CN102131812B - 吡咯并[2，3-d]嘧啶化合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了吡咯并{2，3-d}嘧啶化合物，其作为詹纳斯激酶(JAK)抑制剂的用途，含有所述化合物的药物组合物，和制备这些化合物的方法。

Description

吡咯并[2,3-d]嘧啶化合物

发明领域

本文描述了N-甲基(4-(甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基)环己基)甲磺酰胺，其类似物，其作为詹纳斯激酶(Janus Kinase，JAK)抑制剂的用途，包含这些化合物的药物组合物，和这些化合物的制备方法。

发明背景

蛋白激酶是催化蛋白质中特定残基磷酸化的多种酶家族，主要分为酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶。由突变、过表达或不当调节(inappropriateregulation)、失调(dys-regulation)或脱调节(de-regulation)以及生长因子或细胞因子的过量生产或不足生产引起的不当激酶活性牵涉许多疾病，包括但不限于癌症、心血管疾病、变态反应、哮喘和其他呼吸疾病、自身免疫疾病、炎性疾病、骨疾病、代谢病症和神经与神经变性病症如阿尔茨海默病。不当的激酶活性引发与涉及前述和相关疾病的细胞生长、细胞分化、存活、凋亡、有丝分裂、细胞周期控制和细胞迁移率相关的多种生物学细胞应答。

因此，蛋白激酶已成为作为治疗性介入靶标的一类重要的酶。特别地，JAK家族的细胞蛋白质酪氨酸激酶(JAK-1、JAK-2、JAK-3和Tyk-2)在细胞因子信号转导中起中枢作用(Kisseleva et al，Gene，2002，285，1；Yamaoka et al.Genome Biology 2004，5，253)。与它们的受体结合后，细胞因子活化JAK，JAK随后磷酸化细胞因子受体，从而为信号转导分子、尤其是信号转导及转录激活蛋白(signal transducer and activator oftranscription，STAT)家族的成员创建对接位点，最终导致基因表达。已知大量细胞因子活化JAK家族。

因此，仍然存在对有效抑制JAK酶(包括JAK-1、JAK-2、JAK-3和/或Tyk-2)的替代性化合物的需要。

发明内容

本发明提供了式I的化合物：

或其药学可接受的盐，其中R¹是-C_1-4烷基，任选地被羟基取代。

具体地，式I的化合物中R¹是甲基。

具体地，式I的化合物中R¹是乙基或环丁基。

在另一方面中，本发明还提供了：

包含药学可接受的载体和式I化合物的药物组合物，

通过对有需要的哺乳动物施用治疗有效量的式I化合物或其药学可接受的盐，来控制或治疗选自以下的病症或病况的方法：器官移植排斥、狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、癌症、骨关节炎和糖尿病，

通过对有需要的哺乳动物施用治疗有效量的式I化合物或其药学可接受的盐，控制或治疗其中期望免疫抑制或免疫调控的病症或病况的方法，所述病症或病况选自糖尿病、癌症、自身免疫甲状腺病症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、干眼症、阿尔茨海默病、白血病和其他适应征，

通过对有需要的哺乳动物施用治疗有效量的式I化合物或其药学可接受的盐，控制或治疗下述病症或病况的方法，所述病症或病况选自变应性反应，包括变应性皮炎、湿疹、特应性皮炎、搔痒和其他搔痒病况，和炎性疾病如肠疾病，

通过对有需要的哺乳动物施用治疗有效量的式I化合物或其药学可接受的盐，控制或治疗下述病症或病况的方法，所述病症或病况选自哮喘和其他气道阻塞性疾病，包括慢性或长期哮喘、晚发哮喘(late asthma)、气道应答过度(airway hyper-responsiveness)、支气管炎、支气管哮喘、变应性哮喘、内源性哮喘、外源性哮喘、粉尘性哮喘、经常性气道阻塞(recurrent airway obstruction)和慢性阻塞性肺病，

通过对有需要的哺乳动物施用治疗有效量的式I化合物或其药学可接受的盐，抑制蛋白质酪氨酸激酶或JAK-1、JAK-2、JAK-3和/或Tyk-2的方法，

通过对有需要的哺乳动物施用治疗有效量的式I化合物或其药学可接受的盐，抑制蛋白质酪氨酸激酶或JAK-1、JAK-2、JAK-3和/或Tyk-2的方法，和

制备本发明化合物的方法。

附图说明

图1是N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺马来酸盐(A型)的特征性X-射线粉末衍射图。

图2示出了减少与跳蚤相关的搔痒和皮炎试验中跳蚤变应性狗中针对实施例1b的第27天的VAS评分。

图3示出了减少与跳蚤相关的搔痒和皮炎试验中跳蚤变应性狗中针对实施例1b每4小时记录的搔痒秒数。

发明详述

就上文的化合物而言，和在本申请和权利要求通篇中，以下术语具有下文定义的含义。

术语“哺乳动物”是指人或动物，包括家畜和伴侣动物。短语“伴侣动物”是指作为宠物保留的动物。伴侣动物的例子包括猫、狗和马。术语“家畜”是指在农业环境中培养和饲养以制造产物如食品或纤维或使用其劳动力的动物。在一些实施方案中，家畜适合被哺乳动物(例如人)消耗。家畜动物的例子包括哺乳动物如牛、山羊、马、猪、绵羊(包括小羊)和兔，以及鸟如鸡、鸭和火鸡。

术语“控制”、“治疗”疾病包括：(1)预防疾病，即导致可暴露于疾病或对疾病易感但尚未经历或展示疾病症状/征兆的哺乳动物中不产生疾病的临床症状或征兆；(2)抑制疾病，即停止或减少疾病或其临床症状/征兆的发生；或(3)减轻疾病，即引起疾病或其临床症状/征兆的消退。

术语“治疗有效量”表示被施用给哺乳动物来治疗疾病时足以实现治疗此类疾病的化合物的量。“治疗有效量”会根据化合物、疾病及其严重性和待治疗的哺乳动物的年龄、体重等而变化。

用于定义X-射线粉末衍射图中的峰时，术语“约”被定义为所述2θ值±0.2°2θ。确定晶型是否是A型多晶型体(polymorph)并且是否被权利要求覆盖应当考虑该测试中的变化性来解释。

“药学可接受的”表示适合在哺乳动物、伴侣动物或家畜动物中使用。

多种含烃片段的碳原子含量由指出片段中碳原子最小和最大数量的前缀指出，即前缀C_i-j指出整数“i”到整数“j”个碳原子，i和j包括在内。因此，例如C_1-4烷基是指1到4个碳原子的烷基，1和4包括在内。

术语“烷基”是指直链、支链和环状饱和单价烃基，但是涉及个别原子团如“丙基”时仅包括直链原子团，支链异构体如“异丙基”或环状异构体如环丙基甲基或环戊基被明确地指出。

具有相同分子式但其原子键合的性质或顺序或其原子的空间排列不同的化合物被称作“异构体”。其原子空间排列不同的异构体被称作“立体异构体”。本领域技术人员应当明白，式I的化合物可作为顺式-或反式-非手性非对映异构体而存在。具体地，本发明提供了式IA的化合物或其药学可接受的盐，所述化合物具有化学名称N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺，

所述化合物的范围包括本文所述化合物单独的所有异构体(例如顺式-、反式-或非对映异构体)以及任何混合物。所有这些形式均包括在所述化合物内，包括对映异构体、非对映异构体、顺式、反式、同式(syn)、反式(anti-)、溶剂合物(包括水合物)、互变异构体及其混合物。

可以借助于合适的分离方法，以已知的方式将立体异构混合物例如非对映异构体的混合物分离成它们相应的异构体。例如，可以借助于分级结晶、色谱法、溶剂分布和相似的步骤，将非对映异构体混合物分离成它们的个别非对映异构体。所述分离可以在起始化合物之一的水平上发生，或者在式I化合物自身中发生。可以通过形成非对映异构体盐(例如用对映异构体纯净的手性酸形成盐)或者施用具有手性配体的色谱底物，通过色谱(例如通过HPLC)分离对映异构体。

施用途径

在哺乳动物(即人和动物)中治疗病症的治疗性用途中，本发明的化合物或其药物组合物可经口、肠胃外、局部、直肠、经粘膜或肠内施用。肠胃外施用包括间接注射产生全身性效果或直接注射至受折磨的区域。局部施用包括通过局部应用来处理皮肤或可容易达到的器官，如眼或耳。还包括经皮递送以产生全身效应。直肠施用包括栓剂的形成。优选的施用途径是经口和肠胃外。

药物盐

式I的化合物可以以其天然形式使用或者作为盐使用。期望形成稳定的无毒酸或碱盐时，作为药学可接受的盐施用化合物可以是适当的。式I化合物的药学可接受的盐包括乙酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、酮戊二酸盐(etoglutarate)、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、甘油磷酸盐、六氟磷酸盐、羟苄基苯甲酸盐(hibenzate)、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐(methylsulphate)、萘二酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐、盐酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

组合物/配制物

本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方法，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包封、包埋、冻干方法或喷雾干燥来制造。

可以使用便于将活性化合物加工成可药用制剂的一种或多种药学可接受的载体(包括赋形剂和辅料)，以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。适当的配制取决于选择的施用途径。药学可接受的赋形剂和载体是本领域技术人员普遍已知的，因此包括在本发明中。此类赋形剂和载体描述于例如“Remingtons Pharmaceutical Sciences”Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)中。

本发明的配制物可以被设计为短期作用、快速释放、长期作用和延时释放的。因此，药物配制物也可以被配制用于受控释放或用于缓慢释放。

剂量

适合在本发明中使用的药物组合物包括下述组合物，其中以足以实现预期目的(即控制或治疗病症或疾病)的量含有活性成分。更具体地，治疗有效量表示有效预防、减轻或改善疾病症状/征兆或延长被治疗的受试者的存活期的化合物量。

药物组合物及其单位剂型中活性组分(即本发明的化合物)的量可取决于施用途径、具体化合物的效力和期望浓度而广泛变化或调节。治疗有效量的测定完全属于本领域技术人员的能力范围。通常，活性组分的量应在组合物重量的0.01％到99％之间。

通常，治疗有效量的活性组分剂量应在约0.01到约100mg/kg体重/天，优选地约0.1到约10mg/kg体重/天，更优选地约0.3到3mg/kg体重/天，进一步更优选地约0.3到1.5mg/kg体重/天的范围内。应当理解，剂量可取决于每个受试者的要求和被治疗的病症或疾病的严重性而变化。

期望的剂量可便利地存在于单一剂量中，或者作为以适当间隔(例如每天二、三、四或更多个亚剂量)施用的分散剂量而存在。亚剂量自身可被进一步分散，例如成为大量离散的松散分布的施用；如从吹入器多次吸入或者向眼内应用数滴。

还应当理解，可以将施用的初始剂量提高至高于较高水平，从而快速实现期望的血浆浓度。另一方面，初始剂量可以小于最适度，并且根据具体情况，疗程期间每日剂量可逐渐提高。需要时每日剂量也可以被分成多个剂量来施用，例如每天两次或四次。

医学和兽医用途

本发明的化合物是具有针对詹纳斯激酶-1(JAK-1)、詹纳斯激酶-2(JAK-2)和詹纳斯激酶-3(JAK-3)的效力的詹纳斯激酶抑制剂(JAK-i)。因此，它们可作为治疗剂用于器官移植，狼疮，多发性硬化，类风湿性关节炎，银屑病，I型糖尿病和来自糖尿病的并发症，癌症，哮喘，特应性皮炎，自身免疫甲状腺病症，溃疡性结肠炎，克罗恩病，阿尔茨海默病，白血病，骨关节炎，搔痒控制，慢性呼吸疾病和其中期望免疫阻抑/免疫调控的其他适应征。

另外，对在动物中控制特应性皮炎的安全并有效的药剂存在大量需求。在动物中治疗特应性皮炎的市场目前被皮质激素主宰，它们在动物中(特定地在伴侣动物如狗中)引起痛苦和不受欢迎的副作用。也施用抗组织胺类，但是效果较差。目前出售一种环孢霉素的犬配制物(ATOPICA^TM)，但其昂贵并且起效缓慢。另外，ATOPICA^TM存在胃肠道GI耐受问题。本发明的化合物是具有针对JAK-1和JAK-3的效力的JAK抑制剂。这些化合物应当是类固醇使用的替代物，并且为下述慢性搔痒和炎症提供了解决方案，所述慢性搔痒和炎症在去除变应原或引发性物质(如跳蚤变应性皮炎中的跳蚤)后持续为特应性皮炎或者缓慢消退。

本发明的化合物可以单独或与一种或多种调控哺乳动物免疫系统的其他药剂或与消炎剂组合，以药学可接受的形式被施用。这些药剂可包括但不限于环孢菌素A(例如Sandimmune.RTM.或Neoral.RTM.)，雷帕霉素，FK-506(他克莫司)，来氟米特，脱氧精胍菌素，霉酚酸酯(例如Cellcept.RTM.)，硫唑嘌呤(例如Imuran.RTM.)，达克珠单抗(例如Zenapax.RTM.)，OKT3(例如Orthocolone.RTM.)，AtGam，阿司匹林，对乙酰氨基酚(acctaminophen)，布洛芬，萘普生，吡罗昔康和消炎类固醇(例如泼尼松龙或地塞米松)。这些药剂可以作为单独的剂型或相同剂型的一部分、通过相同或不同的施用途径、并且按照相同或不同的施用流程，根据本领域技术人员已知的标准药学实践被施用。

在一个实施方案中，本发明提供了在受试者如人或非人哺乳动物中治疗或预治疗与JAK相关的疾病、病况或病症的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的一种或多种本文所述的化合物。与JAK相关的疾病、病况或病症可与JAK-1、JAK-2、JAK-3和/或Tyk-2相关。可以治疗的合适受试者包括驯养或野生的动物，伴侣动物如狗、猫、马等等；家畜，包括牛和其他反刍动物，猪，家禽，兔等等；灵长动物，例如猴，如恒河猴(rhesus monkey)和猕猴(cynomolgus)(也称作食蟹猴或长尾猴)，狨猴(marmosets)，金丝猴(tamarins)，猩猩，短尾猴(macaques)等等；和啮齿动物，如大鼠、小鼠、沙鼠、荷兰猪等等。在一个实施方案中，化合物以药学可接受的形式，任选地在药学可接受的载体中施用。

JAK/STAT信号转导涉及许多异常免疫应答如变态反应、哮喘、自身免疫疾病如移植物(同种异体移植物)排斥、类风湿性关节炎、肌萎缩性侧索硬化和多发性硬化的介导，还涉及实体和血液恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤。JAK/STAT途径药学介入的综述见Frank，(1999)，Mol.Med.5：432：456and Seidel et al.，(2000)，Oncogene 19：2645-2656。

JAK-3特别涉及多种生物学过程。例如，IL-4和IL-9诱导的鼠肥大细胞的增殖和存活已显示依赖于JAK-3和γ链信号转导。Suzuki et al.，(2000)，Blood 96：2172-2180。JAK-3还在IgE受体介导的肥大细胞脱粒应答中起关键作用(Malaviya et al.，(1999)，Biochem.Biophys.Res.Commun.257：807-813)，JAK-3激酶的抑制显示阻止包括过敏反应在内的I型超敏反应(Malaviya et al.，(1999)，J.Biol.Chem.274：27028-27038)。JAK-3抑制还显示导致同种异体抑制排斥的免疫阻抑(Kirken，(2001)，Transpl.Proc.33：3268-3270)。JAK-3激酶也涉及与以下的早期和晚期阶段相关的机制：类风湿性关节炎(Muller-Ladner et al.，(2000)，J.Immunal.164：3894-3901)；家族性肌萎缩侧索硬化(Trieu et al.，(2000)，Biochem Biophys.Res.Commun.267：22-25)；白血病(Sudbeck et al.，(1999)，Clin.CancerRes.5：1569-1582)；蕈样肉芽肿病，T-细胞淋巴瘤的一种(Nielsen et al.，(1997)，Prac.Natl.Acad.Sci.USA 94：6764-6769)；和异常细胞生长(Yu etal.，(1997)，J.Immunol.159：5206-5210；Catlett-Falcone et al.，(1999)，Immunity 10：105-115)。

JAK激酶(包括JAK-3)在来自下述儿童的原发白细胞中大量表达，所述儿童患有最常见的儿童癌症形式——急性成淋巴细胞白血病，研究业已将某些细胞中的STAT活化与调节凋亡的信号关联在一起(Demoulin etal.，(1996)，Mol.Cell.Biol.16：4710-6；Jurlander et al.，(1997)，Blood 89：4146-52；Kaneko et al.，(1997)，Clin.Exp.Immun.109：185-193；和Nakamura etal.，(1996)，J.Biol.Chem.271：19483-8))。它们还被已知对淋巴细胞的分化、功能和存活是重要的。JAK-3特别地在淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞的功能中发挥关键作用。考虑到该JAK激酶的重要性，调控JAK途径的化合物(包括对JAK-3具选择性的化合物)可用于治疗涉及淋巴细胞、巨噬细胞或肥大细胞功能的疾病或病况(Kudlacz et al.，(2004)Am.J.Transplant 4：51-57；Changelian(2003)Science 302：875-878)。

其中JAK途径的靶向或JAK激酶(特别是JAK-3)的调控被认为在治疗上有用的病况包括关节炎，哮喘，自身免疫疾病，癌症或肿瘤，糖尿病，某些眼疾病、病症或病况，炎症，肠炎症，变态反应或病况，神经变性疾病，银屑病，移植物排斥和病毒感染。可受益于JAK-3抑制的病况在下文更详细地讨论。

因此，式I的化合物或其药学可接受的盐和药物组合物可以被用于治疗多种病况或疾病，如：

关节炎，包括类风湿性关节炎，幼年型关节炎和银屑病关节炎；

哮喘和其他阻塞性气道疾病，包括慢性或或长期哮喘，晚发哮喘，气道应答过度，支气管炎，支气管哮喘，变应性哮喘，内源性哮喘，外源性哮喘，粉尘性哮喘，经常性气道阻塞和慢性阻塞性肺病；

自身免疫疾病或病症，包括称作单器官或单细胞型自身免疫病症的那些，例如桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，自身免疫性溶血性贫血，恶性贫血的自身免疫性萎缩性胃炎(autoimmune atrophic gastritis ofpernicious anemia)，自身免疫性脑脊髓炎，自身免疫性睾丸炎，Goodpasture′s病，自身免疫性血小板减少，交感性眼炎，重症肌无力，格雷夫斯病(Graves′disease)，原发性胆汁性肝硬化，慢性侵袭性肝炎，溃疡性结肠炎和膜性肾小球病，涉及全身性自身免疫性病症的那些，例如系统性红斑狼疮，类风湿关节炎，口眼干燥综合征(Sjogren′s syndrome)，赖特尔综合征(Reiter′s syndrome)，多肌炎-皮肌炎，系统性硬化症，结节性多动脉炎，多发性硬化症和大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)，以及其他自身免疫性疾病，其可以基于O-细胞(体液)或基于T细胞，包括科根综合征(Cogan′s syndrome)，强直性脊椎炎，韦格纳肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)，自身免疫性脱发，I型或青少年发病糖尿病和甲状腺炎；

癌症或肿瘤，包括消化道/胃肠道癌，结肠癌，肝癌，皮肤癌，包括肥大细胞瘤和鳞状细胞癌，乳癌和乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，包括急性髓细胞性白血病和慢性髓细胞性白血病，肾癌，肺癌，肌肉癌，骨癌，膀胱癌，脑癌，黑素瘤，包括口腔黑色素瘤和转移性黑色素瘤，卡波西肉瘤，骨髓瘤，包括多发性骨髓瘤，骨髓增生性病症，增生性糖尿病性视网膜病变，和血管生成相关病症，包括实体瘤；

糖尿病，包括I型糖尿病和糖尿病的并发症；

眼疾病、病症或病况，包括眼的自身免疫性疾病，角膜结膜炎，春季结膜炎，葡萄膜炎，包括与白塞病(Behcet′s disease)相关的葡萄膜炎和晶状体诱导的葡萄膜炎，角膜炎，疱疹性角膜炎，圆锥形角膜炎，角膜上皮营养不良，角膜白斑，眼天疱疮(ocular pemphigus)，莫伦氏溃疡(Mooren′s ulcer)，巩膜炎，Grave′s眼病，Vogt-Koyanagi-Harada综合征，干燥性角膜结膜炎(干眼症)，小水疱，虹膜睫状体炎，结节病，内分泌性眼病，交感性眼炎，变应性结膜炎和眼内新生血管(ocularneovascularization)；

肠道炎症，变态反应或病况，包括克罗恩病和/或溃疡性结肠炎，炎性肠病，腹部疾病，直肠炎，嗜酸细胞性胃肠炎和肥大细胞增多症；

神经变性疾病，包括运动神经元疾病，阿尔茨海默病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化症，亨廷顿病，脑缺血，或由跌打损伤、撞击、谷氨酸盐神经毒性或缺氧引起的神经变性疾病；中风、心肌缺血、肾缺血、心脏病、心肌肥大、动脉粥样硬化和动脉硬化、器官缺氧和血小板聚集中的缺血/再灌注损伤；

皮肤疾病、病况或病症，包括特应性皮炎，湿疹，银屑病，硬皮病，瘙痒和其他搔痒性病况；

变应性反应，包括哺乳动物中的特应性皮炎，包括马变应性疾病，如马中的叮咬超敏(bite hypersensitivity)，夏季湿疹和钩虫痒病(sweetitch)。

移植物排斥，包括胰岛移植物排斥，骨髓移植物排斥，移植物抗宿主病，器官和细胞移植物排斥，如骨髓，软骨，角膜，心，椎间盘，胰岛，肾，肢体，肝，肺，肌肉，成肌细胞，神经，胰腺，皮肤，小肠，或气管，和异种移植；以及

另一实施方案提供了抑制JAK酶(包括JAK-1、JAK-2、JAK-3和/或Tyk-2)的方法，所述方法包括将JAK酶与非治疗量或治疗有效量的一种或多种本发明的化合物接触。此类方法可体内发生或体外发生。体外接触可涉及筛选测定法，所述测定法针对多种用量或浓度的被选择的酶测定一种或多种化合物的效力。与治疗有效量的一种或多种化合物的体内接触可涉及其中发生接触的动物中所述疾病、病症或病况的治疗或器官移植物排斥的预防。也可以测定或测量一种或多种化合物对JAK酶和/或宿主动物的影响。测定JAK活性的方法包括实施例中所述以及WO 99/65908、WO99/65909、WO 01/42246、WO 02/00661、WO 02/096909、WO2004/046112或WO 2007/012953中公开的方法。

以下反应流程图阐述了本发明化合物的一般合成步骤。所有起始材料通过这些流程图中描述的步骤制备，或者通过本领域常规技术人员已知的步骤制备。

流程图I

本领域技术人员应当明白，在本发明化合物的合成期间，敏感的官能团(Pg或Pg1)可能需要被保护和去保护。这可以通过例如TW Greene和PGM Wuts，John Wiley & Sons Inc(1999)的“Protective Groups in OrganicSynthesis”以及其中参考文献中所述的常规方法来实现。

在流程图I中，4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(a)可以商业获得。反式-4-(甲氨基)-环己基]甲醇(b)可通过在0-60℃的温度下在疏质子的无水溶剂(如四氢呋喃)中用还原剂(如氢化铝锂)处理而得自相应的羧酸，反式-4-[(叔-丁氧羰基)氨基]环己烷羧酸。

如流程图I中所示，可以通过4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(a)与反式-4-(甲氨基)-环己基]甲醇(b)的下述反应合成结构(c)的化合物，所述反应在高达90℃的提高的温度下、存在合适碱如三乙胺和碳酸钾时在合适的疏质子极性溶剂如N，N-二甲基甲酰胺、水性二噁烷和二甲基亚砜中进行多达数小时。

结构(d)的化合物可以在两步骤程序中由结构(c)的化合物合成。例如，结构(d)的化合物可如下合成：首先在极性疏质子溶剂如二氯甲烷中使用溴化试剂如亚硫酰溴或三溴化磷，以供应未受保护的环己基甲基溴化物，其次添加合适的保护性试剂如甲苯磺酰基氯化物，得到受保护的结构(d)的化合物。

结构(e)的化合物可以通过使用简单的保护处理由结构(c)的化合物制备。例如，当Pg和Pg₁均为甲苯磺酰基时，这可以通过在存在极性疏质子溶剂(如二氯甲烷)、催化剂(如DMAP)和弱碱(如三乙胺)时处理结构(c)的未受保护的化合物，而在单步骤反应中实现。

结构(f)的化合物可以使用合适的亲核试剂通过S-烷基化由结构(e)的化合物合成。因此，其中保护性基团(Pg₁)是合适的羟基保护基团如甲苯磺酰基或甲磺酰基的结构(e)的化合物可在高达75℃的提高的温度下，在极性溶剂如二甲基亚砜或N-甲基吡咯烷中与硫代乙酸钾反应多达2小时，得到结构(f)的化合物。

结构(g)的化合物可以通过氧化过程由结构(f)的化合物合成。许多氧化条件是本领域技术人员已知的，例如S.D.Burke和R.L Danheiser编辑的“Handbook of Reagents for Organic Synthesis-Oxidising and ReducingAgents”中所述的那些。例如，可用甲酸处理任选地用水润湿的结构(f)的化合物，之后缓慢添加过氧化氢，同时在室温下搅拌约15小时，得到结构(g)的化合物。或者，如果反应在存在乙酸钾时进行，可以在极性溶剂如乙酸中使用臭氧，生产式(g)化合物的钾盐。

可以想到的是，结构(g)的化合物可以由结构(e)的化合物通过在极性溶剂中用合适的含硫亲核试剂如亚硫酸钠处理而直接合成。类似地，结构(g)的化合物可以由结构(d)的化合物通过用亚硫酸钠亲核取代而被合成。

在疏质子极性溶剂如二氯甲烷与极性共溶剂如N，N-二甲基甲酰胺中，在回流下用氯化剂如亚硫酰二氯处理式(g)的磺酸，得到氯化的化合物。氯化的化合物随后在室温下在疏质子的无水溶剂如四氢呋喃中，与纯的、气态形式的或溶于疏质子的无水溶剂(如四氢呋喃)中的合适胺反应，产生结构(h)的化合物。任选地，可以使用无水的弱碱如三乙胺，来消除反应中产生的盐酸。

本发明的式I的化合物可以通过本领域技术人员已知的去保护过程，由其中Pg是合适的保护基团的式(h)的化合物制备。例如，当保护基团(Pg)是甲苯磺酰基时，合适的去保护条件涉及在质子溶剂如甲醇或异丙醇和任选地可混溶的共溶剂如四氢呋喃和水中，在室温下与碱如氢氧化锂或氢氧化钾反应若干小时，以生产式I的去保护的胺。

可以在存在质子溶剂如丁醇和任选地共溶剂如水时，通过式I化合物的游离碱与合适酸如马来酸的反应，来形成式I化合物的盐。

或者，本发明的化合物可以根据流程图II来制备。

流程图II

在流程图II中，可以使用本领域公知的过程，使用保护性试剂如甲苯磺酰基氯化物，从可商业获得的(a)获得4-甲基-7-[(4-甲苯基)磺酰]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(j)。可以在0-110℃之间的温度下，在无水溶剂如甲苯中用还原剂如红铝(Vitride)处理若干小时，由相应的羧酸，反式-4-[(叔-丁氧羰基)氨基]环己烷羧酸获得反式-4-(甲氨基)-环己基]甲醇(b)。

如流程图II中所示，可以通过4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(j)与反式-4-(甲氨基)-环己基]甲醇(b)在高达60℃的提高的温度下，在存在合适的碱如三乙胺与催化量的碘化钾时，在合适的溶剂如丙酮中多达数小时的反应，来合成结构(k)的化合物。

可以在高达60℃的提高的温度下，在合适的溶剂如丙酮中，在存在合适的碱如三乙胺或二乙基异丙胺时，通过添加合适的甲磺酸化试剂如甲磺酰基氯化物来合成结构(k)的化合物，得到结构(k)的甲磺酰基化合物。

可以使用合适的亲核试剂，通过使用简单的S-烷基化方法，由结构(k)的化合物制备结构(l)的化合物。因此，结构(k)的化合物可以在溶剂如异丙醇或水或甲苯中，在高达90℃的提高的温度下与亚硫酸钠反应多达4小时，得到结构(l)的化合物。

在0和40℃之间的温度下，在疏质子极性溶剂如THF或二氯甲烷与极性共溶剂如N，N-二甲基甲酰胺中，用氯化剂如亚硫酰氯处理式(l)的磺酸得到氯化的化合物。氯化的化合物随后在室温下在疏质子的无水溶剂如四氢呋喃中，与优选纯的、气态形式的或溶于疏质子的无水溶剂(如四氢呋喃)中的合适胺(如甲胺、环丁胺或2-羟基氮杂环丁烷)反应，产生结构(h)的化合物。任选地，可以使用无水的弱碱如三乙胺，来消除反应中产生的盐酸。

实施例

制剂1 N-甲基-1-[反式-4-(甲基{7-[(4-甲苯基)磺酰]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}氨基)环己基]甲磺酰胺

方法(a)向四氢呋喃(1.0l)中的制剂2化合物(308.0g湿重，214.5g干重，0.41mol)的溶液中添加甲胺(四氢呋喃中2M，687ml)，耗时1小时。在室温下搅拌30分钟后，添加额外的甲胺(四氢呋喃中2M，53ml)，并将反应混合物在室温下搅拌18小时。通过真空蒸馏将混合物体积减少至600ml，添加四氢呋喃(300ml)，之后再将混合物的体积减小至约750ml。向45℃下加热的混合物中添加2-丙醇(247ml)和水(693ml)。冷却至室温后，通过过滤收集固体材料，用水(2x250ml)洗涤并在65℃下真空干燥，得到标题化合物(180.4g)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：1.17-1.32(2H)，1.57-1.73(4H)，1.76-1.92(1H)，1.93-2.08(2H)，2.30-2.39(3H)，2.53-2.62(3H)，2.87-2.98(2H)，3.07-3.17(3H)，4.53-4.75(1H)，6.81-6.94(1H)，7.38-7.47(2H)，7.56-7.65(1H)，7.92-8.02(2H)，8.15-8.27(1H).

方法(b)向0-5℃下THF(1.65l)和N，N-二甲基甲酰胺(5.0ml)中的制剂2化合物(165g，0.34mol)的溶液添加亚硫酰氯(125ml，17mol)，耗时25分钟。将反应混合物在0-5℃下搅拌30分钟后，缓慢加热至40℃，保持8小时。冷却至室温后，在减压下蒸发溶剂并与THF共沸去除硫酰氯。向获得的磺酰氯中添加新鲜的THF(1.65l)，并将混合物冷却至0℃。用干燥的N-甲胺气体鼓泡30分钟，将反应在室温下再搅拌4小时。将溶剂蒸发至其一半体积(800ml)并添加己烷(1.5l)。产物沉淀出来，将其过滤并用水(1l)冲洗得到标题化合物(80g)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：1.17-1.32(2H)，1.57-1.73(4H)，1.76-1.92(1H)，1.93-2.08(2H)，2.30-2.39(3H)，2.53-2.62(3H)，2.87-2.98(2H)，3.07-3.17(3H)，4.53-4.75(1H)，6.81-6.94(1H)，7.38-7.47(2H)，7.56-7.65(1H)，7.92-8.02(2H)，8.15-8.27(1H)

制剂2[反式-4-(甲基{7-[(4-甲苯基)磺酰]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}氨基)环己基]甲磺酰氯

向二氯甲烷(1.2l)和N，N-二甲基甲酰胺(4.1ml)中的制剂3化合物(210.0g，0.42mol)的溶液添加亚硫酰氯(151.0ml，2.1mol)，耗时25分钟。将反应混合物在回流下加热18小时，然后通过真空蒸馏将体积减少至800ml。向在约30℃下加热的混合物添加乙酸乙酯(1.1l)，耗时1小时，之后在室温下耗时20分钟添加己烷(546ml)。将混合物冷却至0℃并搅拌1小时，在氮气中通过过滤收集沉淀物。用己烷(2x125ml)洗涤固体得到标题化合物(308.0g湿重)，将其在氮气中储存并直接使用。

制剂3[反式-4-(甲基{7-[(4-甲苯基)磺酰]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}氨基)环己基]甲磺酸

方法(a)向制剂4化合物(100.0g湿重，23.5g干重，47.8mmol)与甲酸(82.0g，68.0ml，1.8mol)的混合物中添加过氧化氢(水中35wt.％，21.0ml，0.26mol)，耗时10分钟。将反应混合物在室温下搅拌15小时，然后通过添加至水性偏亚硫酸钠(sodium metabisulfate)或焦亚硫酸氢钠(sodium metabisulfite)溶液(33wt.％，35ml)将其淬灭。对混合物添加水(5ml)、2-丙醇(50ml)和水性氢氧化钠溶液(33wt.％，161ml)，并将浆体在室温下搅拌1小时。通过过滤收集固体材料，用水(100ml)洗涤并在60℃下真空干燥，得到标题化合物(26.0g)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：0.98-1.18(2H)，1.55-1.76(5H)，1.99-2.13(2H)，2.29-2.39(5H)，3.05-3.15(3H)，4.47-4.76(1H)，6.77-6.92(1H)，7.38-7.48(2H)，7.54-7.62(1H)，7.91-8.02(2H)，8.17-8.25(1H)

方法(b)向IPA-水(各585ml，1∶1，V/V)中东制剂3化合物的溶液添加硫酸钠，并将混合物加热至80-90℃，保持24小时。使其冷却至室温后，将溶剂蒸发多达50％，并通过添加乙酸将反应混合物的pH调节至3-4的范围内。添加甲苯(1l)并将混合物蒸发至80％。添加更多甲苯(1l)并将混合物回流4小时。倾析甲苯，通过在真空下干燥获得得到的标题化合物(168g)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：0.98-1.18(2H)，1.55-1.76(5H)，1.99-2.13(2H)，2.29-2.39(5H)，3.05-3.15(3H)，4.47-4.76(1H)，6.77-6.92(1H)，7.38-7.48(2H)，7.54-7.62(1H)，7.91-8.02(2H)，8.17-8.25(1H)

制剂4 S-{[反式-4-(甲基{7-[(4-甲苯基)磺酰]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}氨基)环己基]甲基}硫代乙酸酯

向硫代乙酸钾(11.4g，99.4mmol)在二甲基亚砜(30ml)中的溶液添加二甲基亚砜(130ml)中的制剂5化合物(50.0g，87.9mmol)。将反应混合物在55℃下加热3小时，冷却至室温并通过添加至水性碳酸氢钠溶液(0.1M，640ml)将其淬灭。将混合物冷却至13℃，通过过滤收集得到的沉淀物，用水(250ml)洗涤得到标题化合物(204.0g湿重)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：1.06-1.23(2H)，1.39-1.51(1H)，1.51-1.70(4H)，1.74-1.88(2H)，2.30-2.40(6H)，2.73-2.84(2H)，3.06-3.14(3H)，4.44-4.76(1H)，6.76-6.94(1H)，7.36-7.49(2H)，7.56-7.62(1H)，7.90-8.02(2H)，8.17-8.26(1H)

制剂5[反式-4-(甲基{7-[(4-甲苯基)磺酰]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}氨基)环己基]甲基4-甲基苯磺酸酯

向二氯甲烷(1l)中的制剂6化合物(42.0g，0.16mol)的溶液中添加三乙胺(68.3g，0.68mol)和4-二甲基氨基吡啶(1.0g，8.2mmol)，之后添加对-甲苯磺酰氯(62g，0.33mol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，之后再添加对-甲苯磺酰氯(45.5g，0.24mol)。搅拌18小时后，将混合物真空浓缩，并将一部分残余物(约309g)在甲醇(758ml)中制浆15分钟。向浆体中添加水(600ml)和饱和的水性碳酸氢钠溶液(142ml)，并将混合物搅拌1小时。通过过滤收集固体材料并用甲醇∶水[1∶1，50ml]、水(50ml)和己烷(50ml)洗涤。将固体在60℃下真空干燥，得到标题化合物(87.1g)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：1.02-1.20(2H)，1.53-1.75(7H)，2.31-2.39(3H)，2.39-2.47(3H)，3.04-3.12(3H)，3.80-3.91(2H)，4.34-4.76(1H)，6.78-6.93(1H)，7.37-7.54(4H)，7.54-7.64(1H)，7.75-7.84(2H)，7.91-8.01(2H)，8.14-8.25(1H)

制剂6{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}-甲醇

将水(1l)和1，4-二噁烷(100ml)中的化合物反式-4-(甲氨基)环己基]甲醇(可根据WO 2002/14267中所述步骤制备)(50.0g，0.35mol)、4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(可商业获得，42.9g，0.27mol)和碳酸钾(57.3g，0.42mol)的混合物在90℃下加热15小时。向混合物添加制剂7化合物(2.0g，14.0mmol)，并将反应混合物在90℃下再加热1小时。冷却至室温后，将混合物搅拌1小时，通过过滤收集固体材料，用水(150ml)洗涤并在65℃下真空干燥，得到标题化合物(72.7g)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：1.00-1.19(2H)，1.30-1.45(1H)，1.52-1.77(4H)，1.77-1.91(2H)，3.09-3.20(3H)，3.20-3.29(2H)，4.37-4.51(1H)，6.45-6.57(1H)，7.06-7.17(1H)，8.01-8.14(1H)

制剂7[反式-4-(甲基{7-[(4-甲苯基)磺酰]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基}氨基)环己基]甲基亚磺酸酯

向丙酮(600ml)中的制剂4化合物(60.0g，0.418mo)的溶液添加三乙胺(117.5ml，0.837mol)和催化性碘化钾(3.4g，0.05mol)，之后添加4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(可商业获得，102.8g，0.335mol)。将得到的混合物加热至60℃，持续22小时。使其冷却至室温后添加丙酮(300ml)，之后添加三乙胺(146.9ml，1.04mol)，之后添加甲基磺酰氯(mesyl chloride)(81.7ml，1.047mol)。在室温下搅拌4小时后，添加水(1.8l)，之后产物沉淀出来。将产物过滤，干燥并与MTBE-庚烷(6∶4，600ml)的混合物一起研磨。进行MTBE-庚烷的第二次研磨，并获得得到的标题化合物(120g)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：

制剂8[反式-4-(甲氨基)环己基]甲醇

耗时1小时向甲苯(1l)中的反式-4-[(叔-丁氧羰基)氨基]环己烷羧酸(可商业获得，100g，0.4109mol)的溶液逐滴添加红铝(Vitride)溶液(65％，767ml，2.465mol)。完成添加后，将反应混合物加热至100-100℃下回流。用低于10℃的温度下的水性硫酸钠溶液(800ml)淬灭反应混合物。将反应混合物滤过硅藻土，用DCM(500ml)之后用水(100ml)洗涤滤饼。分离有机层，并用DCM将水性层萃取两次(600ml之后400ml)。在硫酸钠上干燥合并的有机层，并真空浓缩得到标题化合物(62g)。

¹H-NMR(CD₃OD)：1.08-1.31(4H)，1.51-1.64(1H)，1.93-2.05(2H)，2.10-2.22(2H)，2.38-2.50(1H)，2.50-2.54(3H)，3.48-3.55(2H)

实施例1a

制备N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺。

向2-丙醇(1.2l)中的制剂1化合物(250.0g，0.48mol)的溶液添加水(1.2l)中的氢氧化锂(48.7g，2.03mol)。将反应混合物在40℃下加热8小时，然后在室温下搅拌18小时。将混合物过滤，用2-丙醇∶水(1∶1，100ml)充分洗涤并通过添加盐酸(6N)将滤液调节至pH 7.5。搅拌1小时后，通过过滤收集固体材料，用2-丙醇∶水(1∶2，240ml)洗涤并在60℃下真空干燥，得到作为游离碱的标题化合物(148.7g)(实施例1a)。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：1.20-1.39(2H)，1.62-1.75(4H)，1.77-1.91(1H)，1.97-2.11(2H)，2.54-2.63(3H)，2.89-2.99(2H)，3.10-3.21(3H)，4.44-4.86(1H)，6.43-6.61(1H)，7.01-7.19(1H)，7.94-8.16(1H)

实施例1b

制备N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺马来酸盐

将1-丁醇(3200ml)和水(400ml)中实施例1a的化合物(212.0g，628.3mmol)和马来酸(67.2g，579.0mmol)的混合物在室温下搅拌18小时。通过真空蒸馏(55℃，100mbar)将混合物体积减少至1600ml，然后冷却至0℃。通过过滤收集得到的固体，用己烷(500ml)洗涤并在35℃下真空干燥，得到作为已知为A型的晶型的N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]-环己基}甲磺酰胺(253.0g)。

实验值MH⁺338.2；预期值338.2。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：1.24-1.38(2H)，1.68-1.92(5H)，2.00-2.11(2H)，2.56-2.61(3H)，2.91-3.00(2H)，3.15-3.27(3H)，4.39-4.70(1H)，6.53-6.73(1H)，7.16-7.36(1H)，8.07-8.29(1H).

实施例1c

针对N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}-甲磺酰胺马来酸盐(A型)收集粉末X-射线衍射的方法

使用装有自动进样器、θ-θ侧角仪、自动光束分束缝隙和PSD Vantec-1检测器的Bruker-AXS Ltd.D4粉末X-射线衍射计，收集A型N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}-甲磺酰胺马来酸盐的粉末X-射线衍射图。通过安装在低背景空腔硅片试样支架上，制备样品用于分析。将试样旋转同时用40kV/35mA下运行的X-射线管以铜K-α₁X-射线

辐照。分析用连续模式下运行的侧角仪进行，所述连续模式被设定为在2°到55°的2θ范围中每0.018°的步幅进行0.2秒计数。结果概括于表1和表2中。

表1

以2-θ度数表述的粉末X-射线衍射峰，约±0.2度

2-θ角	强度I％	2-θ角	强度I％	2-θ角	强度I％
						6.178	72.6	17.997	32.3	24.86	19.8
8.519	24.5	18.539	44.5	25.602	10.7
						12.601	88.4	20.298	18.2	26.582	13
13.819	38	20.659	27.8	27.02	30.6
						15.478	34.3	21.583	11.1	27.721	18.7
15.719	100	22.642	12.7	28.161	23.7
						16.32	27.1	23.08	12.1	28.38	28.9

表2

以2-θ度数表述的所选择的粉末X-射线衍射峰，约±0.2度

本领域技术人员众所周知，任何X-射线粉末衍射的结果可以变化，并且继而XRPD结果可不相同，即使用同一批材料进行。所述变化可归因于测试样品制备、温度、使用的X-射线衍射计的具体型号、操作者的技术等等。用于定义X-射线粉末衍射图中的峰时，术语“约”被定义为所述2θ值±0.2°2θ。确定晶型是否是A型多晶型体(polymorph)并且是否被权利要求覆盖应当考虑该测试中的变化性来解释。

所述变化性阐述于图1中。将不同的两批N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}-甲磺酰胺马来酸盐A型呈递给相同的XRPD衍射计。图1中的特征峰证实其为A型多晶型体。然而，这些峰的相对强度以及其他鉴定性峰有轻微变化。

实施例2

制备N-环己基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺

按照实施例1的一般过程并进行非关键性的变化，但是将前体取代为环丁胺，从而提供标题化合物。

实验值MH⁺378.0；期望值378.2

¹H-NMR(d₆-DMSO)：1.22-1.32(2H)，1.47-1.70(6H)，1.78-2.04(5H)，2.16-2.24(2H)，2.85-2.86(2H)，3.15(3H).3.68-3.78(1H)，4.60-4.72(1H)，6.51-6.54(1H)，7.11-7.12(1H)，7.44-7.49(1H)，8.08(1H)，11.60(1H)

实施例3

制备N-乙基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺

按照实施例1的一般步骤并进行非关键性的变化，但是将前体取代为乙胺，从而提供标题化合物。

实验值MH⁺352.0；期望值352.2

¹H-NMR(CDCl₃)：1.24-1.44(5H)，1.64-1.74(2H)，1.87-2.09(3H)，2.15-2.21(2H)，2.97-2.99(2H)，3.18-3.27(5H)，4.46-4.52(1H)，4.74-4.86(1H)，6.55(1H)，7.04(1H)，8.28(1H)

实施例4

JAK酶促试验

材料：重组的JAK-2(目录号PV4210)和JAK-3(目录号PV3855)购自(Invitrogen Corporation，Madison，WI)。所述研究中使用的重组JAK-1(GST-JAK-1(852-1142))和Tyk-2(GST-Tyk2(870-1187，C1187S))在辉瑞实验室表达和纯化。5’-三磷酸腺苷(ATP)得自Sigma ChemicalCompany，St.Louis，MO。用于JAK-2和JAK-3试验的JAKtide肽(肽序列，FITC-KGGEEEEYFELVKK(SEQ ID NO：1))和用于JAK-1和Tyk-2试验的IRS-1肽(肽序列5-FAM-KKSRGDYMTMQIG(SEQ ID NO：2))购自(American Peptide Company，Sunnyvale，CA)。涂层试剂3购自(Caliper LifeSciences，Hopkinton，MA)。

方法：使用肽迁移率变动试验(peptide mobility shift assay)定量JAKtide(JAK-2和JAK-3)或IRS-1肽(JAK-1和Tyk-2)的磷酸化。反应在384-孔平板(Matrical MP-101)中以10微升的总体积进行。反应混合物含有20mM HEPES，pH 7.4，10mM氯化镁，0.01％牛血清白蛋白(BSA)，0.0005％吐温-20，ATP(JAK-2和JAK-3为4微摩尔，JAK-1为40微摩尔，Tyk-2为7微摩尔)，2％DMSO和1微摩尔肽底物(对JAK-2和JAK-3而言为JAKtide，或对JAK-1和Tyk-2而言为IRS-1)。将化合物在100％二甲基亚砜中系列稀释，并一式两份或一式四份地在11点计量应答中测试(每10微升反应添加200nl化合物/DMSO)。通过添加酶至2nM JAK-2、1nM JAK-3、7nM Tyk2或20nM JAK-1的终浓度，引发反应。试验对JAK-1而言运行240分钟，对JAK-2而言运行150分钟，对JAK-3而言运行90分钟，对Tyk-2而言运行60分钟。在指定的时间用20微升140mM HEPES，22.5mM EDTA和0.15％涂层试剂3终止试验。将平板置于LabChip 3000(LC3000)仪器(Caliper Life Sciences)上以测量经磷酸化的肽的形成。使用来自(Caliper Life Sciences)的Hits Well AnalyzerSoftware分析数据，获得形成的产物量。

然后将数据输入内部应用程序中，其中每个数据点被表述为以未受抑制的和无酶的对照为基础的％抑制。然后使用4参数对数方程(方程1)拟合剂量应答数据，以测定IC₅₀值。

等式1： $y=\frac{\max -\min }{1+{\left(\frac{x}{{\mathrm{IC}}_{50}}\right)}^s}+\min$

其中max是拟合的未受抑制的值，min是拟合的完全抑制值，s是斜率因子。

使用所述方案，针对实施例1和2的标题化合物产生以下结果。

表3

JAK酶促测定法结果

Ex.#	JAK-1 IC50	JAK-2 IC50	JAK-3 IC50	Tyk-2 IC50
					1a	9.53nM	17.5nM	95.1nM	75.1nM
2	45.0nM	101.0nM	742nM	-

实施例5

犬体外T-细胞增殖试验

T-细胞活化在多种炎性和自身免疫病症以及哮喘、变态反应和搔痒中起关键作用。因为T-细胞活化能够部分被通过JAK-STAT途径传导信号的细胞因子引发，所以JAK抑制剂能够有效针对涉及异常的T-细胞活化的此类疾病。

方法：在肝素钠管中收集来自29只小猎犬(beagle dog)和23只杂种狗(mixed breed dog)的犬全血。将全血(20μL)涂布在含180μL培养基(RPMI 1640，Gibco#21870-076，具有1％经热失活的胎牛血清，Gibco#10082-39，292μg/ml L-谷氨酰胺，Gibco#250030-081，每ml 100u/ml青霉素和100μg链霉素，Gibco#15140-122)的96孔板(Costar 3598)中，所述培养基含有载剂对照或测试化合物(0.001到10μM)刀豆素A(ConA；1μg/ml，Sigma C5275)和犬干扰素-2(IL-2；50ng/ml，R&DSystems 1815-CL/CF)。使用含有全血、含载剂对照而不含ConA或IL-2的孔作为背景对照。将平板在37℃下孵育48小时。添加0.4μCi/孔(Perkin Elmer，Net027A-005MC)的氚化胸腺嘧啶，再孵育20小时。将平板冷冻然后融化，洗涤并使用Brandel MLR-96细胞收集器和预湿滤垫(Wallac 1205-401，Perkin Elmer)过滤。将滤器在60℃下干燥1小时(Precision 16EG对流烤箱)，并置于含10mL闪烁剂(scintillant)(Wallac 1205-440，Perkin Elmer)的滤样袋(Wallac 1205-411，PerkinElmer)中。将密封的滤器在LKB Wallac 1205 Betaplate液体闪烁计数器上计数。通过Gterm Betaplate程序v1.1(Wallac版权1989-1990)收集数据，并使用下式计算转化为百分比抑制：

使用GraphPad Prism 4.0将数据图示为百分比抑制，并使用点对点分析拟合IC₅₀曲线。

结果 对实施例1a的化合物而言使用来自小猎犬的全血获得的平均IC₅₀值为66.3nM；对实施例2而言为410nM；对实施例3而言为83nM。对实施例1a的化合物而言，使用来自杂种狗的全血获得的平均IC₅₀值为138nM。这些数据表明本发明的化合物有效地抑制许多疾病中的关键特征——T-细胞增殖。

实施例6

减少跳蚤相关搔痒和皮炎的试验

跳蚤相关的搔痒和皮炎是狗中常见的皮肤病症。搔痒是与跳蚤相关的皮炎的最严重的临床征兆之一，并且持续的抓挠、蹭脸和嚼脚(footchewing)可导致皮肤的多种改变，如红斑、水肿、脱毛、苔藓化和色素沉着过度。可以实验性地减少与跳蚤相关的搔痒和皮炎。在这些模型中，炎性细胞和细胞因子显示介导对变应原的免疫反应。因此，抑制引起搔痒和引起炎症的细胞因子受体的信号转导的JAK抑制剂可有效抑制、减少或最小化与跳蚤相关的搔痒和皮炎。

研究设计

在开始给药之前14天用约100只未饲喂的成年猫跳蚤(Ctenocephalides felis)感染体重范围5-35kg并且大于一岁龄的二十八只雄性和雌性杂种狗，并在整个研究期间每4天用每只狗30只跳蚤再感染。给药前七天，以皮肤损伤的视觉模拟评分(visual analog scale，VAS)为基础，将二十四只狗随机化分入三个不同的处理组：安慰剂、0.5mg/kg或0.25mg/kg实施例1b的化合物。每天两次口服给予处理，持续28天，并在研究期间评价搔痒行为以及红斑和皮肤损伤。通过将狗置于具有视频录制功能的圈中来记录搔痒行为，并耗时4小时记录其活动。通过测定狗用于抓挠的秒数来定量搔痒活动。通过腹部、腹股沟区域的图像捕获记录皮肤损伤，并根据视觉模拟评分(VAS)对严重性分级。

统计学分析：

使用用于重复测量的混合线性模型，分析视频捕获的搔痒行为的耗时(elapsed time)。模型包括如下的固定作用：处理和研究天数以及处理和研究天数的相互作用。随机作用包括封闭(block)、封闭和处理的相互作用以及误差。使用搔痒行为的基线数据(-1天)作为搔痒行为分析中的相关变异(covariate)。估算最小二乘法均值(Least squares mean)并构建90％的置信区间。从经对数转化的数据的最小二乘法均值计算几何均值。先验对比(A priori contrasts)被用于评价处理。处理差异被评价为10％显著性水平(P≤0.10)。

结果

处理结果展示于图2和图3中。在0.5mg/kg组中，损伤和红斑显著减少。图2阐述了跳蚤变应性狗中实施例1b的第27天VAS评分(最小二乘法均值)。两组均在研究期间的多个时间点处观察到10％显著性水平上与安慰剂相比搔痒的显著减少(0.25mg/kg剂量而言第1、4和12天，0.5mg/kg剂量而言第1和20天)。图3阐述了跳蚤变应性狗中针对实施例1b记录的每4小时的搔痒秒数(长几何均值(Long Geometric Mean))。

实施例7

细胞增殖抑制试验

猫细胞系

MYA-1和FETJ是得自ATCC(Manassas，VA)的猫T-淋巴母细胞系。在37℃下具有5％CO₂的潮湿培养箱中，在补充有10％FBS的RPMI1640完全培养基中培养这些细胞。

离体犬淋巴结组织

由Michigan State University(MSU)Veterinary College的兽医工作人员切下恶性淋巴结，置于运输培养基(补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和0.25ug/mL两性霉素B(Invitrogen/Gibco

)的Advanced RPMI 1640完全培养基)中。在取出后24小时内，通过切成小块并经过组织筛来加工结节。将细胞悬浮液在200x g离心，去除上清液，并将细胞沉淀物在室温下于NH₄Cl中重悬10分钟。通过离心沉淀细胞悬浮液；去除NH₄Cl，用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤一次，之后重悬于增殖培养基(Advanced RPMI完全，1％FBS，50nM 2-巯基乙醇，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素和0.25ug/mL两性霉素B)中。然后使细胞悬浮液通过100μm尼龙细胞滤网(BD-Falcon)并使用血球计计数。将细胞在单独的增殖培养基、补充有0.005％Pansorbin

(热失活的，福尔马林固定的Staphylococcus Aureus细胞(SAC)，Calbiochem)和10ng/mL犬IL-2(R&D Systems)的增殖培养基，和补充有125ng/mL刀豆素A(Sigma)和125ng/mL脂多糖(LPS；Calbiochem)的增殖培养基任一中培养。

体外抗增殖试验方法

将在上述培养基中培养的细胞以1x10³细胞/孔(猫细胞系)或2x10⁵细胞/孔(淋巴结细胞)的密度涂布于96-孔 Costar平板(Corning)中，并在37℃下含5％CO₂的潮湿培养箱中暴露于不同浓度的测试化合物多达5天。使用CellTiter 96AQ_ueous非放射性细胞增殖试验(Promega)根据制造商的说明测定对增殖的影响。通常，使用可溶的四唑盐(MTS)和电子偶合剂间接测量增殖。在Spectramax平板读数器上使用Softmax Pro 4.6软件(Molecular Devices)，通过490nM处的吸光度监测MTS生物还原成为可溶于组织培养基中的甲臜(formazan)产物。使用GraphPad Prism 4.00将数据图示为百分比DMSO对照，并使用具有S形剂量应答的非线性回归模型拟合IC₅₀曲线。

结果

表4证实实施例1的化合物能够抑制其增殖依赖于IL-2的猫淋巴细胞系MYA-1的增殖，但是不能抑制不依赖于IL-2的株系(FETJ)的增殖。式IA的化合物或其盐也可以抑制得自被诊断患有T-或B-细胞淋巴瘤的狗的犬结组织的增殖。这些结果表明JAK抑制剂可有效治疗犬和猫淋巴瘤。

物种	细胞系或淋巴结	描述	培养基中的刺激物	IC50(nM)
					猫	MYA-1	淋巴系		122(n＝2)
猫	FETj	淋巴系		＞1000
					犬	MSU LN 8	新生T-细胞淋巴瘤	LPS+ConA	357
犬	MSU LN 8	新生T-细胞淋巴瘤	SAC+IL-2	38
					犬	MSU LN 9	新生B-细胞淋巴瘤	LPS+ConA	147
犬	MSU LN 9	新生B-细胞淋巴瘤	SAC+IL-2	100
					犬	MSU LN 10	抗化疗的B-细胞淋巴瘤-	LPS+ConA	687
犬	MSU LN 11	新生B-细胞淋巴瘤	LPS+ConA	64

Claims (13)

1.式I的化合物或其药学可接受的盐：

其中R¹是任选地被羟基取代的C_1-4烷基。

2.权利要求1所述的化合物，其中R¹是甲基。

3.权利要求1所述的化合物，其中R¹是乙基或环丁基。

4.权利要求1所述的化合物，其为N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺，或其药学可接受的盐。

5.药物组合物，其包含权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐和药学可接受的载体。

6.权利要求1所述的化合物用于制备用于治疗哺乳动物中变应性反应、变应性皮炎、特应性皮炎、湿疹或搔痒的药物的用途。

7.权利要求6所述的用途，其中所述哺乳动物是伴侣动物。

8.权利要求7所述的用途，其中所述伴侣动物是狗。

9.权利要求6所述的用途，其中所述哺乳动物是家畜。

10.权利要求1所述的化合物用于制备用于在哺乳动物中治疗神经变性疾病、角膜结膜炎、慢性呼吸疾病、自身免疫病、炎性肠病、瘤形成和关节病症的药物的用途。

11.权利要求1所述的化合物用于制备用于在哺乳动物中治疗癌症、白血病、狼疮、多发性骨髓瘤的药物的用途。

12.N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺马来酸盐的晶型A，所述晶型A包含具有以2-θ度数表述的在约6.178、8.519、12.601、13.819、15.478、15.719、16.32、17.997、18.539、20.298、20.659、21.583、22.642、23.08、24.86、25.602、26.582、27.02、27.721、28.161、28.38处的特征峰的X-射线粉末衍射图。

13.用于制备A型N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺马来酸盐的方法，所述方法包括使N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺与马来酸反应，其中所述A型N-甲基-1-{反式-4-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]环己基}甲磺酰胺马来酸盐包含具有以2-θ度数表述的在约6.178、8.519、12.601、13.819、15.478、15.719、16.32、17.997、18.539、20.298、20.659、21.583、22.642、23.08、24.86、25.602、26.582、27.02、27.721、28.161、28.38处的特征峰的X-射线粉末衍射图。

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