[go: up one dir, main page]

CN114829396A - 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合伴体 - Google Patents

用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合伴体 Download PDF

Info

Publication number
CN114829396A
CN114829396A CN202080087151.9A CN202080087151A CN114829396A CN 114829396 A CN114829396 A CN 114829396A CN 202080087151 A CN202080087151 A CN 202080087151A CN 114829396 A CN114829396 A CN 114829396A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
canine
caninized
amino acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080087151.9A
Other languages
English (en)
Inventor
M·莫尔塞耶
张远征
A·萨哈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intervet International BV
Original Assignee
Intervet International BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intervet International BV filed Critical Intervet International BV
Priority to CN202510665965.0A priority Critical patent/CN120789240A/zh
Publication of CN114829396A publication Critical patent/CN114829396A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供了用于治疗犬特应性皮炎的组合物，其包含结合犬IL‑22的融合蛋白、犬源化抗瘙痒抗体和犬源化抗炎抗体。本发明进一步提供了包含双特异性结合伴体的组合物，所述结合伴体包含所述融合蛋白和犬源化抗瘙痒抗体或犬源化抗炎抗体，或者，包含犬源化抗瘙痒抗体和犬源化抗炎抗体的双特异性抗体，其还包含结合犬IL‑22的融合蛋白。

Description

用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合 伴体
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2020年10月15日提交的美国临时专利申请序列号63/092,294，2020年10月15日提交的美国临时专利申请序列号63/092,296，2020年4月24日提交的美国临时专利申请序列号63/015,209，2020年4月24日提交的美国临时专利申请序列号63/015,220，2019年12月20日提交的美国临时专利申请序列号62/951,778和2019年12月20日提交的美国临时专利申请序列号62/951,793的优先权，上述所有申请的内容通过全文引入并入本文。
技术领域
本发明涉及用于治疗犬科动物中的特应性皮炎的组合物，其包含结合犬IL-22的融合蛋白，犬源化的抗瘙痒抗体和一种犬源化的抗炎抗体。本发明进一步涉及包含双特异性抗体的组合物，该双特异性抗体包含该融合蛋白和犬源化抗瘙痒抗体或犬源化抗炎抗体，或可选地，包含犬源化抗瘙痒抗体和犬源化抗炎抗体的双特异性抗体，其额外包含结合犬IL-22的融合蛋白。
背景技术
免疫系统包括由常驻和再循环的特化细胞组成的网络，这些细胞协同地作用以保护宿主免受传染性疾病和癌症的侵害。免疫系统执行此功能的能力在很大程度上取决于白细胞分泌的统称为白介素的一组蛋白质的生物活性。在经过充分研究的白介素中，三种重要分子被确定分别为白介素4(IL 4)、白介素31(IL-31)和白介素22(IL-22)。虽然IL-4、IL-31和IL-22是产生保护免受细胞外病原体(例如，组织或腔内寄生的寄生虫)侵害所必需的免疫反应的关键细胞因子，但这些细胞因子也与人和动物的过敏性疾病(包括特应性皮炎)的发病机制有关。
特应性皮炎(AD)是一种复发性瘙痒和慢性炎性皮肤病，其特征是人体的免疫系统失调和表皮屏障异常。特应性皮炎的病理和免疫学属性已成为广泛研究的主题[Rahman等人Inflammation&Allergy-drug target 10:486-496(2011)和Harskamp等人,Seminar inCutaneous Medicine and Surgery 32:132-139(2013)中综述]。特应性皮炎也是伴侣动物(尤其是狗)的常见疾病，据估计其患病率约为犬科动物种群的10-15％。狗和猫中特应性皮炎的发病机制[Nuttall等人,Veterinary Records 172(8):201-207(2013)综述]与人类中特应性皮炎的发病机制显著相似，包括多种免疫细胞的皮肤浸润和包括IL-4、IL-13和IL-31的优势的CD4+Th2极化的细胞因子环境。此外，IL-22与导致表皮增生的过度上皮增殖有关，表皮增生是特应性皮炎的特征。
例如，针对犬IL-31的抗体已被证明对与犬的特应性皮炎相关的瘙痒具有显著效果[US 8,790,651 B2；US 10,093,731 B2]。此外，针对人类IL-31受体α(IL31RA)的抗体已经过测试，并发现对人类中的特应性皮炎相关的瘙痒具有显著效果[Ruzicka等人,NewEngland Journal of Medicine,376(9),826–835(2017)]。因此，阻断IL-31与其受体IL31RA的结合导致与特应性皮炎相关的瘙痒的缓解。
已经开发出针对人白介素4受体α的单克隆抗体，并且已经广泛测试了其中这些抗体中的一些对治疗人类特应性皮炎的治疗效果[参见，例如，US2015/0017176 A1]。最近，还公开了阻断犬IL-4与犬IL-4Rα结合的针对犬白介素4受体α(犬IL-4Rα、犬IL-4Rα、cIL-4Rα或cIL-4Rα)的犬源化抗体[US2018/0346580A1，特此通过引用将其全部并入本文]。由于II型IL-4受体由IL-4受体α链和IL-13受体α1链组成，因此已经获得了针对犬IL-4Rα的抗体，该抗体可以阻断犬IL-4和犬IL-13与II型犬IL-4受体结合，从而用于帮助阻断与特应性皮炎相关的炎症[US2018/0346580A1]。
白介素22(IL-22)属于IL-10细胞因子家族。IL-22特异性结合IL-10R2(也称为IL-10Rβ)和白介素22受体(IL-22R)的异二聚体复合物组成的受体复合物，并通过该受体复合物发出信号[参见Lee等人,Pharmacology Research&Perspectives,1-13页(2018:e00434)]。白介素22受体也称为白介素22R，α1；IL-22RA1；IL-22R1；zcytor11；和CRF2-9[Xu等人,Proc.Nat.Acad.Sci.98(17)9511-9516(2001)；Gelebart和Lai,Atlas of Geneticsand Cytogenetics 14(12):1106-1110(2010)]。IL-22在伤口愈合过程中诱导上皮细胞增殖，且其缺乏可能会促进肿瘤发展[Huber等人,Nature 491:259 263(2012)]。
白介素22结合蛋白(IL-22BP)，也被称为IL-22RA2、CRF2-10和CRF2-X，对于通过与IL-22结合来限制作为特应性皮炎特征的表皮增生，从而阻断IL-22与IL-22R的相互作用且因此阻断导致表皮增殖的信号传导途径至关重要。IL-22BP是一种可溶性II类细胞因子受体，其是一种天然存在的IL-22拮抗剂[Xu等人，Proc.Nat.Acad.Sci.98(17)9511-9516(2001)]。在体内，IL-22BP调节IL-22的促炎性作用(例如中性粒细胞浸润)，但不调节IL-10的作用[Weber等人,Infect.Immun.75:1690-1697(2007)]。因此，IL-22BP通过阻断IL-22与IL-22R的相互作用来起到抗增殖剂的作用。
此外，IL-22的生物合成结合伴体，包含与小鼠IgG2a Fc区的N末端融合的人IL-22RA1的胞外结构域[AAH29273.1；Pro-18-Thr228]的融合蛋白，[购买自Creative BioMart45-1Ramsey Road,Shirley NY11967]，已显示抑制COLO 205人结肠直肠腺癌细胞的IL-22诱导的IL-10分泌[来自Creative BioMart的数据表]。
已被证明有助于治疗特应性皮炎和/或已显示有希望治疗特应性皮炎的药物包括：Janus激酶(JAK)抑制剂[参见例如US8,133,899；US8,987,283；WO 2018/108969]、脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂[参见例如US8,759,366]和在TH2细胞上表达的趋化因子受体同源分子的拮抗剂[参见例如US7,696,222、US8,546,422、US8,637,541和US8,546,422]。
然而，尽管最近在治疗特应性皮炎方面取得了成功，但目前所采用的疗法都没有产生伴随着对皮肤炎症的显著效果及皮肤屏障功能改善的快速起效的抗瘙痒作用。因此，需要设计可以一次性解决特应性皮炎的这三种症状的更好的疗法。
本文对任何参考文献的引用不应解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。
发明内容
本发明涉及用于治疗犬科动物的特应性皮炎的双特异性结合伴体、双特异性抗体和包含双特异性结合伴体和/或双特异性抗体的组合物。在具体实施方案中，本发明涉及用于治疗犬科动物的特应性皮炎的组合物，其包含结合犬白介素IL-22(IL-22)的融合蛋白、抗瘙痒抗体和抗炎抗体。在某些实施方案中，抗瘙痒抗体和/或抗炎抗体是嵌合啮齿动物(即小鼠或大鼠)-犬抗体。在这种类型的特定实施方案中，抗瘙痒抗体和抗炎抗体都是嵌合啮齿动物-犬抗体。在其他实施方案中，抗瘙痒抗体和/或抗炎抗体是犬源化抗体。在这种类型的特定实施方案中，抗瘙痒抗体和抗炎抗体都是犬源化抗体。在其他实施方案中，抗瘙痒抗体和/或抗炎抗体是犬抗体。在这种类型的特定实施方案中，抗瘙痒抗体和抗炎抗体都是犬抗体。
因此，本发明包括用于治疗犬科动物的特应性皮炎的组合物，其包含结合犬白介素IL-22(IL-22)的融合蛋白、犬源化的抗瘙痒抗体和犬源化的抗炎抗体。在特定实施方案中，结合犬IL-22的融合蛋白是犬IL-22RA1-Fc融合蛋白。在相关实施方案中，结合犬IL-22的融合蛋白是犬IL-22RA2-Fc融合蛋白。
在具体实施方案中，所述组合物包含犬源化抗炎抗体和双特异性结合伴体，所述双特异性结合伴体包含犬IL-22RA1-Fc融合蛋白和犬源化抗瘙痒抗体的单体。在某些实施方案中，犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31(cIL-31)抗体。在特定实施方案中，犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链。在具体实施方案中，犬源化IL-31抗体的轻链被修饰以包含替代恒定轻链结构域(CL)的来自犬源化IL-31抗体重链的重链恒定区1(CH1)，和犬源化IL-31抗体的重链被修饰以包含替代CH1的来自犬源化IL-31抗体轻链的恒定轻链结构域(CL)。在具体实施方案中，犬IL-22RA1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在某些实施方案中，犬源化抗炎抗体是犬源化白介素4受体α(IL-4Rα)抗体。在特定实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，犬源化的IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链。
在相关实施方案中，所述组合物包含犬源化抗炎抗体和双特异性结合伴体，所述双特异性结合伴体包含犬IL-22RA2-Fc融合蛋白和犬源化抗瘙痒抗体的单体。在某些实施方案中，犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31(cIL-31)抗体。在特定实施方案中，犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链。在具体实施方案中，犬源化IL-31抗体的轻链被修饰以包含替代恒定轻链结构域(CL)的来自犬源化IL-31抗体重链的重链恒定区1(CH1)和犬源化IL-31抗体的重链被修饰以包含替代CH1的来自犬源化IL-31抗体轻链的恒定轻链结构域(CL)。在具体实施方案中，犬IL-22RA2-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在这种类型的某些实施方案中，犬源化抗炎抗体是犬源化白介素4受体α(IL-4Rα)抗体。在特定实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链和含有SEQID NO:5的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链。
在替代实施方案中，所述组合物包含犬IL-22RA1-Fc融合蛋白和双特异性抗体，所述双特异性抗体包含含有重链和轻链的犬源化抗瘙痒抗体的单体和含有重链和轻链的犬源化抗炎抗体的单体。在某些实施方案中，犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31受体α(IL-31RA)抗体。在其他实施方案中，犬源化抗炎抗体是犬源化IL-4Rα抗体。在具体实施方案中，犬源化抗瘙痒抗体是犬源化IL-31RA抗体并且犬源化抗炎抗体是犬源化IL-4Rα抗体。在特定实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链和含有SEQID NO:20的氨基酸序列的重链。在相关实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链。在具体实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体的轻链被修饰以包含替代恒定轻链结构域(CL)的来自犬源化IL-4Rα抗体重链的重链恒定区1(CH1)并且犬源化IL-4Rα抗体的重链被修饰以包含替代CH1的来自犬源化IL-4Rα抗体轻链的恒定轻链结构域(CL)。在某些实施方案中，双特异性抗体的犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31受体α(IL-31RA)抗体的单体。在更具体的实施方案中，犬源化的IL-31RA抗体包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链。在更具体的实施方案中，犬IL-22RA1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在相关实施方案中，所述组合物包含犬IL-22RA2-Fc融合蛋白和双特异性抗体，所述双特异性抗体包含含有重链和轻链的犬源化抗瘙痒抗体的单体和含有重链和轻链的犬源化抗炎抗体的单体。在这种类型的某些实施方案中，犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素-31受体α(IL-31RA)抗体。在其他实施方案中，犬源化抗炎抗体是犬源化IL-4Rα抗体。在具体实施方案中，犬源化抗瘙痒抗体是犬源化IL-31RA抗体并且犬源化抗炎抗体是犬源化IL-4Rα抗体。在特定实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链。在相关实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链。在具体实施方案中，犬源化IL-4Rα抗体的轻链被修饰以包含替代恒定轻链结构域(CL)的来自犬源化IL-4Rα抗体重链的重链恒定区1(CH1)并且犬源化IL-4Rα抗体的重链被修饰以包含替代CH1的来自犬源化IL-4Rα抗体轻链的恒定轻链结构域(CL)。在某些实施方案中，双特异性抗体的犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31受体α(IL-31RA)抗体的单体。在更具体的实施方案中，犬源化的IL-31RA抗体包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链。在更具体的实施方案中，犬IL-22RA2-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
本发明还进一步提供了本发明的双特异性结合伴体。在某些实施方案中，双特异性结合伴体包含犬IL-22RA1-Fc融合蛋白和犬源化抗瘙痒抗体的单体。在这种类型的特定实施方案中，犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31(cIL-31)抗体。在更具体的实施方案中，犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链。在具体实施方案中，犬源化IL-31抗体的轻链被修饰以包含替代恒定轻链结构域(CL)的来自犬源化IL-31抗体重链的重链恒定区1(CH1)和犬源化IL-31抗体的重链被修饰以包含替代CH1的来自犬源化IL31抗体轻链的恒定轻链结构域(CL)。在更具体的实施方案中，犬IL-22RA1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在相关实施方案中，双特异性结合伴体包含犬IL-22RA2-Fc融合蛋白和犬源化抗瘙痒抗体的单体。在这种类型的特定实施方案中，犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31(cIL-31)抗体。在更具体的实施方案中，犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链。在具体实施方案中，犬源化IL-31抗体的轻链被修饰以包含替代恒定轻链结构域(CL)的来自犬源化IL-31抗体重链的重链恒定区1(CH1)和犬源化IL-31抗体的重链被修饰以包含替代CH1的来自犬源化IL-31抗体轻链的恒定轻链结构域(CL)。在更具体的实施方案中，犬IL-22RA2-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在其他实施方案中，包含本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白的组合物还包含一种或多种额外的治疗组分。在一个这样的实施方案中，治疗组分是Janus激酶(JAK)抑制剂。在这种类型的具体实施方案中，JAK抑制剂是奥拉替尼及其药学上可接受的盐。在可选的实施方案中，JAK抑制剂是：1-[(3R,4S)-4-氰基四氢吡喃-3-基]-3-[(2-氟-6-甲氧基-4-吡啶基)氨基]吡唑-4-甲酰胺，及其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，治疗组分是脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂。在这种类型的具体实施方案中，SYK抑制剂是(1S,4R)-4-羟基-2,2-二甲基-4-{5-[3-甲基-5-(4-甲基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-1,3-噻唑-2-基}-环己烷羧酸或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，治疗组分是在TH2细胞上表达的趋化因子受体同源分子的拮抗剂。
本发明进一步提供治疗特应性皮炎的方法，包括将上述组合物之一施用于患有特应性皮炎的犬科动物。
在另一方面，本发明提供了一种分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其特异性结合犬白介素4受体α(IL-4Rα)。在一个这样的实施方案中，IL-4Rα抗体包含一组六个互补决定区(CDR)，其中三个是重链CDR：CDR重链1(CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3(CDRH3)，t其中三个是轻链CDR：CDR轻链1(CDRL1)、CDR轻链2(CDRL2)和CDR轻链3(CDRL3)；其中所述六个CDR的组是：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDRH1；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDRH2；包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDRH3；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDRL3。
在另一个实施方案中，IL-4Rα抗体包含一组六个互补决定区(CDR)，其中三个是重链CDR：CDR重链1(CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3(CDRH3)，和其中三个是轻链CDR：CDR轻链1(CDRL1)、CDR轻链2(CDRL2)和CDR轻链3(CDRL3)；其中所述六个CDR的组是：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDRH1；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDRH2；包含SEQID NO：44的氨基酸序列的CDRH3；包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDRL1；包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列的CDRL2；和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDRL3。
在特定实施方案中，分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段结合犬IL-4Rα并阻断犬IL-4Rα与犬白介素4的结合。在更具体的实施方案中，分离的哺乳动物抗体IL-4Rα或其抗原结合片段是犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段。
在一个具体实施方案中，犬源化抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：5的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO：4的轻链，或该抗体的抗原性片段。在另一个这样的实施方案中，犬源化抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：20的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO：19的轻链，或该抗体的抗原性片段。在另一个实施方案中，犬源化抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：7的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO：6的轻链，或该抗体的抗原性片段。在又一个实施方案中，犬源化抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：22的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链，或该抗体的抗原性片段。
本发明的这些和其他方面将通过参考以下的附图说明和具体实施方式得到更好的理解。
附图说明
图1是显示犬IL-22与犬IL-22RA1-Fc融合蛋白的结合的曲线图。使用的犬IL-22RA1-Fc融合蛋白是(i)犬IL-22RA1的细胞外结构域与(ii)犬IgG-B Fc的融合蛋白(犬IL-22RA1-FcB)。使用的犬IL-22RA1-Fc融合蛋白是一种(i)犬IL-22RA1的细胞外结构域与(ii)犬源IgG-B Fc的融合蛋白。测试了犬IL-22RA1-FcB融合蛋白的与犬IL-22结合的能力，结果表明犬IL-22RA1-FcB融合蛋白与犬IL-22特异性地并且以剂量依赖性方式结合。
图2是显示犬IL-22与犬IL-22BP(IL-22RA2)的结合的曲线图。使用的犬IL-22RA2-Fc融合蛋白是(i)犬IL-22BP(IL-22RA2)与(ii)犬IgG-B Fc的融合蛋白，犬IL-22BP-FcB(IL-22RA2-FcB)。测试了犬IL-22BP-FcB融合蛋白的与犬IL-22结合的能力，结果表明犬IL-22BP-FcB融合蛋白特异性地和以剂量依赖性方式与犬IL-22结合。
图3是显示通过IL-4Rα(IL-4Rα)抗体对IL-4介导的STAT-6磷酸化的抑制的曲线图。评估了三种不同的犬源化单克隆抗犬IL-4Rα抗体(命名为c4H3、c146E2-H3L3和c152H11-H3L3)抑制αSTAT-6磷酸化的能力。数据显示，在IL-4存在下，所有的三种抗体均导致STAT-6磷酸化的剂量依赖性抑制。在不存在IL-4Rα(IL-4Rα)抗体的情况下的IL-4对照显示在曲线图的左上部分。
图4是显示通过IL-4Rα抗体对IL-13介导的STAT-6磷酸化的抑制的曲线图。评估了三种不同的犬源化单克隆抗犬IL-4Rα抗体(命名为c4H3、c146E2-H3L3和c152H11-H3L3)抑制STAT-6磷酸化的能力。数据显示，在IL-13存在下，所有三种抗体均导致STAT-6磷酸化的剂量依赖性抑制。在不存在IL-4Rα(IL-4Rα)抗体的情况下IL-13对照显示在图表的左上部分。
图5是显示IL-31与IL-31R(IL-31RA)细胞外结构域的结合的曲线图。测试了犬IL-31RA的细胞外结构域(ECD)与犬源IL-31结合的能力。结果表明，IL-31RA ECD以剂量依赖性方式与生物素化的犬IL-31结合，EC50为0.3679μg/ml。
具体实施方式
作为对特应性皮炎更好疗法需要的回应，本发明提供了可实现特应性皮炎涉及的犬IL-4(cIL-4)、犬IL-31(cIL-31)和犬IL-22(cIL-22)信号传导途径的同时调节的制剂和方法，以产生一种伴随着对皮肤炎症有显著效果和皮肤屏障功能的改善的抗瘙痒作用的快速起效。
缩写
在本发明的整个详细说明和实施例中，将使用以下缩写：
ADCC 抗体依赖性细胞毒性
CDC 补体依赖性细胞毒性
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用Kabat编号系
统定义
CHO 中国仓鼠卵巢
EC50 导致50％效力或结合的浓度
ELISA 酶联免疫吸附试验
FR 抗体框架区：不包括CDR区的免疫球蛋白可变区
HRP 辣根过氧化物酶
IFN 干扰素
IC50 导致50％抑制的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat开创的免疫球蛋白比对和编号系统[Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版。Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]
mAb 单克隆抗体(也称为Mab或MAb)
MOA 作用机制
NHS 正常人血清
PCR 聚合酶链式反应
PK 药代动力学
SEB 葡萄球菌肠毒素B
TT 破伤风类毒素
VH 免疫球蛋白重链可变区
VL 免疫球蛋白轻链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
定义
为了更容易理解本发明，某些技术和科学术语具体定义如下。除非在本文其他地方特殊定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用，包括所附权利要求，诸如“一”、“一个”和“该”的词的单数形式包括它们对应的复数引用，除非上下文另有明确规定。
当它应用于细胞或受体时，“激活”是指用配体激活或处理细胞或受体，除非上下文另有说明或明确指出。“配体”包括天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和衍生自抗体的结合化合物。“配体”还包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“激活”可以指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。
分子的“活性”可以描述或指该分子与配体或与受体的结合、催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原性活性、调节其他分子的活性等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞-细胞相互作用(例如粘附)的活性，或维持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”还可以指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室(biological compartment)中的浓度等。“活性”可以指先天或适应性免疫系统的组分的调节。
“施用”和“处理”，当它应用于动物(例如犬科动物受试者、细胞、组织、器官或生物流体)时，是指外源性药物、治疗、诊断试剂或组合物与动物(例如犬科动物受试者、细胞、组织、器官或生物流体)接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。
“施用”和“处理”还意指例如通过试剂、诊断、结合化合物或通过另一种细胞进行的体外和离体处理。术语“受试者”包括任何有机体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，犬科动物、猫科动物或人)并且最优选犬科动物。
“治疗”或“处理”是指将治疗剂(如含有本发明的任何抗体和/或双特异性抗体和/或融合蛋白的组合物)内部或外部施用于例如具有一种或多种症状或被怀疑患有该药剂具有治疗活性的病症的犬科动物受试者或患者。
通常，药剂以有效减轻和/或改善治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病/病症症状的量施用，无论是通过任何临床可测量度诱导此类症状的消退或抑制此类症状的进展。有效缓解任何特定疾病/病症症状的治疗剂的量(也称为“疗效有效量”)可以根据诸如患者(例如，犬科动物)的疾病状态、年龄和体重，以及药物组合物在受试者中引起期望反应的能力的因素而变化。可以通过兽医或其他熟练的医疗保健提供者通常使用的任何临床评估来评估疾病/病症症状是否已经减轻或改善，以评估该症状的严重性或进展状态。尽管本发明的实施方案(例如，治疗方法或制品)可能不能有效地减轻每个受试者的目标疾病/病症症状，但它应该减轻具有统计学显著数量的受试者的目标疾病/病症症状，如由本领域已知的任何统计检验确定的，如Student’s t检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验。
“治疗”在应用于人类、兽医(例如犬科动物)或研究对象时，是指治疗性处理以及研究和诊断应用。“治疗”在应用于人类、兽医(例如犬科动物)或研究对象，或细胞、组织或器官时，包括本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或融合蛋白与例如，犬科动物或其他动物受试者、细胞、组织、生理区室(physiological compartment)或生理流体的接触。
如本文所用，除非另有说明，术语“犬科动物”包括所有家犬(domestic dogs)、牧羊犬(Canis lupus familiaris)或家狗(Canis familiaris)。
如本文所用，术语“猫科动物”是指猫科的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和家养成员，包括家猫、纯种和/或杂种伴侣猫、展示猫、实验猫、克隆猫和野猫(wild cats)或流浪猫(feral cats)。
如本文所用，术语“犬框架”是指犬抗体的重链和轻链的除了本文定义为CDR残基的高变区残基以外的氨基酸序列。关于犬源化抗体，在大多数实施方案中，天然犬CDR的氨基酸序列被两条链中相应的外源CDR(例如，来自小鼠或大鼠抗体的CDR)替换。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可以包含一些外源非CDR残基，例如，以保持犬抗体内外源CDR的构象，和/或改变Fc功能，如以下示例和/或在US10,106,607B2中公开，特此通过引用将其全部并入本文。
犬抗体(也称为免疫球蛋白G或IgG)是约150Kd的大四聚体蛋白。每个IgG蛋白由两条相同的轻链(每条约25Kd)和两条相同的重链(每条约50Kd)组成。犬IgG有四种已知的IgG重链亚类，分别称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。有两种类型的轻链；κ和λ链。每条κ或λ轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)组成。两条重链中的每一条都由一个可变域(VH)和称为重链恒定区1(CH1或CH 1)、重链恒定区2(CH2或CH 2)和重链恒定区3(CH3或CH3)的三个恒定域组成。CH1结构域通过称为“铰链”或可选地“铰链区”的氨基酸序列连接到CH2结构域。在本发明中，四种犬IgG Fc片段中每一个的氨基酸序列基于Tang等人确定的CH1和CH2结构域的识别边界[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)]。在人类中，IgG存在于称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的四个亚类之一中。IgG的亚类主要由铰链区的序列决定，这些序列在IgG的四个亚类中不同。两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链也通过二硫键与一条轻链相连接。
用木瓜蛋白酶消化IgG抗体在铰链区破坏抗体分子并导致形成三个片段。这些片段中有两个是相同的，每个都由轻链和重链的VH和CH1结构域结合在一起组成。这些片段称为“Fab”片段并且它们包含抗体的抗原结合位点。Fab片段是通过二硫键附加到VH-CH1链的VL-CL链。用木瓜蛋白酶消化产生的第三个片段称为“Fc”并且它包含通过二硫键结合在一起的两条重链的其余部分。因此，Fc包含由两条重链中每一条的CH2和CH3结构域组成的二聚体。虽然Fab使抗体能够与其同源表位结合，但Fc使抗体能够介导免疫效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。“Fab片段”由一条轻链(VL结构域和CL结构域)和一条重链的CH1和可变区(VH)组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
缩写为“Fc”的“片段可结晶区(Fragment crystallizable region)”对应于与称为Fc受体的细胞表面受体相互作用的抗体的CH3-CH2部分。如本文所用，特别是关于成为与犬IL-22RA1或犬IL-22RA2的融合蛋白的一部分，“Fc”是抗体的CH3-CH2部分的单体。Tang等人首先描述了四种犬IgG中每一种的犬片段可结晶区(cFc)[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)；另见,Bergeron等人,Vet.Immunol.Immunopathol.157:31-41(2014)]。
如本文所用，犬Fc“IgG-Bm”是在IgG-B的SEQ ID NO：14的氨基酸序列中包含两(2)个氨基酸残基置换D31A和N63A(见下文)的犬IgG-B Fc。SEQ ID NO：14的位置31处的天冬氨酸残基(D)和SEQ ID NO：14的位置63的天冬酰胺残基(N)在IgG-Bm中被丙氨酸残基(A)置换。这两个氨基酸残基置换用于显著降低天然存在的犬IgG-B的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)[参见US10,106,607B2，其内容通过引用整体并入本文]。还设想了对IgG-Bm的进一步氨基酸置换，这与可在IgG-B中进行的那些相似，并且可以包括有利于在双特异性抗体和/或双特异性结合伴体中形成异二聚体的氨基酸置换，如下文所述。
白介素22(IL-22)与由白介素22受体和IL-10R2的异二聚体复合物组成的受体复合物特异性结合，并通过该受体复合物发信号。白介素22受体也称为白介素22Rα1(IL-22RA1)。如本文所用，“犬IL-22RA1-Fc融合蛋白”包含与犬IgG Fc的N末端融合的犬IL-22RA1的细胞外结构域。犬IL-22RA1-Fc融合蛋白可以通过基因工程从编码与犬IgG Fc的N端融合的IL-22RA1细胞外结构域的化学合成核酸产生。
白介素22结合蛋白(也称为IL-22RA2或IL-22BP)通过阻断IL-22与其受体的相互作用(见上文)起到抗增殖剂的作用。如本文所用，“犬IL-22RA2-Fc融合蛋白”包含与犬IgGFc融合的犬白介素22结合蛋白。犬IL-22RA2-Fc融合蛋白可以通过基因工程从编码与犬IgGFc的N端融合的犬IL-22RA2的化学合成核酸产生。
如本文所用，例如在抗体的氨基酸序列中用另一个氨基酸残基“置换氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替代氨基酸残基”并且表示氨基酸序列中特定位置的特定氨基酸残基已被不同的氨基酸残基替代(或置换)。可以特别设计此类置换，即通过例如重组DNA技术在氨基酸序列的特定位置处有目的地用丝氨酸替代丙氨酸。或者，抗体的特定氨基酸残基或氨基酸残基串可以通过更天然的选择过程用一个或多个氨基酸残基替代，例如基于细胞产生的抗体结合该抗原上给定区域(例如，含有表位或其部分的区域)的能力，和/或使抗体包含保留与它所取代的CDR相同的规范结构的特定CDR。此类置换/替代可导致“变体”CDR和/或变体抗体。
如本文所用，术语“抗体”是指表现出所需生物活性的任何形式的抗体。抗体可以是单体、二聚体或更大的多聚体。因此，它以最广泛的意义使用，且特别地涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、犬源化抗体、完全犬抗体、嵌合抗体和骆驼源化的单域抗体。“亲本抗体”是通过将免疫系统暴露于抗原而获得的抗体，然后修饰抗体用于预期用途，例如将抗体犬源化以用作犬治疗性抗体。
如本文所用，如在标准结合测定(例如，
Figure BDA0003695308960000161
ELISA或流式细胞术)中所确定的，“阻断”或“阻止”或“封闭”例如犬受体与其结合伴体(配体)的结合的本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或融合蛋白和/或双特异性结合伴体是(部分或完全)阻断犬受体与其犬配体的结合的抗体和/或双特异性抗体和/或融合蛋白和/或双特异性结合伴体，反之亦然。
“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。
如本文所用，术语“双特异性结合伴体”和“双特异性结合蛋白”可互换使用，且是指可同时靶向两种不同抗原的人工蛋白质分子，并且其中该人工蛋白质分子由单克隆抗体的单体重链和轻链与包含犬IgG Fc(或修饰的犬IgG Fc，例如下文定义的IgG-Bm)的融合蛋白的结合形成，通过基因工程与结合靶蛋白的另一个蛋白部分融合。当双特异性结合伴体靶向两种不同的抗原时，双特异性结合伴体的两个结合位点是不同的。双特异性结合伴体的一个实例是犬IL-31的抗体的犬源化单体，其与包含通过基因工程与犬源IgG Fc融合的犬IL-22RA1的细胞外结构域的融合蛋白相关联，例如本文中举例说明的，并且其中双特异性结合伴体可以同时靶向犬IL-31和犬IL-22。
如本文所用，“双特异性抗体”是可以同时靶向两种不同抗原的人工蛋白。一种优选类型的双特异性抗体是由四个不同多肽链组成的IgG样抗体。因此，双特异性抗体可以是包含两个单体的异二聚体，每个单体包含重链和轻链。第一单体可以来自针对一种特定抗原的抗体，而第二单体可以来自针对不同抗原的抗体。例如，本发明的某些双特异性抗体可以同时靶向IL-31RA和IL-4Rα。这样的抗体通过将具有对IL-4Rα的特异性的一条重链和一条轻链与具有对IL-31RA的特异性的一条重链和一条轻链结合而形成。此外，每一条重链和轻链可以用其氨基酸序列的特定突变进行修饰，以便有利于IL-4Rα抗体的重链和轻链相互结合以及IL-31RA抗体的重链和轻链相互结合，但同时相对于IL-4Rα重链与另一个IL-4Rα重链或IL-31RA重链与另一个IL-31RA重链的结合，有利于IL-4Rα抗体的重链与IL-31RA抗体的重链的结合。
在双特异性抗体和双特异性结合伴体的背景下，抗体的“单体”由该抗体的一条重链和一条轻链组成。
如本文所用，“人工蛋白质”和“人工蛋白质分子”可互换使用，并表示自然界中不天然存在的蛋白质(或蛋白质的多聚体，例如二聚体、异二聚体、四聚体和异四聚体等)，例如人造融合蛋白或来自两种不同抗体的单体的异二聚体。
通常，当犬抗原结合活性以摩尔为基础表示时，本发明的抗体或抗原结合片段保留其活性的至少10％(当与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的犬抗原结合亲和力。还意在本发明的抗体或抗原结合片段可以包括不显著改变其生物学活性的保守或非保守氨基酸置换(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
“分离抗体”是指纯化状态，且在这种情况下是指分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或例如细胞碎片和生长培养基的其他物质。一般而言，术语“分离的”并非意指完全不存在此类物质或不存在水、缓冲剂或盐，除非它们以实质上干扰本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。
如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一和第二抗体来自不同的物种。[US4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)]。通常，可变结构域从来自实验动物(例如啮齿动物)的抗体(亲本抗体)获得，而恒定结构域序列从动物受试者抗体(例如人或犬)获得，因此产生的嵌合抗体与亲本(例如啮齿动物)抗体相比，分别在人类或犬科动物受试者中引起不良免疫反应的可能性较小。
如本文所用，术语“犬源化抗体”是指包含来自犬和非犬(例如，鼠或大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，犬源化抗体将包含基本上所有的至少一个或多个，通常两个可变结构域(其中所有或基本上所有高变环对应于非犬免疫球蛋白的那些(例如，包含如下例示的6个CDR))，并且所有或基本上所有框架(FR)区(并且通常所有或基本上所有剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的那些。如本文所例示的，犬源化抗体包含来自鼠或大鼠抗犬抗原抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含一个或多个如本文所例示的氨基酸变化，其进一步优化犬源化抗体的有效性，例如增加其与其犬抗原的结合和/或其阻断该犬抗原与犬抗原的天然结合伴体结合的能力。
每个轻/重链对的可变区配对形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，这两个结合位点通常是相同的。
通常，重链和轻链的可变结构域包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，其位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常通过框架区对齐，从而能够与特定表位结合。通常，从N端到C端，轻链和重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常，氨基酸对于每个结构域的分配是根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978)；Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia等人,Nature 342:878-883(1989)]的定义。
如本文所用，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基[也就是轻链可变域中的CDRL1(或LCDR1)、CDRL2(或LCDR2)和CDRL3(或LCDR3)和重链可变域中的CDRH1(或HCDR1)、CDRH2(或HCDR2)和CDRH3(或HCDR3)]。[参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)，按序列定义抗体的CDR区域；另见Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，通过结构定义抗体的CDR区域]。
如本文所用，术语“框架”或“FR”残基是指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
狗IgG有四种已知的IgG重链亚型，且称为IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。两种已知的轻链亚型称为λ和κ。在本发明的具体实施方案中，除了结合和犬免疫细胞的激活外，本发明的针对其抗原的犬或犬源化抗体最佳地具有两种属性：
1.缺乏例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的效应子功能，和
2.使用工业标准技术如基于蛋白质A色谱的技术易于大规模纯化。
天然存在的犬IgG同种型都不满足这两个标准。例如，IgG-B可以使用蛋白A纯化，但具有高水平的ADCC活性。另一方面，IgG-A与蛋白A弱结合，但也显示出ADCC活性。此外，IgG-C和IgG-D都不能在蛋白A柱上纯化，尽管IgG-D没有显示ADCC活性。(IgG-C存在相当大的ADCC活性)。本发明解决这些问题的一种方式是通过提供对本发明抗原特异性的修饰的本发明的犬IgG-B抗体，和/或双特异性抗体，和/或双特异性结合伴体，和/或融合蛋白，其缺乏诸如ADCC的效应子功能并且可以使用工业标准蛋白A色谱法容易地纯化。
在本发明的替代实施方案中，对本发明的抗原特异性的本发明的犬IgG-B或IgG-C抗体，和/或双特异性抗体，和/或双特异性结合伴体，和/或融合蛋白有意地不进行修饰来去除/显著减少诸如ADCC的效应子功能，因此保留诸如ADCC的效应子功能。
如本文所用，术语“止痒剂)”与“止痒药剂”可互换使用并且是倾向于抑制、缓解和/或预防瘙痒的化合物、大分子和/或制剂。止痒剂俗称抗痒药(anti-itch drugs)。
如本文所用，术语“抗-瘙痒抗体(anti-pruritic antibody)”与“止痒抗体(antipruritic antibody)”可互换使用，并且是可在动物(包括哺乳动物如人、犬科动物和/或猫科动物)中充当抗瘙痒剂的抗体，特别是关于特应性皮炎。在特定实施方案中，抗瘙痒抗体与IL-31信号传导途径中的特定蛋白结合，例如IL-31或其受体IL-31RA。抗瘙痒抗体与其相应抗原(例如IL-31或IL-31RA)的结合抑制例如IL-31与IL-31RA的结合，并干扰和/或阻止该途径的成功信号传导，从而抑制、缓解和/或预防否则由IL-31信号传导途径引起的瘙痒。
如本文所用，“抗炎剂”是通过阻断体内某些引起炎症的物质的相互作用来减轻炎症的化合物、大分子和/或制剂。
如本文所用，“抗炎抗体”是可以在动物中充当抗炎剂的抗体，所述动物包括例如人、犬科动物和/或猫科动物的哺乳动物，特别是关于特应性皮炎。在特定实施方案中，抗炎抗体结合IL-4/IL-3信号传导途径中的特定蛋白质，例如IL-4或受体IL-4Rα。抗炎抗体与其相应抗原(例如，IL-4或IL-4Rα)的结合抑制了例如IL-4与IL 4Rα的结合，并干扰和/或阻止该途径的信号传导，从而干扰或预防与特应性皮炎相关的慢性炎症。
如本文所用，“抗增殖剂”是抵消诱导上皮细胞增殖的化合物、大分子和/或制剂，特别是诱导角质形成细胞增殖，特别是对于特应性皮炎。白介素22结合蛋白(IL-22BP)是天然存在的抗增殖剂的一个例子。犬IL-22RA2-Fc融合蛋白是用于犬类的人工抗增殖剂的一个例子。犬IL-22RA1-Fc融合蛋白是用于犬类的人工抗增殖剂的另一个例子。
如本文所用，“抗增殖抗体”是可以在动物中充当抗增殖剂的抗体，所述动物包括例如人、犬科动物和/或猫科动物的哺乳动物，特别是对于特应性皮炎。在特定实施方案中，抗增殖抗体结合IL-22信号传导途径中的特定蛋白质，例如IL-22或受体IL-22受体(IL-22R)。抗增殖抗体与其相应抗原(例如，IL-22或IL-22R)的结合抑制了例如IL-22与IL-22R的结合，并干扰和/或阻止该途径的信号传导，从而干扰或阻止与特应性皮炎相关的角质形成细胞增殖。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间在它们最佳比对时的序列相似性。当两个比较序列两者中的一个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中每一个的一个位置被腺嘌呤占据，那么该分子在该位置是同源的。同源性百分比是两个序列共享的同源位置数除以比较的位置总数×100。例如，如果两个序列的10个位置中有6个在序列最佳比对时匹配或同源，则这两个序列是60％同源的。通常，当两个序列比对以获得最大百分比同源性时进行比较。
“分离的核酸分子”是指基因组的DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成来源，或其某些组合，其与自然界中发现分离的多核苷酸的全部或部分多核苷酸不相关，或与天然不与其连接的多核苷酸连接。出于本公开的目的，应当理解“包含(特定核苷酸序列)的核酸分子”不包括完整的染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子除了指定序列外，还可以包括多达十个或甚至多达二十个或更多个其他蛋白或其部分或片段的编码序列，或者可以包括可操作地连接的调控序列，其控制所述核酸序列的编码区的表达，和/或可以包括载体序列。
短语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中，它是“可操作地连接”的。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点定位以便于翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点连接来完成的。如果这些位点不存在，则根据常规实践使用合成的合成寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用并且所有此类名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑传代次数。还可以理解，由于有意或无意的突变，并非所有后代都具有完全相同的DNA含量。包括具有与在最初转化的细胞中筛选的相同功能或生物活性的突变后代。在意指不同的名称的情况下，从上下文中将清楚的看出。
本发明提供本发明的分离的犬源化抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白，抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或其融合蛋白用于治疗病症，例如治疗犬的特应性皮炎的使用方法。在犬科动物中，有四个IgG重链，称为A、B、C和D。这些重链代表了犬IgG的四个不同亚类，称为IgG-A(或IgGA)、IgG-B(或IgGB)、IgG-C(或IgGC)和IgG-D(或IgGD)。两条重链中的每一条都由一个可变结构域(VH)和三个称为CH-1、CH-2和CH-3的恒定结构域组成。CH-1结构域通过称为“铰链”或可选地“铰链区”的氨基酸序列连接到CH-2结构域。
这4条重链的DNA和氨基酸序列首先由Tang等人鉴定[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)]。这些重链的氨基酸和DNA序列也可从GenBank数据库中获得。例如，IgGA重链的氨基酸序列的登录号为AAL35301.1，IgGB的登录号为AAL35302.1，IgGC的登录号为AAL35303.1，和IgGD的登录号为(AAL35304.1)。犬抗体还包含两种类型的轻链，κ或λ。这些轻链的DNA和氨基酸序列可以从GenBank数据库中获得。例如，κ轻链氨基酸序列的登录号为ABY57289.1，和λ轻链的登录号为ABY 55569.1。
结合犬IL-31、IL-31Rα、IL-22或IL-4Rα的犬源化鼠或大鼠抗犬抗体包括但不限于：本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白，其包含犬IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D重链和/或犬κ或λ轻链以及鼠或大鼠抗犬抗原CDR。因此，本发明提供了本发明的分离的犬源化鼠或大鼠抗犬抗体，和/或双特异性抗体，和/或双特异性结合伴体，和/或融合蛋白，其与其相应的犬抗原结合并阻断该犬抗原与其天然结合伴体的结合。
因此，本发明进一步提供了犬源化鼠或大鼠抗体和使用本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白治疗病症的方法，例如，治疗犬的特应性皮炎。
本发明进一步提供了全长犬重链，其可以与相应的轻链匹配以制备犬源化抗体。因此，本发明进一步提供犬源化鼠或大鼠抗犬抗原抗体(包括分离的犬源化鼠或大鼠抗犬抗体)和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体，其包含本发明犬源化抗体和/或融合蛋白，以及本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白在治疗病症中的使用方法，例如治疗犬的特应性皮炎。
本发明还提供本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白，其包含犬片段可结晶区域(cFc区)，其中cFc被遗传修饰以增强、减少或消除一种或多种效应子功能。在本发明的一个方面，遗传修饰的cFc降低或消除了一种或多种效应子功能。在本发明的另一个方面，遗传修饰的cFc增强了一种或多种效应子功能。在某些实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGB Fc区。在另一个这样的实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGC Fc区。在一个具体实施方案中，效应子功能是增强、降低或消除的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在另一个实施方案中，效应子功能是增强、降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在又一个实施方案中，cFc区被遗传修饰以增加、减少或消除ADCC和CDC两者。
为了产生缺乏效应子功能的犬IgG的变体，产生了许多突变的犬IgGB重链。这些变体可以在重链氨基酸序列的Fc部分中包括以下单个或组合的置换中的一个或多个：P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93G和P95A。将变体重链(即，包含此类氨基酸置换)克隆到表达质粒中，并与包含编码轻链的基因的质粒一起转染到HEK 293细胞中。评估从HEK 293细胞表达和纯化的完整抗体与FcγRI和C1q的结合，以评估它们介导免疫效应子功能的潜力。[参见US 10,106,607B2，其内容通过引用整体并入本文。]
本发明还提供修饰的犬IgG-Ds，其代替其天然IgG-D铰链区，它们包含来自以下的铰链区：
IgG-A:FNECRCTDTPPCPVPEP SEQ ID NO:23
IgG-B:PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEM SEQ ID NO:24；或
IgG-C:AKECECKCNCNNCPCPGCGL SEQ ID NO:25.
或者，IgG-D铰链区可以通过用脯氨酸残基替换丝氨酸残基来遗传修饰，即PKESTCKCIPPCPVPES，SEQ ID NO：26(替代天然存在的丝氨酸残基的脯氨酸残基(P)加下划线并为粗体)。此类修饰可导致缺乏Fab臂交换的犬IgG-D。可以使用重组DNA技术的标准方法构建修饰的犬IgG-D[例如，Maniatis等人，Molecular Cloning,ALaboratory Manual(1982)]。为了构建这些变体，可以修饰编码犬IgG-D的氨基酸序列的核酸，以便其编码修饰的IgGD。然后将修饰的核酸序列克隆到表达质粒中用于蛋白质表达。
序列同一性是指当两条序列最佳比对时，两条多肽的氨基酸在等同位置处相同的程度。如本文所用，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列100％“相同”。因此，当两个氨基酸序列的50％的氨基酸残基相同时，氨基酸序列与第二氨基酸序列50％“相同”。序列比较是在给定蛋白(例如，被比较的蛋白或多肽的一部分)所包含的连续氨基酸残基段上进行的。在特定实施方案中，考虑到否则可能改变两个氨基酸序列之间的对应性的选定缺失或插入。
序列相似性包括相同的残基和不相同的、生化相关的氨基酸。具有相似属性的生化相关氨基酸是可互换的。
“保守修饰的变体”或“保守置换”是指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸取代蛋白质中的氨基酸，使得在不改变蛋白质的生物活性的情况下通常可以进行该改变。一般而言，本领域技术人员认识到，多肽非必需区中的单个氨基酸置换不会显著改变生物活性[参见，例如，Watson等人，MolecularBiology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.；1987)]。此外，结构或功能相似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。示例性的保守置换列于紧接下方的表A中。
表A
示例性的保守氨基酸置换
原始残基 保守置换
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys；His
Asn(N) Gln；His
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；His
Met(M) Leu；Ile；Tyr
Phe(F) Tyr；Met；Leu
Pro(P) Ala；Gly
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr；Phe
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
本发明还涵盖本发明抗体的功能保守变体。如本文所用，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基已被改变而不改变所需特性(例如抗原亲和力和/或特异性)的抗体或片段。此类变体包括但不限于用具有相似特性的氨基酸替换氨基酸，例如上表A的保守氨基酸置换。
核酸
本发明还包括编码本发明的抗体和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白的核酸(参见例如以下实施例)。
本发明还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当通过BLAST算法进行比较时，所述免疫球蛋白多肽包含与本文提供的犬源化抗体的氨基酸序列至少约70％相同、优选至少约80％相同、更优选至少约90％相同和最优选至少约95％相同(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，其中选择算法的参数以给出相应序列在相应参考序列的整个长度上的最大匹配。本发明进一步提供了编码免疫球蛋白多肽的核酸，当使用BLAST算法进行比较时，所述免疫球蛋白多肽包含与任何参考氨基酸序列至少约70％相似、优选至少约80％相似、更优选至少约90％相似和最优选至少约95％相似(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，其中选择算法的参数以给出相应序列在相应参考序列的整个长度上的最大匹配，也包括在本发明中。
如本文所用，核苷酸和氨基酸序列同一性百分比可使用C,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC 27519)、Vector NTI(Informax,Inc.MD),Oxford Molecular Group PLC(1996)和具有比对默认参数和用于同一性的默认参数的Clustal W算法确定。这些商业上可用的程序也可用于使用相同或类似的默认参数来确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级Blast搜索，例如，使用默认参数的GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)堆积程序(pileup program)。
以下参考文献与常用于序列分析的BLAST算法有关：BLASTALGORITHMS：Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish,W.等人，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden,T.L.等人，Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul,S.F.等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang,J.等人，Genome Res.7:649-656(1997)；Wootton,J.C.等人,Comput.Chem.17:149-163(1993)；Hancock,J.M.等人,Comput.Appl.Biosci.10:67-70(1994)；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.等人,"A model of evolutionary change in proteins."in Atlas of Protein Sequenceand Structure,vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,(1978)；Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人,"Matrices fordetecting distant relationships."in Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,suppl.3."(1978),M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358(1978),Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,J.Mol.Biol.219:555-565(1991)；States,D.J.等人,Methods 3:66-70(1991)；Henikoff,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919(1992)；Altschul,S.F.等人,J.Mol.Evol.36:290-300(1993)；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)；Karlin,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877(1993)；Dembo,A.等人,Ann.Prob.22:2022-2039(1994)；和Altschul,S.F."Evaluating the statisticalsignificance of multiple distinct local alignments."in Theoretical andComputational Methods in Genome Research(S.Suhai,ed.),pp.1-14,Plenum,New York(1997)。
本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白可以通过本领域已知的方法重组产生。可用作表达本文公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是众所周知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系。尤其，这些细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优先的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或其片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，允许抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中来产生抗体。
可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。此外，可以使用许多已知技术增强从生产细胞系表达本发明的抗体(或其中的其他部分)。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。结合欧洲专利号0 216 846、0256 055和0 323 997以及欧洲专利申请号89303964.4对GS系统进行了整体或部分讨论。
一般而言，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有在细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白特有的糖基化模式。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于产生抗体的特定细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体构成本发明，与抗体可能具有的糖基化模式无关。类似地，在特定实施方案中，具有仅包含非岩藻糖基化的N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为这些抗体已被证明在体外和体内通常比其岩藻糖基化的对应物表现出更强的功效[参见例如，Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775]。
抗体和融合蛋白工程
对于本发明的融合蛋白，重链恒定区，例如犬恒定区，例如IgGA、IgGB、IgGC和IgGD，或其变体与结合IL-22的蛋白接合。这样，结合IL-22的蛋白可以与抗体单体结合或形成双特异性结合伴体。此类抗体或抗原结合片段还包含轻链恒定区，例如犬轻链恒定区，例如λ或κ犬轻链恒定区或其变体。作为示例而非限制，犬重链恒定区可以来自IgG B或修饰的cFc，例如本文使用的IgG-Bm[参见US 10,106,607 B2，在此通过引用整体并入]，并且犬轻链恒定区可以来自κ。
本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体可以被工程化以包括对亲本(即小鼠或大鼠)单克隆抗体可变域内的犬框架和/或犬框架残基的修饰，例如：以改善抗体的特性。
药物组合物和施用
为了制备包含本发明的抗体，和/或双特异性抗体，和/或双特异性结合伴体，和/或融合蛋白的药物或无菌组合物，这些抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。[参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,MackPublishing Company,Easton,PA(1984)]。
治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液的形式混合来制备[参见，例如，Hardman等人(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,New York,NY；Avis等人(eds.)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY]。在一个实施方案中，将本发明的抗体和/或双特异性抗体，和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白在pH 5-6的乙酸钠溶液中稀释至适当浓度，并添加NaCl或蔗糖以获得张力。可以添加额外的试剂，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，以增强稳定性。
单独或与另一种药剂联合施用，抗体组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定，例如，用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数(LD50/ED50)。在特定方面，表现出高治疗指数的抗体是需要的。从这些细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定用于犬科动物的剂量范围。此类化合物的剂量优选地位于包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50在内的循环浓度的范围内。剂量可以在这个范围内变化，取决于所使用的剂型和施用途径。
施用方式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、肠、肠胃外；肌肉内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。在具体的实施方案中，本发明的抗体和/或双特异性抗体，和/或双特异性结合伴体，和/或融合蛋白可以通过侵入性途径例如通过注射施用。在本发明的进一步实施方案中，本发明的抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白或其药物组合物静脉内、皮下、肌内、动脉内或通过吸入、气溶胶递送施用。通过非侵入性途径(例如，口服；例如，在丸剂、胶囊或片剂中)施用也在本发明的范围内。
组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，本发明的药物组合物可以通过用皮下注射针(包括例如预填充注射器或自动注射器)注射来施用。本文公开的药物组合物也可以用无针皮下注射装置施用；例如美国专利号：6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。
本文公开的药物组合物也可以通过输注施用。众所周知的施用药物组合物的植入物和模块的示例包括：美国专利第4,487,603号，其公开了一种用于以受控的速度分配药物的可植入的微型输注泵；美国专利第4,447,233号，其公开了一种用于以精确的输液速度递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开了一种用于连续药物递送的可变流量植入式输注装置；美国专利第4,439,196号，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统。许多其他这样的植入物、递送系统和模块对于本领域技术人员来说是众所周知的。
或者，可以局部而非全身方式施用本发明的抗体，和/或双特异性抗体，和/或双特异性结合伴体，和/或融合蛋白，通常以贮库或持续释放制剂的形式。
施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体，和/或双特异性抗体，和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白的血清或组织周转率，症状水平，治疗性抗体和/或双特异性抗体和/或双特异性结合伴体和/或融合蛋白的免疫原性以及靶细胞在生物基质中的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体，和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白以改善目标疾病/病症状态，同时最小化不良副作用。因此，递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体、和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白以及所治疗病症的严重性。提供选择治疗性抗体适当剂量的指导[参见，例如,Wawrzynczak Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；Kresina(ed.)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,NewYork,NY(1991)；Bach(ed.)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy inAutoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY(1993)；Baert等人NewEngl.J.Med.348:601-608(2003)；Milgrom等人New Engl.J.Med.341:1966-1973(1999)；Slamon等人New Engl.J.Med.344:783-792(2001)；Beniaminovitz等人NewEngl.J.Med.342:613-619(2000)；Ghosh等人New Engl.J.Med.348:24-32(2003)；Lipsky等人New Engl.J.Med.343:1594-1602(2000)]。
确定合适的剂量由兽医进行，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，剂量从比最佳剂量稍低的量开始，然后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用实现所需或最佳效果。重要的诊断量度包括那些症状的量度。
本文提供的抗体、和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白可以通过连续输注或通过例如每天、每周1-7次、每周、每两周、每月、双月、每季度、每半年、每年等施用的剂量来提供。可以通过例如，静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、直肠、肌肉内、脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。总每周剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多[参见，例如，Yang等人New Engl.J.Med.349:427-434(2003)；Herold等人New Engl.J.Med.346:1692-1698(2002)；Liu等人J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456(1999)；Portielji等人CancerImmunol.Immunother.52:133-144(2003)]。还可以提供剂量以在犬的血清中实现本发明的抗体、和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更多。在其他实施方案中，本发明的抗体和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白抗体以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者每周、每两周、“每4周”、每月、每两个月或每季度皮下或静脉内施用。
如本文所用，“抑制”或“治疗”或“处理”包括延迟与病症相关的症状的发生和/或降低此类病症的症状的严重性。该术语还包括改善现有的不受控制的或不需要的症状、预防额外的症状以及改善或预防这些症状的基础原因。这些术语还包括改善现有的不受控制的或不需要的症状、预防额外的症状以及改善或预防这些症状的基础原因。因此，这些术语表示对患有疾病、病状和/或症状或具有发生此类疾病、疾病或症状的可能的脊椎动物受试者(例如，犬科动物)产生了有益的结果。
如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指当单独或与另外的治疗剂组合施用细胞、组织或受试者(例如犬科动物)时有效地引起疾病或病症的一种或多种症状或此类疾病或病症的进展的可测量的改善的本发明的抗体、和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白的量。治疗有效剂量进一步指足以导致至少部分症状改善，例如治疗、治愈、预防或改善相关医疗状况，或增加此类病症的治疗、治愈、预防或改善率的抗体、和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白的量。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是联合、连续还是同时施用。有效量的治疗剂将产生诊断量度或参数的改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。在使用主观指标来评估病情严重程度的情况下，有效量也可以产生主观指标的改善。
其他联合疗法
包含本发明的抗体、和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白的组合物可以包含一种或多种额外的治疗性组分。一个这样的治疗性组分家族是Janus激酶(JAK)抑制剂。在这种类型的具体实施方案中，JAK抑制剂包含以下化学式：
Figure BDA0003695308960000341
其中R1是任选被羟基取代的C1-4烷基及其药学上可接受的盐[US 8,133,899；US8,987,283]。更具体地，JAK抑制剂是奥拉替尼(oclacitinib)，甚至更具体地是马来酸奥拉替尼。可选的JAK抑制剂，其相对于JAK3优先抑制JAK1，是：1-[(3R,4S)-4-氰基四氢吡喃-3-基]-3-[(2-氟-6-甲氧基-4-吡啶基)氨基]吡唑-4-甲酰胺，它包含以下化学式：
Figure BDA0003695308960000342
及其药学上可接受的盐[参见，WO 2018/108969]。
可以添加到本发明组合物中的另一种治疗性组分可以是脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂。一种这样的SYK抑制剂是(1S,4R)-4-羟基-2,2-二甲基-4-{5-[3-甲基-5-(4-甲基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-1,3-噻唑-2-基}-环己烷羧酸或其药学上可接受的盐[参见例如US8,759,366]。
此外，可以添加到本发明的组合物中的又一种治疗性组分是在TH2细胞上表达的化学引诱剂受体同源分子的拮抗剂，其包含以下化学式：
Figure BDA0003695308960000343
及其药学上可接受的盐[也参见，US 7,696,222、US 8,546,422、US 8,637,541、WO2010/099039；WO 2010/031183；和US 8,546,422]。
这些额外的治疗性组分可以在施用包含本发明的抗体、和/或双特异性抗体、和/或双特异性结合伴体、和/或融合蛋白的组合物之前、与其结合或之后施用于犬科动物受试者。
实施例
一般材料和方法：
在以下所有实施例中，重组蛋白是通过将选定蛋白质的氨基酸序列提供给商业制造商(ATUM，Newark，California)而获得的，后者又选择了编码该氨基酸序列的适当核苷酸序列。核苷酸序列也可以从公共可用的DNA数据库中获得，例如
Figure BDA0003695308960000351
然后，商业制造商化学合成核酸，其然后由ATUM克隆到表达质粒(pD2610-v10；可从AUTM获得)中，以产生相应的重组蛋白。将质粒置于HEK-293细胞或CHO细胞中以表达重组蛋白，其然后通过常规方法分离。
实施例1
犬IL-22和IL-22的结合蛋白
通过化学合成将编码犬IL-22RA1的细胞外结构域(ECD)的核酸与编码犬IgG-B Fc的核酸连接以形成编码犬IL-22RA1-Fc融合蛋白的核酸。类似地，通过化学合成将编码犬IL-22结合蛋白(cIL-22BP；也称为cIL-22受体α2和cIL-22RA2)的核酸与编码犬IgG-B Fc的核酸连接以形成编码犬IL-22BP-Fc融合蛋白的核酸。然后将这些核酸单独克隆到适合在真核细胞如HEK-293或CHO细胞中产生相应蛋白的表达质粒中。犬IL-22RA1-Fc融合蛋白和犬IL-22BP-Fc融合蛋白均结合犬IL-22并随后阻断犬IL-22与全长膜结合犬IL-22RA1的结合。
犬IL-22RA1和犬IL-22BP(IL-RA2)与犬IL-22的结合
材料：
1.包被抗原：cIL-22-His(带有His标签的犬IL 22)
2.cIL-22BP-Fc融合蛋白(犬IL-22BP-Fc融合蛋白)
3.cIL 22RA1-Fc融合蛋白(犬IL 22RA1-Fc融合蛋白)
4.cPD-L1-Fc，6.8mg/mL。(犬PD-L1-IgG-B Fc融合蛋白，用作对照)。
5.辣根过氧化物酶(HRP)偶联兔抗狗IgG(Fc)，Sigma目录号SAB3700109，1.5mg/mL。
6. 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物，SeraCare KPL5120-0048，
7.过氧化物酶底物溶液B，SeraCare KPL 5120-0037
8.磷酸盐缓冲盐水(PBS)
9.磷酸盐缓冲盐水与
Figure BDA0003695308960000361
(PBST)，国家兽医服务实验室(NationalVeterinary Services Laboratories,NVSL)
10. 1.5M磷酸。
方法：
1.在PBS中将cIL-22-His稀释至1μg/mL，然后添加100μL/孔至ELISA板。在2-7℃下孵育过夜。
2.使用自动机洗涤机用NVSL-PBST清洗包被的板3次，200μL/孔/洗涤。
3.用200μL NVSL-PBST中的5％脱脂奶粉(NFDM)封闭ELISA板，密封并在37℃下孵育至少60分钟。
4.使用自动板洗涤机用NVSL-PBST将封闭的ELISA板洗涤3次，200μL/孔/洗涤。
5.将cIL-22BP-Fc融合蛋白、cIL-22RA1-Fc融合蛋白和cPD-L1-Fc融合蛋白稀释至10μg/mL，并在稀释板上连续3倍稀释。将50μL稀释的测试样品转移到ELISA板中，密封并在37℃下旋转孵育60分钟。
6.使用自动板洗涤机用NVSL-PBST洗涤板3次，200μL/孔/洗涤。
7.加入100μl/孔1:2500稀释的HRP偶联抗狗IgG(Fc)，密封并在37℃下孵育60分钟。
8.混合等量的TMB过氧化物酶底物和TMB过氧化物酶底物溶液B，加入100μl/孔。在37℃下孵育20分钟。
9.用100μl/孔1.5M磷酸终止。
10.在分光光度计上测量A450-A540。
cIL-22-HIS:[SEQ ID NO:1]
LPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVNMGERCYLMKEVLNFTLEEVLLPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNKLSQCHIENDDQHIQRNVQKLKDTVQKLGENGEIKAIGELDLLFMALRNACVHHHHHH
cIL-22RA1-FcB:[SEQ ID NO:2]
AEDTSDLLQYVKFQSSNFENILTWDSGLESAPDVVYSVEYKTYGKKEWLAKEGCQRITRKSCNLTTETGNHTEHYYARVTAVSAGGRSATKMTDRFSSMQQTTIKPPDVTCIPKVRSIQMIVHPTSTPIHAEDGHRLTLEDIFQDLFYRLELQVNHTYQMHLGGKQRDYEFIGLSPDTEFLGTITISVPNFFKESAPYVCRVKTLPDRTWTGGGGSGGGGSPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG
cIL-22RA2-FcB:[SEQ ID NO:3]
TQSAYESLKPQRVHFQSRNFHNILHWQPGRACTSNGSVYFVQYKMYGQRQWKNKEDCWGILECFCDLTNETSDIQEPYYGRVRTTSAGIHSGWTMTQRFTPWWETKIDPPIINITQVNGSLLVILHAPSLPYRDQKGKNVSIENYYELLYRVFIINNSLEKEQKVYEGAHRIVEIGALAPHTGYCVVAEMYQPMLDRRSPRSEERCMELPGGGGSGGGGSPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG
实施例2
抗IL-4受体α抗体
可用于本发明的抗犬IL-4受体α抗体通过抗体c152H11VL3-cCLk-s/c152H11VH3-cIgG Bm和抗体c146E2VL3-cCLk-s/c146E2VH3-cIgG Bm例示。这两种抗体的六(6)个CDR的组(三个单独的轻链(LC)和三个重链(HC)序列)在下表1A(核酸序列)和表1B(氨基酸序列)中提供。这些犬源化抗体的全长LC和HC的氨基酸序列在下表1A和1B中提供。
IL-4Rα抗体CDR
核酸和氨基酸序列
表1A
Figure BDA0003695308960000381
表1B
Figure BDA0003695308960000382
c152H11VL3-cCLk-s(轻链):[SEQ ID NO:4]
EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGQAPKLLIYSASYRYSGLPDRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAEFFCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
c152H11VH3-cIgG-Bm(重链):[SEQ ID NO:5]
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPDKRLQWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCARGTLNNRGFASWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG
c146E2VL3-cCLk-s(轻链):[SEQ ID NO:6]
DIVLTQTPLSLSVSPGETASIYCRASESVDSYGNSFLNWYQQKPGQPPKLLIYRASNLASEIPDRFSGSGSRTEFTLKISRVEADDAGVYYCQQNYENPRTFGQGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
c146E2VH3-cIgG-Bm(重链):[SEQ ID NO:7]
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFARYWMHWMKQAPGAGLDWIGMIHPDSGNINYNERFKTKATLTVDKSTSTAYMELSSLRAGDIAVYYCARQLRNAMDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG
如下测试了针对犬IL-4受体α的抗体抑制DH82细胞中STA-6磷酸化的能力：
材料
1.活跃生长的DH82细胞
2.DH82细胞生长培养基(
Figure BDA0003695308960000391
302003TM，Eagle's Minimum EssentialMedium，提供热灭活胎牛血清至最终浓度为15％w/v)
3.AlphaLISA p-STAT6(Tyr641)检测试剂盒：Perkin Elmer目录号:ALSU-PST6-A-HV
4.重组犬IL-4：R&D Systems，目录号:752-CL/CF
5.重组犬IL-13：R&D Systems，目录号:5894-CL/CF
6.Perkin Elmer Envision
a.犬源化抗犬IL-4Rα单克隆抗体
b.c146E2-H3L3
c.c152H11-H3L3
d.c4H3
方法
1.两个组织培养板接种每孔8x104个DH82细胞(200μL，密度为4x105细胞/mL)，并在37℃下孵育过夜。
2.将测试抗体预稀释至500μg/mL，然后在DH82细胞生长培养基(Cell GrowthMedia)中连续3倍稀释。从细胞培养板中除去培养基，将50μL/孔的连续稀释的测试样品转移到每个板中。
3.将犬IL-4在DH82细胞生长培养基中稀释至5ng/mL，并将50μL加入到一个板的每个孔中。将犬IL-13在DH82细胞生长培养基中稀释至10ng/mL，并将50μL添加到第二个板的每个孔中。将板在37℃下孵育15分钟。
4.从板中取出培养基，向板中加入每孔100μL来自AlphaLISA p-STAT-6检测试剂盒的新鲜制备的1x裂解缓冲液。板在室温下在板振荡器上以350rpm搅拌10分钟。
5.Acceptor Mix由AlphaLISA p-STAT6检测试剂盒制备，且每孔15μL添加到96孔1/2Area Plates中的30μL细胞裂解物中。将板密封，以350rpm搅拌2分钟，然后在室温下孵育2小时。
6.Donor Mix由AlphaLISA p-STAT6检测试剂盒在柔和的实验室照明下制备，且每个板中加入每孔15μL。将板密封，用箔覆盖，以350rpm搅拌2分钟，然后在室温下孵育2小时。
7.在Perkin Elmer EnVison上使用AlphaScreen设置读板。
实施例3
IL-31受体α
核苷酸序列
SEQ ID NO：8的核苷酸序列编码与HIS标签融合的犬IL-31受体α(IL-31RA)的细胞外结构域。犬IL-31RA ECD HIS-标记蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。核苷酸序列通过化学合成制备，然后克隆到适合在真核细胞如HEK-293或CHO细胞中产生相应蛋白质的表达质粒中。
犬IL-31RA ECD-10His：[SEQ ID NO：8]
gtgctgcccgccaagcccgagaacatcagctgcatcttctactacgaggagaacttcacctgcacctggagccccgagaaggaggccagctacacctggtacaaggtgaagagaacctacagctacggctacaagagcgacatctgcagcaccgacaacagcaccagaggcaaccacgccagctgcagcttcctgccccccaccatcaccaaccccgacaactacaccatccaggtggaggcccagaacgccgacggcatcatgaagagcgacatcacctactggaacctggacgccatcatgaagatcgagccccccgagatcttcagcgtgaagagcgtgctgggcatcaagagaatgctgcagatcaagtggatcagacccgtgctggccccccacagcagcaccctgaagtacaccctgagattcagaaccatcaacagcgcctactggatggaggtgaacttcaccaaggaggacatcgacagagacgagacctacaacctgaccgagctgcaggccttcaccgagtacgtgatgaccctgagatgcgcccccgccgagagcatgttctggagcggctggagccaggagaaggtgggcaccaccgaggaggaggccccctacggcctggacctgtggagagtgctgaagcccgccatggtggacggcagaagacccgtgcagctgatgtggaagaaggccaccggcgcccccgtgctggagaaggccctgggctacaacatctggtacttccccgagaacaacaccaacctgaccgagaccgtgaacaccaccaaccagacccacgagctgtacctgggcggcaagacctactgggtgtacgtggtgagctacaacagcctgggcgagagccccgtggccaccctgagaatccccgccctgaacgagaagaccttccagtgcatcgaggccatgcaggcctgcctgacccaggaccagctggtggtggagtggcagagcagcgcccccgaggtggacacctggatggtggagtggttccccgacgtggacagcgagcccagcagcttcagctgggagagcgtgagccaggccagaaactggaccatccagaaggacgagctgaagcccctgtggtgctacaacatcagcgtgtaccccgtgctgagagacagagtgggccagccctacagcacccaggcctacgtgcaggagggcatccccagcgccggccccgtgacccaggccgacagcatcggcgtgaagaccgtgaccatcacctggaaggagatccccaagagcaagagaaacggcttcatcaagaactacaccatcttctaccaggccgaggacggcaaggagttcagcaagaccgtgaacagcaacatcctgcagtacagactggagagcctgaccagaagaaccagctacagcctgcaggtgatggccagcaccaacgccggcggcaccaacggcaccaagatcaacttcaagaccctgagcatcagccaccaccaccaccaccaccaccaccaccac
IL-31受体αECD的表达和纯化
根据制造商的建议，通过MaxCyte仪器使用电穿孔将包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列的质粒转染到HEK-293或CHO细胞中。转染后几天，收获转染细胞和未转染对照的上清液并离心以去除细胞碎片。根据制造商的建议，使从转染细胞中的澄清收获液体通过镍柱，从细胞培养液中纯化带有组氨酸标签的IL-31RA。通过测量它们在280nm下的紫外光的吸光度来定量纯化的蛋白质。
犬IL-31RA ECD-10His：[SEQ ID NO：9]
VLPAKPENISCIFYYEENFTCTWSPEKEASYTWYKVKRTYSYGYKSDICSTDNSTRGNHASCSFLPPTITNPDNYTIQVEAQNADGIMKSDITYWNLDAIMKIEPPEIFSVKSVLGIKRMLQIKWIRPVLAPHSSTLKYTLRFRTINSAYWMEVNFTKEDIDRDETYNLTELQAFTEYVMTLRCAPAESMFWSGWSQEKVGTTEEEAPYGLDLWRVLKPAMVDGRRPVQLMWKKATGAPVLEKALGYNIWYFPENNTNLTETVNTTNQTHELYLGGKTYWVYVVSYNSLGESPVATLRIPALNEKTFQCIEAMQACLTQDQLVVEWQSSAPEVDTWMVEWFPDVDSEPSSFSWESVSQARNWTIQKDELKPLWCYNISVYPVLRDRVGQPYSTQAYVQEGIPSAGPVTQADSIGVKTVTITWKEIPKSKRNGFIKNYTIFYQAEDGKEFSKTVNSNILQYRLESLTRRTSYSLQVMASTNAGGTNGTKINFKTLSISHHHHHHHHHH
犬IL-31RA与生物素化犬IL-31的结合：
1.通过在PBS中稀释至10μg/mL，用IL-31RA蛋白包被免疫板。添加100μL/孔。将板在2-7℃下孵育过夜。
2.用275μL/孔的PBST洗涤板3次。
3.用200μL/孔的封闭缓冲液(PBST中1％奶粉)在36±2℃下封闭板30-45分钟，同时轻轻摇动(120±20RPM)。
4.用275μL/孔的PBST洗涤板3次。
5.在PBST中的1％NFDM中将生物素化的IL-31稀释至10ug/mL。
6.在PBST中的1％NFDM中3倍稀释生物素化的IL-31(10μg/mL)，并转移100μL/孔到免疫板中。在36±2℃下孵育30-45分钟，同时轻轻摇动(120±20RPM)。
7.用275μL/孔的PBST洗涤板3次。
8.在PBST中的1％NFDM中将HRP-链霉亲和素稀释至1:1000的最终稀释度。
9.向免疫板中加入100μL/孔的HRP-链霉亲和素，在36±2℃下孵育30-45分钟，同时轻轻摇动(120±20RPM)。
10.用275μL/孔的PBST洗涤板3次。
11.使用前即时混合等量的预热TMB 2-组分底物。
12.将100μL/孔制备的TMB底物添加到免疫板中，在36±2℃下在黑暗中孵育10至15分钟，同时轻轻摇动(120±20RPM)。
13.通过加入100μL/孔的1M H3PO4终止反应。
14.使用酶标仪在450nm波长下读板，参考波长为540nm。
针对犬IL-31受体α的单克隆抗体
针对犬IL-31RA的单克隆抗体是通过在3至4周的时间内用犬IL-31RA ECD(每次使用10μg或25μg抗原/大鼠)对2只Lewis大鼠进行多次免疫而产生的。免疫后，从每只大鼠收集血清并通过ELISA针对犬IL-31RA进行测试。将具有最高IL-31RA ECD反应性的大鼠淋巴结细胞与骨髓瘤SP2/0细胞系融合以产生杂交瘤。融合后大约10天，使用下述方案通过ELISA在IL-31RA ECD蛋白包被的板上筛选来自生长杂交瘤的上清液。在该ELISA中选择了大约263个克隆，它们显示出与IL-31RA的潜在结合，其中大多数克隆的OD>1。
ELISA的程序：
1.用IL-31RA(在PBS缓冲液中1μg/mL)包被96孔半面积板，25μL/孔。将板在4℃下孵育过夜。
2.用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗涤板3次
3.用封闭缓冲液(含5％FBS的PBS)封闭板，25ul/孔，室温下30分钟。
4.将25ul/孔杂交瘤上清液转移到96孔板中，室温下孵育60分钟。
5.用PBST洗涤板3次。
6.将25ul/孔的抗大鼠HRP(封闭缓冲液中1:4000稀释)加入板中，并在室温下孵育60分钟。
7.用PBST洗涤板5次。
8.将基于TMB的试剂加入板中进行比色反应2-3分钟。
9.用0.16M硫酸终止反应。
10.用读板仪读板。
阻断抗IL-31受体α抗体的活性
在下文描述的阻断ELISA中评估了抗犬IL-31RA杂交瘤上清液阻断IL-31与IL-31RA结合的能力。在显示与IL-31RA结合的263个克隆中，大约24个克隆显示潜在阻断IL-31与IL-31RA结合。
1.用IL-31RA(1μg/mL在PBS缓冲液中)包被96孔半面积板，25μL/孔。将板在4℃下孵育过夜。
2.用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗涤板3次
3.用封闭缓冲液(含5％FBS的PBS)封闭板，25ul/孔，室温下30分钟。
4.将25ul/孔杂交瘤上清液转移到96孔板中，室温下孵育60分钟。
5.用PBST洗涤板3次。
6.转移25μL/孔的生物素化IL-31(在封闭缓冲液中0.5μg/mL)，室温下孵育60分钟。
7.用PBST洗涤板3次。
8.将25μl/孔的链霉亲和素-HRP(封闭缓冲液中1:5000稀释)加入板中，室温下孵育60分钟。
·用PBST洗涤板五(5)次。
·向板中加入TMB基试剂进行比色反应2-3分钟。
·用0.16M硫酸终止反应。
·通过读板仪读板。
抗IL-31RA抗体的生物学活性：
使用全长犬IL-31RA链和全长犬制瘤素M受体(OSMR)链的核苷酸序列转染的Baf3细胞系评估抗IL-31RA抗体抑制STAT-3激活的能力。该细胞系也用荧光素酶报告基因转染。这些受体的核苷酸序列通过化学合成制备，然后克隆到适合在baf3细胞中表达相应蛋白质的表达质粒中。
抗IL-31RA抗体的生物学活性：Baf3细胞中的Stat-3抑制
如下评估在Baf3细胞中，抗IL-31受体α抗体抑制STAT-3激活的能力：
1.制备活细胞密度为5x105细胞/mL的细胞悬液，并在96孔组织培养板的每个孔中加入200μL(1x105细胞/孔)。在湿润的37℃培养箱中孵育板22-24小时。
2.从板中移除培养基，将200μL Eagle's Minimum Essential Media(EMEM)添加到细胞板的每个孔中。将板放回37℃培养箱中2小时。
3.从细胞板移除培养基，加入50μL/孔来自在PBS中生长的抗IL-31RA杂交瘤的上清液。将板在37℃下孵育1小时。加入50μL/孔在PBS中稀释的80ng/mL cIL-31，并在37℃下孵育板5分钟。
4.从板中移除培养基，向所有孔中加入100μL/孔的新鲜制备的1x裂解缓冲液。在室温下以350rpm的转速在板振荡器上摇动板10分钟。
此时，细胞裂解液可以在-20℃下冷冻保存。
5.pSTAT-3AlphaLISA：
-根据试剂盒说明书从
Figure BDA0003695308960000451
UltraTMp-STAT3检测试剂盒制备试剂。
-将30μL细胞裂解液转移到96孔半面积板上，并将15μL/孔Acceptor Mix添加到细胞裂解液中。密封板并在室温下孵育1小时。
-将15μL/孔的Donor Mix添加到细胞板中。密封板，用箔覆盖并在室温下孵育一小时或过夜。注意–donor mix是光敏感的。
-在Perkin Elmer EnVison上使用Alpha Screen Assay设置读取板。
实施例4
对犬IL-31的抗体
可用于本发明的抗体是US 9,206,253B2和US 10,150,810B2中描述的那些。优选地，这些抗体具有以下轻链和重链序列：
来自小鼠抗体克隆M14和犬IgG-B的犬重链序列：
[SEQ ID NO:10]
EVQLVESGPSLVKPGGSLRLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGITDYNPSLKSRITISRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
来自小鼠抗体克隆M14和犬轻链恒定区的犬源化轻链序列：[SEQ ID NO:11]
DIVMTQSPASLSVSLGQRATISCRASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGSGTDFTLTIDPVQADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
Zoe-LC:犬源化轻链序列：[SEQ ID NO:12]
EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASNLEAGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSEC
Zoe-HC:犬源化重链序列：[SEQ ID NO:13]
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG
实施例5
IL-31RA的犬源化抗体
IL-31受体αC10A12VH1-CIGGBM[SEQ ID NO:51]
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYYMAWVRQAPGKGLQWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAKHGTLYFDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
IL-31受体αC10A12VL5-CCL[SEQ ID NO:52]
QPVLTQPPSLSASLGTTARLTCERSSGDIGDSYVSWYQQKPGSPPRDLLYVDDQRPSGVSKSFSGSKDTSANAGLLLISGLQPEDEADYYCQSYDSNIDGPVFGGGTHLTVLGQPKASPSVTLFPPSSEELGANKATLVCLISDFYPSGVTVAWKADGSPVTQGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPDKWKSHSSFSCLVTHEGSTVEKKVAPAECS
实施例6
双特异性结合伴体和双特异性抗体
本发明的双特异性结合伴体是由单克隆抗体的一条重链(HC)和一条轻链(LC)与由融合另一个蛋白部分的IgG Fc(例如，IgG-B)组成的融合蛋白结合而形成的人工蛋白质分子。可以通过在抗IL-31的轻链或重链中以及融合蛋白的Fc部分中引入特定突变来构建包含犬IL-22RA1-Fc融合蛋白或犬IL-22RA2-Fc融合蛋白和抗犬IL-31抗体的双特异性结合伴体，以便相对于同型二聚体有利于异二聚体的形成。这意味着例如迫使犬IL-31抗体的重链与犬IL-22RA1-Fc融合蛋白的Fc配对，而不是与犬IL-31抗体的第二重链配对。
IL-31抗体/IL-22RA1 Fc融合蛋白双特异性结合伴体或IL-31抗体/IL-22RA2-Fc融合蛋白双特异性结合伴体的示例由代表三(3)个氨基酸序列的蛋白质的结合给出：(i)犬源化M14的轻链、犬源化M14的重链和犬IL-22RA1-Fc融合蛋白或者(ii)犬源化M14的轻链、犬源化M14的重链和犬IL-22RA2-Fc融合蛋白。另一个示例由代表三(3)个氨基酸序列的蛋白质的结合给出：(a)Zoe-LC的轻链、Zoe-HC的重链和犬IL-22RA1-Fc融合蛋白或者(b)Zoe-LC的轻链、Zoe-HC的重链和犬IL-22RA2-Fc融合蛋白。
双特异性抗体是可以同时靶向两种不同抗原的人工蛋白分子。一种优选类型的双特异性抗体是由四个不同多肽链组成的IgG样抗体。本发明的双特异性抗体的示例包括可以同时靶向IL-31RA和IL-4Rα的抗体分子。此类抗体是通过具有对IL-4Rα的特异性的一条HC和一条LC链与具有对IL-31RA的特异性的一条HC和一条LC的结合而形成的。每条重链和轻链用其氨基酸序列的特定置换/突变进行修饰，以有利于IL-4Rα抗体的HC和LC与IL-31RA抗体的HC和LC彼此的结合，且同时有利于来自IL-4Rα抗体的HC和IL-31RA抗体的HC的结合，而不是每个HC与其自身的结合。抗体HC中有利于形成HC异二聚体的氨基酸置换的列表列于上面的表2A中。
犬IgG-B Fc最早由Tang等人定义[Vet Immunology&Immunopathology,80:259-270(2001)]，如包含以下列出的SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
Figure BDA0003695308960000481
犬IgG-Bm与天然存在的犬IgG-B的不同之处在于在IgG B的SEQ ID NO:14的氨基酸序列中包含两(2)个氨基酸残基置换D31A和N63A，即，SEQ ID NO：14的31位的天冬氨酸残基(D)和63位的天冬酰胺残基(N)，被丙氨酸残基(A)置换。这些残基在氨基酸序列中的位置以粗体表示并带有下划线。这两个氨基酸残基置换用于显著降低天然存在的犬IgG-B的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)[参见US 10,106,607 B2，其内容通过引用整体并入本文]。
此外，犬IL-31抗体的Fc或犬IL-22RA1-Fc融合蛋白或犬IL-22RA2-Fc融合蛋白的Fc部分中特定氨基酸置换的潜在方式或组合可用于促进异二聚体形成，在下面的表2A中提供。这些置换有利于重链异二聚化的杵-臼方式，或有利于不同重链之间的静电吸引而也允许异二聚化[对于这些氨基酸置换的深入讨论参见Moore等人,Methods,154:38-50(2019)和Brinkmann&Kontermann,MABS,9:182-212(2017)]。在下表2A中列出的氨基酸置换的情况中，在一些实施方案中，链1是指犬IL-31重链(HC)和链2是指犬IL-22RA1-Fc融合蛋白或犬IL-22RA2-Fc融合蛋白。在其他实施方案中，链1是指犬IL-22RA1-Fc融合蛋白或犬IL-22RA2-Fc融合蛋白，且链2是指犬IL-31重链(HC)。此外，在一些实施方案中，链1指抗IL-31RA重链(HC)和链2指抗IL-4RαHC。在其他实施方案中，链1是指抗IL-4RαHC，链2是指抗IL-31RA HC。在又一些实施方案中，链1是指IL-22HC和链2是指抗IL-31HC。在其他实施方案中，链1是指抗IL-31HC并且链2是指IL-22HC。
此外，在结构域交换(domain swab)中，可变轻链(VL)结构域可以与可变重链(VH)结构域交换，即抗体的fab片段内各种结构域之一与另一个结构域的交换。作为用于包含在双特异性抗体中的候选者的轻链(例如上面列出的那些)可以通过将它们掺入例如抗体结构域排列中来使其适合此目的，该排列将轻链恒定(CL)结构域的位置与抗体对之一中CH1结构域的位置交换，从而产生VL-CH1和VH-CL1，同时使双特异性的另一抗体对中的轻链保持不变。其他选项也是可能的，例如CL-VL结构域与CH1-VH结构域的交换或抗体对之一中VL和VH结构域的交换。表2B提供了以下示例：(i)VH-CL结构域的接合处的氨基酸序列和(ii)在这种结构域交换之后的VL-CH1结构域的接合处的氨基酸序列。在另一种情况下，可以交换整个fab片段，使得将VH-CH1结构域交换为VL-CL结构域。
因此，为了最佳地提供IgG样双特异性抗体，可以进行两种类型的修饰：a)修饰抗体的Fc以有利于重链的异二聚化而不是同型二聚化，和b)修饰轻链以有利于两条轻链各自与其同源重链的结合。表2中描述的氨基酸置换可用于链1和链2的情况中以修饰Fc。为了使轻链适合包含在双特异性抗体中，可以采用称为cross-mab的方法[Klein等人,Methods:154:21-23(2019)；Klein等人,MABS,8:1010-1020(2016)；和Schaefer等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.108:11187-11192(2011)]。使用cross-mab技术，作为用于包含在双特异性抗体中的候选者的轻链(例如本发明的轻链)可以通过将它们并入例如抗体结构域排列中来使其适合此目的，该排列将轻链恒定(CL)结构域的位置与抗体对之一中CH1结构域的位置交换，同时使双特异性的另一抗体对中的轻链保持不变。其他选项也是可能的，例如CL-VL结构域与CH1-VH结构域的交换或抗体对之一中的VL和VH结构域的交换，如上所述。
表2A
犬IGG-B FC(SEQ ID NO:14)的氨基酸替代
编号 链1 链2
1 T132W T132S/L134A/Y175V
2 T132W/S120C T132S/L134A/Y175V/Y115C
3 K177D/R160D D167K/E122K
4 S130H/F173A Y115T/T162F
5 F173L K177R
6 T132L/R160L/T162W L117Y/F173A/Y175V
7 K126E/K177W S113R/D167V/F173T
8 K126E/K177W/Y115C S113R/D167V/F173T/S120C
9 K136E/K177W E123N/D167V/F173T
10 K126D/D167M/Y175A Q111R/S113R/T132V/K177V
11 Y115S/K136Y/T132M/K177V E122G/E123D/S130Q/Y175A
12 L117D/L134E L117K/T132K
13 L134D/K136S E122Q/S130K
表2B
κ和λ交叉序列
CL与CH1的结构域交换
Figure BDA0003695308960000501
Figure BDA0003695308960000511
VH或VL可变区的FW4(FR4)，字体略微放大；可能包含一对添加的氨基酸(用粗体)的一段“弯头(elbow)”序列；整个“弯头”序列带有下划线；CH1或CL区的N端用斜体表示[参见，Klein等人，MABS8:1010-1020(2016)和Schaefer,等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.,108:11187–11192(2011)]。
犬源化M14的LC氨基酸:[SEQ ID NO:11]
DIVMTQSPASLSVSLGQRATISCRASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGSGTDFTLTIDPVQADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
犬源化M14的HC氨基酸:[SEQ ID NO:15]该氨基酸序列与SEQ IDNO:10相同，但粗体和下划线的氨基酸除外：
Figure BDA0003695308960000512
具有氨基酸置换以促进异二聚化的cIL-22RA1-FcB:[SEQ ID NO:16]
Figure BDA0003695308960000513
带有突变以促进异二聚化的cIL-22RA2-FcB:[SEQ ID NO:17]
Figure BDA0003695308960000514
Zoe-HC:犬源化重链序列:[SEQ ID NO:18]
Figure BDA0003695308960000521
修饰IL-4Rα抗体的重链用于双特异性抗体的形成的的示例。
IL-4受体αc152H11VL3-cCLk-s(轻链):[SEQ ID NO:19]
EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGQAPKLLIYSASYRYSGLPDRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAEFFCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
修饰的IL-4受体αc152H11VH3-cIgG-Bm(重链):[SEQ ID NO:20]
Figure BDA0003695308960000522
IL-4受体αc146E2VL3-cCLk-s(轻链):[SEQ ID NO:21]
DIVLTQTPLSLSVSPGETASIYCRASESVDSYGNSFLNWYQQKPGQPPKLLIYRASNLASEIPDRFSGSGSRTEFTLKISRVEADDAGVYYCQQNYENPRTFGQGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
修饰的IL-4受体αc146E2VH3-cIgG-Bm:(重链):[SEQ ID NO:22]
Figure BDA0003695308960000523
修饰的IL-31受体α犬源化重链10A12VH1-CIGGBM[SEQ ID NO:53]
Figure BDA0003695308960000524
Figure BDA0003695308960000531
表3
序列表表格(另见上面的表1A和1B)
Figure BDA0003695308960000532
Figure BDA0003695308960000541
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修饰对于本领域技术人员而言从前面的描述中将变得显而易见。此类修饰旨在落入所附权利要求的范围内。
Figure IDA0003695309040000011
Figure IDA0003695309040000021
Figure IDA0003695309040000031
Figure IDA0003695309040000041
Figure IDA0003695309040000051
Figure IDA0003695309040000061
Figure IDA0003695309040000071
Figure IDA0003695309040000081
Figure IDA0003695309040000091
Figure IDA0003695309040000101
Figure IDA0003695309040000111
Figure IDA0003695309040000121
Figure IDA0003695309040000131
Figure IDA0003695309040000141
Figure IDA0003695309040000151
Figure IDA0003695309040000161
Figure IDA0003695309040000171
Figure IDA0003695309040000181
Figure IDA0003695309040000191
Figure IDA0003695309040000201
Figure IDA0003695309040000211
Figure IDA0003695309040000221
Figure IDA0003695309040000231
Figure IDA0003695309040000241
Figure IDA0003695309040000251
Figure IDA0003695309040000261
Figure IDA0003695309040000271
Figure IDA0003695309040000281
Figure IDA0003695309040000291
Figure IDA0003695309040000301
Figure IDA0003695309040000311
Figure IDA0003695309040000321
Figure IDA0003695309040000331
Figure IDA0003695309040000341
Figure IDA0003695309040000351
Figure IDA0003695309040000361
Figure IDA0003695309040000371
Figure IDA0003695309040000381
Figure IDA0003695309040000391
Figure IDA0003695309040000401
Figure IDA0003695309040000411
Figure IDA0003695309040000421
Figure IDA0003695309040000431
Figure IDA0003695309040000441
Figure IDA0003695309040000451
Figure IDA0003695309040000461
Figure IDA0003695309040000471
Figure IDA0003695309040000481
Figure IDA0003695309040000491
Figure IDA0003695309040000501
Figure IDA0003695309040000511
Figure IDA0003695309040000521
Figure IDA0003695309040000531
Figure IDA0003695309040000541
Figure IDA0003695309040000551
Figure IDA0003695309040000561
Figure IDA0003695309040000571
Figure IDA0003695309040000581
Figure IDA0003695309040000591

Claims (27)

1.一种用于治疗犬的特应性皮炎的组合物，其包含结合犬IL-22的融合蛋白、犬源化抗瘙痒抗体和犬源化抗炎抗体；其中结合犬IL-22的所述融合蛋白选自由犬IL-22RA1-Fc融合蛋白和犬IL-22RA2-Fc融合蛋白组成的组。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述融合蛋白是所述犬IL-22RA1-Fc融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述犬IL-22RA1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述融合蛋白是所述犬IL-22RA2-Fc融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述IL-22RA2-犬Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5所述的组合物，其中双特异性结合伴体包含所述融合蛋白及包含重链和轻链的所述犬源化抗瘙痒抗体的单体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31(IL-31)抗体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述犬源化IL-31抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的组合物，其中所述犬源化IL-31抗体的轻链被修饰以包含替代恒定轻链结构域(CL)的来自所述犬源化IL-31抗体的重链的重链恒定区1(CH1)；并且其中所述犬源化IL-31抗体的重链被修饰以包含替代所述CH1的来自所述犬源化IL-31抗体的轻链的所述恒定轻链结构域(CL)。
11.根据权利要求1-10所述的组合物，其中所述犬源化抗炎抗体是犬源化IL-4Rα抗体。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链。
14.根据权利要求1、2或4中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体包含含有重链和轻链的所述犬源化抗瘙痒抗体的单体和含有重链和轻链的所述犬源化抗炎抗体的单体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述犬源化抗炎抗体是犬源化白介素4受体α(IL-4Rα)抗体。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述犬源化IL-4Rα抗体包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的组合物，其中所述犬源化IL-4Rα抗体的轻链被修饰以包含替代恒定轻链结构域(CL)的来自所述犬源化IL-4Rα抗体的重链的重链恒定区1(CH1)；并且其中所述犬源化IL-4Rα抗体的重链被修饰以包含替代所述CH1的来自所述犬源化IL-4Rα抗体的轻链的所述恒定轻链结构域(CL)。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中所述犬源化抗瘙痒抗体是犬源化白介素31受体α(IL-31RA)抗体。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述犬源化IL-31RA抗体包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白是所述犬IL-22RA1-Fc融合蛋白。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述犬IL-22RA1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
23.根据权利要求14-20中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白是所述犬IL-22RA2-Fc融合蛋白。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述IL-22RA2-犬Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
25.根据权利要求1-24所述的组合物，进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的附加组分：Janus激酶(JAK)抑制剂、脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂或在TH2细胞上表达的趋化受体-同源分子的拮抗剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述JAK抑制剂选自由以下组成的组：
Figure FDA0003695308950000031
其中R1是任选被羟基取代的C1-4烷基，及其药学上可接受的盐；和
Figure FDA0003695308950000032
及其药学上可接受的盐。
27.一种治疗特应性皮炎的方法，包括将权利要求1-26所述的组合物施用于患有特应性皮炎的犬科动物。
CN202080087151.9A 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合伴体 Pending CN114829396A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202510665965.0A CN120789240A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合伴体

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962951793P 2019-12-20 2019-12-20
US201962951778P 2019-12-20 2019-12-20
US62/951,778 2019-12-20
US62/951,793 2019-12-20
US202063015220P 2020-04-24 2020-04-24
US202063015209P 2020-04-24 2020-04-24
US63/015,209 2020-04-24
US63/015,220 2020-04-24
US202063092294P 2020-10-15 2020-10-15
US202063092296P 2020-10-15 2020-10-15
US63/092,296 2020-10-15
US63/092,294 2020-10-15
PCT/EP2020/086925 WO2021123094A1 (en) 2019-12-20 2020-12-18 Bispecific caninized antibodies and bispecific binding partners for treating atopic dermatitis

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510665965.0A Division CN120789240A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合伴体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114829396A true CN114829396A (zh) 2022-07-29

Family

ID=74183110

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080087151.9A Pending CN114829396A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合伴体
CN202080087827.4A Pending CN114829397A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体
CN202510666197.0A Pending CN120514846A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体
CN202510665965.0A Pending CN120789240A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合伴体

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080087827.4A Pending CN114829397A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体
CN202510666197.0A Pending CN120514846A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体
CN202510665965.0A Pending CN120789240A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 用于治疗特应性皮炎的双特异性犬源化抗体和双特异性结合伴体

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20230250177A1 (zh)
EP (2) EP4077379A1 (zh)
JP (2) JP2023506922A (zh)
CN (4) CN114829396A (zh)
AU (2) AU2020406738A1 (zh)
BR (2) BR112022011629A2 (zh)
CA (2) CA3161728A1 (zh)
MX (2) MX2022007636A (zh)
WO (2) WO2021123094A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115364223A (zh) * 2022-08-17 2022-11-22 郑州可尔利尔生物科技有限公司 作用于stat 6靶点的物质成分在制备治疗慢性瘙痒症的药物中的应用
CN115505575A (zh) * 2022-11-16 2022-12-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 两株分泌犬il-31单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
AU2020407853A1 (en) * 2019-12-20 2022-06-09 Intervet International B.V. Antibodies to canine interleukin-4 receptor alpha
GB202005879D0 (en) * 2020-04-22 2020-06-03 Petmedix Ltd Heterodimeric proteins
MX2024002150A (es) * 2021-08-20 2024-03-08 Intervet Int Bv Anticuerpos y proteinas de fusion de igg con una semivida prolongada.
JP2024546759A (ja) * 2021-12-16 2024-12-26 インターベット インターナショナル ベー． フェー． イヌインターロイキン－３１受容体アルファｉｉに対するイヌ化抗体
AU2022422400A1 (en) * 2021-12-20 2024-07-11 Vetoquinol Sa Anti-canine interleukine-31-receptor a (il-31ra) antibodies and the uses thereof
WO2024145278A2 (en) 2022-12-27 2024-07-04 Invetx, Inc. Polypeptides with altered binding to neonatal fc receptor (fcrn) and methods of use
AU2024210302A1 (en) 2023-01-20 2025-09-04 Invetx, Inc. Bispecific binding agents for use in companion animals
EP4665756A1 (en) * 2023-02-13 2025-12-24 Intervet International B.V. Canine antibodies to canine il-4
CN120865402A (zh) * 2023-11-27 2025-10-31 宁波贝安生物科技有限公司 抗il-31的抗体及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016156588A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Intervet International B.V. Antibodies to canine interleukin-4 receptor alpha
WO2017186928A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Curevac Ag Rna encoding an antibody
WO2018156367A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
US20180244766A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9818110D0 (en) 1998-08-19 1998-10-14 Weston Medical Ltd Needleless injectors and other devices
US6096002A (en) 1998-11-18 2000-08-01 Bioject, Inc. NGAS powered self-resetting needle-less hypodermic jet injection apparatus and method
DK1176195T3 (da) 1999-04-09 2013-06-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2618550C (en) 2005-08-12 2013-12-17 Merck Frosst Canada Ltd. Indole derivatives as crth2 receptor antagonists
PT2384326E (pt) 2008-08-20 2014-06-09 Zoetis Llc Compostos de pirrolo[2,3-d]pirimidina
US8546422B2 (en) 2008-09-22 2013-10-01 Merck Canada Inc. Azaindole derivatives as CRTH2 receptor antagonists
WO2010031183A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Merck Frosst Canada Ltd. Indole derivatives as crth2 receptor antagonists
US8637541B2 (en) 2008-09-22 2014-01-28 Merck Canada Inc. Indole derivatives as CRTH2 receptor antagonists
US8394819B2 (en) 2009-02-24 2013-03-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Indole derivatives as CRTH2 receptor antagonists
CN102858767B (zh) 2009-12-17 2015-08-19 默沙东公司 作为syk抑制剂的氨基嘧啶
CA2817964C (en) * 2010-11-17 2018-06-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
TWI682781B (zh) 2013-07-11 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 藉由投與ｉｌ－４ｒ抑制劑治療嗜酸性食道炎的方法
CN106029697B (zh) 2013-12-20 2021-06-04 英特维特国际股份有限公司 具有经修饰的ch2-ch3序列的犬抗体
WO2017102920A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Intervet International B.V. Caninized human antibodies to human and canine il-4r alpha
AU2017376398B2 (en) 2016-12-14 2021-07-15 Intervet International B.V. Aminopyrazoles as selective janus kinase inhibitors
EP3585411B1 (en) * 2017-02-21 2025-05-28 The Regents Of The University Of Michigan Il-22bp compositions and method for the treatment of disease therewith

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016156588A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Intervet International B.V. Antibodies to canine interleukin-4 receptor alpha
CN107683291A (zh) * 2015-04-02 2018-02-09 英特维特国际股份有限公司 针对犬白介素‑4受体α的抗体
WO2017186928A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Curevac Ag Rna encoding an antibody
WO2018156367A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
US20180244766A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115364223A (zh) * 2022-08-17 2022-11-22 郑州可尔利尔生物科技有限公司 作用于stat 6靶点的物质成分在制备治疗慢性瘙痒症的药物中的应用
CN115505575A (zh) * 2022-11-16 2022-12-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 两株分泌犬il-31单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022007676A (es) 2022-07-19
MX2022007636A (es) 2022-07-19
CN120514846A (zh) 2025-08-22
EP4077379A1 (en) 2022-10-26
CN114829397A (zh) 2022-07-29
CA3161728A1 (en) 2021-06-24
US20230295289A1 (en) 2023-09-21
AU2020406738A1 (en) 2022-06-23
JP2023506925A (ja) 2023-02-20
US20230250177A1 (en) 2023-08-10
EP4077380A1 (en) 2022-10-26
BR112022011629A2 (pt) 2022-09-13
CA3161496A1 (en) 2021-06-24
WO2021123094A1 (en) 2021-06-24
JP7719077B2 (ja) 2025-08-05
JP2023506922A (ja) 2023-02-20
WO2021123092A1 (en) 2021-06-24
CN120789240A (zh) 2025-10-17
AU2020407269A1 (en) 2022-06-16
BR112022011669A2 (pt) 2022-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7719077B2 (ja) アトピー性皮膚炎を処置するための二重特異性イヌ化抗体および二重特異性結合パートナー
US20230391879A1 (en) Caninized antibodies to canine interleukin-31 receptor alpha
CN114867526B (zh) 犬白介素-4受体α的抗体
JP2024546759A (ja) イヌインターロイキン－３１受容体アルファｉｉに対するイヌ化抗体
WO2023021170A2 (en) Fusion proteins for treating atopic dermatitis
CN117980339A (zh) 用于治疗特应性皮炎的融合蛋白同二聚体
RU2854833C1 (ru) Биспецифические канинизированные антитела и биспецифические партнеры по связыванию для лечения атопического дерматита
RU2854627C1 (ru) Биспецифические канинизированные антитела для лечения атопического дерматита
RU2855920C1 (ru) Канинизированные антитела против альфа-рецептора интерлейкина-31 собаки
CN116472287A (zh) 犬白介素-31受体α的犬源化抗体
CN118525034A (zh) 犬白介素-31受体αI的犬源化抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination