ME01269B - Jedinjenja pirolo (2,3-d) pirimidina - Google Patents

Abstract

Ovdje su opisana jedinjenja pirolo{2,3-d}pirimidina, njihova upotreba kao inhibitora Janus Kinaze (JAK), farmaceutske kompozicije koje sadrže ova jedinjenja i postupke za dobijanje ovih jedinjenja.

Description

OBLAST PRONALASKA

Ovde je opisan N-metil(4-(metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino)cikloheksil)metansulfonamid, njegovi analozi, njihova upotreba kao inhibitora Janus Kinase (JAK), farmaceutske kompozicije koje sadrže ova jedinjenja, i postupci za dobijanje ovih jedinjenja.

STANJE TEHNIKE

Protein kinaze su familije enzima koji katalizuju fosforilaciju specifičnih ostataka u proteinima, generalno kalsifikovani u tirozin i serin /treonin kinaze. Neodgovarajuća aktivnost kinaze, nastala kao posledica mutacija, prekomerna-ekspresija, ili neodgovarajuća regulacija, dis-regulacija ili de-regulacija, kao i prekomerna- ili nedovoljna - proizvodnja faktora rasta ili citokina su uključeni u brojne bolesti, uključujući ali ne ograničavajući se na kancer (rak), kardiovaskularne bolesti, alergije, astmu i druge respiratorne bolesti, autoimune bolesti, inflamatorne bolesti, bolesti kostiju, metaboličke poremećaje, i neurološke i neurodegenerativne poremećaje, kao sto je Alzheimer'ova bolest. Neodgovarajuća aktivnost kinaze aktivira različite biološke ćelijske odgovore koji su povezane sa rastom ćelija, differencijacijom ćelija, preživljavanju, apoptozom, mitogenezom, kontrolom ćelijskog ciklusa, i pokretljivosti ćelija obuhvaćeni prethodno pomenutim i srodnim bolestima.

Tako, protein kinaze su postale veoma važna klasa enzima kao meta terapeutskih intervencija. Posebno, JAK familija ćelijskih protein tirozin kinaza (JAK-1, JAK-2, JAK-3, i Tyk-2) igraju centralnu ulogu u signačizaciji citokina (Kisseleva et al. Gene, 2002, 285, 1; Yamaoka et al. Genome Biology 2004, 5, 253)). Posle vezivanja za receptore, citokini aktiviraju JAK koji zatim fosforilizuje receptore citokina, stvarajući tako mesta za vezivnje signalnih molekule, posebno, članove familije za pretvaranje signala i aktivatora transkripcije (STAT) koji konačno vode do ekpspredije gena. Poznati su brojni citokini koji aktiviraju familiju JAK-a.

Shodno tome, postoji potreba za alternativnim jedinjenjima koji inhibiraju inhibit JAK enzime, uključujući JAK-1, JAK-2, JAK-3, i/ili Ty

OPIS PRONALASKA

Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule I:

Ili njegovu farmaceutski prihvaltjivu so, gde R1 je -C1-4alkil, po izboru supstituisan sa hidroksi.

Posebno, jedinjenje formule I gde R1 je metil.

Posebno, jedinjenje formule I gde R1 je etil ili ciklobutil.

U sledećem aspektu, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje:

Farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač i jedinjenje formule I,

metode za kontrolu ili lečenje poremećaja ili stanja odabranih od odbacivanja transplantiranih organa, lupusa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, psorijaze, kancera, osteoartritisa, i dijabetesa adminsitriranjem obolelom sisaru terapeutski efikasnu količinu jedinjenja formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so,

metode za kontrolu ili lečenje poremećaja ili stanja odabranih od dijabetesa, kancera, autoimunih oboljenja tiroide, ulcerativnog kolitisa, Crohn'ove bolesti, suvih očiju, Alzheimer'ove bolesti, leukemije, i drugih indikacija gde bi bila poželja imunosupresija ili imunomodulacija, administriranjem obolelom sisaru terapeutski efikasne količine jedinjenja formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli,

metode za kontrolu ili lečenje poremećaja ili stanja odabranih od alergijske reakcije uključujući alergijski dermatitis, ekcem, atopični dermatitis, pruritus i druga stanja pruritisa i inflamatome bolesti kao što je bolesti creva kod sisara, administriranjem obolelo sisaru terapeutski efikasnu količinu jedinjenja formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli,

metode za kontrolu ili lečenje poremećaja ili stanja odabranih od astme i drugih opstruktivnih bolesti disajnih puteva, uključujući hroničnu ili trajnu astmu, kasna astma, hiper-responsivenost disajnih puteva, bronhitis, bronhijalna astma, alergijska astma.

intrizična astma, ekstrinzična astma, astma izazavana prašinom, recidivirajuća opstrukcija disajnih puteva, i hronična opstruktivna bolest pluća administriranjem obolelom sisaru terapeutski efikasnu količinu jedinjenja formule I ili njegove farmaceutski prihvatljivu soli,

metode za inhibiciju proteina tirozin kinaza ili JAK-1, JAK-2, JAK-3 i/ili Tyk-2 administriranjem oboleom sisaru terapeutski efikasnu količinu jedinjenja formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli,

metode za inhibiciju protein tirozin kinaza ili JAK-1. JAK-2, JAK-3 i/ili Tyk-2 administriranjem oboleom sisaru therapeutically terapeutski efikasnu količinu jedinjenja formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i metode za dobijanje jedinjenja predmetnog pronalaska.

KRATAK OPIS SLIKA

SLIKA. 1 je karakteristični rendgenski dijagram praha soli N-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}metansulfonamid maleinske kiseline (Oblik A).

SLIKA. 2 ilustruje Dan 27 VAS vrednosti za primer lb kod pasa alergičnih na buve u probi smanjenja pruritusa i dermatitisa povezanih sa buvama SLIKA 3 ilustruje sekunde Pruritusa na 4 sata praćeno za priemer lb kod pasa alerginčnih na buve u probi smanjenja pruritusa i edrmatitisa povezanih sa buvama.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

S obizrom na navedeno jedinjenje, i u prijavi i zahtevima, sledeći izrazi imaju značenja navedena u daljem tekstu.

Izraz "sisar" odnosi se na čoveka ili životinje uključujući stoku i kućne ljubimce. Fraza “kućni ljubimac” ili “kućni ljubimci” odnosi se na životinje koje ljudi čuvaju u kući. Primeri kućnih ljubimaca su mačke, psi, i konji. Izraz “stoka” odnosi se na životinje koje se uzgajaju ili podižu na na poljoprivrednim dobrima gde se proizvodi hrana ili vlakna, ili se koriste za rad. U nekim realizacijama, stoka je pogodna za hranjenje drugih sisara, na primer čoveka. Primer životinja koji obuhvata ovaj termin su sisari, kao što su goveda, koze, konji, svinje, ovce, uključujući jagnje, i zečevi, kao i ptice, kao što su kokoške, patke i ćurke. Izraz “kontrolisati”, “lečiti" ili "tretman" bolesti obuhvata: (1) prevenciju bolesti, tj. da se klinički simptomi ili znakovi bolesti ne razvijaju kod sisara koji mogu da budu izloženi ili predisponirani bolestima ali još uvek ne ispoljavaju niti imaju simptome/znakove bolesti; (2) inhibiranje bolesti, tj., zaustavljaju ili smanjuju razvoj bolesti ili kliničkih simptoma/znakova; ili (3) ublažavanje bolesti, tj., izazivanje regresije bolesti ili njenih kliničkih simptoma /znakova.

Izraz "terapeutski efikasna količina " označava količinu jedinjenja koja je. kada se

admisnitrira sisaru za lečenje bolesti, dovoljna da sprovođenje tretmana ove bolesti "Terapeutski efikasna količina " će varirati u zavisnosti od jedinjenja, bolesti i njenog stadijum, kao i starosti, težine, itd., sisara koji se leči.

Izraz “približno (oko)” ukoliko se koristi za definisanje pikovan u rendegnskom dijagramu praha, je definisan kao što je dato za 2-teta vrednosti ±0. 2 0 2-teta (0). Svaka određivanja da li je kristalni oblik. Oblik A polimorfa i obuhvaćena zahtevima treba da budu protumačena u svetlu varijabiliteta u ovom testu.

“Farmaceutski prihvatljiv” označava pogodan za upotrebu na sisarima, kućnim ljubimcima i stoki.

Sadržaj atoma ulgjenika različitih grupa koje sadrže ugljovodoničnik je naznačen sa prefiksom koji označava minimalni i maksilani broj atoma ugljenika u grupi, tj., prefiks Ci-j označava grupu sa brojem atoma ugljenika od “i” do “j”. Tako, na primer, C1-4 alkil se odnosi na alkil sa jedan do četiri atoma ugljenika.

Izraz alkil odnosi se na prave, razgranate i ciklične zasićene monovalentne ugljenovodonične grupe, ali referenca na individualne (pojedinačne) radikale kao sto je “propil” obuhvata samo prav lanac radikala, “izopropif ’ obuhvata izomer sa razgranatim lancem ili ciklični izomer kao što je ciklopropilmetil ili ciklopentil je posebno naznačen. Jedinjenja koja imaju istu molekulsku formulu ali različite po prirodi ili redosledu vezivanja svojih atoma ili položaju atom u prostoru, označeni su kao "izomeri". Izomeri koje se razlikuju u položaju svojih atoma u prostoru su označeni kao "stereoizomeri". Prosečan stručnjak će ceniti činjenicu da jedinjenje formule I mogu da pošto je kao cis- i trans-ahiralni diastereomeri. Posebno, predmetni pronalazak obuhvata jedinjenje formule IA, čije je hemijsko ime N-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil} metansulfonamid,

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

Predmetnim pronalaskom obuhvaćeni su svi izomeri opisanih jedinjenja (npr. cis-,

trans-, ili diastereomeri) koja su ovde opisana sama ili u smeši. Svi ovi oblici, uključujući enantiomere, diastereomere, cis, trans, sin, anti, solvati (uključujući hidrate), tautomere i njihove smeše, su obuhvaćeni opisanim jedinjenjima.

Stereoizomerne smeše, npr. smeše diastereomera, mogu se razdvojiti u svoje odgovarajuće izomere na poznat način adekvatnim. Diastereomerne smeše mou na primer da budu odvojene u svoje individualne diastereomere frakcionom kristalizacijom, hromatografijom, distribucijom rastvarača, i sličnim procedurama. Ovo razdvajanje može se izvseti na nivou jednog od polaznih jedinjenj a ili ujedinjenjima formule I. Enantiomeri se mogu razdvojiti preko formiranja diastereomernih soli, na primer, formiranjem soli sa enantiomerno-čistom hiralnom kiselinom, ili hromatografijom, na primer, sa HPLC, upotrebom hromatografskih supstrata sa hiralnim ligandima.

Načini administracije

Za terapeutsku primenu za lečenje poremećaja kod sisira (tj. ljudi i životinja), jedinjenje predmetnog pronalaska ili njegova farmaceutska kompozicija može se

adminsitrirati oralno, parenteralno, topikalno, rektalno, transmukozno, ili intestinalno.

Parenteralna administracija obuhvata indirektne injekcije za stvaranje sistemskog efekta ili direktne injekcije za ugroženu oblast. Topikalna administracija obuhvata tretman kože ili oragana koji su lako dostupni topikalnom aplikacijom, na primer, u oči ili u uši. Takođe je obuhvaćena transdermalna distirbucija za stvaranje sistmeskog efekta. Rektalna administracija obuhvata oblik supozitorija (čepića). Preferentni načini administracije su oralni iparenteralni.

Farmaceutske soli

Jedinjenja formule I mogu se upotrebiti u svom nativnom obliku ili kao soli. U slučaju gde je poželjno formiranje stabilnih soli netoksičnih kiselina i baza desired.

administracija jedinjenja kao farmaceutski prihvatljive soli može da bude idgoivarajuća. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule I obuhvataju acetate, askorbate, aspartate, benzoate, bezilate, bikarbonate/karbonate, bisulfate/sulfate, borate, kamzilate, citrate, edisilate, etoglutarate, esilate, formate, tumarate, gluceptate, glukonate, glukuronate, glicerofosfate, heksafluorofosfate, hibenzate, hidrohloride/hloride, hidrobromide/bromide, hidrojodide/jodide, izetionate, laktate, malate. maleate, malonate, mezilate, metilsulfate, naftilate, 2-napsilate, nikotinate, nitrate, orotate, oksalate. palmitate, pamoate, fosfat/hidrogen fosfate/dihidrogen fosfate, saharate, stearate, sukcinate, tartrate, tozilate i trifluoroacetatne soli.

Kompozicija /Formulacija

Farmaceutske komozicije predmetnog pronalaska moguse formulisati prema

procesima koji su poznati u tehnici, npr., konvencionalnim mepanjem, rastvaranjem, granulacijom, dobijanjem dražeja, izbistrivanjem, emulgacijom. inkapsuliranjem, hvatanjem, procesom liofiloizacije ili sušenje raspršivanjem.

Farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se formulisati na uobičajeni način pomoću jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača zajedno sa ekssipiensima i aditivima, koji omogućavaju procesiranje aktivnog jedinjenja u preparat, koji se može upotrebiti u farmaciji. Pogodna formulacija zavisi od željenog načina administracije. Farmaceutski prihvatljivi eksipiensi i nosači su generalno poznati prosečnom stručnjaku i tako obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. Ekspijensi i nosači su opisani, na primer, u "‘Remingtons Farmaceutical Sciences” Mack Pub. Co., New Jersey (1991).

Formulacije pronalaska su oblikovane tako da budu sa kratkotrajnim destvom, brzim-oslobađanjem, dugotrajnim dejstvom, i kontinuiranim oslobađanjem. Tako, farmaceutske formulacije se takođe mogu formulisati da budu za kontrolisano oslobađanje ili sporo oslobađanje.

Doze

Farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku obuhbvataju kompozicije gde se aktivne komonente nalaze u količini dovoljnoj za postizanje najmenjenog cilja, tj., kontrolu ili kečenje poremećaja ili bolesti. Detaljnije, terapeutski efikasna količina jedinjenja efikasnog za prevenciju, ublažavnje ili poboljšanje simptoma/znakova bolesti ili produženje preživaljavanje subjekta koji se tretira.

Količina aktivne kompontnte, koja je jedinjenje predmetnog pronalask, u farmaceutskoj kompoziciji i u jeidničnom doznom obliku, može da varira ili je podešen u zavisnosti od načina administracije, jačine datog jedinjenja i željene koncentracije. Prosečan stručnjak je sposoban da odredi terapeutski efikasnu količinu. Generalno, količina aktivne komponente kreće su opsegu od 0. 01% do 99 tež. % kompozicije.

Generalno, terapeutski efikasna količina dozeokreće se od oko 0. 01 do oko 100 mg/kg telesne težine/dan, poželjno oko 0. 1 do oko 10 mg/kg telesne težine/dan, a bolje oko 0. 3 do 3 mg/kg telesne težine/dan. i još bolje oko 0. 3 to 1. 5 mg/kg telesne težine/dan. Treba napomenuti da doze mogu varirati u zavisnosti od potreba svakog subjekta i stadijuma poremećaja ili bolestikoja se leči.

Željene doze mogu da budu u obliku jedne doze ili kao podeljene doze admisnitriratne u odgovarajućim intervalima, na primer, kao dve. tri, četiri ili više podeljenih doza na dan. Podeljene doze mogu se po potrebi dalje podeliti, npr., u nekoliko podeljenih administracija; kao što su multiple inhalacije pomoću insuflatora ili nekoliko kapi u oko. Takođe, treba naglasiti da se inicijalno adminsitrirana doza može povećati iznd gonjeg nivoa kako bi se brzo postigla željena koncentracija u plazmi. Sa druge strane, inicijalna doza može biti manja od optimalne i dnevna doza može da bude postepeno povećana tokom trajanja lečenje u zavisnosti od date situacije. Po želji, dnevna doza može da bude podeljena u više doza za adminsitraciju, npr dva do četiri puta na dan.

Medicinska i veterinarska upotreba

Jedinjenja predmetnof pronalaska su inhibitori Janus Kinaee (JAK-i) efikasni protiv Janus Kinaze-1 (JAK-1), Janus Kinaze-2 (JAK-2) i Janus Kinaze-3 (JAK-3). Shodno ovom. korisni su kao terapeutski agensi za transplantaciju organa, lupus, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, psorijazu, dijabetes tipa I i komplikacije proizrokovane dijabetesom, kancer (rak), astmu, atopični dermatitis, autoimune pormećaje tiroidee, ulcerativni kolitis, Crohn'ovu bolest, Alzheimer'ovu bolest, leukemiju, osteoartritis, kontrolu pruritusa, hroničnu respiratornu bolest i druge indikacije gde je poželjna imunosupresija/imuno modulacija.

Dodatno, postoji potreba za bezbednim i efikasnim agensima za kontrolu atopičnog dermatitisa kod životinja. Trenutno na tržištu namenjenom za lečenje atopičnog dermatitisa kod životinja dominiraju korticosteroidi. bol i neželjene efekte kod životinja, posebno kod kućnih ljubimaca, kao što su psi. Antihistamini s e takođe upotrebljevaju, ali su nedovoljno efikasni. Formulacija ciklosporina za pse (ATOPICAIM) se trenutno nalazi na tržištu za atopični dermatitis, ali je skup i pokazuje spor nastup dejstva. Dodatno, postoji problem GI tolerancije sa ATOPICATMJedinjenja predmetnog pronalaska u JAK inhibitori efikasni na JAK-1 i JAK-3. Ova jedinjenja predstavljaju alternativnu za upotrebu steroida i obebeđuju razlaganje hroničnog pruritusa i inflamacije koje se ili uporno javljaju u atopičnom dermatitisu ili se sporov povlače posle uklanjanja elrgena ili agensa koji ih izaziva, kao što su buve u alergijskom dermatitisu koji izazivaju buve.

Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se administrirati u farmaceutski prihvatljivom obliku bilo sam bilo u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih agenasa koji moduliraju imuni sistem sisara ili s anti-inflamatornim agensom. Ovi agensi mogu da obuhvate, ali nisu ograničeni na ciklosporin A (npr. Sandimmune. RTM. ili Neoral. RTM., rapamycin, FK-506 (tacrolimus), leflunomid, dezoksispergualin, mikofenolat (npr. Cellcept. RTM., azatioprin (e. g. Imuran. RTM. ), daklizumab (npr. Zenapax. RTM. ), OKT3 (npr. Orthocolone. RTM. ), AtGam, aspirin, acetaminofen, ibuprofen, naproksen, piroksikam, i anti-inflamatorne steroide (npr. prednizolon ili deksametazon). Ovi agensi mogu se adminsitrirati kao deo istih ili odvojenih doznih oblika, na isti ili različitim načinima administracije, i prema istom ili različitom rasporedu administracije prema standardnoj farmaceutskoj praksi poznatoj prosečnom stručnjaku.

U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje metode za lečenje ili prevenciju bolesti, stanja ili poremećaja povezanih sa JAK kod subjekta, kao što je čovek ili drugi sisar pored čoveka, a obuhvata adminsitriranje subjektu efikasnu količinu jednog ili više ovde opisanih jedinjenja. Bolesti, stanja ili poremećaji povezani sa JAK -om mogu da budu povezani sa JAK-1, JAK-2, JAK-3, i/ili Tyk-2. Odgovarajući subjekti koji se mogu tretirati su domaće ili divlje životinje, kućni ljubimci, kao što su psi, mačke, konji i slični; stoka uključujući, krave i drugi preživari, svinje, živina, zečevi i slični; primati, na primer, mamuni, kao što su rhesus majmuni i cinomolgus (poznati i kao dugorepi) majmuni, marmoseti, tamarini, čimpanze, makaki majmuni i slični; i glodari, kao što su pacovi, miševi, gerbili. morsko prase i si. U jednoj realizaciji, jedinjenje je admisnitrirano u farmaceutski prihvatljivom obliku po izboru u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

JAK/STAT signalizacija je uključena u medijaciju brojnih abnormalnih imunih odgovora kao što su alergije, astma, autoimune bolesti kao što je odbacivanje transplantata (alografta), reumatoid artritis, amiotropna lateralna skleroza i multipla skleroza, kao i kod čvrstih i hematoloških maligniteta kao što su leukemija i limfomi. Za pregled farmaceutskih

p intervencija JAK/STAT putanje videti Frank, (1999), Mol. Med. 5: 432: 456 and Seidel et al., (2000), Oncogene 19: 2645-2656.

JAK-3 je posebno umeđan u različite biološke procese. Na primer, pokazano da su proliferacija i preživljavanje mast ćelija miša indukovanih sa 1L-4 i IL-9 zavisni od JAK-3 i signalizacija gama lanca. Suzuki et al., (2000), Blood 96: 2172-2180. JAK-3 takođe igra važnu ulogu u IgE receptor-posredovanim procesima degranulacije mast ćelija (Malaviya et al., (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun. 257: 807-813), i inhibicija JAK-3 kinazeje pokazala da sprečava sipersenzitivne reakcije tipa I. uključujući anafilaksu (Malaviya et al., (1999), J. Biol. Chem. 274: 27028-27038). Inhibicija JAK-3 takođe je pokazala da dovodi do supresije imuniteta za odbacivanje alografta (Kirken, (2001), Transpl. Proc. 33: 3268-3270). JAK-3 kinaze su takođe implicirane u mehanizme uključene u rane i kasne faze reumatoidnog artritisa (Muller-Ladner et al., (2000), J. Immunal. 164: 3894-3901); familiarna amiotrofna lateralna skleroza (Trieu et al., (2000), Biochem Biophys. Res. Commun. 267: 22-25); leukemija (Sudbeck et al., (1999), Clin. Cancer Res. 5: 1569-1582); mikoze fungoida, oblik limfoma T-ćelija (Nielsen et al., (1997), Prac. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6764-6769); i nekontrolisan rast ćelija (Yu et al., (1997), J. Immunol. 159: 5206-5210; Catlett-Falcone et al., (1999), Immunity 10: 105-115).

JAK kinaze, uključuijućo JAK-3, su u obilno eksprimirani u primarnim leukemijskim ćelijama kod dece sa akutnom limfoblastičnom leukemijom, najuobičajeniji oblik raka kod dece, i ispitiavnaja su povezala aktivaciju STAT -au određenim ćelijama sa apoptozom koja reguliše signale (Demoulin et al., (1996), Mol. Cell. Biol. 16: 4710-6; Jurlander et al., (1997), Blood 89: 4146-52; Kaneko et al., (1997), Clin. Eksp. Immun. 109: 185-193; and Nakamura et al., (1996), J. Biol. Chem. 271: 19483-8). Takođe je poznato da su od velike važnosti za diferencijaciju funkciju i preživljavanje. JAK-3 ima posebno važnu ulogu u fukcionisanju lifocita, makrofaga i mast ćelija. Imajući u vidu značaj JAK kinaze, jedinjenja koja modluiraju putanju JAK-a, uključujući i ona sleektivna za JAK-3, mogu da budu korisna za lečenje bolesti ili stanja gde je obuhvaćena fukcija limfocita, makrofaga. ili mast ćelija (Kudlacz et al., (2004) Am. J. Transplant 4: 51-57; Changelian (2003) Science 302: 875-878).

Stanja u kojima su ciljanje JAK putanje ili moduliranje JAK kinaza, posebno JAK-3, razmatrana kao terpaeutski efikasno, obuvhataju artritis, astmu, autoimune bolesti, kancerr ili tumore, dijabetes, određene bolesti, poremećaje ili stanja oka, inflamacije, intestinalne inflamacije, alergije ili stanja, neurodegenerativne bolesti, psorijaza.

odbacivanje transplantata, i viralne infekcije. Stanja koja mogu da imaju benefit od inhibicije JAK-3 su detaljno opisana u daljem tekstu.

Shodno tome, jedinjenje formule 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i farmaceutske kompozicije mogu se upotrebiti za lečenje različtih stanja ili bolesti, kao što su:

Artritis, uključujući reumatoidni artritis, juvenilni artritis, i psorijatični artritis Astma i druge opstruktivne bolesti disajnih puteva, uključujući hroničnu ili hroničnu astmu, kasnu astmu, hiper-osetljivost disajnih puteva, bronhitis, bronhijalna astma, alergijska astma, intrizična astma, ekstrizična astma, astma prourokovana prašinom, recidivna opstrukcija disajnih puteva, i hronična opstruktivna boelsti pluća;

Autoimune bolesti ili poremećaji, uključujući ona označene kao one za jedan organ ili autimuni poremećaji jedne vrste ćelija, na primer Hashimoto'ov tiroiditis, autoimuna hemolitička anemija, autoimuni atrofični gastritis nasledne anemije, autoimuni encefalomijelitis, autoimuni orhitis, Goodpasture'ova bolest, autoimuna trombocitopenija. simpatetička oftalmifa, miastenija gravis, Graves' ova bolest, primarna bilijarna ciroza, hronični agresivni hepatiti, ulcerativni kolitis i membranska glomerulopatija, one naznačene da obuhvataju sistemske autoimune poremećaje, na primer sistemski etirematozni lupus, reumatoidni artritis, Sjogren'ov sindrom, Reiter'ov sindrom, polimijozitis-dermatomijozitis, sistemska skleroza, poliarteritis nodoza, multipla skleroza i bulozan pemfigoid, i druge autoimune boelsti, koje mogu da bud bazirane na O-ćelijama (humoralni) ili na T-ćelijama, uključujući Cogan'ov sindrom, ankilosni spondilitis, Wegener'ovu granulomatozu, autoimunu alopeciju, dijabetes tipa I ili juvenilni dijabetes, i tiroiditis;

Kanceri ili tumori, uključujući kancer probavnog/gastrointestinalnog trakta, rak debelog creva, rak jetre, rak kože uključujući tumor mast ćelija i karvinom skvuamoznih ćelija, rak dojke, rak jajnika, rak prostate, limfom, leukemija, uključujući akutnu mijelogenu leukemiju i hroničnu mijelogenu leukemiju, rak bubrega, rak pluća, rak mišića, rak kostiju, rak bešike, rak mozga, melanom uključujući oralni i metastatični melanom, Kaposijv sarkom, mijelome uključujući multipli mijelom, mijeloproliferativni poremećaji, proliferativna dijabetička retinopatija, i angiogenske-povezane boelsti uključujući čvrste tumore;

Dijabetes, uključujući dijabetes tipa 1 i komplikacije dijabetesa;

Bolesti, poremećaji ili stanja oka, uključujući autoimmune bolesti oka, keratokonjunktivitis, vernalni konjunktivitis, uveitis uključujući uveitis povezan sa

Behcet'ovim oboljenjem i uveitis indukovan kontaktnim sočivom, keratitis, herpetični keratitis, konični keratitis, kornealna epitelialna distrofija. keratoleukoma, okularni premfigus, Mooren'ov ulcer, skleritis, Grave'ova oftalmopatija, Vogt-Koyanagi-Harada sindrom, keratokonjunktivitis sika (suvo oko), flikten, iridociklitis, sarkoidoza, endokrina oftalmopatija, simpatetički oftalmitis, alergijski konjunctivitis, i okularna neovaskularizacija;

Intestinalne inflamacije, alergije ili stanja uključujući Crohn’ovu bolest i/ili ulcerativi kolitis, inflamatorna bolest creva, bolesti trbuha, proktitis, eozinofilni gastroenteritis, i mastocitoze;

Neurodegenerativne bolesti uključujući motornu bolest neurona, Alzheimer'ovu bolest, Parkinson'ovu bolest, amiotrofna lateralna skleroza, Huntington'ova bolest, cerebralna ishemija, ili neurodegenerativne bolesti izazvane traumatskom povredom, šlog, glutamatna neurotoksičnost ili hipoksija; ishemijska/reperfuziona povreda kod šloga, ishemija miokarda, renalna iishemija, srčani udar, srčana hipertrofija, ateroskleroza i arterioskleroza, hipoksija organa, i agregacija trombocita;

Bolesti, stanja i poremećaji kože uključujući atopični dermatitis, ekem, psorijazu, sklerodermu, pruritus i druga pruritična stanja;

Alergijske reakcije uključujući alergijski dermatitis kod sisara uključujući alergijse bolesti kod konja kao sto je hipersensitivnost, letnji ekcem i svrabež kod konja (ujed Sulicoides mušica).

Odbacivanje transplantata, uključujući odbacivanje transplantata pankreasnih (. Langerhan-ova ostrvca). odbacivanje transplantata koštane srži, bolest graft-versus-host (domaćin), odbacivanje transpantata organa i ćelija kao sto je transplantacija koštane srži, hrskavicea, korneje, srca, intervertebralnog diska, ostrvca, bubrega, uda, jetre, pluća, mišića, mioblasta, nerava. pankreasa, kože, tankog creva, ili traheje, i kseno transplantacija; i Druga realizacija obezebđuje postupak za inhibiciju JAK enzima, uključujući JAK-1, JAK-2, JAK-3 i/ili Tyk-2, koja obuhvata stupanje u vezu JAK enzima bilo sa ne-terapeutskom količinom bilo sa terapeutski efikasnom količinom jednog ili više od naznačenih jedinjenja. Ove metode mogu se odvijati in vivo ili in vitro. ln vitro kontakt može da obuhvati skrining probu za određivanje efikasnosti jednog ili više jedinjenja protiv odabranog enzima pri različitim količinama ili koncentracijama. In vivo kontakt sa terapeutski efikasnom količinom jednog ili više jedinjenja može da obuhvati tretiranje opisane bolesti, poremećaja ili stanja ili profilaksu od odbacivanja tranplantiranog organa kod životinja kod kojih je došlo do kontakta. Efekat jednog ili više jedinjenja na JAK enzim i/ili životnje domaćina (host) se takođe može odrediti ili izmeriti. Metode za određivanje aktivnosti JAK obuhvata one opisan u primerima kao i onim opisanim u WO 99/65908. WO 99/65909, WO 01/42246, WO 02/00661, WO 02/096909, WO 2004/046112 ili WO 2007/012953.

Sledeće reakcione sheme ilustruju opšte postupke za sintezu jedinjenja predmetnog pronalaska. Svi polazni materijali su dobijeni prema procedurama opisanim u ovim Shemema ili prema procedurama koje su poznate prosečnom stručnjaku..

Shema I

Biće očigledno za prosečnog stručnjaka da će biti potrebno zaštiti i ukloniti zaštitu sa osetljivih funkcionalnih grupa (Pg ili Pgl), tokom sinteze jedinjenja pronalaska. Ovo se može postići konvencionalnom metodom, na primer kao što je opisano u “Protective Groups in Organic Synthesis” od TW Greene and PGM Wuts, John Wiley & Sons Ine (1999), i tamo navedenim referencama.

U Shemi I, 4-Hlor-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin (a) može se dobiti komercijalno.. trans-4-(Metilamino)- cikloheksiljmethanol (b) može se dobiti od odgovarajuće karboksline kiseline, trans-4-[(tert-butoksikarbonil)amino]cikloheksankarboksline kiseline, posle reakcije sa redukujućim agensom kao sto je litijum aluminijum hidrid u aprotičnom, anhidrovanom rastvaraču kao što je tetrahidrofuran na temperaturama između 0-60°C tokom nekoliko sati.

Kao što je prikazano u Shemi Sjedinjenje strukture (c) može se sintetisati reakcijom 4-hlor-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidine (a) with trans-4-(metilamino)-cikloheksiljmethanola (b) u odgovarajuće aprotičnom, polarnom rastvaraču kao što je N, N-dimetilformamid, vodeni rastvor dioksana i dimetilsulfksid, u prisustv odgovarajuće baze kao što je trietilamin i kalijum karbonat na povišenim temperaturama do 90°C u trajanju do nekoliko sati.

Jedinjenje strukture (d) može se sintetisati u proceduri iz dva koraka, od jedinjenja strukture (c). Na primer, jedinjenje strukture (d) može se sintetisati prvo upotrebom reagensa za bromovanje kao sto je tionil bromid ili fosfor tribromid u polarnom, aprotičnom rastvaraču kao što je metilen hlorid pri čemu se dobija nezaštićeni cikloheksilmetilbromid, i zatim dodatkom odgovarajućeg agensa za zaštitu kao što je tozil hlorid pri čemu se dobija jedinjenje strukture (d).

Jedinjenje strukture (e) može se dobiti prema jednostavnim postupcima od jedinjenja strukture (c). Na primer, kada Pg i Pgi su oba tozil, ovo se može izvesti u reakciji iz jednog koraka posle reakcije nezaštićenog jedinjenja strukture (c) sa tozil hloridom uprisustvu polarnog, aprotičnog rastvarača kao što je metilen hlorid, katalizatora kao što je DMAP i slabe baze kao što je trietilamin.

Jedinjenje strukture (f) može se sintetisati od jedinjenja strukture (e) S-alkilovanjem odgovarajućeg nukleofila. Ova jedinjenja strukture (e) gde je zaštitna grupa (Pg1) odgovarajuća hidroksil zaštitna grupa kao što je tozil ili mezil mogu da reaguju sa kalijum tioacetatom u polarnom rastvaraču kao što je dimetilsulfoksid ili N-metilpirolidin pri povišenim temperaturama do 75°C i do 2 h dajući jedinjenje strukture (f).

Jedinjenje strukture (g) može se sintetisati potupkom oksidacije jedinjenja formule (f). Prosečnom stručnjaku su poznati brojni uslovi oksidacije kao na primer oni opisani u “Handbook of Reagents for Organic Synthesis - Oxidising and Reducing Agents” urednik S. D. Burke and R. L. Danheiser. Na primer, jedinjenje strukture (f), po izboru nakvašeno vodom, može da reaguje sa mravljom kiselinom nakon čega se polako dodaje vodonik peroksid uz mešanje na sobnoj temperaturi oko 15 h dajući jedinjenje strukture (g). Alternativno, može se upotrebiti okson u polarnom rastvaraču kao što je sirćetna kiselina, ako se reakcija izvodi u prisustvu kalijum acetata, pri čemu se dobija kalijumova so jedinjenja formule (g).

Predviđeno je da jedinjenje strukture (g) može da bude sintetisano direktno od jedinjenja strukture (e) posle reakcije sa odgovarajućim sulmpornim nukleofilom kao sto je natrijum sulfit u polarnom rastvaraču. Slično, jedinjenje strukture (g) se može sintetisati od jedinjenja strukture (d) posle nukleofilne supstitucije sa natrijum sulfitom.

Reakcija sulfonske kiseline formule (g) sa agensom za hloriranje kao što je tionil hlorid u aprotičnom, polarnom rastvaraču kao sto je metilen hlorid sa polarnim korastvaračem (kosolventom) kao sto je N, N-dimetilformamid uz refluksovanje dobijaju se hlorirana jedinjenja. Hlorisano jedinjenje zatim reaguje u aprotičnom, anhidrovanom rastvaraču kao što je tetrahidrofuran sa odgovarajućim aminima u čistom, gasovitom obliku, ili rastvorenim u aprotičnim. anhidrovanim rastvaračima kao sto je tetrahidrofuran, na sobnoj temperaturi dajući jedinjenje strukture (h). Po izboru može se upotrebiti anhidrovana, slaba baza kao sto je trietilamin za uklanjanje hlorovodonične kiseline koja se stvara u reakciji.

Jedinjena formule I predmetnog pronalaska mogu se dobiti od jedinjenja formule (h) gde je Pg odgovarajuća zaštitna grupa, uklanjanjem zaštite prema procedurama koje su pozante prosečnom stručnjaku. Na primer, kada zaštitna grupa (Pg) je tozil, odgovarajući uslovi ullanjanja zaštite obuhvataju reakciju sa bazom kao što je litijum hidroksid ili kalijum hidroksid u protičnom rastvaraču kao što je metanol ili izopropanol i po izboru mešljivi kosolventi kao što je tetrahidrofuran i voda na sobnoj temperaturi tokom nekoliko sati, pri čemu se dobija amin formule I sa kojeg je uklonjena zaštita.

Soli jedinjenja formule I mogu se dobiti reakcijom slobodne baze jedinjenja formule I sa odgovarajućim kiselinama kao što ke maleinska kiselina u prisustvu protičnog rastvarača kao što je butanol i po izboru kosolvent kao što je voda.

Alternativno, jedinjenja pronalaska mogu se dobiti prema Shemi II.

U Shemi II, 4-metii-7-[(4-metilfenil)sulfonil]-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin (j) se može dobiti od komercijalno dostupnog jedinjenja (a) pomoću zaštitnog reagensa kao što je tozil hlorid prema procedurama koje su poznate prosečnom stručnjaku, trans-4-(Metilamino)- cikloheksiljmetanol (b) se može dobiti od odgovarajuće karboksilne kiseline, trans-4-[(tert-butoksicarbonil)amino]cikloheksankarboksilne kiseline, posle reakcije sa agensom za redukciju, kao što je Vitride u anhidrovanom rastvaraču kao što je toluen na temperaturama između 0-110°C tokom nekoliko sati.

Kao sto je dato na Shemi Ujedinjenje strukture (k) se može sintetisati reakcijom 4-hlor-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidina (j) sa trans-4-(metilamino)- cikloheksiljmetanolom (b) u odgovarajućem rastvaraču kao što je aceton, u prisustvu odgovarajuće baze kao što je trietilamin sa katalitičom količinom kalijum jodida na povišenoj temperaturi do 60°C tokom nekoliko sati.

Jedinjenje strukture (k) se može sintetisati dodatkom odgovarajućeg reagensa metilsulfonovanje kao što je mezil hlorid u prisustvu odgovarajuće baze kao što je dietilizopropilamin u odgovarajućem rastvaraču kao što je acetone pri povišenim temperaturama do 60°C dajući metan sulfonilno jedinjenje strukture (k).

Jedinjenje strukture (1) može se dobiti prema jednostavnom psotupku S-alkilacije od jedinjenja strukture (k) pomoću odgovarajućeg nukleofila. Tako jedinjenja strukture (k) mogu da reaguju sa natrijum sulfitom u rastvaraču kao što je izopropilalkohol ili voda ili toluen pri povišenim temperaturama do 90°C tokom 4 h dajući jedinjenja strukture (1).

Reakcijom sulfonske kiseline formule (1) sa reagensom za hloriranje kao što je tionil hlorid u aprotičnom, polarnom rastvaraču kao sto je THF ili metilen hlorid sa polarnim kosolventom poput N,N-dimetilformamida na temperaturama između 0 i 40°C dobijaju se hlrorana jedinjenja. Hlorirana jedinjenja zatim reaguju u aprotičnom. anhidrovanom rastvaraču kao što je tetrahidrofuran sa odgovarajućim aminima kao što je metil amin, ciklobutil amin ili 2-hidroksiazetidin poželjno u čistom, gasovitom obliku, ili rastvoren u aprotičnom, anhidrovanom rastvaraču kao što je tetrahidrofuran, na sobnoj temperaturi dajući jedinjenje strukture (h). po izboru može se upotrebiti anhidrovana, slaba baza kao što je trietilamin za uklanjanje hlorovođonične kiseline koja nastaju tokom reakcije.

PRIMER1

Dobijanje 1 N-Metil-l-[trans-4-(metil{7-[(4-metilfenil)sulfonil]-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il}amino)cikloheksil]metansulfonamid

Metoda (a) U rastvor jedinjenja iz Dobijanja 2 (308. 0 g vlažne težine, 214. 5 g suve težine, 0. 41 mol) u tetrahidrofuranu (1. 0 1) dodat je metilamin (2M u tetrahidrofuranu, 687 ml) tokom 1 h. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 30 min, dodato je još metilamina (2M u tetrahidrofuranu, 53 ml) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 h. Smanjena je zapremina smeše na 600 ml, vakuum destilacijom, i dodat je tetrahidrofuran (300 ml), pre nego što je ponovo smanjena zapremina smeše na oko 750 ml. U smešu, zagrejanu na 45°C, dodati su 2-propanol (247 ml) i voda (693 ml). Posle hlađenja do sobne temperature, čvrsti materijal je sakupljen filtracijom, ispran sa vodom (2 x 250 ml) i osušen in vacumu na 65°C dajući traženo jedinjenje (180. 4 g).

1H-NMR (d6-DMSO): 1. 17-1. 32 (2H), 1. 57 - 1. 73 (4H), 1. 76 - 1. 92 (1H), 1. 93 - 2. 08 (2H),

2. 30 - 2. 39 (3H), 2. 53 - 2. 62 (3H), 2. 87 - 2. 98 (2H), 3. 07 - 3. 17 (3H). 4. 53 - 4. 75 (IH). 6. 81

6. 94 (1H), 7. 38 - 7. 47 (2H), 7. 56 - 7. 65 (IH), 7. 92 - 8. 02 (2H), 8. 15 - 8. 27 (1H).

Metoda (b) U rastvor jedinjenja iz dobijanja 2 (165 g, 0. 34 mol) u THF-u (1. 65 1) ATV-dimetilformamidu (5. 0 ml) na 0-5°C dodat je tionil hlorid (125 ml, 17 mol), tokom 25 min. Reakciona smeša je mešana 30 minuta na 0-5°C pa zatim polako zagrejana tokom 8h do 40°C. Posle hlađenja do sobne temperature (engl. room temperature, r. t. ) rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom i azeotropiran sa THF -om uklanjajući tionil hlorid. U dobijeni sulfonil hlorid dodat je svež THF (1. 65 1) i smeša je ohlađena do 0⁰C. Produvavan je gas N-metilamin tokom 30 minuta i reakciona smeša je mešana još 4 h na r. t. rastvarač je uparen na polovinu zapremine (800 ml) i doda tje heptan (1. 5 1). Proizvod je staložen i profitriran i ispran vodom (1 1) dajući traženo jedinjenje (80 g).

'H-NMR (d6-DMSO): 1. 17- 1. 32 (2H), 1. 57- 1. 73 (4H), 1. 76 - 1. 92 (1H), 1. 93 -2. 08 (2H),

2. 30 - 2. 39 (3H), 2. 53 - 2. 62 (3H), 2. 87 - 2. 98 (2H), 3. 07 - 3. 17 (3H), 4. 53 - 4. 75 (1H), 6. 81

6. 94 (1H), 7. 38 - 7. 47 (2H), 7. 56 - 7. 65 (1H), 7. 92 - 8. 02 (2H), 8. 15 - 8. 27 (1H)

Dobijanje 2 [trans-4-(Metil{7-[(4-metilfenil)sulfonil]-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il}amino)cikloheksil]metansulfonil hlorid

U rastvor jedinjenja iz Dobijanja 3 (210. 0 g, 0. 42 mol) u dihlormetanu (1. 2 1) i N, N-dimetilformamidu (4. 1 ml) dodat je tionil hlorid (151. 0 ml, 2. 1 mol), tokom 25 min. reakciona smeša je zagrevana da refluksuje 18 h i zatim je zapremina smanjena do 800 ml, vakuum destilcijom. U smešu, koja je zagrevana na oko 30°C, dodat je etil acetat (1. 1 1) tokom 1 h, pa zatim heptan (546 ml), tokom 20 min na sobnoj temperaturi. Smeša je ohlađena na 0°C i mešana 1 h i dobijeni talog je sakupljen filtracijom u atmosferi azota.

Čvrsti ostatak je ispran heptanom (2 x 125 ml) dajući traženo jedinjenje (308. 0 g vlažne težine), koje je čuvan u atmosferi azota i direktno upotrebljeno.

Dobijanje 3 [trans-(Metil{7-[(4-metilfenil)sulfonil]-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il}amino)cikloheksil]metansulfonska kiselina

Method (a) U smešu jedinjenja iz Dobijanja 4 (100. 0 g vlažne težine, 23. 5 g suve težine, 47. 8 mmol) i mravlje kiseline (82. 0 g, 68. 0 ml, 1. 8 mol) dodat je vodonik peroksid (35 tež. % u vodi. 21. 0 ml, 0. 26mol) tokom 10 min. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 h pa je zatim dodat u vodeni rastvor natrijum metabisulfata ili rastvor metabisulfite (33 tež. %, 35 ml). U smešu je dodata voda (5 ml), 2-propanol (50 ml) i vodeni rastvor natrijum hidroksida (33 tež. %, 161 ml) i gusta smeša jemešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Čvvrsti materijal je askupljen filtracijom, ispran vodom (100 ml) i osušen u vakuumu na 60°C dajući traženo jedinjenje (26. 0 g).

1H-NMR (d6-DMSO): 0. 98 - 1. 18 (2H), 1. 55 - 1. 76 (5H), 1. 99 - 2. 13 (2H), 2. 29 - 2. 39 (5H),

3. 05 - 3. 15 (3H), 4. 47 - 4. 76 (IH), 6. 77 - 6. 92 (1H), 7. 38 - 7. 48 (2H), 7. 54 - 7. 62 (1H), 7. 91 -

8. 02 (2H), 8. 17 - 8. 25 (1H)

Metoda (b) U rastvor jedinjenja iz Dobijanja 3 u IPA-vodi (po 585 ml od svakog, 1: 1, V/V) dodat je natrijum sulfat i smeša je zagrevana na 80-90°C tokom 24 h. Posle hlađenja do sobne temperature, rastvarao je uparen do 50% i zatim je podešeno pH reakcione smeše na oko 3-4 dodatkom sirćetne kiseline. Dodat je toluene(l 1) smeša je uparena na 80%. Dodato je još toluena (1 1) i smešaje refluksovana 4 h. Toluen je odekantovan i traženo jedinjenje je dobijeno sušenjem u vakuumu (168 g).

1H-NMR (d6-DMSO): 0. 98 - 1. 18 (2H), 1. 55 - 1. 76 (5H), 1. 99 - 2. 13 (2H), 2. 29 - 2. 39 (5H),

3. 05 - 3. 15 (3H), 4. 47 - 4. 76 (1H), 6. 77 - 6. 92 (1H), 7. 38 - 7. 48 (2H), 7. 54 - 7. 62 (1H), 7. 91 -

8. 02 (2H). 8. 17-8. 25 (1H)

Dobijanje 4 S-{[trans-4-(Metil{7-[(4-metilfenil)sulfonil]-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-i]}aniino)cikloheksir|metil}etantioat

U rastvor kalijum tioacetata (11. 4 g, 99. 4 mmol) u dimetil sulfoksidu (30 ml) dodato je jedinjenje iz Dobijanja 5 (50. 0 g, 87. 9 mmol) u dimetil sulfoksidu (130 ml). Reakciona smeša je zagrevana na 55°C tokom 3 h, ohlađena do sobne temperature i dodat je vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (0. 1M, 640 ml). Smeša je ohlađena na 13°C i dobijeni talog je sakupljen filtracijom i ispran vodom (250 ml) dajući traženo jedinjenje (204. 0 g vlažne težine).

1H-NMR (d6-DMSO): 1. 06 - 1. 23 (2H), 1. 39 - 1. 51 (1H), 1. 51 - 1. 70 (4H), 1. 74 - 1. 88 (2H), 2. 30 - 2. 40 (6H), 2. 73 - 2. 84 (2H), 3. 06 - 3. 14 (3H), 4. 44 - 4. 76 (1H), 6. 76 - 6. 94 (1H), 7. 36 -7. 49 (2H), 7. 56 - 7. 62 (1H), 7. 90 - 8. 02 (2H), 8. 17 - 8. 26 (1H)

[0096] Dobijanje 5 [trans-4-(Metil{7-[(4-metilfenil)sulfonil]-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il}amino)cikloheksil]metil 4-metilbenzenesulfonat

U rastvor jedinjenja iz Dobijanja 6 (42. 0 g, 0. 16 mol) u dihlormetanu (1 1) dodat je trietilamin (68. 3 g, 0. 68 mol) i 4-dimetilaminopiridin (1. 0 g, 8. 2 mmol), zatim je dodat p-toluensulfonil hlorid (62 g, 0. 33 mol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h. pre nego sto je dodat p-toluensulfonil hlorid (45. 5 g, 0. 24 mol). Posle mešanja od 18 h, smeša je koncentrovana u vakuumu i deo ostatka (oko 309 g) je razmućen u metanolu (758 ml) tokom 15 min. U ovu smešu je dodata voda (600 ml) i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (142 ml) i smeša je mešana 1 h. Čvrsti materijal je sakupljen fuiltracijom i ispran smešom metanol: voda [1: 1, 50 ml], vodom (50 ml) i heksanom (50 ml). Čvrsti ostatak je osuđen u vakuumu na 60°C dajući traženo jedinjenje (87. 1 g). 'H-NMR (d6-DMSO): 1. 02 - 1. 20 (2H), 1. 53 -1. 75 (7H), 2. 31 - 2. 39 (3H), 2. 39 - 2. 47 (3H), 3. 04 - 3. 12 (3H), 3. 80 - 3. 91 (2H), 4. 34 - 4. 76 (IH), 6. 78 - 6. 93 (IH), 7. 37 - 7. 54 (4H), 7. 54 7. 64 (1H), 7. 75 - 7. 84 (2H), 7. 91 - 8. 01 (2H), 8. 14 - 8. 25 (1H)

Dobijanje 6 {trans-4-[Metil(7H-pirolo[2, 3-(7]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}-metanol

Smeša jedinjenja trans-4-(Metilamino)cikloheksil]metanola (može se dobiti prema proceduri opisanoj u WO 2002/14267)(50. 0 g, 0. 35 mol), 4-hlor-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidina (komercijalno dostupan, 42. 9 g, 0. 27 mol) i kalijum karbonata (57. 3 g, 0. 42 mol) u vodi (1 1) i 1, 4-dioksanu (100 ml) je zagrevana na 90°C tokom 15 h. U smešu je dodato jedinjenje iz Dobijanja 7 (2. 0 g, 14. 0 mmol) i reakciona smeša je zagrevana na 90°C još 1 h. Posle hlađenja do sobne temperature, smeša je mešana 1 h i čvrsti materijal je sakupljen filtracijom, ispran vodom (150 ml) i osušen u vakuumu na 65°C dajući traženo jedinjenje (72. 7 g).

1H-NMR (d6-DMSO): 1. 00- 1. 19 (2H), 1. 30 - 1. 45 (1H), 1. 52 - 1. 77 (4H), 1. 77- 1. 91 (2H), 3. 09 - 3. 20 (3H), 3. 20 - 3. 29 (2H), 4. 37 - 4. 51 (1H), 6. 45 - 6. 57 (1H), 7. 06 - 7. 17 (1H), 8. 01 8. 14 (1H)

Dobijanje 7 [trans-4-(Metil{7-[(4-metilfenil)sulfonil]-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il}amino)cikloheksil]metansulfmat

U rastvor jedinjenja iz Dobijanja 4 (60. 0 g, 0. 418 mol) u acetonu (600 ml)

dodat je trietilamin (117. 5 ml. 0. 837 mol) i katalitička količina kalijum jodida (3. 4 g, 0. 05 mol), nakon toga 4-hlor-7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin (komercijalno dostupan, 102. 8 g, 0. 335 mol). Dobijena smeša je zagrevana na 60°C tokom 22 h. Posle hlađenja do sobne temperature dodat je aceton (300 ml), zatim trietilamin (146. 9 ml, 1. 04 mol) na kraju mezil hlorid (81. 7 ml. 1. 047 mol). Posle mešanja od 4 h na sobnoj temperaturi, dodataje voda (1. 8 1) nakon čega je istaložen proizvod. Proizvod je profiltriran, osušen i triturisan dodatkom smeše MTBE-heptan (6: 4, 600 ml). Izvedena je druga trituracija iz MTBE-heptana i dobijeno je traženo jedinjenje (120g).

1H-NMR (d6-DMSO): [00102) Dobijanje 8 [trans-4-(Metilamino)cikloheksil]metanol

Rastvor vitrida (65%, 767 ml, 2. 465 mol) je u kapima u doku 1 h dodat u rastvor trans-4-[(tert-butoksikarbonil)amino]cikloheksankarboksilne kiseline (komercijalno sotupna, 100 g, 0. 4109 mol) u toluenu (1 1). Po završenom dodavanju, reakciona smeša je zagrevana da refluksije 100-110°C. Reakcionoj smeši je dodat vodeni rastvor natrijum sulfata (800 ml) na temperaturama ispod 10°C. Reakciona smeša je profiltriran kroz celit i kolač na filteru je ispran sa DCM (500 ml) pa zatim vodom (100 ml). Organski sloj je odvojen i vodeni sloj je dva puta ekstrahovan sa DCM (600 ml then 400 ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni iznad natrij um sulfata i koncentrovani u vakuumu dajući traženo jedinjenje (62 g).

1H-NMR (CD3OD): 1. 08- 1. 31 (4H), 1. 51 - 1. 64 (1H), 1. 93 - 2. 05 (2H), 2. 10 - 2. 22 (2H), 2. 38 - 2. 50 (1H), 2. 50 - 2. 54 (3H), 3. 48 - 3. 55 (2H)

Primer la Dobijanje N-metil-l-{trans-4-]metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)ainino]cikloheksil}metansulfonamida.

U rastvor jedinjenja iz Dobijanja 1 (250. 0 g, 0. 48 mol) u 2-propanolu (1. 2 1) dodat je litijum hidroksid (48. 7 g, 2. 03 mol) u vodi (1. 2 1). Reakciona smeša je zagrevana na 40°C tokom 8 h i zatim mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 h. Smeša je pro filtri rana, detaljno isprana smešom 2-propanol: voda (1: 1, 100 ml) i podešeno je pH filtrata na 7. 5 dodatkom hlorovodonične kiseline (6N). Posle mešanja od 1 h, Čvrsti materijal je sakupljen filtracijom, ispran 2-propanol: vodom (1: 2, 240 ml) i osušen u vakuumu na 60°C dajući traženo jedinjenje (148. 7 g) kao slobodnu bazu (Primer la).

1H-NMR (d6-DMSO): 1. 20 - 1. 39 (2H), 1. 62 - 1. 75 (4H), 1. 77- 1. 91 (1H), 1. 97-2. 11 (2H), 2. 54 - 2. 63 (3H), 2. 89 - 2. 99 (2H), 3. 10 - 3. 21 (3H), 4. 44 - 4. 86 (1H), 6. 43 - 6. 61 (1H), 7. 01 -7. 19 (1H), 7. 94-8. 16 (1H)

PRIMER lb Dobijanje A-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-

d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}metansulfonamidne soli maleinske kiseline |00106] Smeša jedinjenja iz Primerala (212. 0 g, 628. 3 mmol) i maleinske kiseline (67. 2 g, 579. 0 mmol) u 1-butanolu (3200 ml) i vodi (400 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 h. Zapremina smeše je smanjena do 1600 ml, vakuum destilacijom (55°C, 100 mbar) i zatim ohlađena na 0°C. Dobijeni čvrsti ostatak je sakupljen filtracijom, ispran heptanom (500 ml) i osušen u vakuumu na 35°C dajući maleatnu so A-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]- cikloheksiljmetansulfonamida (253. 0 g) u kristalnom obliku poznatom i kao Oblik A.

Eksperimentalno MH+ 338. 2; očekivano 338. 2.

1H-NMR (d6-DMSO): 1. 24- 1. 38 (2H), 1. 68 - 1. 92 (5H), 2. 00 - 2. 11 (2H), 2. 56 - 2. 61 (3H), 2. 91 - 3. 00 (2H), 3. 15 - 3. 27 (3H), 4. 39 - 4. 70 (1H), 6. 53 - 6. 73 (1H), 7. 16 - 7. 36 (1H). 8. 07 -8. 29 (1H).

PRIMER lc Metoda Za sakupljane difrakcije rendgenskog dijagrama praha

A-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-£/]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}-metansulfonamidne soli maleinske kiseline (Oblik A)

Rendgenski dijagram praha za Oblik A, A-metil-l-{trans-4-[metil(7H-

pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}-metansulfonamidne soli maleinske kiseline je snimljen na Bruker-AXS Ltd. D4 rendgenski difraktometa je opremljen automatskim izmenjivačem uzorka, teta-teta goniometrom, automatskim divergentnim slitom. i PSD Vantec-1 detektorom. Uzorci su pripremljeni za analizu postavjanjem na silikonski nosač sa niskim fonom. Uzorci su rotirani i istovremeno ozračeni sa bakar K-alfai X-zracima (talasna dužina = 1. 5406 Angstrema) sa rendgenskom cevi podešenom na 40kV/35mA. Analize su izvedene sa goniometrom u kontinualnom modu podešenom na implus od 0. 2 sekunde na 0. 018° koraka u opsegu dva teta od 2° do 55°. Rezultati su sumrano dati u Tabeli 1 i Tabeli 2.

Tabela 1

Rendgenski difrakcioni prikovi izraženi u u stepenima 2-teta, ±0. 2 stepena, približno

Tabela 2

Rendgenski difrakcioni prikovi izraženi u u stepenima 2-teta, ±0. 2 stepena, približno

Kao što je očigledno za prosečnog stručnjaka, rezultati rendgenskog

dijagrama praha mogu da variraju i uzastopni rendgenski dijagrami praha neće biti identični, čak i kada se analiziraju uzorci materijala iz iste partije dobijanja. Do ovog može doći usled pripremanja uzorka, temperature, određenog modela rendgenskog difraktometra, tehnike koju koristi tehničar, itd. Izraz “približno” ukoliko se koristi za razlikovanje pikova u rendgenskom dijagramu praha je defmisano kao navedena vrednost za 20 ± 0. 2 °20. Određivanje da li je kristalni oblik, Oblik A polimorfa i obuhvatanje istog u zahtevima treba interpretirati u skladu s varijabilitetima u ovom testu.

Ova varijabilnost je prikazana na Slici 1. Dve različite partije N-metil-1-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}-metansulfonamidne soli maleinske kiseline Oblik A su snimljene na XRPD difraktometru. Karakteritskični pikovi na Slici 1 potvrđuju da Oblik A polimorfa. Međutim, relativni intenzitet ov1H pikova kao i drugi pikovi se neznatno razlikuju.

Primer 2 Dobijanje N-ciklobutil-1 -{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil} metansulfonamida

Prema opštoj proceduri iz Primera 1 i primenom ne-kritičn1H varijacija osim supstituisanjem prekursora ciklobutanamina, dobijeno je traženo jedinjenje. Eksperimentalno MH+ 378. 0; očekivano 378. 2

1H-NMR (d6-DMSO): 1. 22 - 1. 32 (2H), 1. 47 - 1. 70 (6H), 1. 78 - 2. 04 (5H), 2. 16- 2. 24 (2H), 2. 85 - 2. 86 (2H), 3. 15 (3H). 3. 68 - 3. 78 (1H), 4. 60 - 4. 72 (1H), 6. 51 - 6. 54 (1H), 7. 11 - 7. 12 (1H), 7. 44 - 7. 49 (1H), 8. 08 (1H), 11. 60 (1H)

Primer 3 Dobijanje N-etil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin 4-il)amino]cikloheksil}metansulfonamida

Prema opštoj proceduri iz Primera 1 i primenom ne-kritičn1H varijacija osim

supstituisanjem prekursora etanamina, dobijeno je traženo jedinjenje.

Eksperimentalno MH+ 352. 0; očekivano 352. 2

1H-NMR (CDC13): 1. 24- 1. 44 (5H), 1. 64- 1. 74 (2H), 1. 87-2. 09 (3H), 2. 15 - 2. 21 (2H), 2. 97 - 2. 99 (2H), 3. 18 - 3. 27 (5H), 4. 46 - 4. 52 (1H), 4. 74 - 4. 86 (1H), 6. 55 (1H), 7. 04 (1H), 8. 28 (1H)

PRIMER 4 -Enzimatska JAK proba

Materijali: Nabavljeni su rekombinantni JAK-2 (Catalog Number PV4210) i JAK-3 (Catalog Number PV3855) od (Invitrogen Corporation, Madison. WI). Reckombinantni JAK-1 (GST-JAK-1 (852-1142)) i Tyk-2 (GST-Tyk2 (870-1187, Cl 187S)) upotrebljeni u ovom ispitivanju su eksprimirani u prečišćeni u Pfizer Laboratories. Adenozin 5’-trifosfat (ATP) je dobijeno od Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. JAKtid peptid

(peptidna sekvenca, FITC-KGGEEEEYFELVKK (SEQ ID NO: 1)) upotrebljen za JAK-2 i JAK-3 probu i IRS-1 peptid (peptidna sekvenca, 5-FAM-KKSRGDYMTMQIG (SEQ ID NO: 2)) upotrebljeni za JAK-1 i Tyk-2 probe su nabavljene od (American Peptide Company, Sunnyvale, CA). Reagens 3 za oblaganje je nabavljen od (Caliper Life Sciences. Hopkinton, MA).

Metode: Test proba pomeranja peptidne pokretljivosti je upotrebljen za kvantifitativno određivanje fosforilacije JAKtida (JAK-2 i JAK-3) ili IRS-1 peptida (JAK-1 i Tyk-2). Reakcije su izveden na ploči sa 384-ležišta (Matrical MP-101) u ukupnoj zapremini od 10 mikrolitra. Rekacione smeše sa 20 niM I IEPES, pH 7. 4, 10 mM magnezijum hlorida, 0. 01% goveđeg serum albumina (BSA), 0. 0005% Tween-20, ATP (4 mikromola za JAK-2 i JAK-3, 40 mikromola za JAK-1 i 7 mikromola za Tyk-2)), 2% DMSO i 1 mikromol peptidnog supstrata (JAKtid za JAK-2 i JAK-3 ili IRS-1 peptid za JAK-1 i Tyk-2). Jedinjenja su razblažena serijski u 100% dimetil sulfoksidu i testirana kao odgovor na dozu u 1 1 tačaka u duplikatu ili kvadruplikatu (200 ni jedinjenja/DMSO je dodato u 10 mikrolitra reakcije). Reakcije su inicirane dodatkom enzima do krajnje koncentracije od 2 nM JAK-2, 1 nM JAK-3, 7 nM Tyk2 ili 20 nM JAK-1. Probe su trajale 240 minuta za JAK-1, 150 minuta za JAK-2, 90 minuta za JAK-3 i 60 minuta za Tyk-2. Probe su zaustavljene u naznačena vremena dodatkom 20 mikrolitara 140 mM HEPES, 22. 5 mM EDTA i 0. 15% reagensa za oblaganje 3. Ploče su postavljene na LabChip 3000 (LC3000) instrument (Caliper Life Sciences) za merenje formiranje fosforilovanog peptida. Podaci su analizairani pomoću Hits Well Analyzer Software (Caliper Life Sciences) za postizanje količine formiranog proizvoda.

Podaci su zatim ubačeni u internu aplikaciju gde je svaki podatak izražen kao

% inhibicije baziran na uninhibiranim kontroloma i kontrolama bez enzima. Podaci Doza-odgovor su zatim fitovani pomoću 4 paramarske logičke jednačine (jednačina 1) za određivanje vrednosti IC50.

Jednačina 1:

Gde max je fitovana neinhibirana vrednost, min je fitovana vrednost potpune

inhibicije, i s je koeficijent nagiba.

Prema ovom protokolu, dobijeni su sledeći rezultati za tražena jedinjenja iz

Primera 1 i 2.

Tabela 3

Rezultati enzimske JAK probe

PRIMER 5 Proba in vitro proliferacije T-ćelija pasa

Aktivacija T-ćelija igra ključnu ulogu u različitim inflamatornim i autoimunim poremećajima kao i astmi, alergijama i pruritusu. Budući da aktivacija T-ćelija može, delom da bude izazvana citokinima koji signaliziraju kroz JAK-STAT putanju, JAK inhibitor može da bude efikasan protiv bolesti koje uključuju nekontrolisanu aktivaciju T-ćelija.

Metoda: Sakupljena je krv pasa u epruvetama sa natrijum heparinom od

29 Beagle kratkonog1H pasa i 23 psa mešanca. Krv (20 μL) je prebačena na ploču sa 96-ležišta (Costar 3598) sa 180 pL medjiuma (RPMI 1640, Gibco #21870-076, sa 1% goveđim fetalnim serumom inaktivirnim toplotom, Gibco #10082-39, 292 µg/ml L-glutamin, Gibco #250030-081, 100 u/ml penicilin i 100pg streptomicina po ml, Gibco #15140-122) koji sadrži nosač kao kontrolu ili test jedinjenje (0. 001 to 10 µM), konkanavalin A (ConA; 1 µg/ml, Sigma C5275), i pseći interleukin-2 (IL-2; 50 ng/ml. R&D Systems 1815-CL/CF). Ležišta koja sadrže krv, medijum sa nosačem kao kontrolom i bez ConA ili IL-2 su upotrebljena kao kontrole podloge. Ploče su inkubirane na 37° C tokom 48 h. Tritiran timidin, 0. 4 µCi/ležištu (Perkin Elmer, Net027A-005MC), je dodat tokom dodatn1H 20 h. Ploče su zamrznute i zatim odmrznute, isprane i profiltrirane pomoću Brandel MLR-96 ćelijskog harvestera i prethodno navlaženouh filter papira (Wallac 1205-401, Perkin Elmer). Filteri su osušeni na 60° C tokom jednog sata (Precision 16EG sušnica) i stavljeni u iste vrećice (Wallac 1205-411, Perkin Elmer) sa 10 mL scintilanta (Wallac 1205-440, Perkin Elmer). Zatvoreni fdteri su mereni na LKB Wallac 1205 Betaplate tečnom scintilacionom brojaču. Podaci su sakupljeni pomoću Gterm Betaplate programa vl. l (Wallac copiright 1989-1990) i pretvoreni u procenat inhibiticije, izračunati prema sledećoj formuli:

100- [(srednja vrednost Tretmana lekom cpm - srednja vrednost BCK cpm) x 100] = % Inibicije (srednja vrednost tretmana bez leka cpm -srednja vrednost BCK cpm)

Podaci su grafički predstavljeni kao procenat inhibicije pomoću GraphPad Prisni 4. 0, i IC50 krive su fitovane analizom uporednog poređenja.

Rezultati prosečn1H IC50 vrednosti dobijen1H kada je korišćena krv beagle

pasa iznosi 66. 3 nM za jedinjenja iz Primera la: 410 nM za Primer 2; i 83 nM za Primer 3. Prosečna vrednost IC50 dobijena ka je korišćena krv pasa mešanaca, iznosi 138 nM za jedinjenje iz Primera la. Ovi podaci ukazuju na to da su jedinjenja predmetnog pronalaska efikasna u inhibiciji proliferacije T-ćelija, ključne karakteristke u brojnim bolestima.

PRIMER 6 Proba smanjenja Pruritusa i Dermatitisa izazavn1H buvama Pruritus i dermatitis izazvani buvama su uobičajena stanja kod pasa. Pruritus je jedan od najozbiljn1H kliničk1H znakova povezan1H sa dermatitisom povezanim sa buvama, i neprekidno češanje, trljanje lica i griženje nogu može da dovede do različit1H promena na koži kao sto je ertem, edem, alopecija, l1Henifikacija, i hiper pigmentacija. Pruritus i dermatitis povezani sa buvama se mogu eksperimentalno indukovati. U ovim modelima, inflamatorne ćelije i citokini su pokazali da posreduju u imunoj reakciji na alergene. Shodno tome, JAK inhibitor koji inhibira transdukciju signala pruritogensk1H i proinflamatorn1H receptora citokina mogu da udu efikasni u inhibiciji, ublaženju ili smanjenju i pruritusa i dermatitisa povezanog sa buvama..

Ispitivanje

Dvadeset osam mužjaka i ženki pasa mešanaca težine od 5-35 kg i stariji od godinu dana su infestirani sa približno 100 odrasl1H jedinki mačij1H buva (Ctenocephalides felis) 14 dana pre početka doziranja i reinfested sa 30 buva po psu svaka 4 dana tokom ispitivanja. Sedam dana pre doziranja, dvadesetčetiri psa je podeljeno u tri različite grupe, placebo, 0. 5 mg/kg ili 0. 25 mg/kg jedinjenja iz Primera lb, bazirano na vizuelnoj analognoj skali (VAS) vrednosti za kožne lezije. Tretmani su davani oralno dva puta na dan tokom 28 dana, i praćeno je pruritičko ponašanje kao i eritem i kožne lezije tokom ispitivanja. Pruritičko ponašanje je zabeleženo tako što su psi smešteni u ograđeni prostor koji je opremljen video opremom tako daje snimana nj1Hova aktivnost tokom 4 h. Pruritička aktivnost je kvantifikovana određivanjem koliko dugo (u sekundama) su psi proveli češajući se. Kožne lezije su snimljene fotografisanjem abdominalnog, inguinalnog regiona i ozbiljnosti rankiranog prema vizuelnoh analognoj skali (VAS).

Statistička Analiza:

Snimljeno vreme pruritičkog ponašanja je analizirano pomoću pomešanog linearnog modela za ponovljene mere. Model obuhvata utvrđene efekte za lečenje i dan ispitivanja i interakacije za lečenje i dan studiranja. Slučajni efekti uključuju blok, interakcije bloka i tretmana i grešku. Bazni podaci za pruritičko ponašanje (dan -1) su upotrebljeni kao kovarijante u analizi pruritičkog ponašanja. Upotrebljena je metoda najmanjeg kvadrata za procenu načina tretmana. Standardne greške metodom najmanjeg kvadrata su određene i određen je interval pouzdanosti od 90%. Geometrijska sredina je izračunata metodom najmanjeg kvadrata za log-transformisane podatke. A priori kontrasti su upotrebljeni za procenu tretmana. Razlike među tretmanima su procenjeni na nivou od 10% pouzdanosti (P <0. 10).

Rezultati

Rezultati tretmana su prikazani na slici 2 i slici 3. Lezije i eritem su značajno smanjeni na

0. 5 mg/kg po grupi. Slika 2 ilustruje Dan 27 VAS vrednosti za primer lb kod pasa alergičn1H na buve (metoda najmanjeg kvadrata). Značajno smanjenje pruritusa u poređenju sa placebo na nivou pouzdanosti od 10% je zapaženo u različitim vremenskim intervalima tokom ispitivanja obe grupe (dani!, 4 i 12 za 0. 25 mg/kg doze i dani 1 i 20 za 0. 5 mg/kg doze). Slika 3 ilustruje Sekonde Pruritusa na 4 h snimanja za primer lb kod pasa alergičn1H na buve (metoda geometerijske sredine).

PRIMER 7 Proba inhibicije ćelijske proliferacije

Ćelijske linije Feline MYA-1 i FETJ su ćelijske linije T-limfoblasta/e/me

(mačke) dobijene od ATCC (Manassas, VA). Ove ćelije su kultivisane u RµMI 1640 kompletnom medijumu obogaćenom sa 10% FBS na 37°C u inkubatoru saovlaživačem sa 5% C02.

Ex vivo limfom psa u nodalnom tkivu

Maligne limfne čvorove su izvadili veterinari u Michigan State University (MSU)

Veterinary College, postavljeni u transportni medijum (Advanced RµMI 1640 kompletni medijum sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS), 100U/mL penicilina. 100 ug/mL streptomicina i 0. 25 ug/mL Amphotercina B (Invitrogen/Gibco®). Limfni čvorovi su procesirani 24 h od uklanjanja iseckani na komadiće i propušteni kroz sito za tkivo. Ćelijske susenzija su centrifugirane na 200 x g, supernatant je uklonjen, i ćelijske pločice su resuspendovane u NH4CI tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelijska suspenzija je peletiran centrifugiranjem; NH4CI je uklonjen i isprana jednom sa Hanks Balanced Sali Solution (HBSS), pa zatim resuspendovana u medijumu za prolifeaciju (Advanced RPMI komplet, 1% FBS, 50nM 2-Merkaptoetanol, 100U/mL penicilin, 100 ug/mL streptomicin i 0. 25 ug/mL Amfotercin B). Ćelijska suspenzije je zatim propuštena kroz najlonsko sito od 1 OOjim (BD-Falcon) i ćelije izbrojane pomoću hemacitometra. Ćelije su kultivisane ili u samom medujumu za proliferaciju, medijum za prolfieraciju obogaćenom sa 0. 005% Pansorbin® (inaktiviran toplotom, fiksiran formalinom Staphilococcus Aureus ćelije (SAC), Calbiochem), i 10 ng/mL psećeg IL-2 (R&D Systems), ili mediujumu za proliferaicju obogaćenom sa 125 ng/mL konkavalina A (Sigma) i 125 ng/mL lipopoliaharida (LPS; Calbiochem).

Proba In vitro Anti-Proliferacione metode

Ćelije gajene u pretodno opisanom medijumu su stavljene u ploču sa 96-ležišta Costar plates (Corning) u gustini od 1 x 103 ćelija/ležištu (ćelijske linijefeline) ili 2x105 ćelija/ležištu (ćelije limfn1H čvorova) i izložene različitim koncentracijama test jedinjenja do 5 dana na 37°C u inkubatoru sa ovlaživačem sa 5% CO2. Efekat na proliferaciju je određen pomoću CellTiter 96® AQue0Us Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) prema uputstvima proizvođača. Generalno, proliferacija je indirektno merena pomoću rastvorene tetrazolium soli (MTS) i elektron kuplujućim agensom. MTS bioredukcija u formazan proizvod rastvoran u medijumu za gajenje praćena je apsorbancom na 490nM na čitaču ploča Spectramax pomoću softvera Softmax Pro 4. 6 (Molecular Devices). Podaci su grafički prikazani kao procenat DMSO kontrol pomoću GraphPad Prisni 4. 00, i krive IC50 su fitoane modelom ne-linearne regresije sa sigmoidalnim odgovorom na dozu.

Rezultati

Tabela 4 pokazuje da jedinjenje iz Primera 1 može da inhibira proliferaciju limfoidne ćelijske linije MYA-1 mačaka koja zavisi od IL-2 za proliferaciju, ali ne i nezavisna linija IL-2 (FETJ). Jedinjenje formule IA 9 ili njene soli takođe mogu da inhibiraju proliferaciju nodalnog tkiva pasa dobijenog od pasa koji su dijagnozirani sa limfomom T- ili B-ćelija.

Ovi rezultati ukazuju da JAK inhibitor može da bude efikasan u lečenju limfoma pasa i mačaka.

Tabela 4

Claims (19)

1. Jedinjenje formule 1: ili njegova farmaceutski prihvatljiva so gde R1 je C1-4alkil po izboru supstituisan sa hidroksi.

2.    Jedinjenje    prema zahtevu 1, naznačeno time. što R1 je metil.

3.    Jedinjenje    prema zahtevu 1, naznačeno time, što R1 je etil, ili ciklobutil.

4. Jedinjenje prema zahtevu, naznačeno time, što je N-metil-1 -{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}metansulfonamid, ili njegova farmaceutski pr1Hvatljiva so.

5. Farmaceutska kompozicija koa obuhvata jedinjenje prema zahtevu 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i faramceutski prihvatljiv nosač.

6.    Postupak za lečenje alergijsk1H reakcija, alergijski dermatitis, atopični dermatitis, ekcem, ili pruritus kod sisara, koji obuhvata mammal administriranje obolelom sisaru, terapeutski efikasnu količinu jedinjenja iz zahteva 1.

7.    Postupak prema zahtevu 6, naznačen time, što terapeutski efikasna količina iznosi od 0. 01 mg/kg telesne težine/dan do 100 mg/kg of telesne težine/dan.

8. Postupak prema zahtevu 6, naznačen time, što terapeutski efikasna količina iznosi od 0.1 mg/kg telesne težine/dan do 10 mg/kg telesne težine/dan.

9.    Postupak    prema zahtevu 6, naznačen time, što    sisar obuhvata kućne ljubimce.

10.    Postupak    prema zahtevu 9, naznačen time, što    su kućni ljubimci, psi.

11.    Postupak    prema zahtevu 6, naznačen time, što    sisar obuhvata stoku.

12.    Postupak    prema zahtevu 6, naznačen time, što    jedinjenje prema zahtevu    1    je administerirano oralno, parenteralno, ili topikalno.

13.    Postupak za lečenje neurodegenerativn1H bolesti, keratokonjunktivitisa. hroničn1H respiratorn1H oboljenja, autoimun1H bolesti, inflamatornog oboljenja creva, neoplazije i artritičn1H stanja kod sisara koji obuhvata adminsitriranje obolelom sisaru terapeutski efikasnu količinu jedinjenja iz zahteval.

14.    Postupak za lečenje kancera, leukemije, lupusa, multiplog mijeloma kod sisara koji obuhvata adminsitriranje obolellom sisaru terapeutski efikasnu količinu jedinjenja iz zahteva 1.

15.    Kristalni oblik    A N-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}metansulfonamidne soli maelinske kiseline.

16.    Kristalni oblik    A N-metil-1 -{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4- il)amino]cikloheksil}metansulfonamidne soli maleinske kiseline prema zahtevu 15, koji ima rendgenski dijagram praha sa najmanje jednim karakterističnim pikom od oko 6. 2, 12, 6 i 15. 7 izraženim kao 2-teta.

17.    Kristalni oblik    A N-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4- il)amino]cikloheksil}metansulfonamidne soli maleinske kiseline prema zahtevu 15, koji ima rendgenski dijagram praha sa najmanje jednim karakterističnim pikom od oko 6. 2, 12. 6, 15. 7, 18. 5, 27 i 28. 38 izraženim kao 2-teta.

18.    Kristalni oblik A, N-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}metansulfonamidne soli maleinske kiseline prema zahtevu 15, koji ima rendgenski dijagram praha sa najmanje jednim karakterističnim pikom od oko, 6. 178, 8. 519, 12. 601. 13. 819, 15. 478, 15. 719. 16. 32, 17. 997, 18. 539, 20. 298, 20. 659, 21. 583, 22. 642, 23. 08, 24. 86, 25. 602, 26. 582, 27. 02, 27. 721, 28. 161, 28. 38, izraženim kao 2-teta.

19.    Postupak za dobijanje N-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil}metansulfonamidne soli maleinske kiseline oblika A, koji obuhvata reakciju N-metil-l-{trans-4-[metil(7H-pirolo[2, 3-d]pirimidin-4-il)amino]cikloheksil} metansulfonamida sa maleinskom kiselinom.