ES2320374T3 - Dominios de inmunoglobulina sintetica con propiedades de enlace modificadas en regiones de la molecula diferentes de las regiones de determinacion de complementariedad. - Google Patents
Dominios de inmunoglobulina sintetica con propiedades de enlace modificadas en regiones de la molecula diferentes de las regiones de determinacion de complementariedad. Download PDFInfo
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Abstract
Un dominio constante de inmunoglobulina o parte del mismo de origen humano, que comprende al menos una región del bucle estructural de cualquiera de los dominios CH1, CH2, CH3, CH4 o CL, comprendiendo al menos una región del bucle estructural al menos una modificación que permite el enlace de al menos dicha región del bucle estructural a un epítopo de un antígeno, en que el dominio constante de la inmunoglobulina modificada no se une a dicho epítopo, excluyendo dicha modificación la incorporación de un péptido farmacológicamente activo de 2 a 40 aminoácidos en el dominio Fc.
Description
Dominios de inmunoglobulina sintética con
propiedades de enlace modificadas en regiones de la molécula
diferentes de las regiones de determinación de
complementariedad.
La presente invención se refiere a un método
para el diseño y fabricación de una inmunoglobulina modificada.
El campo general es la ingeniería de proteínas
con la finalidad de conferirles propiedades de enlace específicas.
Más específicamente, las proteínas de diseño de relevancia aquí son
inmunoglobulinas (anticuerpos), y aún más específicamente, dominios
sencillos o pares o combinaciones de dominios sencillos de
inmunoglobulinas. Las propiedades de enlace específicas de
inmunoglobulinas son características importantes ya que controlan
la interacción con moléculas tales como antígenos, y hacen útiles a
las inmunoglobulinas para aplicaciones de diagnóstico y
terapéuticas.
La estructura de anticuerpos básica se explicará
aquí utilizando como ejemplo una inmunoglobulina IgG1 intacta.
Dos cadenas pesadas idénticas (H) y dos ligeras
idénticas (L) se combinan para formar la molécula de anticuerpo en
forma de Y. Las cadenas pesadas tienen cada una cuatro dominios. Los
dominios variables amino terminales (VH) están en las puntas de la
Y. Estos son seguidos por tres dominios constantes: CH_{1},
CH_{2} y CH_{3} carboxi terminal, en la base del tronco Y. Un
tramo corto, el conmutador, conecta las regiones constantes y
variables de la cadena pesada. La bisagra conecta CH_{2} y
CH_{3} (el fragmento Fc) al resto de anticuerpo (los fragmentos
Fab). Un Fc y dos fragmentos Fab idénticos se pueden producir por
escisión proteolítica de la bisagra en una molécula de anticuerpo
intacta. Las cadenas ligeras están construidas con dos dominios, el
variable (VL) y el constante (CL), separados por un conmutador.
Los enlaces disulfuro en la región bisagra
conectan dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las
cadenas pesadas por enlaces disulfuro adicionales. Las porciones
carbohidrato enlazadas por Asn se conectan en diferentes posiciones
en dominios constantes dependiendo de la clase de inmunoglobulina.
En IgG1, dos enlaces disulfuro en la región bisagra, entre los
pares Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas pesadas. Las cadenas
ligeras se acoplan a las cadenas pesadas a través de dos enlaces
disulfuro adicionales, entre Cys229s en los dominios CH_{1} y
Cys2l4s en los dominios CL. Las porciones carbohidrato se conectan a
la Asn306 de cada CH_{2}, generando un bulto pronunciado en el
tronco de la Y.
Estas características tienen consecuencias
funcionales profundas. Las regiones variables tanto de las cadenas
pesadas como de las ligeras (VH) y (VL) se encuentran en las
"puntas" de la Y, donde se ubican para reaccionar con el
antígeno. Esta punta de la molécula es el lado en el que se ubica el
extremo N de la secuencia de aminoácidos. El tronco de la Y se
proyecta de forma que medie eficientemente en funciones efectoras
tales como la activación del complemento y la interacción con
receptores Fc o ADCC y ADCP. Sus dominios CH_{2} y CH_{3} se
abultan para facilitar la interacción con proteínas efectoras. El
extremo C de la secuencia de aminoácidos se ubica en el lado
opuesto de la punta, que puede denominarse "fondo" de la Y. La
estructura de una IgG1 intacta se ilustra en la Figura 1a.
En los anticuerpos se encuentran dos tipos de
cadenas ligeras, denominadas lambda (\lambda) y kappa (\kappa).
Una inmunoglobulina dada, tiene cadenas \kappa o cadenas
\lambda, nunca una de cada. No se ha encontrado diferencia
funcional entre anticuerpos que tengan con cadenas ligeras \kappa
o \lambda.
La organización estructural de los monómeros de
la clase de inmunoglobulina humana principal se ilustra en la
Figura 1b. Las clases difieren en la composición y la secuencia de
sus cadenas pesadas respectivas. Tanto IgM como IgE carecen de una
región bisagra pero cada una contiene un dominio de cadena pesada
extra (CH_{4}). Los números y las ubicaciones de los enlaces
disulfuro (líneas) que enlazan las cadenas difieren entre los
isotipos. También difieren en la distribución de los grupos
carbohidrato N-enlazados, mostrados simbólicamente
como círculos.
Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene
una estructura similar de dos hojas beta empaquetadas apretadamente
entre sí en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura
conservada se denomina pliegue de la inmunoglobulina. El pliegue de
la inmunoglobulina de dominios constantes contiene una hoja de
3-hebras empaquetadas contra una hoja de
4-hebras. El pliegue se estabiliza por puentes de
hidrógeno entre las hebras beta de cada hoja, por enlace
hidrofóbico entre los residuos de hojas opuestas en el interior, y
por un enlace disulfuro entre las hojas. La hoja de
3-hebras comprende las hebras C, F y G, la hoja de
4-hebras tiene las hebras A, B, E y D. Las letras A
a G representan las posiciones secuenciales de las hebras beta sobre
la secuencia de aminoácidos del pliegue de la inmunoglobulina.
El pliegue de los dominios variables tiene 9
hebras beta dispuestas en dos hojas de 4 y 5 hebras. La hoja de
5-hebras es estructuralmente homóloga a la hoja de
3-hebras de los dominios constantes, pero contiene
las hebras extra C' y C''. El resto de las hebras (A, B, C, D, E, F,
G) tiene la misma topología y una estructura similar a sus
complementarias en el dominio constante de los pliegues de la
inmunoglobulina. Un enlace disulfuro une las hebras B y F en hojas
opuestas, como en los dominios constantes. El pliegue de la
inmunoglobulina se ilustra en la Figura 2 para un dominio constante
y uno variable de una inmunoglobulina.
Los dominios variables tanto de las cadenas de
inmunoglobulina ligeras como de las pesadas contienen tres bucles
hipervariables, o regiones para la determinación de
complementariedad (Es). Las tres CDRs de un dominio V (CDR1, CDR2,
CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDRs son bucles
que conectan las hebras beta B-C,
C'-C'' y F-G del pliegue de la
inmunoglobulina. Los residuos en las CDRs varían de una molécula de
inmunoglobulina a otra, impartiendo especificidad de antígeno a cada
anticuerpo.
Los dominios VL y VH en las puntas de las
moléculas de anticuerpo están estrechamente empaquetados de tal
manera que las 6 CDRs (3' en cada dominio) cooperan para construir
una superficie (o cavidad) para el enlace específico de antígeno.
Así, el sitio de enlace del antígeno natural de un anticuerpo se
compone de los bucles que conectan las hebras B-C,
C'-C'' y F-G del dominio variable de
la cadena ligera y las hebras B-C,
C'-C'' y F-G del dominio variable de
la cadena pesada.
Utilizando la estructura 3D de una proteína como
ayuda para diseño, los residuos aminoácido ubicados en la
superficie de muchas proteínas se han distribuido aleatoriamente
utilizando como patrón la estructura del núcleo de la proteína.
Ejemplos de esta estrategia se describen o resumen en las siguientes
referencias, incorporadas aquí por referencia: Nygren PA, Uhlen M.,
Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK,
Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG,
Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt
M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; US
6,562,617.
El principio básico de esta técnica se base en
la observación de que muchas proteínas tienen un núcleo estable,
formado por configuraciones específicas de elementos de estructura
secundaria, tales como hojas beta o hélices alfa, que se
interconectan a través de estructuras tales como bucles, giros o
vueltas o espirales al azar. Típicamente, estos tres elementos
estructurales son poco cruciales para la estructura total de la
proteína, y los residuos aminoácido en estos elementos estructurales
pueden intercambiarse a menudo sin destruir el pliegue general de
la proteína. Un ejemplo de origen natural para este principio de
diseño son las CDRs de los anticuerpos. Ejemplos artificiales
incluyen lipocalinas, anquirinas y otros patrones de proteínas.
Los bucles que no son bucles CDR en una
inmunoglobulina nativa no tienen especificidad de unión a antígeno
o a epítopo pero contribuyen al pliegue correcto de la molécula de
inmunoglobulina y/o su efector u otras funciones y por lo tanto se
denominan bucles estructurales para el propósito de esta
invención.
En la patente de los E.U.A. Nº 6,294,654 se
muestra que pueden elaborarse anticuerpos alterados donde un
antígeno peptídico se puede incorporar en un bucle
no-CDR de un anticuerpo (Ab) en la región CH_{1}
entre la región bisagra y la región variable, y el Ab resultante
puede ser recuperado en una APC de tal manera que el antígeno
peptídico se presente en la superficie de la APC en el contexto de
MHC II, produciendo de este modo una respuesta inmune. Estos
péptidos insertados son epítopos y la estructura total de la
molécula portadora no es importante. Se demostró que un péptido ras
puede situarse en un bucle (no-CDR) de una
inmunoglobulina y ésta aún ser secretada. Hay un "control de
calidad" severo en las células que evita que la inmunoglobulina
sea secretada a menos que se pliegue adecuadamente, y alterar la
secuencia de aminoácidos del bucle puede provocar que la proteína
pliegue en una estructura que la célula detectará como incorrecta, y
por lo tanto la degradará. De esta manera, además de los ejemplos
mostrados, se considera difícil modificar adicionalmente los bucles
estructurales sin cambiar la naturaleza de la inmuno-
globulina.
globulina.
La solicitud de patente de los E.U.A. Nº
2004/0101905 describe el enlace de moléculas que comprenden un
sitio de enlace diana y un péptido efector Fc. El péptido efector Fc
es un péptido que interactúa con la molécula efectora. Se muestra
la inserción de un péptido efector en un bucle
no-DDR de un dominio CH_{1} de un fragmento de
inmunoglobulina.
Los péptidos efectores Fc son estructuras de
origen natural en bucles no-CDR de anticuerpos y por
lo tanto se espera que no perturben la estructura de la
inmunoglobulina si se injertan en diferentes sitios equivalentes en
una inmunoglobulina.
Sin embargo, todo péptido injertado en un bucle
no-CDR de acuerdo con esta descripción tiene una
alta probabilidad de ser inactivo por el diferente entorno
estructural que se ha seleccionado.
Se establece en los dos documentos de la técnica
anterior mencionados previamente que es difícil insertar péptidos
en el bucle que debe retener su estructura y su función, siendo
crítico no perturbar la estructura de pliegue de la inmunoglobulina
ya que esto es importante para su funcionamiento y secreción.
Las solicitudes de patente de los E.U.A. Nº
2004/0132101 y 2005/0244403 describen inmunoglobulinas mutantes con
afinidad alterada de unión a un ligando efector, que son ligandos
naturales para bucles estructurales de anticuerpos. En este
documento se describe una variedad de mutaciones en diversas
regiones a lo largo de toda la molécula de inmunoglobulina, que
influencian la función efectora del anticuerpo completo.
El documento WO 01/83525 se refiere a proteínas
que comprenden dominios Fc fundidos con péptidos biológicamente
activos, en que dichos péptidos están fundidos a los dominios Fc en
sus extremos N o C.
El documento US 2002/0106370 da a conocer
polipéptidos quiméricos que comprenden una porción de enlace que
muestra una afinidad específica de unión a la superficie de la
célula eucariótica diana y una porción efectora.
\newpage
El documento WO 02/32925 da a conocer proteínas
capaces de una función anticuerpo similar. Para conseguirlo,
también se introducen estructuras de bucle en dichas proteínas, que
corresponden en estructura y posición a bucles CDR.
El documento WO 2006/036834 da a conocer
moléculas y métodos en los que los péptidos biológicamente activos
se incorporan en una región del bucle de un dominio Fc. El péptido
biológicamente activo con la actividad biológica deseada se
selecciona en primer lugar y después se introduce en los dominios
Fc, bien enlazando en péptido con la proteína o por inserción del
ácido nucleico respectivo en el ácido nucleico que codifica el
dominio Fc.
Otros documentos de la técnica anterior muestran
que el patrón tipo inmunoglobulina se ha empleado hasta ahora con
el propósito de manipular el sitio de unión de antígeno existente,
introduciendo de este modo nuevas propiedades de enlace. Sin
embargo, hasta la fecha sólo las regiones CDR han sido sometidas a
ingeniería para el enlace de antígeno, en otras palabras, en el
caso del pliegue de la inmunoglobulina sólo se ha modificado el
sitio de enlace del antígeno natural para cambiar su afinidad o
especificidad de enlace. Existe una gran cantidad de bibliografía
que describe diferentes formatos de estas inmunoglobulinas
manipuladas, expresadas frecuentemente en forma de fragmentos Fv de
cadena sencilla (scFv) o fragmentos Fab, ya sean presentados en la
superficie de partículas fago o expresados en forma soluble en
diversos sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos. Entre
los autores principales en este campo están Greg Winter, Andreas
Plückthun y Hennie Hoogenboom.
Es objeto de la presente invención proporcionar
inmunoglobulinas con nuevos sitios de enlace de antígeno
introducidos y métodos para diseñar y fabricar dichas
inmunoglobulinas.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
un dominio constante de inmunoglobulina o a parte de él, tal y como
se define en las reivindicaciones 1 a 7 y a moléculas de ácido
nucleico que codifican dicha inmunoglobulina, como se define en la
reivindicación 7.
El método para diseñar una inmunoglobulina que
comprende al menos una modificación en una región del bucle
estructural de la inmunoglobulina y para determinar el enlace de
dicha inmunoglobulina con un epítopo de un antígeno, en el que la
inmunoglobulina no modificada no se une significativamente a dicho
epítopo, comprende las etapas de:
- proporcionar un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que comprende al menos una región del bucle
estructural,
- modificar al menos un residuo nucleótido de al
menos una de dichas regiones del bucle estructural,
- transferir el ácido nucleico modificado en un
sistema de expresión,
- expresar dicha inmunoglobulina modificada,
- poner en contacto la inmunoglobulina
modificada expresada con un epítopo, y
- determinar si dicha inmunoglobulina modificada
se une a dicho epítopo.
En particular, dicho método de diseño se refiere
a la unión específica de una inmunoglobulina con un epítopo de un
antígeno seleccionado del grupo que consiste en alérgenos, antígenos
asociados a tumor, auto-antígenos, enzimas,
antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y
antígenos virales. través de la modificación en la región del
bucle estructural, la inmunoglobulina puede ser diseñada para unirse
al epítopo. En una modalidad preferida, la inmunoglobulina se une
específicamente a al menos dos de dichos epítopos, que difieren
entre sí, ya sean del mismo antígeno o de diferentes antígenos.
Por ejemplo, el método de acuerdo con la
invención se refiere al diseño de una unión específica de
inmunoglobulina con al menos un primer epítopo y que comprende al
menos una modificación en al menos una región del bucle estructural
de dicha inmunoglobulina y la determinación del enlace específico
de al menos dicha región del bucle hasta al menos un segundo
epítopo, seleccionándose éste del grupo de antígenos mencionados
anteriormente, donde la región no modificada del bucle estructural
(región no-CDR) no se une específicamente al menos
a dicho segundo epítopo, comprendiendo las etapas de:
- proporcionar un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que se une específicamente con al menos un
primer epítopo que comprende al menos una región del bucle
estructural,
- modificar al menos un residuo nucleótido de al
menos una de dichas regiones del bucle estructural,
- transferir el ácido nucleico modificado en un
sistema de expresión,
- expresar dicha inmunoglobulina modificada,
- poner en contacto la inmunoglobulina
modificada con al menos dicho segundo epítopo, y
- determinar si dicha inmunoglobulina modificada
se une al segundo epítopo.
El método se refiere preferiblemente a al menos
una modificación en al menos una región del bucle estructural de la
inmunoglobulina y a la determinación de al menos dicha región del
bucle con al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste
en alérgenos, antígenos asociados a tumor,
auto-antígenos, enzimas, antígenos bacterianos,
antígenos fúngicos, antígenos virales y antígenos protozoarios, onde
la inmunoglobulina que contiene una región del bucle estructural no
modificada no se une específicamente a al menos dicho antígeno.
El término "inmunoglobulinas" que se
modifican de acuerdo con la presente invención (como se emplea
aquí, los términos inmunoglobulina y anticuerpo son intercambiables)
pueden mostrar propiedades de unión mono- o
multi-específicas o multivalentes, al menos dos,
preferiblemente al menos tres sitios de unión específicos para
epítopos de, por ejemplo, antígenos, moléculas/proteínas efectoras.
Las inmunoglobulinas de acuerdo con la invención también son
fragmentos funcionales aceptados en la técnica, tales como Fc, Fab,
scFv, dímeros de cadena sencilla de dominios CH/CL, Fv, u otros
derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas, dominios de las
cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tales como Fd, Vl,
Vk, Vh) y la región constante de un anticuerpo intacto tal como
CH1, CH2, CH3, CH4, Cl y Ck, así como mini-dominios
consistentes en dos hebras beta de un dominio inmunoglobulina
conectado por un bucle estructural.
Se entiende que el término
"inmunoglobulina", "inmunoglobulina modificada"
"inmunoglobulina de acuerdo con la invención" incluye también
un derivado de inmunoglobulinas. Un derivado es cualquier
combinación de una o varias inmunoglobulinas de la invención y/o
una proteína de fusión en la que cualquier dominio o
mini-dominio de la inmunoglobulina de la invención
se puede fundir en cualquier posición de una o varias proteínas
(tales como otras inmunoglobulinas, ligandos, proteínas patrón,
toxinas enzimáticas y similares). Un derivado de la inmunoglobulina
de la invención también se puede obtener mediante el enlace con
otras substancias mediante diversas técnicas químicas, tales como
enlace covalente, interacción electrostática, enlaces disulfuro,
etc.
Las tres substancias unidas a las
inmunoglobulinas pueden ser lípidos, carbohidratos, ácidos
nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas o cualquier
combinación de ellas (por ejemplo, PEG, profármacos o fármacos). Un
derivado también es una inmunoglobulina con la misma secuencia de
aminoácidos, pero construida completa o parcialmente a partir de
aminoácidos no naturales o químicamente modificados.
Las moléculas diseñadas de acuerdo con la
presente invención serán útiles como proteínas autónomas, así como
proteínas de fusión o derivados, más típicamente fusionadas de
manera tal que sean parte de estructuras de anticuerpo mayores o
moléculas de anticuerpo completas o partes de ellas, tales como
fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv y otros. Será posible
utilizar las proteínas diseñadas para producir moléculas que son
monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas e incluso pueden
soportar más especificidades al mismo tiempo, y también será
posible controlar y preseleccionar la valencia de enlace al mismo
tiempo de acuerdo con los requerimientos del uso planeado de dichas
moléculas.
De acuerdo con la presente invención, las
regiones o sitios de unión a antígenos de todo tipo de alérgenos,
antígenos asociados a tumores, auto-antígenos,
enzimas, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos
protozoarios y antígenos virales, pueden introducirse en un bucle
estructural de una estructura de anticuerpo dada.
El término "antígeno" de acuerdo con la
presente invención representa moléculas o estructuras que se sabe
que interactúan o son capaces de interactuar con la región del bucle
CDR de las inmunoglobulinas. Las regiones del bucle estructural de
la técnica anterior no interactúan con antígenos sino que más bien
contribuyen a la estructura total y/o al enlace a moléculas
efectoras.
El término "alérgenos, antígenos asociados a
tumores, auto-antígenos, enzimas, antígenos
bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y antígenos
virales" de acuerdo con la presente invención debe incluir todos
los alérgenos y antígenos capaces de ser reconocidos por una
estructura de anticuerpo y fragmentos de dichas moléculas (en
especial subestructuras a las que se refiere generalmente como
"epítopos" (por ejemplo, epítopos de células B)), siempre que
sean inmunológicamente relevantes, es decir, que también sean
reconocibles por anticuerpos naturales o monoclonales.
El término "epítopo" de acuerdo con la
presente invención representa una estructura molecular que puede
constituir completamente un socio de unión especifica o ser parte de
un socio de unión específica al dominio de enlace o la
inmunoglobulina de la presente invención.
Químicamente, un epítopo puede estar compuesto
por un carbohidrato, un péptido, un ácido graso, una sustancia
inorgánica o sus derivados y cualquier combinación de las mismas. Si
el epítopo es un polipéptido, usualmente incluirá al menos 3
aminoácidos, preferiblemente 8 a 50 aminoácidos, y más
preferiblemente entre aproximadamente 10 a 20 aminoácidos en el
péptido. No hay límite superior crítico para la longitud del
péptido, que puede comprender casi toda la longitud de la secuencia
del polipéptido. Los epítopos pueden ser lineales o epítopos
conformacionales. Un epítopo lineal comprende un solo segmento de
una secuencia primaria de una cadena de polipéptido. Los epítopos
lineales pueden ser contiguos o superpuestos. Los epítopos
conformacionales comprenden aminoácidos reunidos por plegado del
polipéptido, para formar una estructura terciaria y los aminoácidos
no son necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia
lineal.
Específicamente, los epítopos son al menos parte
de moléculas relevantes para el diagnóstico, es decir, la ausencia
o presencia de un epítopo en una muestra se correlaciona cualitativa
o cuantitativamente ya sea con una enfermedad o con un estado de
salud o con el estado de un proceso de fabricación o un estado
ambiental y alimentario. Los epítopos también pueden ser al menos
parte de moléculas terapéuticamente relevantes, es decir, moléculas
que pueden ser diana del dominio de unión especifica que cambia el
curso de la enfermedad.
Los "alérgenos, antígenos asociados a tumores,
auto-antígenos, enzimas, antígenos bacterianos,
antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y antígenos virales"
preferidos son aquellos alérgenos o antígenos que ya han demostrado
su capacidad de ser inmunológica o terapéuticamente relevantes o que
lo son, en especial aquéllos en los que se ha probado su eficacia
clínica.
Por otra parte, de acuerdo con otro aspecto de
la presente invención también pueden introducirse otras capacidades
de enlace en las regiones del bucle estructural, por ejemplo
capacidades de enlace para moléculas pequeñas, tales como fármacos
o enzimas, sitios catalíticos de enzimas o substratos enzimáticos o
para un análogo del estado de transición de un substrato
enzimático.
Preferiblemente, el nuevo sitio de unión de
antígeno en los bucles estructurales es ajeno a la inmunoglobulina
no codificada. De esta manera, las dianas como moléculas efectoras o
receptoras Fc se excluyen preferiblemente de las moléculas de
enlace y la especificidad de las inmunoglobulinas de acuerdo con la
invención.
Preferiblemente, los nuevos sitios de enlace de
anfígeno en los bucles estructurales se introducen por sustitución,
deleción y/o inserción de la inmunoglobulina codificada por el ácido
nucleico seleccionado.
De acuerdo con otra modalidad preferida de la
presente invención, la modificación de al menos un nucleótido da
como resultado una substitución, deleción y/o inserción de la
inmunoglobulina codificada por dicho ácido nucleico.
La modificación de al menos una región del bucle
puede dar como resultado una substitución, deleción y/o inserción
de 1 o varios aminoácidos, preferiblemente una mutación puntual,
intercambio de bucles enteros, más preferiblemente el cambio de al
menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 30 aminoácidos.
También es preferible la mutación aleatoria
dirigida al sitio. Con este método uno o varios residuos aminoácido
específicos del bucle se intercambian o introducen utilizando
insertos generados aleatoriamente en dichos bucles estructurales.
De forma alternativa, es preferible el uso de enfoques
combinatorios.
Preferiblemente al menos una región del bucle se
muta o modifica de forma aleatoria, semi-aleatoria,
o en particular por métodos de mutagénesis aleatoria dirigida al
sitio. Estos métodos pueden emplearse para hacer modificaciones de
aminoácidos en posiciones deseadas de la inmunoglobulina de la
presente invención. En estos casos las posiciones se eligen al
azar, o los cambios de aminoácidos se realizan utilizando reglas
simplistas. Por ejemplo, todos los residuos pueden mutarse a
alanina, en referencia al cribado de alanina. Estos métodos pueden
acoplarse con enfoques de ingeniería más sofisticados que emplean
métodos de selección para cribar niveles superiores de diversidad
de secuencia. Un método preferido de acuerdo con la invención se
refiere a la molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente
que comprende al menos una unidad de repetición de nucleótido que
tiene la secuencia 5'-NNS-3',
5'-NNN-3' o
5'-NNK-3'.
5'-NNK-3'.
La molécula de ácido nucleico modificada
aleatoriamente puede comprender las unidades repetitivas
identificadas anteriormente, que codifican todos los aminoácidos de
origen natural conocidos.
Como es bien conocido en la especialidad, hay
una variedad de técnicas de selección que pueden emplearse para la
identificación y el aislamiento de proteínas con ciertas
características y afinidades de enlace, incluyendo por ejemplo
tecnologías de expresión tales como presentación en fago,
presentación en ribosoma, presentación en superficies celulares y
similares, como se describe a continuación. Los métodos para
producción y cribado de variantes de anticuerpos son bien conocidos
por la técnica. Los métodos generales para biología molecular de
anticuerpos, expresión, purificación y cribado se describen en
Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann,
Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; y Hayhurst &
Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689;
Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng
2:339-76.
Un "bucle estructural" o "bucle
no-CDR" de acuerdo con la presente invención debe
entenderse de la forma siguiente: las inmunoglobulinas están
formadas de dominios con el llamado pliegue de la inmunoglobulina.
En esencia, las hojas beta antiparalelas se conectan mediante bucles
formando un barril beta antiparalelo comprimido. En la región
variable, varios de los bucles de los dominios contribuyen
esencialmente a la especificidad del anticuerpo, es decir, la unión
al antígeno. Estos bucles se denominan bucles CDR. Todos los otros
bucles de dominios de anticuerpo contribuyen más bien a la
estructura de la molécula y/o a la función efectora. Estos bucles
se definen aquí como bucles estructurales o bucles
no-CDR.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
las inmunoglobulinas modificadas (e incluidas siempre a través de
toda la especificación siguiente: fragmentos de inmunoglobulina)
pueden clonarse en células huésped, expresadas y ensayadas para sus
especificidades de enlace. Estas prácticas se llevan a cabo
utilizando procedimientos bien conocidos y una variedad de métodos
que pueden usarse en la presente invención se describen en Molecular
Cloning-A Laboratory Manual, 3.sup.rd Ed.
(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), y
Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Los
ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas modificadas de
la presente invención pueden incorporarse en un vector de expresión
para expresar dichas inmunoglobulinas. Los vectores de expresión
comprenden típicamente una inmunoglobulina enlazada operativamente
que se coloca en una relación funcional, con control de secuencias
reguladoras, marcadores seleccionables, cualquier socio de fusión
y/o elementos adicionales. Las inmunoglobulinas modificadas de la
presente invención se pueden producir por cultivo de una célula
huésped transformada con ácido nucleico, preferiblemente un vector
de expresión que contiene ácido nucleico que codifica las
inmunoglobulinas modificadas, bajo las condiciones apropiadas para
inducir o provocar la expresión de las inmunoglobulinas modificadas.
Los métodos de introducción de moléculas de ácido nucleico exógenas
en un huésped son bien conocidas por la técnica y variarán según el
huésped empleado. Por supuesto, también se pueden emplear sistemas
de expresión libre celular o acelular para la expresión de
inmunoglobulinas
modificadas.
modificadas.
En una modalidad preferida de la presente
invención, las inmunoglobulinas modificadas se purifican o aíslan
después de la expresión. Las inmunoglobulinas modificadas pueden
aislarse o purificarse en una variedad de formas conocidas por los
especialistas en la técnica. Los métodos de purificación estándar
incluyen técnicas cromatográficas, técnicas electroforéticas,
inmunológicas, de precipitación, de diálisis, filtración,
concentración y cromatofocalización. La purificación se puede
facilitar a menudo mediante un socio de fusión particular. Por
ejemplo, los anticuerpos pueden ser purificados utilizando resina de
glutatión si se emplea una fusión GTS, usando cromatografía de
afinidad Ni^{+2} si se emplea un His-tag o usando
un anticuerpo anti-flag inmovilizado y se utiliza
un flag tag. Como guía general sobre técnicas de purificación
apropiadas, véase Antibody Purification: Principles and Practice, 3
sup.rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. Por
supuesto, también es posible expresar las inmunoglobulinas
codificadas de acuerdo con la presente invención en la superficie de
un huésped, en particular en la superficie de una célula
bacteriana, de insecto o de levadura o en la superficie de fagos o
virus.
Las inmunoglobulinas modificadas se pueden
cribar utilizando una variedad de métodos, incluyendo pero sin
limitarse a ellos, los que utilizan ensayos in vitro, ensayos
in vivo y basados en células, y técnicas de selección. Las
técnicas de automatización y cribado de alto rendimiento pueden
utilizarse en los procedimientos de cribado. El cribado puede
emplear un socio o etiqueta de fusión, por ejemplo un enzima, una
etiqueta inmune, una etiqueta isotópica o una etiqueta de molécula
pequeña como un colorante fluorescente o colorimétrico o una
molécula luminogénica.
En una modalidad preferida, las propiedades
funcionales y/o biofísicas de las inmunoglobulinas se criban en un
ensayo in vitro. En una modalidad preferida, se criba la
funcionalidad del anticuerpo, por ejemplo su capacidad de catalizar
una reacción o su afinidad de enlace a su diana.
Los ensayos pueden emplear una variedad de
métodos de detección, incluyendo pero sin limitarse a etiquetas
cromogénicas, fluorescentes, luminiscentes, o isotópicas.
Como se conoce en la técnica, un subconjunto de
métodos de criba son aquellos métodos que seleccionan miembros
favorables de una biblioteca. Los métodos se refieren aquí como
"métodos de selección", y estos métodos se usan en la presente
invención para el cribado de inmunoglobulinas modificadas. Cuando se
criban las bibliotecas de inmunoglobulinas utilizando un método de
selección, sólo aquellos miembros de una biblioteca que son
favorables, es decir, que satisfacen algún criterio de selección,
se propagan, aíslan y/u observan. Como se apreciará, debido a que
se observan sólo las variantes más aptas, estos métodos permiten la
criba de bibliotecas más grandes que las que se pueden cribar por
métodos que analizan individualmente la aptitud de los miembros de
bibliotecas. La selección es posible por cualquier método, técnica o
socio de fusión que une de forma covalente o no covalente el
fenotipo de inmunoglobulinas con su genotipo, que es la función de
un anticuerpo con el ácido nucleico que lo codifica. Por ejemplo,
el uso de presentación en fagos como método de selección es
permitido por la fusión de miembros de la biblioteca a la proteína
gen III. De esta forma, la selección o el aislamiento de
inmunoglobulinas modificadas que satisfacen algunos criterios, por
ejemplo la afinidad del unión a la diana de la inmunoglobulina,
también selecciona o aísla el ácido nucleico que la codifica. Una
vez aislado, el gen o los genes que codifican las inmunoglobulinas
modificadas pueden ser amplificados. Este proceso de aislamiento y
amplificación, referido como selección por ciclos de
adsorción-deserción puede repetirse, permitiendo que
se enriquezcan las variantes de anticuerpo favorables en la
biblioteca. La secuenciación del ácido nucleico del ácido nucleico
unido permite finalmente la identificación del gen.
En la técnica se conoce una variedad de métodos
de selección que se pueden usar en la presente invención para el
cribado de bibliotecas de inmunoglobulina. Éstos incluyen, sin estar
limitados a ellos, la presentación en fago (Phage display of
peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al.,
1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Lowman et
al., 1991, Biechemistry 30:10832-10838; Smith,
1985, Science 228:1315-1317) y infección selectiva
de fago (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol
273:544-551), fagos infectivos selectivos (Krebber
et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630) y
selección por ciclos de adsorción-desorción de
infectividad retardada (Benhar et al., 2000, J Mol Biol
301:893-904), expresión en superficie celular
(Witrrup, 2001, Curr Opin Bietechnol, 12:395-399)
tales como presentación en bacterias (Georgiou et al., 1997,
Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou et al.,
1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee et al.,
2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun et al.,
1998, Nat Biotechnol 16:576-80), levadura (Boder
& Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44;
Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol
15:553-557) y células de mamífero (Whitehorn et
al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), así
como tecnologías de presentación in vitro (Amstutz et
al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405)
tales como expresión de polisoma (Mattheakis et al., 1994,
Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026) expresión de
ribosoma (Hanes et a1., 1997, Proc Natl Acad Sci USA
94:4937-4942), expresión de ARNm (mRNA) (Roberts
& Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA
94:12297-12302; Nemoto et al, ]997, FEBS
Lett: 414:405-408) y el sistema de expresión por
inactivación de ribosoma (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc
124, 538-543).
Otros métodos de selección que se pueden usar en
la presente invención incluyen métodos que no se basan en
expresión, como métodos in vivo, incluyendo pero sin
limitarse a ellos, la criba citométrica y la expresión periplásmica
(Chen et al., 2001, Nat Biotechnol.
19:537-542), el ensayo de complementación de
fragmentos de anticuerpo (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc
Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier et
al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA
95:12141-12146) y la criba de dos híbridos de
levadura (Fields & Song, 1989, Nature
310:245-246) empleada en el modo de selección
(Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA
96:11723-11728). En una modalidad alternativa, la
selección se activa por un socio de fusión que se une a una
secuencia específica en el vector de expresión, enlazándose así de
forma covalente o no covalente al socio de fusión y al miembro de la
biblioteca variante de Fc asociado, con el ácido nucleico que los
codifica. Por ejemplo, los documentos PCT WO 00/22906; PCT WO
01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO
01/28702 y PCT WO 02/07466 describen un socio de fusión y una
técnica tales, que se pueden usar en la presente invención. En una
modalidad alternativa, se puede producir la selección in
vivo si la expresión del anticuerpo imparte alguna ventaja de
crecimiento, reproducción o supervivencia a la célula.
Un subconjunto de métodos de selección referidos
como métodos de "evolución dirigida" son aquellos que incluyen
el acoplamiento o desarrollo de secuencias favorables durante la
selección, en ocasiones con la incorporación de nuevas mutaciones.
Como apreciarán los expertos en la materia, los métodos de evolución
dirigida pueden facilitar la identificación de las secuencias más
favorables en una biblioteca y pueden incrementar la diversidad de
las secuencias que se criban. Una variedad de métodos de evolución
dirigida conocidos en la técnica se puede usar en la presente
invención para cribar variantes de anticuerpo, incluyendo pero sin
limitarse a ellos, el barajado de ADN (PCT WO 00/42561 A3; PCT WO
01/70947 A3), el barajado de exones (patentes de los E.U.A. nº
6,365,377; Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol
19:423-428), el barajado de familias (Crameri et
al., 1998, Nature 391:288-291; la patente de los
E.U.A. nº 6,376,246), RACHITT.TM (Coco et al., 2001, Nat
Biotechnol 19:354-359; PCT WO 02/06469), cebado
aleatorio y "STEP" de recombinación in vitro (Zhao et
al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao
et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683),
ensamblaje de genes mediado por exonucleasa (patente de los E.U.A.
nº 6,352,842; patentes de los E.U.A. nº 6,361,974), Gene Site
Saturation Mutagenesis TM (Patente de los E.U.A. nº 6,358,709),
Gene Reassembly.TM (Patente de los E.U.A. nº 6,358,709), SCRATCHY
(Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA
98:11248-11253), métodos de fragmentación de ADN
(Kikuchi et al., Gene 236:159-167), barajado
de ADN de una sola hebra (Kikuchi et al., 2000, Gene
243:133-137) y tecnología de ingeniería de
anticuerpos de evolución dirigida AMEsystem (Applied Molecular
Evolution) (patente de los E.U.A. nº 5,824,514; patente de los
E.U.A. nº 5,817,483; patente de los E.U.A. nº 5,814,476; patente de
los E.U.A. nº 5,763,192; patente de los E.U.A.
nº 5,723,323).
nº 5,723,323).
Las variantes de los anticuerpos se pueden
cribar utilizando uno o varios ensayos basados en células in
vivo. Para dichos ensayos, las inmunoglobulinas modificadas
purificadas o no purificadas se añaden típicamente de forma
exógena, de tal manera que las células se exponen a inmunoglobulinas
individuales o conjuntos de inmunoglobulinas que pertenecen a una
biblioteca. Estos ensayos, típicamente pero no siempre, se basan en
la función de la inmunoglobulina; esto es, la capacidad del
anticuerpo de unirse a su objetivo y mediar varios eventos
bioquímicos, por ejemplo la función efectora, la inhibición de unión
ligando/receptor, la apoptosis y similares. Estos ensayos a menudo
incluyen el seguimiento de la respuesta de las células frente al
anticuerpo, por ejemplo, la supervivencia celular, la muerte
celular, el cambio en la morfología celular o la activación
transcripcional, como la expresión celular de un gen natural o gen
reportero. Por ejemplo estos ensayos pueden medir la capacidad de
las variantes de los anticuerpos para producir ADCC, ADCP o CDC.
Para algunos ensayos puede ser necesaria la adición de células o
componentes adicionales, es decir, además de las células diana,
puede ser necesario añadir, por ejemplo, complemento de suero o
células efectoras tales como monolitos de sangre periférica (PBMCs,
del inglés peripheral blood monocytes), células NK, macrófagos y
similares. Dichas células adicionales pueden ser de cualquier
organismo, preferiblemente de humanos, ratones, ratas, conejos y
monos. Las inmunoglobulinas pueden provocar la apoptosis de ciertas
líneas celulares que expresan la diana, o pueden mediar el ataque
en células diana por células inmunes que se han añadido al ensayo.
Los métodos para el seguimiento de la muerte o la viabilidad
celular son conocidos por la técnica e incluyen el uso de
colorantes, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos.
Por ejemplo, los ensayos de tinción con caspasas pueden permitir la
medición de la apoptosis y la absorción o liberación de sustratos
radioactivos o colorantes fluorescentes, tales como el azul alamar
pueden permitir el seguimiento del crecimiento o la activación
celular. En una modalidad preferida, se puede emplear el ensayo de
citotoxicidad basado en DELFIA.RTM.EuTDA (Perkin Elmer, MA) pueden
emplearse. De forma alternativa, se puede seguir la muerte o el daño
de las células diana midiendo el desprendimiento de uno o varios
componentes intracelulares naturales, por ejemplo, la lactato
deshidrogenasa. La activación transcripcional también puede servir
como un método para ensayar la función en los ensayos basados en
células. En este caso, se puede seguir la respuesta mediante el
análisis de genes naturales o inmuoglobulinas que pueden ser
reguladas al alza, por ejemplo, se puede medir la liberación de
ciertas interleuquinas o de forma alternativa, se puede realizar la
lectura mediante una construcción reportera. Los ensayos basados en
células también pueden incluir la medición de cambios morfológicos
de las células como respuesta a la presencia de inmunoglobulinas
modificadas. Las células para estos ensayos pueden ser de tipo
procariótico o eucariótico y se puede emplear una variedad de
líneas celulares conocidas en la técnica. De forma alternativa, los
tamices basados en células se elaboran usando células que se han
transformado o transfectado con ácidos nucleicos que codifican las
variantes. Es decir, las variantes de anticuerpos no se añaden de
forma exógena a las células. Por ejemplo, en una modalidad, el
tamiz basado en células utiliza la expresión en superficie celular.
Puede emplearse un socio de fusión que permita la expresión de
inmunoglobulinas modificadas en la superficie de las células
(Witrrup, 2001, Curr Opin
Biotechnol,12:395-399).
En una modalidad preferida, la inmunogenicidad
de las inmunoglobulinas modificadas puede determinarse
experimentalmente utilizando uno o varios ensayos basados en
células. En una modalidad preferida, los ensayos de activación de
células T ex vivo se emplean para cuantificar
experimentalmente la inmunogenicidad. En este método, las células
que presentan antígeno y las células T nativas de donantes apareados
se prueban una o varias veces con un péptido o un anticuerpo entero
de interés. Entonces, la activación de las células T puede
detectarse utilizando una variedad de métodos, por ejemplo haciendo
el seguimiento de la producción de citoquinas o midiendo la
absorción de timidina tritiada. En la modalidad más preferida, la
producción de interferón gama se sigue utilizando ensayos Eilspot
(Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth., 24:
17-24).
Las propiedades biológicas de las
inmunoglobulinas modificadas de la presente invención pueden
caracterizarse en experimentos en células, tejidos y organismos
enteros. Como se conoce en la técnica, a menudo los fármacos se
ensayan en animales, incluyendo pero sin limitarse a ellos, ratones,
ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, a fin de medir la
eficacia de un fármaco para el tratamiento de una enfermedad o un
modelo de enfermedad o para medir la farmacocinética, toxicidad y
otras propiedades de un fármaco. Los animales pueden ser referidos
como modelos de enfermedad. Los agentes terapéuticos a menudo se
prueban en ratones, incluyendo pero sin limitarse a ellos, ratones
desnudos, ratones SCID, ratones de xenoinjerto y ratones
transgénicos (incluyendo "knockins" y "knockouts"). Dicha
experimentación puede proporcionar datos significativos para la
determinación del potencial del anticuerpo que se debe utilizar
como agente terapéutico. Cualquier organismo, preferiblemente los
mamíferos, puede emplearse para las pruebas. Por ejemplo, debido a
su similaridad genética con los humanos, los monos pueden ser
modelos terapéuticos apropiados y de esta manera pueden emplearse
para analizar la eficacia, toxicidad, farmacocinética u otra
propiedad de las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención. Finalmente se requieren pruebas en humanos para la
aprobación como fármacos y por supuesto se contemplan estos
experimentos. De esta manera, las inmunoglobulinas modificadas de
la presente invención pueden ensayarse en humanos para determinar
su eficacia terapéutica, toxicidad, inmunicidad, farmacocinética y/u
otras propiedades clínicas.
Las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención pueden encontrar utilidad en un amplio rango de productos
de anticuerpos. En una modalidad, la variante de anticuerpo de la
presente invención se utiliza para la terapia o la profilaxis, para
uso preparativo o analítico, como un compuesto de diagnóstico, un
compuesto industrial o un reactivo de investigación,
preferiblemente un agente terapéutico. La variante del anticuerpo
puede utilizarse en una composición de anticuerpos que es monoclonal
o policlonal. En una modalidad preferida, se usa una
inmunoglobulina modificada de la presente invención para exterminar
células diana que contienen el antígeno diana, por ejemplo células
cancerosas. En una modalidad alternativa, las inmunoglobulinas
modificadas de la presente invención se utilizan para bloquear,
antagonizar o agonizar el antígeno diana, por ejemplo por
antagonización de una citoquina o un receptor de citoquina. En una
modalidad alternativa preferida las inmunoglobulinas modificadas de
la presente invención se utilizan para bloquear, antagonizar o
agonizar el antígeno diana y exterminar las células diana que
contienen el antígeno diana. En una modalidad preferida
alternativa, las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención se utilizan para bloquear, antagonizar o agonizar
factores de crecimiento o receptores de factores de crecimiento y
exterminar las células diana que contienen o requieren el antígeno
diana. En una modalidad preferida alternativa, las inmunoglobulinas
modificadas de la presente invención se utilizan para bloquear,
antagonizar o agonizar enzimas y sustratos de enzimas.
Las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención pueden emplearse para diversos propósitos terapéuticos.
En una modalidad preferida, un anticuerpo que comprende las
inmunoglobulinas modificadas se administra a un paciente para
tratar un desorden específico. Un "paciente" para los
propósitos de la presente invención incluye tanto a humanos como a
otros animales, preferiblemente mamíferos y más preferiblemente
humanos. Aquí se entiende por "desorden específico" un
desorden que puede mejorar por la administración de una composición
farmacéutica que comprende una inmunoglobulina modificada de la
presente invención.
En una modalidad, una inmunoglobulina modificada
de acuerdo con la presente invención es el único agente
terapéuticamente activo administrado a un paciente. De forma
alternativa, la inmunoglobulina modificada de acuerdo con la
presente invención se administra en combinación con uno o varios
agentes terapéuticos, incluyendo pero sin limitarse a ellos,
agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, citoquinas, agentes
inhibidores del crecimiento, agentes
anti-hormonales, inhibidores de quinasa, agentes
anti-angiogénicos, cardioprotectores u otros
agentes terapéuticos. Las inmunoglobulinas modificadas pueden
administrarse de forma concomitante con uno e varios regímenes
terapéuticos. Por ejemplo, una variante del anticuerpo de la
presente invención puede administrarse al paciente junto con
quimioterapia, con terapia de radiación o con ambas terapias de
quimioterapia y radiación. En una modalidad, las inmunoglobulinas
modificadas de la presente invención pueden administrarse junto con
uno o varios anticuerpos, que pueden o no comprender una variante
del anticuerpo de la presente invención. De acuerdo con otra
modalidad de la invención, las inmunoglobulinas modificadas de la
presente invención y uno o varias terapias anticáncer distintas se
emplean para tratar células cancerosas ex vivo. Se contempla
que dicho tratamiento ex vivo pueda ser de utilidad en el
trasplante de médula ósea y particularmente en trasplante de médula
ósea autólogo. Por supuesto, se contempla que los anticuerpos de la
invención se puedan emplear en combinación con aún otras técnicas
terapéuticas, como la
cirugía.
cirugía.
Una variedad de otros agentes terapéuticos se
puede usar para la administración con las inmunoglobulinas
modificadas de la presente invención. En una modalidad, la
inmunoglobulina modificada se administra con un agente
anti-angiogénico, que es un compuesto que bloquea o
interfiere en cierto grado en el desarrollo de los vasos
sanguíneos. El factor anti-angiogénico, por ejemplo,
puede ser una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo un
anticuerpo, fusión Fc, o citoquina, que se une a un factor de
crecimiento o receptor del factor de crecimiento involucrado en la
estimulación de la angiogénesis. El factor
anti-angiogénico preferido aquí es un anticuerpo
que se une al Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF, del
inglés Vascular Endothelial Growth Factor). En una modalidad
alternativa, la inmunoglobulina modificada se administra con un
agente terapéutico que induce o mejora la respuesta inmune
adaptativa, por ejemplo, un anticuerpo que hace diana en
CTLA-4. En una modalidad alternativa, la
inmunoglobulina modificada se administra con un inhibidor de
tirosina quinasa, que es una molécula que inhibe en cierta medida
la actividad tirosina quinasa de una tirosina quinasa. En una
modalidad alternativa, las inmunoglobulinas modificadas de la
presente invención se administran con una citoquina. Por
"citoquina", tal y como se emplea aquí, se entiende un término
genérico para las proteínas liberadas por una población celular que
actúa en otra célula como mediadores intercelulares, incluyendo las
quimioquinas.
Se contemplan composiciones farmacéuticas donde
se formulan las inmunoglobulinas modificadas de la presente
invención y uno o varios agentes terapéuticamente activos. Las
formulaciones de las variantes de anticuerpo de la presente
invención se preparan para su almacenamiento mezclando dicha
inmunoglobulina que tiene el grado deseado de pureza, con
portadores, excipientes o estabilizantes opcionales
farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences
16th edition, Osol, A. Ed., 1980), en forma de formulaciones
liofilizadas o soluciones acuosas. Las formulaciones que se tienen
que usar para la administración in vivo son preferiblemente
estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de
membranas de filtración estériles u otros métodos. Las
inmunoglobulinas modificadas y otros agentes terapéuticamente
activos aquí descritos pueden formularse también como
inmunoliposomas y/o atrapados en microcápsulas.
La administración de la composición farmacéutica
que comprende una inmunoglobulina modificada de la presente
invención, preferiblemente en forma de una solución acuosa estéril,
puede realizarse en una variedad de formas, incluyendo pero sin
limitarse a ellas, oralmente, subcutáneamente, intravenosamente,
intranasalmente, intraóticamente, transdérmicamente, tópicamente
(por ejemplo geles, pomadas, lociones, cremas, etc.), en forma
intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar (por ejemplo, la
tecnología inhalable AERx^{TM} comercialmente disponible de
Aradigm, o el sistema de suministro pulmonar Inhance^{TM}
comercialmente disponible en Inhale Therapeutics), en forma
vaginal, parenteral, rectal o intraocular.
Como se emplea aquí, la expresión "se une
específicamente" se refiere a una reacción de enlace que es
determinante del ligando afín de interés en una población
heterogénea de moléculas. De esta manera, bajo las condiciones
designadas (por ejemplo, las condiciones de inmunoensayo en el caso
de una inmunoglobulina), el anticuerpo especificado se une a su
"diana" particular y no se une en cantidad significativa a
otras moléculas presentes en una muestra. De forma comparable a las
CDRs de anticuerpos, las regiones modificadas del bucle estructural
son porciones de proteínas de unión de antígeno o de unión de
molécula y no son antígenos como tales.
El término "sistema de expresión" se
refiere a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia
de codificación deseada y secuencias control en enlace operativo, de
manera que los huéspedes transformados o transfectados con estas
secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Para
efectuar la transformación, el sistema de expresión puede estar
incluido en un vector; sin embargo, el ADN relevante también puede
estar integrado en el cromosoma huésped.
El sistema de expresión puede comprender un
vector. Cualquier vector de expresión conocido en la técnica puede
ser apropiado para este propósito.
La inmunoglobulina modificada se expresa
preferiblemente en un huésped, preferiblemente en una célula
bacteriana, de levadura, de planta, en una célula de animal o en una
planta o en un animal.
Se puede emplear una amplia variedad de células
huésped apropiadas para expresar la inmunoglobulina modificada,
incluyendo pero no limitadas a células de mamíferos (células de
animales), células de plantas, bacterias (por ejemplo, Bacillus
subtilis, Escherichia coli), células de insecto y levadura (por
ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae). Por
ejemplo, una variedad de líneas celulares que pueden ser de
utilidad en la presente invención se describe en el catálogo de
líneas celulares ATCC, disponible en American Type Culture
Collection. Además, también pueden emplearse plantas y animales como
huéspedes para la expresión de la inmunoglobulina de acuerdo con la
presente invención. La expresión así como los vectores o casetes de
transfección pueden seleccionares de acuerdo con el huésped
empleado.
Por supuesto también se pueden emplear sistemas
de expresión de proteínas libres de células o acelulares. Las
plataformas de expresión de proteínas de transcripción/traducción
in vitro, que producen cantidades suficientes de proteínas,
ofrecen muchas ventajas de una expresión de proteínas libre de
células, eliminando la necesidad de etapas laboriosas secuencia
adelante y atrás (por ejemplo, transformación de célula huésped,
cultivo, o lisis) típicamente asociadas con sistemas de expresión
basados en células.
\newpage
La inmunoglobulina o una preparación
farmacéutica de la misma que comprende al menos una modificación en
una región del bucle estructural de la inmunoglobulina y que
determina la unión de dicha inmunoglobulina a un epítopo de un
antígeno, en que la inmunoglobulina no modificada no se une
significativamente a dicho epítopo, se puede fabricar como
sigue:
- se proporciona un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que comprende al menos una región del
bucle,
- se modifica al menos un residuo nucleótido de
al menos de una de dichas regiones del bucle,
- se transfiere dicho ácido nucleico modificado
a un sistema de expresión,
- se expresa dicha inmunoglobulina
modificada,
- la inmunoglobulina modificada expresada se
pone en contacto con un epítopo,
- se determina si dicha inmunoglobulina
modificada se une a dicho epítopo, y
- se proporciona el enlace de la inmunoglobulina
modificada a dicho epítopo y opcionalmente se acaba en una
preparación farmacéutica.
En particular, una inmunoglobulina
multi-específica que se une de forma específica al
menos a una primera molécula o a una preparación farmacéutica de la
misma que comprende al menos una modificación en al menos una
región del bucle estructural de dicha inmunoglobulina y determina el
enlace específico de al menos una región del bucle a al menos una
segunda molécula seleccionada del grupo que consiste en alérgenos,
antígenos asociados a tumores, auto-antígenos,
enzimas, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos
protozoarios y antígenos virales, donde la inmunoglobulina que
contiene una región del bucle estructural no se une específicamente
a al menos la segunda molécula como mínimo, se puede fabricar como
sigue:
- se proporciona un ácido nucleico que codifica
una inmunoglobulina que se une específicamente al menos a una
primera molécula que comprende al menos una región del bucle
estructural,
- se modifica al menos un residuo nucleótido de
al menos de una de dichas regiones del bucle codificada por dicho
ácido nucleico,
- se transfiere dicho ácido nucleico modificado
a un sistema de expresión,
- se expresa dicha inmunoglobulina
modificada,
- la inmunoglobulina modificada expresada se
pone en contacto con al menos una segunda molécula, y
- se determina si dicha inmunoglobulina
modificada se une específicamente a la segunda molécula y
- se proporciona el enlace de la inmunoglobulina
modificada al menos a dicha segunda molécula y opcionalmente se
acaba en una preparación farmacéutica.
Se prefiere el diseño de más de una
especificidad en un miembro de un par de enlace específico (Kufer
et al. (2004) Trends in Biotechnology vol. 22 páginas
238-244).
Se han realizado numerosos intentos de producir
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoclonales
multiespecíficos, por ejemplo biespecíficos. Un problema en la
producción de anticuerpos biespecíficos hechos de dos cadenas de
polipéptido diferentes (cadena pesada y ligera) es la necesidad de
expresar 4 cadenas diferentes (dos cadenas pesadas y dos cadenas
ligeras) en una célula, dando como resultado numerosas combinaciones
diferentes de moléculas que se tienen que separar de la molécula
biespecífica deseada en la mezcla. Debido a su similitud, la
separación de estas moléculas es difícil y costosa. Se han empleado
numerosas técnicas para reducir al mínimo la ocurrencia de estos
apareamientos indeseados (Carter (2001) Journal of Immunological
Methods, vol 248, páginas 7-15).
Una solución al problema es la producción de una
cadena de polipéptido con dos especificidades, como por ejemplo dos
scFvs enlazados entre sí o la producción de los denominados
diacuerpos. Estas moléculas han demostrado estar muy lejos del
pliegue de una molécula natural y son notoriamente difíciles de
producir (LeGall et al. (2004) Protein Engineering, Design
& Selection vol 17 páginas 357-366).
Otro problema del presente desarrollo de
anticuerpos biespecíficos es el hecho de que incluso si los
anticuerpos precursores se unen bivalentemente a su socio de enlace
respectivo (p.ej. IgG), el anticuerpo biespecífico resultante es
monovalente para cada socio de enlace respectivo.
Las moléculas multiespecíficas preferidas de la
presente invención resuelven estos problemas:
Es posible la expresión de una molécula
biespecífica como cadena polipeptídica (un dominio Ig modificado
con dos especificidades de unión, ver sección de ejemplos) que es
más fácil de lograr que la expresión de las dos cadenas
polipeptídicas de anticuerpo (Cabilly et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984)).
También se puede elaborar como una molécula tipo
anticuerpo (es decir, hecha de dos cadenas de polipéptido) debido
al hecho que la segunda especificidad se ubica en la parte no
variable de la molécula; no hay necesidad de dos cadenas pesadas o
ligeras diferentes. De esta manera, no hay posibilidad de un
apareamiento erróneo de las dos cadenas.
Un anticuerpo de la presente invención puede
consistir en una cadena pesada y una cadena ligera, que forman en
conjunto una región variable que se une a un socio de enlace
específico, pudiendo estar formada la segunda especificidad por un
bucle modificado de cualquiera de los bucles estructurales ya sea de
la cadena pesada o de la cadena ligera. El sitio de unión también
puede estar formado por más de un bucle no-CDR que
puede ser estructuralmente un vecino (ya sea en la cadena pesada o
en la cadena ligera o en ambas cadenas).
El anticuerpo o derivado modificado puede ser un
anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo (p.ej. Fab,
CH1-CH2, CH2-CH3).
Se puede unir de forma mono o multivalente a los
socios de enlace o incluso con diferente valencia a socios de
enlace diferentes, dependiendo del diseño.
Como hay numerosos bucles diferentes disponibles
para la selección y el diseño de un sitio de enlace específico en
las regiones no-CDR de las cadenas pesadas y
ligeras, es posible diseñar derivados de anticuerpo con incluso más
de dos especificidades sin los problemas anteriormente
mencionados.
Los dominios de enlace específico dentro de una
cadena de polipéptido se pueden conectar con o sin un péptido
enlazador.
Algunas clases de anticuerpo pueden considerarse
multiespecíficas, en particular biespecíficas, por naturaleza: se
unen a un antígeno (que típicamente es, por ejemplo, una estructura
extraña o una estructura asociada con cáncer) con la región
variable y se unen a moléculas efectoras Fc con la parte Fc (por
ejemplo, recepLores Fc en diversas células inmunes o una proteína
de complemento) permitiendo así efectos tales como ADCC, ADCP o
CDC.
Las moléculas Fc efectoras se unen por la parte
Fc de una molécula de inmunoglobulina (para IgG1 consiste en los
dominios CH2 y CH3) y se han descrito numerosos métodos para
optimizar la función efectora al mejorar el enlace de la parte Fc
de una molécula de anticuerpo ya sea por técnicas de glicoingeniería
(patente de los E.U.A. nº 6,602,684) o por ingeniería de proteínas
o bien directamente en Fc (US 2005/0054832), o indirectamente por
ingeniería fuera de Fc (US 2005/02444403). Ambos, la unión de la
región Fc al receptor Fc y/o la unión a las proteínas de
complemento, tales como Cql, se ha alterado por estas técnicas.
Usualmente, se busca mejorar la afinidad de unión a estas moléculas
Fc efectoras, ya que esto se correlaciona con funciones efectoras
mejoradas.
Con la presente invención, es posible diseñar el
enlace del anticuerpo a moléculas Fc efectoras fuera de la región
de enlace Fc natural. Los bucles modificados en los dominios de
anticuerpo diferentes a los bucles involucrados en la unión de
moléculas Fc efectoras "naturales" se pueden seleccionar a
partir de una biblioteca o se pueden diseñar para unirse a una o
varias moléculas efectoras Fc. Un anticuerpo con dichos sitios de
unión adicionales a molécula efectora Fc tendrá una avidez más
fuerte a cierta molécula efectora o célula efectora que presenta
una molécula efectora Fc y por lo tanto pueden tener un efecto aún
más fuerte que los anticuerpos de glico-ingeniería
o regiones Fc mejoradas de otra forma. Sin embargo, para ciertas
modalidades de la presente invención, las características efectoras
de un anticuerpo determinado que se tienen que modificar no deben
cambiarse directamente sino que deben permanecer sin ser afectadas
por la modificación en el bucle estructural de acuerdo con la
presente invención.
Los fragmentos de anticuerpo tienen ciertas
ventajas en comparación con los anticuerpos enteros. Los fragmentos
usualmente tienen buenas propiedades de biodistribución y se pueden
producir más fácilmente. Sin embargo, la mayoría de los diseños de
fragmentos de anticuerpo carecen de funciones efectoras y tienen una
vida media corta in vivo (Holliger P, et al. Nat.
Biotechnol.(2005) 23:1126-36).
Ni los dominios CH1 ni C\kappa o C\lambda
median funciones efectoras, lo que es la razón por la que Fabs no
muestra ADCC, ADCP o CDC. El documento WO 02/44215 describe
moléculas de enlace que consisten en el sitio de unión de antígeno
de un anticuerpo y moléculas efectoras Fc de unión a péptido. De
esta manera, se puede construir un fragmento de anticuerpo que
presenta funciones efectoras. El péptido se incorpora en la
molécula de enlace en una posición que no destruye la unión a
antígeno ni la capacidad del péptido para unirse a una molécula
efectora Fc.
Sin embargo, de acuerdo con la presente
invención la unión a moléculas efectoras Fc puede realizarse con
dominios de inmunoglobulina modificados que se han seleccionado para
el enlace de molécula efectoras Fc de bibliotecas de secuencias de
bucle aleatorio dentro de un patrón fijado de un dominio de
inmunoglobulina. Por lo tanto, es posible seleccionar secuencias de
bucle específicas que no se unirán a las moléculas efectoras Fc
fuera del patrón del dominio Ig. Por lo tanto, los polipéptidos que
resultan de la presente invención pueden consistir preferiblemente
en más de 100 aminoácidos.
A fin de seleccionar la función efectora
potencial de estos dominios de acuerdo con la presente invención,
pueden seleccionarse bibliotecas de dominios mutantes CH2, C\kappa
o C\lambda para unirse a receptores Fc y/o factores de
complemento tales como C1q.
A fin de incrementar la vida media in
vivo de una molécula que contiene o consiste en este dominio
(por ejemplo CH1, CH2, CH3, CH4, C\kappa o C\lambda) se puede
seleccionar la unión a FcRn con bibliotecas de dominios mutantes,
por ejemplo CH1, CH2, CH3, CH4, C\kappa o C\lambda, de acuerdo
con la presente invención.
Los receptores FcRn para selección pueden
proporcionarse ya sea en la superficie de las células que expresan
naturalmente los receptores respectivos o por expresión y
purificación de la parte extracelular del receptor respectivo. Para
el propósito de esta invención, una primera criba en FcRn puede
seleccionar dominios mutantes que además pueden probarse in
vitro y se pueden seguir caracterizando en experimentos FACS por
unión a células que expresan el receptor FcRn. Además, se puede
seguir caracterizando por clasificación del rango de afinidad del
enlace con diversos FcRn recombinantes, isoformas y alotipos, por
ejemplo, con técnicas de resonancia de plasmón de superficie.
La inmunoglobulina de la presente invención es
de origen humano.
Como la inmunoglobulina modificada se puede
emplear para diversos propósitos, en particular en composiciones
farmacéuticas, la inmunoglobulina es preferiblemente de origen
humano. Por supuesto, la inmunoglobulina modificada también puede
ser una inmunoglobulina quimérica.
De acuerdo con otra modalidad preferida de la
presente invención, la inmunoglobulina humana deriva de IgG, en
particular de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
La inmunoglobulina modificada puede derivarse de
una de las clases de inmunoglobulina identificadas
anteriormente.
La inmunoglobulina comprende preferiblemente una
cadena pesada y/o ligera de la inmunoglobulina o una parte de la
misma.
La inmunoglobulina modificada puede comprender
una cadena pesada y/o ligera, al menos un dominio variable y/o
constante.
La inmunoglobulina de acuerdo con la presente
invención comprende al menos un dominio constante de la
inmunoglobulina o una parte de la misma incluyendo un
minidominio.
Un dominio constante es una unidad de pliegue de
la inmunoglobulina de la parte constante de una molécula de
inmunoglobulina, también referida como un dominio de la región
constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3, CH4, Ck, Cl).
Una inmunoglobulina preferida de acuerdo con la
invención consiste en un dominio constante que se selecciona del
grupo que consiste en CH1, CH2, CH3, CH4, Igk-C,
Igl-C, Igl-C, o una parte de la
misma que incluye un minidominio, con al menos una región bucle, y
se caracteriza porque al menos una región del bucle comprende al
menos una modificación de aminoácido que forma al menos una región
del bucle modificada, en la que al menos dicha región modificada
del bucle se une específicamente al menos a un epítopo de un
antígeno.
El dominio constante se selecciona del grupo de
los dominios CH1, CH2, CH3 o CH4, el dominio CL, el dominio
C\kappa, C\lambda, un fragmento Fab o un fragmento Fc y sus
combinaciones.
La inmunoglobulina modificada de acuerdo con la
presente puede comprender uno o varios dominios constantes (por
ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, diez dominios). Si
más de un dominio está presente en la inmunoglobulina modificada,
estos dominios pueden ser del mismo tipo o de tipos diferentes (por
ejemplo, CH1-CH1-CH2,
CH3-CH3). Por supuesto el orden de los dominios
simples también puede ser de cualquier tipo (por ejemplo,
CH1-CH3-CH2,
CH4-CH1-CH3-CH2).
Toda la numeración de las secuencias de
aminoácidos de las inmunoglobulinas sigue el esquema de numeración
IMGT (IMGT, the international ImMunoGeneTics information
system@imgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc
et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212;
Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28:
219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids
Res. 29: 207-209; Lefranc. et al., 2003,
Nucleic Acids Res. 307-310; Lefranc et al.,
2005, Dev Comp Immunol 29:185-203).
De acuerdo con otra modalidad preferida de la
presente invención las regiones modificadas del bucle de CH1, CH2,
CH3 y CH4 comprenden los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a
39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los
aminoácidos 89 a 103 y los aminoácidos 106 a 117.
Las regiones del bucle estructural de
Igk-C y Igl-C de origen humano
comprenden preferiblemente los aminoácidos 8 a 18, los aminoácidos
27 a 35, los aminoácidos 42 a 78, los aminoácidos 83 a 85, los
aminoácidos 92 a 100, los aminoácidos 108 a 117 y los aminoácidos
123 a 126.
Las regiones del bucle estructural del dominio
variable de la inmunoglobulina de origen humano comprenden
preferiblemente los aminoácidos 8 a 20, los aminoácidos 44 a 50, los
aminoácidos 67 a 76 y los aminoácidos 89 a 101.
Las regiones de los aminoácidos anteriormente
identificadas de las inmunoglobulinas respectivas comprenden las
regiones del bucle que se tienen que modificar.
La unión específica de la inmunoglobulina
modificada a la molécula se determina mediante un ensayo de unión
seleccionado del grupo que consiste en ensayos inmunológicos,
preferiblemente ensayos inmunosorbente ligado a enzima (ELISA),
ensayos de resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de
resonancia magnética nuclear con diferencia de transferencia de
saturación, espectroscopia de resonancia magnética nuclear de
transferencia NOE (trNOE),
ensayos competitivos, ensayos de unión de tejido, ensayos de unión de células vivas y ensayos de extracto celular.
ensayos competitivos, ensayos de unión de tejido, ensayos de unión de células vivas y ensayos de extracto celular.
Los ensayos de unión se pueden llevar a cabo
usando una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo
pero no limitados a métodos basados en FRET (Transferencia de
energía de resonancia-fluorescencia, del inglés
Fluorescente Resonante Energy Transfer) y BRET (Transferencia de
energía de resonancia-bioluminiscencia, del inglés
Bioluminescence Resonance Energy Transfer), AlphaScreen.TM. (Ensayo
homogéneo de proximidad luminiscente amplificada), ensayo de
proximidad-escintilación, ELISA (Ensayo
inmunosorbente ligado a enzima SPR (Resonancia de plasmón
superficial, del inglés Surface Plasmon Resonance), también conocida
como BIACORE.RTM.), calorimetría de titulación isotérmica,
calorimetría de cribado diferencial, electroforesis en gel y
cromatografía incluyendo gel filtración. Éstos y otros métodos
pueden aprovechar varios socios de fusión o etiqueta.
La inmunoglobulina modificada se conjuga
preferiblemente con una etiqueta seleccionada del grupo que
consiste en moléculas orgánicas, etiquetas de enzimas, etiquetas
radioactivas, etiquetas de color, etiquetas fluorescentes,
etiquetas cromogénicas, etiquetas luminiscentes, haptenos,
digoxigenina, biotina, complejos metálicos, metales, oro coloidal y
sus mezclas.
La inmunoglobulina modificada puede conjugarse
con otras moléculas que permiten la detección simple de dicho
conjugado, por ejemplo, en ensayos de unión (por ejemplo, ELISA) y
estudios de unión.
Según una modalidad particularmente preferida de
la presente invención la inmunoglobulina consiste en un dominio
constante seleccionado del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3, CH4,
Igk-C, Igl-C, o una parte de los
mismos incluyendo minidominios, o combinaciones de los mismos, con
al menos una región del bucle, caracterizado porque al menos una
región del bucle comprende al menos una modificación del aminoácido
que forma al menos una región del bucle modificada, en la que al
menos dicha región del bucle modificada se une específicamente al
menos a un epítopo de un antígeno.
Se prefiere combinar molecularmente al menos un
dominio del anticuerpo modificado (= enlace al socio específico
mediante las secuencias no variables o el bucle estructural) con al
menos otra molécula de enlace que puede ser un anticuerpo, un
fragmento de anticuerpo, un receptor soluble, un ligando u otro
dominio de anticuerpo modificado.
La molécula se selecciona del grupo que consiste
en moléculas proteináceas, ácidos nucleicos y carbohidratos.
Las regiones del bucle de las inmunoglobulinas
modificadas pueden ligarse específicamente a cualquier tipo de
moléculas de enlace, en particular a moléculas proteináceas,
proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos,
carbohidratos, lípidos, pequeñas moléculas orgánicas, moléculas
inorgánicas. Por supuesto, las inmunoglobulinas modificadas pueden
comprender al menos dos regiones del bucle, de manera que cada una
de las regiones del bucle se puede unir específicamente a otras
moléculas o epítopos.
De acuerdo con una modalidad preferida de la
presente invención el enlace de la molécula con la región
modificada del bucle estructural se selecciona del grupo que
consiste en antígenos asociados con tumor, en particular EpCAM,
glicoproteína-72 asociada con tumor
(TAG-72), el antígeno asociado con tumor CA 125, el
antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA, del inglés
Prostate specific membrane antigen), antígeno asociado con melanoma
de alto peso molecular (HMW-MAA, del inglés High
molecular weight melanoma-associated antigen),
antígeno asociado con tumor que expresa carbohidratos relacionado
con Lewis Y, antígeno carcinoembriónico (CEA), CEACAM5, HMFG PEM,
mucina MUC1, MUC18 y antígeno asociado con tumor de citoqueratina,
antígenos bacterianos, antígenos virales, alérgenos, fluoresceína,
lisozima, receptor 9 tipo toll, eritropoyetina, CD2, CD3, CD3E,
CD4, CD11, CD11a, CD14, CD18, CDI9, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28,
CD29, CD30, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54,
CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R,
IL-2, IL-2R, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-6R,
IL-8, IL-12, IL-15,
IL-18, IL-23, interferón alfa,
interferón beta, interferón gama; TNF-alfa,
TNFbeta2, TNF.alfa, TNFalfabeta, TNF-R1,
TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL,
TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, receptor
TRAIL-1, receptor de adenosina Al, receptor de
Linfotoxina Beta, TACI, BAFF-R, EPO;
LFA-3, ICAM-1,
ICAM-3, integrina beta1, integrina beta2, integrina
alfa4/beta7, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4,
integrina alfa5, integrina alfa6, integrina alfav, integrina
alfaVbeta3, FCFR-3, factor de crecimiento de
queratinocitos, VLA-1, VLA-4,
L-selectina, anti-Id,
E-selectina, HLA, HLA-DR,
CTLA-4, receptor de células T,
B7-1, B7-2, VNRintegrina, TGFbeta1,
TGEbeta2, eotaxina 1, Blas (estimulador de
linfocito-B), complemento C5, IgE, factor VII,
CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu
(ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4
(ErbB4), factor tisular, VEGF, VEG-FR, receptor de
endotelina, VLA-4, carbohidratos tales como
antígenos de grupo sanguíneo y carbohidratos relacionados,
glicosilación Galili, gastrina, receptores de gastrina,
carbohidratos asociados con tumor, hapteno NP-cap o
NIP-cap, receptor de celulas T alfa/beta,
E-selectina, digoxina, fosfatasa alcalina
placentaria (PLAP) y fosfatasa alcalina testicular tipo PLAP,
receptor de transferrina, heparanasa I, miosina cardiaca humana,
glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), glicoproteína de la cubierta gH
del citomegalovirus humano (HCMV), HIV gp120, HCMV, Virus sincitial
respiratorio RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrina, Hep B gp120, CMV,
gpIIbIIIa, bucle HIV IIIB gp120 V3, virus sincitial respiratorio
(RSV) Fgp, glicoproteína gD del virus del Herpes simplex (HSV),
glicoproteína HSV gB, glicoproteína de la cubierta HCMV gB, toxina
Clostridium perfringens y sus fragmentos.
La inmunoglobulina modificada de acuerdo con la
presente invención se puede unir preferiblemente a una de las
moléculas descritas anteriormente. Estas moléculas comprenden
también alérgenos.
De acuerdo con otra modalidad preferida de la
presente invención se modifican los residuos aminoácido de las
posiciones 15 a 17, 29 a 34, 85.4 a 85.3, 92 a 94, 97 a 98 y/o 108 a
110 de CH3.
La modificación de la inmunoglobulina de acuerdo
con la presente invención es preferiblemente una deleción, una
sustitución o una inserción.
De acuerdo con la presente invención se eliminan
al menos 1, preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y
15 aminoácidos, substituyendo con otros aminoácidos (también con
aminoácidos modificados) o se insertan en la región del bucle de la
inmunoglobulina. Sin embargo, el número máximo de aminoácidos
insertados en la región del bucle de una inmunoglobulina no puede
exceder el número de 30, preferiblemente 25, más preferiblemente 20
aminoácidos. La sustitución y la inserción de los aminoácidos se
realiza preferiblemente de forma aleatoria por métodos conocidos en
la técnica y como se describe en la presente solicitud de
patente.
La inmunoglobulina de acuerdo con la invención
se corresponde con una modalidad específica caracterizada porque la
región CH3 comprende SEC ID Nº. 16 o SEC ID Nº. 18, cuando EpCam se
une a dicha inmunoglobulina, SEC ID Nº. 20, cuando la fluoresceína
se une a la inmunoglobulina, SEC ID Nº. 22, 24, 26, 28, 30 a 32,
cuando la lisozima se une a dicha inmunoglobulina, SEC ID Nº. 34,
36, 38 o 40, cuando TLR9 se une a la inmunoglobulina, y SEC ID Nº.
42, cuando el lisozima y/o la eritropoyetina se unen a dicha
inmunoglobulina.
De acuerdo con una modalidad específica de la
invención la inmunoglobulina se caracteriza por comprender la SEC
ID nº 44 o SEC ID nº 46, cuando la lisozima y gp41 se unen a dicha
inmunoglobulina.
La inmunoglobulina modificada se conjuga
preferiblemente con una molécula etiqueta o reporter seleccionada
entre el grupo que consiste en moléculas orgánicas, etiquetas
enzimáticas, etiquetas radioactivas, etiquetas coloreadas,
etiquetas fluorescentes, etiquetas cromogénicas, etiquetas
luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complejos
metálicos, metales, oro coloidal y sus mezclas.
Las inmunoglobulinas modificadas conjugadas con
etiquetas como se especifica anteriormente, se pueden emplear, por
ejemplo, en métodos de diagnóstico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de una inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención
o que se obtiene por un método de acuerdo con la presente invención
para la preparación de una vacuna para la inmunización activa. De
esta manera, la inmunoglobulina se utiliza como una fármaco
antigénico para formular una vacuna o bien se utiliza para la
captura o pesca de estructuras antigénicas para el uso en la
formulación de una vacuna.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de una inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención
o que se puede obtener por un método de acuerdo con la presente
invención, para la preparación de una biblioteca de proteínas de
inmunoglobulinas.
La inmunoglobulina de la presente invención se
puede usar en un método para la unión y/o detección específica de
una molécula que comprende las etapas de:
(a) puesta en contacto de una inmunoglobulina
modificada de acuerdo con la presente invención o una
inmunoglobulina modificada que se puede obtener por un método de
acuerdo con la presente invención, con una muestra de ensayo que se
sospecha que contiene dicha molécula, y
(b) detección de la formación potencial de un
complejo específico molécula/inmunoglobulina.
La inmunoglobulina de la presente invención se
puede usar en un método para el aislamiento específico de una
molécula que comprende las etapas de:
(a) puesta en contacto de una inmunoglobulina
modificada de acuerdo con la presente invención o una
inmunoglobulina modificada que se puede obtener por un método de
acuerdo con la presente invención, con una muestra de ensayo que se
contiene dicha molécula, y
(b) separación del complejo específico
molécula/inmunoglobulina formado, y
(c) opcionalmente, aislamiento de la molécula de
dicho complejo.
Las inmunoglobulinas según la invención pueden
emplearse para aislar específicamente moléculas a partir de una
muestra. Si se emplean inmunoglobulinas multiespecíficas, puede
aislarse más de una molécula de una muestra. Es especialmente
ventajoso utilizar inmunoglobulinas modificadas en estos métodos,
porque permite, por ejemplo, generar una matriz con una superficie
homogénea con cantidades definidas de socios de unión (es decir,
inmunoglobulinas modificadas) inmovilizadas allí, que son capaces de
unirse a las moléculas que se tienen que aislar. En contraste a
ello, si se usan socios de enlace monoespecíficos no se puede
generar una matriz homogénea debido a que los socios de enlace
sencillos no se unen con la misma eficacia a la matriz.
La inmunoglobulina según la invención se puede
emplear en un método para hacer blanco a un compuesto con una
diana, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una inmunoglobulina
modificada de acuerdo con la presente invención o una
inmunoglobulina modificada que se puede obtener por un método de
acuerdo con la presente invención, capaz de unirse específicamente
a dicho compuesto,
(b) suministrar el complejo
compuesto/inmunoglobulina a la diana.
Las inmunoglobulinas modificadas de acuerdo con
la presente invención pueden emplearse para suministrar al menos un
compuesto ligado a las regiones CDRs y/o modificadas del bucle a una
diana. Estas inmunoglobulinas pueden emplearse para hacer diana en
sustancias terapéuticas en un sitio de acción preferido en el curso
del tratamiento de una enfermedad.
La inmunoglobulina según la presente invención o
que se puede obtener de acuerdo con la presente invención puede ser
parte de una biblioteca de proteínas.
Los métodos preferidos para construir dicha
biblioteca pueden encontrarse arriba y en los ejemplos. La
biblioteca de acuerdo con la presente invención puede emplearse para
identificar inmunoglobulinas que se unen a una molécula
distinta.
La biblioteca de proteínas que comprende una
inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención o que se puede
obtener por el método de acuerdo con la presente invención, se puede
usar para el diseño de derivados de inmunoglobulina.
Una inmunoglobulina existente se puede cambiar
para introducir sitios de unión de antígeno en cualquier dominio o
minidominio, usando una biblioteca de proteínas del dominio
respectivo de al menos 10, preferiblemente 100, más preferiblemente
1000, más preferiblemente 10000, más preferiblemente 100000, más
preferiblemente más de 1000000 dominios variantes, con al menos un
bucle modificado. Después la biblioteca se criba para la unión al
antígeno específico. Después de la caracterización molecular para
las propiedades deseadas, el dominio o minidominio seleccionado se
clona en la inmunoglobulina original mediante técnicas de ingeniería
genética, de tal manera que reemplaza la región de tipo salvaje.
De forma alternativa, sólo se puede cambiar la codificación de ADN
para los bucles o la codificación para los aminoácidos mutados para
obtener una inmunoglobulina con el sitio de unión adicional para el
antígeno específico.
La elección del sitio para el bucle estructural
anti-específico mutado depende de la estructura de
la inmunoglobulina original y del propósito del sitio de unión
adicional. Si, por ejemplo, la molécula original es una
inmunoglobulina completa que necesita tener insertado un sitio de
unión de antígeno adicional sin perturbación de la función
efectora, los bucles a modificar se seleccionarán a partir de
dominios distantes de CH2 y CH3, que son los socios de unión
naturales para las moléculas efectoras Fc. Si la inmunoglobulina
original es una Fab, es posible la modificación de bucles en
dominios constantes de las cadenas ligeras o las cadenas pesadas o
los dominios variables respectivos. Para generar una biblioteca se
pueden preparar bibliotecas de moléculas originales mutantes que
tienen mutaciones en uno o varios bucles estructurales de uno o
varios dominios. La selección con moléculas originales mutadas
completas puede tener ciertas ventajas, ya que la selección para la
unión de antígeno con un bucle estructural modificado proporcionará
las modificaciones estéricamente ventajosas si también se analizan
para las otras propiedades que deberá mostrar la inmunoglobulina
mutada.
El requerimiento de tamaño (es decir, el número
de variantes de proteínas) de una biblioteca de proteínas de un
dominio o un minidominio mutado o una molécula de fusión depende de
la tarea. En general, una biblioteca para generar un sitio de unión
de antígeno de novo requiere ser mayor que una biblioteca empleada
para modificar adicionalmente un sitio de unión de antígeno
diseñado ya existente, hecho de un bucle estructural modificado
(por ejemplo, para mejorar la afinidad o cambiar la especificidad
fina al antígeno).
La biblioteca de inmunoglobulinas o una
biblioteca de ácidos nucleicos comprende numerosas inmunoglobulinas,
por ejemplo un dominio constante, un minidominio y/o al menos una
región del bucle estructural contenida en un minidominio, o
moléculas de ácido nucleico que los codifican. La biblioteca
contiene miembros con diferentes modificaciones, en que la
pluralidad se define por las modificaciones en al menos una región
del bucle estructural. La biblioteca de ácidos nucleicos incluye
preferiblemente al menos 10 miembros diferentes (que dan como
resultado el intercambio de un aminoácido) y más preferiblemente
incluye al menos 100, más preferiblemente 1000 o 10000 miembros
diferentes (por ejemplo, diseñados por estrategias de aleatorización
o técnicas combinatorias). También son preferibles números de
miembros individuales incluso más diversificados, tales como al
menos 1000000 o al menos 10000000.
Dos dominios o minidominios diferentes
seleccionados a partir de al menos dos bibliotecas de acuerdo con
la invención se pueden usar en combinación a fin de generar
inmunoglobulinas multiespecíficas. Estas inmunoglobulinas
específicas seleccionadas se pueden combinar entre sí y con otras
moléculas, de forma similar a bloques de construcción, para diseñar
la disposición óptima de los dominios o minidominios para obtener
las propiedades deseadas.
Además, una o varias inmunoglobulinas
modificadas de acuerdo con la invención pueden introducirse en
varios o en todos los sitios diferentes de una proteína posible sin
destruir la estructura de la proteína. Mediante esta técnica de
"barajado de dominios" se crean nuevas bibliotecas que a su vez
pueden seleccionarse para las propiedades deseadas.
Una biblioteca puede contener inmunoglobulinas
de acuerdo con la invención, seleccionadas del grupo que consiste
en dominios de una inmunoglobulina, mini dominios o sus
derivados.
Una modalidad preferida de la presente invención
es una molécula de unión para un antígeno (molécula de unión de
antígeno) que comprende al menos un dominio de inmunoglobulina y una
región del bucle estructural que se modifica de acuerdo con la
presente invención para unir el antígeno, en que dicha molécula de
unión no comprende dominios variables de un anticuerpo. Puede
comprender otras partes utilizables para las actividades del
anticuerpo (por ejemplo, como regiones efectoras naturales o
modificadas (secuencias); sin embargo, carece de la región de unión
"natural" de anticuerpos, es decir, los dominios variables en
sus posiciones de origen natural. Estas moléculas de unión de
antígeno de acuerdo con la presente invención tienen las ventajas
descritas anteriormente para las presentes moléculas, aunque sin la
actividad de unión específica de los anticuerpos; sin embargo, con
una actividad de unión específica recientemente introducida en la
región del bucle estructural.
Preferiblemente, estas moléculas de unión de
antígeno de acuerdo con la presente invención comprenden CH1, CH2,
CH3, CH4, Igk-C, Igl-C y sus
combinaciones; dichas combinaciones comprenden al menos dos,
preferiblemente al menos cuatro, especialmente al menos seis
dominios constantes y al menos una región del bucle estructural
modificada de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente
estas regiones del bucle estructural se conectan mediante la región
del bucle estructural modificada de acuerdo con la presente
invención o bien mediante los bucles estructurales que están
presentes naturalmente presentes entre estos dos dominios
constantes. Una modalidad de estas moléculas de unión de antígeno
de acuerdo con la presente invención consiste de la región Fc de un
anticuerpo con al menos una modificación en un bucle estructural de
acuerdo con la presente invención. También para las moléculas de
unión de antígeno de acuerdo con la presente invención se prefiere
que los nuevos sitios de unión de antígeno en los bucles
estructurales se introduzcan por tecnologías de aleatorización, es
decir, intercambiando uno o varios residuos aminoácido del bucle
por técnicas de aleatorización o introduciendo insertos generados
aleatoriamente en dichos bucles estructurales. De forma alternativa
se prefiere el uso de enfoques combinatorios.
Una inmunoglobulina modificada puede tener un
sitio de unión de antígeno ajeno a la inmunoglobulina no modificada
e incorporado en uno o varios bucles estructurales. El término
"ajeno" significa que el sitio de unión de antígeno no se
forma naturalmente mediante la región específica de la
inmunoglobulina, y un socio de unión ajeno, pero no el socio de
unión natural de una inmunoglobulina, se une por el sitio de unión
del antígeno. Esto significa que un socio de unión como un receptor
Fc o un efector del sistema inmune, no se considera ligado por el
sitio de unión de antígeno ajeno a la inmunoglobulina no
modificada.
Preferiblemente, el antígeno se selecciona del
grupo que consiste en antígenos patógenos, antígenos asociados a
tumor, enzimas, substratos, autoantígenos, moléculas orgánicas o
alérgeno. Más preferiblemente, los antígenos se seleccionan del
grupo que consiste en antígenos virales, antígenos bacterianos o
antígenos de patógenos de eucariotas o fagos. Los antígenos virales
preferidos incluyen antígenos de los virus HAV, HBV, HCV, HIV I,
HIV II, Parvovirus, Gripe, HSV, Hepatitis, Flavivirus, virus del
Nilo Occidental, virus Ébola, virus pox, virus de la viruela, virus
del sarampión, virus del Herpes, Adenovirus, virus del Papiloma,
virus del Polioma, Parvovirus, Rinovirus, virus Coxsackie, virus de
la Polio, Ecovirus, virus de la Encefalitis Japonesa, virus del
Dengue, virus de la Encefalitis transportado por garrapatas, virus
de la fiebre amarilla, Coronavirus, virus sincitial respiratorio,
virus de la parainfluenza, virus de La Crosse, virus de Lassa,
virus de la Rabia, Rotavirus; los antígenos bacterianes preferidos
incluyen antígenos de Pseudomonas, Micobacterias, Estafilococos,
Salmonela, Meningococos, Borelia, Listeria, Neisseria, Clostridium,
Escherichia, Legionela, Bacilos, Lactobacilos, Estreptococos,
Enterococos, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Moraxella,
Brucella, Campylobacter, Cardiobacterium, Francisella,
Helicobacter, Haemophilus, Klebsiella, Shigella, Yersinia, Vibrio,
Chlamydia, Leptospira, Rickettsia, Micobacterias, Treponema,
Bartonella. Los antígenos eucarióticos preferidos de eucariotas
patógenas incluyen antígenos de Giardia, Toxoplasma, Cyclospora,
Cryptosporidiurn, Trichinella, Levaduras, Candida, Aspergillus,
Cryptococcus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides.
Las inmunoglobulinas preferidas de acuerdo con
la presente invención comprenden al menos dos sitios de unión de
antígeno, el primer sitio enlaza a un primer epítopo, el segundo
sitio enlaza a un segundo epítopo.
De acuerdo con una modalidad preferida, la
presente inmunoglobulina comprende al menos dos regiones del bucle,
la primera región del bucle une a un primer epítopo, y la segunda
región del bucle liga a un segundo epítopo. Tanto al menos la
primera como al menos la segunda región del bucle o ambas pueden
contener un bucle estructural. Las inmunoglobulinas de acuerdo con
la presente invención incluyen fragmentos de ellas conocidos en la
técnica que son funcionales, que contienen los elementos esenciales
de acuerdo con la presente invención: la región del bucle
estructural modificada de acuerdo con la presente invención.
Preferiblemente, la inmunoglobulina de acuerdo
con la presente invención está compuesta de al menos dos dominios
de inmunoglobulina, o una parte de los mismos que incluye un
minidominio y cada dominio contiene al menos un sitio de unión de
antígeno.
Una inmunoglobulina de acuerdo con la invención
puede comprender al menos un dominio de la región constante o una
parte del mismo que incluye un minidominio. De esta manera, un
dominio variable que, por ejemplo, se modifica en la región
C-terminal o el dominio variable enlazado a una
región CH1 modificada, por ejemplo un minidominio CH1 modificado,
es una de las modalidades preferidas.
La inmunoglobulina preferida de acuerdo con la
invención comprende un dominio que tiene al menos un 50% de
homología con el dominio no modificado.
El término "homología" indica que los
polipéptidos tienen los mismos residuos o residuos conservados en
una posición correspondiente en su estructura primaria, secundaria o
terciaria. El término también se extiende a das o más secuencias de
nucleótidos que codifican los polipéptidos homólogos.
"Dominio de inmunoglobulinas homólogo"
significa un dominio de inmunoglobulina de acuerdo con la invención
que tiene al menos aproximadamente un 50% de identidad de secuencia
de aminoácidos con respecto a una secuencia de dominio de
inmunoglobulina de secuencia nativa de longitud completa o cualquier
otro fragmento de una secuencia de dominio de inmunoglobulina de
longitud completa como se describe aquí. Preferiblemente, un dominio
de inmunoglobulina homólogo tendrá al menos aproximadamente un 50%
de identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos
aproximadamente un 55% de identidad de secuencia de aminoácidos, más
preferiblemente al menos aproximadamente un 60% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 65% de identidad de secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente al menos aproximadamente un 70% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 75% de identidad de secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, más
preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos
respecto a una secuencia de dominio de inmunoglobulina nativa, o
cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia
de dominio de inmunoglobulina de longitud completa como se describe
aquí.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de
aminoácidos" con respecto a las secuencias de dominio de
inmunoglobulina aquí identificadas, se define como el porcentaje de
residuos aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a
los residuos aminoácido en la secuencia de dominio de
inmunoglobulina específica, después de alinear la secuencia e
introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo
porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna
substitución conservadora como parte de la identidad de la
secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el
porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede
lograrse de diversas formas que están dentro de la destreza en la
técnica, por ejemplo, utilizando programas informáticos disponibles
para el público, tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o
Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar
parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo
cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento a
lo largo de toda la longitud de las secuencias que se comparan.
Los valores de % de identidad de secuencia de
aminoácidos se pueden obtener como se describe a continuación al
utilizar el programa informático
WU-BLAST-2 (Altschul et al.,
Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La
mayoría de los parámetros de búsqueda de
WU-BLAST-2 se ajustan a los valores
predefinidos. Aquellos valores no ajustados a los valores
predefinidos, es decir, los parámetros ajustables, se definen con
los valores siguientes: overlap span=l, overlap fraction=0,125,
Word threshold (T)=11, y scoring matrix=BLOSUM62. Cuando se emplea
WU-BLAST-2, se determina un valor de
% de identidad de secuencia de aminoácidos al dividir (a) el número
de residuos aminoácidos idénticos que se corresponden con la
secuencia de aminoácidos del dominio de inmunoglobulina de interés
que tiene una secuencia derivada del dominio de inmunoglobulina
nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es
decir, la secuencia frente a la que se compara el dominio de
inmunoglobulina de interés que puede ser el dominio de
inmunoglobulina no modificado) como se determina por
WU-BLAST-2 por (b) el número total
de residuos aminoácido de las partes no aleatorias del dominio de la
inmunoglobulina de interés. Por ejemplo, en la declaración "un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene
al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos frente a la
secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la
secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de
aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del dominio de
inmunoglobulina de interés.
La inmunoglobulina de acuerdo con la presente
invención puede emplearse para cualquier propósito conocido en la
técnica para inmunoglobulinas, pero también permite aplicaciones que
dependen de la combinación de especificidades introducidas por la
presente invención. De acuerdo con esto, las inmunoglobulinas según
la presente invención se emplean preferiblemente para uso
terapéutico y preventivo (por ejemplo, como inmunoterapia activa o
pasiva); para uso preparativo y analítico y para uso
diagnóstico.
La inmunoglobulina de la presente invención se
puede usar en un kit de socios de unión que contiene
(a) una inmunoglobulina modificada que tiene un
sitio de unión de antígeno ajeno a la inmunoglobulina incorporada
en uno o varios bucles estructurales, y
(b) una molécula de unión que contiene un
epítopo de dicho antígeno.
Una molécula de unión de este kit de acuerdo con
la presente invención se puede emplear para identificar la
especificidad de la inmunoglobulina modificada de acuerdo con la
presente invención. Al utilizar la molécula de unión de este kit de
acuerdo con la presente invención, se puede determinar la potencia
de las inmunoglobulinas modificadas de acuerdo con la presente
invención.
La potencia como aquí se define, es la propiedad
de enlace de la molécula modificada a su antígeno. El enlace puede
determinarse cuantitativa y/o cualitativamente en términos de
especificidad y/o afinidad y/o avidez, como se emplea para
propósitos de control de calidad.
Además, la molécula de unión de un kit de
acuerdo con la presente invención puede emplearse para seleccionar
la inmunoglobulina modificada de acuerdo con la presente invención a
partir de una biblioteca que consiste en al menos 10,
preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 1000, más
preferiblemente al menos 10000, en especial al menos 100000
inmunoglobulinas con diferentes modificaciones en los bucles
estructurales.
De acuerdo con la presente invención, una de las
características clave de la presente invención es que el diseño de
los dominios de inmunoglobulina se lleva a cabo en regiones que
normalmente no están involucradas en la unión de antígeno, en otras
palabras, en regiones distintas de los CDRs de un anticuerpo. Se
observó que el pliegue específico de dominios de inmunoglobulina
permite la introducción de mutaciones aleatorias en regiones que
estructuralmente son análogas a los CDRs pero diferentes en la
posición en la secuencia. Las regiones identificadas por la
presente invención son, como los CDRs, regiones del bucle que
conectan las hebras beta del pliegue de la inmunoglobulina.
Más específicamente, aquí se describe que al
introducir mutaciones aleatorias en los bucles que conectan las
hebras beta A-B y E-F de un dominio
IgG1 CH3 humano, se seleccionaron dominios CH3 mutados que se unen
específicamente a un péptido 9 receptor tipo Toll
(TLR-9) o a una lisozima de huevo de gallina, que
son un péptido y una proteína respectivamente que normalmente no
son reconocidos y unidos por dominios CH3 humanos de IgGL. Las
mutaciones introducidas por nosotros incluyen mutaciones en las que
los residuos aminoácidos seleccionados en la secuencia salvaje se
reemplazaron por residuos seleccionados aleatoriamente, y también
incluyen inserciones de residuos aminoácido extra en los bucles
anteriormente mencionados.
Por analogía los dominios de inmunoglobulina de
cualquier clase de inmunoglobulinas y de inmunoglobulinas de
cualquier especie son susceptibles a este tipo de ingeniería.
Además, no sólo se pueden manipular los bucles específicos objetivo
de la presente invención, sino que cualquier bucle que conecta
hebras beta en dominios de inmunoglobulina puede ser manipulado de
la misma forma.
Los dominios de inmunoglobulina diseñados a
partir de cualquier organismo y de cualquier tipo de inmunoglobulina
pueden emplearse de acuerdo con la presente invención ya sea como
tales (como dominios sencillos), o como parte de una molécula más
grande. Por ejemplo, pueden ser parte de una inmunoglobulina
intacta, que de acuerdo con esto tendrá su región de unión de
antígeno "normal" formada por los 6 CDRs y la nueva región de
unión de antígeno diseñada. Como esto, se puede generar una
inmunoglobulina multiespecífica, por ejemplo biespecífica. Los
dominios de inmunoglobulina diseñados también pueden formar parte de
cualquier proteína de fusión. El uso de estos dominios de
inmunoglobulina diseñados se encuentra en el campo general del uso
de inmunoglobulinas.
Los dominios de las siguientes inmunoglobulinas
se entienden aquí como dominios de inmunoglobulina:
para IgG, IgD e IgA: VL, CL, VH, CH1, CH2,
CH3
para IgM e IgE: VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3,
CH4
1. Dominios de inmunoglobulina sencillos
aleatorizados en un lado, es decir, ya sea en bucles que conectan
hebras beta B-C, D-E o
F-G (la "punta", con la excepción de dominios
variables que están cubiertos por muchas patentes) o hebras beta
A-B, C-D, (C-C' y
C''-D en el caso de dominios variables) o
E-F (el "fondo"). Se pueden aleatorizar los
bucles sencillos o cualquier combinación de bucles. Pueden
cambiarse, eliminarse o insertarse residuos adicionales.
2. Dominios de inmunoglobulina sencillos
aleatorizados en ambos lados, la punta y el fondo.
3. Cualquier proteína que contiene uno de los
dominios sencillos aleatorizados, tales como:
- a)
- dímeros de "CH3 de cadena sencilla" (scCH3), scCH2, scCH1/CL, aleatorizados en uno o ambos lados
- b)
- Fv de cadena sencilla aleatorizados en el "fondo", es decir, en el lado opuesto a los CDRs
- c)
- fragmentos Fab aleatorizados en el "fondo", es decir, en el extremo C-terminal del dominos CH1 y del CL
- d)
- fragmentos Fc (es decir, proteínas que consisten en CH2-CH3) aleatorizadas en uno o ambos lados
- e)
- inmunogiobulinas completas aleatorizadas en el fondo de Fc
- f)
- otros dominios convenientes.
Las ventajas primarias de los dominios
sencillos: son muy similares a todos los argumentos que se utilizan
para estimular las moléculas VH de camello ("nanocuerpos"
(nanobodies), ver www.ablynx.com). Los dominios de
inmunoglobulina aleatorizados son proteínas muy pequeñas (peso
molecular aproximado 12-15 kDa, dependiendo del
número de residuos aminoácido insertados) y por tanto tendrán las
siguientes ventajas en comparación con los anticuerpos o fragmentos
de anticuerpos convencionales tales como scFv y Fabs: reconocer
epítopos no comunes u ocultos, unirse en cavidades o sitios activos
de dianas de proteína, facilidad de fabricación, y muchos otros. En
el caso de un dominio de inmunoglobulina que está aleatorizado en
ambos lados, puede generarse una molécula bivalente o
biespecífica. Las ventajas principales de los dominios sencillos
como parte de proteínas de fusión son las propiedades de enlace
adicionales que pueden diseñarse en cualquier otra proteína.
Se contempla que cualquier sistema de expresión
pueda emplearse para hacer proteínas. Una analogía a los dominios
sencillos como se describe aquí se puede encontrar en los
anticuerpos del camello, que sólo tienen un VH pero ningún VL. En
estas proteínas, solo 3 CDRs (en lugar de 6 como en los anticuerpos
"normales" son responsables de la unión de antígeno).
Las siguientes referencias de patentes se
incorporan aquí por referencia como si se establecieran en su
totalidad:
Patente de los E.U.A. Nº 6,294,654 "Modified
immunoglobulin molecule incorporating an antigen in a
non-CUD loop region"
Patente de los E.U.A. Nº 5,844,094 "Target
binding polypeptide"
Patente de los E.U.A. Nº 5,395,750 "Methods
for producing proteins which bind to predetermined antigens"
Patente de los E.U.A. Nº 2004/0071690 "High
avidity polyvalent and polyspecific reagents"
Patente de los E.U.A. Nº 2004/0018508
"Surrogate antibodies and methods of preparation and use
thereof"
Patente de los E.U.A. Nº 2003/0157091 "Multi-
functional proteins"
Patente de los E.U.A. Nº 2003/0148372 "Method
to screen phage display libraries with different ligands"
Patente de los E.U.A. Nº 2002/0103345
"Bispecific immunoglobulin-like antigen binding
proteins and method of production"
Patente de los E.U.A. Nº 2004/0097711
"Immunoglobulin superfamily proteins"
Patente de los E.U.A. Nº 2004/0082508
"Secreted proteins"
Patente de los E.U.A. Nº 2004/0063924
"Secreted proteins"
Patente de los E.U.A. Nº 2004/0043424
"Immunoglobulin superfamily proteins"
Patente de los E.U.A. Nº 5,892,019 "Production
of a single-gene-encoded
immunoglobulin"
Patente de los E.U.A. Nº 5,844,094 "Target
binding polypeptide"
La presente invención además se ilustra en las
siguientes figuras y ejemplos sin estar restringida a ellos.
La Figura 1a muestra la estructura de una IgG1
intacta. Los dominios se indican con flechas.
La Figura 1b ilustra la organización estructural
de los monómeros principales del isotipo de la inmunoglobulina
humana. Los enlaces disulfuro se muestran como líneas, los grupos
carbohidratos N-enlazados se muestran como
círculos.
La Figura 2 muestra el pliegue de la
inmunoglobulina para un dominio constante (izquierdo) y uno variable
(derecho) de una inmunoglobulina. Las hebras beta se indican
mediante flechas.
La Figura 3 muestra un modelo molecular del
dominio diseñado CH3 de acuerdo con la presente invención, con la
parte aleatorizada indicada por una superficie accesible a solvente.
La superficie está en un círculo.
La Figura 4 muestra una presentación esquemática
de los PCRs utilizados para la producción de los fragmentos
empleados para el ensamblaje del dominio CH3 mutado. Los cebadores
PCR se indican mediante flechas con su orientación
5'-3' respectiva, y las líneas verticales indican
las posiciones aproximadas de los sitios de restricción
introducidos que se emplearon para el ensamblaje del gen mutado. Los
siguientes sitios de restricción están contenidos en los cebadores
para las ligaciones de los fragmentos PCR: CH3LNCO: NcoI; CH3LSAC y
CH3CSAC: SacI; CH3CHIN y CH3RHIN: HindIII; CH3RNOT: NotI.
La Figura 5 muestra algunos ejemplos de cómo
pueden utilizarse los dominios de la inmunoglobulina de la presente
solicitud. Las regiones aleatorizadas se indican mediante un símbolo
de estrella. Las especificidades de las regiones aleatorizadas en
una molécula pueden ser idénticas o diferentes.
La Figura 6 muestra una presentación esquemática
del diseño del dominio CH3 biespecífico de ingeniería. Los nombres
de los cebadores se dan en casillas y las flechas indican la
dirección en la que se alargan los cebadores. Las casillas con
líneas inclinadas indican las posiciones relativas de las regiones
que se aleatorizan en esta construcción, las casillas con líneas
verticales indican las posiciones relativas de las regiones que se
introdujeron para la generación del clon C24, y se indican los
sitios de restricción empleados para el procedimiento de
clonación.
La Figura 7 muestra una presentación esquemática
del diseño del dominio CH3 biespecífico diseñado. La secuencia de
nucleótidos y su traducción se muestra en el diseño básico del
dominio CH3 biespecífico diseñado. Las secuencias rojas indican
regiones aleatorizadas a fin de generar la construcción
biespecífica, mientras que las casillas verdes indican regiones en
las que la secuencia se aleatorizó a fin de generar el clon C24.
La Figura 8 muestra el listado de secuencia de
las secuencias aquí descritas.
La estructura cristalina de un fragmento IgG1
Fc, que se publica en la Base de Datos Brookhaven como entrada
1OQO.pdb se usó para ayudar en el diseño del dominio CH3 mutado.
La secuencia que se utiliza como base para la
construcción de la biblioteca CH3 se indica en la SEC ID Nº 1. En
esta secuencia, el primer aminoácido corresponde a Prolina 343 de la
cadena A de la entrada loqo.pdb de la base de datos Brookhaven. El
último residuo contenido en 1oqo.pdb es Serina 102 de la SEC ID Nº
1. Después del análisis detallado de la estructura de 1oqo.pdb y
mediante la inspección visual de los residuos que forman los bucles
que conectan las hebras beta, se decidió aleatorizar los residuos
17, 18 y 19, que son parte del bucle que conecta la hebra
A-B así como 71, 72, 73, 76 y 77, que son parte del
bucle que conecta a la hebra beta E-F de SEC ID Nº
1. Un modelo molecular del dominio CH3 diseñado, con la parte
aleatorizada indicada por una superficie accesible a solvente se
muestra en la Figura 3. El gen diseñado se produjo mediante una
serie de reacciones PCR seguidas por ligación de los productos PCR
resultantes. Para facilitar la ligación, algunos de los codones de
la secuencia de nucleótidos que codifica para SEC ID Nº 1 se
modificaron para producir sitios de restricción sin cambiar las
secuencias de aminoácidos (mutaciones silenciosas). Para la
inserción en el vector de clonación pHEN1 (Nucleic Acids Res. 1991
Aug 11; 19(15):4133-7.
Multi-subunit proteins on the surface of
filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy
and light chains. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell
DJ, Hudson P, Winter G.) en cuadro con la señal de secreción peIB,
los residuos nucleótidos extra que codifican Met-Ala
se conectaron en el extremo 5' de la secuencia para crear un sitio
de restricción NcoI. Para los residuos aleatorizados, se eligió el
codón NNS (código IUPAC, donde S significa C o G) que codifica
todos los 20 aminoácidos de origen natural, pero se evitan 2 de 3
codones de parada. La secuencia diseñada se indica como una
secuencia de nucleótido en SEC ID Nº 2 y como una secuencia de
aminoácidos en SEC ID Nº 3. La letra X en SEC ID Nº 3 representa
residuos aminoácido aleatorizados. Las secuencias de los cebadores
PCR utilizados para el ensamblaje del dominio CH3 mutado se indican
en SEC ID Nº 4 a 9. La Figura 4 muestra una presentación
esquemática de los fragmentos PCR generados para el ensamblaje del
gen mutado y los cebadores empleados para eso.
El ADNc de la cadena pesada del anticuerpo
monoclonal humano 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, Rüker F. Nucleotide
sequences of the cD-NAs encoding the
V-regions of H- and L-chains of a
human monoclonal antibody specific to
HIV-1-gp41. Nucleic Acids Res. 1990
Aug 25; 18(16):4927) se usó como patrón para las reacciones
PCR. Los 3 productos PCR se digirieron con SacI y/o HindIII
respectivamente y ligaron en conjunto. El producto de ligación se
digirió adicionalmente con NcoI y NotI y se ligó en el vector
fagémido pHEN1 de expresión de superficie, que previamente se
digirió con NcoI y NotI. Un número de clones seleccionados se
controló por análisis de restricción y por secuenciado de ADN y se
encontró que contienen el inserto planificado, incluyendo las
secuencias aleatorizadas insertadas de forma correcta. Para las
siguientes etapas de preparación del fago se siguieron protocolos
estándar. Brevemente, la mezcla de ligación se transformó en células
TGI de E. coli por electroporación. Posteriormente, las
partículas del fago se rescataron de células TG1 de E. coli
con el fago M13-KO7 auxiliar. Después las
partículas del fago se precipitaron a partir del sobrenadante del
cultivo con PEG/NaCl en 2 etapas, se disolvieron en agua y se
usaron para la selección por ciclos o, de forma alternativa, se
almacenaron a menos 80ºC.
Esta biblioteca se construyó y clonó de la misma
forma que la biblioteca CH3. La secuencia de aminoácidos de la
construcción esta indica en SEC ID Nº 10, la secuencia de
nucleótidos correspondiente en SEC ID Nº 11 y los cebadores
empleados para la construcción fueron SEC ID Nº 4-7,
SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta biblioteca se construyó y clonó de la misma
forma que la biblioteca CH3. La secuencia de aminoácidos de la
construcción se indica en SEC ID Nº 13, la secuencia de nucleótidos
correspondiente en SEC ID Nº 14, y los cebadores empleadas para la
construcción fueron SEC ID Nº 4-7, SEC ID Nº 9 y SEC
ID Nº 15.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron 3 rondas de selección por ciclo de
adsorción-desorción de acuerdo con protocolos
estándar. Brevemente, se aplicó el siguiente método. Se recubrieron
placas de 96 pocillos (Nunc) con un péptido sintético que
representa parte de la secuencia del receptor 9 tipo toll
(TLR-9). Se agregaron 200 \mul por pocillo de la
siguiente solución: tampón carbonato Na 0,1M, pH 9,6, con las
siguientes concentraciones de péptido disuelto:
Primer ronda de selección por ciclos de
adsorción-desorción: 1 mg/ml de péptido
TLR-9
Segunda ronda de selección por ciclos de
adsorción-desorción: 500 \mug/ml de péptido
TLR-9
Tercera ronda de selección por ciclos de
adsorción-desorción: 100 \mug/m1 de péptido
TLR-9
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la incubación durante 1 hora
aproximadamente a 37ºC, seguida de bloqueo con leche deshidratada
al 2% (M-P133) con 200 \mul por pocillo durante 1
hora a temperatura ambiente.
Después, la biblioteca de fagos de expresión en
superficie se dejó reaccionar con el péptido unido por adición de
100 \mul de suspensión de fago y 100 \mul de leche deshidratada
al 4% (M-PBS), seguido de incubación durante 45
minutos con agitación y durante 90 minutos sin agitación a
temperatura ambiente.
Las partículas de fago no ligadas se lavaron por
arrastre como sigue. Después de la primera ronda de selección por
ciclos de adsorción-desorción: 10 x 300 \mul de
T-PBS, 5 x 300 \mul de PBS; después de la segunda
selección por ciclos de adsorción-desorción: 15 x
300 \mul de T-PBS, 10x 300 \mul de PBS; después
de la tercera selección por ciclos de
adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de
T-PBS, 20 x 300 \mul de PBS.
La elusión de las partículas de fago ligadas se
realizó añadiendo 200 \mul por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2 e
incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, se neutralizó la suspensión del fago mediante
adición de 60 \mul de base Tris 2M, seguida de infección en
células TG1 de E. coli por mezcla de 10 ml de cultivo de
crecimiento exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación
durante 30 minutos a 37ºC. Finalmente, las bacterias infectadas se
dispusieron en medio TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de
ampicilina y se incubaron a 30ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN fagémido del fago seleccionado a través
de 3 rondas de selección por ciclos de
adsorción-desorción se aísla con un
midi-prep. El ADN que codifica regiones CH3 mutadas
se amplificó por lotes por PCR y se clonó NcoI-NotI
en el vector pNOTBAD/Myc-His, que es el vector de
expresión E. coli pBAD/Myc-His (Invitrogen)
con un sitio de restricción NotI insertado para facilitar la
clonación. Las construcciones ligadas se transformaron en células
LMG194 de E. coli (Invitrogen) con electroporación y se
desarrollaron a 30ºC grados en medio TYE con glucosa al 1% y
ampicilina durante la noche. Los clones seleccionados se inocularon
en 200 \mul de medio 2xYT con ampicilina, se desarrollaron
durante la noche a 30ºC y se indujeron por adición de
L-arabinosa a una concentración final de 0,1%.
Después de la expresión a 16ºC durante la noche, las células se
recolectaron por centrifugación y se trataron con 100 \mul de
tampón borato Na, pH 8,0, a 4ºC durante la noche para la
preparación de extractos periplásmicos. 50 \mul de los extractos
periplásmicos se emplearon en ELISA (ver a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó el enlace específico de los clones
seleccionados frente al péptido TLR-9 por ELISA.
Revestimiento: Placa de microtitulación (NUNC,
Maxisorp), 100 \mul por pocillo, 20 \mug de péptido
TLR-9/ml tampón carbonato pH 9,6, 1 h a 37ºC
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Bloqueo: BSA-PBS al 1%, 1 h a
temperatura ambiente
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Enlace de extractos periplásmicos: 50 \mul de
extracto periplásmico 50 ml de BSA-PBS al 2% a
temperatura ambiente durante la noche.
Lavado: 3x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Primer anticuerpo: anti-His4
(Qiagen), 1:1000 en BSA- PBS al 1%, 90 min a TA, 100 \mul por
pocillo
- \quad
- Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\newpage
Segundo anticuerpo: cabra antiratón*HRP (SIGMA),
1:1000 en BSA-PES al 1%, 90 min a TA, 100 \mul
por pocillo
- \quad
- Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Detección: 3 mg/ml de OPD en tampón
citrato/fosfato de Na, pH 4,5, 0,4 \mul H_{2}O_{2} al 30%
Parada: 100 ml de H_{2}SO_{4} 3M
Lectura de absorbancia: 492/620 nm
Los clones que dieron señal alta en este primer
ELISA preliminar se cultivaron en un volumen de 20 ml en las mismas
condiciones que se describe anteriormente. Sus extractos
periplásmicos se aislaron en 1/20 del volumen de cultivo como se
describe anteriormente y se ensayaron con ELISA (como se describe
arriba) para confirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron 3 rondas de selección por ciclos
de adsorción-desorción. Se recubrieron placas de 96
pocillos Maxisorp (Nunc) con lisozima de huevo de gallina, por
adición de 200 \mul de la siguiente solución por pocillo:
PBS, con las siguientes concentraciones de
lisozima de huevo de gallina disuelta:
- \quad
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 2 mg/ml HEL
- \quad
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: l mg/ml HEL
- \quad
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 1 mg/ml HEL
\vskip1.000000\baselineskip
La incubación se realizó durante 1 hora a 37ºC,
seguida de bloqueo con leche deshidratada al 2%
(M-PBS) con 200 \mul por pocillo durante 1 hora a
temperatura ambiente.
Después, se permite que la biblioteca de fagos
de expresión en superficie reaccione con la lisozima de huevo de
gallina ligada mediante adición de 100 \mul de suspensión de fago
y 100 \mul de leche deshidratada al 4% (M-PBS),
seguido de incubación durante 45 minutos con agitación y durante 90
minutos sin agitación a temperatura ambiente.
Las partículas de fago no ligadas se lavaron por
arrastre como sigue:
- \quad
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de T-PBS, 5 x 300 \mul de PBS.
- \quad
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 15 x 300 \mul de T-PBS, 10 x 300 \mul de PBS.
- \quad
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de T-PBS, 20 x 300 \mul de PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
La elución de las partículas de fago ligadas se
realizó añadiendo 200 \mul por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2 e
incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, la suspensión de fago se neutralizó por adición de
60 \mul de Base Tris 2M, seguido de infección en células TG1 de
E. coli por mezcla de 10 ml de cultivo de crecimiento
exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación durante 30
minutos a 37ºC. Finalmente, las bacterias infectadas se dispusieron
en medio TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de ampicilina, y se
incubaron a 30ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación de clones seleccionados para
expresión soluble se realizó como se describe anteriormente para
los mutantes CH3 seleccionados frente a TLR-9
\global\parskip0.950000\baselineskip
La expresión soluble de clones seleccionados se
realizó como se describe anteriormente para los mutantes CH3
seleccionados frente a TLR-9. Los extractos
periplásmicos se ensayaron en un ELISA preliminar (protocolo ver
ejemplo 10).
Los clones que dieron señal alta en este primer
ELISA preliminar se cultivaron en un volumen de 20 ml en las mismas
condiciones que se describe anteriormente. Sus extractos
periplásmicos se aislaron en 1/20 de volumen de cultivo como se
describió anteriormente y se ensayaron con ELISA (como se describe
en el ejemplo 10) para confirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
Revestimiento: Placa de microtitulación (NUNC,
Maxisorp), 100 \mul por pocillo, 100 \mul de lisozima de huevo
de gallina/ml en PBS, 1 h a 37ºC.
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Bloqueo: BSA-PBS al 1%, 1 h a
TA
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Enlace de extractos periplásmicos: 50 \mul de
extracto periplásmico 50 \mul de BSA-PBS al 2% a
temperatura ambiente durante la noche
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Primer anticuerpo: anti-His4
(Qiagen), 1:1000 en BSA-PBS al 1%, 90 min a TA, 100
\mul por pocillo
- \quad
- Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo anticuerpo: cabra
anti-ratón*HRP(SIGMA),1:1000 en
BSA-PBS al 1%, 90 min a TA (temperatura ambiente),
100 \mul por pocillo
- \quad
- Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Detección: 3 mg/ml OPD en tampón citrato/fosfato
Na, pH 4,5, 0,4 \mul de H_{2}O_{2} al 30%
\vskip1.000000\baselineskip
Parada: 100 ml de H_{2}SO_{4} 3M
Lectura de absorbancia: 492/620 nm
Se observa que la lisozima de huevo de gallina
reacciona con anticuerpo anti-his4, por lo tanto se
observa un fondo relativamente alto.
La inspección visual de la estructura cristalina
de un fragmento de Fab (se emplea la estructura del Fab del
anticuerpo monoclonal humano 3D6: RSCB Protein Data Bank
(http://www.rcsb.org/pdb/) entrada 1DFB.PDB (He XM, et al.
Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Aug
1;89(15):7154-8) y el análisis asistido por
ordenador (por ejemplo, para este propósito se usa Protein Explorer
(http://molvis.sdsc.edu/protexpl/frntdoor.htm)) de la
estructura secundaria y terciaria de esta proteína) permite
identificar residuos localizados en regiones del bucle que conectan
las hebras beta de la plantilla del dominio CL. Estos residuos
comprenden los aminoácidos 8 a 18, los aminoácidos 27 a 35, los
aminoácidos 42 a 78, los aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 92 a
100, los aminoácidos 108 a 117 y los aminoácidos 123 a 126
(numeración de acuerdo con el sistema de numeración IMGT (Lefranc
MP, et al. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1; 33 (Database
issue):0593-7; Lefranc MP, et al. Dev Comp
Immunol. 2005; 29(3):185- 203)).
Más específicamente, los residuos 11, 12,
14-18, y 92-95 se aleatorizan dentro
del dominio CL humano (SEC ID Nº 48). La aleatorización se logra
por amplificación PCR de las secuencias de codificación con
cebadores PCR en que las posiciones de los codones relevantes se
codifican por la secuencia de nucleótidos
5'-NNS-3', que potencialmente
codifica todos los 20 aminoácidos, evitando 2 de los 3 codones de
parada. El inserto de la biblioteca se amplifica mediante dos
reacciones PCR separadas y los dos fragmentos PCR se ligan en
conjunto mediante un sitio restricción HpyCH4IV que se introduce
como mutación silenciosa mediante los cebadores PCR. Además, los
cebadores proporcionan los sitios de restricción de endonucleasa
NcoI y NotI respectivamente para clonar en el vector de expresión
de fago pHEN (Hoogenboom HR, et al. Nucleic Acids Res. 1991
Aug 11; 19(15):4133-7). La cisteína
C-terminal del dominio CL no se incluye para la
expresión de fago, pero puede agregarse posteriormente cuando se
utiliza un clon CL modificado, por ejemplo, para la construcción de
un fragmento Fab.
Como una plantilla para la amplificación PCR, se
usa un plásmido pRcCMV-3D6LC (Rüker F, et al.
Ann N Y Acad Sci. 1991 Dec 27; 646:212-9), que
contiene como inserto la cadena ligera completa del anticuerpo
monoclonal humano.
Para las bibliotecas CL+3 (SEC ID Nº 50, 51) y
CL+5 (SEC ID Nº 52, 53), que contienen residuos adicionales
insertados entre las posiciones 92 y 95 del dominio CL, se emplean
los cebadores CLRHPY3 y CLRHPY5 respectivamente en lugar del
cebador CLRHPY.
A continuación se muestra (SEC ID Nº 48, 49) la
secuencia de aminoácidos y nucleótidos del producto final del PCRs
las ligaciones, clonada en el sitio NcoI de pHEN1, que conduce a la
unión de una secuencia líder peIB con el extremo N de la
construcción:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Lista de cebadores para la biblioteca CL:
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante análisis de restricción y secuenciación
de ADN se controla que los numerosos clones seleccionados de la
biblioteca (dominios CL mutados clonados en el vector fagémido
pHEN1) contengan el inserto planificado, incluyendo las secuencias
aleatorizadas correctamente insertadas. Para las siguientes etapas
de preparación del fago, se siguen protocolos estándar. Brevemente,
la mezcla de ligación se transforma en células TG1 de E.
coli por electroporación. Posteriormente, se rescatan partículas
fago de las células TG1 de E. coli con el fago auxiliar
M13-KO7. Después. Las partículas de fago se
precipitan a partir del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en 2
etapas, se disuelven en agua y se utilizan para la selección por
ciclos de adsorción-desorción o, de forma
alternativa, se pueden almacenar a menos 80ºC.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\newpage
La inspección visual de la estructura cristalina
de un fragmento Fab (se usa la estructura del Fab del anticuerpo
monoclonal humano 3D6: RSCB Protein Data Bank Entry 1DFB.PDB) y el
análisis asistido por ordenador (se utiliza Protein Explorer para
este propósito) de la estructura secundaria y terciaria de esta
proteína permite identificar residuos ubicados en regiones del
bucle que conectan las hebras beta del patrón del dominio CH1.
Estos residuos comprenden los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25
a 39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los
aminoácidos 89 a 103 y los aminoácidos 106 a 117 (numeración de
acuerdo con el sistema de numeración IMGT).
Más específicamente, los residuos
12-19 y 93-100 se aleatorizan dentro
del dominio CH1 humano (SEC ID Nº 54, 55). La aleatorización se
logra mediante amplificación PCR de las secuencias de codificación
con cebadores PCR en que las posiciones de los codones relevantes
se codifican por la secuencia de nucleótidos
5'-NNS-3', que codifica
potencialmente todos los 20 aminoácidos, evitando 2 de los 3
codones. El inserto de la biblioteca se amplifica mediante dos
reacciones PCR separadas y los dos fragmentos PCR se ligan en
conjunto mediante un sitio de restricción BstEII que aparece de
forma natural en el dominio CH1. Los cebadores proporcionan además
los sitios de restricción de endonucleasa NcoI y NotI
respectivamente para la clonación en el vector de expresión del
fago pHEN. La cisteína C-terminal del dominio CH1 no
se incluye para la expresión del fago pero puede agregarse
posteriormente cuando se utiliza un clon CH1 modificado, por
ejemplo, para la construcción de un fragmento Fab.
Se usa como plantilla para la amplificación PCR
un plásmido como pRcCMV-3D6HC, que contiene como
inserto la cadena pesada completa del anticuerpo monoclonal
humano.
A continuación se muestra (SEC. ID Nº 54, 55) la
secuencia de nucleótidos y aminoácidos del producto final de los
PCRs y ligaciones, clonada en el sitio NcoI de pHEN1, que lleva a la
unión de una secuencia líder peIB con el extremo N de la
construcción:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Lista de cebadores para la biblioteca CH1
Mediante análisis de restricción y secuenciación
de ADN se controla que los numerosos clones seleccionados de la
biblioteca (dominios CH1 mutados clonados en el vector fagémido
pHEN1) contengan el inserto planificado, incluyendo las secuencias
aleatorizadas correctamente insertadas. Para las siguientes etapas
de preparación del fago, se siguen protocolos estándar. Brevemente,
la mezcla de ligación se transforma en células TG1 de E.
coli por electroporación. Posteriormente, se rescatan partículas
fago de las células TG1 de E. coli con el fago auxiliar
M13-KO7. Después. Las partículas de fago se
precipitan a partir del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en 2
etapas, se disuelven en agua y se utilizan para la selección por
ciclos de adsorción-desorción o, de forma
alternativa, se pueden almacenar a menos 80ºC.
Se realizan 3 rondas de selección de ciclos de
adsorción-desorción con la biblioteca
fago-CH1 (ver ejemplo 12). Placas de 96 pocillos
Maxisorp (Nunc) se revisten con lisozima de huevo de gallina,
añadiendo 200 \mul de la siguiente solución por pocillo: PBS, con
las siguientes concentraciones de lisozima de huevo de gallina
disuelta:
- \quad
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 2 mg/ml HEL
- \quad
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: l mg/ml HEL
- \quad
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 1 mg/ml HEL
La incubación se realizó durante 1 hora a 37ºC,
seguida de bloqueo con leche deshidratada al 2%
(M-PBS) con 200 \mul por pocillo durante 1 hora a
temperatura ambiente.
Después, se permite que la biblioteca de fagos
de expresión en superficie reaccione con la lisozima de huevo de
gallina ligada mediante adición de 100 \mul de suspensión de fago
y 100 \mul de leche deshidratada al 4% (M-PBS),
seguido de incubación durante 45 minutos con agitación y durante 90
minutos sin agitación a temperatura ambiente.
Las partículas de fago no ligadas se lavaron por
arrastre como sigue:
- \quad
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 10 x 300 \mul de T-PBS, 5 x 300 \mul de PBS.
- \quad
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 15 x 300 \mul de T-PBS, 10 x 300 \mul de PBS.
- \quad
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de T-PBS, 20 x 300 \mul de PBS.
La elución de las partículas de fago ligadas se
realizó añadiendo 200 \mul por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2 e
incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, la suspensión de fago se neutralizó por adición de
60 \mul de Base Tris 2M, seguido de infección en células TG1 de
E. coli por mezcla de 10 ml de cultivo de crecimiento
exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación durante 30
minutos a 37ºC. Finalmente, las bacterias infectadas se dispusieron
en medio TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de ampicilina, y se
incubaron a 30ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN fagémido del fago seleccionado a través
de 3 rondas de selección por ciclos de
adsorción-desorción se aísla con un
midi-prep. El ADN que codifica dominios CH1 mutados
se amplifica por lotes por PCR y se clona NcoI-NotI
en el vector pNOTBAD/Myc-His, que es el vector de
expresión E. coli pBAD/Myc-His (Invitrogen)
con un sitio de restricción NotI insertado para facilitar la
clonación. Las construcciones ligadas se transformaron en células
LMG194 de E. coli (Invitrogen) con electroporacción y se
desarrollaron a 30ºC grados en medio TYE con glucosa al 1% y
ampicilina durante la noche. Los clones seleccionados se inocularon
en 200 \mul de medio 2xYT con ampicilina, se desarrollaron
durante la noche a 30ºC y se indujeron por adición de
L-arabinosa a una concentración final de 0,1%.
Después de la expresión a 16ºC durante la noche, las células se
recolectaron por centrifugación y se trataron con 100 \mul de
tampón borato Na, pH 8,0, a 4ºC durante la noche para la
preparación de extractos periplásmicos. 50 \mul de los extractos
periplásmicos se emplearon en ELISA.
Los clones que dan señal alta en este primer
ELISA preliminar se cultivan en un volumen de 20 ml en las mismas
condiciones gue se describen anteriormente. Sus extractos
periplásmicos se aíslan en 1/20 del volumen de cultivo como se
describió anteriormente y ensayan con ELISA (como se describe a
continuación) para confirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
Revestimiento: placa de micro titulación (NUNC,
Maxisorp), 100 \mul por pocillo, 100 \mug de lisozima de huevo
de gallina/ml en PBS, 1 h a 37ºC
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Bloqueo: BSA-PBS al 1%, 1 h a
TA
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Enlace de extracto periplásmico: 50 \mul de
extracto periplásmico 50 \mul de BSA-PBS al 2%, a
temperatura ambiente durante la noche
Primer anticuerpo: anti-His4
(Qiagen), 1:1000 en BSA-PBS al 1%, 90 min a TA, 100
\mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Segundo anticuerpo: cabra
anti-ratón*HRP(SIGMA),1:1000 en
BSA-PBS al 1%, 90 min a TA (temperatura ambiente),
100 \mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Detección: 3 mg/ml OPD en tampón citrato/fosfato
Na, pH 4,5, 0,4 \mul de H_{2}O_{2} al 30%
Parada: 100 ml de H_{2}SO_{4} 3M
Lectura de absorbancia: 492/620 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones se interpretan como positivos cuando
su señal ELISA es al menos tres veces la de la señal de fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan 3 rondas de selección por ciclos de
adsorción-desorción con la biblioteca de
fago-CL (ver ejemplo 11).
Se revisten placas de 96 pocillos Maxisorp
(Nunc) con lisozima de huevo de gallina, añadiendo 200 \mul de la
solución siguiente por pocillo: PBS, con las concentraciones
siguientes de lisozima de huevo de gallina:
- \quad
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 2 mg/ml HEL
- \quad
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: l mg/ml HEL
- \quad
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 1 mg/ml HEL
La incubación se realizó durante 1 hora a 37ºC,
seguida de bloqueo con leche deshidratada al 2%
(M-PBS) con 200 \mul por pocillo durante 1 hora a
temperatura ambiente.
Después, se permite que la biblioteca de fagos
de expresión en superficie reaccione con la lisozima de huevo de
gallina ligada mediante adición de 100 \mul de suspensión de fago
y 100 \mul de leche deshidratada al 4% (M-PBS),
seguido de incubación durante 45 minutos con agitación y durante 90
minutos sin agitación a temperatura ambiente.
Las partículas de fago no ligadas se lavaron por
arrastre como sigue:
- \quad
- Primera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 10 x 300 \mul de T-PBS, 5 x 300 \mul de PBS.
- \quad
- Segunda ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 15 x 300 \mul de T-PBS, 10 x 300 \mul de PBS.
- \quad
- Tercera ronda de selección por ciclos de adsorción-desorción: 20 x 300 \mul de T-PBS, 20 x 300 \mul de PBS.
La elución de las partículas de fago ligadas se
realizó añadiendo 200 \mul por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2 e
incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, la suspensión de fago se neutralizó por adición de
60 \mul de Base Tris 2M, seguido de infección en células TG1 de
E. coli por mezcla de 10 ml de cultivo de crecimiento
exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación durante 30
minutos a 37ºC. Finalmente, las bacterias infectadas se dispusieron
en medio TYE con glucosa al 1% y 100 \mug/ml de ampicilina, y se
incubaron a 30ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN fagémido del fago seleccionado a través
de 3 rondas de selección por ciclos de
adsorción-desorción se aísla con un
midi-prep. El ADN que codifica dominios CL mutados
se amplifica por lotes por PCR y se clona NcoI-NotI
en el vector pNOTBAD/Myc-His, que es el vector de
expresión E. coli pBAD/Myc-His (Invitrogen)
con un sitio de restricción NotI insertado para facilitar la
clonación. Las construcciones ligadas se transformaron en células
LMG194 de E. coli (Invitrogen) con electroporacción y se
desarrollaron a 30ºC grados en medio TYE con glucosa al 1% y
ampicilina durante la noche. Los clones seleccionados se inocularon
en 200 \mul de medio 2xYT con ampicilina, se desarrollaron
durante la noche a 30ºC y se indujeron por adición de
L-arabinosa a una concentración final de 0,1%.
Después de la expresión a 16ºC durante la noche, las células se
recolectaron por centrifugación y se trataron con 100 \mul de
tampón borato Na, pH 8,0, a 4ºC durante la noche para la
preparación de extractos periplásmicos. 50 \mul de los extractos
periplásmicos se emplearon en ELISA.
Los clones que dan señal alta en este primer
ELISA preliminar se cultivan en un volumen de 20 ml en las mismas
condiciones que se describen anteriormente. Sus extractos
periplásmicos se aíslan en 1/20 del volumen de cultivo como se
describió anteriormente y ensayan con ELISA (como se describe a
continuación) para confirmación.
\vskip1.000000\baselineskip
Revestimiento: placa de micro titulación (NUNC,
Maxisorp), 100 \mul por pocillo, 100 \mug de lisozima de huevo
de gallina/ml en PBS, 1 h a 37ºC
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Bloqueo: BSA-PBS al 1%, 1 h a
TA
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Enlace de extracto periplásmico: 50 \mul de
extracto periplásmico 50 \mul de BSA-PBS al 2%, a
temperatura ambiente durante la noche
Primer anticuerpo: anti-His4
(Qiagen), 1:1000 en BSA-PBS al 1%, 90 min a TA, 100
\mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Segundo anticuerpo: cabra
anti-ratón*HRP(SIGMA), 1:1000 en
BSA-PBS al 1%, 90 min a TA (temperatura ambiente),
100 \mul por pocillo
Lavado: 3 x 200 \mul de PBS
Detección: 3 mg/ml OPD en tampón citrato/fosfato
Na, pH 4,5, 0,4 \mul de H_{2}O_{2} al 30%
Parada: 100 ml de H_{2}SO_{4} 3M
Lectura de absorbancia: 492/620 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones se interpretan como positivos cuando
su señal ELISA es al menos tres veces la de la señal de fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe un dominio de
inmunoglobulina de diseño con dos especificidades de enlace.
El diseño de este dominio de inmunoglobulina de
diseño comprende la siguiente estrategia:
* se usa como punto de partida un dominio CH3 de
diseño, clon C24 (ver ejemplo 10), derivado de la biblioteca CH3+5
que se une específicamente a lisozima
* los residuos que se tienen que aleatorizar se
identificaron en este dominio CH3 modificado, conectando hebras
\beta del pliegue de la inmunoglobulina y disponiéndose en el lado
opuesto del dominio comparado con los residuos que se mutaron al
generar el clon C24.
* se diseñaron los cebadores PCR que permiten la
aleatorización de estos residuos y la síntesis de este dominio de
inmunoglobulina de diseño en un procedimiento similar al descrito
anteriormente para las bibliotecas CH3, CH3+3 y la CH3+5.
Se ligaron 4 productos PCR que contienen
posiciones aleatorizadas y se amplificaron insertos de longitud
completa por PCR. Posteriormente, se clonaron en
pHEN-1 mediante sitios NcoI-NotI y
transformaron en células TG-1 de E. coli
para construir una biblioteca de aproximadamente 10^{8} colonias.
Se secuenciaron 20 colonias seleccionadas aleatoriamente y se
encontró que las posiciones aleatorizadas mutaron
independientemente. Tampoco se observó la secuencia "salvaje"
(C24). La biblioteca del fago se generó siguiendo protocolos
estándar, y se logró un título de fago de 6,32 x 10^{10}
TU/ml.
A fin de probar la biespecificidad, se eligió
eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) como segundo antígeno,
mientras que se espera que la construcción retenga su especificidad
diseñada originalmente para la lisozima de huevo de gallina. El
fago reactivo a rhEPO se seleccionó en 4 rondas de selección por
ciclos de adsorción-desorción. A fin de conservar
la población de clones C24 que después de la mutagénesis todavía se
unen a lisozima de huevo de gallina, la primera ronda de selección
en rhEPO fue seguida de una ronda de selección por ciclos de
adsorción-desorción de la población fago en lisozima
de huevo de gallina (1 mg/ml en PBS). 200 \mul de rhEPO se
revistieron en los 5 pocillos de la placa de micro titulación
(Maxisorp, Nunc) en tampón carbonato Na 0,1 M, pH 9.6, en
concentraciones decrecientes en rondas sucesivas de selección por
ciclos de adsorción-desorción (ver tabla siguiente).
Después de bloquear con M-PBS al 2%, se permitió la
unión del fago en el agente de bloqueo a temperatura ambiente
durante 2 h. Después de 20 lavados con T-PBS y 20
con PBS, se eluyó con glicina 0,1 M, pH 2,2, y se neutralizó con
Tris 2M. El fago eluído se utilizó inmediatamente para infectar
TG-1 de crecimiento exponencial. Las células
infectadas se seleccionaron en medio que contiene ampicilina. Las
partículas de fago se rescataron de sobrenadantes de cultivo hasta
superinfección con fago auxiliar M13-KO7, se
concentraron con PEG y se utilizaron en otra ronda de selección por
ciclos de adsorción-desorción. Los números de
entrada y salida de fago se determinaron como comunidades de
transformación de E. coli después de cada ronda de selección
por ciclos adsorción-desorción (Tabla 8).
La colonias resultantes se desprendieron de las
placas, se cultivaron en 2xYT con ampicilina y su ADN plasmídico se
aisló con un midi-prep. Los insertos se amplificaron
con PCR y después se subclonaron en el vector pNOTBAD y se
transformaron en una cepa E104 de E. coli. Se cultivaron 4x72
colonias en 200 \mul de 2xYT con ampicilina y Se indujeron con
L-arabinosa al 0,1% al día siguiente. Tras 24 h de
expresión a 16ºC, se rompieron con 200 \mul de tampón borato Na,
pH 8,0 durante 6 h a 4ºC y se usó extracto periplásmico en
ELISA.
Para ELISA, se revistieron placas Maxisorp con
lisozima de huevo de gallina en PBS (20 \mug/ml) o rhEPO en
tampón carbonato Na 0,1 M, pH 9,6, respectivamente, durante 1 h a
37ºC. Tras el bloqueo con BSA-PBS al 1%, se dejó
que el extracto periplásmicos se uniera en el mismo agente de
bloqueo durante la noche. El enlace se reveló con un anticuerpo
anti-His-(4) y un anticuerpo IgG cabra
anti-ratón, conjugado con HRP (para la detección de
lisozima de huevo de gallina) o AP (para la detección de rhEPO). El
color de la reacción de la conversión OPD (HRP) se leyó a 492/620
nm después de pararse con H_{2}SO_{4} 1,25 M y la conversación
pNPP (AP) se leyó a 405/620 nm. 14 clones con valores prometedores
de absorbancia se seleccionaron para expresión a escala de 20 ml.
Después de 24 h de inducción de arabinosa a 16ºC, las células se
recogieron y se rompieron durante la noche en 1 ml de tampón borato
Na a 4ºC, y el lisado se empleó para ELISA. El ELISA se realizó
como antes, en 4 paralelos, y se usaron pocillos sin extracto
periplásmico y sin antígenos como controles negativos. Los
resultados (Tabla 9) se obtuvieron con clones de acuerdo con SEC ID
Nº 42, 43.
En la construcción empleada en este ejemplo,
tanto la cadena VL como la cadena VH de un anticuerpo se fusionan
en un dominio CH3 de diseño.
La región VL y VH del anticuerpo monoclonal
humano 3D6. (He XM, et al. Pro Natl Acad Sci USA. 1992
89:7154-8., Kohl J. et al. Ann N Y Acad Sci.
1991 646:106-14., Felgenlauer M, et al.
Nucleic Acids Res. 1990 18:4927), que reconocen un epítopo en gp41
de HIV-1 se utilizaron como socio de fusión para el
clon C24 del dominio CH3 diseñado que se une específicamente a
lisozima de huevo de gallina.
A fin de promover la formación del dímero
VL-CH3/VH-CH3 mediante un enlace
disulfuro, se añadieron los residuos Ser-Cys al
extremo C de las secuencia C24.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
respectivamente de las dos cadenas 3D6VL-C24 y
3D6VH-C24 se indican en SEC ID Nº 47, 46 y SEC ID
Nº 45, 44, respectivamente.
Se diseñaron cebadores que permiten la
amplificación de las regiones de codificación, introduciendo al
mismo tiempo sitios de restricción (mutaciones silenciosas) que se
emplearon para reunir las regiones de codificación. Para la
expresión de los genes, se escogió el sistema de expresión de
Pichia pastoris. Se clonaron construcciones en vectores de
expresión apropiados de Pichia pastoris:
3D6VL-C24 se clonó en pPIC9K (nombre final:
pPIC9K3LC) y 3D6VH-C24 (nombre final: pPICZ3HC) se
clonó en pPICZalphaA. La construcción pPICZ3HC se linearizó con Bgl
II, se transformó en Pichia pastoris GS115 y los
transformantes se seleccionaron en medio sólido que contiene
zeocina. Uno de los transformantes se usó posteriormente como célula
huésped para la construcción linearizada pPIC9K3LC. Después se
seleccionaron dobles transformantes en medio RDB.
Los clones se inocularon en 30 ml de medio YPG y
se desarrollaron hasta OD_{600}=10, y después se indujeron por
adición de metanol al 1% en medio BMMY. La inducción se continuó
durante 36 horas a 16ºC. Se retiraron los sobrenadantes por
centrifugación y después se concentraron aproximadamente 10 veces.
La presencia de la proteína recombinante se confirmó por
transferencia Western con un anticuerpo anti-His (4)
y se estimó una concentración de aproximadamente
50-100 \mug/l de cultivo inicial.
Las primeras pruebas funcionales se realizaron
con sobrenadante 10x concentrado. Primero, los pocillos de las
placas Maxisorp se revistieron con 20 \mug/ml de lisozima de huevo
de gallina en PBS o 20 \mug/ml de epítopo del anticuerpo 3D6 en
tampón carbonato Na 0,1 M, pH 9,6, respectivamente, durante 1 h a
37ºC. El epítopo 3D6 se utilizó en forma de una proteína de fusión
GST producida por recombinación. Después de bloquear con
BSA-PBS al 1%, se dejó que los sobrenadantes
concentrados se unieran durante la noche en el mismo agente
bloqueante. El enlace se reveló con un anticuerpo
anti-His(4) y anticuerpo cabra
anti-ratón, conjugado con HRP, y se visualizó como
reacción de color resultante de la conversión OPD a 492/620 nm
(Tabla 10).
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Rüker, Florian
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> DOMINIOS DE INMUNOGLOBULINA
SINTÉTICA CON PROPIEDADES DE ENLACE MODIFICADAS EN REGIONES DE LA
MOLÉCULA DIFERENTES DE LAS REGIONES DE DETERMINACIÓN DE
COMPLEMENTARIEDAD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> R 46751
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 06703578.2
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2006-01-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/641144
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-01-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (57)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (60)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, a, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (63)..(64)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (219)..(220)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, ar t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (222)..(223)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (225)..(226)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (234)..(235)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (237)..(238)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(75)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (78)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipct t gccat gg ccccccgaga accacaggt g t ac
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagt cgagct c gt cacgggat gggggcaggg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgt acgagct c nnsnnsnnsc aagt cagcct gacct gcct g g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccaagctt gctgtagagg aagaaggagc cg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (295)..(296)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (298)..(299)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (301)..(302)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)..(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (52)..(53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (56)..(59)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (61)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)..(65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(68)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (70)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacaacgtc agggt gct gc t gaggc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagaacgtt gnnsnnsnns nnst acgaga aacacaaagt c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
<221) característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipt cagaacgt t gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nst acgagaa acacaaagt c
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (36)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagaacgtt t gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsta cgagaaacac aaagt c
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcat cgcggcc gcct ct cccc t gt tgaagct c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58)..(59)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (61)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)..(65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(68)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (70)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (76)..(77)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcacggt ca ccacgct gct gag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (37)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcat agcggcc gcagatttgg gctcaacttt cttgtc c
\hfill36
Claims (11)
1. Un dominio constante de inmunoglobulina o
parte del mismo de origen humano, que comprende al menos una región
del bucle estructural de cualquiera de los dominios CH1, CH2, CH3,
CH4 o CL, comprendiendo al menos una región del bucle estructural
al menos una modificación que permite el enlace de al menos dicha
región del bucle estructural a un epítopo de un antígeno, en que el
dominio constante de la inmunoglobulina modificada no se une a
dicho epítopo, excluyendo dicha modificación la incorporación de un
péptido farmacológicamente activo de 2 a 40 aminoácidos en el
dominio Fc.
2. Una inmunoglobulina modificada según la
reivindicación 1, en que dicha región modificada del bucle es
cualquiera de los dominios C\kappa o C\lambda.
3. Una inmunoglobulina modificada según la
reivindicación 1 o 2, en que dicha región modificada del bucle es
cualquier fragmento Fab.
4. Una inmunoglobulina modificada según la
reivindicación 1, en que dicha región modificada del bucle es
cualquier fragmento Fc.
5. Una inmunoglobulina modificada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que deriva de IgG.
6. Una inmunoglobulina modificada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con al menos dos regiones
modificadas del bucle estructural.
7. Inmunoglobulina que comprende al menos una
inmunoglobulina modificada según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, en que dicha región modificada del bucle estructural
comprende al menos 6 modificaciones de aminoácidos.
8. Molécula que comprende al menos una
inmunoglobulina modificada según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7, y al menos otra molécula de unión, en que esta otra molécula
de unión mencionada se selecciona del grupo de inmunoglobulinas
modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
receptores solubles, ligandos, ácidos nucleicos y
carbohidratos.
9. Molécula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque cualquiera de
las regiones modificadas del bucle estructural de un CH1, CH2, CH3
o CH4 comprenden una modificación en una de las posiciones de
aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo que consiste en los aminoácidos 7 a 21, los aminoácidos 25 a
39, los aminoácidos 41 a 81, los aminoácidos 83 a 85, los
aminoácidos 89 a 103 o los aminoácidos 106 a 117, donde la
numeración de la posición de los aminoácidos de los dominios es la
de IMGT.
10. Molécula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque cualquiera de
las regiones de C\kappa o C\lambda comprende una modificación
en una de las posiciones de aminoácidos dentro de la secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 8
a 18, los aminoácidos 27 a 35, los aminoácidos 42 a 78, los
aminoácidos 83 a 85, los aminoácidos 92 a 100, los aminoácidos 108 a
117 o los aminoácidos 123 a 126, donde la numeración de la posición
de los aminoácidos de los dominios es la de IMGT.
11. Ácidos nucleico que codifica una
inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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