Verfahren zur mikrobiologischen Reduktion von Steroiden Die Verwendung von Mikroorganismen zur Re duktion von Oxogruppen und Kohlenstoff-Kohlen- stoff-Doppelbindungen in Steroidverbindungen ist seit längerem bekannt. Gemäss den bis heute gesammelten Erfahrungen mit Hefe und anderen Mikroorganismen, wie Streptomyces, Rhizopus, Curvularia-Arten u. a., ist die Art der eintretenden Reduktion sowohl vom verwendeten Organismus wie auch weitgehend von der Konstitution des eingesetzten Steroids abhängig.
So findet im allgemeinen bei Verwendung von Hefe und andern Mikroorganismen keine Reduktion der 14-3-Oxogruppe statt. Während Androstan-3,17-dion zum 3 ss, l 7ss-diol reduziert wird, findet beim Pregnan- 3,20-dion und Allo-pregnan-3,20-dion überhaupt keine Reduktion statt. Ist in den zuletzt genannten Verbindungen jedoch in 11-Stellung eine Oxogruppe vorhanden, so tritt Reduktion zum 3a-Alkohol ein.
Bei Anwesenheit einer 11-Oxygruppe hängt der Verlauf der Reduktion davon ab, ob die betreffende Pregnan- Verbindung der Normal- oder Alloreihe angehört und ob sich die 11.-Oxygruppe in a- oder 6-Stellung be findet. 17- und/oder 21-Oxygruppen scheinen die Reduktion wiederum zu hindern, während bei Andro- stanverbindungen mit 17-Oxogruppe diese stets zur 17ss-Oxygruppe reduziert wird.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist nun ein neuer Stamm der Actinomyceten, Streptomyces 7994, aufgefunden worden, welcher in d4-3-Ketonen der Androstan- und Pregnanreihe, ihren Nor-, Homo- oder Nor-Homoderivaten die 3-Oxogruppe zur 3,B- Oxygruppe unter Aufhebung der 4,
5-Doppelbindung und Bildung der in 5-Stellung gesättigten Verbindun gen mit Sa-Konfiguration reduziert, wobei andere im Molekül vorhandene reduzierbare Gruppierungen nicht reduziert werden, z. B. Oxogruppen in 17- oder 20-Stellung.
Als Zwischenprodukte der Reduktion treten die 5Ha-3-Ketone auf, welche durch weitere Reduktion mit demselben Organismus zu den 3ss-Alkoholen reduziert werden. Die vorliegende Erfindung liefert also ein Verfahren zur partiellen selektiven Reduktion von z. B. d4-Androsten-3,17-dionen und d4-Pregnen- 3,20-dionen zu den entsprechenden in 5-Stellung ge sättigten 3ss-Oxy-Verbindungen.
Die Ausgangsstoffe können ausser den bereits er wähnten noch weitere Substituenten aufweisen, ins besondere eine freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppe in 11-, 16-, 17-, 18-, 19- und/oder 21-Stellung sowie Halogenatome z. B. in 9- oder 12-Stellung. Es können, wie gesagt, auch die Nor-, Homo- und Nor-Homo-Derivate der genannten d4-3-Oxo-steroide, z.
B. d4-3-Oxo-19-nor-pregnene oder -androstene oder d4-D-Homo-3-Oxo-19-nor- pregnene oder -androstene, als Ausgangsstoffe ver wendet werden. Ferner können weitere Doppelbin dungen vorhanden sein, z. B. in 9,11-; 14,15- und'oder 16,17,Stellung. Als spezifische Ausgangs stoffe seien z.
B. genannt: Cortexon, Progesteron, 16a-Oxy-progesteron, Corticosteron, Cortison, Hydro- cortison und d4-Androsten-3,17-dion.
Bei den Actinomyceten der vorliegenden Erfin dung handelt es sich um einen neuen Stamm von Streptomyces griseus, welcher aus einer bei La-Tour- de-Peilz, Kanton Waadt, gesammeten Bodenprobe iso liert worden ist. Er wird im Institut für spezielle. Botanik der Eidgenössischen Technischen Hochschule in Zürich unter der Nummer 7994 aufbewahrt. Der Organismus zeichnet sich aus durch: 1. Morphologie der Sporen im Elektronenmikroskop: ellipsoidisch, glatt.
2. Farbe des Luftmycels: anfangs kreideweiss oder weissgelb, in ausgereiftem Zustande gelblich-grün- lichgrau. 3. Farbe des Substratmycels: weissgelb-bräunlichgelb- sattgelb, auf Kartoffeln dunkelrotgelb.
4. Farbe des löslichen Pigmentes: auf keinem der untersuchten Nährmedien wurde ein auffallendes lösliches Pigment gebildet.
5. Melaninbildung: Nach der Methode von Ettlinger et a1. [Ettlinger, L., Corbaz, R. und Hütter, R.: Zur Systematik der Actinomyceten 4. Eine Artein teilung der Gattung Streptomyces Waksman et Henrici, Arch. Mikrobiol., <I>31,</I> 326 (1958)] wurde der Stamm auf seine Fähigkeit zur Melaninbildung untersucht; er war chromogen negativ.
6. Morphologie der Sporenketten: Sporenketten in sympodial verzweigten Büscheln mit kurzer Hauptachse; Seitenzweige gerade oder gewellt. Das Wachstum dieses Pilzes ist relativ wenig tem- peraturabhär-gig; sowohl bei 18 als auch bei 40 C entwickelt er sich<B>gut,</B> doch liegt das Optimum zwi schen 25 und 32 C.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Streptomyces-Stammes 7994 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nähr medien 1 bis 5 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. <I>17,</I> 361 (1952) hergestellt.
1. Synthetischer Agar: Wachstum anfangs punkt- förmig bis schleierartig, später runzelig, weissgelb bis bräunlichgelb; Luftmycel staubig, einen feinen Überzug bildend, kreideweiss.
2. Synthetische Lösung: Wachstum als Flocken und Sediment, hellgelb; spärliches Oberflächenwachs tum mit wenig kreideweissem Luftmycel; Substrat hellgelb.
3. Glucose-Agar: Wachstum runzelig, hell bräunlich- gelb; kein Luftmycel.
4. Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum dünn, schleier artig bis runzelig, bräunlichgelb; Luftmycel sam- metig, anfangs kreideweiss bis weissgelb, in ausge reiftem Zustande gelblich-grünlichgrau.
5. Calciummalat-Agar: Wachstum dünn, schleier artig, manchmal nur punktförmig, weissgelb bis hellgelb; Luftmycel nur sehr spärlich.
6. Kartoffeln: Wachstum flechtenartig, dunkelrot gelb; Luftmycel spärlich; Substrat grünlich-raben- schwarz bis bräunlich-pechschwarz.
7. Karotten: Wachstum anfangs dünn, schleierartig, später wenig flechtenartig, weissgelb.
B. Lackmusmilch: Ringwachstum und runzelige Pellikula, graublau bis hellbraun; Peptonisierung, aber keine Koagulation; Lackmus rot.
9. Stärkeplatte: Wachstum dünn, schleierartig, hell gelb bis sattgelb; Luftmycel sammetig, weissgelb; Hydrolyse nach acht Tagen 2 mm.
10. Gelatinestich (18 C): Wachstum spärlich, pustelig, hellbrau; Verflüssigung spärlich und langsam. Anstelle des Streptomyces-Stammes 7994 können Varianten dieser Organismen, wie sie durch Selektio- nierung oder Mutation, insbesondere unter der Ein wirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen, gewonnen werden, verwendet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist somit da durch gekennzeichnet, dass man auf die genannten d4-3-Oxo-steroide Enzyme des Streptomyces-Stammes 7994 einwirken lässt. Man inkubiert dabei die Aus gangsstoffe meistens direkt mit unter aeroben Bedin gungen wachsenden Kulturen des genannten Stammes. Diese werden zweckmässig bewegt, das heisst geschüt telt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Koh lenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebe nenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nähr lösungen brauchbar.
Das praktisch einfachste Verfah ren ist im folgenden geschildert: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Be dingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Die Tem peratur wird vorzugsweise bei 25 bis 32 C gehalten, und unter diesen Bedingungen sind die Kulturen nach 1 bis 3 Tagen voll entwickelt. Man gibt so dann die Ausgangsstoffe unter sterilen Bedingungen, in feiner Dispersion oder Lösung, z. B. in Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan oder Propylenglykol, zu und inkubiert weiter. Nach 8 bis 36 Stunden ist die Reak tion meistens beendet.
Man trennt vom Mycel ab, extrahiert gegebenenfalls das Mycel, z. B. mit Methanol oder Aceton, und gibt den eingedampften Extrakt dem Kulturfiltrat zu; man extrahiert diesen mit einem ge eigneten Lösungsmittel, wie Essigester, Chloroform, Äthylenchlorid oder Methylenchlorid, wäscht den Ex trakt mit verdünnter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser und dampft ihn schliesslich im Va kuum zur Trockne ein.
Aus dem so gewonnenen rohen Reduktionsprodukt können die Verfahrenspro dukte nach üblichen Reinigungsmethoden, wie Kri stallisation, Chromatographie, Verteilungschromato- graphie, Verteilung zwischen miteinander nicht misch baren Lösungmitteln usw., rein erhalten werden. Die Reduktion kann aber auch so durchgeführt werden, dass man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen des Stammes 7994 der Gattung Streptomyces zuerst abtrennt und unter Ausschluss der wachsenden Kulturen verwendet.
Bei kürzerer Inkubationszeit der Ausgangsstoffe mit den genannten Organismen oder den entsprechen den Enzymen können aus den Reduktionsprodukten neben unverändertem Ausgangsmaterial und den in 5-Stellung gesättigten 3f-Alkoholen, die als Zwischen produkte auftretenden, in 5-Stellung gesättigten 5a-3- keto-steroide isoliert werden. In einigen Fällen, wie z.
B. bei der Reduktion von Progesteron und Cor- texon, können durch papierchromatographische Analyse noch weitere niedrigpolare Verbindungen un bekannter Konstitution ermittelt werden. Im Falle des Progesterons konnte dieses Nebenprodukt isoliert und untersucht werden: anhand des IR.-Spektrums enthält es keine Hydroxylgruppe, jedoch eine nicht konju gierte Carbonylgruppe.
Das Verfahren der vorliegenden Anmeldung be deutet für die Synthese verschiedener wichtiger physio- logisch wirksamer Steroide einen grossen Fortschritt, z. B. in Anbetracht dessen, dass bei der partiellen Reduktion von z. B. d4-3,17-Dioxo-androsten bzw. J-I-3,20-Dioxo-pregnen zu den 5a-3ss-oxy-steroiden mit chemischen Mitteln andere im Molekül vorhan dene reduzierbare Gruppierungen, z. B. die 20-Keto- gruppe, unter Umständen geschützt werden müssen und dass diese chemischen Hydrierungen nicht immer stereospezifisch verlaufen.
So lässt sich nunmehr der kürzlich bekanntgewordene natriumausscheidende Faktor aus Nebennieren, das Allopregnan-3ss,16a- 6o diol-20-on, aus 16a-Oxy-progesteron in einer einzigen Reduktionsstufe gemäss dem vorliegenden Verfahren herstellen:
EMI0003.0011
<I>Beispiel 1</I> Man bereitet 4 Liter einer Nährlösung, die auf 1 Liter Leitungswasser folgende Zusätze enthält: 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, 5 g Na triumchlorid und 10 g Calciumcarbonat, stellt sie auf pH 7,5 ein, bringt sie in ein Schüttelgefäss und sterili siert sie 30 Minuten bei 118 C.
Dann beimpft man sie mit einer Kultur von Streptomyces sp. A 7994 und lässt sie bei 27 C schütteln. Nach drei Tagen gibt man zu der nun gut entwickelten Kultur unter sterilen Be dingungen eine Lösung von 1 g Cortexon in 20 cm3 Aceton und lässt weitere 36 Stunden unter den glei chen Bedingungen schütteln. Nun wird das Mycel ab getrennt und zweimal mit warmem Aceton extrahiert. Die vereinigten Acetonauszüge konzentriert man im Vakuum und gibt das Konzentrat zum Kulturfiltrat. Hierauf wird das Kulturfiltrat dreimal mit je 500 cm 3 Essigester ausgezogen.
Die Extrakte wäscht man drei mal mit je 100 cm-' 2o/o,iger Natriumhydrogencar- bonatlösung und Wasser, vereinigt sie, trocknet sie über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein. Der Rückstand wird in 80 cm- Methanol gelöst, wor auf man 100 cm3 Petroläther und 20 cm3 Wasser zugibt. Die methanolisch-wässrige Phase und die Petrolätherphase werden separat im Vakuum einge dampft und papierchromatographisch untersucht.
Die letztere enthält keine Steroide und nur ölige Verun reinigungen, während die erstere zur Hauptsache 3ss,21 Dioxy-allopregnan-20-on enthält. Dieses wird mittels Chromatographie an 30 g Silicagel gereinigt, wobei folgende Lösungsmittel verwendet werden: Chloro form, Gemische von Chloroform und Aceton mit steigendem Aceton-Gehalt und schliesslich Aceton. Mit einem Gemisch von Chloroform-Aceton (99 : 1) wird die Hauptmenge der Substanz, das 3ss,21-Dioxy- allopregnan-20-on, von der Säule eluiert. Es wird aus einem Aceton - Petroläther - Gemisch kristallisiert, F. = 168 bis 174 C.
<I>Beispiel 2</I> Wie im Beispiel 1 beschrieben, gibt man zu 4 Liter einer Kultur von Streptomyces sp. A 7994 1 g Cor- texon. Nach achtstündigem Schütteln bei 27 ' C arbei tet man den Ansatz gemäss den Angaben im Beispiel 1 auf.
Die papierchromatographische Untersuchung des Rohproduktes zeigt, dass es neben Cortexon (1I) und neben einem im Papierchromatogramm unterhalb Cortexon stehenden Nebenprodukt zur Hauptsache 21 Oxy-allopregnan-3,20-dion (I) und 3ss,21-Dioxy-allo- pregnan-20-on enthält (11I). Durch Chromatographie an 30 g Silicagel unter Verwendung der im Beispiel 1 angegebenen Lösungsmittel (100-cm3-Fraktionen) können die drei Substanzen wie folgt getrennt werden:
EMI0003.0053
Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> enthält
<tb> 1 <SEP> Chloroform <SEP> Verunreinigungen
<tb> 2-3 <SEP> <SEP> I
<tb> 4 <SEP> <SEP> Gemisch <SEP> von <SEP> I <SEP> und <SEP> I1
<tb> 5-6 <SEP> <SEP> II
<tb> 7-8 <SEP> Chloroform-Aceton <SEP> <B>(99:</B> <SEP> 1) <SEP> III Das 21-Oxy-allopregnan-3,20-dion wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch kristallisiert, F. = 162 bis 164 C.
<I>Beispiel 3</I> Zu einer gemäss den Angaben im Beispiel 1 be reiteten 4-Liter-Kultur von Streptomyces sp. A 7994 gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Progesteron in 20 cm3 Aceton und schüttelt das Kulturgefäss 8 Stunden lang bei 27 C. Dann arbeitet man den Ansatz gemäss Beispiel 1 auf und verteilt den Rohextrakt wie beschrieben zwischen Petroläther und 80P/o@igem wässrigem Methanol.
Nach dem Ein dampfen werden die Rückstände der Petroläther- und der Methanol-Phase papierchromatographisch unter- sucht. Erstere enthält neben etwas Progesteron eine unbekannte Substanz, die im@ Papierchromatogramm unterhalb Progesteron steht. In der Methanol-Phase können Progesteron, die soeben erwähnte unbekannte Substanz sowie Allopregnan-3,20-dion und 3,B-Oxy- allopregnan-20-on nachgewiesen werden.
Der Rück stand der Methanolphase (0,958) wird in wenig Me- thylenchlorid gelöst und auf eine Säule von 30 g Sili- cagel gebracht. Die Säule wird mit Methylenehlorid, Gemischen von Methylenchlorid und Aceton von steigendem Acetongehalt und mit Aceton eluiert. Die anfallenden Fraktionen (je 25 cm3 Lösungsmittel) werden separat eingedampft und papierchromato- graphisch untersucht.
Die ersten drei Fraktionen (Methylenchlorid) enthalten die erwähnte unbekannte Substanz in einheitlicher Form. Sie wird aus Aceton kristallisiert und schmilzt bei 149 bis 150 C. Sie zeigt keine Absorption bei 240 m,u. Im Infrarotspek- trum sind Banden u. a. bei 5,87 iz, 7,24,u, <B>7,3811</B> 8,48<I>u,</I> 8,82,u, 9,15 ,lz, 9.53 /z und 11,50 ,cz sichtbar.
Aus den Fraktionen 5 bis 8 (Methylenchlorid) kann Allopregnan-3,20-dion vom Smp. 204 bis 206 C und aus den Fraktionen 17 bis 18 (Methylenchlorid) und 19 bis 22 (Methylenchlorid-Aceton 99 :l) 3fl'-Oxy- allopregnan-20-on vom Smp. 192 bis 195 C isoliert werden.
<I>Beispiel 4</I> Man beschickt acht Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fassungsvermögen mit je 100 cm?, der im Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung und sterilisiert sie. Dann beimpft man sie mit einer Kultur von Streptomyces sp. A 7994 und lässt sie 3 Tage bei 28 C schütteln.
Zu den gut ausgebildeten Kulturen gibt man unter sterilen Bedingungen Lösungen von je 30 mg der folgenden Steroide in 1,5 cm3 Aceton: Pro gesteron, 16a-Oxy-progesteron, Corticosteron, 17a- Oxy-cortexon (Reichsteins Substanz S), Cortison, Hydrocortison und 44-Androsten-3,17-dion. Man lässt die Kulturen 14 Stunden lang weiter schütteln und extrahiert sie dann einzeln mit je 2 30-cm3-Por- tionen Essigester.
Die von den einzelnen Kulturen er haltenen Extrakte werden separat eingedampft und papierchromatographisch untersucht. Sie enthalten alle neben wenig Ausgangsmaterial ein Gemisch der entsprechenden 3-Keto- und 3ss-Oxy-5a-pregnane respektive 3-Keto- und 3,B-Oxy-5a-androstane.
Process for the microbiological reduction of steroids The use of microorganisms for the reduction of oxo groups and carbon-carbon double bonds in steroid compounds has been known for a long time. According to the experience with yeast and other microorganisms, such as Streptomyces, Rhizopus, Curvularia species, etc. a., the type of reduction that occurs depends both on the organism used and largely on the constitution of the steroid used.
In general, when yeast and other microorganisms are used, there is no reduction in the 14-3-oxo group. While androstane-3,17-dione is reduced to 3 ss, l 7ss-diol, there is no reduction at all with pregnane-3,20-dione and allo-pregnane-3,20-dione. However, if an oxo group is present in the 11-position in the last-mentioned compounds, reduction to the 3a-alcohol takes place.
If an 11-oxy group is present, the course of the reduction depends on whether the pregnant compound in question belongs to the normal or allo series and whether the 11th-oxy group is in the a- or 6-position. 17- and / or 21-oxy groups again seem to prevent the reduction, while in the case of androstane compounds with 17-oxo group this is always reduced to the 17ss-oxy group.
According to the present invention, a new strain of the actinomycetes, Streptomyces 7994, has now been found, which in d4-3-ketones of the androstane and pregnane series, their nor-, homo- or nor-homo derivatives, the 3-oxo group to 3, B- Oxy group with cancellation of the 4,
5 double bond and formation of the compounds saturated in the 5-position with Sa configuration reduced, other reducible groups present in the molecule are not reduced, e.g. B. oxo groups in the 17 or 20 position.
The 5Ha-3-ketones occur as intermediate products of the reduction, which are reduced to the 3ss-alcohols by further reduction with the same organism. The present invention thus provides a method for the partial selective reduction of e.g. B. d4-androstene-3,17-dione and d4-pregnene-3,20-dione to the corresponding in the 5-position ge saturated 3ss-oxy compounds.
The starting materials can have other substituents in addition to those already mentioned, in particular a free or functionally modified oxy or oxo group in the 11-, 16-, 17-, 18-, 19- and / or 21-position and halogen atoms z. B. in 9 or 12 position. As already mentioned, the nor-, homo- and nor-homo derivatives of said d4-3-oxo-steroids, eg.
B. d4-3-oxo-19-nor-pregnene or -androstene or d4-D-homo-3-oxo-19-nor- pregnene or -androstene can be used as starting materials. Furthermore, other Doppelbin connections may be present, for. B. in 9,11-; 14,15- and 'or 16,17, position. As specific starting materials are z.
B. named: cortexone, progesterone, 16a-oxy-progesterone, corticosterone, cortisone, hydrocortisone and d4-androstene-3,17-dione.
The actinomycetes of the present invention are a new strain of Streptomyces griseus, which has been isolated from a soil sample collected at La-Tour-de-Peilz, Canton of Vaud. He is in the institute for special. Botany at the Swiss Federal Institute of Technology in Zurich under the number 7994. The organism is characterized by: 1. Morphology of the spores in the electron microscope: ellipsoidal, smooth.
2. Color of the air mycelium: initially chalk-white or white-yellow, when fully developed, yellowish-greenish-gray. 3. Color of the substrate mycelium: white-yellow-brownish-yellow-rich yellow, on potatoes dark red-yellow.
4. Color of the soluble pigment: a noticeable soluble pigment was not formed on any of the nutrient media examined.
5. Melanin formation: According to the method of Ettlinger et al. [Ettlinger, L., Corbaz, R. and Hütter, R .: On the systematics of the actinomycetes 4. A species division of the genus Streptomyces Waksman et Henrici, Arch. Mikrobiol., <I> 31, </I> 326 (1958) ] the strain was examined for its ability to produce melanin; it was chromogen negative.
6. Morphology of the spore chains: spore chains in sympodial branched tufts with a short main axis; Side branches straight or wavy. The growth of this fungus is relatively little dependent on temperature; It develops <B> well at both 18 and 40 C, </B> but the optimum is between 25 and 32 C.
For further characterization, the growth of the Streptomyces strain 7994 on various nutrient media is described below. The nutrient media 1 to 5 were according to W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. <I> 17, </I> 361 (1952).
1. Synthetic agar: growth initially point-like to veil-like, later wrinkled, white-yellow to brownish-yellow; Air mycelium dusty, forming a fine coating, chalk-white.
2. Synthetic solution: growth as flakes and sediment, light yellow; sparse surface growth with little chalk-white aerial mycelium; Substrate light yellow.
3. Glucose agar: growth wrinkled, light brownish-yellow; no aerial mycelium.
4. Glucose asparagine agar: growth thin, veil-like to wrinkled, brownish-yellow; Aerial mycelium velvety, initially chalk-white to white-yellow, when fully ripe, yellowish-greenish-gray.
5. Calcium malate agar: growth thin, veil-like, sometimes only punctiform, white-yellow to light yellow; Aerial mycelium only very sparse.
6. Potatoes: growth like lichen, dark red yellow; Aerial mycelium scanty; Substrate greenish-raven-black to brownish-pitch black.
7. Carrots: initially thin, veil-like, later a little lichen-like, white-yellow.
B. Litmus milk: ring growth and wrinkled pellicle, gray-blue to light brown; Peptonization but no coagulation; Litmus red.
9. Starch plate: growth thin, veil-like, light yellow to deep yellow; Aerial mycelium velvety, white-yellow; Hydrolysis after eight days 2 mm.
10. Gelatin tint (18 C): growth sparse, pustular, light brown; Liquefaction sparse and slow. Instead of the Streptomyces strain 7994, it is possible to use variants of these organisms, such as are obtained by selection or mutation, in particular under the action of ultraviolet or X-rays or of nitrogen mustard oils.
The method according to the invention is thus characterized in that the d4-3-oxosteroid enzymes mentioned of the Streptomyces strain 7994 are allowed to act. The starting materials are usually incubated directly with cultures of the said strain growing under aerobic conditions. These are expediently moved, that is, shaken or stirred, and contain assimilable carbon, in particular carbohydrates, and, if necessary, growth substances, for example corn steep liquor or wort, and inorganic salts. There are therefore natural, synthetic or semi-synthetic nutrient solutions useful.
The simplest method in practice is described below: The organisms are grown in equipment and under similar conditions, as are known in the manufacture of antibiotics as so-called deep-tank processes. The temperature is preferably maintained at 25 to 32 C, and under these conditions the cultures are fully developed after 1 to 3 days. The starting materials are then given under sterile conditions, in a fine dispersion or solution, e.g. B. in methanol, ethanol, acetone, dioxane or propylene glycol, and continue to incubate. After 8 to 36 hours, the reaction is usually over.
It is separated from the mycelium, optionally extracted the mycelium, z. B. with methanol or acetone, and gives the evaporated extract to the culture filtrate; this is extracted with a suitable solvent such as ethyl acetate, chloroform, ethylene chloride or methylene chloride, the extract is washed with dilute sodium hydrogen carbonate solution and with water and finally evaporated to dryness in a vacuum.
The process products can be obtained in pure form from the crude reduction product obtained in this way by customary purification methods, such as crystallization, chromatography, partition chromatography, partitioning between immiscible solvents, etc., etc. However, the reduction can also be carried out in such a way that the active enzymes are first separated off from corresponding aerobic cultures of the strain 7994 of the genus Streptomyces and used to the exclusion of the growing cultures.
In the case of a shorter incubation time of the starting materials with the organisms mentioned or the corresponding enzymes, the reduction products, in addition to unchanged starting material and the 3f-alcohols saturated in the 5-position, the 5a-3-keto-steroids which occur as intermediate products and which are saturated in the 5-position to be isolated. In some cases, such as
B. in the reduction of progesterone and cortexon, other low-polar compounds of unknown constitution can be determined by paper chromatographic analysis. In the case of progesterone, this by-product could be isolated and investigated: on the basis of the IR spectrum, it does not contain any hydroxyl group, but a non-conjugated carbonyl group.
The process of the present application signifies a great advance for the synthesis of various important physiologically active steroids, eg. B. in view of the fact that the partial reduction of z. B. d4-3,17-dioxo-androsten or J-I-3,20-Dioxo-pregnen to the 5a-3ss-oxy-steroids with chemical agents other in the molecule IN ANY reducible groups, z. B. the 20-keto group, may have to be protected and that these chemical hydrogenations are not always stereospecific.
The sodium excreting factor that has recently become known from adrenal glands, allopregnan-3ss, 16a-6o diol-20-one, can now be produced from 16a-oxy-progesterone in a single reduction step according to the present process:
EMI0003.0011
<I> Example 1 </I> 4 liters of a nutrient solution are prepared which contains the following additives per 1 liter of tap water: 10 g of raw glucose, 5 g of peptone, 3 g of meat extract, 5 g of sodium chloride and 10 g of calcium carbonate, and the pH is adjusted 7.5, put it in a shaker and sterilize it for 30 minutes at 118 C.
They are then inoculated with a culture of Streptomyces sp. A 7994 and let it shake at 27 C. After three days, a solution of 1 g of cortexone in 20 cm3 of acetone is added to the now well-developed culture under sterile conditions, and the mixture is shaken for a further 36 hours under the same conditions. The mycelium is then separated off and extracted twice with warm acetone. The combined acetone extracts are concentrated in vacuo and the concentrate is added to the culture filtrate. The culture filtrate is then extracted three times with 500 cm 3 of ethyl acetate each time.
The extracts are washed three times with 100 cm 2% sodium hydrogen carbonate solution and water, combined, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo. The residue is dissolved in 80 cm of methanol, whereupon 100 cm3 of petroleum ether and 20 cm3 of water are added. The methanolic-aqueous phase and the petroleum ether phase are evaporated separately in vacuo and examined by paper chromatography.
The latter contains no steroids and only oily impurities, while the former contains mainly 3ss, 21 dioxy-allopregnan-20-one. This is purified by chromatography on 30 g of silica gel, the following solvents being used: chloroform, mixtures of chloroform and acetone with increasing acetone content and finally acetone. The bulk of the substance, the 3ss, 21-dioxyallopregnan-20-one, is eluted from the column with a mixture of chloroform-acetone (99: 1). It is crystallized from an acetone - petroleum ether mixture, F. = 168 to 174 C.
<I> Example 2 </I> As described in Example 1, 4 liters of a culture of Streptomyces sp. A 7994 1 g of cortexon. After eight hours of shaking at 27 ° C, the batch is worked up as described in Example 1.
The paper chromatographic examination of the crude product shows that, in addition to cortexon (1I) and a by-product below the cortexon in the paper chromatogram, it mainly contains 21 oxy-allopregnane-3,20-dione (I) and 3ss, 21-dioxy-allo-pregnane-20 -on contains (11I). The three substances can be separated as follows by chromatography on 30 g of silica gel using the solvents specified in Example 1 (100 cm3 fractions):
EMI0003.0053
Fraction <SEP> contains solvent <SEP>
<tb> 1 <SEP> chloroform <SEP> impurities
<tb> 2-3 <SEP> <SEP> I
<tb> 4 <SEP> <SEP> Mixture <SEP> of <SEP> I <SEP> and <SEP> I1
<tb> 5-6 <SEP> <SEP> II
<tb> 7-8 <SEP> chloroform-acetone <SEP> <B> (99: </B> <SEP> 1) <SEP> III The 21-oxy-allopregnan-3,20-dione is made from an acetone - Petroleum ether mixture crystallized, F. = 162 to 164 C.
<I> Example 3 </I> For a 4 liter culture of Streptomyces sp. A 7994 is given a solution of 1 g of progesterone in 20 cm3 of acetone under sterile conditions and the culture vessel is shaken for 8 hours at 27 ° C. Then the batch is worked up according to Example 1 and the crude extract is distributed as described between petroleum ether and 80P / o @ aqueous methanol.
After the evaporation, the residues of the petroleum ether and the methanol phase are examined by paper chromatography. In addition to some progesterone, the former contains an unknown substance that is shown below progesterone in the @ paper chromatogram. Progesterone, the unknown substance just mentioned, as well as allopregnan-3,20-dione and 3, B-oxyallopregnan-20-one can be detected in the methanol phase.
The residue of the methanol phase (0.958) is dissolved in a little methylene chloride and placed on a column of 30 g of silica gel. The column is eluted with methylene chloride, mixtures of methylene chloride and acetone with increasing acetone content and with acetone. The resulting fractions (25 cm3 of solvent each) are evaporated separately and examined using paper chromatography.
The first three fractions (methylene chloride) contain the aforementioned unknown substance in a uniform form. It is crystallized from acetone and melts at 149 to 150 C. It shows no absorption at 240 m, u. In the infrared spectrum there are bands u. a. at 5.87 iz, 7.24, u, <B> 7.3811 </B> 8.48 <I> u, </I> 8.82, u, 9.15, lz, 9.53 / z and 11.50, cz visible.
From fractions 5 to 8 (methylene chloride) allopregnan-3,20-dione with a melting point of 204 to 206 ° C. and from fractions 17 to 18 (methylene chloride) and 19 to 22 (methylene chloride-acetone 99: l) 3fl'-oxy - Allopregnan-20-one with a melting point of 192 to 195 ° C. can be isolated.
<I> Example 4 </I> Eight Erlenmeyer flasks with a capacity of 500 cm3, each with 100 cm?, Of the nutrient solution described in Example 1 are charged and they are sterilized. They are then inoculated with a culture of Streptomyces sp. A 7994 and let it shake at 28 C for 3 days.
Solutions of 30 mg each of the following steroids in 1.5 cm3 acetone are added to the well-developed cultures under sterile conditions: Pro gesterone, 16a-oxy-progesterone, corticosterone, 17a-oxy-cortexon (Reichstein's substance S), cortisone, hydrocortisone and 44-androstene-3,17-dione. The cultures are left to shake for another 14 hours and then extracted individually with 2 30 cm3 portions of ethyl acetate.
The extracts obtained from the individual cultures are evaporated separately and examined by paper chromatography. In addition to a small amount of starting material, they all contain a mixture of the corresponding 3-keto- and 3-p-oxy-5a-pregnanes or 3-keto- and 3, B-oxy-5a-androstanes.