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CN108712911A - 抗体及其缀合物 - Google Patents

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CN108712911A
CN108712911A CN201680082940.7A CN201680082940A CN108712911A CN 108712911 A CN108712911 A CN 108712911A CN 201680082940 A CN201680082940 A CN 201680082940A CN 108712911 A CN108712911 A CN 108712911A
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KODA PHARMACEUTICAL CO Ltd
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Abstract

本文提供了抗‑VEGF‑A抗体及其抗体缀合物。抗体的一些实施方案可以与诸如HEMA‑PC聚合物的部分缀合。抗体缀合物的一些实施方案可以保留或增强抗体活性。抗体及其缀合物可特别用于治疗糖尿病性视网膜病变。还提供了用于将聚合物与蛋白质(例如抗体，例如IgG1)缀合的方法。

Description

抗体及其缀合物
通过引用并入任意优先权申请
在本申请提交的申请数据表中标识了外国或国内优先权要求的任意和所有申请在此基于37C.FR§1.57通过引用并入。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以名为KDIAK004.txt的文件提供，其于2016年12月28日创建，其大小为18,231字节。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及抗体及其缀合物，以及使用和制造所述抗体、其缀合物和其他蛋白质缀合物的方法。
背景技术
糖尿病性视网膜病变是年龄在约20至64岁之间的人失明的主要原因。EngelgauM,Geiss L,Saaddine J,Boyle J，等人2004.The Evolving Diabetes Burden in theUnited States.Ann of Int Med.140(11):945-951。在美国，糖尿病性视网膜病变占新发失明病例的约12％。通常，在糖尿病性视网膜病变的情况下，视网膜血管会膨胀并将液体泄漏到眼后部。高血糖诱导基底膜的壁内和增厚，导致血管渗漏或渗透。
在糖尿病性视网膜病变中，血糖水平的变化引起视网膜血管的变化。所有患有糖尿病的人都有风险。患糖尿病的时间越长，患眼病的风险就越高。被诊断患有糖尿病的美国人中有40％至45％患有一些阶段的糖尿病视网膜病变。Causes and RiskFactors.Diabetic Retinopathy.United States National Library of Medicine.15September 2009。
糖尿病性视网膜病变首先在视网膜微动脉瘤的发展中表现出来。当供给视网膜的毛细血管(非常小的血管)肿胀时，出现微动脉瘤。存在相对少量的微动脉瘤通常不会引起视力问题。然而，如果视网膜病变发展到后期阶段，则视力丧失的可能性很大。这种早期视网膜病变被称为背景糖尿病性视网膜病变或非增殖性糖尿病性视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)。虽然NPDR患者通常无症状，但视网膜病变的早期检测至关重要，因为如果疾病进展到后期阶段，很可能会出现严重的视力丧失。
在糖尿病性视网膜病变的下一阶段，在眼后部发生新血管形成(增殖性糖尿病性视网膜病变)。新血管系统渗漏，血管破裂，然后出血，导致视力模糊或遮蔽。由于眼睛中缺氧，还会发生进一步的新血管形成。血管沿视网膜和在玻璃体液中生长。随着这些血管破裂，进一步出血，并且视网膜可能严重受损或破坏。由于血管渗漏导致的黄斑中的液体积聚被称为糖尿病性黄斑水肿。许多糖尿病性视网膜病变患者会发展为糖尿病性黄斑水肿。
对于患有糖尿病性视网膜病变的患者，通常存在三种治疗途径：激光手术、注射皮质类固醇和注射抗-VEGF剂(例如(贝伐单抗(bevacizumab))、(雷珠单抗(ranibizumab))和(阿柏西普(aflibercept)))。虽然激光手术通常对治疗糖尿病性视网膜病变有效，但激光诱导的视网膜损伤是常见的副作用。已经通过玻璃体内注射施用类固醇制剂如曲安奈德以治疗糖尿病性视网膜病变。然而，为了治疗糖尿病性视网膜病变，必须经常施用类固醇溶液。此外，用类固醇玻璃体内治疗与白内障、类固醇诱导的青光眼和眼内炎有关。
治疗糖尿病性视网膜病变的另一种方法是玻璃体内注射抗-VEGF剂。在这方面，(雷珠单抗)和(阿柏西普)最近被批准用于治疗糖尿病性黄斑水肿患者的糖尿病性视网膜病变。VEGF指导的疗法不仅对糖尿病性视网膜病变有效，而且对年龄相关性黄斑变性(AMD)也有效，例如新生血管(湿性)AMD。
发明内容
本文提供了抗-VEGF-A抗体的抗体缀合物，所述抗-VEGF-A抗体在抗体可变区外的半胱氨酸处与含磷酸胆碱的聚合物键合，其中所述半胱氨酸已通过重组DNA技术添加。任选地，抗-VEGF-A抗体包含轻链和重链，并且重链包含Fc区。任选地，抗-VEGF-A抗体是免疫球蛋白G(IgG)。任选地，半胱氨酸位于重链的Fc区。任选地，抗-VEGF-A重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，并且位置221(通过如SEQ ID NO.3中的顺序计数)是T，并且抗-VEGF-A轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)，并且Kabat位置4为L。任选地，抗-VEGF-A重链同种型是人IgG1。
任选地，抗-VEGF-A抗体IgG1的重链恒定结构域相对于IgG1恒定结构域具有一个或多个突变以调节效应子功能。突变任选地为以下氨基酸位置中的一个或多个(EU编号)：E233X，L234X，L235X，G236X，G237X，A327X，A330X和P331X，其中X是任意天然或非天然氨基酸。任选地，突变选自由以下组成的组(EU编号)：E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S和P331S。任选地，突变是(EU编号)L234A，L235A和G237A。在一些实施方案中，效应子功能降低。在一些实施方案中，CDC、ADCC和/或ADCP降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或更多百分比。在一些实施方案中，CDC由与C1q结合的Fc介导，ADCC和ADCP由与各种Fcγ受体结合的Fc介导，并且这些结合相互作用中的每一种均降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，或更多百分比。
半胱氨酸残基任选地在抗-VEGF-A重链中并且任选地为Q347C(EU编号)或L443C(EU编号)。任选地，抗-VEGF-A重链是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ ID NO.2。任选地，半胱氨酸是L443C(EU编号)。
任选地，含磷酸胆碱的聚合物包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵)乙基磷酸酯(MPC)单体，如下所示：
使得聚合物包含以下重复单元：
其中n是自1至3000的整数，波浪线表示聚合物中单体单元之间的连接点。
该聚合物任选地具有三个或更多个臂，或者用包含3个或更多个聚合物引发位点的引发剂合成。任选地，聚合物具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个臂，或者用包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个聚合物引发位点的引发剂合成。任选地，聚合物具有2，3，6或9个臂，或者用包含2，3，6或9个聚合物引发位点的引发剂合成。任选地，聚合物具有9个臂，或者用包含9个聚合物引发位点的引发剂合成。
任选地，如通过尺寸排阻色谱-多角度光散射(下文称为“SEC-MALS”)所测量的，聚合物的分子量在约300,000和约1,750,000Da之间。任选地，聚合物的分子量在约500,000和约1,000,000Da之间。任选地，聚合物的分子量在约600,000至约800,000Da之间。
任选地，抗体缀合物是纯化的并且聚合物是多分散的。任选地，聚合物的多分散性值(polydispersity value,PDI)小于1.2。在一些实施方案中，本文提供的任意缀合物溶液的多分散指数(PolyDispersity Index,PDI)等于或小于1.8，例如，小于或等于：1.7，1.6，1.5，1.4，1.3，1.2，1.1。
任选地，抗体缀合物包含与聚合物键合的抗-VEGF-A免疫球蛋白G(IgG)，该聚合物包含MPC单体，其中抗-VEGF-A重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ IDNO.2，并且其中抗体仅在SEQ ID NO.1中的C449处与聚合物键合。任选地，聚合物具有9个臂；并且聚合物的分子量在约600,000至约800,000Da之间。
任选地，抗体缀合物包含与聚合物键合的抗-VEGF-A免疫球蛋白G(IgG)，该聚合物包含MPC单体，其中抗-VEGF-A重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ IDNO.2，并且其中抗体仅在C443(EU编号)处与聚合物键合。任选地，聚合物具有9个臂；并且聚合物的分子量在约600,000至约800,000Da之间。
任选地，抗体缀合物具有以下结构：
其中：抗-VEGF-A抗体的每条重链用字母H表示，并且抗-VEGF-A抗体的每条轻链用字母L表示；聚合物通过SEQ ID NO：1中的C449的巯基与抗-VEGF-A抗体键合，该键描述在一条重链上；PC是其中曲线表示与聚合物其余部分连接的点；其中X＝a)OR其中R＝H，甲基，乙基，丙基，异丙基，b)H，或c)任意卤化物，包括Br；并且n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，使得n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9的总和为2500±15％。任选地，n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9独立地为自0至3000的整数。任选地，n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9独立地为自0至500的整数。在一些实施方案中，X＝OR，其中R是糖，氨基烷基，以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和的C1-C24烷基，不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基，酰基，酰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧基羰氧基，环烷基，环烯基，烷氧基，环烷氧基，芳基，杂芳基，芳基烷氧基羰基，烷氧基羰基酰基，氨基，氨基羰基，氨基羰基氧(aminocarboyloxy)，硝基，叠氮基，苯基，羟基，烷硫基，芳硫基，氧磺酰基，羧基，氰基，和卤代烷基，包括多卤代烷基，--CO--O--R7，羰基--CCO--R7，--CO--NR8R9，--(CH2)n--COOR7，--CO--(CH)n--COOR7，--(CH2)n--NR8R9，酯，烷氧基羰基，芳氧基羰基，其中n是自1至6的整数，其中每个R7、R8和R9分别选自由以下组成的组：氢原子，卤原子，以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和的C1-C24烷基，不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基，酰基，酰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧基羰氧基，环烷基，环烯基，烷氧基，环烷氧基，芳基，杂芳基，芳基烷氧基羰基，烷氧基羰基酰基，氨基，氨基羰基，氨基羰基氧，硝基，叠氮基，苯基，羟基，烷硫基，芳硫基，氧磺酰基，羧基，氰基，和卤代烷基，包括多卤代烷基，5元环和6元环。
任选地，抗体缀合物具有以下结构：
其中：抗-VEGF-A抗体的每条重链用字母H表示，并且抗-VEGF-A抗体的每条轻链用字母L表示；聚合物通过C443(EU编号)的巯基与抗-VEGF-A抗体键合，该键描述在一条重链上；PC是其中曲线表示与聚合物其余部分连接的点；其中X＝a)OR其中R＝H，甲基，乙基，丙基，异丙基，b)H，或c)任意卤化物，包括Br；并且n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，使得n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9的总和为2500±15％。任选地，n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9独立地为自0至3000的整数。任选地，n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9独立地为自0至500的整数。在一些实施方案中，X＝OR，其中R是糖，氨基烷基，以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和的C1-C24烷基，不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基，酰基，酰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧基羰氧基，环烷基，环烯基，烷氧基，环烷氧基，芳基，杂芳基，芳基烷氧基羰基，烷氧基羰基酰基，氨基，氨基羰基，氨基羰基氧，硝基，叠氮基，苯基，羟基，烷硫基，芳硫基，氧磺酰基，羧基，氰基，和卤代烷基，包括多卤代烷基，--CO--O--R7，羰基--CCO--R7，--CO--NR8R9，--(CH2)n--COOR7，--CO--(CH)n--COOR7，--(CH2)n--NR8R9，酯，烷氧基羰基，芳氧基羰基，其中n是自1至6的整数，其中每个R7、R8和R9分别选自由以下组成的组：氢原子，卤原子，以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和的C1-C24烷基，不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基，酰基，酰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧基羰氧基，环烷基，环烯基，烷氧基，环烷氧基，芳基，杂芳基，芳基烷氧基羰基，烷氧基羰基酰基，氨基，氨基羰基，氨基羰基氧，硝基，叠氮基，苯基，羟基，烷硫基，芳硫基，氧磺酰基，羧基，氰基，和卤代烷基，包括多卤代烷基，5元环和6元环。
在一些实施方案中，提供了液体溶液中的如上所述的抗体缀合物。任选地，液体溶液具有药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，提供了包含重链和轻链的抗-VEGF-A抗体。重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，并且位置221(通过如SEQ ID NO.3中的顺序计数)是T，轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)，并且Kabat位置4为L。任选地，重链同种型是IgG1，其中IgG1恒定结构域包含以下突变中的一个或多个以调节效应子功能(EU编号)：E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S，和P331S。任选地，抗体具有(EU编号)L234A，L235A和G237A。任选地，抗-VEGF-A重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ ID NO.2。
在一些实施方案中，提供了用于治疗或预防眼部疾病的方法。该方法包括施用如上所述的抗体缀合物，或如上所述的药物组合物。任选地，眼部疾病选自由以下组成的组：糖尿病性视网膜病变，脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization,CNV)，年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)，糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)，病理性近视，冯希-林二氏(von Hippel-Lindau)病，眼睛的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion,CRVO)，视网膜中央分支静脉阻塞(branched central retinal vein occlusion,BRVO)，角膜新生血管形成，视网膜新生血管形成，早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)，结膜下出血和高血压性视网膜病变。任选地，所述疾病是糖尿病性视网膜病变。
在一些实施方案中，提供了制备抗体缀合物的方法，所述抗体缀合物包含与含磷酸胆碱的聚合物缀合的抗-VEGF-A抗体。所述方法包括以下步骤：将抗-VEGF-A抗体与含磷酸胆碱的聚合物缀合；其中抗-VEGF-A抗体包含通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基，并且其中所述半胱氨酸位于抗体的可变区之外；其中含磷酸胆碱的聚合物包括选自由以下组成的组的巯基特异性反应基团：马来酰亚胺，乙烯基砜，邻二硫吡啶和碘乙酰胺；并且其中含磷酸胆碱的聚合物上的巯基特异性反应基团与抗-VEGF-A抗体上的半胱氨酸残基反应以制备抗体缀合物。
任选地，抗-VEGF-A抗体是免疫球蛋白G(IgG)，并且半胱氨酸位于抗体的Fc区。任选地，抗-VEGF-A抗体包含轻链和重链，其中抗VEGF-A抗体重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ IDNO：11)，并且位置221(通过如SEQ ID NO.3中的顺序计数)是T，并且VEGF-A抗体轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)，并且Kabat位置4为L。任选地，抗-VEGF-A抗体重链同种型是IgG1。
任选地，所述IgG1恒定结构域相对于IgG1恒定结构域具有一个或多个突变以调节效应子功能。任选地，所述突变是针对以下氨基酸位置中的一个或多个(EU编号)：E233X，L234X，L235X，G236X，G237X，G236X，D270X，K322X，A327X，P329X，A330X，A330X，P331X，和P331X，其中X是任意天然或非天然氨基酸。任选地，所述突变选自由以下组成的组(EU编号)E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S和P331S。任选地，所述突变是(EU编号)L234A，L235A和G237A。
任选地，通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基选自由Q347C(EU编号)和L443C(EU编号)组成的组。任选地，通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基是L443C(EU编号)。任选地，抗-VEGF-A重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ ID NO.2。
任选地，含磷酸胆碱的聚合物包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵)乙基磷酸酯(MPC)单体，如下所述：
使得聚合物包含以下重复单元：
其中n是自1至3000的整数，波浪线表示聚合物中单体单元之间的连接点。
任选地，聚合物具有三个或更多个臂。任选地，聚合物具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个臂。任选地，聚合物具有2，3，6或9个臂。任选地，聚合物具有9个臂。
任选地，聚合物的分子量在约300,000和1,750,000Da之间。任选地，聚合物的分子量在约500,000和1,000,000Da之间。任选地，聚合物的分子量在约600,000至800,000Da之间。
任选地，所述方法还包括以下步骤：在产生还原型半胱氨酸巯基的条件下使抗-VEGF-A抗体与硫醇还原剂接触以产生其中所有半胱氨酸残基均被还原的还原型抗-VEGF-A抗体。任选地，硫醇还原剂选自由以下组成的组：三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，二硫苏糖醇(DTT)，二硫赤藓糖醇(DTE)，硼氢化钠(NaBH4)，氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，β-巯基乙醇(BME)，半胱氨酸盐酸盐和半胱氨酸。任选地，硫醇还原剂是TCEP。任选地，硫醇还原剂相对于抗-VEGF-A抗体的浓度为1至100倍摩尔过量。任选地，硫醇还原剂相对于抗-VEGF-A抗体的浓度为20至50倍摩尔过量。
任选地，所述方法还包括从还原的抗-VEGF-A抗体中除去硫醇还原剂，和用氧化剂处理还原的抗-VEGF-A抗体的步骤。任选地，氧化剂是空气，CuSO4水溶液(aqueous CuSO4)或脱氢抗坏血酸(DHAA)。任选地，所述方法还包括纯化抗体缀合物的步骤。
任选地，使用选自由以下组成的组的技术纯化抗体缀合物：离子交换色谱，疏水相互作用色谱，尺寸排阻色谱，亲和色谱及其组合。任选地，纯化的抗体缀合物相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体保留至少20％的生物活性。任选地，纯化的抗体缀合物相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体保留至少50％的生物活性。任选地，纯化的抗体缀合物相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体保留至少90％的生物活性。任选地，相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体，纯化的抗体缀合物的半衰期增加。任选地，相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体，纯化的抗体缀合物的半衰期增加至少1.5倍。
任选地，所述方法还包括以下步骤：在聚合介质中聚合可自由基聚合的含磷酸胆碱的单体以提供含磷酸胆碱的聚合物，所述介质包含：可自由基聚合的含磷酸胆碱的单体；过渡金属催化剂Mt (q-1)+其中Mt是过渡金属，q是金属的最高氧化态，q-1是金属的氧化态，其中金属可以作为催化剂，其中过渡金属催化剂以Mt(q-1)+X’(q-1)形式的盐提供，其中X'是反离子或基团，或者其中过渡金属催化剂通过提供处于其最高氧化态的非活性金属盐Mt q+X’q与还原剂一起原位提供，所述还原剂能够将过渡金属从氧化的非活性态还原为还原的活性态；配体；和引发剂。
任选地，可自由基聚合的含磷酸胆碱的单体是
其中R1是H或C1-6烷基；R2、R3、R4各自为甲基；X和Y各自为2。
任选地，Mt选自由以下组成的组：Cu，Fe，Ru，Cr，Mo，W，Mn，Rh，Re，Co，V，Zn，Au和Ag。任选地，金属催化剂以Mt(q-1)+X’(q-1)形式的盐提供。任选地，Mt (q-1)+选自由以下组成的组：Cu1+，Fe2+，Ru2+，Cr2+，Mo2+，W2+，Mn3+，Rh3+，Re2+，Co+，V2+，Zn+，Au+和Ag+，并且X'选自由以下组成的组：卤素，C1-6烷氧基，(SO4)1/2，(PO4)1/3，(R7PO4)1/2，(R72PO4)，三氟甲磺酸酯，六氟磷酸酯(hexaluorophosphate)，甲磺酸酯，芳基磺酸酯，CN和R7CO2组成的组，其中R7是H或直链或支链C1-6烷基，其可被卤素取代1至5次。任选地，Mt (q-1)+是Cu1+并且X'是Br。任选地，原位提供Mt (q-1)+。任选地，Mt q+Xq是CuBr2。
任选地，还原剂是无机化合物。任选地，无机化合物自由以下组成的组：低氧化水平的硫化合物，亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，含金属离子的无机盐，金属，水合肼和这些化合物的衍生物。
任选地，还原剂是金属。任选地，还原剂是Cu0。
任选地，还原剂是有机化合物。任选地，有机化合物自由以下组成的组：烷基硫醇，巯基乙醇，或易于烯醇化的羰基化合物，抗坏血酸，乙酰丙酮酸酯，樟脑磺酸，羟基丙酮，还原糖，单糖，葡萄糖，醛以及这些有机化合物的衍生物。
任选地，配体自由以下组成的组：2,2'-联吡啶，4,4'-二-5-壬基-2,2'-联吡啶，4,4-二壬基-2,2'-联吡啶，4,4',4”-三(5-壬基)-2,2':6',2”-三联吡啶，N,N,N',N',N”-五甲基二亚乙基三胺，1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺，三(2-二甲基氨基乙基)胺，N,N-双(2-吡啶基甲基)十八烷基胺，N,N,N',N'-四[(2-吡啶)甲基]乙二胺，三[(2-吡啶基)甲基]胺，三(2-氨基乙基)胺，三(2-双(3-丁氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺，三(2-双(3-(2-乙基己氧基)-3-氧代丙基)氨基乙基)胺，和三(2-双(3-十二烷氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺。任选地，配体是2,2'-联吡啶。
任选地，引发剂具有以下结构：
其中R1是亲核反应性基团，R2包含接头(linker)，并且R3包含具有以下结构的聚合物合成引发剂部分：
其中R4和R5相同或不同并且选自由以下组成的组：烷基，取代的烷基，亚烷基，烷氧基，羧基烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基醚，烯基，亚烯基，炔基，亚炔基，环亚烷基，杂环烷基，杂环亚烷基，芳基，亚芳基，亚芳基-氧基，杂芳基，氨基，酰氨基及其任意组合；Z是卤素或CN；并且s是1至20之间的整数。
任选地，Z是Br并且R4和R5各自是甲基。任选地，R1选自由以下组成的组：NH2-，OH-和SH-。任选地，R1是NH2-。任选地，R2是烷基，取代的烷基，亚烷基，烷氧基，羧基烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基醚，烯基，亚烯基，炔基，亚炔基，环亚烷基，杂环烷基，杂环亚烷基，芳基，亚芳基，亚芳基-氧基，杂芳基，氨基，酰氨基及其任意组合。任选地，R2是
其中X和Y相同或不同并且是1-20的整数。
任选地，X和Y各自为4。任选地，R3还包含
其中R6、R7和R8相同或不同，并且选自由以下组成的组：
其中Z是NCS，F，Cl，Br或I。任选地，Z是Br。任选地，R6、R7和R8各自为
任选地，引发剂具有以下结构：
其中A和B相同或不同，并且是2至12的整数，并且Z是任意卤化物，例如Br。任选地，A和B各自为4。
任选地，所述方法还包括使聚合物与马来酰亚胺试剂反应以提供具有末端马来酰亚胺的聚合物的步骤。任选地，马来酰亚胺化合物是
在一些实施方案中，本文提供的选项避免了其他方法或治疗形式的一个或多个问题。例如，它们可以将施用频率降低至每月少于一次玻璃体内注射，因为这样的玻璃体内注射可能是痛苦的并且需要临床环境。此外，视力相对未受损的糖尿病性视网膜病变患者可能抗拒每月的玻璃体内注射，因此在其他形式的治疗下可能不进行治疗。因此需要以较低频率给药的糖尿病性视网膜病变治疗。在这种情况下，可以在疾病早期使用糖尿病性视网膜病变的治疗来预防疾病的进展和相关的视力威胁事件。
在一些实施方案中，抗体缀合物包含(1)抗-VEGF-A抗体和(2)含磷酸胆碱的聚合物。聚合物在抗体可变区外的半胱氨酸处与抗体共价键合，并且所述半胱氨酸已经通过重组DNA技术添加。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，并且抗-VEGF-A轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，如通过尺寸排阻色谱-多角度光散射(下文称为“SEC-MALS”)所测量的，与抗体缀合的聚合物的分子量在约300,000和约1,750,000Da之间。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体包含重链和轻链。重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQID NO：11)，并且轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)，并且重链同种型是IgG1。IgG1恒定结构域包含以下突变中的一个或多个以降低效应子功能(EU编号)：E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S，和P331S。
在一些实施方案中，任意方法均可以采用包含轻链和重链的抗-VEGF-A抗体，其中抗VEGF-A抗体重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，并且抗VEGF-A抗体轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ IDNO：14)。
在一些实施方案中，抗体包含重链氨基酸可变区(其包含SEQ ID NO 1)和轻链氨基酸可变区(其包含SEQ ID NO.2)。
在一些实施方案中，抗体是人IgG1，并且重链恒定结构域包含一种或多种降低免疫介导的效应子功能的突变。
在一些实施方案中，抗体进一步与聚合物缀合以形成生物缀合物，并且其中生物缀合物的分子量在约450,000和1,900,000道尔顿之间。
在一些实施方案中，多分散指数(PDI)等于或小于1.5。
在一些实施方案中，与VEGF-A结合的抗体包含CDRH1，即SEQ ID NO：1中的CDRH1；CDRH2，即SEQ ID NO：1中的CDRH2；CDRH3，即SEQ ID NO：1中的CDRH3；CDRL1，即SEQ ID NO：2中的CDRL1；CDRL2，即SEQ ID NO：2中的CDRL2；CDRL3，即SEQ ID NO：2中的CDRL3；至少一种以下突变：L234A，L235A和G237A(EU编号)；以及至少一种以下突变：Q347C(EU编号)或L443C(EU编号)。
在一些实施方案中，抗体包含全部以下三种突变(EU编号)L234A，L235A和G237A，并且其中抗体包含L443C(EU编号)。
在一些实施方案中，制备缀合蛋白的方法包括还原蛋白质中的一个或多个半胱氨酸以在溶液中形成去帽(decapped)蛋白质，再氧化去帽蛋白质以恢复还原蛋白质中的至少一个二硫键，同时确保蛋白质中工程化的半胱氨酸残基保持游离硫醇形式，从而在溶液中形成再氧化的去帽蛋白质，并向溶液中加入至少一种赋形剂，其中赋形剂减少聚合物诱导的蛋白质沉淀。所述方法还包括向溶液中加入聚合物，并在工程化的半胱氨酸残基处将聚合物与再氧化的去帽蛋白质缀合以形成缀合的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体蛋白质融合体或其结合片段。在一些实施方案中，赋形剂是酸或碱。在一些实施方案中，赋形剂选自由以下至少一种组成的组：去污剂、糖和带电荷的氨基酸。在一些实施方案中，聚合物与还原蛋白质的反应在pH6.0至pH8.5的水性条件下发生。在一些实施方案中，还原蛋白质的量小于聚合物的量。在一些实施方案中，聚合物在2-37摄氏度下与蛋白质缀合。在一些实施方案中，所述方法还包括使包含缀合的蛋白质的溶液与离子交换介质或疏水相互作用色谱或亲和色谱介质接触的过程。在一些实施方案中，离子交换介质或疏水相互作用色谱或亲和色谱介质将缀合的蛋白质与游离聚合物和再氧化的去帽蛋白质分离。在一些实施方案中，聚合物包含两性离子。在一些实施方案中，聚合物包含磷酸胆碱。在一些实施方案中，聚合物包含PEG接头，其将聚合物分支点的中心桥接至马来酰亚胺官能团。
在一些实施方案中，提供了这样的抗-VEGF抗体缀合物，其能够阻断VEGF配体和VEGF-受体之间的至少90％的相互作用。
在一些实施方案中，提供了这样的抗-VEGF抗体缀合物，其阻断VEGF配体和VEGF-受体之间的至少95％的相互作用。
在一些实施方案中，提供了这样的抗-VEGF抗体，其阻断VEGF配体和VEGF-受体之间的至少90％的相互作用。
附图说明
图1示出了化合物L。
图2示出了化合物K。
图3示出了从R3707合成OG1802。
图4示出了OG1786。
图5示出了从OG1550合成OG1546。
图6示出了从OG1546和OG1563合成OG1784。
图7示出了从OG1784合成OG1405。
图8示出了从OG1405合成OG 1785。
图9示出了从OG1785合成OG1786。
图10示出了OG1802。
图11示出了化合物E。
图12描绘了具有某些效应子功能突变和L443C(EU编号，其在SEQ ID NO.1中为449位)的抗-VEGF-A重链的一些实施方案。
图13描绘了抗-VEGF-A轻链(SEQ ID NO.2)的一些实施方案。
图14描绘了贝伐单抗重链(SEQ ID NO.3)的一些实施方案。
图15描绘了贝伐单抗轻链(SEQ ID NO.4)的一些实施方案。
图16描绘了雷珠单抗重链(SEQ ID NO.5)的一些实施方案。
图17描绘了雷珠单抗轻链(SEQ ID NO.6)的一些实施方案。
图18描绘了用于制备抗体缀合物的方法的一些实施方案。
图19描绘了反应A至G的离子交换分析(A280吸光度)。
图20描绘了各种抗-VEGF分子对生物素-VEGF与平板结合的VEGFR ECD-Fc蛋白结合的影响，以及它们的IC50值。
图21描绘了通过BIAcore单循环动力学测量的OG1950对VEGF的结合亲和力。
图22描绘了OG1950与Fcγ受体I的结合。
图23描绘了OG1950与Fcγ受体IIIa的结合。
图24描绘了QG 1950与人补体蛋白C1q的结合。
图25描绘了增殖测定的结果(包括IC50值)。
图26描绘了VEGF与抗-VEGF剂结合的单循环动力学的结果。
图27描绘了编码重链可变区和轻链可变区的核酸序列的一些实施方案。
图28描绘了各种样品(各种赋形剂)在聚合物溶液(OG1802)中在2-8摄氏度孵育20小时后的筛选结果。
具体实施方式
本文提供了抗-VEGF-A抗体。在一些实施方案中，这些抗体可以与半衰期延长部分缀合。在一些实施方案中，缀合物可用于治疗某些病况，例如糖尿病性视网膜病变和/或年龄相关性黄斑变性。
本文还提供了制备抗体(任意类型的抗体)的缀合物组合物的方法。在一些实施方案中，这些方法允许较低的聚集体形成或较高的所需抗体缀合物的形成效率。
以下在定义部分之后提供这些实施方案和另外的实施方案。
定义
“新生血管性病症”是以改变的、失调的或未经调节的血管生成为特征的病症或疾病状态。新生血管性病症的实例包括致瘤性转化(例如癌症)和包括糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性在内的眼部新生血管性病症。
“眼部新生血管性”病症是以患者眼中改变的、失调的或未经调节的血管生成为特征的病症。这些病症包括视神经盘新血管形成，虹膜新血管形成，视网膜新血管形成，脉络膜新血管形成，角膜新血管形成，玻璃体新血管形成，青光眼，血管翳，翼状胬肉，黄斑水肿，糖尿病性视网膜病变，糖尿病性黄斑水肿，血管性视网膜病变，视网膜变性，葡萄膜炎，视网膜炎性疾病和增生性玻璃体视网膜病变。
术语抗体包括完整抗体及其结合片段。结合片段是指不同于完整抗体的包含完整抗体的一部分的分子，其与完整抗体所结合的抗原相结合。结合片段的实例包括Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。Houston JS.1991.Methods in Enzymol.203:46-96中描述了scFv抗体。另外，抗体片段包括具有VH结构域特征(即能够与VL结构域一起组装到功能性抗原结合位点从而提供全长抗体的抗原结合性质)或VL结构域特征(即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点从而提供全长抗体的抗原结合性质)的单链多肽。
抗体与其靶抗原的特异性结合是指至少106，107，108，109或1010M-1的亲和力。特异性结合是可检测地更高的量值，并可区别于对至少一个不相关靶标发生的非特异性结合。特异性结合可以是特定官能团之间成键的结果或特定空间配合(例如，锁和钥匙类型)的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合不一定意味着抗体或融合蛋白结合一个且仅结合一个靶标。
基本抗体结构单元是亚单元的四聚体。每个四聚体包括相同的两对多肽链，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。该可变区最初表达为与可切割的信号肽连接。没有信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是指没有轻链信号肽的轻链可变区。然而，提到可变区并不意味着信号序列必然存在；事实上一旦抗体或融合蛋白被表达和分泌，信号序列就被切割。一对重链可变区和轻链可变区限定抗体的结合区。轻链和重链的羧基末端部分分别限定轻链恒定区和重链恒定区。重链恒定区主要负责效应子功能。在IgG抗体中，重链恒定区分为CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。CH1区通过二硫键和非共价键与轻链恒定区结合。铰链区在抗体的结合区和效应子区之间提供柔性，并且还提供四聚体亚单元中两个重链恒定区之间的分子间二硫键形成位点。CH2区和CH3区是效应子功能和FcR结合的主要位点。
轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区段连接，重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区段。(一般参见Fundamental Immunology(Paul,W.编辑，第2版，Raven Press,N.Y.,1989)第7章)(其全部内容通过引用并入本文用于所有目的)。
每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点，即是二价的。在天然抗体中，两个结合位点是相同的。然而，可以制备其中两个结合位点不同的双特异性抗体(参见例如Songsivilai S,Lachmann PC.1990.Bispecificantibody:a tool for diagnosis and treatment of disease.Clin Exp Immunol.79:315-321；Kostelny SA,Cole MS,Tso JY.1992.Formation of bispecific antibody bythe use of leucine zippers.J Immunol.148:1547-1553)。可变区均显示通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同基本结构。每对的两条链的CDR通过框架区对齐，使得能够结合特定表位。从N末端到C末端，轻链和重链都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。为了方便起见，可变重链CDR可以称为CDRH1、CDRH2和CDRH3；可变轻链CDR可以称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。每个结构域的氨基酸分配符合以下的定义：Kabat EA，等人1987 and 1991.Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,MD)或Chothia C,LeskAM.1987.Canonical Structures for the Hypervariable Regions ofImmunoglobulins.J Mol Biol 196:901-917；Chothia C，等人1989.Conformations ofImmunoglobulin Hypervariable Regions.Nature 342:877-883。Kabat还提供广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链可变区之间或不同轻链可变区之间的相应残基被赋予相同的编号。尽管Kabat编号可以用于抗体恒定区，但是EU编号更常用，如本申请中的情况一样。尽管提供了本文公开的示例性抗体的具体序列，但应当理解，在蛋白质链表达后，轻链和/或重链的氨基末端或羧基末端的一个至数个氨基酸，特别是重链C末端的赖氨酸残基，在一定比例的分子或所有分子中可能缺失或衍生化。
术语“表位”是指抗体或细胞外捕获(trap)段结合的抗原上的位点。蛋白质上的表位可以由连续氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂时得以保持，而由三级折叠形成的表位(也称为
构象表位)通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括至少3个，更通常地，至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和2维核磁共振(参见，例如Epitope Mapping Protocols,in Methods in MolecularBiology，第66卷，Glenn E.Morris，编辑(1996))。
识别相同或重叠的表位的抗体可以在简单的免疫测定中鉴定，该免疫测定显示一种抗体与另一种抗体竞争结合靶抗原的能力。抗体的表位也可以通过与其抗原结合的抗体(或Fab片段)的X射线晶体学来定义以鉴定接触残基。
或者，如果抗原中减少或消除一种抗体结合的所有氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，则两个抗体具有重叠的表位。
抗体之间的竞争通过试验来测定，其中测试的抗体抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合(参见例如Junghans等人，Cancer Res.50:1495,1990)。如果过量的测试抗体(例如，至少2x，5x，10x，20x或100x)抑制至少50％的参考抗体的结合，则测试抗体与参考抗体竞争。在一些实施方案中，如在竞争性结合测定中所测量的，测试抗体抑制75％、90％或99％的参考抗体的结合。通过竞争试验鉴定的抗体(竞争性抗体)包括结合与参考抗体相同的表位的抗体和结合与参考抗体所结合的表位足够接近从而产生空间位阻的相邻表位(anadjacent epitope)的抗体。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
为了将氨基酸取代分类为保守的或非保守的，将氨基酸做如下分组：第I组(疏水侧链)：met，ala，val，leu，ile；第II组(中性亲水侧链)：cys，ser，thr；第III组(酸性侧链)：asp，glu；第IV组(碱性侧链)：asn，gin，his，lys，arg；第V组(影响链取向的残基)：gly，pro；和第VI族(芳族侧链)：trp，tyr，phe。保守取代包括在同一种类的氨基酸之间的取代。将这些种类中一个种类的成员交换为另一个种类的成员构成非保守取代。
用通过Kabat编号惯例(用于可变区)或通过EU编号(用于恒定区)最大程度比对的抗体序列确定序列同一性百分比。在比对之后，如果将受试者抗体区域(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域进行比较，则受试者抗体区域和参考抗体区域之间的序列同一性百分比为受试者抗体区域和参考抗体区域中相同氨基酸占据的位置数除以两个区域的比对位置的总数，并乘以100以转换为百分比，其中未计数空位。其它序列的序列同一性可以通过使用算法，如威斯康星州麦迪逊575科学博士，遗传计算机组，威斯康星遗传学软件包版本7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)中的BESTFIT、FASTA和TFASTA，使用默认空位参数，或通过检查，和最佳比对(即，在比较窗口中产生最高序列相似性百分比)来确定。序列同一性百分比是通过以下步骤计算的：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中出现相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的总的位置数(即窗口尺寸)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
“包含”一个或多个所记载的要素的组合物或方法可以包括未具体记载的其他要素。例如，包含抗体的组合物可以包含单独的抗体或与其他成分组合的抗体。
术语“抗体依赖性细胞毒性”或ADCC是诱导细胞死亡的机制，其取决于外面覆有抗体的靶细胞(即，具有结合的抗体的细胞)与具有细胞溶解活性的免疫细胞(也称为效应细胞)的相互作用。这种效应细胞包括自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。ADCC由与细胞结合的抗体的Fc区与免疫效应细胞(例如嗜中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞)上的Fcy受体(特别是FcγRI和FcγRIII)之间的相互作用触发。根据介导的效应细胞类型，通过吞噬作用或细胞溶解来消除靶细胞。外面覆有抗体的靶细胞死亡的发生是效应细胞活性的结果。
术语调理作用(opsonization)也称为“抗体依赖性细胞吞噬作用”或ADCP，是指外面覆有抗体的细胞被与免疫球蛋白Fc区结合的吞噬免疫细胞(例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)完全或部分内化的过程。
术语“补体依赖性细胞毒性”或CDC是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应子结构域激活一系列酶促反应，最终在靶细胞膜中形成孔。通常，抗原-抗体复合物(例如外面覆有抗体的靶细胞上的抗原-抗体复合物)结合并激活补体成分Clq，补体成分Clq转而激活导致靶细胞死亡的补体级联反应。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，通过结合白细胞上的补体受体(例如CR3)来促进ADCC。
人源化抗体是基因工程抗体，其中将来自非人“供体”抗体的CDR移植到人“受体”抗体序列中(参见例如Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539,Carter,US 6,407,213,Adair,US 5,859,205 6,881,557,Foote,US 6,881,557)。受体抗体序列可以是例如人的成熟抗体序列，这些序列的复合物，人抗体序列的共有序列或胚系区(germline region)序列。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的一些或全部CDR以及可变区框架序列和恒定区(如果存在，完全或基本上来自人抗体序列)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个、通常全部三个CDR，以及重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在，基本上来自人重链可变区框架序列和恒定区序列)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个、通常全部三个CDR，以及轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在，基本上来自人轻链可变区框架序列和恒定区序列)。不同于纳米抗体和dAb，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当各CDR之间至少85％、90％、95％或100％的相应残基(如Kabat所定义的)相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的相应CDR。当至少85％，90％，95％或100％的由Kabat定义的相应残基相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区基本上分别来自人可变区框架序列或人恒定区。
尽管人源化抗体通常包含来自小鼠抗体的所有六个CDR(其可以由Kabat定义)，但它们也可以用少于所有六个CDR制成(例如，来自小鼠抗体的至少3、4或5个CDR)(例如，DePascalis R,Iwahashi M,Tamura M,等人2002.Grafting ―Abbreviated”Complementary-Determining Regions Containing Specificity-Determining Residues Essential forLigand Contact to Engineer a Less Immunogenic Humanized Monoclonal Antibody.JImmunol.169:3076-3084；Vajdos FF,Adams CW,Breece TN,Presta LG,de Vos AM,Sidhu,SS.2002.Comprehensive functional maps of the antigen-binding site of an anti-ErbB2antibody obtained with shotgun scanning mutagenesis.J Mol Biol.320:415–428；Iwahashi M,Milenic DE,Padlan EA,等人1999.CDR substitutions of a humanizedmonoclonal antibody (CC49):Contributions of individual CDRs to antigenbinding and immunogenicity.Mol Immunol.36:1079-1091；Tamura M,Milenic DE,Iwahashi M,等人2000.Structural correlates of an anticarcinoma antibody:Identification of specificity-determining regions(SDRs)and development of aminimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only.JImmunol.164:1432-1441)。
嵌合抗体是其中非人抗体(例如小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链恒定区和重链恒定区组合的抗体。这样的抗体基本上或完全保留小鼠抗体的结合特异性，并且为约三分之二的人序列。
镶嵌抗体(veneered antibody)是一类人源化抗体，其保留非人抗体的一些但通常是所有的CDR和非人抗体的一些非人可变区框架残基，但将可能构成B细胞表位或T细胞表位的其他可变区框架残基例如暴露的残基(Padlan EA.1991.A possible procedurefor reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preservingtheir ligand-binding properties.Mol Immunol.28:489-98)替换为来自人抗体序列相应位置的残基。结果得到这样的抗体：其中CDR完全或基本上来自非人抗体，且通过取代使非人抗体的可变区框架与人更加相似。人抗体可以从人中分离，或者由人免疫球蛋白基因的表达(例如，在转基因小鼠中，体外或通过噬菌体展示)产生。产生人抗体的方法包括以下的三源杂交瘤(trioma)方法： L,Pursch E.1983.Human x(mouse x human)hybridomas stably producing human antibodies.Hybridoma 2:361-367；美国专利号4,634,664；和Engleman等人，美国专利4,634,666，use of transgenic miceincluding human immunoglobulin genes(参见，例如Lonberg等人，W093/12227(1993)；US5,877,397,US 5,874,299,US 5,814,318,US 5,789,650,US 5,770,429,US 5,661,016,US5,633,425,US 5,625,126,US 5,569,825,US 5,545,806,Nature 148,1547-1553(1994),Nature Biotechnology 14,826(1996),Kucherlapati,WO 91/10741(1991))和噬菌体展示方法(参见，例如，Dower等人，WO 91/17271和McCafferty等人，WO 92/01047,US 5,877,218,US 5,871,907,US 5,858,657,US 5,837,242,US 5,733,743和US 5,565,332)。
“聚合物”是指连接在一起的一系列单体基团。聚合物由多个单元的单一单体(均聚物)或不同单体(杂聚物)组成。高分子量(High MW)聚合物由包括但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基吡啶、乙烯基吡咯烷酮和乙烯基酯(如乙酸乙烯酯)的单体制备。另外的单体可用于高MW聚合物。当使用两种不同的单体时，这两种单体被称为“共聚单体(comonomer)”，这意味着不同的单体共聚合形成单一聚合物。聚合物可以是线性的或支化的。当聚合物是枝化聚合物时，每条聚合物链被称为“聚合物臂”。与引发剂部分连接的聚合物臂的末端为近端，聚合物臂的增长链端为远端。在聚合物臂的增长链端上，聚合物臂端基团可以为自由基清除剂(radical scavenger)或另一基团。
“引发剂”是指能够引发单体或共聚单体聚合的化合物。聚合可以是常规的自由基聚合或可控/“活性”自由基聚合，例如原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂-终止(RAFT)聚合或氮氧自由基介导的聚合(NMP)。聚合可以是“假”可控聚合，例如退化转移。当引发剂适用于ATRP时，其包含不稳定键，该不稳定键可以被均裂以形成引发剂片段I(能够引发自由基聚合的基团)，以及自由基清除剂I’，其与聚合物增长链的自由基反应以可逆地终止聚合。自由基清除剂I’通常是卤素，但也可以是有机部分，例如腈。在一些实施方案中，引发剂含有一个或多个2-溴异丁酸酯基团作为ATRP聚合的位点。
“化学接头”是指将两个基团连接在一起的化学部分，例如半衰期延长部分和蛋白质。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头可以是可水解的、可酶解的、pH敏感的、光不稳定的或二硫化物接头等。其它接头包括同双功能(homobifunctional)接头和异双功能(heterobifunctional)接头。“连接基团”为能够形成由一个或多个与生物活性剂连接的键组成的共价连接的官能团。非限制性实例包括WO2013059137的表1中所示的那些(通过引用并入本文)。
术语“反应性基团”是指在合适的反应条件下能够与另一化学基团反应以形成共价键(即共价反应)的基团，并且通常表示与另一种物质的连接点。反应性基团为一部分，例如马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯，能够与不同部分上的官能团进行化学反应以形成共价键。反应性基团通常包括亲核体、亲电体和可光活化基团。
“磷酸胆碱”，也表示为“PC”，是指以下结构：
其中*表示连接点。磷酸胆碱为两性离子基团且包括盐(如内盐)及其质子化和脱质子化形式。
“含磷酸胆碱的聚合物”是含有磷酸胆碱的聚合物。“含两性离子的聚合物”是指含有两性离子的聚合物。
含有聚(丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)的聚合物是指含有2-(丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯(HEA-PC，示于下面实施例6中)作为单体的聚合物。
含有聚(甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)的聚合物是指含有2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯(HEMA-PC或MPC)作为单体的聚合物(见下文)
如本文所用，“MPC”和“HEMA-PC”是可互换的。
在聚合物的上下文中，“分子量”可以表示为数均分子量或重均分子量或峰值分子量。除非另有说明，本文中所有提及的分子量是指峰值分子量。这些分子量测定，即数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和峰值分子量(Mp)的测定，可以使用尺寸排阻色谱或其它液相色谱技术测量。也可以使用测量分子量值的其它方法，例如使用端基分析或测量依数性(例如凝固点降低、沸点升高或渗透压)以确定数均分子量，或使用光散射技术、超速离心或粘度测定法来确定重均分子量。在一些实施方案中，通过SEC-MALS(尺寸排阻色谱-多角度光散射)测量分子量。在一些实施方案中，聚合物试剂通常是多分散的(即聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，并且具有例如小于约1.5的低多分散性值(例如通过从SEC-MALS测量结果推导出的PDI值所判断的)。在一些实施方案中，多分散性(PDI)在约1.4至约1.2的范围内。在一些实施方案中，PDI小于约1.15，1.10，1.05或1.03。
短语“一种”实体是指一种或多种该实体；例如，一种化合物是指一种或多种化合物或至少一种化合物。因此，术语“一种”、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。
“约”是指在不同仪器、样品和样品制备物之间进行的测量中可能看到的偏差。
“受保护的”、“保护形式”、“保护基团”和“保护性基团”是指存在防止或阻断分子中特定化学反应性官能团在某些反应条件下的反应的基团(即保护基团)。保护基团根据所保护的化学反应基团的类型以及要使用的反应条件和分子中其他的反应性基团或保护基团的存在(如果有的话)而不同。合适的保护基团包括例如专著Greene等人，―ProtectiveGroups In Organic Synthesis,”第3版，John Wiley and Sons,Inc.,New York,1999中记载的那些。
“烷基”是指具有指定碳原子数的直链或支链的饱和脂族基团。例如，C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基包括但不限于：庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可包括任何数目的碳，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。烷基通常是一价的，但可以是二价的，例如当烷基将两个部分连接在一起时。
上文和下文中提及的与有机基团或化合物有关的术语“低级”分别定义可以为支链或非支链的化合物或基团，其具有至多且包括7个碳原子，或至多且包括4个碳原子和(如非支链的)一个或两个碳原子。
“亚烷基”是指如上定义连接至少两个其它基团的烷基，即二价烃基。连接到亚烷基的两个部分可以连接到亚烷基的相同原子或不同原子。例如，直链亚烷基可以是-(CH2)n二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。亚烷基包括但不限于亚甲基，亚乙基，亚丙基，亚异丙基，亚丁基，亚异丁基，亚仲丁基，亚戊基和亚己基。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基，烯基，杂亚烷基，杂烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自以下的各种基团：-OR’，＝O，＝NR’，＝N-OR’，-NR’R”，-SR’，-卤素，-SiR’R”R”’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R”’，-NR”C(O)2R’，-NH-C(NH2)＝NH，-NR’C(NH2)＝NH，-NH-C(NH2)＝NR’，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R”，-CN和-NO2，其数量范围为0到(2m’+1)，其中m’是这种基团中的碳原子总数。R’、R”和R”’各自独立地是指氢，未取代的(C1-C8)烷基和杂烷基，未取代的芳基，1-3个卤素取代的芳基，未取代的烷基，烷氧基或硫代烷氧基或芳基-(C1-C4)烷基。当R’和R”连接至相同的氮原子时，它们可以与氮原子组合形成5元环、6元环或7元环。例如，-NR’R”意在包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。术语“烷基”包括例如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3，-C(O)CF3，-C(O)CH2OCH3等)的基团。在一些实施方案中，取代的烷基和杂烷基具有1-4个取代基。在一些实施方案中，取代的烷基和杂烷基具有1、2或3个取代基。除了那些全卤代烷基(例如，五氟乙基等)。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基，烯基，杂亚烷基，杂烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自但不限于以下的各种基团中的一种或多种：-OR’，＝O，＝NR’，＝N-OR’，-NR’R”，-SR’，-卤素，-SiR’R”R”’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R”’，-NR”C(O)2R’，-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””，-NR-C(NR’R”)＝NR’”，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R”，-NRSO2R’，-CN和–NO2，其数量范围为0到(2m’+1)，其中m’是这种基团中的碳原子总数。R’、R”、R”’和R””各自独立地指氢，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的芳基(例如1-3个卤素取代的芳基)，取代或未取代的烷基，烷氧基或硫代烷氧基，或芳烷基。当化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，各R基团独立地选择为R’、R”、R’”和R””基团。当R’和R”连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子组合形成5元环、6元环或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述取代基的讨论中，本领域技术人员会理解术语“烷基”意在包括包含与氢原子以外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如-CF3和–CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3，-C(O)CF3，-C(O)CH2OCH3等)。
“烷氧基”是指具有氧原子的烷基，所述氧原子将烷氧基连接到连接点或与烷氧基的两个碳连接。烷氧基包括例如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，2-丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，己氧基等。烷氧基可以进一步被本文所述各种取代基取代。例如，烷氧基可以被卤素取代以形成“卤代烷氧基”。
“羧基烷基”是指被羧基取代的烷基(如本文所定义)。术语“羧基环烷基”是指被羧基取代的环烷基(如本文所定义)。术语烷氧基烷基是指被烷氧基取代的烷基(如本文所定义)。本文使用的术语“羧基”是指羧酸及其酯。
“卤代烷基”是指其中一些或所有氢原子被卤素原子取代的如上定义的烷基。卤素(卤代)表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟苯基等。术语“全氟”定义为所有可用的氢均被氟取代的化合物或基团。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基，全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。
“氟取代的烷基”是指其中一个、一些或所有氢原子被氟取代的烷基。
“细胞因子”是可在免疫和炎症反应中参与细胞间通讯的一组蛋白信号分子的成员。细胞因子通常是质量为约8-35kDa的小的水溶性糖蛋白。
“环烷基”是指含有约3-12个、3-10个或3-7个环内(endocyclic)碳原子的环状烃基。环烷基包括稠合环结构、桥环结构和螺环结构。
“环内”是指包含环状环结构的部分的原子或原子组。
“环外”是指连接但不限定环状环结构的原子或原子组。
“环状烷基醚”是指具有3个或4个环内碳原子和1个环内氧原子或硫原子的4元或5元环状烷基(例如，氧杂环丁烷，硫杂环丁烷，四氢呋喃，四氢噻吩)；或具有1个或2个环内氧或硫原子的6元至7元环状烷基(例如四氢吡喃，1,3-二噁烷，1,4-二噁烷，四氢噻喃，1,3-二噻烷，1,4-二噻烷，1,4-氧硫杂环己烷)。
“烯基”是指具有至少一个双键的2-6个碳原子的直链或支链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基，丙烯基，异丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，异丁烯基，丁二烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，异戊烯基，1,3-戊二烯基，1,4-戊二烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，1,3-己二烯基，1,4-己二烯基，1,5-己二烯基，2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基还可以具有2-3，2-4，2-5，3-4，3-5，3-6，4-5，4-6和5-6个碳。烯基通常是一价的，但可以是二价的，例如当烯基将两个部分连接在一起时。
“亚烯基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的烯基，即二价烃基。与亚烯基连接的两个部分可以连接到亚烯基的相同原子或不同原子。亚烯基包括但不限于亚乙烯基，亚丙烯基，异亚丙烯基，亚丁烯基，异亚丁烯基，仲亚丁烯基，亚戊烯基和亚己烯基。
“炔基”是指具有具有至少一个三键的2-6个碳原子的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基，丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，异丁炔基，仲丁炔基，丁二炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，异戊炔基，1,3-戊二炔基，1,4-戊二炔基，1-己炔基，2-己炔基，3-己炔基，1,3-己二炔基，1,4-己二炔基，1,5-己二炔基，2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基还可以具有2-3，2-4，2-5，3-4，3-5，3-6，4-5，4-6和5-6个碳。炔基通常是一价的，但可以是二价的，例如当炔基将两个部分连接在一起时。
“亚炔基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的炔基，即二价烃基。连接到亚炔基的两个部分可以连接到亚炔基的相同原子或不同原子。亚炔基包括但不限于亚乙炔基，亚丙炔基，亚丁炔基，亚仲丁炔基，亚戊炔基和亚己炔基。
“环烷基”是指含有3-12个环原子或指定原子数的饱和或部分不饱和的，单环，稠合双环或桥连多环组合体。单环包括例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环辛基。双环和多环包括例如降莰烷(norbornane)，十氢萘和金刚烷。例如，C3-8环烷基包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环辛基和降莰烷。
“环亚烷基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的环烷基，即二价烃基。连接到环亚烷基的两个部分可以连接到环亚烷基的相同原子或不同原子。环亚烷基包括但不限于环亚丙基，环亚丁基，环亚戊基，环亚己基和环亚辛基。
“杂环烷基”是指具有3个环成员至约20个环成员和1个至约5个例如N，O和S的杂原子的环系。也可以用其他的杂原子，包括但不限于B，Al，Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂环包括但不限于四氢呋喃基，四氢噻吩基，吗啉代，吡咯烷基，吡咯啉基，咪唑烷基，咪唑啉基，吡唑烷基，吡唑啉基，哌嗪基，哌啶基，二氢吲哚基，奎宁环基和1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基。
“杂环亚烷基”是指连接至少两个其它基团的如上所定义的杂环烷基。连接到杂环亚烷基的两个部分可以连接到杂环亚烷基的相同原子或不同原子。
“芳基”是指含有6-16个环碳原子的单环或稠合双环、三环或更大的芳族环组合体。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基。“亚芳基”是指衍生自芳基的二价基团。芳基可以被一个、两个或三个基团单取代、双取代或三取代，所述基团选自烷基，烷氧基，芳基，羟基，卤素，氰基，氨基，氨基烷基，三氟甲基，亚烷基二氧基和氧-C2-C3亚烷基，所有这些基团任选地进一步被取代，例如如上文所定义；或1-萘基或2-萘基；或1-菲基或2-菲基。亚烷基二氧基是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如亚甲二氧基或亚乙二氧基。氧-C2-C3亚烷基也是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如氧亚乙基或氧亚丙基。氧-C2-C3-亚烷基-苯基的实例为2,3-二氢苯并呋喃-5-基。
在一些实施方案中，芳基为萘基，苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单取代或双取代的苯基，特别是苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或双取代的苯基，特别是苯基。
作为R的取代苯基的实例为例如4-氯苯-1-基，3,4-二氯苯-1-基，4-甲氧基苯-1-基，4-甲基苯-1-基，4-氨基甲基苯-1-基，4-甲氧基乙基氨基甲基苯-1-基，4-羟乙基氨基甲基苯-1-基，4-羟乙基-(甲基)-氨基甲基苯-1-基，3-氨基甲基苯-1-基，4-N-乙酰基氨基甲基苯-1-基，4-氨基苯-1-基，3-氨基苯-1-基，2-氨基苯-1-基，4-苯基-苯-1-基，4-(咪唑-1-基)苯基，4-(咪唑-1-基甲基)苯-1-基，4-(吗啉-1-基)-苯-1-基，4-(吗啉-1-基甲基)苯-1-基，4-(2-甲氧基乙基氨基甲基)苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)苯-1-基，4-噻吩基-苯-1-基，4-(3-噻吩基)-苯-1-基，4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯-1-基和杂环任选地被取代的4-(哌啶基)-苯基和4-(吡啶基)-苯基。
“亚芳基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的芳基。连接到亚芳基的两个部分是连接到亚芳基的不同原子。亚芳基包括但不限于亚苯基。
“亚芳基-氧基”是指如上定义的亚芳基基团，其中连接到亚芳基的两个部分之一通过氧原子连接。亚芳基-氧基包括但不限于亚苯基-氧基。
类似地，芳基和杂芳基的取代基是多样的并且选自：-卤素，-OR’，-OC(O)R’，-NR’R”，-SR’，-R’，-CN，-NO2，-CO2R’，-CONR’R”，-C(O)R’，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR”C(O)2R’，，-NR’-C(O)NR”R”’，-NH-C(NH2)＝NH，-NR’C(NH2)＝NH，-NH-C(NH2)＝NR’，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R”，-N3，-CH(Ph)2，全氟(C1-C4)烷氧基和全氟(C1-C4)烷基，数量范围为从0到芳族环系上的开放化合价的总数；并且其中R’、R”和R”’独立地选自氢，(C1-C8)烷基和杂烷基，未取代芳基和杂芳基，(未取代芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代芳基)氧基-(C1-C4)烷基。
芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CH2)q-U-的取代基替代，其中T和U独立地为-NH-、-O-、-CH2-或单键，且q为0-2的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基替代，其中A和B独立地为-CH2-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2NR’-或单键，并且r为1-3的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键代替。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CH2)s-X-(CH2)t-的取代基替代，其中s和t独立地为0-3的整数，X为-O-，-NR’-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-或-S(O)2NR’-。-NR’-和-S(O)2NR’-中的取代基R’选自氢或未取代的(C1-C6)烷基。
“杂芳基”是指含有5-16个环原子的单环或稠合双环或三环芳香环组合体，其中1-4个环原子为杂原子，各自为N、O或S。例如，杂芳基包括吡啶基，吲哚基，吲唑基，喹喔啉基，喹啉基，异喹啉基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，呋喃基，吡咯基，噻唑基，苯并噻唑基，噁唑基，异噁唑基，三唑基，四唑基，吡唑基，咪唑基，噻吩基或任何其它被例如烷基，硝基或卤素取代(尤其是单取代或双取代)的基团。吡啶基表示2-吡啶基，3-吡啶基或4-吡啶基，有利地表示2-吡啶基或3-吡啶基。噻吩基表示2-噻吩基或3-噻吩基。在一些实施方案中，喹啉基代表2-喹啉基，3-喹啉基或4-喹啉基。在一些实施方案中，异喹啉基代表1-异喹啉基，3-异喹啉基或4-异喹啉基。在一些实施方案中，苯并吡喃基，苯并噻喃基可分别代表3-苯并吡喃基或3-苯并噻喃基。在一些实施方案中，噻唑基可代表2-噻唑基或4-噻唑基。在一些实施方案中，三唑基可以是1-三唑基，2-三唑基或5-(1,2,4-三唑基)。在一些实施方案中，四唑基可以是5-四唑基。
在一些实施方案中，杂芳基为吡啶基，吲哚基，喹啉基，吡咯基，噻唑基，异噁唑基，三唑基，四唑基，吡唑基，咪唑基，噻吩基，呋喃基，苯并噻唑基，苯并呋喃基，异喹啉基，苯并噻吩基，噁唑基，吲唑基或任何被取代的(特别是单取代或二取代的)所述基团。
术语“杂烷基”是指具有1-3个例如N、O和S的杂原子的烷基。也可以使用其他杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂烷基可以包括醚、硫醚、烷基胺和烷基硫醇。
术语“杂亚烷基”是指连接至少两个其它基团的如上所定义的杂烷基。连接到杂亚烷基的两个部分可以连接到杂亚烷基的相同原子或不同原子。
“亲电体”是指这样的离子或原子或原子集合，其可以是离子的，具有亲电中心，即寻找电子，能够与亲核体反应的中心。亲电体(或亲电试剂)为通过从其反应配体(reactionpartner)接受两个成键电子而与该反应配体(亲核体)形成键的试剂。
“亲核体”是指这样的离子或原子或原子集合，其可以是离子的，具有亲核中心，即寻求亲电中心或能够与亲电体反应的中心。亲核体(或亲核试剂)是通过提供两个成键电子与其反应配体(亲电体)形成键的试剂。“亲核基团”是指与反应性基团反应之后的亲核体。非限制性实例包括氨基，羟基，烷氧基，卤代烷氧基等。
“马来酰亚胺基”是指具有以下结构的吡咯-2,5-二酮-1-基：
其在与巯基(例如硫代烷基)反应时形成具有如下结构的-S-马来酰亚胺基：
其中“·”表示马来酰亚胺基团的连接点，表示硫醇的硫原子与原始的含巯基基团的其余部分的连接点。
为了本发明的目的，在蛋白质和多肽中发现的“天然存在的氨基酸”为L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酰胺，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和/或L-缬氨酸。在蛋白质中发现的“非天然存在的氨基酸”为除了那些记载为天然存在的氨基酸以外的任何氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D异构体，以及天然存在的氨基酸的D异构体和L异构体的混合物。对于其它氨基酸，例如N-α-甲基氨基酸(例如肌氨酸)，4-羟脯氨酸，锁链素，异锁链素，5-羟赖氨酸，ε-N-甲基赖氨酸，3-甲基组氨酸，虽然其发现于天然存在的蛋白质中，但为了本发明的目的，被认为是蛋白质中发现的非天然存在的氨基酸，因为它们通常通过mRNA的核糖体翻译以外的手段引入。
涉及聚合物的几何形状、架构或整体结构时，“线性”是指具有单个聚合物臂的聚合物。
涉及聚合物的几何形状、架构或整体结构时，“支化(branched)”是指具有从包含在引发剂内的芯结构延伸的2个或更多个聚合物“臂”的聚合物。引发剂可以用于原子转移自由基聚合(ATRP)反应。支化聚合物可具有2个聚合物链(臂)、3个聚合物臂、4个聚合物臂、5个聚合物臂、6个聚合物臂、7个聚合物臂、8个聚合物臂、9个聚合物臂或更多个聚合物臂。每个聚合物臂从聚合物引发位点延伸。每个聚合物引发位点是可通过加入单体增长聚合物链的位点。例如但不限于，使用ATRP，引发剂上的聚合物引发位点通常是经历由过渡金属化合物(如卤化亚铜)催化的可逆氧化还原过程的有机卤化物。在一些实施方案中，该卤化物为溴。
“药学上可接受的赋形剂”是指可以包含在组合物中并且对患者没有显著不利的毒理学作用并且被FDA批准或可批准用于治疗用途(特别是在人类中)的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖等。
以有效方案施用治疗性蛋白质是指延迟病症发作、降低病症严重性、抑制病症进一步恶化和/或改善病症的至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果患者已经患有病症，则该方案可以称为治疗有效的方案。如果患者相对于一般群体处于高患病风险但尚未发现症状，则该方案可以被称为预防有效的方案。在一些情况下，相对于同一患者的历史对照或以往经历，可以在该个体患者中观察到治疗功效或预防功效。在其它情况下，相对于未治疗患者的对照群体，可在临床前或临床试验中在经治疗的患者群体中证明治疗功效或预防功效。
物质的“生物半衰期”是药代动力学参数，其说明在物质引入后一半物质从组织或生物体中除去所需的时间。
“OG1786”是用于聚合物合成的具有图30所示结构的9-臂引发剂，图30描述了OG1786与三氟乙酸形成的盐形式。OG1786可作为其它盐或作为游离碱使用。
“OG1801”是采用OG1786作为ATRP合成引发剂并采用单体HEMA-PC制备的约(+/-15％)750kDa的聚合物(Mn或Mp)。
“OG1802”是增加马来酰亚胺官能团的OG1801，如图36所示，其中n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9各自是整数(正数)(从0直到约3000)，使得聚合物的总分子量为750,000±15％道尔顿(Mw)。
多角度光散射(MALS)是分析大分子的技术，其中激光撞击在分子上，光的振荡电场在其内部引起振荡偶极子。该振荡偶极子将重新辐射光并且可以使用例如WyattminiDawn TREOS的MALS检测器来测量。辐射光的强度取决于在大分子中诱导的偶极子的大小，其反过来与大分子的极化性成比例，诱导的偶极子越大，因此散射光的强度越大。因此，为了分析来自这种大分子溶液的散射，人们应该知道它们相对于周围介质(例如溶剂)的极化性。这可以通过测量溶液折射率n的变化Δn，与分子浓度变化Δc，通过使用WyattOptilab T-rEX差示折射计测量dn/dc(＝Δn/Δc)值来确定。MALS测定采用的两个摩尔重量参数为数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)，其中多分散指数(PDI)等于Mw除以Mn。SEC还允许另一种平均分子量测定，峰值分子量Mp，其定义为SEC处最高峰的分子量。
PDI用作聚合物和生物缀合物的分子量分布宽度的量度，所述生物缀合物衍生自离散蛋白质(例如OG1950)与多分散生物聚合物(例如，OG1802)的缀合。对于蛋白质样品，其多分散性接近1.0，因为它是翻译产物，其中溶液中的每个蛋白质分子预期具有几乎相同的长度和摩尔质量。相反，由于生物聚合物的多分散性质，其中聚合过程中合成了不同长度的聚合物链，因此将样品的PDI确定为其分子量窄分布的质量属性之一是非常重要的。
尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)是一种色谱技术，其中溶液中的分子根据它们的大小而分开。通常，施加水性溶液以将样品输送通过填充有各种孔径的树脂的柱。预期在分析物通过柱时，树脂对分析物呈惰性，并且分析物基于其独特的尺寸和所选柱的孔径特征而彼此分离。
将SEC与MALS或SEC/MALS偶联可提供摩尔质量和大小(均方根半径)的精确分布，而不是依赖于一组SEC校准用标准。与传统的柱校准方法相比，这种类型的布置具有许多优点。由于测量每种洗脱级分的光散射和浓度，因此可以独立于洗脱位置而确定摩尔质量和大小。这对于具有非球形大分子的物种尤其重要，例如生物聚合物(OG1802)或生物缀合物(OG1953)；这些物种通常不会以可能由一组柱校准标准描述的方式洗脱。
在一些实施方案中，SEC/MALS分析包括具有Alliance 2695溶剂递送模块的Waters HPLC系统和配备有Shodex SEC-HPLC柱(7.8×300mm)的Waters 2996光电二极管阵列检测器。它与Wyatt miniDawn TREOS和Wyatt Optilab T-rEX差示折光仪在线连接。Waters的Empower软件可以用于控制Waters HPLC系统，Wyatt的ASTRA V 6.1.7.16软件可用于从Wyatt miniDawn TREOS获取MALS数据，从T-rEX检测器获取dn/dc数据，并使用A280吸光度信号从Waters 2996光电二极管阵列探测器获取质量恢复数据(mass recoverydata)。SEC可以在1xPBS pH 7.4中在样品注射后以1ml/min进行，可以通过ASTRA软件分析MALS和RI信号以测定绝对摩尔质量(Mp，Mw，Mn)和多分散指数(PDI)。此外，计算还涉及聚合物和蛋白质的输入dn/dc值，分别为0.142和0.183。对于OG1953生物缀合物dn/dc值，使用下式，基于聚合物和蛋白质的加权MW计算dn/dc为约0.148：
缀合物dn/dc＝0.142x[MW聚合物/(MW聚合物+MW蛋白)]+0.183x[MW蛋白/(MW聚合物+MW蛋白)]
其中OG1802的MW聚合物为800kDa，OG1950的MW蛋白为146kDa。
概述
本文提供了抗-VEGF抗体及其缀合物。在一些实施方案中，抗体本身不同于其他抗-VEGF剂并且提供优于其他抗-VEGF剂的优异结果。在一些实施方案中，抗-VEGF抗体缀合物显示出优于其他抗体和/或对其他抗体缀合物的活性的预期的惊人优势。
历史上，将分子与蛋白质缀合通常导致蛋白质与其预期靶标的结合相互作用降低。在本公开的一些实施方案中，当缀合到活性位点外部的位置时，不一定观察到与预期相同的降低水平。本文提供的证据表明与可能预期的相反的效果。在一些实施方案中，并且不打算受理论限制，缀合物可优于单独的抗体。例如，配体与其特异性受体的相互作用通常通过配体和受体的立体特异性相互作用驱动，如配体上的亲水性氨基酸与受体上的亲水性氨基酸的相互作用所示的，水分子是这些相互作用的前沿和中心。同时，通过不再强调(de-emphasize)和/或抑制通常由疏水-疏水氨基酸介导/产生的非特异性疏水相互作用，进一步增强了这种亲水性立体特异性。
在一些实施方案中，提供了这样的抗-VEGF抗体缀合物，其能够阻断VEGF配体(“VEGFL”)和VEGF-受体(“VEGFR”)之间的至少90％的相互作用。例如，它可以阻断VEGFR和VEGFL之间的至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99相互作用或实际上所有相互作用。在一些实施方案中，所述阻断发生在饱和浓度下。在一些实施方案中，提供了这样的抗-VEGF抗体缀合物，其阻断VEGF配体和VEGF-受体之间的至少95％的相互作用。作为阻断的这种优越性的实例，参见图20，其关于OG1953(和本文提供的抗体缀合物)比(雷珠单抗)或(贝伐单抗)或甚至抗体OG1950(未缀合的)更高程度地阻断的能力。实际上，这一结果是出乎意料的，因为虽然向抗体添加聚合物(以形成抗体缀合物)，可预计会对抗体的结合/活性产生一些或没有不利影响，但出乎意料的是，它实际上会以这种方式改善抗体的阻断能力。
在一些实施方案中，所述抗体或其缀合物抑制至少70，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％的VEGFR和VEGFL之间的活性和/或相互作用。在一些实施方案中，IC50值可以是0.1，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，100nM或小于前述值的任意一个或多个。在一些实施方案中，KD可以是2*10^-13，1*10^-13，1*10^-12，1*10^-11，1*10-^10M或小于任意一个前述值。在一些实施方案中，IC50值可以是1，5，10，20，30，40，50，60，70 80，90，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1,000，1,100，1,200，1,300，或小于任意一个前述值。
在一些实施方案中，提供了这样的抗-VEGF抗体，其阻断VEGF配体和VEGF-受体之间的至少90％的相互作用。例如，它可以阻断VEGFR和VEGFL之间的至少91，92，93，94，95，96，97，98，99相互作用或实际上所有相互作用。作为阻断的这种优越性的实例，参见图20，其关于OG1950(和本文提供的抗体)比(雷珠单抗)或(贝伐单抗)更高程度地阻断的能力。
在一些实施方案中，可通过本文所述的一种或多种方法，将其他抗体，例如(雷珠单抗)或(贝伐单抗)与本文所述的一种或多种聚合物缀合。在一些实施方案中，可通过本文所述的一种或多种方法，将任意抗体或其片段与本文所述的一种或多种聚合物缀合。
在一些实施方案中，抗体包含重链氨基酸可变区，其包含SEQ ID NO 1和轻链氨基酸可变区，其包含SEQ ID NO.2。在一些实施方案中，抗体与本文提供的一种或多种聚合物缀合。在一些实施方案中，缀合的抗体与SEQ ID NO：1和/或2至少90％一致。在一些实施方案中，抗体含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的6个CDR，以及L443C(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)的点突变。在一些实施方案中，缀合的抗体与SEQ ID NO：1和/或2至少90％一致并且包括以下突变：L234A、L235A和G237A(EU编号)，以及至少一种以下突变：Q347C(EU编号)或L443C(EU编号)。
在一些实施方案中，提供了结合VEGF-A的抗体。所述抗体包含CDRH1，即SEQ IDNO：1中的CDRH1，CDRH2，即SEQ ID NO：1中的CDRH2，CDRH3，即SEQ ID NO：1中的CDRH3，CDRL1，即SEQ ID NO：2中的CDRL1，CDRL2，即SEQ ID NO：2中的CDRL2，CDRL3，即SEQ ID NO：2中的CDRL3，至少一种以下突变：L234A，L235A和G237A(EU编号)，以及至少一种以下突变：Q347C(EU编号)或L443C(EU编号)。
如本领域技术人员将理解的，根据本说明书，本文提供的任意抗体均可以与本文提供的任意聚合物缀合和/或本文提供的任意抗体均可以添加半胱氨酸以使其允许用于与聚合物的位点特异性缀合。
“VEGF”或“血管内皮生长因子”是影响血管生成或血管生成过程的人血管内皮生长因子。具体地，术语VEGF意指以下生长因子类别中的任意成员：(i)其结合VEGF受体，例如VEGFR-1(Flt-1)，VEGFR-2(KDR/Flk-1)或VEGFR-3(FLT-4)；(ii)其激活与VEGF受体相关的酪氨酸激酶活性；并且(iii)由此其影响血管生成或血管生成过程。
VEGF家族的因子由以下五种相关糖蛋白组成：VEGF-A(也称为VPE)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PGF(胎盘生长因子)。其中，VEGF-A是研究最充分的，并且是抗血管生成治疗的靶标。Ferrara等人，(2003)Nat.Med.9:669-676。VEGF-A以许多不同同种型存在，其通过可变剪接和蛋白水解产生：VEGF-A206、VEGF-A189、VEGF-A165和VEGF-A121。同种型在结合肝素和称为神经纤毛蛋白(neuropilins)的非信号结合蛋白的能力方面有所不同。同种型作为二聚体均具有生物活性。
VEGF的各种作用由VEGF(例如VEGF-A(P15692)、VEGF-B(P49766)、VEGF-C(P49767)和VEGF-D(Q43915))与受体酪氨酸激酶(RTK)的结合介导。VEGF家族受体属于V类RTK，且每种受体在细胞外结构域(ECD)中携带七个Ig样结构域。在人类中，VEGF结合三种类型的RTK：VEGFR-1(Flt-1)(P17948)、VEGFR-2(KDR，Flk-1)(P935968)和VEGFR-3(Flt-4)(P35916)。除非上下文中另有说明，否则提及的VEGF意指VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PGF中的任一种的任何天然同种型或天然变体或与天然形式具有至少90％、95％、98％或99％或100％序列同一性的诱导变体。在一些实施方案中，这样的VEGF是人VEGF。同样提及的VEGFR是指VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3的任一种，包括任何天然同种型或天然变体，或与天然序列具有至少90％、95％、98％或99％或100％序列同一性的诱导变体。
已经批准VEGF拮抗剂疗法用于治疗某些癌症和湿性AMD。贝伐单抗(AVASTIN，Genentech/Roche)是人源化小鼠单克隆抗体，其结合并中和人VEGF，特别是VEGF-A的所有同种型和VEGF-A的生物活性蛋白水解片段。参见，例如，Ferrara N,Hillan KJ,Gerber HP,Novotny W.2004.Discovery and development of bevacizumab,an anti-VEGF-Antibodyfor treating cancer.Nat Rev Drug Discov.3(5):391-400。贝伐单抗已被批准用于治疗某些癌症。贝伐单抗(DrugBank DB00112)的重链和轻链的蛋白质序列在SEQ ID NO.3(重)和SEQ ID NO.4(轻)中列出。
贝伐单抗可变轻链CDR为CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)，CDRL2：FTSSLHS(SEQID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)。贝伐单抗可变重链CDR为CDRH1：GYTFTNYGMN,CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)，和CDRH3:YPHYYGSSHWYFDV。除了CDRH1使用Kabat/Chothia复合定义之外，CDR由Kabat定义。在一些实施方案中，可以将半胱氨酸添加至贝伐单抗序列，并且可以将抗体(和/或包括贝伐单抗的6个CDR的变体)与本文提供的任意一种或多种聚合物缀合。
衍生自与贝伐单抗相同的小鼠单克隆抗体的另一种抗-VEGF分子已经被批准用于治疗湿性AMD：雷珠单抗((雷珠单抗)，Genentech/Roche)。雷珠单抗是抗体片段或Fab。雷珠单抗由贝伐单抗的可变重链和轻链的亲和力成熟而产生。雷珠单抗(如Novartis所公布的)的重链和轻链的序列分别在SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中列出。在一些实施方案中，可以将半胱氨酸添加至雷珠单抗序列，并且可以将抗体(和/或包括雷珠单抗的6个CDR的变体)与本文提供的任意一种或多种聚合物缀合。
雷珠单抗CDR与贝伐单抗相同，除了在亲和力成熟后增加了改进：雷珠单抗可变轻链CDR为：CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)。雷珠单抗可变重链CDR为：CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)。
在一些实施方案中，呈现这样的抗体缀合物，其具有在抗体可变区外的半胱氨酸处与含磷酸胆碱的聚合物键合的抗-VEGF-A抗体，其中半胱氨酸已通过重组DNA技术添加。在一些实施方案中，聚合物与单个半胱氨酸键合。在一些实施方案中，“通过重组DNA技术添加”是使半胱氨酸残基取代在已知或现有抗体或共有抗体序列中在相同位置存在的非半胱氨酸氨基酸。因此，例如，当抗体是IgG1并且重链在EU位置443具有亮氨酸时，亮氨酸通过重组DNA技术用半胱氨酸替换(L443C，EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)。相应地，EU位置347处的天然IgG1序列是Q(谷氨酰胺)，并且通过重组DNA技术用半胱氨酸替换Q以产生Q347C。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体包含轻链和重链，其中重链具有Fc区。在一些实施方案中，半胱氨酸在Fc区中，并且抗-VEGF-A抗体是免疫球蛋白G(IgG)。在一些实施方案中，抗-VEGF-A重链具有CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，并且位置221(通过如SEQ IDNO.3中的顺序计数)是T，抗-VEGF-A轻链具有CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)，并且Kabat位置4为L。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A重链同种型是IgG1。在一些实施方案中，所述IgG1恒定结构域相对于IgG1恒定结构域(例如SEQ ID NO.3的恒定区)具有一个或多个突变以调节效应子功能。在一些实施方案中，效应子功能突变是以下中的一种或多种：E233X，L234X，L235X，G236X，G237X，A327X，A330X和P331X，其中X是任意天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，突变选自由以下组成的组(EU编号)：E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S和P331S。在一些实施方案中，抗体缀合物具有以下突变(EU编号)：L234A，L235A和G237A。
在一些实施方案中，半胱氨酸残基在抗-VEGF-A重链中并且为Q347C(EU编号)或L443C(EU编号)。在一些实施方案中，半胱氨酸残基是L443C(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)。在一些实施方案中，抗-VEGF-A重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ ID NO.2。
在一些实施方案中，含磷酸胆碱的聚合物包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵)乙基磷酸酯(MPC)单体，如下所述：
使得聚合物包含以下重复单元：
其中n是自1至3000的整数，波浪线表示聚合物中单体单元之间的连接点。
在一些实施方案中，聚合物具有三个或更多个臂，或者用包含3个或更多个聚合物引发位点的引发剂合成。在一些实施方案中，聚合物具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个臂，或者用包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个聚合物引发位点的引发剂合成。更优选地，聚合物具有3，6或9个臂，或者用包含3，6或9个聚合物引发位点的引发剂合成。在一些实施方案中，聚合物具有9个臂，或者用包含9个聚合物引发位点的引发剂合成。
在一些实施方案中，添加的聚合物的分子量在约300,000和约1,750,000Da(SEC-MAL)之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约500,000和约1,000,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约600,000至约900,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约750,000至约850,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约800,000至约850,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约750,000至约800,000Da之间。
在一些实施方案中，本文所述的任意抗体均可进一步与聚合物缀合以形成生物缀合物。生物缀合物的分子量(总共，SEC-MAL)可在约350,000和2,000,000道尔顿之间，例如在约450,000和1,900,000道尔顿之间，在约550,000和1,800,000道尔顿之间，在约650,000和1,700,000道尔顿之间，在约750,000和1,600,000道尔顿，在约850,000和1,500,000道尔顿之间，在约900,000和1,400,000道尔顿之间，在约950,000和1,300,000道尔顿之间，在约900,000和1,000,000道尔顿之间，在约1,000,000和1,300,000道尔顿之间，在约850,000和1,300,000道尔顿之间，在约850,000和1,000,000道尔顿之间,以及在约1,000,000和1,200,000道尔顿之间。
在一些实施方案中，抗体缀合物是经纯化的。在一些实施方案中，聚合物是抗体缀合物的一部分，是多分散的，即聚合物PDI不为1.0。在一些实施方案中，PDI小于1.5。在一些实施方案中，PDI小于1.4。在一些实施方案中，PDI小于1.3。在一些实施方案中，PDI小于1.2。在一些实施方案中，PDI小于1.1。
在一些实施方案中，抗体缀合物具有与聚合物键合的抗-VEGF-A免疫球蛋白G(IgG)，该聚合物包含MPC单体，其中抗-VEGF-A重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ ID NO.2，并且其中抗体仅在SEQ ID NO.1中的C449处与聚合物键合。在一些实施方案中，聚合物具有9个臂并且分子量在约600,000至约1,000,000Da之间。
在一些实施方案中，抗体缀合物具有与聚合物键合的抗-VEGF-A免疫球蛋白G(IgG)，该聚合物包含MPC单体，其中抗-VEGF-A重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ ID NO.2，并且其中抗体仅在C443(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)处与聚合物键合。在一些实施方案中，聚合物具有9个臂并且分子量在约600,000至约1,000,000Da之间。
在一些实施方案中，抗体缀合物具有以下结构：
其中：抗-VEGF-A抗体的每条重链均用字母H表示，并且抗-VEGF-A抗体的每条轻链均用字母L表示；
聚合物通过SEQ ID NO：1中的C449的巯基与抗-VEGF-A抗体键合，该键描述在一条重链上；PC是其中曲线表示与聚合物其余部分连接的点；其中X＝a)OR，其中R＝H，甲基，乙基，丙基，异丙基，b)H，或c)任意卤化物，包括Br；并且n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，使得n1，n2，n3，n4，n5，n6，n6，n7，n8和n9的总和为2500±10％。在某些实施方案中，n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，并且是自0至3000的整数。在某些实施方案中，n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，并且是自0至500的整数。在一些实施方案中，X＝OR，其中R是糖，氨基烷基，以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和的C1-C24烷基，不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基，酰基，酰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧基羰氧基，环烷基，环烯基，烷氧基，环烷氧基，芳基，杂芳基，芳基烷氧基羰基，烷氧基羰基酰基，氨基，氨基羰基，氨基羰基氧，硝基，叠氮基，苯基，羟基，烷硫基，芳硫基，氧磺酰基，羧基，氰基，和卤代烷基，包括多卤代烷基，--CO--O--R7，羰基--CCO--R7，--CO--NR8R9，--(CH2)n--COOR7，--CO--(CH)n--COOR7，--(CH2)n--NR8R9，酯，烷氧基羰基，芳氧基羰基，其中n是自1至6的整数，其中每个R7、R8和R9分别选自由以下组成的组：氢原子，卤原子，以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和的C1-C24烷基，不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基，酰基，酰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧基羰氧基，环烷基，环烯基，烷氧基，环烷氧基，芳基，杂芳基，芳基烷氧基羰基，烷氧基羰基酰基，氨基，氨基羰基，氨基羰基氧，硝基，叠氮基，苯基，羟基，烷硫基，芳硫基，氧磺酰基，羧基，氰基，和卤代烷基，包括多卤代烷基，5元环和6元环。
在一些实施方案中，抗体缀合物具有以下结构：
其中：抗-VEGF-A抗体的每条重链均用字母H表示，并且抗-VEGF-A抗体的每条轻链均用字母L表示；
聚合物通过C443(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)的巯基与抗-VEGF-A抗体键合，该键描述在一条重链上；PC是其中曲线表示与聚合物其余部分连接的点；其中X＝a)OR，其中R＝H，甲基，乙基，丙基，异丙基，b)H，或c)任意卤化物，包括Br；并且n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，使得n1，n2，n3，n4，n5，n6，n6，n7，n8和n9的总和为2500±10％。在某些实施方案中，n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，并且是自0至3000的整数。在某些实施方案中，n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，并且是自0至500的整数。在一些实施方案中，X＝OR，其中R是糖，氨基烷基，以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和的C1-C24烷基，不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基，酰基，酰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧基羰氧基，环烷基，环烯基，烷氧基，环烷氧基，芳基，杂芳基，芳基烷氧基羰基，烷氧基羰基酰基，氨基，氨基羰基，氨基羰基氧，硝基，叠氮基，苯基，羟基，烷硫基，芳硫基，氧磺酰基，羧基，氰基，和卤代烷基，包括多卤代烷基，--CO--O--R7，羰基--CCO--R7，--CO--NR8R9，--(CH2)n--COOR7，--CO--(CH)n--COOR7,--(CH2)n--NR8R9，酯，烷氧基羰基，芳氧基羰基，其中n是自1至6的整数，其中每个R7、R8和R9分别选自由以下组成的组：氢原子，卤原子，以下残基的单取代、多取代或未取代的变体：饱和的C1-C24烷基，不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基，酰基，酰氧基，烷氧基羰氧基，芳氧基羰氧基，环烷基，环烯基，烷氧基，环烷氧基，芳基，杂芳基，芳基烷氧基羰基，烷氧基羰基酰基，氨基，氨基羰基，氨基羰基氧，硝基，叠氮基，苯基，羟基，烷硫基，芳硫基，氧磺酰基，羧基，氰基，和卤代烷基，包括多卤代烷基，5元环和6元环。
在一些实施方案中，抗体缀合物存在于液体制剂中。在一些实施方案中，抗体缀合物与药学上可接受的载体组合。
在一些实施方案中，提供了抗-VEGF-A抗体。抗-VEGF-A抗体重链具有至少以下CDR序列：CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)。在一些实施方案中，抗-VEGF-A重链具有那些CDR并且另外在位置221(通过如在SEQ ID NO.3中的连续计数)处具有苏氨酸(T)。在一些实施方案中，抗-VEGF-A轻链具有至少以下CDR：CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)。在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体具有那些CDR并且另外在Kabat位置4处具有亮氨酸(L)。在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体重链的同种型是IgG1并且具有CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，轻链同种型是κ。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体的IgG1结构域具有一个或多个突变以调节效应子功能，例如ADCC、ADCP和CDC。在一些实施方案中，IgG1突变降低效应子功能。在一些实施方案中，用于效应子功能突变的氨基酸包括(EU编号)E233X，L234X，L235X，G236X，G237X，G236X，D270X，K322X，A327X，P329X，A330X，A330X，P331X和P331X，其中X是任意天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，突变包括以下中的一种或多种：E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S和P331S(EU编号)。在一些实施方案中，抗-VEGF-A重链具有以下突变(EU编号)：L234A、L235A和G237A。在一些实施方案中，相对于天然人IgG1序列的效应子功能突变数目不超过10。在一些实施方案中，相对于天然人IgG1序列的效应子功能突变数目不超过5，4，3，2或1个。在一些实施方案中，抗体的Fcγ结合力和/或补体C1q结合力降低，使得抗体导致效应子功能的能力降低。这对于眼科适应症/病症尤其有利。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体包含以下氨基酸突变中的一种或多种：L234A，L235A，G237A(EU编号)和L443C(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体是人免疫球蛋白G(IgG1)或是其一部分。
在一些实施方案中，VEGF-A抗体包含重链恒定结构域，其包含降低免疫介导的效应子功能的一种或多种突变。
在一些实施方案中，提供了抗-VEGF-A抗体。抗-VEGF抗体包含重链，所述重链包含CDRH1，CDRH2，CDRH3，CDRL1，CDRL2和CDRL3，所述CDRH1包含序列GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)，所述CDRH2包含序列WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)，所述CDRH3包含序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，所述CDRL1包含序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)，所述CDRL2包含序列FTSSLHS(SEQ ID NO：13)，并且所述CDRL3包含序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)。
或者，IgG结构域可以是IgG2、IgG3或IgG4或复合物，在所述复合物中恒定区由多于一种这些同种型形成(例如，来自IgG2或IgG4的CH1区，铰链，来自IgG1的CH2和CH3区)。此类结构域可在关于IgG1提及的一个或多个EU位置处含有突变以降低和/或调节效应子功能。人IgG2和IgG4相对于人IgG1和IgG3具有降低的效应子功能。
抗-VEGF-A重链具有通过重组DNA技术作为突变添加的半胱氨酸残基，其可用于缀合半衰期延长部分。在一些实施方案中，突变是(EU编号)Q347C(EU编号)和/或L443C(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)。在一些实施方案中，突变是L443C(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)。在一些实施方案中，抗体与聚合物的化学计量比为1：1；换句话说，缀合物具有与一个聚合物分子缀合的一个抗体分子。
抗-VEGF-A抗体的半衰期可以通过连接“半衰期延长部分”或“半衰期延长基团”来延长。半衰期延长部分包括可以与所讨论的生物学药物一起在框内表达的(或根据情况化学缀合的)肽和蛋白质，和可以与一个或多个氨基酸侧链或末端官能团(例如-SH，-OH，-COOH，-CONH2，-NH2，或一种或多种N-和/或O-聚糖结构)连接或缀合的各种聚合物。半衰期延长部分通常起到增加生物学药物的体内循环半衰期的作用。
肽/蛋白质半衰期延长部分的实例包括Fc融合(Capon DJ,Chamow SM,MordentiJ,等人Designing CD4immunoadhesions for AIDS therapy.Nature.1989.337:525-31)，人血清白蛋白(HAS)融合(Yeh P,Landais D,Lemaitre M,等人Design of yeast-secretedalbumin derivatives for human therapy:biological and antiviral properties ofa serum albumin-CD4genetic conjugate.Proc Natl Acad Sci USA.1992.89:1904-08)，羧基末端肽(carboxy terminal peptide,CTP)融合(Fares FA,Suganuma N.Nishimori K,等人Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminalsequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin betasubunit.Proc Natl Acad Sci USA.1992.89:4304-08)，非精确重复肽序列(XTEN)融合的遗传融合(Schellenberger V,Wang CW,Geething NC,等人A recombinant polypeptideextends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunablemanner.Nat Biotechnol.2009.27:1186-90)，弹性蛋白样肽(ELP化)(MCpherson DT,Morrow C,Minehan DS,等人Production and purification of a recombinantelastomeric polypeptide,G(VPGVG19-VPGV,from Escheriachia coli.BiotechnolProg.1992.8:347-52)，人转铁蛋白融合(Prior CP,Lai C-H,Sadehghi H等人Modifiedtransferrin fusion proteins.专利WO2004/020405.2004)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS化)(Skerra A,Theobald I,Schlapsky M.Biological active proteins havingincreased in vivo and/or vitro stability.专利WO2008/155134 A1.2008)，同型氨基酸聚合物(HAP化)(Schlapschy M,Theobald I,Mack H,等人Fusion of a recombinantantibody fragment with a homo-amino acid polymer:effects on biophysicalproperties and prolonged plasma half-life.Protein Eng Des Sel.2007.20:273-84)和明胶样蛋白(GLK)融合(Huang Y-S,Wen X-F,Zaro JL,等人Engineering apharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating-factor byfusion with gelatin-like protein polymer.Eur J.Pharm Biopharm.2010.72:435-41)。
聚合物半衰期延长部分的实例包括聚乙二醇(PEG)，支化PEG，(Warwick Effect Polymers；Coventry，UK)，聚唾液酸(PSA)，淀粉，羟乙基淀粉(HES)，羟烷基淀粉(HAS)，碳水化合物，多糖，普鲁兰多糖(pullulane)，壳聚糖，透明质酸，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，葡聚糖，羧甲基葡聚糖，聚环氧烷(PAO)，聚亚烷基二醇(PAG)，聚丙二醇(PPG)，聚恶唑啉，聚丙烯酰吗啉，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚磷腈，聚恶唑啉，聚乙烯-共-马来酸酐，聚苯乙烯-共-马来酸酐，聚(1-羟甲基乙烯羟甲基甲酰胺)(poly(1-hydroxymethyethylene hydroxymethylformal)，PHF)，两性离子聚合物，含磷酸胆碱的聚合物和包含MPC、聚(Glyx-Sery)、透明质酸(HA)、肝素前体(Heparosan)聚合物(HEP)、Fleximer、葡聚糖和聚唾液酸(PSA)的聚合物。
在一个实施方案中，半衰期延长部分可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯通过蛋白质的游离氨基与抗体缀合。靶向与胺基缀合的试剂可以随机地对赖氨酸的ε-胺基、N-末端氨基酸的α-胺基和组氨酸的δ-胺基作出反应。
然而，本文公开的抗-VEGF-A抗体具有许多可用于聚合物缀合的胺基。因此，聚合物与游离氨基的缀合可能负面影响抗体蛋白与VEGF结合的能力。
在一些实施方案中，使用任意合适的硫醇反应性化学(包括但不限于马来酰亚胺化学)，或聚合物酰肼或聚合物胺与在先氧化后的抗体的碳水化合物部分的偶联，将半衰期延长部分偶联至一个或多个游离SH基团。在一些实施方案中，使用马来酰亚胺偶联。在一些实施方案中，偶联发生在天然存在的或通过基因工程引入的半胱氨酸处。
在一些实施方案中，将聚合物共价连接至通过定点诱变引入到抗-VEGF-A抗体中的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，半胱氨酸残基用于抗体的Fc部分。在一些实施方案中，WO 2013/093809、US 7,521,541、WO 2008/020827、US 8,008,453、US 8,455,622和US2012/0213705(为了所有目的通过引用并入本文)提供了将半胱氨酸残基引入Fc区的位点。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是Q347C(EU编号)和L443C，参考EU编号的人IgG重链。
在一些实施方案中，提供了抗体和用作半衰期延长剂的高MW聚合物的缀合物。在一些实施方案中，缀合物包含与两性离子聚合物偶联的抗体，其中所述聚合物由一种或多种单体单元形成，并且其中至少一种单体单元具有两性离子基团。在一些实施方案中，两性离子基团是磷酸胆碱。
在一些实施方案中，单体单元之一是HEMA-PC。在一些实施方案中，聚合物由单一单体合成，所述单体是HEMA-PC。
在一些实施方案中，一些抗体缀合物具有2、3或更多个聚合物臂，其中单体是HEMA-PC。在一些实施方案中，缀合物具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个聚合物臂，其中单体是HEMA-PC。在一些实施方案中，缀合物具有3，6或9个臂。在一些实施方案中，缀合物具有9个臂。
在一些实施方案中，聚合物-抗体缀合物具有分子量在100,000和1,500,000Da之间的聚合物部分。在一些实施方案中，所述缀合物具有分子量在500,000和1,000,000Da之间的聚合物部分。在一些实施方案中，所述缀合物具有分子量在600,000和800,000Da之间的聚合物部分。在一些实施方案中，所述缀合物具有分子量在600,000和850,000Da之间并且具有9个臂的聚合物部分。当考虑与聚合物缀合的抗体的分子量时，分子量将是蛋白质的分子量(包括与其相关的任意碳水化合物部分)与聚合物的分子量的加和。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体具有HEMA-PC聚合物，由Mw测量的所述HEMA-PC聚合物分子量在约100kDa和1650kDa之间。在一些实施方案中，由Mw测量的所述聚合物的分子量在约500kDa和1000kDa之间。在一些实施方案中，由Mw测量的所述聚合物的分子量在约600kDa至约900kDa之间。在一些实施方案中，由Mw测量的所述聚合物的分子量为750kDa±15％。
在一些实施方案中，所述聚合物由具有一个或多个聚合物引发位点的、适合于ATRP的引发剂制备。在一些实施方案中，聚合物引发位点具有2-溴异丁酸酯位点。在一些实施方案中，引发剂具有3个或更多个聚合物引发位点。在一些实施方案中，引发剂具有3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个聚合物引发位点。在一些实施方案中，引发剂具有3，6或9个聚合物引发位点。在一些实施方案中，引发剂具有9个聚合物引发位点。在一些实施方案中，引发剂是OG1786。
抗-VEGF-A抗体可以通过重组表达产生，包括(i)通过基因工程产生重组DNA，(ii)通过例如但不限于转染、电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞中，(iii)培养转化的细胞，(iv)表达抗体，例如组成型或诱导表达，和(v)分离抗体，例如从培养基中分离或通过收获转化的细胞，以便(vi)获得纯化的抗体。
抗-VEGF-A抗体可以通过在合适的原核或真核宿主系统中表达来产生，所述原核或真核宿主系统的特征在于产生药理学上可接受的抗体分子。真核细胞的实例是哺乳动物细胞，例如CHO，COS，HEK 293，BHK，SK-Hip和HepG2。其他合适的表达系统是原核细胞(例如，具有pET/BL21表达系统的大肠杆菌)、酵母细胞(酿酒酵母和/或巴斯德毕赤酵母系统)和昆虫细胞。
多种载体可用于制备本文公开的抗体，并选自真核表达载体和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒，例如但不限于preset、pet和pad，其中原核表达载体中使用的启动子包括lac，trc，trp，recA或araBAD中的一种或多种，但不限于此。用于真核表达的载体的实例包括：(i)用于在酵母中表达，载体例如但不限于pAO，pPIC，pYES或pMET，使用启动子例如但不限于AOX1，GAP，GAL1或AUG1；(ii)用于在昆虫细胞中表达，载体例如但不限于pMT，pAc5，pIB，pMIB或pBAC，使用启动子例如但不限于PH，p10，MT，Ac5，OpIE2，gp64或polh，和(iii)用于在哺乳动物细胞中表达，载体例如但不限于pSVL，pCMV，pRc/RSV，pcDNA3或pBPV，以及在一方面衍生自病毒系统的载体，所述病毒系统例如但不限于痘苗病毒，腺病毒-相关病毒，疱疹病毒，或逆转录病毒，使用启动子例如但不限于CMV，SV40，EF-1，UbC，RSV，ADV，BPV和β-肌动蛋白。
蛋白质与聚合物的缀合方法
在一些实施方案中，提供了制备治疗性蛋白质-半衰期延长部分缀合物的方法，其具有以下步骤：将治疗性蛋白质与半衰期延长部分缀合以提供治疗性蛋白质-半衰期延长部分缀合物，所述治疗性蛋白质具有通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基，所述半衰期延长部分具有选自由以下组成的组的巯基特异性反应基团：马来酰亚胺，乙烯基砜，邻二硫吡啶和碘乙酰胺。
在一些实施方案中，提供了一种从OG1950制备OG1953抗体缀合物的方法。如图18所示，所述方法包括用50倍摩尔过量的TCEP还原剂还原OG1950蛋白(图18)。还原后，将抗体氧化以产生去帽的OG1950抗体，其中抗体中天然存在的轻链和重链链间和链内二硫键形成，但重链位置L443C(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)上的工程化半胱氨酸，仍然保持去帽(图18)。然后通过添加赋形剂并添加5-10x摩尔过量的马来酰亚胺生物聚合物来缀合OG1950。(图18)。生物聚合物通过共价硫醇醚键连接到OG1950抗体(图18)。缀合后，纯化OG19503抗体缀合物，去除未缀合的抗体和聚合物(图18)。
上述蛋白质和方法也可以变化。因此，在一些实施方案中，提供了制备缀合蛋白(其不必是抗体或抗-VEGF抗体)的方法。该方法包括还原蛋白质中的一个或多个半胱氨酸以在溶液中形成去帽蛋白质。在将所述一个或多个半胱氨酸还原后，将去帽蛋白质再氧化以恢复还原蛋白质中的至少一个二硫键，同时确保蛋白质中的工程化半胱氨酸残基保持游离硫醇形式以在溶液中形成再氧化的去帽蛋白质。然后将至少一种赋形剂加入溶液中。赋形剂减少聚合物诱导的蛋白质沉淀。在添加赋形剂后，将聚合物添加到溶液中，其在工程化半胱氨酸残基处与再氧化的去帽蛋白缀合以形成缀合蛋白。
在一些实施方案中，摩尔过量的还原剂可以改为任意起作用的量。在一些实施方案中，可以使用10，20，30，40，50，60，70，80，90x摩尔过量的还原剂(在所有实施方案中其不必是TCEP)。在一些实施方案中，可以使用任意抗体(治疗性或其他)。在一些实施方案中，可以使用1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15x摩尔过量的马来酰亚胺生物聚合物。在一些实施方案中，存在对于聚合物过量的去帽蛋白。在一些实施方案中，还原蛋白质的量小于聚合物的量。在一些实施方案中，还原蛋白的量为聚合物的量的90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％，4％，3％，2％，1％。在一些实施方案中，使用的聚合物是蛋白质的10-15倍。在一些实施方案中，还原抗体的量大于聚合物的量。在一些实施方案中，聚合物的量大于还原抗体的量。
在一些实施方案中，纯化步骤是任选的。
在一些实施方案中，制备抗体缀合物的方法包括将抗-VEGF-A抗体与含磷酸胆碱的聚合物缀合。在一些实施方案中，所述方法包括将抗-VEGF-A抗体与含磷酸胆碱的聚合物缀合的步骤。抗-VEGF-A抗体包含通过重组DNA技术添加的氨基残基。在一些实施方案中，所添加的氨基酸残基是半胱氨酸残基。在一些实施方案中，将半胱氨酸残基添加到抗体的可变区之外。可以将半胱氨酸残基添加到抗体的重链或轻链中。
在一些实施方案中，聚合物包含含磷酸胆碱的聚合物或由其组成。在一些实施方案中，含磷酸胆碱的聚合物包含选自由以下组成的组的巯基特异性反应基团：马来酰亚胺，乙烯基砜，邻二硫吡啶和碘乙酰胺。在一些实施方案中，含磷酸胆碱的聚合物上的巯基特异性反应基团与抗-VEGF-A抗体上的半胱氨酸残基反应以制备抗体缀合物。
在一些实施方案中，待缀合的蛋白质可以是抗体、抗体蛋白质融合体或其结合片段。在一些实施方案中，蛋白质不是抗体，而是酶、配体、受体或其他蛋白质或其突变体或变体。在一些实施方案中，天然蛋白质含有至少一个二硫键和至少一个非天然半胱氨酸。
在一些实施方案中，赋形剂可以是酸或碱。在一些实施方案中，赋形剂是去污剂、糖或带电荷的氨基酸。在一些实施方案中，赋形剂有助于在与聚合物缀合期间将蛋白质保持在溶液中。在一些实施方案中，在将聚合物添加到含有蛋白质的溶液之前，将赋形剂添加到含有蛋白质的溶液中。
在一些实施方案中，反应在约pH 5至约pH 9之间的水性条件下发生。在一些实施方案中，反应在6.0和8.5之间，6.5和8.0之间或7.0和7.5之间发生。
在一些实施方案中，聚合物在2-37摄氏度下与蛋白质缀合。在一些实施方案中，缀合在0-40摄氏度，5-35摄氏度，10-30摄氏度和15-25摄氏度发生。
在一些实施方案中，可使本文所述的缀合蛋白与离子交换介质或疏水相互作用色谱或亲和色谱介质接触以进行纯化(以从未缀合的蛋白中移开缀合的蛋白)。在一些实施方案中，离子交换介质、疏水相互作用色谱或亲和/或色谱介质将缀合的蛋白质与游离聚合物和再氧化的去帽蛋白质分离。
在一些实施方案中，本文所述和图18中概述的方法涉及能够促进和/或维持溶解度体系(a solubility system)的赋形剂。在一些实施方案中，该方法允许溶液维持打算相互作用的两种组分的溶解度。这可以包括蛋白质和聚合物的溶解度，然后也包括终端缀合物的溶解度。在一些实施方案中，不使用赋形剂方法的情况下，问题可能是虽然蛋白质可溶，但当加入生物聚合物时，溶液(例如蛋白质)的溶解度下降并且从溶液中崩解(crash)/沉淀出来。当然，当蛋白质崩解出来时，其不能有效地与生物聚合物缀合。因此，可以使用赋形剂来维持在生物聚合物存在下蛋白质的溶解度，因此两者可以偶联形成蛋白质缀合物(或如图18中所示，抗体缀合物)。这也允许保持缀合物的溶解度。
在一些实施方案中，本文公开的聚合物可包含以下中的一种或多种：两性离子，磷酸胆碱，或PEG接头，所述PEG接头将聚合物分支点的中心桥接至马来酰亚胺官能团。在一些实施方案中，可以通过本文提供的方法将本文提供的任意聚合物添加至蛋白质。
在一些实施方案中，本文提供的任意蛋白质可以通过本文提供的一种或多种方法与本文提供的任意聚合物缀合。
在一些实施方案中，本文提供的(多种)方法允许进行更大规模的加工以制备和纯化蛋白质和/或抗体缀合物。在一些实施方案中，所用体积为至少1升，例如1，10，100，1,000，5,000，10,000，升或更多。在一些实施方案中，产生的和/或纯化的抗体缀合物的量可以是0.1，1，10，100，1000或更多克。
在一些实施方案中，治疗性蛋白质可以是本文所述的任意抗-VEGF-A抗体，其具有通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，抗-VEGF抗体重链具有以下CDR：CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)。重链还可以在位置221(通过如SEQ ID NO.3中的连续计数)具有苏氨酸(T)。在一些实施方案中，抗-VEGF轻链具有以下CDR：CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ IDNO：14)。抗-VEGF-A轻链还可以在Kabat位置4具有亮氨酸(L)。
在一些实施方案中，抗-VEGF-A抗体是IgG1。在一些实施方案中，重链具有一个或多个突变以调节效应子功能。在一些实施方案中，突变是针对以下氨基酸位置中的一个或多个(EU编号)：E233，L234，L235，G236，G237，A327，A330和P331。在一些实施方案中，突变选自由以下组成的组：E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S和P331S(EU编号)。在一些实施方案中，突变是(EU编号)L234A，L235A和G237A。
在一些实施方案中，通过重组DNA技术添加至治疗性蛋白质的半胱氨酸残基不应参与Cys-Cys二硫键配对。鉴于此，治疗性蛋白质可以是二聚体。因此，例如，完整的抗-VEGF-A抗体具有两条轻链和两条重链。如果将Cys残基引入到例如重链中，则完整抗体将在相同位置具有两个这样引入的半胱氨酸，并且存在这些半胱氨酸残基将形成链内二硫键的可能性。如果引入的半胱氨酸残基形成Cys-Cys二硫键或具有这样做的倾向，那么引入的Cys残基将不能用于缀合。本领域已知如何避免重链和轻链中将导致链内二硫键配对的位置。参见，例如，美国专利申请号2015/0158952。
在一些实施方案中，通过重组DNA技术引入的半胱氨酸残基选自由(EU编号)Q347C和L443C组成的组。在一些实施方案中，半胱氨酸残基是L443C(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)。在一些实施方案中，抗体的重链具有SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列并且轻链具有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，巯基特异性反应基团是马来酰亚胺。
在一些实施方案中，半衰期延长部分选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)，支化PEG，(Warwick Effect Polymers；Coventry，UK)，聚唾液酸(PSA)，淀粉，羟乙基淀粉(HES)，羟烷基淀粉(HAS)，碳水化合物，多糖，普鲁兰多糖(pullulane)，壳聚糖，透明质酸，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，葡聚糖，羧甲基葡聚糖，聚环氧烷(PAO)，聚亚烷基二醇(PAG)，聚丙二醇(PPG)，聚恶唑啉，聚丙烯酰吗啉，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚磷腈，聚恶唑啉，聚乙烯-共-马来酸酐，聚苯乙烯-共-马来酸酐，聚(1-羟甲基乙烯羟甲基甲酰胺)(PHF)，两性离子聚合物，含磷酸胆碱的聚合物和包含2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC)的聚合物。
在一些实施方案中，半衰期延长部分是两性离子聚合物。在一些实施方案中，两性离子是磷酸胆碱，即含磷酸胆碱的聚合物。在一些实施方案中，聚合物由MPC单元组成。
在一些实施方案中，MPC聚合物具有三个或更多个臂。在一些实施方案中，MPC聚合物具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个臂。在一些实施方案中，MPC聚合物具有3，6或9个臂。在一些实施方案中，MPC聚合物具有9个臂。在一些实施方案中，聚合物用包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多个聚合物引发位点的引发剂合成。
在一些实施方案中，MPC聚合物的分子量在约300,000和1,750,000Da之间。在一些实施方案中，MPC聚合物的分子量在约500,000和1,000,000Da之间或在约600,000至900,000Da之间。
在一些实施方案中，制备治疗性蛋白质-半衰期延长部分缀合物的方法具有如下额外步骤：在产生还原型半胱氨酸巯基的条件下使治疗性蛋白质与硫醇还原剂接触。如上所述，优选地，通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基是不配对的，即不参与Cys-Cys链内二硫键或基本上不参与这种键合。然而，已知不参与这种Cys-Cys二硫键合并且可自由缀合的Cys残基与培养基中的游离半胱氨酸反应形成二硫化物加合物。参见，例如，WO 2009/052249。如此衍生的半胱氨酸将不可用于缀合。为了从二硫化物加合物中释放新添加的半胱氨酸，用还原剂例如二硫苏糖醇处理纯化后的蛋白质。然而，用还原剂进行的这种处理将还原治疗性蛋白质中的所有半胱氨酸残基，包括天然半胱氨酸，其中许多参与链间和链内Cys-Cys二硫键。天然Cys-Cys二硫化物通常对蛋白质稳定性和活性至关重要，应对其进行重建。在一些实施方案中，重建所有天然(例如，链间和链内)Cys-Cys二硫化物。
为了重建天然链间和链内二硫化物残基，在还原以除去半胱氨酸二硫化物加合物后，将治疗性蛋白质暴露于氧化条件和/或氧化剂一段规定的时间，例如过夜。在一些实施方案中，过夜暴露环境空气可用于实现天然二硫键的重建。在一些实施方案中，使用氧化剂来恢复天然二硫化物。在一些实施方案中，氧化剂选自由CuSO4水溶液和脱氢抗坏血酸(DHAA)组成的组。在一些实施方案中，氧化剂是DHAA。在一些实施方案中，所用DHAA的范围为5-30当量。在一些实施方案中，范围为10-20当量。在一些实施方案中，范围为15当量。
在一些实施方案中，硫醇还原剂选自由以下组成的组：三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，二硫苏糖醇(DTT)，二硫赤藓糖醇(DTE)，硼氢化钠(NaBH4)，氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，β-巯基乙醇(BME)，半胱氨酸盐酸盐和半胱氨酸。在一些实施方案中，硫醇还原剂是TCEP。
在一些实施方案中，硫醇还原剂浓度相对于治疗性蛋白质浓度为1至100倍摩尔过量。在一些实施方案中，硫醇还原剂浓度相对于治疗性蛋白质浓度为20至50倍摩尔过量。在一些实施方案中，在氧化治疗性蛋白质之前，在与治疗性蛋白质孵育后，除去硫醇还原剂。
在一些实施方案中，用于将治疗性蛋白质与半衰期延长部分缀合的方法还具有以下步骤：在缀合后纯化治疗性蛋白质缀合物。在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的技术纯化治疗性蛋白缀合物：离子交换色谱，疏水相互作用色谱，尺寸排阻色谱，和亲和色谱或其组合。
在一些实施方案中，治疗性蛋白质缀合物相对于未缀合的治疗性蛋白质保留至少20％的生物活性。在一些实施方案中，治疗性蛋白质缀合物相对于未缀合的治疗性蛋白质保留至少50％的生物活性。在一些实施方案中，治疗性蛋白质缀合物相对于天然治疗性蛋白质保留至少90％的生物活性。
在一些实施方案中，相对于未缀合的治疗性蛋白质，治疗性蛋白质缀合物的半衰期增加。在一些实施方案中，相对于未缀合的治疗性蛋白质，治疗性蛋白质缀合物的半衰期增加至少1.5倍。在一些实施方案中，相对于未缀合的治疗性蛋白质，治疗性蛋白质缀合物的半衰期增加至少5倍。
在一些实施方案中，将治疗性蛋白质与半衰期延长部分缀合的方法的两性离子聚合物是具有两性离子基团的可自由基聚合的单体，并且所述方法还具有以下步骤：在聚合介质中聚合可自由基聚合的两性离子单体以提供聚合物，所述介质包含：可自由基聚合的两性离子单体；过渡金属催化剂Mt (q-1)+其中Mt是过渡金属，q是金属的较高氧化态，q-1是金属的较低氧化态，其中金属催化剂以Mt(q-1)+X’(q-1)形式的盐提供，其中X'是反离子或基团，或者过渡金属催化剂通过提供处于其较高氧化态的非活性金属盐Mt q+X’q与还原剂一起原位提供，所述还原剂能够将过渡金属从氧化的非活性态还原为还原的活性态；配体；和引发剂。
为了起到ATRP过渡金属催化剂的作用，过渡金属应该具有至少两个易于达到的、由一个电子分开的氧化态，较高氧化态和较低氧化态。在ATRP中，可逆的氧化还原反应导致过渡金属催化剂在较高氧化态和较低氧化态之间循环，而聚合物链在具有增长链端和休眠链端之间循环。参见，例如，美国专利号7,893,173。
在一些实施方案中，可自由基聚合的两性离子单体选自选自由以下组成的组：
其中R1是H或C1-6烷基，ZW是两性离子，n是1-6的整数。
在一些实施方案中，可自由基聚合的单体是
其中R1是H或C1-6烷基，R2、R3、R4相同或不同并且是H或C1-4烷基，并且X和Y相同或不同并且是1-6的整数。在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自为甲基，并且X和Y各自为2。
在一些实施方案中，可自由基聚合的单体是
其中R1是H或C1-6烷基，R2和R3相同或不同并且是H或C1-4烷基，R4是PO4-、SO3-或CO2-，X和Y是相同或不同的并且是1-6的整数。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自为甲基，R4是PO4-并且X和Y各自为2。
在一些实施方案中，单体是
其中R1是H或C1-6烷基，R2、R3和R4相同或不同并且是H或C1-4烷基，
R5是PO4-、SO3-或CO2-，X和Y是相同或不同的并且是1-6的整数。在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自为甲基，R5是PO4-并且X和Y为2。
在一些实施方案中，过渡金属Mt选自由以下组成的组：Cu，Fe，Ru，Cr，Mo，W，Mn，Rh，Re，Co，V，Zn，Au和Ag。在一些实施方案中，金属催化剂以Mt(q-1)+X’(q-1)形式的盐提供。Mt (q-1)+选自由以下组成的组：Cu1+，Fe2+，Ru2+，Cr2+，Mo2+，W2+，Mn3+，Rh3+，Re2+，Co+，V2+，Zn+，Au+和Ag+，并且X'选自由以下组成的组：卤素，C1-6烷氧基，(SO4)1/2，(PO4)1/3，(R7PO4)1/2，(R72PO4)，三氟甲磺酸酯，六氟磷酸酯，甲磺酸酯，芳基磺酸酯，CN和R7CO2组成的组，其中R7是H或直链或支链C1-6烷基，其可被卤素取代1至5次。在一些实施方案中，Mt (q-1)+是Cu1+并且X'是Br。
在一些实施方案中，Mt (q-1)+原位提供。在一些实施方案中，Mt q+Xq是CuBR2。在一些实施方案中，还原剂是无机化合物。在一些实施方案中，还原剂选自由以下组成的组：低氧化水平的硫化合物，亚硫酸氢钠，含金属离子的无机盐，金属，水合肼和这些化合物的衍生物。在一些实施方案中，还原剂是金属。在一些实施方案中，还原剂是Cu0。
在一些实施方案中，还原剂是有机化合物。在一些实施方案中，有机化合物自由以下组成的组：烷基硫醇，巯基乙醇，或易于烯醇化的羰基化合物，抗坏血酸，乙酰丙酮酸酯，樟脑磺酸，羟基丙酮，还原糖，单糖，葡萄糖，醛以及这些有机化合物的衍生物。
在一些实施方案中，配体自由以下组成的组：2,2'-联吡啶，4,4'-二-5-壬基-2,2'-联吡啶，4,4-二壬基-2,2'-联吡啶，4,4',4”-三(5-壬基)-2,2':6',2”-三联吡啶，N,N,N',N',N”-五甲基二亚乙基三胺，1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺，三(2-二甲基氨基乙基)胺，N,N-双(2-吡啶基甲基)十八烷基胺，N,N,N',N'-四[(2-吡啶)甲基]乙二胺，三[(2-吡啶基)甲基]胺，三(2-氨基乙基)胺，三(2-双(3-丁氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺，三(2-双(3-(2-乙基己氧基)-3-氧代丙基)氨基乙基)胺和三(2-双(3-十二烷氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺。在一些实施方案中，配体是2,2'-联吡啶。
在一些实施方案中，引发剂具有以下结构：
其中R1是亲核反应性基团，R2包含接头，R3包含具有以下结构的聚合物合成引发剂部分：
其中R4和R5相同或不同并且选自由以下组成的组：烷基，取代的烷基，亚烷基，烷氧基，羧基烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基醚，烯基，亚烯基，炔基，亚炔基，环亚烷基，杂环烷基，杂环亚烷基，芳基，亚芳基，亚芳基氧基，杂芳基，氨基，酰氨基或其任意组合；Z是卤素或CN；并且s是1至20之间的整数。
在一些实施方案中，Z是Br并且R4和R5各自是甲基。在一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：NH2-，OH-和SH-。
在一些实施方案中，R2是烷基，取代的烷基，亚烷基，烷氧基，羧基烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基醚，烯基，亚烯基，炔基，亚炔基，环亚烷基，杂环烷基，杂环亚烷基，芳基，亚芳基，亚芳基氧基，杂芳基，氨基，酰氨基或其任意组合。在一些实施方案中，R2是
其中X和Y相同或不同并且是1-20的整数。在一些实施方案中，X和Y各自为4。
在一些实施方案中，R3是
其中R6、R7和R8相同或不同，并且选自由以下组成的组：
其中Z是NCS，F，Cl，Br或I。在一些实施方案中，Z是Br并且R6、R7和R8各自是
在一些实施方案中，引发剂具有以下结构：
其中A和B相同或不同，并且是2至12的整数，并且Z是任意卤化物，例如Br。在一些实施方案中，A和B各自为4。
在一些实施方案中，所述方法还具有使聚合物与马来酰亚胺试剂反应以提供具有末端马来酰亚胺的聚合物的步骤。在一些实施方案中，马来酰亚胺化合物是
治疗方法
在一些实施方案中，提供了用于治疗或预防眼部疾病的方法，其具有以下步骤：施用选自由抗-VEGF-A抗体(及其缀合物)组成的组的治疗性蛋白质。在一些实施方案中，本文提供的任意一种或多种抗体或抗体缀合物可用作眼部疾病的治疗和/或预防。所述方法包括向受试者施用本文提供的任意一种或多种抗体或抗体缀合物。
在一些实施方案中，提供了用于治疗或预防眼部疾病的方法。所述方法包括向有此需要的受试者施用有效剂量的本文所述的任意抗体和/或抗体缀合物。在一些实施方案中，疾病可以是年龄相关性黄斑变性(AMD)或糖尿病性黄斑水肿(DME)。在一些实施方案中，疾病可以是湿性AMD。
在一些实施方案中，眼部疾病选自由以下组成的组中的一种或多种：糖尿病性视网膜病变，脉络膜新生血管形成(CNV)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性黄斑水肿(DME)，病理性近视，冯希-林二氏病，眼睛的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，视网膜中央分支静脉阻塞(BRVO)，角膜新生血管形成，视网膜新生血管形成，早产儿视网膜病变(ROP)，结膜下出血和高血压性视网膜病变。在一些实施方案中，眼部疾病是糖尿病性视网膜病变。
在一些实施方案中，抗体或抗体缀合物的施用频率不超过每月一次。在一些实施方案中，抗体或其缀合物每月施用两次或每周施用一次。在一些实施方案中，抗体或其缀合物每两个月施用一次，每三个月施用一次，每四个月施用一次，每五个月施用一次，每六个月施用一次，每七个月施用一次，每八个月施用一次，每九个月施用一次，每十个月一次，每十一个月施用一次，或每十二个月施用一次。
在一些实施方案中，本文提供的一种或多种组合物可以减少由于使用玻璃体内注射抗-VEGF剂来治疗湿性(增殖)形式的年龄相关性黄斑变性(AMD)而产生的高治疗负担的后果。湿性AMD患者的真实世界结果落后于3期临床研究中证实的临床结果，例如使用(雷珠单抗)的MARINA和ANCHOR研究以及使用(阿柏西普)的VIEW 1和VIEW 2研究。抗-VEGF治疗剂具有较长眼部停留时间使得其可以较不频繁地施用，并且因此具有更多的患者可耐受特征，可以使更多患者的现实世界结果更接近3期临床结果。
在一些实施方案中，本文所述的化合物，包括抗体缀合物和抗-VEGF-A抗体，用于治疗患有背景或非增殖性糖尿病性视网膜病变但具有很少或没有视力损伤的患者。在一些实施方案中，这些患者通过玻璃体内注射每月给药少于一次。在一些实施方案中，这些患者每年给药六次。在一些实施方案中，这些患者每年给药不超过四次。在一些实施方案中，该患者每年给药不超过三次。在一些实施方案中，该患者每年给药不超过两次。在一些实施方案中，该患者每年给药不超过一次。在一些实施方案中，受试者通过玻璃体内注射接受抗体或抗体缀合物。
本文所述的治疗性蛋白质(例如，抗体和抗体缀合物)可以通过在患者体内表达这种多肽来使用，即基因治疗。
使核酸(任选地包含在载体中)进入患者细胞有两种主要方法：体内和离体。对于体内递送，将核酸直接注射到患者体内，通常在需要治疗性蛋白质的部位，即需要治疗性蛋白质的生物活性的部位。对于离体治疗，移除患者的细胞，将核酸引入到这些分离的细胞中，并将修饰的细胞直接施用于患者，或者例如，包封在多孔膜中，多孔膜会植入到患者体内(参见，例如，美国专利号4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸引入到活细胞中。这些技术根据核酸是在体外转移到培养细胞中，还是在体内在转移到预期宿主的细胞中而变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体，电穿孔，显微注射，转导，细胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸钙沉淀法等。转导涉及复制缺陷型重组病毒(包括逆转录病毒)颗粒与细胞受体的结合，然后将颗粒所含的核酸引入到细胞中。用于离体递送基因的常用载体是逆转录病毒。
在一些实施方案中，体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒载体(例如腺病毒，慢病毒，单纯疱疹病毒I或腺病毒相关病毒(adeno-associated virus,AAV))和基于脂质的系统(用于脂质介导的基因转移的有用脂质是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol；参见，例如Tonkinison等人，Cancer Investigation,14(1):54-65(1996))的转染。在一些实施方案中，用于基因治疗的载体是病毒，其包括腺病毒，AAV，慢病毒或逆转录病毒。病毒载体如逆转录病毒载体包括至少一种转录启动子/增强子或(多个)基因座限定元件，或通过其他方式(例如可变剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰)控制基因表达的其他元件。另外，病毒载体如逆转录病毒载体包括核酸分子，当在编码治疗性蛋白质的基因的存在下转录时，该核酸分子与其可操作地连接并起到翻译起始序列的作用。此类载体构建体还包括包装信号，长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)或其部分，以及适合于所用病毒的正链和负链引物结合位点(如果它们尚未存在于病毒载体中)。另外，这种载体通常包括信号序列，用于从其位于其中的宿主细胞分泌PRO多肽。在一些实施方案中，用于此目的的信号序列是哺乳动物信号序列。在一些实施方案中，信号是治疗性蛋白质的天然信号序列。任选地，载体构建体还可以包括指导多腺苷酸化的信号，以及一个或多个限制性位点和翻译终止序列。举例来说，此类载体通常包括5'LTR，tRNA结合位点，包装信号，第二链DNA合成的起点，和3'LTR，或它们的一部分。可以使用非病毒的其他载体，例如阳离子脂质体、聚赖氨酸和树枝状大分子。
在一些情况下，期望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸源，所述靶向靶细胞的试剂例如细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性抗体，靶细胞上受体的配体等。在使用脂质体的情况下，结合与内吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如，针对特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段，针对在周期中经历内化的蛋白质的抗体，以及靶向细胞内定位并增强细胞内半衰期的蛋白质。受体介导的内吞作用技术描述于例如Wu等人，J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)；和Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3410-3414(1990)。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述，参见Anderson等人，Science,256:808-813(1992)。还参见WO 93/25673和其中引用的参考文献。
合适的基因疗法和制备逆转录病毒颗粒和结构蛋白的方法可见于例如美国专利号5,681,746中。
在一些实施方案中，提供了用于治疗或预防哺乳动物眼部疾病的方法，其中施用编码治疗性蛋白质的核酸分子，所述治疗性蛋白质选自由抗-VEGF-A抗体组成的组。在一些实施方案中，核酸在图27中列出。
在一些实施方案中，重链是SEQ ID NO.1中所示的重链，轻链是SEQ ID NO.2中所示的轻链。在一些实施方案中，核酸分子通过离体基因疗法施用。
可以将治疗性蛋白质与药学上可接受的赋形剂一起掺入药物组合物中。适合口服施用的药物组合物可以作为离散单元(discrete unit)存在，例如胶囊、溶液、糖浆剂或混悬液(在水性或非水性液体中；或作为可食用泡沫状物(foam或whip)；或作为乳剂)。适用于片剂或硬胶囊的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物，硬脂酸或其盐。适于与软明胶胶囊一起使用的赋形剂包括例如植物油，蜡，脂肪，半固体或液体多元醇等。对于溶液和糖浆剂的制备，可使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。对于悬浮液的制备，可以使用油(例如植物油)来提供水包油或油包水悬浮液。
药物组合物可适合于鼻内施用，其中赋形剂为固体，包括粒度例如在20至500微米范围内的粗粉末，其以摄取鼻烟的方式施用，即通过从靠近鼻子的粉末容器经鼻道快速吸入。其中赋形剂为液体、作为鼻喷雾剂或滴鼻剂施用的合适组合物包括活性成分的水性溶液或油溶液。适于通过吸入施用的药物组合物包括细颗粒粉剂或雾剂，其可通过各种类型的计量剂量加压气溶胶、喷雾器或吹入器产生。
适于肠胃外施用的药物组合物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液基本等渗的溶质的水性和非水性无菌注射溶液；和可包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。可用于可注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，使用前仅需加入所携带的无菌液体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。药物组合物可以是基本上等渗的，意味着渗透压为约250-400mOsm/kg水。
药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、添味剂、盐(物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。除所述物质外，它们还可以含有治疗活性剂。药物组合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合使用。此类赋形剂可以包括但不限于盐水、缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、葡萄糖、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。
抗体和含有它们的药物组合物可以以有效方案施用用于治疗或预防患者的疾病，包括例如通过口服、玻璃体内、静脉内、皮下、肌内、骨内、鼻内、局部、腹膜内和病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用或其他途径等。在治疗中或作为预防剂时，活性剂可作为可注射组合物向个体施用，例如作为无菌水性分散液。在一些实施方案中，所述药剂是等渗的或基本上等渗的。
对于向哺乳动物特别是人类施用，预期活性剂的剂量为0.01mg/kg体重，通常为约1mg/kg。医师可以确定最适合个体的实际剂量，其取决于包括个体的年龄、体重、性别和反应，所治疗的疾病或病症以及所治疗个体的年龄和病况在内的因素。上述剂量是平均情况的示例。当然，可存在需要更高或更低剂量的情况。在一些实施方案中，剂量可以是0.5至20mg/眼，例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18或19mg。
该剂量可以适当重复(例如每周一次，每两周一次，每月一次，每两个月一次，每季度一次，每年两次，每年一次)。如果发生副作用，则可以根据正常临床实践减少给药的量和/或频率。在一个实施方案中，药物组合物可以每一至三十天施用一次。在一个实施方案中，药物组合物可以每三十天施用两次。在一个实施方案中，药物组合物可以每周施用一次。
抗体和药物组合物可单独使用或与其它化合物组合使用，例如治疗性化合物或分子，例如抗炎药、镇痛药或抗生素。这种与其它化合物一起的施用可以是同时、分开或相继的。组分可以以试剂盒的形式制备，试剂盒可以适当包括说明书。
本文公开的抗体和药物组合物可用于治疗或预防疾病，特别是本文所述的眼部疾病或病况。
如此使用，通常将缀合物配制为适合以下施用方式并通过以下方式施用：眼部、眼内、和/或玻璃体内注射、和/或近巩膜(juxtascleral)注射、和/或视网膜下注射、和/或眼球筋膜下(subtenon)注射、和/或脉络膜上腔(superchoroidal)注射和/或结膜下施用和/或以滴眼剂和/或软膏的形式局部施用。这样的抗体和组合物可以通过多种方法递送，例如作为允许化合物缓慢释放到玻璃体中的装置和/或贮库(depot)进行玻璃体内递送，包括例如Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Ashton,and Pearson,editors,Taylor&Francis(March 2006)的参考文献中描述的那些。在一个实例中，装置可以是长时间释放化合物的微型泵和/或基质和/或被动扩散系统和/或包封池的形式(Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Ashton,and Pearson,editors,Taylor&Francis(March 2006))。
用于眼、眼内或玻璃体内施用的制剂可以通过本领域已知的方法使用本领域已知的成分制备。高效治疗的主要要求是适当渗透眼睛。不同于药物可以局部递送的眼睛前部的疾病，视网膜疾病需要更加位点特异性的方法。滴眼剂和软膏很少渗透到眼后部，并且血眼屏障阻碍全身施用的药物渗透到眼组织中。因此，通常选择的用于治疗视网膜疾病(例如AMD和CNV)的药物递送方法为直接玻璃体内注射。玻璃体内注射通常以取决于患者的状况以及所递送的药物的性质和半衰期的间隔进行重复。
治疗性抗体和相关缀合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。这种组合物也可以以预填充注射器的形式提供。
“稳定的”制剂为其中蛋白质或与其它半衰期延长部分的聚合物缀合的蛋白质在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。“稳定的”还指表现出很少或没有不稳定性迹象(包括聚集和/或脱酰胺)的制剂。例如，当在5-8℃的温度下储存时，所提供的制剂可保持稳定至少两年。
用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术可在本领域中获得，并且在例如Peptideand Protein Drug Delivery,247-301(Vincent Lee编辑，New York,N.Y.,1991)和Jones,1993Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90中进行了综述。稳定性可以在选定的温度下测量选定的时间段。在一些实施方案中，制剂的储存稳定至少6个月，12个月，12-18个月，或2年或更多年。
如果在肉眼检查颜色和/或透明度或通过紫外光散射或尺寸排阻色谱法测量时，没有显示出聚集、沉淀、脱酰胺和/或变性的迹象，则蛋白质(例如抗体或其片段)在药物制剂中“保持其物理稳定性”。
如果给定时间处的化学稳定性使得蛋白质被认为仍然保持其生物活性，则蛋白质在药物制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可以通过检测和定量蛋白质的化学改变形式来评价。化学改变可涉及尺寸变化(例如剪切)，其可以使用例如尺寸排阻色谱法、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)进行评价。其它类型的化学改变包括电荷改变(例如，作为脱酰胺的结果而发生)，其可以通过例如离子交换色谱法评价。如果，例如在抗原结合测定中测定的，抗体在给定时间处的生物活性在药物制剂制备时显示的生物活性的约10％以内(在测定的误差内)，则抗体在药物制剂中―保持其生物活性”。
蛋白质-聚合物缀合物“保持其化学稳定性”，蛋白质和聚合物之间的化学键保持完整，例如其不被水解或不以其它方式被破坏。缀合物的蛋白质部分保持其如上所述的化学稳定性。
“等渗”是指目标制剂具有与人血液或用于玻璃体内注射的玻璃体基本上相同的渗透压。等渗制剂通常具有约250-400mOsm的渗透压。等渗性可以使用例如蒸汽压或冰冻型渗压计测量。
如本文所用，“缓冲剂”是指通过其酸-碱共轭组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。在一些实施方案中，缓冲剂的pH为约3.0至约8.0；例如约4.5至8；或约pH 6至约7.5；或约6.0至约7.0，或约6.5-7.0，或约pH 7.0至约7.5；或约7.1至约7.4。还涵盖上述范围之间的任何点的pH。
在一些实施方案中，使用“PBS”磷酸盐缓冲盐水、基于Tris的缓冲剂和基于组氨酸的缓冲剂。
在一些实施方案中，PBS缓冲剂至少由Na2HPO4、KH2PO4和NaCl组成，进行调节以提供合适的pH。在一些实施方案中，缓冲剂可以含有其它药物赋形剂例如KCl和其它盐、去污剂和/或防腐剂以提供稳定的储存溶液。
“防腐剂”是可以包括在制剂中以基本上减少其中的细菌作用从而便于例如多用途制剂的生产的化合物。可能的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇如苯酚、丁基和苄基醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。
在一些实施方案中，对人类使用或动物试验安全的制剂应具有足够低水平的内毒素。“内毒素”是来自革兰氏阴性细菌的细胞膜的脂多糖(LPS)。内毒素由共价连接到疏水脂质部分(脂质A)的亲水多糖部分组成。Raetz CR,Ulevitch RJ,Wright SD,Sibley CH,DingA,Nathan CF.1991.Gram-negative endotoxin:an extraordinary lipid with profoundeffects on eukaryotic signal transduction.FASEB J.5(12):2652-2660。脂质A负责内毒素的大多数生物活性，即其毒性。在细菌细胞死亡时以及在生长和分裂期间内毒素大量流出。它们是高度热稳定的，并且在常规灭菌条件下不被破坏。必须使用热或pH极限处理，例如180-250℃和超过0.1M的酸或碱(Petsch D,Anspach F.2000.Endotoxin removalfrom protein solutions.J Biotechnol.76:97-119)。这种条件当然会对生物药物非常不利。
在生物技术和制药工业中，可以在生产过程和最终产品中找到内毒素。由于细菌可以在营养不良的培养基(包括水、盐水和缓冲剂)中生长，内毒素是普遍的，除非采取预防措施。内毒素注射到动物或人体会引起各种各样的病理生理效应，包括内毒素休克、组织损伤甚至死亡。Ogikubo Y,Ogikubo Y,Norimatsu M,Noda K,Takahashi J,Inotsume M,Tsuchiya M,Tamura Y.2004.Evaluation of the bacterial endotoxin test forquantifications of endotoxin contamination of porcine vaccines.Biologics 32:88-93。
在以低浓度(1ng/mL)静脉内注射内毒素后，在哺乳动物中诱发热原反应和休克(Fiske JM,Ross A,VanDerMeid RK,McMichael JC,Arumugham.2001.Method forreducing endotoxin in Moraxella catarrhalis UspA2 protein preparations.JChrom B.753:269-278)。所有药典均将药物和生物制品的静脉内应用的内毒素的最大水平设定为每小时每kg体重5个内毒素单位(EU)(Daneshiam M,Guenther A,Wendel A,HartungT,Von Aulock S.2006.In vitro pyrogen test for toxic or immunomodulatorydrugs.J Immunol Method 313:169-175)。EU是内毒素的生物活性的量度。例如，100pg的标准内毒素EC-5和120pg的来自大肠杆菌O111:B4的内毒素具有1EU的活性(Hirayama C,Sakata M.2002.Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions bypolymer particles.J Chrom B 781:419-432)。达到该阈值水平在生物研究和制药工业中一直是一个挑战(Berthold W,Walter J.1994.Protein Purification:Aspects ofProcesses for Pharmaceutical Products.Biologicals 22:135-150；Petsch D,AnspachFB.2000.Endotoxin removal from protein solutions.J Biotech 76:97-119)。
在要通过玻璃体内注射递送的药物中内毒素的存在受到特别的关注。在1945年，药物(青霉素)的玻璃体内注射首次由Rycroft进行。Rycroft BW.1945.Penicillin andthe control of deep intra-ocular infection.British J Ophthalmol 29(2):57-87。玻璃体是一个腔室，高水平的药物可引入其中并维持相对长的时间段。通过玻璃体内注射可获得的药物浓度远远超过通过局部施用或通过全身施用(例如静脉内施用)可以产生的浓度。
可能由玻璃体内注射引起的最危险的并发症之一是眼内炎。眼内炎分为两类：感染性眼内炎和无菌性眼内炎。感染性眼内炎通常由细菌、真菌或寄生虫引起。感染性眼内炎的症状包括严重的疼痛、视力丧失以及结膜和下面的巩膜外层发红。感染性眼内炎需要紧急诊断和治疗。在一些情况下可能的治疗包括玻璃体内注射抗生素和平坦部玻璃体切除术。可能需要眼球摘除术以除去失明和疼痛的眼睛。参见，例如Christy NE,SommerA.1979.Antibiotic prophylaxis of postoperative endophthalmitis.Ann Ophthalmol11(8):1261–1265。
相反，无菌性眼内炎不涉及传染原，并且可以定义为玻璃体腔的急性眼内炎症，其不需要玻璃体内抗生素和/或玻璃体视网膜手术即可消退。如果已经进行了玻璃体微生物学研究，则需要证明为阴性培养物以维持无菌性眼内炎的诊断。Marticorena J,Romano V,Gomez-Ulla F.2012―Sterile Endophthalmitis after Intravitreal Injections”MedInflam.928123。
已经观察到玻璃体内注射被内毒素污染的生物药物可导致无菌性眼内炎(Marticorena等)。贝伐单抗(阿瓦斯汀)被美国食品和药物管理局批准用于治疗成胶质细胞瘤、转移性结肠直肠癌、晚期非鳞状非小细胞肺癌和转移性肾癌。贝伐单抗也在核准标示外广泛用于湿性AMD的治疗。制造商提供的贝伐单抗为100mg/4ml。该溶液不能直接用于玻璃体内注射，必须由药剂师配制。已经观察到一些无菌性眼内炎并且理论上认为是由配制药剂师无意造成的内毒素对贝伐单抗的污染引起的。
鉴于玻璃体内注射内毒素的可怕的临床结果，可以通过玻璃体内给药给予患者的内毒素的总量是非常有限的。在一些实施方案中，提供了具有抗体或抗体缀合物的溶液，其内毒素水平不超过5.0EU/ml。在一些实施方案中，内毒素水平不超过1.0EU/ml。在一些实施方案中，内毒素水平不超过0.5EU/ml。在一些实施方案中，内毒素水平不超过0.2EU/ml。在一些实施方案中，内毒素水平不超过2，1，0.5，0.2，0.1，0.09，0.08，0.07，0.06，0.05，0.04，0.03，0.02或0.01EU/ml。
两种常用的FDA批准的用于内毒素存在的测试为兔热原测试和鲎变形细胞溶解物(LAL)测定(Hoffman S，等人2005.International validation of novel pyrogen testsbased on human monocytoid cells J.Immunol.Methods 298:161-173；Ding JL,HoBA.2001.New era in pyrogen testing.Biotech.19:277-281)。兔热原测试在20世纪20年代开发，包括监测注射有测试溶液的兔子的体温升高。然而，由于花费和长的周转时间，几年来兔热原测试的使用已经大大减少。更常见的是LAL测试。LAL来自马蹄蟹的血液，并在暴露于内毒素时凝结。
最简单的LAL测定法之一是LAL凝胶-凝结测定法。本质上，将LAL凝结测定与所述样品的连续稀释组合。凝胶的形成与样品中内毒素的量成比例。由样品制备连续稀释液，并测定每种稀释液形成LAL凝胶的能力。在某点含有阴性反应。原始样品中内毒素的量可以根据稀释测定估算。
还开发了其他LAL测试，包括比浊LAL测定(Ong KG,Lelan JM,Zeng KF,BarrettG,Aourob M,Grimes CA.2006.A rapid highly-sensitive endotoxin detectionsystem.Biosensors and Bioelectronics 21:2270-2274)和显色LAL测定(Haishima Y,Hasegawa C,Yagami T,Tsuchiya T,Matsuda R,Hayashi Y.2003.Estimation ofuncertainty in kinetic-colorimetric assay of bacterial endotoxins.J PharmBiomed Analysis.32:495-503)。比浊测定和显色测定比简单的凝胶-凝结稀释测定更加灵敏和定量。
在一些实施方案中，提供了降低具有本文公开的抗体的组合物中内毒素的量的方法。该方法具有以下步骤：使组合物与结合抗体的亲和色谱树脂接触；从亲和色谱树脂中洗脱抗体，以形成具有拮抗剂的亲和色谱洗脱液；使亲和色谱洗脱液与结合抗体的离子交换树脂接触；以及从离子交换树脂中洗脱抗体，其中从离子交换树脂中洗脱的抗体基本上不含内毒素。
用于减少内毒素的量的上述方法或本文所述的其它方法或过程可以以上述步骤中描述的顺序进行，或者其可任选地通过改变步骤的顺序或甚至重复一个或多个步骤进行。在一个实施方案中，减少组合物中内毒素的量的方法以所描述的步骤的顺序进行。在一些实施方案中，在亲和色谱洗脱液与离子交换树脂接触之前，以相同的次序将亲和色谱树脂接触、洗涤和洗脱步骤重复一次以上。该方法还可以包括使用例如0.1微米、0.22微米或0.44微米过滤器的过滤步骤，可以对在每个树脂结合步骤后移除的一个或多个洗脱液进行该步骤。
在某些情况下，在使第一洗脱液与离子交换树脂接触之前，可将组合物与亲和色谱树脂接触的步骤、洗涤步骤和从亲和色谱树脂洗脱抗体的步骤重复多于一次。在一个实施方案中，亲和色谱树脂包含重组蛋白质A
(“rProteinA”)树脂。合适的重组蛋白质A树脂的一个实例为rProteinASepharose树脂(Amersham，Piscataway，N.J.)。在另一个实施方案中，合适的亲和色谱树脂将包含蛋白质G色谱树脂。在其它实施方案中，合适的亲和色谱树脂包含混合的蛋白质A/蛋白质G树脂。在其它实施方案中，合适的亲和色谱树脂包含含有4-巯基乙基吡啶配体的疏水性电荷诱导树脂，例如MEP树脂(BioSepra，Cergy，Saint Christophe，France)。
在一些实施方案中，离子交换树脂包含阴离子交换树脂。如本领域技术人员所知的，对基质以及所连接的带电基团而言，离子交换剂可以是基于各种材料的。例如，可以使用以下基质，其中所提及的材料可以或多或少地交联：MacroCap Q(GE HealthcareBiosciences，Piscataway，NJ)、基于琼脂糖的基质(例如SepharoseSepharoseFast和Sepharose High )、基于纤维素的基质(例如DEAE)、基于葡聚糖的基质(例如)、基于二氧化硅的基质和基于合成聚合物的基质。对于阴离子交换树脂，共价连接到基质上的带电基团可以是例如二乙基氨基乙基、季氨基乙基和/或季铵。在一些实施方案中，阴离子交换树脂包含季胺基。用于结合抗M-CSF抗体的具有季胺基团的示例性阴离子交换树脂为Q树脂(Amersham，Piscataway，N.J.)。
在其它方面，如果在组合物经历上述阴离子交换色谱步骤之后，内毒素水平高于所需的，则组合物可以备选地经历阳离子交换树脂。在一些实施方案中，组合物中的任何内毒素与离子交换树脂的结合应当不同于所讨论的蛋白质的结合，从而从内毒素中纯化蛋白质。在这点上，内毒素是带负电荷的，并且通常结合阴离子交换树脂。如果蛋白质和内毒素都与阴离子交换树脂结合，则可以通过使用盐梯度将两者洗脱至不同的级分来实现其中一种从另一种中的纯化。通过相对于蛋白质的pI改变缓冲剂的pH，也可以影响蛋白质与特定树脂的相对结合。在一些实施方案中，阳离子交换色谱是采用的唯一的离子交换色谱。
在一些实施方案中，如果在阴离子交换树脂之后内毒素水平太高，则组合物可以进一步经历第二离子交换步骤，例如通过使组合物与阳离子交换树脂接触，随后进行洗涤步骤，然后从离子交换树脂中洗脱。在一些实施方案中，阳离子交换树脂包含用于结合的磺酸基。示例性的阳离子交换树脂为SP树脂FF(Amersham，Piscataway，N.J.)、Poros XS(CEX)(Life Technology，Grand Island，New York)。
在一些实施方案中，在产生具有规定水平的内毒素的抗体蛋白质溶液之后，在蛋白质的最终制剂之前有多个步骤。在一些实施方案中，半衰期延长部分与蛋白质缀合。然后将缀合物配制成注射到患者体内的最终药物制剂。在一些实施方案中，缀合物再次用离子交换树脂纯化，该离子交换树脂可以是阳离子交换树脂。在其他实施方案中，对蛋白质进行制剂。在所有情况下，应当使用正常的实验室程序以防止内毒素污染物引入至蛋白质样品或蛋白质-聚合物缀合物中。
实施例
实施例1.OG1802的合成途径1。
用于合成OG1802的第一种途径如下。首先，合成具有图1所示结构的TFA/胺盐引发剂(化合物L)，合成过程如下。
首先，合成具有图2所示结构的化合物K，合成过程如下。在氮气下向200mL圆底烧瓶中加入化合物J(OG1563)(1.9g，2.67mmol，3.3当量)
和化合物E(0.525g，0.81mmol，1.0当量)(参见图11)，随后加入二甲基甲酰胺(10mL)，然后加入二异丙基乙胺(2.5mL，14.6mmol，18当量)。使用冰浴将烧瓶冷却至0℃。在～6分钟内向其中加入丙基膦酸酐溶液(50重量％的乙酸乙酯溶液，2.5mL，4.04mmol，5当量)。
将反应升温至室温并搅拌15分钟。通过加入水(20mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和乙酸乙酯(100mL)淬灭反应。分离有机层，水层用乙酸乙酯(75mL)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)、0.5M柠檬酸水溶液(40mL)、水(25mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并真空浓缩。残余物无需进一步纯化即可使用，得到2.0g(0.80mmol，99％)化合物K。
1H NMR(400MHz DMSO-d6):δ＝1.36(s,9H,OCCH3),1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J＝7.2Hz,6H,CCH2 CH2NH),2.98(d,J＝5.6Hz,6H,CCH2 NH),3.04(q,J＝6.0Hz,2H,OCH2 CH2 NH),3.18(s,2H,OCH2 C),3.3-3.37(m,8H,CH2 ),3.47-3.55(m,12H,CH2 ),3.58(s,6H,OCH2 C),3.87(s,6H,O＝CCH2 O),4.27(s,18H,CCH2 OC＝O),6.74(br t,1H,CH2 NHC＝O),7.69(t,J＝6.8Hz,3H,CH2 NHC＝O),7.84(t,J＝6.0Hz,3H,CH2 NHC＝O).
LC-MS(ES,m/z):[(M+2H-boc)/2]+计算值(C84H136Br9N7O33+2H-Boc)/2＝1196.6；实测值1196.6。
接下来，合成化合物L(图1)，合成过程如下：在氮气下，向100mL圆底烧瓶中加入化合物K(2.0g，0.8mmol)、二氯甲烷(10mL)，然后加入三氟乙酸(5mL)。将反应物在室温下搅拌30分钟。将反应物在真空下浓缩。使用二氯甲烷(10mL)稀释反应物并在真空下浓缩。使用乙腈(10mL)溶解残余物，通过针筒式滤器(Acrodisc CR25，PN 4225T)过滤，并上样到制备型HPLC柱上，用60％的乙腈水溶液(含0.1％三氟乙酸)至98％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脱。合并含有产物的试管，在真空下浓缩，冷冻并置于冷冻干燥器上。得到990mg(0.4mmol，2个步骤的产率50％)白色粉末状化合物L。
1H NMR(400MHz DMSO-d6):δ＝1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J＝7.2Hz,6H,CCH2 CH2NH),2.97-3.0(m,8H,CCH2 NH和OCH2 CH2 NH),3.17(s,2H,OCH2 C),3.3(q,6H,CH2 CH2 NHC＝O),3.4-3.59(m,20H,CH2 ),3.87(s,6H,O＝CCH2 O),4.27(s,18H,CCH2 OC＝O),7.69-7.84(m,9H,CH2 NHC＝O和NH3+).LC-MS(ES,m/z):[(M+2H)/2]+计算值(C84H136Br9N7O33+2H)/2＝1196.6；实测值1197.4.
接下来，将化合物L用作引发剂以合成MPC聚合物。通常将引发剂制备成约100mg/mL的DMF储备溶液。将引发剂和配体(2,2’-联吡啶)引入Schlenk管中。使用干冰/丙酮混合物将所得溶液冷却至-78℃，并在真空下脱气10分钟。将管在氩气下再次填充，把保持在氩气下的催化剂(CuBr，除非另有说明)引入Schlenck管中(引发剂中的溴原子/催化剂(CuBr)/配体的摩尔比保持在1/1/2)。溶液立即变为深棕色。将Schlenk管密封，并立即通过施加短循环真空/氩气吹扫。通过将在保持于氮气下的手套箱中制备的确定量的单体与200标准酒精度(proof)的脱气乙醇混合来制备HEMA-PC的溶液。将单体溶液逐滴加入Schlenk管(通过套管)(并轻轻搅拌使其均匀)。温度保持在-78℃。对反应混合物施加完全真空至少10-15分钟直到溶液鼓泡停止。然后用氩气再填充该管并升温至室温。搅拌溶液，随着聚合的进行，溶液变粘稠。在3-8小时或使其过夜之后，通过直接暴露于空气中以将Cu(I)氧化为Cu(II)使反应猝灭，混合物变成蓝绿色，并通过硅胶柱以除去铜催化剂。通过旋转蒸发浓缩收集的溶液，所得混合物用四氢呋喃沉淀或用水透析，然后冷冻干燥，得到自由流动的白色粉末。下表1.1列出了使用化合物L作为引发剂的聚合物的聚合物数据。
表1.1
接下来，将马来酰亚胺Mal-PEG4-PFP酯搭接(如图29所示)到上文提及的750kDa聚合物以提供OG1802。向20mL小瓶中加入聚合物R3707(使用L作为引发剂制备的750kDa聚合物，515mg)，用乙醇(4.0mL)在搅拌40分钟后溶解。向其中加入1％4-甲基吗啉的乙腈(22μL)溶液。在单独的小瓶中将Mal-PEG4-PFP(1.97mg)溶于乙腈(1.0mL)中，并将该溶液在室温下在～2分钟内加入到聚合物溶液中，将所得溶液搅拌过夜。将反应物用0.1％三氟乙酸水溶液(2mL)(pH～5)稀释，然后用水(～12mL)稀释，通过针筒式滤器(Acrodisc Supor，PN4612)过滤，并均匀地置于3个Amicon离心膜透析管(截留分子量为30,000)中。将管稀释并与水混合(每管～5mL)，置于离心机(rpm 3200)中离心25分钟。移出滤液用于分析，同时稀释保留物并与水混合(～10mL/管)。离心过程再重复5次，之后移出保留物并置于小瓶中。用水冲洗Amicon膜管(2×～2mL每管)，并将其与保留物合并。将保留物溶液通过针筒式滤器(Acrodisc Supor，PN 4612)过滤、冷冻并置于冷冻干燥器上。得到485mg白色粉末。
实施例2.引发剂OG1786的合成
OG1786是用于聚合物合成的九臂引发剂，其在OG1802的合成中用作前体。每条臂都用2-溴异丁酸酯封端，2-溴异丁酸酯能够在ATRP下引发聚合。OG1786是三氟乙酸(TFA)的盐，如图30所示。OG1786的制备如下。首先，如图31所示，使OG1550与TFA(三氟乙酸)反应以产生OG1546。
在装备有磁力搅拌棒和加料漏斗的1L圆底烧瓶中，加入OG1550(14.8g)、甲基叔丁基醚(MTBE)(350ml)和水(30ml)。搅拌混合物以溶解OG1550，然后在冰浴中冷却。在90分钟内向该混合物中滴加三氟乙酸(4.9ml)的水(90ml)溶液。加入完成后，将混合物再搅拌15分钟，然后从冰浴中取出，使其升温至室温。将混合物再搅拌(从冰浴中取出后)4-5小时，直到tlc显示剩余～5％的起始材料，并且水溶液的pH在3和4之间(pH试纸)。
使混合物分层。MTBE层用水(30ml)洗涤。合并水层，然后用MTBE(150ml)萃取水层。将该第二个MTBE相用水(30ml)洗涤。合并的水层用第三部分的MTBE(100ml)洗涤。第三个MBTE相用水(25ml)洗涤。再次合并水层(～250ml，pH～4，通过pH试纸测得)。
通过冷冻干燥收集产物。得到11.5g白色固体。这种物质是极度吸湿的，因此最好在氮气下处理。通过LCMS对产物进行验证。
然后，使制备的OG1546与OG1563反应得到OG1784(如图32所示)。
在氮气下，向装备有搅拌棒的250ml烧瓶中加入OG1546(吸湿的，9.0g)，然后加入N,N-二甲基甲酰胺(110ml)。将混合物在室温下搅拌，直到所有OG1546溶解(约15分钟)，然后加入OG1563(29.9g)，混合物再搅拌3分钟，直到OG1563也溶解。将所得溶液在冰浴中冷却，在3分钟内加入N,N-二异丙基乙胺(37.6ml)，然后在5分钟内滴加50％的丙基膦酸酐(T3P)的乙酸乙酯(34.5ml)溶液(T3P的加入是放热的)。在T3P加入完成后，将烧瓶从冷却浴中取出并使其达到室温。然后以5分钟间隔取样用于LCMS分析。反应显示非常浅的黄色/棕褐色。
20分钟后，将反应物在冰浴中再次冷却，加入5ml水。然后从冷却浴中取出混合物，再分批加入50ml水，随后加入50ml 0.5M柠檬酸，然后加入乙酸异丙酯(300ml)。使混合物分层。用另外的乙酸异丙酯(150ml)萃取水相(～300ml)。水相为用于HPLC测试的AQ1。将合并的有机物层用柠檬酸水溶液(115ml，65mM，其是15ml的0.5M柠檬酸加上100ml水的混合物)洗涤，水相为AQ2(pH～3)。有机相用水/饱和氯化钠(100ml/25ml)洗涤，水相为AQ3(pH～3)。有机相最后用饱和氯化钠(100ml)洗涤，水相为AQ4。AQ级分均不含有任何重要产物(未提供数据)。通过LCMS证实有机相含有产物。产物用硫酸钠(80g)干燥，过滤，用乙酸异丙酯(75ml)冲洗，并在旋转蒸发器上浓缩，得到棕褐色油状物(33.2g)。将粗产物在氮气下储存过夜。
第二天使粗产物达到室温，然后溶解于乙腈/水(46ml/12ml)中，并使用HPLC盘式过滤器(Cole-Parmer PTFE0.2μm，产品编号02915-20)过滤。将滤液分成三等份并在三次运行中纯化。
将滤液上样至用50％乙腈/水平衡的RediSep Rf Gold C18柱(275g，SN 69-2203-339，批号24126-611Y)上。使用以下梯度(溶剂A：水，溶剂B：乙腈)以100ml/min的流速洗脱物质。通过HPLC检测所有相关级分。合并确定为足够纯的(来自所有三次运行的)级分并在旋转蒸发仪上浓缩(浴温保持在约20℃)，然后在二氯甲烷(100ml)和水(5ml)/饱和氯化钠(25ml)之间分配。将水层用二氯甲烷(2×30ml)再萃取两次。将合并的有机物层用硫酸钠(35g)干燥，过滤，用DCM(30ml)冲洗，并浓缩。通过LCMS方法证实产物和纯度。表2.1示出了R5172和R5228批次的分离产率和纯度。
表2.1
接下来，由OG1784制备OG1405，如图33所示。在装备有磁力搅拌棒的500ml圆底烧瓶中，加入OG1784(20.9g)，然后加入二氯甲烷(50ml)，然后加入三氟乙酸(20ml)。将混合物在室温下搅拌，HPLC分析显示在23分钟内完全脱保护。将混合物在旋转蒸发器上浓缩，再溶解在二氯甲烷(25ml)中并再次浓缩，然后再溶解于乙腈(25ml)中并再次浓缩。通过LCMS证实产物。将由此得到的物质(OG1405，34.5g，假定定量收率为21.0g)用作下一步中的油状粗产物。不需要纯化。
接下来，使OG1405与OG1402反应以制备OG1785，如图34所示。在氮气下，在装备有搅拌棒的500ml烧瓶中加入OG1402(5.5g)，随后加入乙腈(70ml)，然后加入N,N-二异丙基乙胺(26.3ml)和T3P溶液(见上文)(7.9ml)。将溶液在室温下搅拌30分钟，然后在冰水浴中冷却，加入OG1405(以上所得油状粗产物，34.5g)的乙腈(70ml)溶液。将混合物升温至室温。20分钟后，将反应物在冰水浴中冷却，并用水(5ml)淬灭反应。然后使用旋转蒸发器将混合物在真空下浓缩至一半体积。取样用于LCMS。
加入更多的水(50ml)，随后加入0.5M柠檬酸(75ml)和乙酸异丙酯(175ml)。混合物在5分钟内分层。水层用另外的乙酸异丙酯(50mL)萃取。合并的有机物层用柠檬酸水溶液(0.13M，30ml，由10ml 0.5M柠檬酸和20ml水组成)洗涤。然后将有机物层用饱和氯化钠(25ml)和水(25ml)的混合物洗涤，最后用饱和氯化钠(25ml)洗涤。然后将它们用硫酸钠(124g)干燥，过滤，用乙酸异丙酯(30ml)冲洗，并在旋转蒸发器浓缩，得到棕褐色油状物(27.3g)。取样用于LCMS分析。
将油状物溶解在乙腈/水(3:1，15ml/5ml)中，通过HPLC盘式过滤器(Cole-ParmerPTFE膜0.2μm，产品编号02915-20)过滤，并分成三等份，其中对每份进行如下的单独纯化。
将每份上样至用50％溶剂B(乙腈)/50％溶剂A(水)平衡的Redi-Sep Gold C18柱(275g，SN-69-2203-339，批号241234-611W)。然后通过反相HPLC采用溶剂A：水/溶剂B：乙腈梯度纯化该物质。合并适当的级分并使其在二氯甲烷(150ml)与水(5ml)/饱和氯化钠(25ml)之间进行分配。水层用二氯甲烷(2×50ml)萃取两次。合并的有机物层用硫酸钠(60g)干燥，过滤，用二氯甲烷(40ml)冲洗并浓缩。通过包括LCMS在内的各种分析证实结构和纯度：分离出OG1785，为泡沫状固体(R5329，19.0g，83％产率，95.1％纯度(a/a210nm))，于4℃在氮气下储存。
接下来，使用三氟乙酸(TFA)除去OG1785上的叔丁氧基羰基保护基团，得到OG1786，如图35所示。
实施例3.聚合物OG1801的合成
首先由引发剂OG1786制备聚合物OG1801。OG1801具有胺官能团，其在聚合物合成期间(比马来酰亚胺)更稳定。为了合成聚合物OG1801，使用改进版本的ATRP，其中通过向Cu(II)中加入金属铜而原位产生铜物质(Cu(I))。基于分批加入的单体(HEMA-PC)OG47以及目标分子量(MW)计算反应中所需的起始材料和试剂。
在手套箱中称取50g单体OG47，并在室温下加入200mL脱气的EtOH以溶解单体；取样进行单体浓度测试。将称量的Cu(II)、Bpy、Cu(0)加入500mL烧瓶中，用氩气吹扫，同时向烧瓶中加入单体溶液；用塞子密封烧瓶并抽真空25分钟直至无气泡。反应物颜色逐渐从浅绿色变为深绿色，然后变为浅棕色；在手套箱中称取～200mg引发剂OG1786，并在室温下溶解在～2000μL DMF中以制备100mg/mL的储备溶液；取样用于引发剂浓度和纯度测试；在氩气下向烧瓶中加入引发剂溶液。反应溶液变成深棕色，并开始随时间变稠；密封系统，让反应进行2天。
然后制备OG1801用于加入马来酰亚胺，并按如下过程除去催化剂(铜)：使用预装柱的Rf正相硅胶柱来除去催化剂。基于反应混合物中铜的量来选择柱的尺寸。例如，将330g柱(目录号69-2203-330，柱尺寸330g，CV＝443mL)用于50g批次的OG1801。当EtOH为洗脱溶剂时，特氟隆管(Teflon)用于所有连接。
除去铜后，将所有级分分批转移到圆底烧瓶中，并通过旋转蒸发器在45-50℃下减压蒸发EtOH至干燥。在该步骤中，监测从冷凝中收集的EtOH的体积以确保EtOH去除率>90％。将聚合物溶解在250mL WFI中，并使用0.2μm过滤器过滤。得到～150mg/mL的澄清至浅黄色聚合物溶液。使用前，溶液可在2-8℃储存长达3个月。
实施例4.聚合物OG1802的合成
基于分批加入的OG1801计算反应所需的起始材料和试剂。接头为3-马来酰亚胺基丙酸、NHS酯。向50g聚合物溶液(～150mg/mL)中加入30ml 0.5M磷酸钠(WFI溶液，pH8)。搅拌1分钟；pH试纸测量pH值为8.0。称量204.8mg接头并溶解于4.1mL DMF中以制备50mg/mL的储备液；在强烈搅拌下将接头溶液滴加到聚合物溶液中，每分钟加入815μL。加入4095μL接头溶液花费5分钟。在室温下反应30分钟。用20mL 5％乙酸淬灭反应以使最终pH为5。使用1L真空过滤器(0.2μm)过滤溶液。
然后对OG1802(参见图36)进行如下纯化：将Milipore交叉流过滤盒用于水性系统中的聚合物纯化。从将聚合物溶液浓缩至250mL(～200mg/mL)开始进行。从储液器中加入新鲜WFI，并将新鲜WFI进料的流速调节至与渗透物相同(～2mL/min)。UF/DF在2-8℃下过夜。通常使用2.5L的WFI(相对于聚合物溶液为10倍的体积比)。收集保留物样品用于纯度测试。目标纯度>98％。通过0.2μM 1L过滤瓶过滤聚合物溶液。在缀合前，聚合物溶液可以在2-8℃下储存长达3个月。
实施例5.可选的磷酸胆碱聚合物
按照如下所述合成HEA-PC聚合物。与上述甲基丙烯酸酯HEMA-PC不同，HEA-PC(2-(丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯)为丙烯酸酯，且具有以下结构：
使HEA-PC聚合至实施例1中所示的引发剂化合物L上。
表5.1
通过将2.2mg引发剂溶解在11μl无水DMF中来制备200mg/mL的引发剂储备溶液，通过将4.6mg Me6TREN溶解在23μL无水DMF中来制备200mg/ml的配体溶液。将8.25μl的引发剂储备溶液和13.6μl的配体分配到试管中。在-78℃下脱气5分钟，然后用氩气再填充，并加入1.2mg CuBr。脱气，再填充氩气。在-78℃下向反应器内的溶液中加入HEA-PC在甲醇中的储备溶液(称出0.461g HEA-PC并溶解在0.5mL甲醇中)。用200μl甲醇冲洗小瓶，并将其在-78℃下加入反应器中，然后加入0.5mL蒸馏水，再加入200μl水。彻底脱气，直到看不到鼓泡且所有不均匀性消失(固体颗粒溶解或消失)。用4psi氩气再填充，并使反应在室温下进行1小时。反应物已经是粘稠的。使反应进行约1小时。加入双吡啶的甲醇溶液(5mg双吡啶，在0.5uL甲醇中)。再加入2-3ml甲醇，使催化剂在4℃氧化过夜。通过1H NMR估算转化率为94％。
第二天，将聚合物透析，并在pH 7.4的1×PBS中使用Shodex SB806M_HQ柱(7.8×300mm)以1ml/min进行SEC/MALS分析，得到以下结果：PDI为1.157，Mn为723.5kDa，Mp为820.4kDa，Mw为837.2kDa(透析前PDI为1.12，Mn＝695kDa，Mp＝778kDa)。接下来，将马来酰亚胺官能团加入到聚合物中，使得聚合物可以与蛋白质缀合。
接下来，将马来酰亚胺Mal-PEG4-PFP(见上述实施例1)酯搭接到HEA-PC聚合物上，如实施例1所示。如本文针对HEMA-PC聚合物所讨论的，然后可将得到的马来酰亚胺官能化的HEA-PC聚合物与巯基缀合。
还使用具有以下结构的单体2-(丙烯酰胺基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯(Am-PC)制备丙烯酰胺PC聚合物：
使用具有以下结构的3臂引发剂(TFA盐)进行Am-PC的聚合：
如下所述进行Am-PC聚合物的合成：
表5.2
通过将9mg Me6TREN溶解在45μL无水DMF中制备200mg/mL的配体储备溶液。将19.7μL的储备溶液加入到反应容器中。通过将6.5mg物质溶解在32.5μL DMF中制备200mg/mL的引发剂储备溶液。向以上所得的配体中加入11uL引发剂储备溶液。脱气5分钟。加入1mgCuBr。通过将4mg CuBr2溶解在20μL DMF中制备200mg/mL的CuBr2储备溶液。将0.5g单体(AmPC)加入到1mL甲醇(缓慢溶解/粘稠溶液)中，然后加入1μL CuBr2的储备溶液。将单体溶液滴加到上述反应混合物中。用1mL水冲洗。将反应混合物彻底脱气(冻-融)。让反应进行24小时。
然后可以透析Am-PC聚合物。通过SEC/MALS测定上述聚合物的分子量：Mn为215kDa，Mp为250kDa，PDI为1.17。通过1H NMR估算转化率为94％。按照上文针对HEMA-PC和HEA-PC所讨论的，将马来酰亚胺官能团(functionality)添加到Am-PC聚合物中。马来酰亚胺官能化的Am-PC聚合物可以如上所述与蛋白质缀合。
实施例6.用于计算化合物中的游离马来酰亚胺的反向Ellman测定法。
在向聚合物OG1801添加马来酰亚胺官能团形成OG1802(见上文)后，使用Ellman测定法确定样品中功能性马来酰亚胺(即可缀合的)的量。在中性和碱性pH下，在水中，硫醇将Ellman试剂(DTNB)转化为TNB-然后转化为TNB2-，其为黄色(在412nm下测量)。使用半胱氨酸建立标准曲线。由于马来酰亚胺与硫醇反应，该测定实际上测量剩余的硫醇(半胱氨酸)。按照(原始硫醇-马来酰亚胺聚合物加和后留下的硫醇)/(原始硫醇)来计算抑制作用，并将其以百分比表示。
在测定中使用的试剂：使用62.5μM至2μM的半胱氨酸制备标准曲线。通过将粉末溶解在pH7.4的1×PBS(反应缓冲剂)中并充分混合来制备聚合物储备溶液。将等摩尔的聚合物和半胱氨酸溶液混合，并使其在27℃下反应30分钟。将150μM的DTNB溶液加入到半胱氨酸标准品和聚合物/半胱氨酸反应中，并在27℃下显色5分钟。在Spectramax读板机上读取412nm处的OD，并用Softmax Pro软件和半胱氨酸标准曲线计算抑制百分比。
实施例7.包含抗-VEGF-A抗体重链和抗-VEGFA-抗体轻链的抗体(OG1950)的蛋白质序列，所述抗-VEGF-A抗体重链具有L443C(EU编号，或SEQ ID NO：1中的449C)突变
克隆具有L443C(EU编号)突变的抗-VEGF-A抗体，其具有下文SEQ ID NO.1中所示的序列(图12)(重链)。克隆抗-VEGF-A抗体轻链，其具有下文SEQ ID NO.2所示的序列(图13)。
实施例8a.OG1950的纯化和去帽
可以将OG1950重链和轻链克隆到表达质粒中并转染到CHO细胞中。细胞可以在合适的培养基中生长并收获。可以使用上述技术纯化OG1950。OG1950位置443(L443C(EU编号))处的半胱氨酸残基通常被细胞培养基中的化学物质“封端”或氧化，并且不可用于缀合。鉴于此，将纯化的OG1950进行去帽(即还原)程序以将帽除去并使游离的半胱氨酸残基(即不参与Cys-Cys二硫键的那些)与聚合物的马来酰亚胺官能团缀合。通过在25℃下将纯化的OG1950蛋白与30x摩尔过量的还原剂TCEP(3,3′,3″-膦三基三丙酸(Phosphanetriyltripropanoic acid))混合1小时来进行去帽。通过SDS-PAGE检测用TCEP进行的还原反应。变性后，可以使用Pellion Xl超滤盒、用20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，0.5mM TCEP缓冲剂通过UFdF洗涤OG1950蛋白以除去帽。然后可以在相同的UFdF装置中、用20mM Tris pH7.5，150mM NaCl除去TCEP试剂。然后可以使用空气(环境氧气)使还原的OG1950再次折叠，然后再进行SDS-PAGE作为测定。
实施例8b.OG1950的纯化和去帽
可以将OG1950重链和轻链克隆到表达质粒中并转染到CHO细胞中。细胞可以在合适的培养基中生长并收获。可以使用上述技术纯化OG1950。OG1950位置443(L443C(EU编号))处的半胱氨酸残基通常被细胞培养基中的化学物质“封端”或氧化，并且不可用于缀合。鉴于此，将纯化的OG1950进行去帽(即还原)程序以将帽除去并使游离的半胱氨酸残基(即不参与Cys-Cys二硫键的那些)与聚合物的马来酰亚胺官能团缀合。通过在25℃下将纯化的OG1950蛋白与30x摩尔过量的还原剂TCEP(3,3′,3″-膦三基三丙酸)混合1小时来进行去帽。通过SDS-PAGE检测用TCEP进行的还原反应。还原后，OG1950蛋白可以通过超滤/渗滤(UF/DF)系统、使用Millipore的配有30kDa MWCO膜的Pellicon XL超滤盒，用20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，0.5mM TCEP缓冲剂洗涤，以除去帽和过量的TCEP。然后可以在相同的UF/DF装置中用20mM Tris pH7.5，150mM NaCl除去残余TCEP试剂。然后，在环境温度下使用dHAA使还原的OG1950再氧化1小时，随后通过UF/DF除去dHAA，以形成去帽的OG1950。通过SDS-PAGE测定法检测去帽状态。
实施例9.OG1950与MPC聚合物缀合
去帽OG1950可以与聚合物OG1802缀合。使用过量的OG1802(10-20倍摩尔过量)。可以通过SDS-PAGE监测缀合并将驱动其接近完成。OG1950缀合物可以通过阳离子交换色谱法纯化，并通过UF/DF将缓冲剂交换到制剂缓冲剂中。聚合物-OG1950缀合物可以如上所述通过色谱纯化。
实施例10.OG1950SPR结合动力学
该实施例说明了在单循环动力学BIAcoreTM实验中OG1950与VEGF-165的结合
在配备有蛋白质A芯片(GE Healthcare)的BIAcoreTM T200系统(GE Healthcare)上进行OG1950与人VEGF-165的SPR相互作用分析。实施单循环动力学方法。以10μl/min的流速用25s的脉冲在HBS-EP+缓冲剂(0.01M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，0.15M氯化钠和0.05％聚山梨醇酯20)中在25μg/mL下捕获抗体。随后，以30μl/min的流速和1000s的最终解离时间以60s的脉冲施加不同浓度的重组人VEGF-165(R&D Systems)。该实验在25℃下进行。在50μL/min的流速下用10mM甘氨酸pH 1.7将表面再生1分钟。使用Biacore T200评估软件进行结合动力学分析，其中响应整体拟合至1：1相互作用。结果总结在表10.1和图21中。
表10.1.OG1950与VEGF-165的结合动力学
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
OG1950 3.35E+05 6.77E-08 2.02E-13
OG1950在1：1结合拟合模型中显示<1pM KD(超出仪器灵敏度)。
实施例11-OG1953的缀合并使用阳离子交换色谱法纯化
OG1950蛋白质表达和蛋白质制备：OG1950蛋白质在哺乳动物GSCHOK1表达系统中表达，然后使用蛋白质A亲和柱纯化。基于尺寸排阻色谱和SDS-PAGE，蛋白质A柱纯化的OG1950的纯度超过90％。OG1950的工程化特异性半胱氨酸残基可用于与OG1802生物聚合物进行硫醇缀合。OG1802的硫醇反应性化学基团反应形成稳定的共价键，从而形成OG1953生物缀合物。为此，用Tris-(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原剂完全还原1mg的OG1950，然后使用30KDa旋转浓缩器通过缓冲剂交换除去TCEP。然后使完全还原的OG1950蛋白再氧化以确保形成所有预期的蛋白质二硫键形成，除了工程化的半胱氨酸残基(去帽OG1950)，工程化的半胱氨酸残基保持还原形式用于通过硫醇特异性缀合化学过程与生物聚合物缀合。
缀合反应：通过将100ug的去帽OG1950与15x摩尔过量的OG1802生物聚合物混合来进行缀合反应，OG1802生物聚合物在Tris缓冲剂(20mM Tris，100mM NaCl，pH7.5)中的最终蛋白质浓度为2mg/mL。在不同的缀合反应中评估各种添加剂，如表11.1所示。为了比较它们对缀合效率的影响。将所有反应设定在固定体积中并在4℃下孵育20小时。表11.1和图19显示了缀合反应A至G的离子交换分析(A280吸光度)和分馏。反应A仅含有缓冲剂；反应B仅含有OG1950抗体；反应C含有OG1950抗体+OG1802聚合物；反应D含有OG1950抗体+OG1802聚合物+蔗糖；反应E含有OG1950抗体+OG1802聚合物+海藻糖；反应F含有OG1950抗体+OG1802聚合物+谷氨酸；反应G含有OG1950抗体+OG1802聚合物+天冬氨酸。反应B-G以100ug OG1950蛋白质投入开始，具有固定的总反应体积。反应完成后，注入等体积的B-G反应物进行IEX分析。缀合效率比较显示在图19中。峰1(P1)代表过量的生物聚合物(OG1802)，其未与蛋白质缀合并且不能与离子交换柱结合，因此在每个反应中作为未结合的级分洗脱；峰2(P2)代表每个反应中的抗体聚合物生物缀合物；峰3(P3)代表在每个反应中未与聚合物缀合的游离抗体。
表11.1
从以上结果可以看出，各种赋形剂均允许显著较高的缀合效率。不希望受理论限制，有助于维持成分溶解度的此类赋形剂有助于缀合效率。
OG1953缀合反应的阳离子交换分析：在缀合反应完成后，将5ul每种反应混合物用柱平衡缓冲剂(20mM乙酸钠pH 5.5)稀释3倍，用于阳离子交换色谱(IEX)分析并使用ShodexSP-825HPLC柱分离。IEX在结合和洗脱模式下进行，其中首先将反应混合物稀释以降低盐浓度，使得缀合物和未反应的蛋白质都与柱结合，然后进行盐梯度洗脱，其中增加NaCl浓度会导致缀合物(OG1953)和未缀合的游离蛋白(OG1950)在不同的保留时间由于差异电荷变化而洗脱。如图19所示，IEX分析结果显示OG1953缀合物(峰P2)与如峰P1中所示的未反应的游离聚合物(OG1802)和如P3中所示的未反应的游离蛋白质(OG1950)非常好地分离。
扩大纯化OG1953缀合物用于活性分析：合并缀合反应物D和E并用IEX进一步分离，其中收集缀合物峰(P2)洗脱的级分并浓缩用于活性分析。
实施例12——使用ELISA分析抗-VEGF分子对生物素-VEGF与VEGFR的结合的影响。
在ELISA测定中测试OG1950、OG1953和其他抗-VEGF分子抑制生物素-VEGF-165与VEGFR结合的能力。用1ug/mL重组VEGF R1-Fc蛋白(R&D systems，货号#321-FL-050)包被96孔ELISA板。将板在室温下孵育过夜。然后洗涤平板并用封闭缓冲液(在1x PBS，pH7.4中的1％BSA)封闭≥90分钟，同时轻轻摇动。制备3倍稀释系列的测试样品。从400nM开始，将样品与生物素-VEGF(R&D systems，货号#custom06)混合。生物素-VEGF的最终浓度为4ng/mL(100pM)。样品稀释系列的最高浓度为85ug/mL。制备稀释液后，将样品在室温下孵育≥30min，然后洗涤3次。洗涤后，将100uL样品/生物素-VEGF混合物转移到每个孔中。将板在室温下孵育≥90分钟并轻轻摇动。孵育后，向每个孔中加入100μl 1：1500稀释的SA-HRP(R&Dsystems，货号#A7906)。孵育的平板避光保持约20分钟。然后将板洗涤3次。洗涤后，加入100ul TMB底物(R&D systems，货号#DY998)。将板孵育并避光保持约30分钟。监测显色。通过添加50ul终止溶液来停止显色。在450nm下读板。结果显示在图20中。
这些结果显示，与OG1950(未缀合的抗体)以及市售的VEGF抑制剂(雷珠单抗)和(贝伐单抗)相比，OG1953抗体/缀合物对生物素-VEGF与VEGFR的结合达到更高的最大抑制。在典型的VEGF配体VEGF受体结合测定中，添加OG1953导致抑制97-98％的VEGF配体与VEGF受体的结合。将其与添加OG1950进行比较，OG1950可抑制75-87％的VEGF配体/受体结合，与添加(雷珠单抗)或(贝伐单抗)比较，(雷珠单抗)或(贝伐单抗)中的每种仅能抑制68-78％的VEGF配体/受体结合。此外，先前的研究表明，添加浓度为400nM的OG1950、(雷珠单抗)或(贝伐单抗)不会导致VEGF配体与VEGF受体的结合的100％抑制。
图20还显示，与单独的抗体(抗-VEGF)相比，其他抗体缀合物抗-VEGF生物缀合物(抗-VEGF BC)对VEGF与VEGF受体的结合达到更高的最大抑制。这些结果一起表明，(i)与目前可用的VEGF抑制剂相比，OG1953抗体缀合物在抑制VEGF配体与VEGF受体结合方面更有效，并且(ii)在活性位点区域外的位点处缀合VEGF抗体可以导致对VEGF配体与VEGF受体结合的抑制增加。
在一些实施方案中，与单独的抗-VEGF抗体相比，本文提供的抗-VEGF抗体缀合物显示出优异(或至少相等)水平的阻断能力。
实施例13——测定OG1950与Fcγ受体I和IIIa的结合的方法
使用BIAcore T200在25℃下进行结合动力学实验。将抗-his抗体固定在CM5芯片上。在HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％吐温-20)中制备浓度为0.5μg/mL的组氨酸标记的FcγRI和FcγRIIIa，仅在活性流动池中使用5μL/min的流速独立地注射60-s。然后，应用单循环动力学方法，以30μL/mL用60-s注射，将抗体候选物和作为阳性对照的(贝伐单抗)注射到参照和活性流动池上。FcγRI使用0.48至300nM范围的抗体浓度，FcγRIIIa使用7.8nM至2000nM范围的抗体浓度。每次运行后，使用50μ/mL的流速用10mM甘氨酸pH 1.7注射60s以再生流动池。数据为双参照的(doublereferenced)，减去参照流动池和空白循环。使用BIA评估软件进行分析。结果显示在图22和23中。结果显示，在该测定中OG1950并未与Fcγ受体I和IIIa显著结合。
实施例14-测定OG1950与人补体蛋白C1q的结合的方法
通过C1q ELISA结合测定评估补体接合倾向(complement engagementliability)。将抗体组从在1xPBS中的最高浓度10ug/mL以1：2进行滴定，在4℃下过夜包被。然后在1％BSA中进行2小时封闭步骤后封闭平板。然后在室温下施加1％BSA中的5ug/mL纯化的人C1q，持续2小时，然后用HRP缀合的抗人C1q抗体和TMB显色进行检测。结果显示在图24中。结果显示，在10μg/mL和0.625μg/mL之间的抗体浓度下，相对于OG1950，C1q对(贝伐单抗)具有更高的结合亲和力。
在一些实施方案中，OG1950的结合小于Avastin结合的10％。在一些实施方案中，OG1950与C1q的结合比Avastin(贝伐单抗)要小。
实施例15—抗-VEGF剂对VEGF刺激的HRMVEC增殖的影响
人视网膜微血管内皮细胞(HuRMVEC)增殖测定如下进行：将细胞维持在补充有2％的CultureBoost(cell systems，#4CB-500)和0.2％的Bac-off(cell systems，#4ZO-643)的CSC完全培养基(cell systems，#4Zo-500)中，以每孔10,000个细胞的密度接种在96孔板中的测定培养基中(无血清培养基(cell systems，#4Z3-500-S)，含5％FBS)。首先以指定浓度将VEGF抑制剂加入每个孔中。30分钟后，加入VEGF 165(R&D systems，#293-VE-500/CF)至终浓度为1.3nM。3天后，将细胞与WST-1细胞增殖测定试剂孵育，并在OD450nM下读数。
结果证明，OG1953的两个独立的制备物(OG1953A和OG1953B)均显示出对HuRNVEC增殖的强有力的抑制。在该测定中，OG1953的最大抑制和IC50与单独的抗体OG1950的最大抑制和IC50相当。OG1953的最大抑制还显著优于(贝伐单抗)和(阿柏西普)。结果(包括IC50值和它们与(雷珠单抗)、(阿柏西普)和(贝伐单抗)的比较)示于图25中。
实施例16—25度下VEGF与捕获在蛋白质A芯片上的抗-VEGF剂结合的单循环动力学(SCK)
使用BIAcore T200，在25℃下，对(贝伐单抗)、OG1950和OG1953进行结合动力学。简言之，在蛋白质A芯片(GE)上捕获抗-VEGF剂。将1ug/mL OG1950和(贝伐单抗)以25ul/min流动2分钟。10ug/mL OG1953以10ul/min流动10分钟。使VEGF(重组；R&D系统)各自以0.56nM，1.67nM，5nM，15nM和45nM在捕获的抗体上流动240秒接触时间进行单循环动力学，并解离30分钟。使用BiaEvaluation软件(GE)进行分析。所有传感图减去双参照，并使用1：1Langmuir结合模型拟合。由于抗-VEGF剂和蛋白质A捕获之间的解离，在该实验中可能低估了这些抗-VEGF剂的解离速率。
结果如图26所示，包括计算的KD、ka和kd值。
实施例17—赋形剂筛选实验，用于防止OG1802聚合物诱导的IgG1沉淀
使用标准缀合反应方法设置，发现OG1950缀合反应混合物是浑浊的，混合后立即出现沉淀。进一步研究显示沉淀物是蛋白质本身，其反过来导致通过SDS-PAGE或离子交换分析观察到的缀合效率差，因为蛋白质通过沉淀损失而不是参与缀合反应。
进行的初始排错实验揭示了不产生澄清反应溶液的情况包括(1)聚合物摩尔过量比从10以上降低至小于5；(2)将反应溶液的pH从标准中性pH范围(例如pH6.5-7.5)预调节至更酸性(例如pH5)或碱性(例如pH8.5)；(3)测试与OG1950相比具有相似或不同等电点(pI)的其他IgG1蛋白样品；(4)将样本存储缓冲液更换为1xPBS pH 7.4或20mM Tris缓冲剂pH 7.4，100mM NaCl；以及(5)用pH7.4的20mM Tris缓冲剂预调节OG1802溶液。
已知蛋白质带有净表面电荷，有助于蛋白质在水性溶液中的溶解性。氨基酸是指亲水性氨基酸，包括精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸和谷氨酸。在中性pH 7下，这些氨基酸的侧链带有电荷——精氨酸和赖氨酸带正电荷，天冬氨酸和谷氨酸带负电荷。改变溶液pH可调节内在蛋白质溶解度，因此在上述一些排错实验例如(2)中应用了该方法。理论上，蛋白质在水性溶液中的溶解度根据表面的疏水性质或亲水性质的水平而不同。具有更大疏水性质的表面的蛋白质将容易沉淀。离子(例如NaCl或其他盐)的添加产生电子屏蔽效应，其使水颗粒和蛋白质之间的一些活性无效，当蛋白质彼此结合并开始聚集时降低溶解度。在目前的情况下，假设生物聚合物以促进分子间疏水相互作用(这导致蛋白质沉淀)的方式直接或间接调节蛋白质表面电荷和/或暴露表面。
确定调节蛋白质溶解度的赋形剂包括以下类别(i)去污剂，包括中性去污剂(例如0.1-1％聚山梨醇酯20或吐温20)或带电荷的去污剂(例如0.1-1％十二烷基硫酸钠(SDS))(ii)糖(例如6％海藻糖或6％蔗糖)(iii)带负电荷的氨基酸(例如0.03-1mM谷氨酸或0.03-1mM天冬氨酸)或带正电荷的氨基酸(例如1-100mM赖氨酸或精氨酸)(iv)离液剂或变性剂(例如1-100mM尿素，盐酸胍类似物或1-100mM精氨酸)(v)聚乙二醇(例如0.03-1mMPEG8000)；和(vi)有机溶剂(例如20％乙醇)。
在进一步的实验设计(DOE)研究中，基于它们与用于人注射用途的药物制造的相容性，从上述每个类别选择各种赋形剂。此外，在该评价中还包括极端酸性pH(pH为4)和碱性pH(pH为9)。选择标准IgG1蛋白样品用于该评估，其不含有工程化的半胱氨酸，以最小化这种未配对的半胱氨酸残基使沉淀观察复杂化的潜在干扰。表17.1描述了该矩阵(matrix)。带阴影的编号/行是产生澄清溶液的条件，而无阴影的行是产生不同程度的混浊或沉淀的条件。
表17.1
所得沉淀溶液(或非沉淀溶液)示于图28中。
上文或下文所引用的所有专利申请、网站、其它出版物、登录号等通过引用整体并入本文用于所有目的，其程度如同具体地单独指出每个单独文献通过引用并入本文。如果序列的不同版本与不同时间的保藏号相关联，则指的是在本申请的有效申请日时与保藏号相关联的版本。有效申请日指的是实际申请日或涉及保藏号的优先权申请的申请日(如适用)中较早的一个。同样地，如果在不同时间公开了出版物、网站等的不同版本，则指的是在本申请的有效申请日时最近公布的版本，除非另有说明。本文公开的任意特征、步骤、元素、实施方式或方面均可以与任意其它特征、步骤、元素、实施方式或方面组合使用，除非另有明确说明。尽管为了清楚和理解的目的通过说明和实施例的方式对一些实施方案进行了详细的描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。
序列表
<110> 科达制药（Kodiak Sciences）
维克多.D.派尔罗斯（Perlroth, Victor D.）
<120> 抗体及其缀合物
<130> KDIAK.004WO
<150> 62/273177
<151> 2015-12-30
<160> 14
<170> FastSEQ用于Windows版本4.0
<210> 1
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-VEGF-A重链
<400> 1
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原结合蛋白部分
<400> 11
Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原结合蛋白部分
<400> 12
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原结合蛋白部分
<400> 13
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原结合蛋白部分
<400> 14
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5

Claims (121)

1.一种抗体缀合物，其包含(1)抗-VEGF-A抗体和(2)含磷酸胆碱的聚合物，其中所述聚合物在抗体可变区外的半胱氨酸处与抗体共价键合，其中所述半胱氨酸已经通过重组DNA技术添加。
2.根据权利要求1所述的抗体缀合物，其中抗-VEGF-A抗体包含轻链和重链，所述重链包含Fc区。
3.根据权利要求2所述的抗体缀合物，其中半胱氨酸位于重链的Fc区。
4.根据权利要求3所述的抗体缀合物，其中抗-VEGF-A抗体是免疫球蛋白G(IgG)。
5.根据权利要求3或4所述的抗体缀合物，其中抗-VEGF-A抗体重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，并且抗-VEGF-A轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ IDNO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)。
6.根据权利要求4或5所述的抗体缀合物，其中抗-VEGF-A重链同种型是人IgG1。
7.根据权利要求6所述的抗体缀合物，其中抗-VEGF-A抗体的重链恒定结构域相对于人IgG1的恒定结构域具有一个或多个突变以调节效应子功能。
8.根据权利要求7所述的抗体缀合物，其中突变任选地为以下氨基酸位置中的一个或多个(EU编号)：E233X，L234X，L235X，G236X，G237X，A327X，A330X和P331X，其中X是任意天然或非天然氨基酸。
9.根据权利要求8所述的抗体缀合物，其中突变选自由以下组成的组(EU编号)：E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S和P331S。
10.根据权利要求9所述的抗体缀合物，其包括以下突变：L234A、L235A和G237A(EU编号)。
11.根据权利要求10所述的抗体缀合物，其中半胱氨酸在抗-VEGF-A抗体重链中并且为Q347C(EU编号)或L443C(EU编号)。
12.根据权利要求11所述的抗体缀合物，其中抗-VEGF-A抗体重链的序列是SEQ IDNO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ ID NO.2。
13.根据权利要求11所述的抗体缀合物，其中半胱氨酸是L443C(EU编号)。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体缀合物，其中含磷酸胆碱的聚合物包含如下所示的2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵)乙基磷酸酯(MPC)单体：
15.根据权利要求14所述的抗体缀合物，其中聚合物具有三个或更多个臂，或者用包含3个或更多个聚合物引发位点的引发剂合成。
16.根据权利要求15所述的抗体缀合物，其中聚合物具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个臂，或者用包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个聚合物引发位点的引发剂合成。
17.根据权利要求16所述的抗体缀合物，其中聚合物具有2，3，6或9个臂，或者用包含2，3，6或9个聚合物引发位点的引发剂合成。
18.根据权利要求17所述的抗体缀合物，其中聚合物具有9个臂，或者用包含9个聚合物引发位点的引发剂合成。
19.根据权利要求18所述的抗体缀合物，其中如通过尺寸排阻色谱-多角度光散射(下文称为“SEC-MALS”)所测量的，聚合物的分子量在约300,000和约1,750,000Da之间。
20.根据权利要求19所述的抗体缀合物，其中聚合物的分子量在约500,000和约1,000,000Da之间。
21.根据权利要求20所述的抗体缀合物，其中聚合物的分子量在约750,000和约850,000Da之间。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体缀合物，其是经纯化的。
23.根据权利要求22所述的抗体缀合物，其在聚合物中是多分散的。
24.根据权利要求23所述的抗体缀合物，其中聚合物的多分散性值(PDI)小于约1.2。
25.一种抗体缀合物，其包含与聚合物键合的抗-VEGF-A免疫球蛋白G(IgG)，所述聚合物包含MPC单体，其中抗-VEGF-A抗体重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A抗体轻链的序列是SEQ ID NO.2，并且其中抗体在SEQ ID NO.1中的C449处与聚合物键合。
26.根据权利要求25所述的抗体缀合物，其中
聚合物具有9个臂；并且
聚合物的分子量在约600,000至约900,000Da之间。
27.根据权利要求25所述的抗体缀合物，其具有以下结构：
其中：
抗-VEGF-A抗体的每条重链用字母H表示，抗-VEGF-A抗体的每条轻链用字母L表示；
聚合物通过C443(EU编号)的巯基与抗-VEGF-A抗体键合，该键描述在一条重链上；
PC是其中曲线表示与聚合物其余部分连接的点，其中X＝a)OR，其中R＝H、甲基、乙基、丙基、异丙基，b)H，或c)任意卤化物，包括Br；并且
n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9相同或不同，使得n1，n2，n3，n4，n5，n6，n7，n8和n9的总和为2500±15％。
28.一种药物组合物，其包含液体溶液中的根据权利要求1-27中任一项所述的抗体缀合物。
29.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-27中任一项所述的抗体缀合物，以及药学上可接受的载体。
30.一种抗-VEGF-A抗体，其包含重链和轻链，其中：
重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ ID NO：14)；并且
重链同种型为IgG1，其中IgG1恒定结构域包含以下突变中的一个或多个以调节效应子功能(EU编号)：E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S，和P331S。
31.根据权利要求30所述的抗体，其包括以下突变(EU编号)：L234A、L235A和G237A。
32.根据权利要求30所述的抗体，其中抗-VEGF-A重链的序列是SEQ ID NO.1，抗-VEGF-A轻链的序列是SEQ ID NO.2。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的抗体，其是IgG。
34.一种治疗或预防眼部疾病的方法，其包括施用根据权利要求1-27中任一项所述的抗体缀合物，或权利要求28或29所述的药物组合物。
35.根据权利要求34所述的用于治疗或预防的方法，其中眼部疾病选自由以下组成的组：糖尿病性视网膜病变，脉络膜新生血管形成(CNV)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性黄斑水肿(DME)，病理性近视，冯希-林二氏病，眼睛的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，视网膜中央分支静脉阻塞(BRVO)，角膜新生血管形成，视网膜新生血管形成，早产儿视网膜病变(ROP)，结膜下出血和高血压性视网膜病变。
36.根据权利要求34所述的用于治疗或预防的方法，其中疾病是糖尿病性视网膜病变。
37.制备抗体缀合物的方法，所述抗体缀合物包含与含磷酸胆碱的聚合物缀合的抗-VEGF-A抗体，所述方法包括以下步骤：
将抗-VEGF-A抗体与含磷酸胆碱的聚合物缀合；
其中抗-VEGF-A抗体包含通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基，并且其中半胱氨酸位于抗体的可变区之外；
其中，含磷酸胆碱的聚合物包含选自由以下组成的组的巯基特异性反应基团：马来酰亚胺，乙烯基砜，邻二硫吡啶和碘乙酰胺；并且
其中，含磷酸胆碱的聚合物上的巯基特异性反应基团与抗-VEGF-A抗体上的半胱氨酸残基反应以制备抗体缀合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中抗-VEGF-A抗体是免疫球蛋白G(IgG)，并且半胱氨酸位于抗体的Fc区。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中抗-VEGF-A抗体包含轻链和重链，其中抗-VEGF-A抗体重链包含CDRH1：GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：9)、CDRH2：WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ IDNO：10)和CDRH3：YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：11)，并且抗-VEGF-A抗体轻链包含CDRL1：SASQDISNYLN(SEQ ID NO：12)、CDRL2：FTSSLHS(SEQ ID NO：13)和CDRL3：QQYSTVPWT(SEQ IDNO：14)。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中抗-VEGF-A抗体重链同种型是IgG1。
41.根据权利要求40所述的方法，其中抗-VEGF-A抗体恒定结构域相对于IgG1恒定结构域具有一个或多个突变以调节效应子功能。
42.根据权利要求41所述的方法，其中突变是针对以下氨基酸位置中的一个或多个(EU编号)：E233X，L234X，L235X，G236X，G237X，G236X，D270X，K322X，A327X，P329X，A330X，A330X，P331X，和P331X，其中X是任意天然或非天然氨基酸。
43.根据权利要求42所述的方法，其中突变选自由以下组成的组(EU编号)E233P，L234V，L234A，L235A，G237A，A327G，A330S和P331S。
44.根据权利要求43所述的方法，其中突变是(EU编号)L234A、L235A和G237A。
45.根据权利要求44所述的方法，其中通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基选自由Q347C(EU编号)和L443C(EU编号)组成的组。
46.根据权利要求45所述的方法，其中通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基是L443C(EU编号)。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中抗-VEGF-A抗体重链的序列是SEQ ID NO.1，并且抗-VEGF-A抗体轻链的序列是SEQ ID NO.2。
48.根据权利要求37所述的方法，其中巯基特异性反应基团是马来酰亚胺。
49.根据权利要求48所述的方法，其中含磷酸胆碱的聚合物包含如下所示的2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵)乙基磷酸酯(MPC)单体：
50.根据权利要求49所述的方法，其中聚合物具有三个或更多个臂，或者用包含3个聚合物引发位点的引发剂合成。
51.根据权利要求50所述的方法，其中聚合物具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个臂，或者用包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个聚合物引发位点的引发剂合成。
52.根据权利要求51所述的方法，其中聚合物具有2，3，6或9个臂，或者用包含2，3，6或9个聚合物引发位点的引发剂合成。
53.根据权利要求52所述的方法，其中聚合物具有9个臂，或者用包含9个聚合物引发位点的引发剂合成。
54.根据权利要求53所述的方法，其中聚合物的分子量在约300,000和1,750,000Da之间。
55.根据权利要求54所述的方法，其中聚合物的分子量在约600,000和1,000,000Da之间。
56.根据权利要求55所述的方法，其中聚合物的分子量在约600,000至850,000Da之间。
57.根据权利要求37所述的方法，其还包括以下步骤：在产生还原型半胱氨酸巯基的条件下使抗-VEGF-A抗体与硫醇还原剂接触以产生其中所有半胱氨酸残基均被还原的还原型抗-VEGF-A抗体。
58.根据权利要求57所述的方法，其中硫醇还原剂选自由以下组成的组：三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，二硫苏糖醇(DTT)，二硫赤藓糖醇(DTE)，硼氢化钠(NaBH4)，氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，β-巯基乙醇(BME)，半胱氨酸盐酸盐和半胱氨酸。
59.根据权利要求58所述的方法，其中硫醇还原剂是TCEP。
60.根据权利要求59所述的方法，其中硫醇还原剂的浓度相对于抗-VEGF-A抗体的浓度为1至100倍摩尔过量。
61.根据权利要求60所述的方法，其中硫醇还原剂的浓度相对于抗-VEGF-A抗体的浓度为20至50倍摩尔过量。
62.根据权利要求60所述的方法，其还包括从还原型抗-VEGF-A抗体中除去硫醇还原剂，和用氧化剂处理还原型抗-VEGF-A抗体的步骤。
63.根据权利要求61所述的方法，其中氧化剂是空气，CuSO4水溶液或脱氢抗坏血酸(DHAA)。
64.根据权利要求37所述的方法，其还包括纯化抗体缀合物的步骤。
65.根据权利要求64所述的方法，其中使用选自由以下组成的组的技术纯化抗体缀合物：离子交换色谱，疏水相互作用色谱，尺寸排阻色谱，亲和色谱及其组合。
66.根据权利要求65所述的方法，其中纯化的抗体缀合物相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体保留至少20％的生物活性。
67.根据权利要求66所述的方法，其中纯化的抗体缀合物相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体保留至少50％的生物活性。
68.根据权利要求67所述的方法，其中纯化的抗体缀合物相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体保留至少90％的生物活性。
69.根据权利要求66所述的方法，其中相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体，纯化的抗体缀合物的半衰期增加。
70.根据权利要求69所述的方法，其中相对于未缀合的抗-VEGF-A抗体，纯化的抗体缀合物的半衰期增加至少1.5倍。
71.根据权利要求37所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：在聚合介质中聚合可自由基聚合的含磷酸胆碱的单体以提供含磷酸胆碱的聚合物，所述介质包括：
可自由基聚合的含磷酸胆碱的单体；
过渡金属催化剂Mt (q-1)+，其中Mt是过渡金属，q是金属的最大氧化态，q-1是金属的氧化态，其中金属可以作为催化剂，其中过渡金属催化剂以Mt(q-1)+X’(q-1)形式的盐提供，其中X'是反离子或基团，或者其中过渡金属催化剂通过提供处于其最高氧化态的非活性金属盐Mt q +X’q与还原剂一起原位提供，所述还原剂能够将过渡金属从氧化的非活性态还原为还原的活性态；
配体；以及
引发剂。
72.根据权利要求71所述的方法，其中可自由基聚合的含磷酸胆碱的单体是
其中R1是H或C1-6烷基；
R2、R3、R4各自为甲基；并且
X和Y各自为2。
73.根据权利要求72所述的方法，其中Mt选自由以下组成的组：Cu，Fe，Ru，Cr，Mo，W，Mn，Rh，Re，Co，V，Zn，Au和Ag。
74.根据权利要求73所述的方法，其中金属催化剂以Mt(q-1)+X’(q-1)形式的盐提供。
75.根据权利要求74所述的方法，其中Mt (q-1)+选自由以下组成的组：Cu1+，Fe2+，Ru2+，Cr2 +，Mo2+，W2+，Mn3+，Rh3+，Re2+，Co+，V2+，Zn+，Au+和Ag+，并且X'选自由以下组成的组：卤素，C1-6烷氧基，(SO4)1/2，(PO4)1/3，(R7PO4)1/2，(R72PO4)，三氟甲磺酸酯，六氟磷酸酯，甲磺酸酯，芳基磺酸酯，CN和R7CO2，其中R7是H或直链或支链C1-6烷基，其可被卤素取代1至5次。
76.根据权利要求75所述的方法，其中Mt (q-1)+是Cu1+并且X'是Br。
77.根据权利要求72所述的方法，其中Mt (q-1)+原位提供。
78.根据权利要求77所述的方法，其中Mt q+Xq是CuBr2。
79.根据权利要求72所述的方法，其中还原剂是无机化合物。
80.根据权利要求79所述的方法，其中无机化合物选自由以下组成的组：低氧化水平的硫化合物，亚硫酸氢钠，含金属离子的无机盐，金属，水合肼，和这些化合物的衍生物。
81.根据权利要求80所述的方法，其中还原剂是金属。
82.根据权利要求81所述的方法，其中还原剂是Cu0。
83.根据权利要求72所述的方法，其中还原剂是有机化合物。
84.根据权利要求83所述的方法，其中有机化合物选自由以下组成的组：烷基硫醇，巯基乙醇，或易于烯醇化的羰基化合物，抗坏血酸，乙酰丙酮酸酯，樟脑磺酸，羟基丙酮，还原糖，单糖，葡萄糖，醛，以及这些有机化合物的衍生物。
85.根据权利要求72所述的方法，其中配体自由以下组成的组：2,2'-联吡啶，4,4'-二-5-壬基-2,2'-联吡啶，4,4-二壬基-2,2'-联吡啶，4,4',4”-三(5-壬基)-2,2':6',2”-三联吡啶，N,N,N',N',N”-五甲基二亚乙基三胺，1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺，三(2-二甲基氨基乙基)胺，N,N-双(2-吡啶基甲基)十八烷基胺，N,N,N',N'-四[(2-吡啶)甲基]乙二胺，三[(2-吡啶基)甲基]胺，三(2-氨基乙基)胺，三(2-双(3-丁氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺，三(2-双(3-(2-乙基己氧基)-3-氧代丙基)氨基乙基)胺和三(2-双(3-十二烷氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺。
86.根据权利要求85所述的方法，其中配体是2,2'-联吡啶。
87.根据权利要求72所述的方法，其中引发剂具有以下结构：
其中R1是亲核反应性基团，R2包含接头，并且R3包含具有以下结构的聚合物合成引发剂部分：
其中R4和R5相同或不同并且选自由以下组成的组：烷基，取代的烷基，亚烷基，烷氧基，羧基烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基醚，烯基，亚烯基，炔基，亚炔基，环亚烷基，杂环烷基，杂环亚烷基，芳基，亚芳基，亚芳基氧基，杂芳基，氨基，酰氨基，及其任意组合；
Z是卤素或CN；并且s是1至20之间的整数。
88.根据权利要求87所述的方法，其中Z是Br并且R4和R5各自是甲基。
89.根据权利要求88所述的方法，其中R1选自由以下组成的组：NH2-，OH-和SH-。
90.根据权利要求89所述的方法，其中R1是NH2-。
91.根据权利要求90所述的方法，其中R2是烷基，取代的烷基，亚烷基，烷氧基，羧基烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基醚，烯基，亚烯基，炔基，亚炔基，环亚烷基，杂环烷基，杂环亚烷基，芳基，亚芳基，亚芳基氧基，杂芳基，氨基，酰氨基，及其任意组合。
92.根据权利要求91所述的方法，其中R2是
其中X和Y相同或不同并且是1-20的整数。
93.根据权利要求92所述的方法，其中X和Y各自为4。
94.根据权利要求93所述的方法，其中R3还包括
其中R6、R7和R8相同或不同，并且选自由以下组成的组：
其中Z是NCS，F，Cl，Br或I。
95.根据权利要求94所述的方法，其中Z是Br。
96.根据权利要求94所述的方法，其中R6、R7和R8各自是
97.根据权利要求96所述的方法，其中引发剂具有以下结构：
其中A和B相同或不同并且是2至12的整数，并且Z是Br。
98.根据权利要求97所述的方法，其中A和B各自为4。
99.根据权利要求98所述的方法，其还包括使聚合物与马来酰亚胺试剂反应以提供具有末端马来酰亚胺的聚合物的步骤。
100.根据权利要求99所述的方法，其中马来酰亚胺化合物是
101.一种抗体，其包括：
重链氨基酸可变区，其包含SEQ ID NO 1；以及
轻链氨基酸可变区，其包含SEQ ID NO.2。
102.根据权利要求101所述的抗体，其中抗体是人IgG1，并且其中重链恒定结构域包含降低免疫介导的效应子功能的一种或多种突变。
103.根据权利要求101所述的抗体缀合物，其中抗体进一步与聚合物缀合以形成生物缀合物，并且其中生物缀合物的分子量在约350,000和1,900,000道尔顿之间。
104.根据权利要求103所述的抗体缀合物，其中多分散指数(PDI)等于或小于1.5。
105.与VEGF-A结合的抗体，所述抗体包括：
CDRH1，即SEQ ID NO：1中的CDRH1；
CDRH2，即SEQ ID NO：1中的CDRH2；
CDRH3，即SEQ ID NO：1中的CDRH3；
CDRL1，即SEQ ID NO：2中的CDRL1；
CDRL2，即SEQ ID NO：2中的CDRL2；
CDRL3，即SEQ ID NO：2中的CDRL3；
至少一种以下突变(EU编号)：L234A，L235A和G237A；以及
至少一种以下突变(EU编号)：Q347C或L443C。
106.根据权利要求105所述的抗体，其中抗体包含全部以下三种突变(EU编号)L234A，L235A和G237A，并且其中抗体包含L443C(EU编号)。
107.制备缀合蛋白质的方法，所述方法包括：
还原蛋白质中的一个或多个半胱氨酸以在溶液中形成去帽蛋白质；
将去帽蛋白质再氧化以恢复还原蛋白质中的至少一个二硫键，同时确保蛋白质中的工程化半胱氨酸残基保持游离硫醇形式以由此在溶液中形成再氧化的去帽蛋白质；
将至少一种赋形剂加入溶液中，其中赋形剂减少聚合物诱导的蛋白质沉淀；
将聚合物加入溶液中；以及
在工程化的半胱氨酸残基处将聚合物与再氧化的去帽蛋白质缀合以形成缀合的蛋白质。
108.根据权利要求107所述的方法，其中蛋白质是抗体、抗体蛋白质融合体或其结合片段。
109.根据权利要求108所述的方法，其中赋形剂是酸或碱。
110.根据权利要求109所述的方法，其中赋形剂选自由以下至少一种组成的组：去污剂、糖和带电荷的氨基酸。
111.根据权利要求107所述的方法，其中聚合物与还原蛋白质的反应在pH6.0至pH 8.5的水性条件下发生。
112.根据权利要求107所述的方法，其中还原蛋白质的量小于聚合物的量。
113.根据权利要求107所述的方法，其中聚合物在2-37摄氏度下与蛋白质缀合。
114.根据权利要求107所述的方法，其还包括使包含缀合蛋白质的溶液与离子交换介质或疏水相互作用色谱或亲和色谱介质接触的过程。
115.根据权利要求114所述的方法，其中离子交换介质或疏水相互作用色谱或亲和色谱介质将缀合的蛋白质与游离聚合物和再氧化的去帽蛋白质分离。
116.根据权利要求107所述的方法，其中聚合物包含两性离子。
117.根据权利要求107所述的方法，其中聚合物包含磷酸胆碱。
118.根据权利要求107所述的方法，其中聚合物包含PEG接头，其将聚合物分支点的中心桥接至马来酰亚胺官能团。
119.抗-VEGF抗体缀合物，其能够阻断VEGF配体和VEGF-受体之间的至少90％的相互作用。
120.抗-VEGF抗体缀合物，其阻断VEGF配体和VEGF-受体之间的至少95％的相互作用。
121.抗-VEGF抗体，其阻断VEGF配体和VEGF-受体之间的至少90％的相互作用。
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