、以放射性核素形式制备的抗CD20抗体(例如¹³¹I-标记的抗CD20抗体)，以及用于减轻因前列腺癌和乳癌转移所致骨痛的⁸⁹Sr-标记形式的抗CD20抗体(Endo，Gan To Kagaku Ryoho 1999，26：744-748)。

[0010]涉及CD20抗体的专利和专利公布说明书包括美国专利号5,776,456、5,736,137、6,399,061和5,843,439，以及美国专利申请号US 2002/0197255A1和US 2003/0021781A1(Anderson等)；美国专利号6,455,043B1和WO 00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO 00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO00/44788(Braslawsky等)；WO 01/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO 01/10460(White和Grillo-Lopez)；美国申请号US2002/0006404和WO 02/04021(Hanna和Hariharan)；美国申请号US2002/0012665A1和WO 01/74388(Hanna，N.)；美国申请号US2002/0009444A1和WO 01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO01/97858(White，C.)；美国申请号US2002/0128488A1和WO 02/34790(Reff，M.)；WO 02/060955(Braslawsky等)；WO 02/096948(Braslawsky等)；WO 02/079255(Reff和Davies)；美国专利号6,171,586B1和WO 98/56418(Lam等)；WO 98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO 99/51642、美国专利号6,194,551B1、美国专利号6,242,195B1、美国专利号6,528,624B1和美国专利号6,538,124(Idusogie等)；WO 00/42072(Presta，L.)；WO 00/67796(Curd等)；WO 01/03734(Grillo-Lopez等)；美国申请号US 2002/0004587A1和WO 01/77342(Miller和Presta)；美国申请号US2002/0197256(Grewal，I.)；美国专利号6,090,365B1、6,287,537B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski等)；美国专利号5,500,362、5,677,180、5,721,108和6,120,767(Robinson等)；美国专利号6,410,391B1(Raubitschek等)；美国专利号6,224,866B1和WO 00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO 01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO 00/67795(Goldenberg)；WO00/74718(Goldenberg和Hansen)；WO 00/76542(Golay等)；WO01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利号6,368,596B1(Ghetie等)；美国申请号US2002/0041847A1，(Goldenberg，D.)；美国申请号US2003/0026801A1(Weiner和Hartmann)；WO 02/102312(Engleman，E.)，另见美国专利号5,849,898和EP申请号330,191(Seed等)；美国专利号4,861,579和EP332,865A2(Meyer和Weiss)；和WO 95/03770(Bhat等)，所述各文献通过引用结合到本文中。

[0011]据报道，对CD20具有特异性的嵌合单克隆抗体(由来自小鼠的重链可变区和轻链可变区与人IgG1重链和人κ轻链恒定区融合而成)保留对CD20的结合力以及介导ADCC和结合补体的能力(Liu等，J.Immunol.198+7，139：3521-26)。而另一嵌合抗CD20抗体由IDEC杂交瘤C2B8制得，称为利妥昔单抗。认为上述利妥昔单抗的抗肿瘤活性机制由若干活性组成，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体结合和触发促进恶性B细胞凋亡的信号。ADCC是细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随之引起靶细胞溶解。补体结合即补体依赖性细胞毒性(CDC)是在补体存在下的分子溶解靶标的能力。通过补体系统第一成分(Clq)与同相关抗原缔合的分子(例如抗体)结合，而启动补体活化途径。利妥昔单抗的大尺寸阻止分子向含有恶性B细胞的淋巴组织的最佳扩散，因而限制了这些抗肿瘤活性。

[0012]利妥昔单抗通常在4周内输注抗体4剂(1剂/周×4)，目前用于治疗低级(low-grade)或滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma))(McLaughlin等，Oncology 1998，12：1763-1777；Leget等，Curr.Opin.Oncol.1998，10：548-551)和复发性III/IV期滤泡性淋巴瘤(White等，Pharm.Sci.Technol.Today 1999，2：95-101)。用利妥昔单抗可治疗的其它障碍包括滤泡性中心细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)和小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)(Nguyen等，Eur J Haematol.1999，62：76-82))。每周输注利妥昔单抗也可用于治疗CLL(Lin等，Sem Oncol.2003，30：483-92)。

[0013]抗CD20抗体也已广泛用于治疗与B细胞产生自身抗体相关的自身免疫性疾病患者。例如，在包括RA在内的多发性自身免疫性/炎性疾病患者中，已经证明利妥昔单抗在耗竭CD20+B细胞中的显著临床益处(Edwards，N Engl J Med.2004，350：2546-8；Cambridge等，Arthritis Rheum.2003，48：2146-54)。RA患者接受连续剂量的甲氨蝶呤(MTX)和2剂量疗程的利妥昔单抗输注(Edwards等，出处同上)。与对照组相比，这些患者表现出美国风湿病学学会(AmericanCollege of Rheumatology，ACR)反应的改善。

[0014]在系统性红斑狼疮(SLE)的治疗试验(Leandro等，Arthritis Rheum.2002，46：2673-7)中，给患者两次输注高剂量利妥昔单抗，表现出B细胞耗竭并改善疾病状态。在SLE中进行的B细胞耗竭的第二次研究中(Looney等，Arthritis Rheum.2004，50：2580-9)，给患者单次输注100mg/m²(低剂量)、单次输注375mg/m²(中等剂量)或4次输注(间隔1周)375mg/m²(高剂量)。这些患者表现出B细胞耗竭并改善疾病评分，但是治疗并未改变自身抗体水平。也已经在瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)中进行了利妥昔单抗试验(Treon等，Immunother.2001，24：272-9)，其中在4次输注利妥昔单抗后，患者的血细胞比容(HCT)和血小板(PLT)计数增加。

[0015]用利妥昔单抗治疗多发性硬化(multiple scleorosis，一种影响中枢神经系统的自身免疫性疾病)患者的近期报告表明，利妥昔单抗治疗过程耗竭了外周B细胞，但对脑脊液的B细胞却几乎没有影响(Monson等，Arch Neurol.2005，62：258-64)。

[0016]有关利妥昔单抗用途的其它出版物包括：Stashi等″Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatmnet for adultswith chronic idiopathic thrombocytopenic purpura(利妥昔单抗嵌合抗CD20单抗治疗成人慢性特发性血小板减少性紫癜)″Blood 2001，98：952-957；Matthews，R.″Medical Heretics″New Scientist(2001年4月7日)；Leandro等″Clinical outcome in 22 patients with rheumatoidarthritis treated with B lymphocyte depletion(22例类风湿性关节炎患者用B淋巴细胞耗竭治疗的临床结果)″Ann Rheum Dis 2002，61：833-888；Leandro等″Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis：early evidence for safety，efficacy and dose response(类风湿性关节炎中的淋巴细胞耗竭：安全性、功效和剂量反应的早期证据).Arthritis andRheumatism 2001，44：S370；Leandro等″An open study of Blymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus(系统性红斑狼疮中B淋巴细胞耗竭的开放性研究)″，Arthritis Rheum.2002，46：2673-2677；Edwards等，″Sustained improvement in rheumatoidarthritis following a protocol designed to deplete B lymphocyte(在接受用于耗竭B淋巴细胞的方案后类风湿性关节炎的持续改善)″Rheumatology2001，40：205-211；Edwards等″B-lymphocyte depletiontherapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders(在类风湿性关节炎和其它自身免疫病中进行B-淋巴细胞耗竭治疗)″Biochem.Soc.Trans.2002，30：824-828；Edwards等″Efficacy and safety ofRituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody：Arandomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis(利妥昔单抗，一种靶向B细胞的嵌合单克隆抗体的功效和安全性：对类风湿性关节炎患者的随机、安慰剂对照试验).Arthritis Rheum.2002，46：S197；Levine等，″IgM antibody-related polyneuropathies：B-cell depletion chemotherapy using Rituximab(IgM抗体相关的多神经病：用利妥昔单抗进行B细胞耗竭化学治疗)″Neurology 1999，52：1701-1704；DeVita等″Efficacy of selective B-cell blockade in thetreatment of rheumatoid arthritis(选择性B细胞阻滞剂对治疗类风湿性关节炎的功效)″Arthritis Rheum.2002，46：2029-2033；Hidashida等″Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with Rituximab(用利妥昔单抗治疗DMARD-难治性类风湿性关节炎).″Presented atthe Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology；October 24-29；New Orleans，La.2002；Tuscano，J.″Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis withRituximab(用利妥昔单抗成功治疗英夫利昔单抗难治性类风湿性关节炎)″Presented at the Annual Scientific Meeting of the American Collegeof Rheumatology；October 24-29；New Orleans，La.2002。

[0017]利妥昔单抗的治疗还有些问题。例如，大多数用利妥昔单抗治疗的癌症患者通常在约6-12个月内会复发，而且已报道利妥昔单抗输注24小时内有致命输注反应。这些致命反应是在输注反应综合征(包括低氧、肺部浸润、急性呼吸窘迫综合征、心肌梗塞、心室纤颤或心源性休克)之后发生的。也已报道了用利妥昔单抗治疗之后，在肿瘤溶解综合征中，在致命结果的病例中需要透析的急性肾衰竭，具有严重粘膜皮肤反应，有些有致命后果。另外，需要高剂量利妥昔单抗进行静脉内注射，因为分子较大，约150kDa，而且如上所述，向含有许多肿瘤细胞的淋巴组织扩散是有限的。利妥昔单抗治疗的另一缺点就是通常给予接受治疗的患者多剂量利妥昔单抗，通常每周给予高剂量，持续4周(Maloney等，Blood 1997，90：2188-2195)，但是在给予单剂量利妥昔单抗抗体的人体内进行的剂量反应，在接受高剂量抗体的患者中导致少量B细胞耗竭(Maloney等，Blood 1994，84：2457-2466)。

[0018]单克隆抗体技术和遗传工程方法导致免疫球蛋白分子的快速开发，用于人类疾病的诊断和治疗。蛋白质工程已经用于改进抗体与其相关抗原的亲和性，减少免疫原性相关问题，并改变抗体的效应子功能(effector function)。对免疫球蛋白的各区结构进行改造，因为抗原结合区和具有效应子功能的结构域在免疫球蛋白类和亚类之间可以交换。免疫球蛋白结构和功能的综述参见例如Harlow等(编著)，Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor(1988)。有关重组抗体技术所有方面的深入介绍和细节可参见教科书“Recombinant Antibodies”(John Wiley& Sons，NY，1999)。详细的抗体工程实验室方案大全可参见R.Kontermann和S.Dübel(编著)，“The Antibody Engineering Lab Manual”(Springer Verlag，Heidelberg/New York，2000)。

[0019]最近已构建了较小的免疫球蛋白分子，以克服用完整免疫球蛋白治疗的相关问题。单链Fv(scFv)包括通过短接头肽与抗体轻链可变区连接的抗体重链可变区(Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85：5879-83)。除了可变区之外，各抗体链还具有一个或多个恒定区。轻链具有单个恒定区结构域。因此，轻链具有一个可变区和一个恒定区。重链具有几个恒定区结构域。IgG、IgA和IgD的抗体重链具有3个恒定区结构域(称为CH1、CH2和CH3)，而IgM和IgE的抗体重链具有4个恒定区结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。因此，重链具有一个可变区和三个或四个恒定区。

[0020]免疫球蛋白的重链也可分为3个功能区：Fd区(包含VH和CH1的片段，即重链的2个N-端结构域)、铰链区和Fc区(“可结晶片段”区，来自恒定区，在胃蛋白酶消化后形成)。Fd区与轻链一起构成Fab(“抗原结合片段”)。因为抗原与抗原结合区在各Fab的氨基端产生立体化学反应，所以IgG分子是二价的，即可与两个抗原分子结合。Fc含有与细胞上的免疫球蛋白受体相互作用并且与补体级联起始元件相互作用的结构域。因此，通常认为Fc片段负责免疫球蛋白的效应子功能，例如补体结合和与Fc受体结合。

[0021]因为scFv分子体积小，所以它们从血浆和组织中清除得非常快，并且比完整免疫球蛋白能更有效地穿透进入到组织中。与相应的嵌合抗体相比，抗肿瘤scFv表现出更快的肿瘤穿透性和更均匀地在瘤体内分布(Yokota等，Cancer Res.1992，52：3402-08)。将scFv与其它分子(例如毒素)融合，利用特异性抗原结合活性和scFv的小体积，将毒素递送到靶组织。(Chaudary等，Nature 1989，339：394)；Batra等，Mol.Cell.Biol.1991，11：2200)。

[0022]尽管scFv分子在血清疗法上具有优势，但是该治疗方法也存在若干缺点。尽管scFv的快速清除可减少对正常细胞的毒性效应，但是这样快速清除也会妨碍将最低有效量递送到靶组织。制备足够量的scFv以给予患者，一直都是个挑战，因为scFv难以表达和分离，对收率有不利影响。在表达期间，scFv分子缺乏稳定性，通常会因不同分子的可变区配对而聚集。此外，在哺乳动物表达系统中scFv分子的产生水平低下，限制了有效制备scFv分子用于治疗的潜力(Davis等，J Biol.Chem.1990，265：10410-18)；Traunecker等，EMBO J1991，10：3655-59)。一直在研究改进生产的策略，包括给可变区添加糖基化位点(Jost，C.R.美国专利号5,888,773，Jost等，J.Biol.Chem.1994，69：26267-73)。

[0023]采用scFv进行治疗的另一缺点是缺乏效应子功能。与免疫球蛋白恒定区缔合的、没有细胞溶解功能、ADCC和补体依赖性细胞毒性(CDC)的scFv对治疗疾病而言是无效的。虽然对scFv技术的开发早在12年前就开始进行，但是目前仍然没有批准scFv产品用于治疗。

[0024]或者，已经提出将scFv与其它分子(例如毒素)融合，可利用特异性抗原结合活性和scFv的小体积，将毒素递送到靶组织。Chaudary等，Nature 1989，339：394；Batra等，Mol.Cell.Biol.1991，11：2200。因此，将毒素与scFv缀合或融合，给出了替代策略，以提供强效的抗原特异性分子，但是因这类制剂的毒素部分所致的过度和/或非特异性毒性而限制了给予这类缀合物或嵌合物。毒性效应可包括超过生理性的肝脏酶升高和血管渗漏综合征及其它不想要的效应。另外，免疫毒素本身在给予宿主时是高免疫原性的，针对免疫毒素而产生的宿主抗体限制了对个体的重复治疗性治疗的潜在用途。

[0025]其它的工程融合蛋白，称为小模块免疫药物(small，modular immunopharmaceutical，SMIP^TM)产品，参见共同拥有的美国专利公布说明书2003/133939、2003/0118592和2005/0136049以及共同拥有的国际专利公布说明书WO 02/056910、WO 2005/037989和WO 2005/017148，这些文献都通过引用结合到本文中。SMIP产品是新型结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其特征是针对例如以下相关结构的结合结构域：抗原、反受体等；野生型IgG1、IgA或IgE铰链区多肽或突变型IgG1铰链区多肽(具有0、1或2个半胱氨酸残基)；和免疫球蛋白CH2区和CH3区。SMIP产品具有ADCC和/或CDC能力。

[0026]尽管对基于抗体的疗法进行了深入研究，但是在所属领域仍然需要改进的方法，以治疗异常B细胞活性相关疾病。本发明所述和要求保护的方法就提供了这类改进方法以及其它优势。

发明概述

[0027]本发明涉及在异常B细胞活性相关疾病中调节B细胞群体水平的方法。

[0028]一方面，本发明提供用于治疗患有或疑似患有异常B细胞活性相关疾病的患者的方法，所述方法包括给予患者单剂量的治疗有效量的CD20特异性结合分子。在一个实施方案中，CD20特异性结合分子是CD20特异性小模块免疫药物(SMIP)。

[0029]“异常B细胞活性”是指偏离正常、适当或预期进程的细胞活性。例如，异常细胞活性可包括不适当的细胞增殖，其中DNA或其它细胞组分已经有损伤或者有缺陷。异常B细胞活性可包括细胞增殖，其特征是与以下疾病相关：由不适当的高水平细胞分裂、不适当的低水平细胞凋亡或这两者同时引起的、介导的疾病，或者能导致不适当的高水平细胞分裂、不适当的低水平细胞凋亡或这两者的疾病。这类疾病的特征是例如通过细胞、细胞群体或组织的单次或多次局部异常增殖，无论是癌性细胞还是非癌性细胞，良性细胞还是恶性细胞，详见下文。异常B细胞活性也可包括产生异常抗体(例如产生自身抗体)或过量产生通常希望以正常水平产生的抗体。它还包括异常B细胞活性可发生在某些B细胞亚群内而不发生在其它亚群。异常B细胞活性也可包括对T细胞的不适当刺激，例如通过不适当的B细胞抗原呈递给T细胞或通过涉及B细胞的其它途径。

[0030]CD20特异性结合分子的“单剂量”是指在治疗开始给予单次连续输注一个剂量的CD20特异性SMIP，而不是需要每周一次或两周一次给予CD20特异性结合分子的多剂量治疗。在一个实施方案中，单次连续输注可以是长时间的皮下输注、静脉内输注等。可以在一段时间内给予单次连续输注，例如从约15分钟至约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时，或者一天或多天或一周或多周(例如从植入装置或凝胶缓释型制剂中持续释放)。单剂量可以与其它治疗药或第二药物联合用药，可以在给予本文所述的第二治疗药的同时、之前或之后给予。按照本发明，单次连续输注可包括视实际情况按需要短时中断输注。

[0031]“患有或疑似患有异常B细胞活性相关疾病的患者”是这样的患者：其中疾病或疾病症状可由异常B细胞活性引起，可因异常B细胞活性而恶化，或可通过调节B细胞活性而缓解。这类疾病的实例是B细胞癌(例如B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、B细胞骨髓瘤)、以产生自身抗体为特征的疾病或者以不适当T细胞刺激(例如通过不适当的B细胞抗原呈递给T细胞或通过涉及B细胞的其它途径)为特征的疾病。

[0032]一方面，与用利妥昔单抗而没用其它CD20结合分子治疗的反应相比，用本发明方法治疗的个体表现出对用本文所述CD20结合分子治疗的改善反应更好。与用利妥昔单抗而没用其它CD20结合分子治疗相比有所改善的反应，是指这样的临床反应：其中用本发明方法对患者进行治疗导致临床反应，比接受利妥昔单抗治疗(例如利妥昔单抗单用或利妥昔单抗与其它药物联用，其中其它药物不是其它CD20结合分子)的患者的临床反应更好。通过比较本领域众所周知的和本文所述的临床标准来评价改进反应。示例性的标准包括但不限于B细胞耗竭持续时间，B细胞总数减少、生物样品中B细胞数量减少，肿瘤大小缩小，现有肿瘤数量和/或治疗后出现的肿瘤的数量减少，以及患者本人和医生评价的改善的总体反应，例如采用国际预后指数(International Prognostic Index)。可能在一项或多项临床标准上发生改善。用本发明方法的改善反应可能因为对先前或目前使用利妥昔单抗的治疗的不适当反应，例如因为毒性和/或不适当的利妥昔单抗治疗功效。

[0033]在相关方面，用本发明方法治疗的个体也接受利妥昔单抗。在一个实施方案中，可以作为一线治疗和持续治疗给予利妥昔单抗，当开始用本发明方法进行治疗时。在另一个实施方案中，在用本发明方法开始治疗后，停止给予利妥昔单抗治疗。

[0034]“患有或疑似患有风湿病的患者”是受累于关节或肌骨骼系统(这类受累区例如关节、软骨、肌肉、神经和腱等区域)的疾病或障碍的患者或个体。还包括患有或疑似患有风湿病的患者可预先接受针对风湿病的治疗。在一个实施方案中，风湿病包括但不限于类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、皮肌炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、青少年类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、雷诺综合征(Raynaud’s syndrome)、赖特综合征(Reiter’s syndrome)、结节病、脊椎关节病、进行性系统性硬化病和肌病。

[0035]“患有或疑似患有中枢神经系统自身免疫性疾病”或“中枢神经系统障碍的患者”是受累于中枢神经系统(包括脑和脊髓，或者视神经等区域)的疾病或障碍的患者或个体。还包括患有或疑似患有中枢神经系统障碍的患者可预先接受针对中枢神经系统障碍的治疗。在一个实施方案中，中枢神经系统自身免疫性疾病包括但不限于多发性硬化、变应性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、狼疮性脊髓炎和狼疮性脑炎。

[0036]“脉管炎”是指与血管炎症相关的疾病或障碍。示例性的脉管炎包括但不限于贝赫切特综合征(Behcet’s disease)、中枢神经系统脉管炎、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)、冷球蛋白血症、巨细胞性动脉炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜、过敏性脉管炎/血管炎、川崎病(Kawasaki disease)、白细胞破碎性脉管炎、多脉管炎(polyantitis)、结节性多脉管炎、多肌痛、多软骨炎、类风湿性脉管炎、无脉病(Takayasu’sarteritis)、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulamatosis)、肝炎所致脉管炎、家族性地中海热、微小多脉管炎(microscopic polyangiitis)、科根综合征(Cogan’s syndrome)、Whiskott-Aldrich综合征和血栓闭塞性脉管炎。

[0037]“治疗”是指治疗性治疗或预防性治疗。治疗性治疗可改善接受治疗个体的至少一种疾病症状或者可延迟个体的进行性疾病的恶化，或预防额外相关疾病的发作。

[0038]CD20特异性结合分子的“治疗有效剂量”或“有效量”是指化合物足以导致所治疗疾病的一种或多种症状得到改善的量。当用于单一活性成分，单独给予时，治疗有效剂量是指单一成分。当联合用药时，治疗有效剂量是指导致疗效的活性成分的联合量，无论是连续联合用药还是同时联合用药。本发明尤其涵盖按照本发明方法给予一种或多种CD20特异性结合分子，每种都按有效量给予。

[0039]本发明所涵盖的方法适用于治疗例如以下疾病：B细胞癌(例如B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤)、以产生自身抗体为特征的疾病或者以不适当T细胞刺激(例如通过不适当的B细胞抗原呈递给T细胞或通过涉及B细胞的其它途径)为特征的疾病。

[0040]B细胞癌包括B细胞淋巴瘤[例如霍奇金病(Hodgkin′sdisease)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或中枢神经系统淋巴瘤的各种形式]、白血病[例如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病和慢性成肌细性白血病(myoblastic leukemia)]和骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)。其它B细胞癌包括小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞样淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、结外粘膜相关淋巴组织边缘带B细胞淋巴瘤(MALT)、结节性边缘带B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)/白血病、不明原因的可能恶化的恶性B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿和移植后淋巴增殖障碍。

[0041]以产生自身抗体为特征的障碍通常称为自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括但不限于：关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、多软骨炎、银屑病性关节炎、银屑病、皮炎、多肌炎/皮肌炎、包含体肌病、炎性肌病、中毒性表皮坏死松解、系统性硬皮病和硬化、CREST综合征、炎性肠病相关反应、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球性肾炎、过敏性病症、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎性反应的病症、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)、亚急性皮肤红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮性脊髓炎、狼疮性脑炎、青少年起病型糖尿病、多发性硬化、变应性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、风湿热、西登哈姆舞蹈病(Sydenham’s chorea)、由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答、结核病、结节病、包括韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)和丘-施病(Churg-Strauss disease)在内的肉芽肿病、粒细胞缺乏症、脉管炎(包括过敏性脉管炎/血管炎、ANCA和类风湿性脉管炎)、再生障碍性贫血、先天性再生不良性贫血、免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA))、恶性贫血、纯红细胞发育不良(PRCA)、VIII因子缺乏症、A型血友病、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、白细胞渗出相关疾病、中枢神经系统(CNS)炎性障碍、多器官损伤综合征、重症肌无力(mysathenia gravis)、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜抗体病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、贝赫切特病(Behcet disease)、Castleman综合征、古德帕斯彻综合征(Goodpasture′s syndrome)、兰-伊(Lambert-Eaton)肌无力综合征、雷诺综合征(Reynaud′s syndrome)、斯耶格伦综合征(Sjorgen′ssyndrome)、史蒂文斯-约翰逊综合征、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多内分泌腺病、血清反应阴性的脊椎关节病、赖特病(Reiter’s Disease)、僵体综合征、巨细胞性动脉炎、免疫复合物性肾炎、IgA肾病、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombotic throbocytopenic purpura，TTP)、亨诺赫-舍恩莱因紫癜、自身免疫性血小板减少、睾丸和卵巢的自身免疫性疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、原发性甲状腺功能减退症；自身免疫性内分泌病(包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis))、亚急性甲状腺炎、原发性甲状腺功能减退症)、艾迪生病(Addison’s disease)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、自身免疫性多腺性综合征(或多腺性内分泌病综合征)、I型糖尿病(也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))和席汉氏综合征(Sheehan′ssyndrome)；自身免疫性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)NSIP、急性热病性多神经炎(Guillain-Barre′Syndrome)、大血管脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞性(Takayasu′s)动脉炎)、中等血管脉管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、结节性多动脉炎(PAN)、关节强硬性脊椎炎、贝格尔病(Berger′s disease，IgA肾病)、快速进行性肾小球性肾炎、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(谷蛋白肠病)、冷球蛋白血症、肝炎相关的冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、冠状动脉病、家族性地中海热、微小多脉管炎、科根综合征(Cogan’s syndrome)、Whiskott-Aldrich综合征和血栓闭塞性脉管炎。

[0042]类风湿性关节炎(RA)是以关节炎症为特征的慢性病，导致肿胀、疼痛和功能丧失。长期患有RA的患者通常表现出进行性的关节破坏、畸形、致残，甚至过早死亡。

[0043]系统性红斑狼疮(SLE)是包括肾、皮肤和关节在内的多器官内血管的复发性损伤所致的自身免疫性疾病。在SLE患者中，T细胞与B细胞间错误的相互作用，导致产生攻击细胞核的自身抗体。普遍都同意，自身抗体负责SLE的至少某些方面。涵盖耗竭B-细胞谱系的新疗法，以允许免疫系统重新调整，因为新的B细胞从前体中产生，将有望对SLE患者提供长期持续的益处。

[0044]多发性硬化(MS)也是自身免疫性疾病，其特征是中枢神经系统炎症和髓磷脂的破坏，髓磷脂将大脑、脊髓和机体中的神经细胞纤维隔离开。尽管MS的起因尚不知道，但是普遍认为自身免疫T细胞对该病的发病机制起到主要作用。然而，高水平的抗体存在于MS患者的脑脊液中，某些预测B细胞反应导致抗体产生的理论对介导疾病而言是重要的。

[0045]克罗恩病及其相关疾病溃疡性结肠炎是都属于称为炎性肠病(IBD)的两大类疾病。克罗恩病是引起消化道或胃肠道炎症的慢性疾病。尽管该病可涉及胃肠道中从口腔到肛门的任何部位，但是它最主要还是影响小肠和/或结肠。在溃疡性结肠炎中，所累及的GI限制在结肠中。

[0046]克罗恩病的特征是针对嗜中性粒细胞抗原的抗体(即“核周抗嗜中性粒细胞抗体”(pANCA))和针对酿酒酵母(Saccharomycescervisiae)的抗体(即“抗酿酒酵母抗体”(ASCA))。许多溃疡性结肠炎患者血液中都具有pANCA抗体，但是没有ASCA抗体，而许多克罗恩病患者表现出有ASCA抗体，而没有pANCA抗体。评价克罗恩病的一种方法是使用克罗恩病活性指数(Crohn’s disease Activity Index，CDAI)，根据医生所收集的18个预测变量评分。CDAI值在150以下与静息疾病有关；数值在150以上表明活动性疾病，而数值超过450则患有非常严重疾病(Best等，″Development of a Crohn’s diseaseactivity index.″Gastroenterology 70：439-444，1976。然而，因为先前的研究，某些研究人员使用′主观值′为200-250作为健康评分。

[0047]自身免疫性甲状腺病是因自身抗体的产生而引起的，自身抗体既可刺激甲状腺而引起甲状腺功能亢进(格雷夫斯病(Graves′disease))又能破坏甲状腺而引起甲状腺功能减退(桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis))。通过自身抗体结合并活化促甲状腺激素(TSH)受体而引起对甲状腺的刺激。通过自身抗体与其它甲状腺抗原反应而引起对甲状腺的破坏。

[0048]斯耶格伦综合征是特征为产生身体水分的腺体受到破坏的自身免疫性疾病。

[0049]免疫性血小板减少性紫癜(ITP)是由自身抗体结合血液中的血小板并造成对它们的破坏而引起。

[0050]重症肌无力(MG)是慢性自身免疫性神经肌肉障碍，其特征是自身抗体与神经肌肉接头上表达的乙酰胆碱受体结合，导致随意肌群(voluntary muscle group)弱化。

[0051]银屑病的特征是皮肤的自身免疫性炎症，也与30％的关节炎病例有关。

[0052]还涵盖对包括皮肌炎(DM)和多肌炎(PM)在内的原发性炎性肌病(IIM)的治疗。采用多种分类方案对炎性肌病加以分类。Miller氏分类方案(Miller，Rheum Dis Clin North Am.1994，20：811-826)确定2种原发性炎性肌病(IIM)，即多肌炎(PM)和皮肌炎(DM)。

[0053]多肌炎和皮肌炎是使人衰弱的慢性炎性疾病，累及肌肉和皮肤(后者是在DM的情况下)。这些疾病极其罕见，据报道在美国的年发病率大约为每百万成年人5-10例，每百万儿重0.6-3.2例(Targoff，Curr Probl Dermatol.1991，3：131-180)。原发性炎性肌病与显著发病率和致死率有关，注意到高达半数的受累成人会经受明显的病损(Gottdiener等，Am J Cardiol.1978，41：1141-49)。Miller(Rheum DisClin North Am.1994，20：811-826和Arthritis and Allied Conditions，第75章，Koopman和Moreland编著，Lippincott Williams和Wilkins，2005)提出5组标准，用于诊断IIM，即原发性炎性肌病标准(IdiopathicInflammatory Myopathy Criteria，IIMC)评价，包括肌肉衰弱、肌肉变性的活检证据、肌肉相关酶血清水平升高，肌病电磁三联征(electromagnetic triad of myopathy)、皮肌炎中皮疹的证据、以及还包括自身抗体证据作为第二标准。

[0054]IIM相关因子(包括肌肉相关酶)和自身抗体包括但不限于肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶、醛缩酶、C-反应蛋白、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和抗核自身抗体(ANA)、肌炎特异性抗体(MSA)以及针对可提取的核抗原的抗体。

[0055]本发明的“结合分子”可以是例如与靶标结合的蛋白质(“蛋白质”可以是多肽或肽)、核酸、碳水化合物、脂质或小分子化合物。本发明所涵盖的一类蛋白样结合分子是抗体或保留结合活性的抗体片段。可以按照本领域标准方法修饰结合分子，以改进其结合亲和性，减少其免疫原性，改变其效应子功能和/或改进其在个体体内的利用度。这类修饰可包括例如氨基酸序列修饰或表达为融合蛋白。这类融合蛋白也可以是本发明的结合分子。本发明示例性的结合分子是小模块免疫药物(SMIP^TM)。

[0056]比起任何其它靶标而言，对某靶标具有“特异性”的结合分子可以较高亲和性与该靶标结合。例如，CD20特异性结合分子与CD20结合的亲和性大于与其它靶标结合的亲和性。本发明的结合分子对其靶标的亲和力Ka大于等于约10⁴M^-1，优选大于等于约10⁵M^-1，更优选大于等于约10⁶M^-1，还更优选大于等于约10⁷M^-1。甚至还更优选亲和力大于约10⁷M^-1，例如亲和力大于等于约10⁷M^-1，约10⁸M^-1，约10⁹M^-1，约10¹⁰M^-1。可采用例如以下文献所述的常规技术，容易地确定本发明结合分子的亲和力：Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660(1949)。在一个实施方案中，CD20特异性结合分子对CD20的亲和力范围为1nM-30nM。

[0057]在额外方面，CD20特异性结合分子的体内半衰期为7-30天。

[0058]小模块免疫药物(SMIP)的制备方法先前已有描述，参见共同拥有的美国申请号10/627,556和美国专利公布说明书2003/133939、2003/0118592和2005/0136049，这些文献都通过引用全部结合到本文中。SMIP是新型结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其特征是针对例如以下相关结构的结合结构域：抗原、反受体等；IgG1、IgA或IgE铰链区多肽或突变型IgG1铰链区多肽(具有0、1或2个半胱氨酸残基)；和免疫球蛋白CH2区和CH3区。在一个实施方案中，结合结构域分子具有1个或2个半胱氨酸残基。在一个相关实施方案中，它涵盖当结合结构域分子包括2个半胱氨酸残基时，前一个半胱氨酸(通常在重链可变区与轻链可变区间参与结合)没有缺失或被另一氨基酸取代。

[0059]涵盖这样的本发明方法所用的分子的结合结构域：其具有1个或多个结合区，例如来自一个或多个免疫球蛋白超家族成员(例如免疫球蛋白)的轻链可变区结合区和重链可变区结合区。此外，这些区域通常被接头肽间隔开，接头肽可以是本领域已知的与结合分子内的结构域或区连接相容的任何接头肽。示例性接头是基于Gly₄Ser接头基序的接头，例如(Gly₄Ser)_n，其中n＝3-5。本发明方法所用的分子也含有来自免疫球蛋白恒定区的足够的氨基酸序列，以提供效应子功能，优选ADCC和/或CDC。因此，这些分子具有来自免疫球蛋白CH2区或者来自一个或多个免疫球蛋白的CH2区和CH3区的序列。SMIP具有ADCC和/或CDC能力，但是不具备构成二硫键多聚体的能力。

[0060]示例性CD20特异性SMIP包括来自抗CD20单克隆抗体2H7的SMIP，参见美国专利公布号2003133939和20030118592。SMIP包括2H7scFv-Ig或其衍生物。衍生物包括CytoxB-MHWTG1C，其具有人IgG1Fc区和突变型IgG1铰链区；CytoxB-MHMG1C，其包含突变Fc区；MG1H/MG1C，其包含具有突变亮氨酸残基234的Fc受体；CytoxB-IgAHWTHG1C，其包含人IgA铰链区与人Fc区融合的部分；2H7scFv-llama IgG1，其包含llama IgG1铰链区和CH2CH3区；2H7scFv-llama IgG2，其包含llama IgG2铰链区和CH2CH3区；2H7scFv-llama IgG3，其包含llama IgG3铰链区和CH2CH3区。

[0061]2H7scFv-Ig衍生物也包括在铰链区具有点突变的2H7scFv突变体。2H7scFv MTH(SSS)WTCH2CH3，其中在连接区即铰链区内的所有3个半胱氨酸残基都突变为丝氨酸残基，和野生型CH2区和CH3区；2H7scFv MTH(SSC)，其中前2个半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代；2H7scFv MTH(SCS)，其中第一个和第三个半胱氨酸被丝氨酸残基取代；2H7scFv MTH(CSS)WTCH2CH3，其中半胱氨酸残基在第二和第三位置上被丝氨酸取代；2H7scFv VH11SER IgGMTH(SSS)WTCH2CH3，其中重链可变区11位的亮氨酸被丝氨酸取代；2H7scFv IgA铰链-IgG1CH2-CH3，其包含IgA铰链区和WT IgG1区；2H7scFv IgA铰链-CH2-CH3，其包含IgA铰链，CH2-CH3区；2H7IgAWH IgACH2-T4CH3，其包含IgA铰链、野生型IgA CH2和缺乏4个羧基氨基酸GTCY的截短的IgA CH3区。

[0062]在IgG CH3区内具有突变的衍生物包括2H7scFvMTH WTCH2 MTCH3 Y405，其中405位的苯丙氨酸残基(按照Kabat等(出处同上)的编号)被酪氨酸取代；2H7scFv MTH WTCH2 MTCH3A405，其中405位的苯丙氨酸被丙氨酸取代；scFv MTH WTCH2MTCH3 A407，其中407位的酪氨酸残基被丙氨酸取代；scFv MTHWTCH2 MTCH3 Y405A407，其包含两个突变；和scFv MTH WTCH2MTCH3 A405A407，其包含两个突变。

[0063]构建2H7scFv MTH(CCS)WTCH2CH3，其中IgG1铰链区内的第三个半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。2H7scFv IgGMTH(SSS)MTCH2WTCH3SMIP包括突变的铰链区(MT(SSS))和突变的CH2区，其中残基238的脯氨酸(按照Ward等)被丝氨酸取代。

[0064]2H7scFv-Ig衍生物也包括在重链可变区具有点突变的2H7scFv突变体。以下构建体都包含突变，其中重链可变区11位的亮氨酸被丝氨酸取代：2H7scFv VH11SER IgG MTH(SSS-S)WTCH2CH3，2H7scFv VHL11S(CSS-S)H WCH2WCH3，其包含以上已提出的突变铰链区；2H7scFv VHL11S(CSC-S)H WCH2 WCH3，其包含以上已提出的突变铰链区；2H7scFv VHL11S IgAH IgACH2T4CH3，其包含IgA铰链、WT igA CH2和截短IgA CH3；2H7scFvVHL11S IgECH2 CH3 CH4，其包含IgE CH 2-4区；2H7 VHL11S scFv(SSS-S)IgECH3CH4，其包含以上已提出的突变铰链区和IgE CH3和CH4区；2H7scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4，其包含小鼠IgE区；2H7scFv VHL11S mIgAH WIGACH2 T4CH3，其包含上述突变以及由野生型CH2区和突变型CH3区组成的小鼠IgA恒定区；2H7scFv VHL11S(SSS-S)H K322S CH2WCH3，其包含人IgG1 CH2区内残基322的突变，其中赖氨酸变为丝氨酸；2H7scFv VHL11S(CSS-S)H K322SCH2WCH3，其包含如上所述的突变铰链区和如前所示的突变CH2区；2H7scFv VH L11S(SSS-S)H P331S CH2WCH3，其包含如上所述的突变铰链区和突变CH2区，其中残基331的脯氨酸变为丝氨酸；2H7scFv VH L11S(CSS-S)H P331S CH2WCH3，其包含突变的铰链区和CH2区内残基331由脯氨酸突变为丝氨酸；2H7scFv VH L11S(SSS-S)H T256N CH2WCH3，其包含突变的铰链区和CH2区内残基256由苏氨酸突变为天冬酰胺；2H7scFv VH L11S(SSS-S)HRTPE/QNAK(255-258)CH2WCH3，其包含突变的铰链区和一系列突变，其中残基255-258由精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸分别突变成谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸和赖氨酸；2H7scFv VH L11S(SSS-S)H K290Q CH2WCH3，其包含突变的铰链区和290位的赖氨酸变为谷氨酰胺；2H7scFv VH L11S(SSS-S)H A339P CH2WCH3，其包含突变的铰链区和339位上的丙氨酸变为脯氨酸。

[0065]SMIP 2H7scFv(SSS-S)H P238SCH2WCH3，其包含突变的铰链区和CH2内238位的脯氨酸变为丝氨酸，这与2H7scFv IgGMTH(SSS)MTCH2WTCH3相同。2H7scFv IgAH IGAHCH2 T18CH3包含野生型IgA铰链区和CH2区以及在羧基端有18个氨基酸截短的CH3区。

[0066]考虑到本发明的结合分子可包含天然胞外结构域或来自其它蛋白质以改善结合分子活性的工程胞外结构域。在一个实施方案中，胞外结构域选自CD154和CTLA4。

[0067]在本发明一方面，以药物组合物形式给予CD20特异性结合分子。为了将CD20特异性结合分子给予人或试验动物，优选将结合分子配制在含有一种或多种药学上可接受载体的组合物中。术语“药学上或药理学上可接受的”是指当用如下所述的本领域熟知途径给药时，不会产生过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床适用的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

[0068]另外，化合物可与水或常规有机溶剂形成溶剂合物。也涵盖这类溶剂合物。

[0069]CD20特异性结合分子的组合物可经口服、局部、经皮、胃肠外、吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射给予。本文所用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。也涵盖经静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射给药和或手术植入特定部位。通常，组合物基本上不含热原以及其它对接受者有害的杂质。优选注射，尤其是经静脉内注射。

[0070]根据给药途径，本发明方法所用的含有CD20特异性结合分子的本发明药物组合物可含有药学上可接受的载体或添加剂。这类载体或添加剂的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油二酯、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、十八烷醇、十八烷酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。根据本发明的剂型，所用添加剂可视需要选自但不限于以上添加剂或其组合。

[0071]药物组合物的配制可因所选给药途径的不同而异(例如溶液剂、乳剂)。可将包含待给予抗体的合适组合物配制在生理上可接受的溶媒或载体中。对于溶液剂或乳剂，合适载体包括例如水性或醇性/水性溶液剂、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。胃肠外溶媒可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油类。静脉内溶媒可包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养物或电解质补充剂。

[0072]各种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸或水性混悬液可含有活性化合物以及适于制备水性混悬剂的赋形剂。这类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂类(例如卵磷脂)，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七碳乙烯氧基十六烷醇)，或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物(例如聚乙烯山梨醇酐单油酸酯)。水性混悬剂也可含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

[0073]可将CD20特异性结合分子组合物冻干贮存，在临用前用合适载体重配。已经知道该技术对常规免疫球蛋白是有效的。任何合适的冻干和重配技术都可采用。本领域技术人员知道，冻干和重配可导致不同程度的抗体活性损失，应当调节使用水平以利于补偿。

[0074]适合通过加水而配制水性混悬剂的分散粉剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合在一起的活性化合物。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂的实例在上文已经提及。

[0075]CD20特异性结合分子在这些制剂中的浓度可在宽范围内变化，例如从小于约0.5％，通常为或至少约1％至高达15％或20％(重量)，可主要根据流体体积、粘度等并按照所选的特定给药方式来选择。因此，供胃肠外注射用的典型药物组合物可以配制成含有1ml无菌缓冲水和50mg抗体。供静脉内输注用的典型组合物可配制成含有250ml无菌林格液和150mg抗体。制备胃肠外给药用组合物的实际方法是本领域技术人员已知的和显而易见的，详见例如Remington′sPharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1980)。每次给药的有效剂量的抗体范围为0.01mg至1000mg/kg体重。

[0076]药物组合物可呈无菌注射用水性、油性混悬剂、分散体或在临用时配制无菌注射用溶液剂或分散体的无菌粉针剂的形式。可按已知技术，用上文提及的合适分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制混悬剂。无菌注射用制剂也可以是配制在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射用溶液剂或混悬剂，例如1，3-丁二醇溶液。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物、植物油、林格液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发油类可常规用作溶剂或悬浮介质。为此，任何温和的不挥发油都可使用，包括合成的甘油单酯和甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸也可用于制备注射用制剂。

[0077]在所有情况下，其形式必须都是无菌的并且必须具有一定程度的流动性以便注射。可以通过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散剂情况下通过保持所需粒径达到合适的流动性，以及通过使用表面活性剂，以保持合适流动性。在制备和贮存条件下它必须稳定，而且必须防止细菌和真菌等微生物污染作用。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂可达到对微生物活动的预防作用，所述试剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好还包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在注射用组合物中使用例如单硬脂酸铝和明胶等延迟吸收剂来达到组合物的延迟吸收。

[0078]用于给药的组合物可与摄取或吸收增强剂配制在一起以增加其功效。这类增强剂包括例如水杨酸盐、甘胆酸盐/亚油酸盐、甘胆酸盐(glycholate)、抑肽酶、杆菌肽、SDS、癸酸盐等。参见例如Fix(J.Pharm.Sci.，85：1282-1285，1996)以及Oliyai和Stella(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：521-544，1993)。

[0079]另外，本发明所用组合物的亲水性和疏水性特性是充分平衡的，因而增强了它们的体外和尤其是体内应用，而缺乏这样的平衡的其它组合物基本上很少用。具体地讲，本发明所用的组合物在允许在体内吸收和生物利用的水性介质中具有合适程度的溶解度，同时在允许化合物穿越细胞膜到达推定作用位点的脂质中也具有一定程度的溶解度。因此，当所涵盖的抗体组合物递送到靶抗原活性位点时，所述组合物在最大程度上是有效的。

[0080]一方面，本发明的方法包括药物组合物的给药步骤。

[0081]用将治疗药直接或间接引入哺乳动物患者体内的任何药学上可接受的方法，实施本发明的方法，包括但不限于注射、口服摄入、鼻内、局部、经皮、胃肠外、吸入喷雾、阴道或直肠给药。本文所用的术语胃肠外包括皮下、静脉内、肌内和脑池内注射、以及导管或输注技术。也涵盖经皮内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射给药和或手术植入特定位点。

[0082]在一个实施方案中，在需要治疗的癌症部位或受累组织，通过直接向该部位注射或通过可在内部递送制剂的持续递送或持续释放机制，进行给药。例如，植入肿瘤附近的本发明制剂可包括能够持续递送组合物(例如可溶性多肽、抗体或小分子)的生物可降解微球体或胶囊剂或其它生物可降解聚合物构型。

[0083]也可将治疗用组合物递送到患者的多个部位。可以同时进行多次给药或者可以在一段连续时间内多次给药。

[0084]本发明还涵盖给予结合分子组合物和第二药物的组合。本发明所涵盖的第二药物列于以下段落。

[0085]第二药物可以是B细胞相关分子。本发明所涵盖的其它B细胞相关分子包括与B细胞表面分子结合、而不与CD20结合的结合分子。B细胞相关分子包括但不限于CD19(B-淋巴细胞抗原CD19，也称为B-淋巴细胞表面抗原B4或Leu-12)、CD21、CD22(B细胞受体CD22，也称为Leu-14、B-淋巴细胞细胞粘附分子或BL-CAM)、CD23、CD37、CD40(B-细胞表面抗原CD40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5、CD40L受体或Bp50)、CD80(T淋巴细胞激活抗原CD80、也称为激活B7-1抗原、B7、B7-1或BB1)、CD86(T淋巴细胞激活抗原CD86，也称为激活B7-2抗原、B70、FUN-1或BU63)、CD137(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、CD152(也称为细胞毒T-淋巴细胞蛋白4或CTLA-4)、L6(肿瘤相关抗原L6，也称为跨膜4超家族成员1、膜组分表面标记1或M3S1)、CD30(淋巴细胞激活抗原CD30，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员8、CD30L受体或Ki-1)、CD50(也称为胞间粘附分子-3(ICAM3)或ICAM-R)、CD54(也称为胞间粘附分子-1(ICAM1)或Major group鼻病毒受体)、B7-H1(免疫抑制受体的配体，也称为PD-L1，该受体是由活化T细胞、B细胞和骨髓细胞表达的；参见Dong等，″B7-H1，a third member ofthe B7 family，co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10secretion，″Nat.Med.1999，5：1365-1369)、CD134(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4、OX40、OX40L受体、ACT35抗原或TAX-转录激活糖蛋白1受体)、41BB(4-1BB配体受体、T细胞抗原4-1BB或T细胞抗原ILA)、CD153(也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员8、CD30配体或CD30-L)、CD154(也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员5、TNF相关激活蛋白、TRAP或T细胞抗原Gp39)和Toll受体。以上列出的构建体靶标和/或靶抗原仅是示例性的，并非是穷举的。

[0086]本发明所涵盖的作为第二药物的细胞因子和生长因子包括但不限于一种或多种下列细胞因子和生长因子：TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血小板生成素、干细胞因子和红细胞生成素。本发明的药物组合物也可包括其它已知促血管生成素，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y和/或人促血管生成素样多肽、和/或血管内皮生长因子(VEGF)。本发明药物组合物中所用的生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、上皮衍生的嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板衍生内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子A链、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子B链、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子受体α、血小板衍生生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜在转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、血管内皮生长因子和嵌合蛋白及其生物活性或免疫活性片段。

[0087]所涵盖的作为第二药物的化疗药的实例包括但不限于烷化剂，例如氮芥类(例如氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥)；亚硝基脲(例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU))；亚乙基亚胺类和甲基蜜胺(例如曲他胺(TEM)、三亚乙基硫代磷酰胺(塞替派)和六甲基蜜胺(HMM、六甲蜜胺))；磺酸烷基酯类(例如白消安(buslfan))；和三嗪类(例如达卡巴嗪(dacabazine，DTIC))；抗代谢药、例如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤、三甲曲沙和培美曲塞(多靶向抗叶酸))；嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿糖苷(AraC、阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷和2，2’-二氟脱氧胞苷)；和嘌呤类似物(例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2’-脱氧考福霉素(喷司他丁)、赤式羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)(EHNA)、磷酸氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷(克拉曲滨、2-CdA))；I型拓扑异构酶抑制剂，例如喜树碱(CPT)、托泊替康和伊立替康；某些天然产物，例如表鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)；和长春花属生物碱类(例如长春碱、长春新碱和长春瑞滨)；抗肿瘤抗生素，例如放线菌素D、多柔比星和博来霉素；某些辐射敏化剂，例如5-溴脱氧尿苷、5-碘脱氧尿苷和溴脱氧胞苷；铂配位络合物，例如顺铂、卡铂和奥沙利铂；取代脲，例如羟基脲；和甲基肼衍生物，例如N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼。

[0088]化疗药、放疗药和其它活性剂及辅助药的非限制性实例也见表1。

表1

烷化剂               天然产物

氮芥类               抗有丝分裂药

氮芥

环磷酰胺

异环磷酰胺           紫杉烷类

美法仑               紫杉醇

苯丁酸氮芥           长春花属生物碱类

                     长春碱(VLB)

亚硝基脲类           长春新碱

卡莫司汀(BCNU)       长春瑞滨

洛莫司汀(CCNU)       泰索帝

(多西他赛)

司莫司汀(甲基-CCNU)  雌莫司汀

                     磷酸雌莫司汀

亚乙基亚胺类/甲基蜜胺

三亚乙基蜜胺(TEM)    表鬼臼毒素类

三亚乙基硫代磷酰胺   依托泊苷

(塞替派)             替尼泊苷

六甲基蜜胺

                     抗生素

(HMM，六甲蜜胺)

                     放线菌素D

                       道诺霉素(红比霉素)

磺酸烷基酯类

                       多柔比星(阿霉素)

白消安                 米托蒽醌伊达比星

                       博来霉素

三嗪类                 普卡霉素(光辉霉素)

达卡巴嗪(DTIC)         丝裂霉素C

                       更生霉素

抗代谢药

                       阿非迪霉素

叶酸类似物

甲氨蝶呤               酶

三甲曲沙               L-天冬酰胺酶

培美曲塞               L-精氨酸酶

(多靶向抗叶酸)

                       辐射敏化剂

嘧啶类似物             甲硝唑

5-氟尿嘧啶             米索硝唑

氟脱氧尿苷             去甲米索硝唑

吉西他滨               哌莫硝唑

胞嘧啶阿糖苷           依他硝唑

(AraC，阿糖胞苷)       尼莫唑

5-氮杂胞苷             RSU 1069

2，2′-二氟脱氧-胞苷   EO9

                       RB 6145

嘌呤类似物             SR4233

6-巯基嘌呤             烟酰胺

6-硫鸟嘌呤             5-溴脱氧尿苷

硫唑嘌呤               5-碘脱氧尿苷

2′-脱氧考福霉素       溴脱氧胞苷

(喷司他丁)

赤式羟基壬基腺嘌呤(EHNA)

磷酸氟达拉滨                   其它药物

2-氯脱氧腺苷                   铂配位络合物

(克拉曲滨，2-CdA)              顺铂

                               卡铂

                               奥沙利铂

I型拓扑异构酶抑制剂            蒽二酮

喜树碱                         米托蒽醌

托泊替康

伊立替康                       取代脲

                               羟基脲

生物反应调节剂

G-CSF                          甲基肼衍生物

GM-CSF                         N-甲基肼(MIH)

                               丙卡巴肼

分化剂

视黄酸衍生物                   肾上腺皮质抑制剂

                               米托坦(o，p′-DDD)

激素和拮抗剂                   氨鲁米特(ainoglutethimide)

肾上腺皮质类固醇/拮抗剂

泼尼松及等同物                 细胞因子

地塞米松                       干扰素(α、β、γ)

氨鲁米特(Ainoglutethimide)     白介素-2

孕酮                           光敏剂

己酸羟孕酮                     血卟啉衍生物

醋酸甲羟孕酮                   Photofrin

醋酸甲地孕酮                   苯并卟啉衍生物

                               Npe6

雌激素药                          本卟啉锡(SnET2)

二乙基己烯雌酚                    嗜硼卟啉-a(pheoboride-a)

乙炔雌二醇/等同物                 细菌叶绿素-a

                                  萘酞菁

抗雌激素药                        酞菁

他莫昔芬                          锌酞菁

雄激素药                          辐射

丙酸睾酮                          X射线

氟甲睾酮/等同物                   紫外线

                                  γ辐射

抗雄激素药                        可见光

氟他胺                            红外辐射

促性腺激素释放

                                  微波辐射

激素类似物

亮丙立德

非甾体抗雄激素药

氟他胺

[0089]用于治疗自身免疫性疾病的本发明所涵盖的第二药物称为免疫抑制剂，其作用是抑制或掩蔽所治疗个体的免疫系统。免疫抑制剂包括例如非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、糖皮质激素、治疗关节炎的调节疾病用抗风湿药(DMARD)或生物反应调节剂。除了治疗RA之外，所述DMARD中的组合物还适用于治疗许多其它自身免疫性疾病。

[0090]示例性的NSAID选自布洛芬、奈普生、奈普生钠、Cox-2抑制剂(例如万络(Vioxx)和西乐葆(Celebrex)和唾液酸盐(sialylates)。示例性的镇痛药选自对乙酰氨基酚、羟可酮、丙氧芬盐酸曲马多。示例性的糖皮质激素选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性的生物反应调节剂包括但不限于针对细胞表面标记(例如CD4、CD5、CTLA4等)的分子、abatacept、细胞因子抑制剂，例如TNF拮抗剂(例如依那西普(Enbrel)、阿达林单抗(adalimumab)(Humira)和英夫利昔单抗(Remicade))、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物反应调节剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性的DMARD包括但不限于硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺吡啶、羟氯喹、金[口服(金诺芬)和肌内]和米诺环素。

[0091]考虑到CD20特异性结合分子组合物和第二药物可在同一制剂中同时给予。或者，各药物可在单独制剂中同时给予，同时是指各药物在30分钟内给予。

[0092]另一方面，第二药物可在给予CD20特异性结合分子组合物之前给予。之前给予是指在用抗体治疗1周到30分钟范围内提前给予第二药物，然后给予抗体。还考虑到第二药物在给予SMIP组合物之后给予。之后给予是指在抗体治疗之后30分钟至一周后给予。

[0093]还考虑到当CD20特异性结合分子与第二药物联合用药(其中第二药物是细胞因子或生长因子，或化疗药)时，给予还可包括使用放疗药和放疗。根据治疗医师的判定，按照给予有待治疗癌症的患者的常用剂量，进行放疗与抗体组合物的联用。

[0094]给定剂量的CD20特异性结合分子组合物的用量因所治疗个体的体型、以及所治疗疾病的特点而异。在示例性治疗中，需要给予约1mg/天、约5mg/天、约10mg/天、约20mg/天、约50mg/天、约75mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约250mg/天、约400mg/天、约500mg/天、约800mg/天、约1000mg/天、约1600mg/天或约2000mg/天。剂量也可根据患者体重来给予，剂量为0.01-50mg/kg。在相关实施方案中，可以给予CD20特异性结合分子的剂量范围为0.015-30mg/kg。在额外实施方案中，给予CD20特异性结合分子的剂量为约0.015mg/kg、约0.05mg/kg、约0.15mg/kg、约0.5mg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg、约15mg/kg或约30mg/kg。

[0095]先在动物模型中、再在临床试验中进行的标准剂量反应研究揭示了特定疾病和患者群体的最佳剂量。

[0096]在给予CD20特异性结合分子组合物的单剂量治疗后，B细胞群体增加或减少至少约20％。在一个实施方案中，B细胞群体增加或减少至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。B细胞耗竭定义为B细胞的绝对计数下降到低于正常范围的下限。B细胞恢复定义为回到B细胞的绝对计数达到以下任一项：1)患者基线值的70％；或2)正常范围。

[0097]给予CD20特异性结合分子也会使特定B细胞亚类细胞凋亡增加。细胞凋亡是指诱导细胞程序化死亡，表现为DNA断裂、细胞皱缩、细胞破裂、形成膜泡囊或膜脂质组成改变(经膜联蛋白V染色测定)，并且可根据这些表现来进行评价。

[0098]此外，给予CD20特异性结合分子对所治疗疾病或障碍可产生良好临床效果。例如，在类风湿性关节炎患者中，给予CD20分子在临床上可明显改善患者症状[例如达到美国风湿病学学会初步改善检测(American College of Rheumatology Preliminary Detection ofImprovement，ACR20)]和/或改善20％关节触痛和肿胀以及在3/5的其余ACR测定中有20％改善(Felson等，Arthritis Rheum.1995，38：727-35)。给予CD20特异性结合分子后，对改善RA患者的生物学测定包括测定细胞因子水平的变化，通过蛋白质或RNA水平的测定。目标细胞因子包括但不限于TNF-α、IL-1、干扰素、Blys和APRIL。细胞因子变化是因为B细胞数量减少或活化T细胞减少。在RA患者中，在给予CD20特异性结合分子前后测定骨更新(骨吸收或骨侵蚀)相关标记。相关标记包括但不限于碱性磷酸酶、骨钙素、胶原蛋白降解片段、羟脯氨酸、酒石酸抗性酸性磷酸酶和RANK配体(RANKL)。RA改善的其它相关数据包括测定C反应蛋白(CRP)水平、红细胞沉降速率(ESR)、类风湿因子、CCP(环状瓜氨酸化肽)抗体，以及通过流式细胞仪测定全身B细胞水平和淋巴细胞计数。也可测定RA患者滑膜的特定因子，包括测定来自滑膜活检的滑膜B细胞水平、RANKL水平和其它骨因子和上述细胞因子。

[0099]在相关方面，按照本领域已知标准，测定给予CD20特异性结合分子对其它疾病的疗效。例如，考虑到接受CD20特异性结合分子的克罗恩病患者在克罗恩病活性指标(CDAI)上的改善范围达到约50至约70单位，其中症状缓解150单位(Simonis等，Scand.JGastroent.1998，33：283-8)。认为150或200的分值是正常的，而认为450的分值是严重疾病分值。还希望给予CD20特异性结合分子使炎性肠病个体的核周抗嗜中性粒细胞抗体(pANCA)和抗酿酒酵母抗体(ASCA)减少。

[00100]还考虑到接受CD20特异性结合分子的成人和青少年肌炎患者在核心系列评价中达到改善，例如在6项核心系列测定中至少有3项达到20％以上的改善，而且不超过2项核心测定恶化25％(参见Rider等，Arthritis Rheum.2004，50：2281-90)。

[00101]还考虑到接受CD20特异性结合分子的SLE患者在系统性狼疮活性测定(Systemic Lupus Activity Measure，SLAM)或SLE疾病活性指数(SLE Disease Activity Index，SLEDAI)得分上至少改善了1个点(Gladman等，J Rheumatol 1994，21：1468-71)(Tan等，ArthritisRheum.1982，25：1271-7)。在临床上认为SLAM得分＞5，或SLEDAI得分＞2就是活动性疾病。对治疗的反应可定义为在2种疾病活性测定(SLE疾病活性指数[SLEDAI]和系统性狼疮活性测定)和2种生命质量测定(患者的总体评价和Krupp氏疲劳严重程度量表(Krupp FatigueSeverity Scale))上的改进或稳定化(Petri等，Arthritis Rheum.2004，50：2858-68)。最好还将CD20特异性结合分子给予SLE患者，使抗双链DNA抗体减少。或者，可使用不列颠群岛狼疮评价组标准(BritishIsles Lupus Assessment Group Criteria，BILAG)来测定改善。

[00102]还考虑到接受CD20特异性结合分子的多发性硬化患者在Kurtzke扩大失能状态量表(Kurtzke Expanded Disability statusscale，EDSS)(Kurtzke，F.，Neurology 1983，33：1444-52)的临床得分中至少改善0.5，或在Kurtzke量表的临床疾病恶化上延迟至少1.0(Rudick等，Neurology 1997，49：358-63)。

[00103]还考虑到接受CD20特异性结合分子的IIM患者在特发性炎性肌病标准(Idiopathic inflammatory Myopathy Criteria，IIMC)评价的5项标准中至少有一项下降(Miller，F.，出处同上)。还考虑到将CD20特异性结合分子给予IIM患者，使选自以下的IIM相关因子下降：肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶、醛缩酶、C-反应蛋白、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和抗核自身抗体(ANA)、肌炎特异性抗体(MSA)和针对可提取的核抗原的抗体。或者，满足Rider等(Arthritis Rheum.2004，50：2281-90)所提出的6项标准中的3项的患者，可以接受本发明的治疗，其恶化不超过2项标准。

[00104]在又一个实施方案中，根据众所周知的并常用于本领域的下文所述的临床标准，B细胞癌症患者接受CD20特异性结合分子，在总体上表现出对CD20特异性结合分子的有益反应，例如肿瘤大小减小，肿瘤数量下降和/或疾病症状改善。

[00105]例如，美国国立癌症研究院(U.S.National CancerInstitute，NCI)已将癌症划分为“惰性(Indolent)”淋巴瘤和“侵袭性(Aggressive)”淋巴瘤的临床类型。惰性淋巴瘤包括滤泡细胞淋巴瘤(其可按细胞学来“分级”)、弥散性小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、淋巴浆细胞样/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、边缘带淋巴瘤和毛细胞白血病。侵袭性淋巴瘤包括弥散性混合型和大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/弥散性小无裂细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和AIDS相关淋巴瘤。在某些情况下，国际预后指数(International Prognostic Index，IPI)用于侵袭性淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤的病例中。IPI中考虑的因子包括年龄(＜60岁与＞60岁)、血清乳酸脱氢酶(正常水平与升高水平)、表现状态(0或1与2-4)(参见以下定义)、病期(I或II与III或IV)和结外部位受累(0或1个与2-4个)。具有2个以上危险因子的患者不复发的机会小于50％，总体生存期5年。

[00106]侵袭性IPI的表现状态定义如下：评分描述：0分，活动完全不受限制，能从事患病前的所有工作；1分，体力活动受到限制，但不用卧床，并能从事较轻松或坐着做的工作，例如轻体力家务活、办公室工作；2分，不用卧床，生活全部自理，但不能从事任何工作，至多或超过50％左右的时间清醒；3分，生活仅部分自理，超过50％的清醒时间里要卧床或坐轮椅，4分，完全失能，生活完全不能自理，完全卧床或坐轮椅；5分，死亡。(参见The InternationalNon-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors Project.A predictivemodel for aggressive Non-Hodgkin’s Lymphoma.N Engl J Med.329：987-94，1993)。

[00107]通常，采用低分淋巴瘤通常表现为结节病且发展缓慢或生长缓慢的标准，对淋巴瘤进行临床评分。中等分值和高分疾病通常表现出更具侵袭性并具有大的结外实体瘤。

[00108]Ann Arbor分类系统也用于确定肿瘤进程，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤的进程。在该系统中，成人NHL的I、II、III和IV期可分为A类和B类，这是根据患者具有(B)或没有(A)已明确定义的全身症状。B类是指具有以下症状的患者：在确诊前6个月内不明原因的体重下降超过10％，不明原因发热，体温超过38℃，以及盗汗。各期定义如下：I期-累及单个淋巴结区或局部累及单个淋巴外器官或部位。II期-累及横膈膜同侧的两个以上淋巴结区或局部累及单个相关淋巴外器官或部位且该区淋巴结在横膈膜同侧有或无其他淋巴结区。III期-累及横膈膜两侧淋巴结区，可能伴有局部累及淋巴外器官或部位，累及脾脏或这两者。IV期-弥散性(多病灶)累及一个或多个淋巴外部位，同时累及或不累及淋巴结或累及远端(非区域的)结的单独的淋巴外器官。有关详情可参见The InternationalNon-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors Project：A predictivemodel for aggressive Non-Hodgkin’s Lymphoma，New England J.Med.(1993)329：987-994。

[00109]一方面，CD20特异性结合分子的疗效是由反应水平而决定的，例如部分反应定义为肿瘤缩小到不足原体积的一半。完全反应定义为经临床或辐射学评价证实疾病完全消失。在一个实施方案中，接受单剂量CD20特异性结合分子的个体表现出对治疗至少有部分反应。

[00110]根据与国立癌症研究院合作开发的用于评价NHL的Cheson标准(Cheson等，J Clin Oncol.1999，17：1244；Grillo-Lopez等，Ann Oncol.2000，11：399-408)，当疾病和疾病相关症状的所有可检测的临床上和辐射影像上的证据完全消失，所有淋巴结恢复到正常大小，脾脏也恢复大小，而且淋巴瘤从骨髓中清除时，即达到完全反应。

[00111]当患者表现出疾病完全消失，脾脏恢复大小，但淋巴结恢复超过75％，骨髓不确定时，则达到未经证实的完全反应。未经证实的完全反应满足并超过了部分反应的标准。总体反应定义为总体肿瘤负荷下降至少50％。

[00112]已经开发出类似标准，用于各种其它形式的癌症或过度增殖性疾病，这些都是本领域技术人员容易得到的。参见例如Cheson等，Clin Adv Hematol Oncol.2006，4：4-5，其中描述了CLL的评价标准；Cheson等，J Clin Oncol.2003，21：4642-9，其中描述了AML的标准；Cheson等，Blood 2000，96：3671-4，其描述脊髓增生异常综合征的标准。

[00113]另一方面，与未接受治疗的B细胞癌患者相比，患者对CD20结合分子的治疗反应表现为病程发展更为缓慢。可用骨扫描、CT扫描、镓扫描、淋巴管造影、MRI、PET扫描、超声波等本领域众所周知的技术，对放缓的病程或任何以上因子进行测定。

[00114]在相关方面，为了确定CD20结合分子治疗功效，对个体生物样品中的B细胞数量进行测定。在一个实施方案中，生物样品选自血液、肿瘤活检样品、淋巴结、扁桃体、骨髓、胸腺和其它富含淋巴细胞的组织。富含淋巴细胞的组织是淋巴细胞特别多的组织，包括但不限于淋巴结及相关器官(脾、骨髓、扁桃体、胸腺、粘膜淋巴组织)、肿瘤和炎症部位。

[00115]显而易见的是，如果将传统治疗药与本发明治疗药联合用药时可以改变剂量。

[00116]一方面，用本发明方法治疗的个体表现出对用本文所述的CD20结合分子进行治疗的改善的反应，比用利妥昔单抗而没有其它CD20结合分子进行治疗的反应更好。通过比较本领域众所周知的和本文所述的临床标准，可对改善的反应进行评价。示例性标准包括但不限于B细胞耗竭持续时间，B细胞总数减少、生物样品中B细胞数量减少，肿瘤大小缩小，现有肿瘤数量和/或治疗后出现的肿瘤的数量减少，以及患者本人和医生评价的改善的总体反应，例如采用国际预后指数。

[00117]还考虑到用本发明方法治疗的个体可以再次接受治疗，例如，如果疾病症状再次出现或者治疗药药代动力学和/或药效学允许采用这样的再次治疗。在一个实施方案中，给予用单剂量CD20结合分子治疗的个体另一单剂量CD20特异性结合分子。根据本领域普通技术，临床医生将能够根据例如疾病症状的重新出现或个体B细胞恢复到再次治疗所需水平等，来鉴别是否要进行再次治疗。本文进一步描述了临床标准的其它测定和标记以及结果。用本发明方法治疗的个体可以接受维持治疗方案，其中根据CD20特异性结合分子的药代动力学/药效学特性，用单剂量CD20特异性结合分子对个体进行再次治疗。这样的维持治疗通常在起始单剂量后给予约3个月至约2年时间。示例性的药效学数据包括但不限于对本文所述疾病的改善进行的生物学测定，例如CD20特异性结合分子的血清水平，疾病评价方面的改善(例如通过ACR、SLAM或IPI)、在细胞因子或表面标记表达上的变化、自身抗体水平，以及肿瘤大小变化。本领域还可理解，对用本发明方法进行治疗的个体反应差异使得用单剂量CD20特异性结合分子再次治疗的时间上也有差异。

[00118]作为额外方面，本发明包括这样的药盒：其中装有按照便于将其用于本发明实践方法的方式包装的一种或多种化合物或组合物。在一个实施方案中，这样的药盒包括本文所述的CD20特异性结合分子化合物或组合物(例如单独含有CD20特异性结合分子的组合物或者含有CD20特异性结合分子与第二药物联用的组合物)，将其包装在密封瓶或管等容器中，在容器上贴有标签或者在包装中附有标签，所述标签描述化合物或组合物在实施方法中的用途。优选化合物或组合物以单剂型形式包装。药盒还可包括适于按照特定给药途径给予组合物或用于实施筛选测定的装置。优选药盒中带有描述抗体组合物用途的标签。

[00119]本发明也包括制造品(articles of manufacture)。这样的制造品包括至少一种CD20特异性结合分子，以及任选的药物载体或稀释剂，还包括至少一个标签以描述本发明CD20特异性SMIP的用途的方法。这类制造品也任选包括至少一种第二药物，用于与CD20特异性SMIP联合用药。

[00120]本发明也要求保护一种包含至少一种CD20特异性结合分子的组合物在制备用于抑制或预防以异常B细胞活性为特征或由异常B细胞活性介导的患者的异常B细胞活性或者治疗或预防疾病、病症或障碍的药物中的用途。

附图简述

[00121]图1A表示在非人灵长类接受单剂量CD20特异性结合分子TRU-015的剂量研究中，对B细胞耗竭的评价。图1B是在更长时间内测定的类似实验中对B细胞耗竭的进一步分析，以B细胞耗竭的百分率来表示。

[00122]图2表示单剂量给予人类患者CD20特异性结合分子TRU-015后，对B细胞耗竭的评价。

[00123]图3表示在ADCC和CDC测定中，TRU-015与其它CD20结合分子构建体的比较。

[00124]图4显示在剂量范围研究中，当对接受TRU-015的RA患者测定CD19+B细胞数量的测定，B细胞耗竭持续时间。

[00125]图5显示接受单剂量15mg/kg TRU-015或2×7.5mg/kg剂量TRU-015的RA患者的B细胞耗竭。

实施例

[00126]根据以下实施例，本发明的额外方面和细节将会是显而易见的，这些实施例是说明性的，而非限制性的。实施例1描述CD20特异性SMIP的重组产生。实施例2描述CD20特异性SMIP体外活性。实施例3描述CD20特异性结合分子在体内对B细胞肿瘤系的效果。实施例4描述将单剂量CD20特异性SMIP给予非人灵长类。实施例5描述将CD20特异性SMIP给予人类患者。实施例6描述给予CD20特异性SMIP以治疗原发性炎性肌病。实施例7描述给予CD20特异性SMIP以治疗类风湿性关节炎患者。实施例8描述将CD20特异性SMIP给予类风湿性关节炎患者的临床结果。

实施例1

CD20特异性结合分子的重组产生

[00127]在共同拥有的美国专利公布说明书2003/133939、2003/0118592和2005/0136049中描述了CD20特异性SMIP。选择示例性的SMIP即TRU-015用于进行如下所述的进一步研究。

[00128]TRU-015是一种能与CD20抗原结合的重组(鼠/人)单链蛋白。结合结构域是基于公众可得的人CD20抗体序列。结合结构域与人IgG1的效应区即CH2区和CH3区通过修饰的CSS铰链区而连接。TRU-015在溶液中以二聚体存在，该二聚体的理论分子量约为106,000道尔顿。

[00129]TRU-015包含来自SEQ ID NO：2氨基酸1-23的2e12前导肽克隆序列；2H7鼠抗人CD20轻链可变区，其在可变区残基11的赖氨酸被丝氨酸(VHL11S)取代，这反映在SEQ ID NO：2的位置34；asp-gly₃-ser-(gly₄ser)₂接头，在SEQ ID NO：2残基129处开始；2H7鼠抗人CD20重链可变区，其在重链区末端缺乏丝氨酸残基，即从VTVSS变为VTVS；人IgG1Fc区，包括含有(CSS)序列的修饰铰链区，以及野生型CH2区和CH3区。TRU-015的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和2。

[00130]用专有的培养基，在生物反应器中培养产生TRU-015的CHO细胞。用一系列色谱和过滤(包括病毒减少滤器)步骤纯化TRU-015。再浓缩所得材料，用20mM磷酸钠和240mM蔗糖配制，所得pH为6.0。将组合物过滤后，加入到玻璃小瓶中，浓度为10mg/mL。每个玻璃瓶都装5mL TRU-015(50mg/瓶)。

剂型和给药

[00131]把TRU-015装入单次使用的玻璃瓶中，其中含有50mg TRU-015(5mL[10mg/mL])的无菌无防腐剂的液体制剂和20mM磷酸钠和240mM蔗糖，pH6.0。经静脉内(IV)输注给予TRU-015。按体重给药(mg/kg)。TRU-015小瓶在-20℃冷冻保存，直至使用。融化后，立即使用小瓶或贮存于2-8℃。

实施例2

CD20特异性结合分子体外活性

[00132]为了评价CD20特异性SMIP在体内的功效，首先测定给药对细胞特异性活性的体外效应，所述活性例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和凋亡活性。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性

[00133]用不同剂量的TRU-015或利妥昔单抗，评价TRU-015对B细胞靶标(BJAB B淋巴瘤细胞系)的ADCC活性。也测定了TRU-015对新鲜人外周血单核细胞(PBMC，其含有NK细胞，但不含嗜中性粒细胞)的效应。来自2个不同供体的效应细胞，在0.5μg/ml和2.5μg/ml都表现出约30％溶解(图3)。在该项研究中，比较TRU-015与利妥昔单抗在通过ADCC而诱导CD20+靶细胞溶解的能力。类似于TRU-015、但在效应区残基331的脯氨酸突变为丝氨酸(Pro331Ser)的CD20结合分子表现出ADCC活性，而在残基238的脯氨酸突变为丝氨酸(Pro238Ser)的构建体则没有ADCC活性。

TRU-015的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性

[00134]已经报道补体激活与利妥昔单抗的输注反应有关(vander Kolk，Br.J Haematol.2001，115：807-11)。另外，在类风湿性关节炎等慢性炎性疾病中，疾病活性与补体激活相关。因此，降低TRU-015的CDC活性，以解决这些问题。为了评价TRU-015的CDC减毒水平，评价CDC活性并与利妥昔单抗的CDC活性进行比较。

[00135]当TRU-015与靶抗原CD20结合时，Clq(一种补体级联的第一成分)与TRU-015 CH2区结合而启动补体依赖性细胞毒性。为了评价CDC活性，在兔补体[Dynal Biotech(Invitrogen)，BrownDeer，WI]存在下，将TRU-015与WIL2-S细胞一起孵育(Gazzano-Santoro，等，J Immunol.Meth.1997，202：163-71)。也可用人血清和人补体(Clq)(Quidel Corporation，San Diego，CA)进行该实验。

[00136]TRU-015介导的对WIL2-S细胞的剂量依赖性杀伤，在1μg/ml表现出约30％溶解，在10μg/ml表现出50％溶解，在1μg/ml表现出约65％溶解，而对照蛋白(人IgG)则不能介导这些细胞的CDC。TRU-015对WIL2-s细胞的细胞毒效应是补体依赖性的，因为在没有补体(仅有介质)的情况下，TRU-015没有细胞毒活性。这些结果表明补体募集途径是另一机制，在该机制中，TRU-015表现出细胞毒性。然而，与利妥昔单抗相比，TRU-015在其通过CDC而相对耗竭CD20+靶细胞的活性上要低10-100倍，这表明TRU-015通过CDC溶解细胞的能力已得到成功的衰减。相反，类似于TRU-015、但在效应区的残基331上的脯氨酸突变为丝氨酸(P331S)的CD20结合分子却没有表现CDC活性，而与TRU-015构建体相比，在残基238的脯氨酸突变为丝氨酸(P238S)的构建体却表现出CDC活性(图3)。

[00137]这些测定证明SMIP分子效应子功能可因改变分子序列而得以调节，从而改善、保持或缺失某些效应子功能。

TRU-015的凋亡活性

[00138]测定TRU-015和利妥昔单抗在CD20+B细胞淋巴瘤系(Ramos B细胞)中诱导细胞凋亡的能力。按照制造商方案，使用流式细胞仪测定，用市售检测试剂盒(BD/Pharmingen)供应的膜联蛋白V/碘化丙锭的结合，定量测定细胞凋亡。TRU-015与利妥昔单抗的凋亡活性相似，在10μg/ml和20μg/ml都表现出约60％的细胞溶解。

结合特异性

[00139]用FACS Caliber流式细胞仪(BD/Pharmingen)评价TRU-015与大鼠脾细胞、小鼠脾细胞、猴外周血和表达CD20的人B细胞淋巴瘤细胞系WIL2-S的结合特异性。观察到TRU-015对人WIL2-S细胞和猴外周血具有高度结合亲和性，而在大鼠或小鼠的脾细胞的情况下则未检出TRU-015的结合特异性。在该项实验中采用针对人、小鼠和大鼠的B细胞标记的直接FITC缀合的抗体。当用市售的针对B细胞表面分子的抗体进行染色时，在所有3种细胞制备物中都观察到特异性B细胞结合。结果概述于下表1，用阳性染色细胞百分率来表示。

表1

	对照	CD3	CD19	CD45R	TRU-015	利妥昔单抗
							大鼠脾	9.0	52.2	ND	30.3	5.0	ND
小鼠脾	0.14	31	40.5	ND	0.98	ND
							猴外周血(N＝3，平均[SD])	0.2(0.1)	ND	ND	ND	23.5(3.9)	21.5(3.3)
人WIL2-S	0.43	ND	97	ND	66	ND

[00140]这些结果表明，与靶向CD20的单克隆抗体即利妥昔单抗相比，TRU-015表现出明显的体外效应子功能，即至少在通过ADCC诱导CD20+靶细胞溶解的能力上相当。相比之下，与利妥昔单抗相比，TRU-015在其通过CDC而相对耗竭CD20+靶细胞的活性上要低10-100倍。在流式细胞仪测定中，TRU-015与利妥昔单抗的凋亡活性相似。

实施例3

CD20特异性结合分子在体内对B细胞肿瘤系的效果

[00141]与利妥昔单抗相比，TRU-015表现出明显的体外效应子功能，即至少在通过ADCC诱导CD20+靶细胞溶解的能力上相当。TRU-015在通过CDC杀伤CD20+靶细胞上的能力上低于利妥昔单抗，而在凋亡活性上类似于利妥昔单抗。TRU-015不与小鼠或大鼠的CD20结合；因此，TRU-015活性促使用人细胞系进行小鼠研究。

[00142]为了进一步了解TRU-015针对人体细胞的活性，检测了TRU-015对已建立的能表达人CD20的肿瘤的生长的抑制能力，采用Ramos细胞系(一种来自伯基特淋巴瘤的人B成淋巴细胞系)。

[00143]给雌性无胸腺裸鼠植入表达人CD20的Ramos肿瘤。植入后8天，给小鼠分组(n＝6-8只/组)，按照相同肿瘤体积分组，并在0、2、4、6和8天经静脉内注射人IgG作为对照(100μg)或注射TRU-015或利妥昔单抗(100μg)。平均组肿瘤体积为370mm³。每周3次测定肿瘤并计算肿瘤体积。

[00144]与利妥昔单抗和对照治疗的动物相比，将TRU-015给予已建立Ramos肿瘤异种移植的小鼠，结果肿瘤体积缩小并延长了存活时间。对于接种TRU-015的小鼠，50％的肿瘤完全消退，存活时间≥90天。在利妥昔单抗组的小鼠的肿瘤都没有完全消除。TRU-015治疗动物的中位存活时间为64.5天，相比之下，利妥昔单抗治疗的动物和对照治疗的动物则分别为11天和8天。

[00145]用增加数量的试验动物进行的额外实验提供了额外的具有统计学意义的结果。每组所用的小鼠总数上升到n＝40-44只，计算存活时间的平均值和肿瘤大小的变化。对于TRU-015治疗动物而言，增加数据的存活率改善为90天，对于利妥昔单抗治疗小鼠而言为约50天。平均基线肿瘤大小为231mm³。这些动物中肿瘤存在的分析表明，约50％TRU-015小鼠将无肿瘤状态维持90天，而接受利妥昔单抗或对照治疗的小鼠则带有肿瘤。

[00146]将B细胞系植入小鼠，进行进一步实验，所述B细胞系已经证明对由利妥昔单抗导致的杀伤具有抗性。给无胸腺裸鼠植入5×10⁶Daudi肿瘤细胞，所述细胞对由利妥昔单抗导致的杀伤具有抗性，让小鼠的肿瘤生长。植入后7天，将小鼠分组，在第0、2、4、6和8天用TRU-015(100μg)、利妥昔单抗(100μg)、对照HuIgG(100μg)或PBS进行治疗。用30μg/剂、300μg/剂和1000μg/剂，进行剂量研究。每周3次测定肿瘤并计算肿瘤体积。

[00147]与利妥昔单抗和对照治疗的动物相比，将TRU-015给予已建立Daudi肿瘤异种移植的小鼠，结果肿瘤体积缩小并延长了存活时间。接受1000μg剂量TRU-015的小鼠的存活率在植入后30天为约85％，在第40天降低为约65％。接受300μgTRU-015/剂的小鼠的存活率在第40天为85％，而接受100μgTRU-015/剂的小鼠的存活率在第25天为约65％，在第40天降低为50％，中位存活时间(MST)为约36天。对于接受1000和300μgTRU-015的小组，无法计算MST，因为超过50％小组成员的存活比测定进行的时间还要长。接受30μgTRU-015的小鼠在第25天的存活率为约25％，MST为23天。

[00148]利妥昔单抗治疗的动物存活率比接受TRU-015的动物更低。接受1000μg/剂利妥昔单抗的动物的存活率在第20天为约65％，在第40天下降到25％，MST为24天。接受300μg利妥昔单抗/剂的小鼠在第20天的存活率为50％，在第40天下降到25％，MST为24天。接受每剂100μg利妥昔单抗或30μg利妥昔单抗的小鼠在第20天的存活率都为25％，在第40天的存活率都下降到约10％，中位存活时间分别为17天和16天。

[00149]因此，TRU-015抗CD20SMIP能有效杀伤B细胞肿瘤(所述肿瘤对由抗CD20嵌合抗体利妥昔单抗引起的杀伤具有抗性)并显著延长TRU-015治疗动物的存活时间。

[00150]为了测定CD20发挥该效应的机制，对接受Ramos肿瘤移植的小鼠进行天然杀伤(NK)细胞耗竭实验。如上所述地给小鼠植入Ramos肿瘤系，在第0、4、8和12天给予所有小鼠抗Asialo GM1IV抗体(WAKO，Dallas，TX)以耗竭NK细胞。然后再在第1、3、5、7和9天给予小鼠TRU-015、利妥昔单抗或HuIgGIV。

[00151]仅给予TRU-015的小鼠在第15天的存活率为50％，在第35天下降到约30％，而接受TRU-015和NK细胞耗竭抗体的小鼠在第15天的存活率为约40％，在第25天下降到约20％。仅接受利妥昔单抗的动物在第15天的存活率为约50％，在第27天下降到10％，而接受利妥昔单抗和NK细胞耗竭抗体的小鼠在第15天的存活率为约30％，在第20天下降到10％。

[00152]这些结果表明，NK细胞在TRU-015和利妥昔单抗的作用机制中可能起到某些作用，因为NK细胞的耗竭降低了B细胞耗竭治疗的功效。

实施例4

将单剂量CD20特异性结合分子给予非人灵长类

[00153]上述结果表明，TRU-015在体外能有效耗竭B细胞。为了测定B细胞在体内耗竭的功效，给恒河猴(cynomolgus monkey)输注CD20特异性SMIP并测定该药物的药代动力学和药效学。

[00154]在起始治疗方案中，让恒河猴(n＝2只/组)接受单次IV剂量的10mg/kg TRU-015或另外2种临床前形式的TRU-015。用非优化流式细胞仪方案以跟踪CD20+细胞和CD40+细胞，测定外周血中B细胞的百分比。所有6只动物都有明显的外周B细胞耗竭并在第35天基本上恢复。

[00155]为了测定TRU-015在体内的药代动力学(PK)和药效学(PD)，给猴子注射(IV)单剂量10mg/kg TRU-015、另一种临床前CD20靶向候选药、利妥昔单抗或PBS(n＝3只/组)。外周血记为基线，然后在第1和3天后给药，每周一次给药(共12周)，然后每2周一次给药(再进行12周)，通过流式细胞仪进行分析。在该项研究中，观察到用TRU-015和利妥昔单抗后，B淋巴细胞亚类从外周血中快速耗竭。通过测定CD40+细胞或CD20+细胞的恢复情况，将使用TRU-015与使用用利妥昔单抗时的B细胞恢复情况进行比较。然而，恢复的细胞较少表达CD20。治疗中没有发生与TRU-015用药相关的不良安全性事件。

[00156]然后进行剂量范围研究，其中给18只恒河猴(n＝3只/组)注射(IV)单剂量TRU-015(0.01、0.1、1.0或10mg/kg)或利妥昔单抗(10mg/kg)或PBS。在不同时间点采集外周血样，进行流式细胞仪分析。评价标记包括CD19和CD20，以评价反应和恢复。

[00157]单次IV给予后，利妥昔单抗组和高剂量TRU-015组(1.0和10mg/kg)的循环B细胞趋于产生类似的起始反应。一般而言，在所有3个治疗组中，外周血B淋巴细胞亚类CD19+和CD20+都能有效被耗竭。研究结果见图1A。

[00158]对B细胞耗竭过程的进一步研究表明，截止到输注后100天为止，接受TRU-015的患者的B细胞水平为基线水平的约30％。在第200天，耗竭保持为基线水平的约55％，而利妥昔单抗治疗组的B细胞耗竭在第200天为基线的约60％(图1B)。

[00159]该剂量范围试验结果表明，针对TRU-015的反应是剂量依赖性的。利妥昔单抗组和10mg/kg TRU-015组在循环B细胞中都表现出类似的反应，在10mg/kg组的B细胞耗竭方式重复了在先前治疗中所见方式。一般而言，这两者在耗竭外周血B淋巴细胞亚类中效果相等。较低剂量的TRU-015表现出剂量反应，1mg/kg剂量就能导致给药后的B细胞耗竭，但与较高剂量相比，恢复得更快，0.1mg/kg剂量仅导致部分耗竭，而0.01mg/kg剂量没有表观效果。

[00160]对于给药治疗中的PK和PD分析，通过基于流式细胞术的测定，分析恒河猴的血清样品，以测定单次IV注射(在5分钟内缓慢推注)利妥昔单抗(10mg/kg)或TRU-015(10、1、0.1milliongallon outlining the idea of或0.01mg/kg)后的血浆浓度。在给药前，在给药后5分钟和30分钟，在给药后第4、24、72和168小时，在研究的第10、14、21和28天，采集血清样品。将10mg/kg和1mg/kg剂量的TRU-015的血浆浓度与时间，同10mg/kg利妥昔单抗进行比较。TRU-015和利妥昔单抗表现出类似的血浆浓度水平，其在零时的最高水平：TRU-015为约400mg/ml，而利妥昔单抗为约450mg/ml。这两种化合物的血浆浓度在给药后72小时都同样下降到约100mg/ml。在给药后168小时，在血浆内仍可检出利妥昔单抗和TRU-015(10mg/kg剂量)。在较低剂量的TRU-015时，在血浆中可检出少量该化合物。表2表示该治疗方案的PK参数。

[00161]表2

AUC＝浓度-时间曲线下面积，(ug-hr/mL)；Cmax＝最大浓度；SD＝标准差；T1/2＝半衰期

[00162]因此，该项研究表明TRU-015的效果是剂量依赖性的、可逆的并可重现的。

实施例5

将TRU-015给予人类患者

[00163]为了评价TRU-015对人类患者的PK和PD，对40名患有类风湿性关节炎的个体进行单剂量TRU-015治疗，范围为0.015-15mg/kg。在15分钟至12小时的时间范围内，按照单次静脉内给药，将TRU-015给予患者。患者接受如下剂量：队列1-0.015mg/kg、队列2-0.05mg/kg、队列3-0.15m/kg、队列4-0.5mg/kg、队列5-1.5mg/kg、队列6-5mg/kg、队列7-15mg/kg和队列8-5mg/kg。通过流式细胞术，在TRU-015输注后的不同时间点测定外周血CD19+细胞，测定对循环B细胞的影响。在这些患者中，B淋巴细胞耗竭表现出剂量依赖方式，用B淋巴细胞下降程度和持续时间来表示(图2)。结果表明，在队列6和7中分别接受单剂量5mg/kg和15mg/kgTRU-015的患者，在输注后至多4周表现出几乎完全的B细胞耗竭。接受1.5mg/kg TRU-015的患者，在4周内表现出小于15％的B细胞恢复，而接受0.5mg/kg的患者则在第4周结束时表现出B细胞为基线的约45％。从这些研究中没有得到有用的PK数据。

[00164]这些结果表明，将一定剂量范围的TRU-015给予人类患者能有效降低需要这类治疗的患者的B细胞群体。

实施例6

用CD20特异性SMIP治疗原发性炎性肌病

[00165]目前，原发性炎性肌病(IIM)的处置方法包括用高剂量皮质类固醇(通常剂量至少为1mg/kg/天的泼尼松)进行起始治疗。甲氨蝶呤和硫唑嘌呤通常与皮质类固醇联用，因为它们具有不良的预后因子或者它们对皮质类固醇具有抗性。已采用静脉内免疫球蛋白、环磷酰胺、环孢菌素、他克莫司、麦考酚酸吗乙酯、肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂、苯丁酸氮芥以及上述药物的组合。其中使用的大多数药物没有来自对照试验的数据支持(Miller，Anthritis and Allied Conditions：ATextbook of Rheumatology，第15版，1614，2005)。

[00166]最近，Levine(Anthritis Rheum.2005，52：601-607)发表数据证明，用B细胞耗竭剂利妥昔单抗进行治疗，改善了6名DM患者队列的肌炎。此外，也有无对照的报道称患有高度难治性多肌炎的患者用B细胞耗竭治疗后有所改善。

[00167]为了测定CD20特异性SMIP对IIM发展的效果，人类患者用示例性SMIP即TRU-015治疗，并且跟踪病程，测定CD20特异性SMIP治疗对B细胞耗竭、B细胞恢复的效果和其它效果。

[00168]第一治疗组的患者接受安慰剂或单剂量5mg/kgTRU-015。第二治疗组的患者随机接受两个剂量的安慰剂或5mg/kgTRU-015，在基线给予第一剂量，在第7天给予第二剂量。第三治疗组的患者随机接受安慰剂或单剂量15mg/kg TRU-015。至少6名活动性多肌炎(PM)或皮肌炎(dermatomysositis，DM)的患者参与到各治疗组中。各组都包括约4名活性剂治疗患者和2名安慰剂治疗患者。

[00169]对患者至少进行12周的评价。每4周一次对明显有B细胞耗竭的患者进行评价，监测疾病活性和B细胞恢复。B细胞耗竭定义为绝对B细胞计数下降到低于正常范围的下限。B细胞恢复定义为绝对B细胞计数恢复到以下任一项：1)患者基线值的70％；或2)正常范围。

[00170]在给予CD-20特异性SMIP之前，对疾病进行基线评价并获取其它健康参数。基线评价包括测定同时采取的治疗方法、生命体征(血压、脉搏、体温和呼吸率)、定向身体检查、手肌试验、肺活量、患者的整体评价/医生的整体评价、根据HAQ、肌炎疾病活性评价工具(Myositis Disease Activity Assessment Tool，MDAAT)而确定的失能指数、流式细胞术、血液学特征(CBC分类和血小板计数)、尿液分析、化学特征(电解质、BUN、肌酸酐、碱性磷酸酶、总蛋白和白蛋白)、LFT(AST、ALT、LDH)、肌酶(CPK、醛缩酶)、定量免疫球蛋白、对血液样品进行基因分型以及对血清样品进行药物浓度研究和测定针对TRU-015的抗体。

[00171]在给予TRU-015或安慰剂之前，先用甲泼尼龙(例如SOLUMEDROL

100mg IV)、对乙酰氨基酚和抗组胺药(例如苯海拉明、氯雷他定或类似产品)对各患者进行预治疗。由医生评价各患者并确定这些预治疗的合适剂量。然后患者通过IV输注接受合适剂量的TRU-015或安慰剂。

[00172]在第1、7、14、28、47、56、70和84天连续评价患者。如果临床需要的话，以28天的间隔持续跟踪患者超过84天。持续跟踪患者至少直到B细胞恢复。

[00173]将合适量的TRU-015经IV输注给予患者。TRU-015的剂量按体重计(mg/kg)。然而，体重在110kg以上的任何患者都按体重110kg来计算剂量。在玻璃IV瓶中用稀释剂(例如0.9％氯化钠，美国药典)制备TRU-015。化合物的输注速率开始为25mL/小时。30分钟后，如果未见毒性的话，速率可增加至50mL/小时。如果能耐受的话，每20-30分钟可将速率增加25mL/小时(不要超过250mL/小时)。

[00174]在第1天(给药后18-24小时)，按照以下程序评价患者：同时采用的治疗方法、不良事件评价、生命体征(血压、脉搏、体温和呼吸率)、定向身体检查、流式细胞仪测定和研究血清中的药物浓度。

[00175]在第7天(1周)，按照以下程序评价患者：同时采用的治疗方法、不良事件评价、生命体征、定向身体检查、流式细胞仪测定、血液学特征(CBC分类和血小板计数)、尿液分析、化学特征(电解质、BUN、肌酸酐、碱性磷酸酶、总蛋白和白蛋白)、LFT(AST、ALT、LDH)、肌酶(CPK、醛缩酶)，以及对血清样品进行药物浓度研究。

[00176]在第14天(2周)、第28天(4周)、第42天(6周)、第56天(8周)、第70天(10周)、第84天(12周)，此后每4周一次，按照以下程序评价患者：同时采用的治疗方法、不良事件评价、生命体征、定向身体检查、手肌试验、肺活量(仅在第84天)、患者的整体评价/医生的整体评价、根据HAQ，肌炎疾病活性评价工具而确定的失能指数和定量免疫球蛋白(仅在24周)。

[00177]以下各项疾病活性测定都将用于评价疗效：医生的整体活力评价；患者的整体活力评价；肌肉强度：评价15个肌群(颈屈肌、三角肌、二头肌、腕伸肌、臀大肌、臀中肌、四头肌、踝屈肌)，各项在Kendall 10-点量表上记分；身体机能：健康评价问卷调查(HealthAssessment Questionnaire，HAQ)失能指数；肌肉相关酶：CPK、醛缩酶、AST、ALT、LDH；肌肉外活性评价：由来自肌炎疾病活性评价工具的6项目测类似评分组成，评价体质、皮肤、胃肠道、关节、心脏和肺部活性。

[00178]除了对个体结果的测定外，还评价患者是否达到国际肌炎疾病评价和临床研究(International Myositis Assessment andClinical Studies，IMACS)小组所提出的复合反应标准(Rider，ArthritisRheum.2004，50：2281-90)。这些初步反应标准所界定的反应者是这样的个体：所述个体在6项核心系列测定(以上列出)中至少有3项达到20％以上的改善，而且不超过2项标准恶化25％以上。如果肌肉强度恶化25％以上，就不能认为患者是反应者。

初步临床反应评价

[00179]临床反应的初步评价是肌肉酶水平的改善。在12周内比较CPK的改善，以测定初步功效分析，使用基线上的曲线下面积(AUC)分析，比较TRU-015治疗患者与接受安慰剂的患者。也评价了平均CPK和醛缩酶水平，CPK和醛缩酶下降的百分率以及达到有意义改善的时间(从基线计下降30％)。

[00180]第二类评价是基于肌肉强度的改善，是通过上述15个肌肉群的手肌测定而判定的，在12周内使用基线上的AUC分析，比较TRU-015治疗患者与接受安慰剂的患者，根据手肌测定评分的改善而测定肌肉强度的改善。另外，也评价了平均肌肉强度、肌肉强度变化百分率和达到有意义改善的时间(从基线计达12％的改善)。也评价了达到15％改善的时间。

[00181]也评价了其它各项个体反应测定。采用医生和患者的整体评价、HAQ失能指数、肌肉酶(而非CPK和醛缩酶)和肌肉外活性，评价了平均改善、变化百分率和达到有意义改善的时间。

实施例7

用CD20特异性SMIP治疗类风湿性关节炎患者

[00182]在RA患者中，让B细胞进行抗原依赖性克隆表达、亲和力成熟和并分化为浆细胞，产生类风湿因子，这是一种公知的RA侵袭的预后因子。免疫复合物介导的炎症和抗原呈递是B细胞的额外作用，认为在它RA发病机制中起作用。在人RA滑膜-SCID小鼠嵌合物的研究中，已知T细胞激活是B细胞依赖性的(Takemura等，JImmunol.2001，167：1072-80)。

[00183]通过补体依赖性细胞毒性(CDC)减少对细胞杀伤，使TRU-015适用于炎性疾病。然而，TRU-015保持了强效ADCC活性，针对TRU-015的反应可能不如对CD16多态性敏感。

[00184]为了评价CD20特异性SMIP对类风湿性关节炎患者的效果，用示例性SMIP即TRU-015进行了两项研究。

[00185]在单剂量给药中，患者以剂量逐渐增加的方式、按照以下水平之一来接受单次静脉内(IV)输注TRU-015(≥4名患者/队列)：0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.15mg/kg、0.5mg/kg、1.5mg/kg、5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg。不需要活动性RA。如上所述，采用相同制剂和类似的输注速率，经静脉内给予该药物，用于治疗IIM。

[00186]收集以下数据，进行临床前评价：同时采取的治疗方法、如上所述的不良事件、定向身体检查、生命体征(血压、脉搏、体温和呼吸率)、流式细胞术、血液学特征(CBC分类和血小板计数)、凝血特征(PT/PTT)、尿液分析、化学特征(电解质、BUN、肌酸酐、AST、ALT、碱性磷酸酶、总蛋白和白蛋白)、定量免疫球蛋白、类风湿因子/CCP抗体、基因分型、对血清样品评价药物浓度并测定针对TRU-015的抗体，以及血清库，即用于评价特定数据的血清样品库。

[00187]在第1天(给药后18-24小时)，评价患者的以下指标：同时采取的治疗方法、不良事件、定向身体检查、生命体征、流式细胞术、血液学特征、凝血特征(PT/PTT)、尿液分析、化学特征、对血清评价药物浓度。

[00188]在第3天(72小时)，评价患者的以下指标：同时采取的治疗方法、不良事件、定向身体检查、生命体征、流式细胞术、血液学特征(CBC分类和血小板计数)、对血清评价药物浓度。

[00189]在第7天(1周)、14天(2周)、21天(3周)、28天(4周)，对患者完成以下程序：同时采取的治疗方法、不良事件、定向身体检查、生命体征、流式细胞术、血液学特征(CBC分类和血小板计数)、凝血特征(PT/PTT)[第7、14和28天]、尿液分析[第7、14和28天]、化学特征[第7、14和28天]、定量免疫球蛋白[仅在第28天]、类风湿因子/CCP抗体[第14和28天]、对血清样品评价药物浓度[并测定针对TRU-015的抗体，在第28天]、血清库[仅在第28天]。

[00190]在第6、8、10和12周，对明显有B细胞耗竭的患者持续进行如上所述的评价，直到有证据表明B细胞恢复。评价包括以上指标，还包括凝血特征(PT/PTT)[第8和12周]、尿液分析[第8和12周]、化学特征[第8和12周]、定量免疫球蛋白[第8和12周]、类风湿因子/CCP抗体[仅在第8和12周]、对血清样品评价药物浓度[仅在第6和8周]并检测针对TRU-015的抗体[仅在第8周]和血清库[仅在第12周]。

[00191]活动性疾病研究：使第一治疗组的患者随机接受安慰剂或单剂量5mg/kg TRU-015。第二治疗组的患者随机接受两个剂量的或者安慰剂或者2.5mg/kg TRU-015，在基线给予第一剂量，在第7天给予第二剂量。第三治疗组的患者随机接受两个剂量的或者安慰剂或者7.5mg/kg TRU-015，在基线给予第一剂量，在第7天给予第二剂量。第四治疗组的患者随机接受或者安慰剂或者单剂量15mg/kgTRU-015。至少6个活动性PM或DM患者参与到各治疗组。各组包括约10个活性剂治疗患者和2个安慰剂治疗患者。

[00192]除了进行上述临床前评价外，对该治疗组中患有活动性RA的患者进行以下评价：完全关节评价(Complete joint assessment)(置换关节不作评价)、患者整体评价/医生整体评价、患者疼痛评价、通过健康评价问卷调查(HAQ)测定的失能指数、晨僵持续时间、CRP和ESR。

[00193]按照实施例3所述，各患者先用甲泼尼龙(例如SOLUMEDROL 100mg IV)、对乙酰氨基酚和抗组胺药进行预治疗。

[00194]对患者至少监测4周。此后每2-4周一次对明显有B细胞耗竭的患者进行评价以监测B细胞恢复。

实施例8

类风湿性关节炎患者用TRU-015治疗后的临床评价

[00195]按照实施例7所述，对RA患者进行治疗，在输注后至42周评价TRU-015的治疗效果。每组至少4名患者接受0.015、0.05、0.15、0.5、1.5、5、15或30mg/kg(15mg/kg治疗，每周两次)TRU-015。从这些患者组中获取TRU-015的药代动力学(PK)数据。表3显示接受0.5、1.5、5、15或2×15mg/kg TRU-015的各组的相对PK数据。

表3

[00196]TRU-015的最终半衰期范围为281-484小时，表明TRU-015，甚至在低剂量时，在体内也具有长半衰期，并随剂量增加而增加。另外，没有与给予TRU-015相关的剂量-限制性毒性或严重不良事件。少有报道TRU-015治疗的不良副作用，包括头痛(13.5％)、上呼吸道感染(13.5％)、支气管炎(10.8％)、外周水肿(13.5％)、瘙痒(10％)、背痛(13.5％)、关节痛(8.1％)、咳嗽(8.1％)、瘀斑(8.1％)、疲劳(8.1％)、鼻咽炎(8.1％)和尿道感染(8.1％)。在接受TRU-015的患者中可见3级异常，包括3级AST/ALT(n＝1)、3级低白细胞(n＝2)和3级低嗜中性粒细胞(n＝3)。治疗期间未见4级，仅见3例3级不良事件，包括皮疹/支气管痉挛(已解决，并未终止治疗)、药物输注后2周有关节痛、以及与输注无关的高血压。在该项实验中观察到一例严重不良事件，一名TRU-015患者在治疗后6个月发生胆囊炎。在一项后续研究中，一名患者在治疗后4周前列腺活检后发生前列腺癌和菌血症/发热，一名安慰剂组的患者先前诊断的充血性心力衰竭进一步恶化。

[00197]对接受TRU-015的RA患者的B细胞耗竭范围进行测定，并与治疗开始前的患者平均基线水平进行比较。图4显示在接受TRU-015的RA患者中B细胞耗竭的持续时间，这是通过测定CD19+B细胞数量而确定的。接受至少0.5mg/kg TRU-015的患者在输注后1天就表现出B细胞几乎完全耗竭。接受单剂量15mg/kg TRU-015或2×15mg/kg剂量的患者的B细胞在输注后第84天完全耗竭，到第168天上升至基线的约10-15％。接受5mg/kg剂量的患者在输注后第84天显示出B细胞基线水平的约15-20％，到第168天上升至约35％。接受单剂量1.5mg/kg TRU-015的患者在第84天时B细胞水平水平为基线的约30％，此水平一直保持到第168天。

[00198]在第二组治疗方案中，给予患者5mg/kg的2×2.5mg/kg剂量或15mg/kg的2×7.5mg/kg剂量，在一定时间测定B细胞耗竭。在2×2.5mg/kg剂量下的平均B细胞耗竭反映出接受1×5mg/kg的患者的B细胞耗竭，在第72天下降到基线的约10％，到第172天上升到基线水平的约30％。然而，对接受单剂量15mg/kgTRU-015或2×7.5mg/kg剂量的患者进行比较，显示出在第84天时两组B细胞水平都几乎完全耗竭，而在第168天，接受单剂量的患者的B细胞数量略有增加(至约15％)，而给予两个剂量的患者的B细胞数量则增加至基线水平的约35-40％(图5)。

[00199]评价所有患者是否含有针对TRU-015的中和抗体。经检测的血清样品全都是中和抗体阴性。对5mg/kg和15mg/kg组患者的血清样品进行检测，都未见中和抗体。然而，在取样时血清中仍然含有TRU-015。

[00200]治疗期间，也监测患者的类风湿因子(RF)抗体水平，并将其分为RF+患者或RF-患者。治疗后第42周时这些组的最大临床反应见下表4。

表4

	所有患者	RF+患者
			ACR20	76％	80％
ACR50	28％	35％
			ACR70	12％	15％

[00201]这些结果表明，TRU-015能有效地治疗类风湿性关节炎。TRU-015治疗是暴露给这样的药物：所述药物的剂量通常是按比例来计，而且其血清半衰期与大蛋白质治疗药类似。观察用TRU-015治疗的剂量反应；其中随着TRU-015剂量的增加，B细胞耗竭通常在程度和持续时间上也增加，在延长时间周期中表现出100％的细胞耗竭。此外，迄今为止未检出针对TRU-015的中和抗体。

[00202]根据上述说明性实施例提出对本发明的各种修改和变动是本领域技术人员可以预料到的。因此，只有所附权利要求书中出现的这类限制才能用于界定本发明的范围。

序列表

<110>Burge，Daniel J.

<120>单剂量CD20特异性结合分子的用途

<130>31126/41325PCT

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1518

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TRU-015多核苷酸

<400>1

aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca   60

gtcataatgt ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct  120

ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg  180

taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct  240

tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc  300

agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca  360

cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt  420

ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagtcggtg  480

aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac  540

aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat  600

ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta  660

gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg  720

gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg  780

ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttgtga caaaactcac  840

acatctccac cgtgctcagc acctgaactc ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc  900

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg  960

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg  1020

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc  1080

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc  1140

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga  1200

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc  1260

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat  1320

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc  1380

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca  1440

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct  1500

ccgggtaaat gatctaga                                                1518

<210>2

<211>499

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRU-015多肽

<400>2

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1               5                   10                  15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile

            20              25              30

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

        35              40              45

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser

    50              55              60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65              70              75              80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

            85              90              95

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

            100                 105                 110

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

        115                 120                 125

Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

    130                 135                 140

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala

145                 150                 155                 160

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

                165                 170                 175

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile

            180                 185                 190

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

        195                 200                 205

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

    210                 215                 220

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

225                 230                 235                 240

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

                245                 250                 255

Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys

            260                 265                 270

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly

        275                 280                 285

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

    290                 295                 300

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

305                 310                 315                 320

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

                325                 330                 335

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

            340                 345                 350

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

        355                 360                 365

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

    370                 375                 380

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

385                 390                 395                 400

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

                405                 410                 415

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

            420                 425                 430

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

        435                 440                 445

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

    450                 455                 460

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

465                 470                 475                 480

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

                485                 490                 495

Pro Gly Lys

Claims (55)

1. 一种用于治疗患有或疑似患有异常B细胞活性相关疾病的个体的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效单剂量的CD20特异性结合分子。

2. 一种用于治疗患有或疑似患有风湿病的个体的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效单剂量的CD20特异性结合分子。

3. 权利要求2的方法，其中所述风湿病选自类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、皮肌炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜、青少年类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、雷诺综合征、赖特综合征、结节病、脊椎关节病、进行性系统性硬化病和肌炎。

4. 权利要求3的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎。

5. 权利要求4的方法，其中给予CD20特异性结合分子导致ACR评分为20。

6. 权利要求4的方法，其中所述个体的生物样品中的B细胞数量下降。

7. 权利要求4的方法，其中所述个体的生物样品中的RANK配体表达下降。

8. 权利要求6或7的方法，其中所述生物样品是血液、滑液或滑膜活检样品。

9. 一种用于治疗患有或疑似患有炎性肠病的个体的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效单剂量的CD20特异性结合分子。

10. 权利要求9的方法，其中所述炎性肠病选自溃疡性结肠炎和克罗恩病。

11. 权利要求10的方法，其中所述疾病是克罗恩病。

12. 权利要求11的方法，其中给予CD20特异性结合分子导致克罗恩病活性指标(CDAI)评分的改善范围为约50单位至约70单位。

13. 权利要求10的方法，其中给予CD20特异性结合分子导致核周抗嗜中性粒细胞抗体(pANCA)或抗酿酒酵母抗体(ASCA)减少。

14. 权利要求10的方法，其中所述疾病是溃疡性结肠炎。

15. 一种用于治疗患有或疑似患有中枢神经系统自身免疫性疾病的个体的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效单剂量的CD20特异性结合分子。

16. 权利要求15的方法，其中所述中枢神经系统自身免疫性疾病选自多发性硬化、变应性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、狼疮性脊髓炎和狼疮性脑炎。

17. 权利要求16的方法，其中所述疾病是多发性硬化。

18. 权利要求17的方法，其中给予CD20特异性结合分子导致扩展失能状况量表(EDSS)评分至少下降0.5。

19. 权利要求16的方法，其中所述疾病是变应性脑炎。

20. 权利要求16的方法，其中所述疾病是视神经脊髓炎。

21. 一种用于治疗患有或疑似患有脉管炎的个体的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效单剂量的CD20特异性结合分子。

22. 权利要求21的方法，其中所述脉管炎选自贝赫切特综合征、中枢神经系统脉管炎、丘-施综合征、冷球蛋白血症、巨细胞性动脉炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜、过敏性脉管炎/血管炎、川崎病、白细胞破碎性脉管炎、多脉管炎、结节性多脉管炎、多肌痛、多软骨炎、类风湿性脉管炎、无脉病、韦格纳肉芽肿病、肝炎所致脉管炎、家族性地中海热、微小多脉管炎、科根综合征、Whiskott-Aldrich综合征和血栓闭塞性脉管炎。

23.一种用于治疗患有或疑似患有原发性炎性肌病的个体的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效单剂量的CD20特异性结合分子。

24. 权利要求23的方法，其中所述炎性肌病选自多肌炎和皮肌炎。

25. 权利要求24的方法，其中给予CD20特异性结合分子导致原发性炎性肌病标准(IIMC)评价所提出的5项标准中至少一项下降。

26. 权利要求24的方法，其中给予CD20特异性结合分子导致选自以下的IIM相关因子下降：肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶、醛缩酶、C-反应蛋白、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和抗核自身抗体(ANA)、肌炎特异性抗体(MSA)以及针对可提取的核抗原的抗体。

27. 权利要求24的方法，其中给予CD20特异性结合分子导致肌酸激酶(CK)水平下降。

26. 权利要求2、9、15、21或23中任一项的方法，其中所述结合分子与第二药物联合用药。

27.  权利要求26的方法，其中所述第二药物选自第二B细胞特异性结合分子、细胞因子、趋化因子、生长因子和免疫抑制药。

28. 权利要求27的方法，其中所述第二药物选自非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、糖皮质激素、治疗关节炎的调节疾病用抗风湿药(DMARD)和生物反应调节剂。

29. 一种用于治疗患有或疑似患有异常B细胞活性相关的癌症的个体的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效单剂量的CD20特异性结合分子。

30. 权利要求29的方法，其中所述癌症选自B细胞淋巴瘤、B细胞白血病和B细胞骨髓瘤。

31. 权利要求29或30的方法，其中所述癌症选自霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、慢性成肌细胞性白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、结外粘膜相关淋巴组织边缘带B细胞淋巴瘤(MALT)、结节性边缘带B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、不明原因的可能恶化的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿和移植后淋巴增殖障碍。

32. 权利要求29的方法，其中所述个体的B细胞数量下降。

33. 权利要求32的方法，其中所述个体选自以下的生物样品中的B细胞数量下降：血液、肿瘤活检样品、唾液、淋巴结、扁桃体、骨髓、胸腺和其它富含淋巴细胞的组织。

34. 权利要求29的方法，其中所述CD20特异性结合分子与第二药物联合用药。

35. 权利要求34的方法，其中第二药物选自第二B细胞特异性结合分子、细胞因子、趋化因子、生长因子、免疫抑制药、化疗药和放疗药。

36. 权利要求29的方法，其中所述个体对CD20特异性结合分子的治疗至少表现出部分反应。

37. 权利要求29的方法，其中与用利妥昔单抗而不用其它CD20结合分子治疗相比，所述个体对CD20结合分子治疗的反应有所改善。

38. 权利要求37的方法，其中所述个体也接受利妥昔单抗。

39. 权利要求1、2、9、15、21、22或29中任一项的方法，其中所述CD20特异性结合分子是CD20特异性的小模块免疫药物(SMIP)TRU-015。

40. 权利要求39的方法，其中所述CD20特异性SMIP的给药剂量范围为约0.01mg/kg至约50mg/kg。

41. 权利要求40的方法，其中所述CD20特异性SMIP的给药剂量范围为约0.015mg/kg至约30mg/kg。

42. 权利要求41的方法，其中所述CD20特异性SMIP的给药剂量范围为约0.015mg/kg、约0.05mg/kg、约0.15mg/kg、约0.5mg/kg、约1.5mg/kg、约5.0mg/kg、约15mg/kg或约30mg/kg。

43. 权利要求39的方法，其中所述CD20特异性结合分子对CD20的亲和力范围为约1nM至约30nM。

44. 权利要求39的方法，其中所述CD20特异性结合分子的体内半衰期为约7天至约30天。

45. 权利要求1、2、9、15、21、22或29中任一项的方法，其中给予CD20特异性结合分子导致个体的B细胞数量下降至少20％。

46. 权利要求45的方法，其中给予CD20特异性结合分子的结果是个体的B细胞数量下降至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。

47. 一种制造品，所述制造品包括CD20特异性结合分子和注明权利要求1的方法的标签。

48. 一种制造品，所述制造品包括CD20特异性结合分子和注明权利要求2的方法的标签。

49. 一种制造品，所述制造品包括CD20特异性结合分子和注明权利要求9的方法的标签。

50. 一种制造品，所述制造品包括CD20特异性结合分子和注明权利要求15的方法的标签。

51. 一种制造品，所述制造品包括CD20特异性结合分子和注明权利要求21的方法的标签。

52. 一种制造品，所述制造品包括CD20特异性结合分子和注明权利要求23的方法的标签。

53. 一种制造品，所述制造品包括CD20特异性结合分子和注明权利要求29的方法的标签。

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