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DE2116601A1 - Oxydation von Steroiden - Google Patents

Oxydation von Steroiden

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Publication number
DE2116601A1
DE2116601A1 DE19712116601 DE2116601A DE2116601A1 DE 2116601 A1 DE2116601 A1 DE 2116601A1 DE 19712116601 DE19712116601 DE 19712116601 DE 2116601 A DE2116601 A DE 2116601A DE 2116601 A1 DE2116601 A1 DE 2116601A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
acid
alkylenedioxy
group
orthoester
derivative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19712116601
Other languages
English (en)
Inventor
Ewart Ray Herbert; Meakins George Denis; Clegg Andrew Samuel; Oxford Jones (Großbritannien)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Glaxo Laboratories Ltd
Original Assignee
Glaxo Laboratories Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glaxo Laboratories Ltd filed Critical Glaxo Laboratories Ltd
Publication of DE2116601A1 publication Critical patent/DE2116601A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
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Description

TELEFON: SAMMEL-NR. 225341 8 MÜNCHEN 2, TELEX 529979 BRÄUHAUSSTRASSE 4/III
TELEGRAMME: ZUMPAT POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 91139
BANKKONTO: BANKHAUS H. AUFHÄUSER
Case Cortisone 182
GLAXO LABORATORIES LIMITED, Greenford, Middlesex/Grossbritannien
Oxydation von Steroiden
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Hydroxylierung von Steroiden.
Auf dem Gebiet der Steroidsynthesen ist es oft nützlich, eine ' Sauerstoffunktion an ein zuvor nicht substituiertes Kohlenstoffatom durch mikrobiologische Hydroxylierung einzuführen, d.h. man verwendet das Steroid als Substrat für einen bestimmten Bakterien- oder Pilzorganismus und gewinnt das hydroxylierte Steroidprodukt, das metabolisch durch den Organismus herge— ',* stellt wurde. Auf diese Weise können die meisten Stellen des Steroidgerüstes hydroxyliert werden.
Im allgemeinen haben die Steroidsubsträte für solche Hydroxylierungen im Ring A eine TJnsättigungj im allgemeinen eine 4,5-Doppelbindung. Dies gilt besonders, wenn Aspergil- ' ^ lus ochraceus und andere Organismen verwendet wurden, um einen 11 Oi -Hydroxysubstituenten einzuführen.
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Obgleich man manchmal findet, dass ein Mikroorganismus zwei Hydroxygruppen in das Steroidsubstrat einführt,beobachtet man im allgemeinen, dass die erste Hydroxygruppe, die eingeführt wurde« die Einführung einer zweiten Hydroxygruppe in eine konformationsnahe Stellung sterisch hindert. Selbst wenn man findet, dass ein 11 Oi-hydroxyIierender Organismus etwas 1ß-Hydroxy~ lier-ung eines 4,5-Dehydrosteroidsubstrats liefert, verhindert die sterische Konkurrenz des 1ß-Hydroxyls mit dem 11 OC-Hydroxyl irgendeine 1ß,110<-Dihydroxylierung (V, Schwarz et al, Steroids, 1964,4, Seite 645). '
Es wurde nun gefunden, wenn Ring A- und C-gesättigte 50c - und 5(6)-Dehydro-pregnan-20-one und die Carbonylderivate derartiger Verbindungen, beispielsweise 2O-Ketale? als Substrate verwendet werden, bestimmte Organismen, von denen bekannt ist, dass sie eine 11O^-Hydroxygruppe einführen, nicht nur diese Gruppe, sondern eine weitere Hydroxylgruppe in 1ß-Stellung einführen. Soweit aus der Literatur bekannt ist9 sind Bis-Hydroxylierun-=· gen dieser Art, bei denen zwei räumlich benachbarte Hydroxygruppen eingeführt werdeiis, sehr ungewöhnlich und keine derartigen Verf ateeii- wurden beschrieben»
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur mikrobiologischen 1ß,1 Ia-Bis~Hyäroxylierung van. Ring A- und G-gesättigten 5a- und 5(6)--Deh.ydro-'pregnan-20-o]iens die in 16- und 17a-Steilungen Wasserstoff atome oder eiae oder mehrere der folgenden Gruppen, eine 1Ta-Hydroxygrüppe, eine 17<x-Acyloxygruppe, eine 16-aliphatisclie 6-rappej eine 16,17-°Spoxygruppe oder eine 16,17-Doppelbindung eattelttB^ Das ■ erfindungsgeiBäße Verfahren besteht darin, daß maa .das Steroid sub st-rat mit einem der Mikroorganismen Aspergillms ockpaoeus, Aspergilltas nidtslans oder Rhizopus arrhizus inkubiei't iiaä äas Mshydroxylierte Produkt gewinnt, Gegenstand der ErfiBdra,jg ist weiterhiia eine Modifikation des Verfahrens, bei öesa ias SteiOiasufestratrait einem Mikroorganismus, wie p^aticola oder" Bolystiotus sangui^aeus inkubiert wird.'
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Die Voraussetzung einer 1ß-Hydroxylgruppe in einem Ring A-gesättigten Steroid ermöglicht die Einführung einer 1,2-Doppelbindung durch Dehydrierung und schafft somit einen Weg zu physiologisch aktiven 11-Sauerstoff enthaltenden 1,2-Dehydrosteroiden, wie 11CX-Hydroxy-5 (X-pregn-1-en-3-20-dion, das in der US-Patentschrift 2 788 353 beschrieben ist und therapeutische Hormonaktivität aufweist, insbesondere kann man auf diese Weise adrenale-corticoide Steroide herstellen. Weiterhin können die 3-Ketone, die auf diese Weise hergestellt wurden, im Ring A dehydriert werden, wobei die 3-Οχο-,Δ ' -Struktur gebildet wird, die in einer grösseren Anzahl von physiologisch aktiven Steroiden vorliegt. So kann man beispielsweise 1 ß, 11 C*s.-Dihydroxy-5C<-pregnan-3,20-äion durch Ring Α-Dehydrierung und Wasserabspaltung in das 110f-Hydroxypregna-1,4~dien-3»20-dion überführen, dessen Oxydation zu Pregna-1,4-dien-3,11,20-trion führt, was in der US-Patentschrift 2 883 400 beschrieben ist, und welches wertvolle glucocorticoide und antiinllammatorische Aktivität aufweist. In einigen Fällen kann die obige Dehydrierung so durchgeführt wsrslsn, dass man 4,16~Dien-3*20-dione erhält, die bei der Dehydrierung ±il der 1«Stellang 1,4,6-Trien-3,20-dione ergeben und die ebenfalls in öer IlS-JPatentschrift 2 788 353 beschrieben sind und die adrenale-corticoide Aktivität aufweisen. ■ ". -
Wie oben angegeben, umfassen die Steroide, die man bei dem erfind ungsgemäs sen Verfahren verwenden kann, 5(X- und 5(6)-Dehydro-pregnan-20-one, die 5oC-Pregnan-20-one'sind für das erfindungsgemässe Verfahren bevorzugte Substrate.. Diese 20~0ne können ebenfalls als Garbonylderivate, beispielsweise als 20-Ketale, wie als Äthylenketale, verwendet werden.
Die Steroide können verschiedene Substituenten enthalten. So trägt d^e 3-Stellung vorzugsweise eine Sauerstoffunktion, beispielsweise eine Hydroxy- oder eine veresterte Hydroxygruppe oder eine Ketogruppe. Veresterte Hydroxygruppen schliessen * beispielsweise ein, Acyloxygruppen, beispielsweise niedrige aliphatisch^, araliphatisch^'oder aromatische Acyloxygruppen,
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vorzugsweise mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in den aliphatischen Teilen und irgendwelche aromatischen Gruppen sind vorzugsweise monocyclisch. Acetoxy-, Propionylöxy-, Phenylacetoxy- oder Benzoyloxygruppen können ebenfalls vorhanden sein.
Enthält das Steroid einen 16-aliphatischen Substituenten, so kann dieser in (X - oder ß-Konfiguration vorliegen, wobei die ß-Konfiguration bevorzugt ist. Die aliphatisehe Gruppe kann beispielsweise eine Alkylgruppe sein, vorzugsweise eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Methylgruppe .
17&-Hydroxygruppen sind vorzugsweise in Form von 17<X-Acyloxygruppen vorhanden. Diese Acyloxygruppen können irgendeine der oben als mögliche 3-Acyloxygruppen angegebenen Gruppen sein.
Die mikrobiologische Hydroxylierung wird vorzugsweise ausgeführt, indem man den Hydroxyl einführenden Organismus auf oder in einem Nährmedium kultiviert und danach das Steroidsubstrat, das hydrolxyliert werden soll, zufügt und eventuell das bishydrolxylierte Produkt isoliert, obgleich es ebenfalls möglich ist, das Steroidsubstrat mit getrenntem und gewaschenem Mycelium oder Sporen zu kontaktieren. Das Nährmedium enthält im allgemeinen eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle und eine Energiequelle, Kofaktoren und Spurenelemente. Die Stickstoff quelle kann beispielsweise ein Material von organischem Ursprung, wie Korneinweichwasser, Malz, Sojabohnenmehl, Rinderextrakt, Hefe extrakt, Laetalbumin, Casein,,Pepton oder Proteinhydrolysate oder ein synthetisches Material, wie ein Nitrat oder ein Ammoniumsalz,sein. Die Kohlenstoff- und Energiequellekann beispielsweise ein Kohlenhydrat, beispielsweise Glucose, Maltose, Mannose, Dextrose, Lactose,Saccharose, Melasse, Glycerin, Mannitol oder Stärke sein.
Spurenelemente und Kofaktoren werden in den meisten Nährböden natürlichen Ursprungs vorhanden sein, wenn aber synthetische
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Medien verwendet werden, müssen sie zugefügt werden.
Die Mikroorganismen können sich' im Wachsturnszustand befinden oder sie können ruhend sein, entweder können Sporen oder Mycelium verwendet werden. Besonders wertvolle Stämme von A. ochraceus schliessen ein Wilhelm (CBS 132 52), NRRL 398, IMI 16264 und NRRL 405. Der bevorzugte A. nidulans ist ATCO 11267. Der bevorzugte Stamm von R. arrhizus ist CBS 285 55, der von C. praticola ist Kotila CBS 340 51 "und der von P. sanguineus ist (L. ex Fr.) Mey (Pycnoporus sanguineus (L.ex Pr.) Murrill) CBS 358 63. '
Der pH-Wert des Mediums wird für das Wachstum vorzugsweise optimal gewählt und er liegt im allgemeinen im Bereich von 4,0 bis 7,0. Für A. ochraceus ist der bevorzugte pH-Wert ungefähr 5,5.
Es ist vorteilhaft, zu dem Kulturmedium ein Lösungsmittel für das Steroidsubstrat zuzufügen, obgleich es ebenfalls möglich ist, einen ausreichenden Metabolismus des Steroids zu erhalten, wenn man dieses in mikrofeiner Form verwendet. Das am meisten bevorzugte Lösungsmittel ist Dimethylsulfoxyd, aber andere Dialkylsulfoxyde können verwendet werden, wie auch Alkanole, wie Methanol und Äthanol, substituierte Amidlösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, Ketone, wie Aceton und Methyläthylketon und Äther, wie Diäthyläther, Tetrahydrofuran und Dioxan. Ein Befeuchtungsmittel kann ebenfalls vorteilhafterweise vorhanden sein, ob oder ob kein Lösungsmittel zugefügt wird. Beispiele derartiger Mittel sind Spans(Hexitolanhydrldester von langkettigeii. Fettsäuren), Tweens (Polyoxyalkylenäther von Hexitolanhydrid langkettigen Fettsäureestern, vorzugsweise mit 15 bis 30 Oxy äthyl en einheit en), Nacconole und TJltrawette (Alkylarylnatriumsulfonate) und ähnliche. Tween 80, das ungefähr 20 Oxyäthyleneinheiten besitzt und Ultrawet 30-DS ein °10 ~ c^2~^*cy1-'benzolnatriumsulfonat hat)en sich als besonders geeignet erwiesen. Wird Dimethylsulfoxyd verwendet, so beträgt seine Konzentration in dem Medium bevorzugt 0,1 bis 10 °/ot vor-
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teilhafterweise ungefähr 7t5 i» (V/V) und andere Lösungsmittel werden vorteilhafterweise in dem gleichen Konzentrationsbereich verwendet.
Die Konzentration des Steroidsubstrats in dem Medium liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 5 Gew.-^, vorteilhafterweise bei ungefähr 0,01 bis i;o Gew.-% "
Die Kultur des Organismus wird vorteilhafterweise bei optimaler Wachsturnstemperatur durchgeführt, die im allgemeinen zwischen 15°C und 370G liegen wird. Die Hydroxylierung wird im allgemeinen in einem halben Tag bis 8 Tage, beispielsweise in 5 bis 7 Tagen, stattfinden, wobei 6 Tage üblich sind. Den Verlauf der Umwandlung kann man verfolgen beispielsweise durch Dünnschichtchromatographie.
Die 1ß,11 fX-Dihydroxyprodukte kann man aus dem Medium gewinnen, beispielsweise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, entweder in Anwesenheit des Mikroorganismus oder nachdem dieser abgetrennt wurde, beispielsweise durch Filtration oder durch Zentrifugieren. In jedem Fall werden die Zellen des Mikroorganismus, um absorbiertes Steroid zu gewinnen, vorzugsweise mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gewaschen, wie mit dem,das man vorteilhafterweise zu dem Kulturmedium zugegeben hat, um die Lösung des Steroids zu unterstützen, beispielsweise ein Keton, wie Aceton. Dieses Lösungsmittel kann dann eingedampft und der Rückstand in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gelöst werden. Das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel für die Extraktion oder für die Lösung des obigen Rückstands kann beispielsweise ein Kohlenwasserstoff oder ein chlorierter Kohlenwasserstoff, wie Benzol, Methylenchlorid oder Chloroform, ein Ätherlösungsmitte, wie Diäthyläther, ein Keton, wie Methylisobutylketon, oder ein Ester, wie Äthyl- oder Butylacetat, sein.
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Das extrahierte 1ß,11(X-Dihydroxysteroid kann dann vorteilhafterweise in ein Alkylendioxyderivat, beispielsweise ein Ketonid, durch Umsetzung mit einem Keton oder Aldehyd oder in einen Orthoester durch Umsetzung mit einem Orthoesterreagens überführt werden, wobei man die Nachbarschaft der 1ß- und 11 (X-Hydroxylgruppen ausnutzt.
Um ein Alkylendioxyderivat zu bilden, sind die bevorzugten Reagentien aliphatische, araliphatische oder Arylaldehyde und Ketone, beispielsweise Aceton, Methyläthylketon, Acetophenon und Benzaldehyd. Das Reagens zur Bildung des Orthoesters kann beispielsweise ein Trialkylorthoester einer niedrigen Alkancarbonsäure, beispielsweise Trimethyl- oder Triäthylorthoformiat, Triäthylorthoaeetat, Triäthylorthopropionat, Trimethylorthobutyrat oder Orthovalerat sein. Ein Säurekatalysator wird üblicherweise vorhanden sein, beispielsweise eine anorganische Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure oder Schwefelsäure oder eine■organische Säure, wie p-Toluolsulfonsäure. Im allgemeinen sind die Acetonide, die bevorzugten Derivate der dihydroxylierten Steroidprodukte. Ist eine weitere freie Hydroxylgruppe vorhanden, beispielsweise in der 3-Stellung, kann-die Umsetzung mit einem Reagens, das Orthoester bildet, etwas acyliertes Material liefern, aber die Hydroxy- und Acyloxyverbindungen können getrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie.
Die Orthoester enthalten ein asymmetrisches Kohlenstoffatom, wie auch die Alkylendioxyderivate von Aldehyden'und asymmetrischen Ketonen, so dass derartige Produkte im allgemeinen zu Anfang als Mischung der Diastereoisomeren gebildet werden. Diese müssen üblicherweise nicht getrennt werden, da die Schutzgruppe in den meisten Fällen später entfernt wird.
Gewünschtenfalls können die Alkylendioxy- oder Orthoestergruppen anschließend durch Hydrolyse entfernt werden. Saure Hydrolyse, beispielsweise in verdünnter Mineralsäure, wie mit Chlorwasserstoffsäure, Perchlorsäure oder Schwefelsäure, Überführt
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BAOORlGfNAL
ein Alkylendioxyderivat zurück in das Diol. Ist das Alkylendioxyderivat ein Ketonid, ist Perchlorsäure in einem Alkanol, ■beispielsweise in Methanol, ein "bevorzugtes Reagens, um die Hydrolyse zweckdienlich "bei Zimmertemperatur zu bewirken. Die· saure Hydrolyse eines Orthoesters liefert üblicherweise zu Anfang ein Monoacyloxyderivat. Um das Diol zu regenerieren, kann die Aeyloxygruppe durch weitere Behandlung mit Säure oder mit einer Base, wie mit einem Alkalimetallalkoholat in alkoholischer lösung, hydrolysiert werden. Ist jedoch eine 3-Ketogruppe vorhanden, so liefert die Elimination der Gruppe in der 1ß-Stellung in dem sauren hydrolytischen Medium das entsprechen-" de 1,2-Dehydro-3-ketosteroid.
Die 1ß, 11 (X-Dihydroxyderivate können ebenfalls verestert werden, beispielsweise durch Umsetzung mit einem Acylierungsmittel, wie mit einem Säureanhydrid oder Chlorid, beispielsweise in Pyridin,wobei eine oder beide der zwei Hydroxylgruppen acyliert werden können. Unter diesen Bedingungen.wird jedoch ein 3-Keton im al I^
steht.
im allgemeinen Wasser abspalten, wobei ein Δ -Steroid ent·
Die Wasserabspaltung eines 1ß,11 (X—Dihydroxy-3-ketosteroids zu der entsprechenden 1,2-Dehydroverbindung kann ebenfalls ohne vorherige Bildung eines Alkylendioxy- oder Orthoesterderivats erfolgen, wobei man einfach erhitzt, vorzugsweise in saurem Medium, beispielsweise mit verdünnter Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure oder in einem basischen Medium, wie Pyridin. ' ■
Ist in dem Anfangsreaktionsprodukt eine 3ß-Hydroxygruppe vorhanden und wurden die 1ß- und 11 CX-Hydroxygruppe geschützt, beispielsweise durch Bildung eines Ketonids, Esters oder Orthoesters, ist es möglich, die entsprechende 3-Oxoverbindung durch Oxydation, beispielsweise mit einem Oxydationsmittel, das Chromsäure enthält, beispielsweise in Aceton- oder Pyridinlösung, herzustellen. Ein Orthoester wird vorzugsweise unter basischen oder neutralen Bedingungen oxydiert. Andere Oxyda-
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ton*'·:-: _ 9 Λ . 21166Ο1
tionsmittel* können zur Oxydation verwendet werden, "beispielsweise. Öppenauer Reagens, das sind sekundäre oder tertiäre AlkohOlate in Anwesenheit eines Ketons, beispielsweise Aluminiumisopropy-lat: und Aceton öder Kalium-tert.-butylat und Benzo*- phenon, Dimethylsulfoxyd (DMSO) Reagentien, beispielsweise ■ DMSO mit Pyridin-Schwefeltrioxydkomplex und Triethylamin, DMSO mit Essigsäureanhydrid oder ein Carbodiimid, beispielsweise - · Dicyclohexylcarbodiimid, Pyridin: und Dichloressigsäure in DMSO-Benzolj Quellen für positives Halogen, beispielsweise N-Brom-amide oder -imide, Isocyanursäurehalogenide oder tert.-Buty!hypochlorite, Bleitetraacetat in Py'ridin oder Sauerstoff, in Anwesenheit eines Katalysators, beispielsweise eines Platinkatalysators. · ■ ·
Verwendet man ein Keton, wie Aceton, als Lösungsmittel mit einem sauren Oxydationsmittel., beispielsweise Chromsäure,1 ;so'kann man ein 1ß,3ß,11 Ö^-Triol als Ausgangsmaterial· verwenden, da die tß- und 11 (X -Hydroxygruppen durch schnelle Ketonidbildung ge— -
schützt werden. ' - j ...'-,;■ :
Für die Einführung einer 4,5-Doppelbindung kann man ein 3-Keto-1ß, 11 CC-alkylend!oxy- öder" Örthoesterderivat bromieren, um in den Α-Ring ein Brömatom einzuführen und danach kann man Bromwasserstoff abspalten. Die Bromierung kann ebenfalls durch molekulares Brom in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise einem cyclischen Itherlösungsmittel, wie Dioxan oder Tetrahydrofuran, in Anwesenheit einer Spur von Bromwassjerstöff erfolgen. Die Bromwasserstoffabspaltung wird vorzugsweise durchgeführt, indem man eine Base mit hohen dielektrischen Konstanten verwendet^ beispielsweise ein Ν,υ-disubstitui'ertes' Amid oder F-substitui'erte cyclische Amide, Wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N-Methylpyrrolidon, in Anwesenheit eines Alkali- oder Erdalkalimetallcärbonats, beispielsweise Lithium-" carbonät öder Galciumcarbonat. Bei der Bromierung wird leicht ein weiteres Bromatom in.die 1?0(-Stellung eingeführt, bei der Bromwasserstoffabspaltung erhält■man ein 4,T6-Dien-3%20-dion, ' Bei der durch Säure katalysiei'ten Entfernung der Alkylendioxy-
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oder Ortlioestergruppe erhält man ,dann" ein 11 λ-Hydroxy-1,4-dien-3,20-dion: oder das entsprechende 1,4,16-Trien.
Die in Hing A- und C-gesättigten 1ß, 11 C/y -dihydroxylierten . 5# -Pregnan—3f20-dione und 3-Hydroxy-5 CK-pregnan-20-one besitzen, ein 17ö€-Wasser stof f atom oder. eine 17 θ(-Hydroxy- oder 17(X--Acyloxygruppe oder eine 16-aliphatis ehe Gruppe'oder eine 16,17-Epoxygruppe oder eine 16, 17~Doppelbindung und die entsprechendem 5(6 )^Dehydroderivate' sind-neue Verbindungen und sind ebenfalls Segenstand der vorliegenden Erfindung.· Die 1ß, 11 cd.-Alkylendioxy- und Orthoesterderivate dieser Steroide sind eben- * falls neue ¥erbindungenf mit Ausnahme der Acetonide, Andere^ neue1 Verbiiietemigen schliessen ein ti3,11 g( ^-Alkylendioxy—'und ; Orthoes-terderiVate TTon- 1B, 11 ß« -Dihydroxypregn-4-en-3,20-dionen und 1,11 OS---liihydrQxypregna--4, To-dien-Jj 20-dionen. ·
Spezifische"neue-Verbindungen, die wie zuvor erklärt als Zwischenprodiifciie -wertvoll sind, sehliessen eini ,
1ß,TiOi-BiÄydröxy-5of-pregnan-3,2Q-dion
3ß-Acetoxy-tS;,11 a-(1 '-äthoxy-1 '-methylmethylen
1 ß, 110C-Ct '-Athoxy-I '-methylmethylendioxy)-3ßhydroxy-5öC-pregnan-20-on
1 β, 11 !X-Ci'-Xthoxy-I r-me thylme thylendioxy )-5οί -pregnan» 3,20-dion
Iß,11 U— Isopropylidendioxypregn-4~en-3,20-dion
1 ß, 11 OC-a:so:pro:pylidendioxypregna-4., 16-dien~3, 20~dion. ",-
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BAD
1ß,3ß,11(X-Trihydroxypregn-5-en-20-on
1ß,3ß, 11CX -Trihydroxy-16oC , 17 tf.-epoxy-5tt-pregiian-20-on und die Acetonide
1ß,3ß,11Oi-Trihydroxy-5C^-pregn-16-en-20-on und die Acetonide
1ß,3ß,11 Of-Trihydroxy-16ß-methyl-50C-pregnan-20-oii und die Acetonide.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch, zu "beschränken. Alle Temperaturen sind in 0C angegeben. Die zwei Zahlen, die im folgenden als Prozentausbetite bei der Hydroxylierungsstufe angegeben sind, beziehen, sich, auf die tatsächliche Ausbeute, sowie auf die Ausbeute, bei der das wiedergewonnene Ausgangsmaterial berücksichtigt würde. Die Daten für die Massenspektren stimmen in allen Pällen mit der angegebenen Struktur über ein. "Petrol- . ... . . — äther" bedeutet eine niedrig-siedende Petrolätherfrafction mit einem Siedepunkt im Bereich von 40 bis 60°. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Drehungen in Chloroformlösung bestimmt. Alle UV-Spektren wurden in Äthanol und IR-Spektren wurden in Schwefelkohlenstoff bestimmt, soweit es nicht anders angegeben ist. Die Schichtchromatographie wurde auf Aluminiumoxyd- oder Silieiumdioxydplatten durchgeführt, "t.l.c." bedeutet Dünnschi chtchromatographie , "ρ.1.c." bedeute t präparat!ve Dünnschichtchromatographie.
Beispiel 1
Hydroxylierung von 3fl-Hvdroxy—5Qf -pregnan-20-on mit Aspergillus ochraceus
V/achstura_yon__Mikro Organismen
Aspergillus ochraceus, Wilhelm (CBS 132 52) wurde auf geneigten Agarflachen von dem Centraalbureau voor Schimmeleultures, Baarn, Holland, erhal
Schräge Flächen wurden aus 3$igem Malzextrakt, der 2 fo Agar in ionenfreiem destilliertem Wasser enthielt, hergestellt. Diese Lösung wurde in 10 ml-Anteilen in Reagensgläser gegossen, die dann sterilisiert wurden und wobei man die Reagensgläser schräg, d. h. in einem Winkel aufbewahrte, damit sich die Nährlösung setzen konnte. Biese schrägen Flächen wurden dann mit dem Organismus aus den . schrägen Masterflächen unter Verwendung einer NickeIchromnadel inokuliert und während 10 bis 15 Tagen bei 25° entwickelt. Um eine kontinuierliche Versorgung von schrägen Nährmedien festzustellen, wurden 14 Tage nach Auftreten einer gesunden (healthy) Entwicklung aus den fe Vorhandenen neue hergestellt.
Nährmedium der folgenden Zusammensetzung wurde, in ionenfreiem destilliertem Wasser hergestellt!
" Malzextrakt 1 g /l
Rinderextrakt (Lab lemco) 1 g /l
Hefe (Mfco) 1 g /l
Korneinweichflüssigkeit 1 ml/l
Glucose · 5 g /l .
Mit 2n-Chlorwasserstoffsäure wurde der pH-Wert auf 5,5 eingestellt und dann wurde Saccharose (2 g/l) hinzugefügt. Das Me- W dium wurde in 500 ml konische Kolben (200 ml/Kolben) eingefüllt, die dann mit Baumwolle verschlossen und in Dampf bei einem
. Druck von 0,7 kg/cm (10 p.s.i.) während 10 Minuten sterilisiert wurden. Diese Kolben wurden dann mit einer Sporensuspension aus den Nährmedien unter sterilen Bedingungen in einem Raum mit Klimaanlage auf die folgende Weise inokuliert. Steriles ionenfreies destilliertes Wasser (2 bis 3 ml) wurde zu je-:
. dem Reagensglas mit der schrägen Nährmediumsflache gegeben, wobei über dem Gel eine Schicht gebildet wurde. Die Masse wurde dann mit einer sterilen Nickelnadel umgerührt, wobei man eine Sporensuspension erhält, die geeignet war, 3 bis 4 Kolben mit sterilisiertem Medium zu inokulieren. Die Pipette, die zum Inokulieren verwendet wurde, wurde zuvor über einer freien Flam-
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i* 2116B01
me erwärmt und dann abgekühlt und der Kolbenhals wurde vor und nach der Zugäbe mit einer Flamme behandelt, um das Risiko einer "Verunreinigung zu vermindern. Die Kolben würden mit Baumvrolle erneut verschlossen und 2 Tage bei 25° mit 200 Upm gedreht," danach wurden solche, die kein gesundes Wachstum zeigten (healthy growth) weggeworfen.
Das Substrat 3ß-Hydroxy-5 (X-pregnan-20-on wurde in Dimethylsulfoxyd (40 mg/i5 ml) gelöst und diese lösung wurde unter sterilen Bedingungen in die Kolben (15 ml/Kolben) eingefüllt, die zwei Tage alte Organismen enthielten. Die Organismen und das Substrat wurden 6 Tage bei 25° inkübiertj wobei man mit einer Geschwindigkeit von 200 Upm drehte.
Der Inhalt der Kolben wurde dann vereinigt und eine gleiche Menge Wasser wurde zugefügt und das Ganze mit Salz gesättigt* Die. Lösung wurde dann mit i/3 ihres Volumens an Methylenchlorid filtriert, wobei man durch Glaswolle filtrierte, um die gebildete Emulsion zu brechen und das Mycelium abzutrennen* Das FiI-trat wurde dann zweimal auf ähnliche Weise extrahiert. Das Mycelium wurde über Nacht in Aceton aufbewahrt und dann filtriert. Dieses Filtrat wurde konzentriert, in Chloroform aufgenommen und mit Salzlösung gewaschen, bevor es mit den Methyleriextrakten wurde. Eindampfen lieferte eine Lösung des Rohprodukts in Dimethylsulfoxyd. Das letztere wurde durch Kurzweg-Destillatiori an einer Ölpumpe auf einem Dampfbad entfernt. Für Versuche in kleinem Maßstab (2 Kolben) wurde dieses Verfahren geringfügig abgeändert. Das Mycelium und die Lösung wurden nicht getrennt Und das Dimethylsulfoxyd wurde ausgewaschen,, indem man die organische Schicht zweimal mit Salzlösung extrahierte.
V "
109841/1821
* U - 2116801
BejSpiel £ ;-::':■' -■-.
a.) RgaroXfcli&tpng von
3ß-Hydröxy-5£*^pregrian-2ö-<-ön (3,0 g) wurde zu A. ochraeetis. auf die in Beispiel Ϊ beschriebene Weise gegeben. Der braune viskose Flüssigkeitsextrakt wurde an Äluminiumoxyd (25.Og, IG^ig deaktiviert) cnromatögraphiert. Elution mit PetrolätheiS-Cliloro form (2:1) lieferte einen farblosen Feststoff (100 mg, 0,3 Y°), der hicHt-umgesetztes Ausgangsmäterial war. Durch Chloroform würde ein unreiner Feststoff elüiert, der weiter durch p.l.c. gereinigt wurde ^präparative Dünnschichtchromatographie: 1 m~3?latten, die sechsmal mit Petroläther-Äcetbii. (4:1) entwickelt würden__7» wobei man einen kristallipen Feststoff erhielt»' Iß, 11 C*-Pihydroxy-5 0<-pregnan-3* 20-Dion (256 mg, 8 ^, 8 fo). Fp 186-196° * ^majt 3603, 3435, 1717 und 1704 cnT1. Durchspülen der Säule nut Chloroform-Methanol (20:1) lieferte unreines Material # das durch präparat! ve Dünnschi ent chromatograpiiie weiter" gereinigt vnirde ^""fühf 1 m-Platten, die sechsmal Mit Petröiä'feher-Aceton (3:1) entv/iekelt wurden_7« Man erhielt einen fartHdöen Feststoffj der aus Aceton-Hexan kristallisiert wurde, wobei man das 10*30*11 £*-$rihydroxy-5i^- 20-ön in Form vpii iradeln örhiilti (1,7 g, 52 ^, 54 ft) i Fp 2i2-2i5Ö, £%Τ|° + 5ÖÖ (c Öi5i MeOH), .
U 7i*T
berechnet: 72^0
1ß,3ß, 11D( ^THh^droxy-'5iX^pregriän--20^on (400 mg) in Aceton (15 ml) würde ttö^fenwiise mit Jones Reagens auf übliche Weise behandelt, isolierung mit Äther lieferte einen Gummi, der aßt Aluminiümoxyd (50 g, -10?äig deaktiviert) chromatographiert wurde. Elution mit ^etröl-Xther (3:1) lieferte einen kristallinen Feststoff (160 ig» 3B fo)\ der aus Äeeton-Hexan umkristallisiert wurdej wobei ihäh. das gewünsohte Äöetotiid erhielt^ Fp 182^183*5°
20 + 106° (c 0,7)
C24H36°4
berechnet: C 74,2 H 9,3 1° ., .
gefunden: 74,0 . 9,2 $
V 1721 und 1708 cm~1, . KMRr-Signale bei T (CDCl,) 9,37
(3H, 18-H), 8,95 (3H, 19~H), 8,71 (3H, Acetonidmethyl). 8,68
(3Ή, Acetonidmethyl), 7,87 (.3H, .21-H), 6,17 (J=10,7,1H, 10L-H),
'6,00 (J= 12,9,6, 1H, 11ß-H>.
1ß,3ß 11O(-Trihydroxy-5cX-pregnan-20-on (80 mg) in Aceton (10 ml) wurde mit 2n-Chlorwasserstoffsäure (5 Tropfen) behan- . delt und 2 Stunden bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Extraktion mit Äther lieferte ein Peststoff, der an einer Aluminiumoxydsäule (10 g, 10$ig deaktiviert) gereinigt wurde. Elution mit Petrol-Äther (1:1) lieferte einen farblosen Feststoff (74 mg, 83 $), der aus Hexan kristallisiert wurde, wobei man das Hydroxy-acetonid in Form von Blättchen erhielt, Fp 166-168°,
ß*Jv + 77 ' ( C 0,4) - ,8 H 9 ,8
°24Η38°4 ,8 9 ,7
berechnet: C 73
gefunden: 73
■V 3610 und 1708 cm"1, NMR-Signale bei X (CDCl,) 9,39
jilcQC J
(3H, 18-H), 9,11 (3H, 19-H), 8,69 (6H, Ac e t oni dme thy lgr up pen), 7,88 (3H, 21-H), 6,4 (m. 1H, 3ÖC-H), 6,42 (J=12',5,1H, 1(X-H), 6,06 (J=11,10,6,1H,11ß-H).
109845/1825
Beispiel 3
ä) 1ß,11 ö{~Diliydroxy-5(5C-pregiian-3,20-dion (40 mg) wurde in Pyridin (6 ml) gelöst. Essigsäureanhydrid (2 ml); wurde zugefügt und die Lösung wurde 24 Stunden bei 20° aufbewahrt. Wasser (5 ml) wurde zugefügt und die Lösung wurde weitere 24 Stunden stehengelassen. Ätherextraktion lieferte einen viskosen Rückstand, der dann auf einer kleinen Platte chromatographiert wurde. Die Hauptbande lieferte einen kristallinen Feststoff (24 mg, 63 f°) * der aus Aceton-Hexan umkristallisiert wurde, wobei man das Titeidion in Form von Blättchen erhielt, Pp und. Mischschmelzpunkt mit authentischem Material (vergleiche unten) 202 bis 203°, Vma -3595, 1707 und 1695 cm"1, NMR-Signale bei
HIcLX.
-3) 9,32 (3H,18-H), 8,86 (3H, 19-H, 7,86" (3H," 21-H), 5,89 (J=IO,10,4, 1H,11ß-H), 4,19 (J=10, 1H,2-H), 1,66 (J=10, IH, 1-H).
b) 1ß,11 oc-Isopropylidendioxy-5 0c-pregnan-3,20-dion (100 mg) in Dioxan (16 ml) und 2n-Chlorwasserstoffsäure (4 ml) wurden 3 Stunden unter Verwendung eines Luftkühlers am Rückfluss erhitzt, danach zeigte die Dünnschichtchromatographie an, dass kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden war. Extraktion mit Äther lieferte einen Gummi, der durch p.l.c. gereinigt wurde ^"eine 20 χ 20 cm Platte, die sechsmal mit Petroläther-Aceton (6:1) eluiert wurde_7. Man erhielt einen farblosen kristallinen Peststoff (55 mg, 65 #). Dieser wurde aus Aceton-Hexan umkristallisiert, wobei man das Titeidion in Form, von Blättchen erhielt, Pp 202 bis 203°, /OiJ^0 + 44° (c 0,9),
berechnet: C 76,3 H 9,15 $ .
gefunden: 76,1 9,3 ^
Amax 231 nm ( £ 10 000), NMR-Sigiiale bei Tj" (ODCl5) 9,32 (3H, 18-H), 8,86 (3H, 19-H), 7,87 (3H, 21-H), 5,90 (J=10, 10,5, 1H,.11ß-H), 4,20 (J=10, 1H, 2-H), 1,66 (J=IO, 1H, 1-H).
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Bäispiel 4
a) .Ink^b^tion^yon^ß-Hid^
3ß-Hydroxypregn-5-en-20-on (3,0 g) in DMSO (1110 ml) wurde'zu einer Kultur Ton A. οehraceus wie in Beispiel 1 gegeben. Extraktion nach 6 Tagen lieferte einen Feststoff, der an Aluminiumoxyd (500 g, 10$ig deaktiviert) chromatographiert wurde» Elution mit Chloroform-Methanol (95:5) und weitere Reinigung durch p.l.c. /"eine 1m- Platte, die einmal mit Äther-Methanol (98:2) eluiert wurde_7 und Kristallisation aus Aeeton-Hexan lieferte 1 ß, 3ß, 11 Of -Trihydroxypregn-5-en-20-on in Form von Nadeln (250 mg, 7 #), Fp 224 bis 226°, ^_7^° +8° (c 0,9 Äthanol), ·
berechnet: C 72,8 H 9,3 $
gefunden: 73,0 9,4 1°
1711 om"1.
b) 3ß-H^drox^-^ßillö^^iso£ro£2;lidendiOx^iISSSzSZf-Sz20-on
1ß,3ß,11oC-Trihydroxypregn-5-en-20-on (68 mg, Rohmaterial, Rückstand aus der Kristallisation) wurde in Aceton (20 ml) mit p-Toluolsulfonsäure (2 mg) am Rückfluss erwärmt, Der Verlauf der Umsetzung wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt und nach 3 Stunden konnte nur noch wenig Ausgangsmaterial gefunden werden. Man extrahierte mit Äthylacetai und reinigte das erhaltene Material durch präparative SchichtChromatographie /"eine 20 χ 20 cm Platte, die zwölfmal mit Petroläther-Aceton (12:1) entwickelt wurde_7. Die Hauptbande lieferte ein Produkt (28 mg), das aus Aceton-Hexan umkristallisiert wurde, wobei man das Acetonid in Form von Rhomboiden erhält, Fp 245 "bis 248°, ßxjf - 10° (0 0,4), ,,, ,·
C24H36O4
berechnet: C 74,2 H 9,3 1°
gefunden: 74,3 9,3 %
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Vmov 3600 und 1707 cm""1, NMR-Signale bei <J (GDCl,) · 9,37
IUdX j
(3H, 18-H), 8,89-(3H, 19-H), 8,68 und 8,66 (Acetonidmethyle), 7,86 (3H,-.'21-H), 6,4 (1H, Multiplett, 3Ot-H), 6,38 (1H, J=12,5, .1Oi-H), 6,00 (1H, J=11,9,6, 11ß-H), 4,61 (1H, J=4, 6-H). \
Beispiel 5
5#-Pregnan-3,20~dion (3,92 g) in DMSO (1470 ml) wurde mit A.ochraceus inkubiert. Extraktion nach 6 Tagen lieferte ein braunes Öl, das an einer Aluminiumoxydsäule (300 g, 10$ig deaktiviert) chromatographyert wurde. Elution mit Chloroform lieferte ein Öl, das nicht weiter gereinigt werden konnte und das daher in Pyridin-Essigsäureanhydrid (4:1, 65 ml) 2 Tage auf übliche Weise acetyliert wurde. Der Extrakt wurde chromatographiert ^~eine 1 m Platte, entwickelt dreimal mit Petroläther-Aceton (6:1)_7, man erhielt drei Banden. Die mittlere Bande lieferte 11 D^-Acetoxy-5(X-pregn-1-en-3,20-dion (100 mg, 2,5 c/°, 3 ^), das dann umkristallisiert wurde aus Aceton-Hexan, wobei man Nadeln enthält, Pp 148 bis 151°, /#7^° + 85° (c 0,3), Vmax 1742, 1710, 1680 und 1233 cm"', NMR-Signale bei T(CDCl3) 9,25 (3H, 18-H), 8,93 (3H, 19-H), 7,87 (6H, Acetatmethyl und .21-H), 4,71 (1H, J=10,10,5 11S-H), 4,18 (1H, J=11,2 - H), 2,48 (1H, J=11, 1-H), (M /~Massenspektrum7, 372. Cp-zH^p» berechnet: M 372). Die am meisten polare Bande lieferte eine Mischung, die weiter durch präparätive Schichtchromatographie aufgelöst wurde ~^~eine 1 m Platte, die 15mal mit Petroläther-Aceton (8:1) entwickelt wurde_7· Eine Bande lieferte 11 <X-Hydroxy-5 #-pregn-1-en-3,20-dion (140 mg, 3 ^, 4 fi)t Schmelzpunkt und Mischschmelzpunkt 199 bis 203 , /ckJ-Q + 82° (c 1,0), Vmax 3395, 1705 und 16βΟ cm"1, Amax 23° nm (£11 300, NMR-Signale bei T(CDGl3) 9,31 (3H, 18-H), 8,86· (3H, 19-H)S 7,86 (3H,21-H), 5Vö8 (1H, J=1O,1O,5,5, 11ß-H) ^"mit DgO, 5,90 (1H, J=TO,10,5, 11ß~H)i7, 4,18 (1H, J=H, 2-H),= 1,64 (IH-, J=11, 1-H)8
Ο 3 S.4 S / 1 3 2 5
Weitere Elution der Aluminiumoxydsaule mit Chloroform-Methanol (20:1) lieferte einen braunen Feststoff, der auf übliche Weise mit Tyridin-Essigsäureanhydrid (4:1, 40 ml) acetyliert wurde. Der Extrakt wurde durch p.l.c. aufgelöst /eine 1 m Platte, die dreimal mit Petroläther-.Aceton (6:1) eluiert wurde J, Man erhielt zwei farblose Feststoffe, der am wenigsten polar war eine Mischung (300 mg) aus 1ß,3ß-Diacetoxy-11o( -hydroxy-5(X pregnan-20-on (100 mg, 2$, 3$) und 3ß,11(X-Diacetoxy-1ßhydroxy-5#-pregnan-20-on (200 mg, 4 $, 5 $) war. NMR-Signale (des Nebenbestandteils) bei T (CDCl5) 9,41 (3H, 18-H), 8,86 (3H, 19-H), 8,0 (Acetatmethyle), 7,88 (3H, 21-H), 6,15 (1H, J=IO,10,6, 11ß-H), 5,31 (1H, J=IO,10,5,5, 3<*-H), 5,19 (1H, J=12,5, 1(X-H) und (Hauptbestandteil) bei (CDCl5) 9,38 (3H, 18-H), 9,09 (3H, 19-H), 8,0 (Acetatmethyle), 7,88 (3H, 21-H), 6,38 (1H, J=12,5, 1«-H), 5,31 (1H, J=1O,1O,5,5, 3(X-H), 4,92 (1H, J=10,10,6, 11ß-H).
Beispiel 6
Eine Anzahl von Pregnanderivaten wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hydroxyliert (der Versuch wurde im kleinen Maßstab durchgeführt, zwei Kolben pro Versuch). Man verwendete verschiedene Stämme von A.ochraceus und A.nidulans. Der Extrakt wurde, nachdem er durch Dünnschichtchromat-ographie untersucht wurde, in Aceton (3 bis 5 ml) aufgenommen.' 2n-Chlorwasserstoffsäure (3 bis 4 Tropfen) wurden zugefügt und die Lösung wurde 15 Minuten am Rückfluss erwärmt. Das Produkt wurde durch DünnschichtChromatographie untersucht und die Ergebnisse sind im folgenden angegeben:
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- 20 Tabelle I
Substrat
Organismus
Acetonid des entsprechenden 1 ß, 11 Oc -Dihydroxyderivats
3ß-Hydroxy-16c< 17oi-epoxy-5ft'- pregnan-20-on
Aspergillus ochraceus Wilhelm
vollständige Bildung 40 mg
2. 3ß-Acetoxy-5 0(-pregnan-20-on
Aspergillus ochraceus Wilhelm
.Acetonid von 3ß-Hydroxyderivat vollständige ^ Bildung 45 mg
3. 3ß-Hydroxy-5oC-pregn-16-en-20-on
Aspergillus
ochraceus
Wilhelm
vollständige Bildung 25 mg
4. 3ß-Hydroxy-i6ßmethyl-5 C< -pregnan-20-on
Aspergillus ochraceus ■Wilhelm
vollständige Bildung 25 mg nach 30 Hinuten
pregnan-20-on
Aspergillus ochraceus Wilhelm
vollständige Bildung
6. 3ß-Hydroxy-5<X-pregnan-20-on
Aspergillus ochraceus NRRL 398
offensichtlich etwas Acetonidbildung
7. 3ß-Hydroxy-5 0<pregnan-20-on
Aspergillus ochraceus IMI 16264
Dihydroxyderivatbildet ein Acetonid
8. 3ß-Hydroxy-5OC-'pregnan-20-on
Aspergillus ochraceus
NRRL 405
Acetonidbildung
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- 2t -
Substrat
pregnan-20-on
Organismus
Aspergillus nidulans ATCO 11267 Acetonid des entsprechenden 1 β, 11 CA -Dihydroxyderivats
Ac etonidbildung
10. 20,20-A'thylen- Asperdioxy-5O^-pregnangillus 3ß-ol Wilhelm
Acetonid des 20-Oxoderivats bildete sich"
* Die Verbindung wurde isoliert (angegebene Menge) und ihre Struktur wurde durch Nlffi-Spektrujn wie in der folgenden Tabelle angegeben bestimmt.
0 9 8.4 5/1825
Tabelle II
Acetonid 1 Acetonid 2 Acetonid 3 Acetonid 4
NMR
18-H 8,99
(9,00*)		 9,39 9,11
(9,12*)		 9,04 .
(9,06*)
19-H 9,11
(9,11*)		 9,12
(9,13*)		 9,08
(9,08*)		 9,14
(9,13*)
Acetonid-
methyle		 8,72 ;
8,69		 8,68
8,68		 8,71
8,67		 8,71
8,71
21-H 7,98 7,89 7,77 7,86
HX-H 6,46
J=12,5		 6,42
J=12,5		 6,44
J=12,5		 6,44
J=12,5
3 OC-H . 6,37 6,37 r^6,4 6,35
J=1O,1O,5,5 J=1O,1O,5,5 Multiplett J=1O,1O,5,5
11ß-H 6,02 6,07 5,97 6,06
J=11,10,6 J=I1,10,6 J=10,10,6 J=IO,10,6
andere
Signale		 ^, 37 3,33
(16-H)		 * 8,95
IR 3650 und 3050 und 3650 und 3650 und
1710 cm"1 1710 cm"1 1673 cm"1 1706 cm "1
* berechnete HiTerte
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Beispiel 7
Das Verfahren, das verwendet wurde, war gleich dem-, das in Beispiel 1 in Bezug auf A.ochraceus verwendet wurde, m±t der Ausnahme, dass die entsprechenden Organismen 7 Tage vor der Oxydation gezüchtet wurden.
Pregnanolon (40 mg) in DMSO (15 ml) wurde zu jedem Kolben,der bis, .zur Reife gewachsenen Organismen (7 Tage) in 200 ml Fährmedien enthielt, gegeben. Nach 5 Tagen wurden die Korbeninhalte mit Chloroform extrahiert und der Extrakt wurde zweimal zur Entfernung von DMSO mit Salzlösung gewaschen. Das Produkt wurde sit Dünnschichtehromatographie untersucht, bevor es in Aceton (1 ml) gelöst und zum Sieden während 15 Minuten auf einem Wasserbad mit 4 Tropfen 2n-Chlorwasserstoffsäure erhitzt wurde. Die Lösung wurde mit Dünnschichtehromatographie erneut auf die Bildung des 1ß,11C*-Acetonids untersucht.
In beiden Fällen beobachtete man Acetonidbildung. Beispiel 8
3ß-Hydroxy-5 (X-pregnan-20-on (1Q g) wurde zu A.öchraceus auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise gegeben. Nach der Inkubation während 6 Tagen bei 25° unter Drehen mit 200 Upm wurde das Mycelium abfiltriert, mit Wasser gewaschen und die Filtrate wurden vereinigt (>~\.47Ii). 351» Filtrat wurden mit Acetylacetat (3x15 Jj) extrahiert, getrocknet (MgSO*) und unter vermindertem Druck bei 60° auf ca. 31 eingedampft. Die Reaktionsmischung wurde dann auf ca. 100 ml aufkonzentriert und dann bei 140° · und 0,1 mm Druck destilliert. Chromatographie an neutralem Aluminiumoxyd unter Verwendung von Chloroform-Petroläther
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(Siedepunkt 4-0 bis 60°) und Chloroform als Lösungsmittel und anschliessende Kristallisation aus Methylacetat-Petroläther (Siedepunkt 40 Ms 60°) lieferte die Titelverbindung (3,91 g), Pp 215 bis 219°, /jüj^ + 55° (c 0,5 MeOH), NMR-Signale bei ) 9,40 (3H, 18-H), 9,09 (3H, 19-H), 7,84 (3H, 21-H).
1ß,3ß,11 (X-Triliydroxy-5(X-Pi>egnan-20-on (1 g) wurde in Aceton (100 ml) gelöst und Perchlorsäure (50 $ Gew./V., 0,02 ml) in Aceton (10 ml) wurde zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur während 25 Minuten aufbewahrt, in Natriumbicarbonatlösung gegossen und dann wurde das Steroid mit Äther extrahiert. Verreiben mit Äther lieferte die Titelverbindung (1,12 g), Pp 166 bis 167°.
c) UiIlOC zill
5_#-p_reS.nan-20-on
1ß,3ß,11OC-Trihydroxy-5 <X-pregnan-20-on (100 mg) wurde in Methyläthy!keton (10 ml) gelöst und Perchlorsäure (60 fo Gew./?., 0,01 ml) in Methyläthylketon (1 ml) wurden zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur während 60 Minuten aufbewahrt, in wässrige Natriumbiearbonatlösung gegossen und mit Äther extrahiert, wobei man die Titelverbindung in Porm der zv/ei Diastereoisomeren (110 mg) erhielt, NMR-Signale bei T(CDCl3) 9,38, 9,41 (3H, 18-H), 9,11, 9,14 (3H,"" 19-H), 7,87, 7,90 (3H,-21-H), 8,79 (Ketonid CH3) 9,10. (Ketonid CH2CH3), 6,34 (J=12,6, IH, 10(-H), 6,4 Multiplett (1H, 3"CC-H), 6,07 (IH, 11ß-H).
Beinpiel 9
a) 1 R, 3ß, 11r>( -Trihydroxy-5K -pregnan-20-on (250 mg) wurde in Dioxan. (50 ml), Trläthylorthoacetat (1 ml) gelöst und p-Toluo.lsulfonsäure (240 mg) in Chloroform (0,2 ml) wurden zugegeben.
,..,..,.. 109845/1825
BADORiGlNAL
Dae &emiscji wurde bei Zimmertemperatur während 14 Minuten aufbewahrt.» dann in eine wässrige Fatriumbicarbonatlösung gegossen und mit.Äther-extrahiert..Die Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung von 2,5.$ Isopropylalkohol. in Chloroform als lösungsmittel lieferte 1ß,11C<-(1'-Äthoxy-1'-methylmethylendioxy)-3ß-hydroxy-5 (X.-pregnan-20-on (160 mg), MMR-Signale-bei T.(CDCl5) 9,44 (3H, 18-H), 9,09, 9,13 (3H, 19-H), 7,89 (3H, 21-H), 5,8-6,75 (KX1-H, 3 OC-H, 11ß-H), 6,47, 8,79 (Äthoxymethylendioxy), 8,56 (Methylmethylendioxy), in Form von zwei Diastereoisomeren und ^ß-Acetoxy—1ß,11 (1'-äthoxy-1'-methylmethylendioxy)-5Of-pregnan-20-on (50 mg), NMR-Signale bei (CDCl5) 9,44 (3H, 18-H), 9,09, 9,13 (3H, 19-H), 7,90 (3H, 21-H), 6,6 (IH, 10C-H), 5,3 (IH, 3(X-H), 6,0 (1H, 11ß-H), 6,49, 8,80 (Äthoxymethylendioxy), 8,60 (Methylmethylendioxy) , 8,00 (3ß-CH,C00-), ebenfalls eine Mischung der zwei Diastereoisomeren.
Die Mischung der 3ß-01e (100 mg) wurde in Pyridin (1 ml) gelöst und zu einer gerührten Lösung von Chromtrioxyd (150 mg) in Pyridin (2 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 22 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, in Wasser gegossen und das Steroid wurde mit Äther extrahiert, wobei man das 1ß,11 OC—(1 * — Äthoxy-1 '-metliylmethylendioxy)-5oC-pregnan-3» 20-dion erhielt. Das gesamte Rohprodukt wurde in Dioxan (16 ml) gelöst und 2n-Chlorwasserstoffsäure (4 ml) wurde zugefügt,, die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden am Rückfluss erwärmt, gekühlt und in eine wässrige Natriumbicarbonatlösung gegeben und dann wurde das Steroid mit Äther extrahiert" (65 mg), X „ · (EtOH) 231 mn. Kristallisation aus Methylacetat-Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60°) lieferte die Titelverbindung (30 mg), Fp 190 bis 192°, Amax (Et0H> 251 nm·
b) 1ß,11 OC-lGoprOpylidendioxy-5 oC-pregnan-3,20-dion (100 mg) wurde in Methanol (10 ml) gelöst und Perchlorsäure (0,75 ml, βθπ/ό Gew./V.) wurde zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur 17 Stunden .aufbewahrt und dann in Natriumbicarbonatlösung gegossen und das Steroid wurde mit Chloroform
109845/1825 BADOR,G,NAU
2118601
extrahiert. Kristallisation aus .Methylacetat-Petro lather; . (Siedepunkt 40 bis 60°) lieferte die Titelverbindung (50 ing), Pp 199 bis.2010, Amax (EtOH) 229,5 nm, (£t0,990). ...., .
Beispiel 10 V . -.',"' . ..·...-. ■'-■;·■■
Chromtrioxyd (600, mg) wurde zu Pyridin (6 ml) gegeben und die Reaktionsmischung wurde ca, 15 Minuten gerührt.3ß-Hydroxy-1ß,11 Oi-isopropylidendioxy-5 P(~pregnan-20-on (560 mg), gelöst in Pyridin (4.ml) wurde zugefügt und die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur während 20 Stunden gerührt, in Yfasser gegossen und dann wurde das Steroid mit Äther extrahiert. Der Extrakt wurde mit 2n-Chlorwasserstoffsäure, wässriger ETatriumbi carbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO.) und eingedampft. Kristallisation aus Aceton-Hexan lieferte die Titelverbindung (360 mg), Fp 182 bis 184°.
Beispiel 11 " ' ;
1ß,11 OC-Isopropylidendioxy-5 <V-pregnan-3,20-dion (261 mg) v/urde in Dioxan (9,5 ml) gelöst und zu Brom (40 mg) zusammen mit einem Tropfen HBr/Essigsäure (45 °p) gegeben. Die· Reakt-ionsmi—- * schung wurde bei Zimmertemperatur 2 Stunden aufbewahrt. Sie wurde dann in eine wässrige ETatriumbicarbonatlösung gegossen und das Steroid wurde mit Äther extrahiert, wobei man die rohe: Bromverbindung erhielt. . - - ' . '
Das Rohprodukt wurde in Dimethylacetamid (100 ml) gelöst und Galciumcarbonat (600 mg) wurde zugefügt. Die Reaktionsralschimg wurde gerührt und 1 Stunde am Rückfluss erwärmt. Sie wurde'- dann gekühlt und in 2n-r-Chlorwass er stoff säure gegossen und das Steroid wurde mit Chloroform (220 mg) extrahiert. Das Produkt wurde an Silioagelplatten unter Verwendung von Chloroform als Lösungsii).itt,ej.r;Chromatographiert und das UV-abeorbierende Material wurde mit Methanol (03 mg) eluiert. Erneute Chromatographie
10 9 8 4 5/1825
BAD ORIGINAL
unter Verwendung von Aceton-Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60°) als lösungsmittel trennte dieses Material in zwei Bestandteile. Der Nebenbestandteil (18 mg) war 1ß,11# -Isopropylidendioxypregna-4f16-dien-3,20-dion, Xmov (EtOH) 238 nm, HMR-Signale
r IQcLJC
bei T(CDCl3) 9,07 (3H, 18-H), 8,64 (3H, 19-H),- 7,74 (3H, 21-H), 3,18 (1H, 1Ot-H), 4,21 (1H, 4-H), 5,82 (1H,11ß-H), 5,94 (1H, 16-H), 8,74 (Acetonid-CH^). Der Hauptbestandteil (37 mg) wurde aus Methylacetat-Petrolather^(Siedepunkt 40-60°) kristallisiert, wobei man das 1ß,110t-lsopropylidendioxypregn-4-en-3,20-dion (20 mg) erhielt, Pp 196 bis 198°, Amr,v (EtOH) 238,5 nm,
' max
C24H34O4. 1/2 H2O
berechnet: C 73,0 H 8,8 $
gefunden: 72,9 8,75 1°
Beispiel 12
Das rohe Bromierungsprodukt, hergestellt wie in Beispiel 11 aus 1ß, 11 (X-Isopropylidendioxy-5^X-pregnan^-3,20-dion (252 mg) wurde in Dimethylacetamid (50 ml) gelöst und mit Calciumcarbonat (600 mg) unter Rühren während 1 Stunde am Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde in kalte 2n-Chlorwasserstoffsäure gegeben und das Steroid wurde mit Chloroform (230 mg) extrahiert. Das Rohprodukt (220 mg) wurde in Methanol,(20 ml) gelöst und Perchlorsäure (1,5 ml, 60 $ Gew./V.) wurde zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur·während 17 Stunden aufbewahrt, in eine wässrige liatriumbicarbonatlösung gegossen und mit Chloroform extrahiert. Chromatographie an Siliciumdioxydplatten unter Verwendung von Äthylacetat als Lösungsmittel lieferte nach 4 Durchläufen und Elution mit Methanol die Titelverbindung (40 mg), Gesamtausbeute 19 $, Pp 215 bis 218°, Amax (EtOH) 247,5 nm.
BAD ORiGINAL
1 098AB/182B

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur mikrobiologischen 1ß,1Ia-Bis-Hydroxylierung von Ring A- und C-gesättigten 5a- und 5(6)-Dehydropregnan-20-onen, die in 16- und 17a-Stellungen Wasserstoffatome oder eine der folgenden Gruppen, eine 1Ta-Hydroxygruppe, eine 17&- Acyloxygruppe, eine 16-aliphatische Gruppe, eine 16,17-Epoxygruppe oder eine 16,17-DoppelMndung enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man das Steroidsubstrat mit einem der folgenden Mikroorganisraen Aspergillus ochraceus, Aspergillus nidulans oder Rhizopus arrhizus inkubiert und das bishydroxylierte Produkt gewinnt.
    2. Verfahren gemäss Anspruch 1,-dadurch gekennzeichnet, dass das Steroidsubstrat eine Hydroxygruppe, eine veresterte
    Hydroxygruppe oder eine Ketogruppe in der 3-Stellung enthält.
    3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die veresterte Hydroxygruppe eine aliphatische, araliphatisch^ oder aromatische Acyloxygruppe ist, worin der aliphatische Teil 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und jede
    aromatische Gruppe monocyclisch ist.
    4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Steroidsubstrat eine aliphatische, araliphatische oder aromatische Acyloxygruppe in der
    17<X-Stellung enthält, wobei jeder aliphatische Teil 1
    bis 6 Kohlenstoffatome enthält und jede, aromatische Gruppe monocyclisch ist.
    5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche T bis 3, dadurch ge"-kennzeichnet, dass das Steroidsubstrat in 16-Stellung eine aliphatische Gruppe besitzt, wobei dies eine Alkylgruppe
    mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
    1098.45/182 5
    6. Verfahren gemäss Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass die 16-aliphatische Gruppe eine Methylgruppe ist.
    7. Verfahren gemäss Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die aliphatische Gruppe in 16-Stellung in ß-Konfiguration vorliegt.
    8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man- die hydroxylierenden Mikroorganismen auf oder in einem Nährmedium kultiviert, das Steroidsubstrat, das hydroxyliert werden soll, dazugibt und . schliesslich das bishydroxylierte Produkt gewinnt.
    9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das ETährmedium eine Sticks to ff quelle, eine Kohlenstoff- und Energiequelle, Kofaktoren und Spurenelemente enthält,
    10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Stickstoffquelle Korneinweichflüssigkeit, Malz, Sojabohnenmehl, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Lactalbumin, Casein, Pepton, Proteinhydrolysate, ein Mtrat oder ein Ammoniumsalz ist.
    11. Verfahren gemäss Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoff- und Energiequelle Glucose, Maltose, Mannose, Dextrose, Lactose, Saccharose, Melassen, Glycerin Mannit oder Stärke ist. -
    12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösungsmittel für das Steroidsubstrat zu dem Kulturmedium zugegeben wird.
    13. Verfahren gemäss Anspruch 12, 'dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein Dialkylsulfoxyd, ein Alkohol, ein substituiertes Amid, ein Keton oder ein Äther ist.
    10 9 8.45/1825
    14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel Dimethylsulfoxyd ist.
    15. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Lösungsmittels in dem Kulturmedium 0,1 bis 10 Vol*$ beträgt.
    16. Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Lösungsmittels ungefähr 7,5 Vol.$
    beträgt.
    17. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem Kulturmedium ein Befeuchtungsmittel zufügt.
    18. Verfahren gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polyoxyäthylenäther von Hexitolanhydrid-langkettigen-Iettsäureester mit/20 Oxyäthyleneinheiten pro Molekül oder ein Alkylbenzolnatriumsulfonat als Befeuchtungsmittel verwendet wird.
    19. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 8 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Steroidsubstrat .
    in dem Kulturmedium 0,01 bis 5 Gew.-^ beträgt.
    20. Verfahren gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Steroidsubstrat 0,01 bis 1 Gew.-5$
    beträgt. * . -.
    21. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrobiologische Hydroxylierung während 1/2 bis 8 Tagen durchgeführt wird,
    22. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus
    A. ochraceus vom Stamm Wilhelm (GBS 132 52), NRRL 398,
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    IMI 16264 oder FRRL 405, oder A. nidulans vom Stamm
    ATCO 11267 oder R. arrhizus vom Stamm CBS 285 55'ist.
    23. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewinnung des bishydroxylierten Produkts einschliesst, dass ein Alkylendioxyderivat durch
    Umsetzung des Produktes mit einem Keton oder Aldehyd gebildet wird, oder dass ein Orthoester durch Umsetzung des Produkts mit einem Orthoesterreagens gebildet wird.
    24. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das gebildete Alkylendioxyderivat ein Ketonid ist.
    25. Verfahren gemäss Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkylendioxyderivat durch Umsetzung des bishydroxylierten Produkts mit Aceton, Methyläthylketon oder Benzaldehyd gebildet wird.
    26. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Orthoesterreagens ein Trialkylorthoester einer niedrigen Alkancarbonsäure ist.
    27. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch
    gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Anwesenheit eines
    sauren Katalysators durchgeführt wird.
    28. Verfahren gemäss Anspruch 27,, dadurch gekennzeichnet, dass der saure Katalysator Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoff säure, Perchlorsäure, Schwefelsäure oder p-Toluolsulfonsäure ist.
    29. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkylendibxyderivat oder das Orthoesterderivat anschliessend zur Entfernung der Alkylendioxy- oder Orthoestergruppen hydrolysiert wird.
    1 0 9 8.4 5 / 1 8 2 5
    30. Verfahren gemäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse in verdünnter Mineralsäure bewirkt· wird.
    31. Verfahren gemäss Anspruch 30,, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure Ohlorwasserstoffsäure, Perchlorsäure oder
    Schwefelsäure ist.
    32. Verfahren gemäss Anspruch 31 * dadurch gekennzeichnet,! dass das Alkylendioxyderivat ein Ketonid und die Säure eine
    alkoholische Perchlorsäure ist»
    P 33» Verfahren gemäss Anspruch 32, · dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse bei Zimmertemperatur durchgeführt wird.
    34. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das bishydroxylierte Produkt bei der Gewinnung durch .umsetzung mit einem Acylierungsmittel verestert wird.
    35· Verfahren gemäss Anspruch 34, dadurch· gekennzeichnet, dass das Acylierungsmittel ein Säureanhydrid oder Säurechlorid
    ist.
    ^ 36. Verfahren gemäss Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass ■
    die Acylierung in Pyridin als Lösungsmittel'durchgeführt
    wird. .
    37. Verfahren gemäss ein-em der Ansprüche 1 bis '22, dadurch gekennzeichnet, dass das bishydroxylierte Produkt ein
    1ß,11 (X-Dihydroxy-3-ketosteroid ist, das anschliessend zu
    der entsprechenden 1,2-Dehydroverbindung dehydratisiert- " wird,
    38. Verfahren gemäss Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Wasserabspaltung in saurem oder basischem Medium durch-
    ' geführt wird.
    1 09 8.45/Ϊ 825
    39. "Verfahren gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das saure Medium eine verdünnte Mineralsäure ist....
    40. Verfahren gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das "basische Medium Pyridin ist.
    41. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 23 Ms 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Alkylendioxy-, Orthoester- oder Esterderivat eines 3ß-Hydroxysteroids gebildet wird und dieses anschliessend zu der entsprechenden 3-Oxoverbindung oxydiert wird. .
    42. Verfahren gemäss Anspruch 41> dadurch gekennzeichnet, dass die Oxydation mit. Chromsäure, einem sekundären oder tertiären Alkoholat in Anwesenheit eines Ketone, Dimethylsulfoxydreagentien, Quellen für positives Halogen, Bleitetraacetat in Pyridin oder durch Sauerstoff in Anwesenheit eines Katalysators, "bewirkt 'wird.
    43. Verfahren gemäss Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxydation unter Verwendung von Chromsäure in Anwesenheit von Schwefelsäure/Aceton oder Pyridin durchgeführt wird.
    44. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass ein 1ß,3ß, 11 (X-irihydroxys.teroid mit Chromsäure in Anwesenheit eines Ketons oxydiert wird, wobei ein 1ß,11 <X-Alkylendioxy-3~keton hergestellt wird.
    45. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 23 bis 28 oder 41 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass ein 3-Keto~1ß, 11 OC-alkylendioxy- oder Orthoesterderivat der sauren Hydrolyse unterworfen wird, wobei .das entsprechende 3-Keto-HOC-hydroxy-1(2)-dehydrosteroid gebildet wird.
    1098.45/182 5
    46. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 23 bis 28 oder 41 44, dadurch""gekennzeichnet, dass ein 3-Keto-1ß,l.ioi -alkylendioxy- oder Orthoesterderivat gebildet wird und dieses anschliessend bromiert wird, um in den Ring A ein Bromatom einzuführen und diese Verbindung anschliessend dehydrobromiert wird, um eine 4,5-Doppe!bindung einzuführen.
    47. Verfahren gemäss Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Bromierung ebenfalls ein 17-Bromatom eingeführt wird, wobei man bei der Dehydrobromierung eine 16,17-Doppelbindung erhält.
    48. Verfahren gemäss Anspruch 46 oder 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Bromierung durch molekulares Brom in einem inerten Lösungsmittel in Anwesenheit einer Spur von Bromwasserstoff erfolgt. .
    49« Verfahren gemäss Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein cyclisches Itherlösungsmittel ist.
    50, Verfahren gemäss einem der Ansprüche 46 bis 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehydrobromierung durchgeführt wird, indeml man eine Base mit hoher dielektrischer Konstante in Anwesenheit eines Alkali- oder Erdalkalimetallcarbonate verwendet.
    .51. Verfahren gemäss Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass die Base ein U,N-disubstituiertes Amid oder N-substituier~ tes cyclisches Amid ist.
    52. Verfahren gjemäss Anspruch 51» dadurch gekennzeichnet, dassr die Base Dimethylformamid oder Dirnethylacetamid ist.
    53. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 50 bis 52, dadurch gekennzeicim^t, dass das Erdalkaliiaetsllcarbonat Galciumearbonat ist.'
    54. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 46 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass das 3-Keto-4(5)-dehydro-alkylendioxy- oder Orthoesterderivat der sauren Hydrolyse unterworfen wird, wobei man das entsprechende 3~Keto-11Crt—hydroxy-
    ^1 ^-derivat erhält.
    55. Modifikation des Verfahrens gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Steroidsubstrat mit einem der Mikroorganismen Corticium praticola oder Polystictus sanguineus anstelle der in Anspruch 1 angegebenen Mikroorganismen inkubiert wird.
    56. Verfahren gemäss Anspruch 55» dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus.C.praticola Kotila des Stammes CBS 340 51 oder P.sanguineus (L.ex.Pr.) Mey /P*ycnoporcus sanguineus (L.ex Fr.) Murrill_7 vom Stamm CBS 358 63 ist.
    57. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Steroidsubstrat in Form eines 20-Carbonylderivats umgesetzt wird.
    58. Verfahren gemäss Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass das Steroidsubstrat, das umgesetzt wird, ein 20-Ketal ist.
    59. 1ß,11(X-Dihydroxysteroide, deren Alkylendioxy-, Orthoester- und Esterderivate und verwandte Verbindungen, hergestellt gemäss einem der Verfahren der vorhergehenden Ansprüche*
    60. Ring A- und C-gesättigte Tß,11p<-dihydroxylierte 5iX-Pregnan-3,20-dione und 3-Hyaroxy-5<X-Pi'egnan-20-one, die ein 17O<-Wasserstoffatom oder eine 17Oi -Hydroxy- oder 17<X-Acyloxygruppe oder eine 16-aliphatische oder 16,17-Epöxygruppe oder eine 16,17—Doppelbindung enthalten und die entsprechenden 5(6)-Dehydroderivate. ■
    61. 1ß,11 OC-Alkylendioxy- und Orthoesterderivate der Verbin-
    10 9.84 57 182 6
    düngen gemäss Anspruch. 60, mit der Ausnahme der Acetonide,
    62. 1 ß, 11 iX-Alkylendioxy- und Orthoesterderivate von 1ß, 11(?C-Dihydroxypregn-4-en-3,20-dionen und 1ß,11 <X-Dihydroxy— · pregna-4,16-dien-3,20-dionen.
    63. 1ß,3ß,11<X-Trihydroxy-5 0C
    1 ß, 110C-Dihydroxy-5 fK-pr egiian-3,20-dion
    1ß, 11 (X -(1'-Äthyl-1f-methylmethylendioxy)-3ß-hydroxy- -5 O(^-pregnan-20-on
    ^ 3ß-Acetoxy-1ß,11ΊΧ -(1 '-äthoxy-1'-methylmethylendioxy)-5 (X-pregnan-20-on
    1ß,11^X-(i'-lthoxy-1l-methylmethylendioxy)-3ß-hydroxy-5 (X-pregnan-20-on
    1 ß, 11 OC -(-1 ' -Äthoxy-1 ' -me thylmetliylendioxy) -5 C/· -pregnan-3,20-dion
    1ß,1T<X-Isopropylidendioxypregn-4-en-3,20-dion
    1 ß, 11 <X_lsoprop3''lidendioxypregna-4,16-dien-3,20-dion
    1ß,3ß,11 iX-Trinydroxypregn-5-en-20-on
    1 ß,3ß, 1 ToC-Trihydroxy-16o(., 17 CX-epoxy-5 CX.-pregnan-20-on und dessen Acetonid
    - 1ß,3ß,1iCX-Trihydroxy-5 !X-pregn-T6-en-20-on und dessen Acetonid
    1ß,3ß,11 Ot-Trihydroxy-16ß-methyl-5rX-pregnan-20-on und dessen Acetonid. ... ·
    1 09 84 5/18 25
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PL444646A1 (pl) * 2023-04-27 2024-10-28 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 11α-hydroksy-pregn-1,4-dien-3,20-dion i sposób wytwarzania 11α-hydroksy-pregn-1,4 dien-3,20-dionu
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