CH376910A

CH376910A - Verfahren zur mikrobiologischen Reduktion von Steroiden

Info

Publication number: CH376910A
Application number: CH6249158A
Authority: CH
Inventors: Albert Dr Wettstein; Ernst Dr Vischer
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1958-08-01
Filing date: 1958-08-01
Publication date: 1964-04-30
Also published as: FR1271047A

Description

Verfahren zur mikrobiologischen Reduktion von Steroiden Die Verwendung von Mikroorganismen zur Re duktion von Oxogruppen und Kohlenstoff-Kohlen- stoff-Doppelbindungen in Steroidverbindungen ist seit längerem bekannt. Gemäss den bis heute gesammelten Erfahrungen mit Hefe und anderen Mikroorganismen, wie Streptomyces, Rhizopus, Curvularia-Arten u. a., ist die Art der eintretenden Reduktion sowohl vom verwendeten Organismus wie auch weitgehend von der Konstitution des eingesetzten Steroids abhängig.

So findet im allgemeinen bei Verwendung von Hefe und andern Mikroorganismen keine Reduktion der 14-3-Oxogruppe statt. Während Androstan-3,17-dion zum 3 ss, l 7ss-diol reduziert wird, findet beim Pregnan- 3,20-dion und Allo-pregnan-3,20-dion überhaupt keine Reduktion statt. Ist in den zuletzt genannten Verbindungen jedoch in 11-Stellung eine Oxogruppe vorhanden, so tritt Reduktion zum 3a-Alkohol ein.

Bei Anwesenheit einer 11-Oxygruppe hängt der Verlauf der Reduktion davon ab, ob die betreffende Pregnan- Verbindung der Normal- oder Alloreihe angehört und ob sich die 11.-Oxygruppe in a- oder 6-Stellung be findet. 17- und/oder 21-Oxygruppen scheinen die Reduktion wiederum zu hindern, während bei Andro- stanverbindungen mit 17-Oxogruppe diese stets zur 17ss-Oxygruppe reduziert wird.

Gemäss der vorliegenden Erfindung ist nun ein neuer Stamm der Actinomyceten, Streptomyces 7994, aufgefunden worden, welcher in d4-3-Ketonen der Androstan- und Pregnanreihe, ihren Nor-, Homo- oder Nor-Homoderivaten die 3-Oxogruppe zur 3,B- Oxygruppe unter Aufhebung der 4,

5-Doppelbindung und Bildung der in 5-Stellung gesättigten Verbindun gen mit Sa-Konfiguration reduziert, wobei andere im Molekül vorhandene reduzierbare Gruppierungen nicht reduziert werden, z. B. Oxogruppen in 17- oder 20-Stellung.

Als Zwischenprodukte der Reduktion treten die 5Ha-3-Ketone auf, welche durch weitere Reduktion mit demselben Organismus zu den 3ss-Alkoholen reduziert werden. Die vorliegende Erfindung liefert also ein Verfahren zur partiellen selektiven Reduktion von z. B. d4-Androsten-3,17-dionen und d4-Pregnen- 3,20-dionen zu den entsprechenden in 5-Stellung ge sättigten 3ss-Oxy-Verbindungen.

Die Ausgangsstoffe können ausser den bereits er wähnten noch weitere Substituenten aufweisen, ins besondere eine freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppe in 11-, 16-, 17-, 18-, 19- und/oder 21-Stellung sowie Halogenatome z. B. in 9- oder 12-Stellung. Es können, wie gesagt, auch die Nor-, Homo- und Nor-Homo-Derivate der genannten d4-3-Oxo-steroide, z.

B. d4-3-Oxo-19-nor-pregnene oder -androstene oder d4-D-Homo-3-Oxo-19-nor- pregnene oder -androstene, als Ausgangsstoffe ver wendet werden. Ferner können weitere Doppelbin dungen vorhanden sein, z. B. in 9,11-; 14,15- und'oder 16,17,Stellung. Als spezifische Ausgangs stoffe seien z.

B. genannt: Cortexon, Progesteron, 16a-Oxy-progesteron, Corticosteron, Cortison, Hydro- cortison und d4-Androsten-3,17-dion.

Bei den Actinomyceten der vorliegenden Erfin dung handelt es sich um einen neuen Stamm von Streptomyces griseus, welcher aus einer bei La-Tour- de-Peilz, Kanton Waadt, gesammeten Bodenprobe iso liert worden ist. Er wird im Institut für spezielle. Botanik der Eidgenössischen Technischen Hochschule in Zürich unter der Nummer 7994 aufbewahrt. Der Organismus zeichnet sich aus durch: 1. Morphologie der Sporen im Elektronenmikroskop: ellipsoidisch, glatt.

2. Farbe des Luftmycels: anfangs kreideweiss oder weissgelb, in ausgereiftem Zustande gelblich-grün- lichgrau. 3. Farbe des Substratmycels: weissgelb-bräunlichgelb- sattgelb, auf Kartoffeln dunkelrotgelb.

4. Farbe des löslichen Pigmentes: auf keinem der untersuchten Nährmedien wurde ein auffallendes lösliches Pigment gebildet.

5. Melaninbildung: Nach der Methode von Ettlinger et a1. [Ettlinger, L., Corbaz, R. und Hütter, R.: Zur Systematik der Actinomyceten 4. Eine Artein teilung der Gattung Streptomyces Waksman et Henrici, Arch. Mikrobiol., 31, 326 (1958)] wurde der Stamm auf seine Fähigkeit zur Melaninbildung untersucht; er war chromogen negativ.

6. Morphologie der Sporenketten: Sporenketten in sympodial verzweigten Büscheln mit kurzer Hauptachse; Seitenzweige gerade oder gewellt. Das Wachstum dieses Pilzes ist relativ wenig tem- peraturabhär-gig; sowohl bei 18 als auch bei 40 C entwickelt er sichgut, doch liegt das Optimum zwi schen 25 und 32 C.

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Streptomyces-Stammes 7994 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nähr medien 1 bis 5 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952) hergestellt.

1. Synthetischer Agar: Wachstum anfangs punkt- förmig bis schleierartig, später runzelig, weissgelb bis bräunlichgelb; Luftmycel staubig, einen feinen Überzug bildend, kreideweiss.

2. Synthetische Lösung: Wachstum als Flocken und Sediment, hellgelb; spärliches Oberflächenwachs tum mit wenig kreideweissem Luftmycel; Substrat hellgelb.

3. Glucose-Agar: Wachstum runzelig, hell bräunlich- gelb; kein Luftmycel.

4. Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum dünn, schleier artig bis runzelig, bräunlichgelb; Luftmycel sam- metig, anfangs kreideweiss bis weissgelb, in ausge reiftem Zustande gelblich-grünlichgrau.

5. Calciummalat-Agar: Wachstum dünn, schleier artig, manchmal nur punktförmig, weissgelb bis hellgelb; Luftmycel nur sehr spärlich.

6. Kartoffeln: Wachstum flechtenartig, dunkelrot gelb; Luftmycel spärlich; Substrat grünlich-raben- schwarz bis bräunlich-pechschwarz.

7. Karotten: Wachstum anfangs dünn, schleierartig, später wenig flechtenartig, weissgelb.

B. Lackmusmilch: Ringwachstum und runzelige Pellikula, graublau bis hellbraun; Peptonisierung, aber keine Koagulation; Lackmus rot.

9. Stärkeplatte: Wachstum dünn, schleierartig, hell gelb bis sattgelb; Luftmycel sammetig, weissgelb; Hydrolyse nach acht Tagen 2 mm.

10. Gelatinestich (18 C): Wachstum spärlich, pustelig, hellbrau; Verflüssigung spärlich und langsam. Anstelle des Streptomyces-Stammes 7994 können Varianten dieser Organismen, wie sie durch Selektio- nierung oder Mutation, insbesondere unter der Ein wirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen, gewonnen werden, verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist somit da durch gekennzeichnet, dass man auf die genannten d4-3-Oxo-steroide Enzyme des Streptomyces-Stammes 7994 einwirken lässt. Man inkubiert dabei die Aus gangsstoffe meistens direkt mit unter aeroben Bedin gungen wachsenden Kulturen des genannten Stammes. Diese werden zweckmässig bewegt, das heisst geschüt telt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Koh lenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebe nenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nähr lösungen brauchbar.

Das praktisch einfachste Verfah ren ist im folgenden geschildert: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Be dingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Die Tem peratur wird vorzugsweise bei 25 bis 32 C gehalten, und unter diesen Bedingungen sind die Kulturen nach 1 bis 3 Tagen voll entwickelt. Man gibt so dann die Ausgangsstoffe unter sterilen Bedingungen, in feiner Dispersion oder Lösung, z. B. in Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan oder Propylenglykol, zu und inkubiert weiter. Nach 8 bis 36 Stunden ist die Reak tion meistens beendet.

Man trennt vom Mycel ab, extrahiert gegebenenfalls das Mycel, z. B. mit Methanol oder Aceton, und gibt den eingedampften Extrakt dem Kulturfiltrat zu; man extrahiert diesen mit einem ge eigneten Lösungsmittel, wie Essigester, Chloroform, Äthylenchlorid oder Methylenchlorid, wäscht den Ex trakt mit verdünnter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser und dampft ihn schliesslich im Va kuum zur Trockne ein.

Aus dem so gewonnenen rohen Reduktionsprodukt können die Verfahrenspro dukte nach üblichen Reinigungsmethoden, wie Kri stallisation, Chromatographie, Verteilungschromato- graphie, Verteilung zwischen miteinander nicht misch baren Lösungmitteln usw., rein erhalten werden. Die Reduktion kann aber auch so durchgeführt werden, dass man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen des Stammes 7994 der Gattung Streptomyces zuerst abtrennt und unter Ausschluss der wachsenden Kulturen verwendet.

Bei kürzerer Inkubationszeit der Ausgangsstoffe mit den genannten Organismen oder den entsprechen den Enzymen können aus den Reduktionsprodukten neben unverändertem Ausgangsmaterial und den in 5-Stellung gesättigten 3f-Alkoholen, die als Zwischen produkte auftretenden, in 5-Stellung gesättigten 5a-3- keto-steroide isoliert werden. In einigen Fällen, wie z.

B. bei der Reduktion von Progesteron und Cor- texon, können durch papierchromatographische Analyse noch weitere niedrigpolare Verbindungen un bekannter Konstitution ermittelt werden. Im Falle des Progesterons konnte dieses Nebenprodukt isoliert und untersucht werden: anhand des IR.-Spektrums enthält es keine Hydroxylgruppe, jedoch eine nicht konju gierte Carbonylgruppe.

Das Verfahren der vorliegenden Anmeldung be deutet für die Synthese verschiedener wichtiger physio- logisch wirksamer Steroide einen grossen Fortschritt, z. B. in Anbetracht dessen, dass bei der partiellen Reduktion von z. B. d4-3,17-Dioxo-androsten bzw. J-I-3,20-Dioxo-pregnen zu den 5a-3ss-oxy-steroiden mit chemischen Mitteln andere im Molekül vorhan dene reduzierbare Gruppierungen, z. B. die 20-Keto- gruppe, unter Umständen geschützt werden müssen und dass diese chemischen Hydrierungen nicht immer stereospezifisch verlaufen.

So lässt sich nunmehr der kürzlich bekanntgewordene natriumausscheidende Faktor aus Nebennieren, das Allopregnan-3ss,16a- 6o diol-20-on, aus 16a-Oxy-progesteron in einer einzigen Reduktionsstufe gemäss dem vorliegenden Verfahren herstellen:
EMI0003.0011
Beispiel 1 Man bereitet 4 Liter einer Nährlösung, die auf 1 Liter Leitungswasser folgende Zusätze enthält: 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, 5 g Na triumchlorid und 10 g Calciumcarbonat, stellt sie auf pH 7,5 ein, bringt sie in ein Schüttelgefäss und sterili siert sie 30 Minuten bei 118 C.

Dann beimpft man sie mit einer Kultur von Streptomyces sp. A 7994 und lässt sie bei 27 C schütteln. Nach drei Tagen gibt man zu der nun gut entwickelten Kultur unter sterilen Be dingungen eine Lösung von 1 g Cortexon in 20 cm3 Aceton und lässt weitere 36 Stunden unter den glei chen Bedingungen schütteln. Nun wird das Mycel ab getrennt und zweimal mit warmem Aceton extrahiert. Die vereinigten Acetonauszüge konzentriert man im Vakuum und gibt das Konzentrat zum Kulturfiltrat. Hierauf wird das Kulturfiltrat dreimal mit je 500 cm 3 Essigester ausgezogen.

Die Extrakte wäscht man drei mal mit je 100 cm-' 2o/o,iger Natriumhydrogencar- bonatlösung und Wasser, vereinigt sie, trocknet sie über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein. Der Rückstand wird in 80 cm- Methanol gelöst, wor auf man 100 cm3 Petroläther und 20 cm3 Wasser zugibt. Die methanolisch-wässrige Phase und die Petrolätherphase werden separat im Vakuum einge dampft und papierchromatographisch untersucht.

Die letztere enthält keine Steroide und nur ölige Verun reinigungen, während die erstere zur Hauptsache 3ss,21 Dioxy-allopregnan-20-on enthält. Dieses wird mittels Chromatographie an 30 g Silicagel gereinigt, wobei folgende Lösungsmittel verwendet werden: Chloro form, Gemische von Chloroform und Aceton mit steigendem Aceton-Gehalt und schliesslich Aceton. Mit einem Gemisch von Chloroform-Aceton (99 : 1) wird die Hauptmenge der Substanz, das 3ss,21-Dioxy- allopregnan-20-on, von der Säule eluiert. Es wird aus einem Aceton - Petroläther - Gemisch kristallisiert, F. = 168 bis 174 C.

Beispiel 2 Wie im Beispiel 1 beschrieben, gibt man zu 4 Liter einer Kultur von Streptomyces sp. A 7994 1 g Cor- texon. Nach achtstündigem Schütteln bei 27 ' C arbei tet man den Ansatz gemäss den Angaben im Beispiel 1 auf.

Die papierchromatographische Untersuchung des Rohproduktes zeigt, dass es neben Cortexon (1I) und neben einem im Papierchromatogramm unterhalb Cortexon stehenden Nebenprodukt zur Hauptsache 21 Oxy-allopregnan-3,20-dion (I) und 3ss,21-Dioxy-allo- pregnan-20-on enthält (11I). Durch Chromatographie an 30 g Silicagel unter Verwendung der im Beispiel 1 angegebenen Lösungsmittel (100-cm3-Fraktionen) können die drei Substanzen wie folgt getrennt werden:

EMI0003.0053

Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> enthält
<tb> 1 <SEP> Chloroform <SEP> Verunreinigungen
<tb> 2-3 <SEP> <SEP> I
<tb> 4 <SEP> <SEP> Gemisch <SEP> von <SEP> I <SEP> und <SEP> I1
<tb> 5-6 <SEP> <SEP> II
<tb> 7-8 <SEP> Chloroform-Aceton <SEP> (99: <SEP> 1) <SEP> III Das 21-Oxy-allopregnan-3,20-dion wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch kristallisiert, F. = 162 bis 164 C.

Beispiel 3 Zu einer gemäss den Angaben im Beispiel 1 be reiteten 4-Liter-Kultur von Streptomyces sp. A 7994 gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Progesteron in 20 cm3 Aceton und schüttelt das Kulturgefäss 8 Stunden lang bei 27 C. Dann arbeitet man den Ansatz gemäss Beispiel 1 auf und verteilt den Rohextrakt wie beschrieben zwischen Petroläther und 80P/o@igem wässrigem Methanol.

Nach dem Ein dampfen werden die Rückstände der Petroläther- und der Methanol-Phase papierchromatographisch unter- sucht. Erstere enthält neben etwas Progesteron eine unbekannte Substanz, die im@ Papierchromatogramm unterhalb Progesteron steht. In der Methanol-Phase können Progesteron, die soeben erwähnte unbekannte Substanz sowie Allopregnan-3,20-dion und 3,B-Oxy- allopregnan-20-on nachgewiesen werden.

Der Rück stand der Methanolphase (0,958) wird in wenig Me- thylenchlorid gelöst und auf eine Säule von 30 g Sili- cagel gebracht. Die Säule wird mit Methylenehlorid, Gemischen von Methylenchlorid und Aceton von steigendem Acetongehalt und mit Aceton eluiert. Die anfallenden Fraktionen (je 25 cm3 Lösungsmittel) werden separat eingedampft und papierchromato- graphisch untersucht.

Die ersten drei Fraktionen (Methylenchlorid) enthalten die erwähnte unbekannte Substanz in einheitlicher Form. Sie wird aus Aceton kristallisiert und schmilzt bei 149 bis 150 C. Sie zeigt keine Absorption bei 240 m,u. Im Infrarotspek- trum sind Banden u. a. bei 5,87 iz, 7,24,u, 7,3811 8,48u, 8,82,u, 9,15 ,lz, 9.53 /z und 11,50 ,cz sichtbar.

Aus den Fraktionen 5 bis 8 (Methylenchlorid) kann Allopregnan-3,20-dion vom Smp. 204 bis 206 C und aus den Fraktionen 17 bis 18 (Methylenchlorid) und 19 bis 22 (Methylenchlorid-Aceton 99 :l) 3fl'-Oxy- allopregnan-20-on vom Smp. 192 bis 195 C isoliert werden.

Beispiel 4 Man beschickt acht Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fassungsvermögen mit je 100 cm?, der im Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung und sterilisiert sie. Dann beimpft man sie mit einer Kultur von Streptomyces sp. A 7994 und lässt sie 3 Tage bei 28 C schütteln.

Zu den gut ausgebildeten Kulturen gibt man unter sterilen Bedingungen Lösungen von je 30 mg der folgenden Steroide in 1,5 cm3 Aceton: Pro gesteron, 16a-Oxy-progesteron, Corticosteron, 17a- Oxy-cortexon (Reichsteins Substanz S), Cortison, Hydrocortison und 44-Androsten-3,17-dion. Man lässt die Kulturen 14 Stunden lang weiter schütteln und extrahiert sie dann einzeln mit je 2 30-cm3-Por- tionen Essigester.

Die von den einzelnen Kulturen er haltenen Extrakte werden separat eingedampft und papierchromatographisch untersucht. Sie enthalten alle neben wenig Ausgangsmaterial ein Gemisch der entsprechenden 3-Keto- und 3ss-Oxy-5a-pregnane respektive 3-Keto- und 3,B-Oxy-5a-androstane.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Überführung von d4-3-Oxo- steroiden der Pregnan- oder Androstanreihe, ihren Nor-, Homo- oder Nor-Homoderivaten in die entspre- chenden 3,B-Oxy-5a-steroide durch selektive Reduk tion der 3-Keto-Gruppierung und der 4,5-Doppel- bindung, dadurch gekennzeichnet, dass man auf die A4-3-Oxo-steroide Enzyme des Stammes Streptomyces 7994 einwirken lässt. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man die Ausgangsstoffe direkt mit aerob wachsenden Kulturen des Stammes Strepto- myces 7994 inkubiert und aus der Fermentations- brühe die Reduktionsprodukte durch Extraktion mit organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungs mitteln und durch anschliessende Kristallisation iso liert. 2.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man das Mycel von aerob ge züchteten Kulturen des Stammes Streptomyces 7994 abtrennt und die Ausgangsstoffe zum Kulturfiltrat oder zu wässrigen Mycelsuspensionen zugibt und nach erfolgter Reduktion die Lösung mit einem orga nischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert und die Reduktionsprodukte durch Kristalli sation isoliert. 3.

Verfahren nach den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man vor der Kristalli sation eine Vorreinigung des gewonnenen Rohextrak tes durch Verteilung zwischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen oder durch Absorption an Aktivkohle, Silicagel oder Aluminiumoxyd vornimmt. 4. Verfahren nach Patentanspruch und den Unter ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man auf 44-3-Oxo-androstene oder J4-3-Oxo-pregnene die Enzyme des Stammes Streptomyces 7994 8 bis 36 Stunden einwirken lässt und die gebildeten 5a Androstan-3ss-ole oder 5a-Pregnan-3ss-ole isoliert. 5.

Verfahren nach Patentanspruch und den Unter ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Cortexon verwendet. 6. Verfahren nach Patentanspruch und den Unter ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Progesteron verwendet. 7. Verfahren nach Patentanspruch und den Unter ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff 16a-Oxy-progesteron verwendet. B.

Verfahren nach Patentanspruch und den Unter ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoffe Corticosteron, 17a-Oxy-cortexon, Cortison, Hydrocortison oder J4-Androsten-3,17- dion verwendet.