DE1493095C

DE1493095C - Verfahren zur Herstellung von 3 Keto Delta hoch 1,4 steroiden der Androstan oder Pregnanreihe

Info

Publication number: DE1493095C
Authority: DE
Inventors: Franco Modelh Renato Mailand Marini (Italien)
Original assignee: Societa Farmaceutici Itaha, Mai land (Italien)
Publication date: 1971-02-18

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 3-Keto- !'^-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe. Im besonderen ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein mikrobiologisches Verfahren, mittels welchem unter Verwendung des neuen Mikroorganismus Nocardia lucida n. sp. eine Doppelbindung in Stellung 1 eines 3-Ketol⁴-steroids der Androstan- und Pregnanreihe eingeführt werden kann. Nocardia lucida n. sp. wurde beim Institute of Microbiology of the Rutgers University (U. S. A.) mit der Indexnummer I. M. 3890 und bei dem Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew (Surrey, England), mit der Indexnummer I.M.I. 113.416 hinterlegt.
. Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen der Gattung Nocardia fähig sind, eine Doppelbindung in Stellung 1 in das Steroidmolekül einzuführen (britische Patentschrift 874 188, deutsche Patentschrift 1 093 792, französische Patentschrift 1 270 506, indische Patentschrift 62 483). Daraus kann man jedoch nicht schließen, daß alle Mikroorganismen der obenerwähnten Gattung die besagte Dehydrierung bewirken, da bewiesen wurde, daß die Stämme von Nocardia rugosa, N. Brasiliensis, N. caprae und N. frabozae die Doppelbindung in Stellung 1 nicht einzuführen vermögen.

Der neue, im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus, der auch mit dem Namen Nocardia lucida n. sp. bezeichnet wird, gehört der Gattung Nocardia Trevisan an und erzeugt solche Enzyme, die eine Dehydrierung in Stellung 1 der 3-Keto-/l⁴-steroide der Androstan- oder Pregnanreihe bewirken, wobei die entsprechenden ,!'-^-Steroide mit hohen Umwandlungsausbeuten erhalten werden.

Der neue Mikroorganismus weist außerdem die überraschende Eigenschaft auf, daß er als Kohlenstoffquelle außer den üblichen Kohlehydraten auch Mischungen von Kohlenwasserstoffen mit vorzugsweise 12 bis 18 Kohlenstoffatomen verwerten kann.

Mikroskopisches Aussehen

Der neue Mikroorganismus N. lucida bildet auf

ίο Kartoffel-Glukose-Agar anfangs ein Mycel mit sehr langen (25 bis 30 μ · 1,0 bis 1,5 μ), oft verkrümmten, wenig verzweigten, unseptierten Hyphen. Nach etwa 24 Stunden werden die Hyphen kürzer und septiert, und die ersten Fragmente erscheinen als bakteroidartige Elemente von etwa 3 · 0,8 μ Durchmesser.

Eine vollständige Fragmentierung in kokkoidartige Elemente von etwa 1 μ Durchmesser wird erst um die 40. Stunde nachgewiesen. Solche kokkoidartigen Elemente erscheinen häufig charakteristisch angeordnet.

In keinem Nährboden konnte die Bildung von Luftmycel nachgewiesen werden. Das Mycel ist gram-positiv und nicht widerstandsfähig gegen Säure. Der Mikroorganismus wächst gut bei einer Temperatur von 28 bis 30⁰C und erzeugt keine löslichen Pigmente auf den üblichen Nährböden.

Makroskopisches Aussehen

In der Tabelle sind die bei den angegebenen Kulturböden beobachteten Eigenschaften angeführt, wobei die' Beobachtungen nach einer 7tägigen Bebrütung bei 28 bis 30⁰C durchgeführt wurden.

Kulturnährboden	Wachstum	spärlich	Farbe	Bemerkungen
Czapek-Agar¹)	reichlich, glatte,	von weißlich bis hellrosa
Bennet-Agar¹)	glänzende Patina mit	Lachsrosa
	sauberem Rand
	kein Wachstum	. <
Glycin-glycerin-Agar¹)	sehr spärlich
Glycerin-Pepton-		Rosa, sehr hell
Kartoffel-Agar¹)	reichlich, glatte,
Emerson-Agar	glänzende Patina	Lachsrosa
	kein Wachstum
Stärke-Agar und
Pridham-Salze²)	reichlich, glatte, ".
GIukose-Agar	glänzende Patina	Lachsrosa
Hefeextrakt¹)	reichlich, glatte,
Glukose-Kartoffel-Agar³)	glänzende Patina	Lachsrosa
	spärlich
Nutrient-Agar¹)	mäßig	Blaßrosa
Fleischextrakt-Stärke- Pentnn-Aßfar¹ )	mäßig	sehr helles Rosa	keine Stärkehydrolyse
*X \* LJ LKJ km* xlgUl I** Gelatine-Agar¹)	gut, dunkle Brühe, rosa	sehr helles Rosa	keine Gelatinverflüssigung
Hefebrühe¹)	Niederschlag auf dem	Hellrosa
	Boden
	spärlich
Milch		farblos	die Milch wird alkalisch,
		keine Gerinnung

') Wa k s m a n, S. Α., »The Actinomyces«, Vol. II, S. 328 bis .134.

^z) P r i d h a m, T. C, »Antibiotics Annual«, 1956/1957, S. 947 bis 953.

³J Glukose-Kartoffel-Agar: 200 g geschälte Kartoffeln, 20 g Glukose, 20 g Agar, destilliertes Wasser, 1000 ml bei pH 7,2.

Biochemische Eigenschaften , ^.

Stärke: keine Hydrolyse; a)

Gelatine: keine Verflüssigung; b) Nitrate: Reduktion zu Nitriten; gute Verwertung

der Nitrate für das Wachstum; 5 c)

Milch: die Milch wird alkalisch; keine Peptoni- d)

sierung, keine Gerinnung; . 7. N.

Melanin: kaum nachweisbare Bildung; a) Indol: keine Bildung;

Tyrosin: Tyrosin wird abgebaut; io b)

Erzeugung von H₂S: positive Bleiacetatreaktion; c)

Säureerzeugung aus Kohlehydraten: positiv aus d)

Glukose, Fruktose, Sorbit, Glycerin und Mannit, 8. N.

negativ aus Xylose, Maltose, Laktose, Saccharose, a)

Arabinose und Inosit. 15 b)

Die oben angegebenen Kohlenwasserstoffe können c)

zur Züchtung gut verwendet werden. Phenol wird 9. N.

nicht verwertet. a)

Identifizierung des Stammes , .

Die Beschreibung des untersuchten Mikroorganis- c)

mus entspricht der Gattung Nocardia Trevisan d)

(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology— 10. N.

Seventh Edition 1957, S. 713 bis 715). a)

Aus dem analytischen Schlüssel der Nocardia- 25 b) Gattung von Waksman und H e η r i c i (Wa k s-

m a n, S.A., »The Actinomycetes«, Vol. II, 1961) . c)

ergibt sich für den untersuchten Mikroorganismus d)

eine der Nocardia rubra nahestehende systematische 11. N.

Lage. Dennoch unterscheidet sich Nocardia lucida 3° a) von dem Stamm Nocardia rubra durch verschiedene

Eigenschaften. Im nachfolgenden werden die bei b)

Vergleich der Eigenschaften von Nocardia lucida c) n. sp. mit denjenigen der bekannten Arten erhaltenen

Angaben angeführt. 35

Der neue Stamm Nocardia lucida unterscheidet d)

sich von: e)

1. Nocardia rubra:

a) weil er kein Mycel mit matt runzeliger Patina 12. N. von lebhafter roter Farbe bildet, 4° a)

b) weil er Hyphen länger als 10 bis 15 μ bildet,

c) weil er Säuren aus Sorbit bildet. b)

2. N. opaca: c)

a) weil das Mycel auf Glycerin-Kartoffel-Agar d) nicht trocken, rauh, gefaltet und lederfarbig ist, 45 e)

b) weil er auf Kartoffel-Agar keine Büschel von
Lufthyphen bildet, 13. N.

c) weil er Phenol nicht verwertet, a)

d) weil er viel längere Hyphen (bis 25 bis 30 μ) . b) bildet. 50 c)

3. N. polychromogenes: d)

a) weil er kein weißliches Luftmycel bildet,

b) weil er keine 70 bis 100 μ langen, sehr ver- . 14. N. zweigten Fäden bildet, a)

c) weil er die Stärke nicht hydrolysiert. 55 b)

4. N. globerula:

a) weil er keine Fäden 1 · 2 bis 9 μ bildet, c)

b) weil das Mycel nicht orange oder braunorange d) gefärbt ist, 15. N.

c) weil er die Nitrate reduziert. 6° a)

5. N. coeliaca: · b)

a) weil er keine kurzen Stäbchen von 0,8 · 5 μ

bildet, c)

b) weil er auf Glycerin-Kartoffel-Agar kein trok- 16. N. kenes gefaltetes Mycel mit Orangefarbe bildet, ⁶5 a)

c) weil er die Nitrate reduziert,

d) weil er Säuren aus Glukose und Glycerin

bildet. b)

blackwellii:

weil er kein weißes Luftmycel bildet,
weil er keine farblosen Kolonien auf Kartoffel-Agar bildet,

weil er Säuren aus Mannit und Sorbit bildet, weil er die Nitrate reduziert,
asteroides:

weil er kein Mycel von gelber oder oranger Farbe bildet,

weil er kein weißes Luftmycel bildet,
weil er Säuren aus Mannit bildet,
weil er die Kristalle des Tyrosins abbaut,
leishmanii:

weil er kein Luftmycel bildet,
weil er die Milch nicht koaguliert,
weil er säurefest ist.
formica:

weil sich die Hyphen des Mycels in kokkoidartigen Formen fragmentieren,
weil er kein Luftmycel bildet,
weil er kein braunes lösliches Pigment bildet, weil er Paraffin verwertet,
gardneri:

weil er Gelatine nicht verflüssigt,
weil er Säuren aus Glukose oder Mannit bildet,

weil er kein cremefarbiges Mycel aufweist,
weil er kein Luftmycel bildet,
crythropolis:

weil er Hyphen langer als 11 μ (bis 25 bis 30 μ) aufweist,

weil er kokkoidartige Elemente bildet,
weil er kein trockenes, runzeliges, orangefarbiges Mycel auf Glycerin-Kartoffel-Agar bildet,

weil er Nitrate zu Nitriten reduziert,
weil er Säuren aus Glukose und Glycerin bildet,
rugosa:

weil er kein Mycel mit dicker, gefalteter, cremefarbiger Schicht aufweist,
weil er Milch nicht koaguliert,
weil er Gelatine nicht verflüssigt,
weil er Nitrate reduziert,
weil er keine Säuren aus Arabinose bildet und Säuren aus Sorbitol produziert,
brasiliensis:

weil er kein lederfarbiges Luftmycel bildet, weil er Gelatine nicht verflüssigt,
weil er keine Säuren aus Inosit bildet,
weil er kein gefaltetes, gelbfarbiges Mycel auf Glukose-Hefeextrakt-Agar bildet,
caprae:

weil er kein Luftmycel bildet,
weil er keine braunen löslichen Substanzen bildet,

weil er Milch nicht koaguliert,
weil er Paraffin verwertet,
petroleophila:

weil er kein weißes Luftmycel bildet,
weil er keine gelbweißlichen Kolonien auf Pepton-Fleischextrakt-Agar bildet,
weil er auf Kartoffeln wächst, corallina:

weil er auf Glycerin-Kartoffel-Agar kein gehobenes, trockenes Mycel mit gelbbraunen oder korallenroten Falten bildet, weil er Hyphen langer als 10. μ (bis 25 bis 30 μ) bildet,

c) weil er Phenol nicht verwertet,

d) weil er keine rosa Schicht auf der Milchoberfläche bildet,

e) weil er Säuren aus Glukose bildet.
17. N. salmonicolor:

a) weil er auf Pepton-Fleischextrakt-Agar kein zusammengefaltetes, gelbes, in orangerote Farbe übergehendes Mycel aufweist,

b) weil er Säuren aus Glukose und Glycerin bildet,

c) weil er auf Kartoffeln kein gehobenes, warziges, brüchiges, glänzendes, lederfarbiges Mycel, dessen Farbe dann in orange und blutrote Farbe übergeht, bildet.

Daraus kann geschlossen werden, daß der untersuchte Mikroorganismus von den bisher bekannten Arten verschieden ist, und deshalb wurde ihm der Name Nocardia lucida n. sp. gegeben.

Der Mikroorganismus N. lucida kann durch Gefriertrocknung aufbewahrt werden, wobei Milch oder Milchserum als Aufschlämmungsmittel verwendet werden. Er kann auch durch aufeinanderfolgende Züchtung auf Glukose-Kartoffel-Agar aufbewahrt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 3-Keto- I¹ ^-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe durch Bebrütung eines entsprechenden 3-Keto- l⁴-steroids mit einer Kultur der Gattung Nocardia unter submersen und aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff-, Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bebrütung mit einer Kultur von Nocardia lucida n. sp. durchgeführt wird. Darauf wird das resultierende 3-Keto-I¹ "^-steroid in bekannter Weise extrahiert.

Als Kohlenstoffquelle können Stärke, Dextrin, Melasse. Saccharose, Glukose, Maltose, Glycerin, Pflanzenöle, Getreide- und Hülsenfrüchtemehl, Getreideweiche und andere hierfür übliche Substanzen verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen außer einigen der obenerwähnten stickstoffhaltigen Substanzen auch Kasein, Ammoniumsalze, Peptone, Fleisch- und Fischmehl oder andere für diesen Zweck üblicherweise verwendete Substanzen in Frage. Die anorganischen Salze können Sulfate, Phosphate, . Chloride oder Nitrate von Natrium, Kalium, Magnesium, Eisen oder Kobalt sowie Calciumkarbonat sein. Die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen, wie »Tween 80« (eingetragene Schutzmarke für PoIyoxyäthylen-sorbitan-monooleat), ist ebenfalls nützlich.

Es wurde außerdem überraschenderweise gefunden, daß die obenerwähnten Kohlenstoffquellen vollständig durch rohe Gasöl-Paraffin-Mischungen ersetzt werden können. Der Mikroorganismus verwendet vorzugsweise Mischungen von Kohlenwasserstoffen, die 12 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten.

Der Mikroorganismus wird unter submersen und aeroben Bedingungen in Drehkolben oder in Fermentern bei einer Temperatur zwischen 24 und 34 C, vorzugsweise bei 30^cC, während einer Zeit von 30 bis 50 Stunden kultiviert. Der pH-Wert des Nährbodens muß zwischen 7 und 8 liegen, vorzugsweise zwischen 7,5 und 7,6. Während der Gärung bleibt der pH-Wert praktisch beständig.

Das Ausgangssteroid kann der Mikroorganismenkultur entweder in fester Form oder in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Aceton, Dimethylformamid oder deren Analogen, gelöst zugesetzt werden. Die Fermentierung wird unter den gleichen Bedingungen während 20 bis 50 Stunden ausgeführt.

Die Umwandlung des 3-Keto-. l⁴-steroids in das entsprechende 3-Keto-. I¹ -⁴-steroid wird durch Dünnschichtchromatographie festgestellt (vgl. Egon Stahl, Pharmac. Weekblad, 92, 1957, S. 829; Chemiker Zeitung, 82, 1958, S. 323; Van Dam und Mitarb., J. Chromatography, 4, 1960, S. 26). Die Extraktion

ίο kann nach bekannten Verfahren ausgeführt werden, wobei die Gärungsbrühe mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Chloroform, Methylenchlorid, Trichloräthylen und deren Analogen, ausgeschüttelt wird.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1
l^lj*-Pregnadien-17«,21-diol-3,l 1,20-trion

Eine 3 Tage alte Kultur von N. lucida auf Kartoffel-Glukose-Agar gezüchtet wird benutzt, um zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben, die je 50 ml des folgenden Nährbodens enthalten, zu beimpfen:

KCl Ig

NaNO₃ 6 g

Wasserfreies MgSO₄ 0,3 g

Ca(H₂PO₄J₂ · H₂O 4,0g

FeSO₄ ■ 7 H₂O 20 mg

ZnSO₄-7 H₂O 5 mg

CoCI₂ · 6 H₂O 5 mg

Mischung 1 :1 von Gasöl (spezifisches
Gewicht bei 15°C/4°C = 0,8203);
Flammpunkt 72° C und von rohem
Paraffin (Dichte bei 15⁰C = 0,891;
Dichte bei 8O⁰C = 0,772); Erstarrungspunkt der entstandenen Mischung: 46°C 15 ml

Leitungswasser 1000 ml

Der pH-Wert wird mit verdünnter Natronlauge auf 7,5 bis 7,6 eingestellt, Sterilisation 30 Minuten bei 120 C.
Die Gasöl-Paraffin-Mischung wird separat sterilisiert und dem Nährboden unter steriler Bedingung hinzugefügt.

Man fermentiert die Kultur bei 3O⁰C auf einem Schüttelgerät mit 220 U/min und einer Exzentrizität von 6 cm.

Nach 40 Stunden werden in jeden Kolben 25-mg

r^t-Pregnen-17u,21-diol-3,ll,20-trion, in 1 ml Äthanol

gelöst, eingebracht, und das Gemisch wird unter denselben Bedingungen weiter 24 Stunden fermentiert.

Die chromatographische Prüfung (Dünnschichtplatten aus Silikagel, Lösungsmittel Benzol zu Äthylazetat 70:30) zeigt fast vollständiges Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Stoffes, dessen Rf-Wert demjenigen des l'-⁴-Pregnadien-17«, 21 -diol-3,11-20-trions gleich ist.

Extraktion, Kristallisation und Identifizierung werden in der folgenden Weise ausgeführt: Der Inhalt der beiden Kolben wird vereinigt, mit 50 ml Petroläther in einem Scheidetrichter heftig ausgeschüttelt, worauf die Petrolätherschicht verworfen wird. Die

f>5 Brühe wird dann nochmals mit Methylisobutylketon extrahiert; der organische Auszug wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft.

Der trockene Rückstand wird an 1 g Silicagel chromatographiert. Durch Eluieren mit 5% Äthyläther—Äthylacetat erhält man ein kristallines Produkt, das bei 230 bis 234"^JC schmilzt; [α]? = +170° (1% in Dioxan), )._max = 238 πΐμ, EJ "°_m = 435.

Das gewonnene Produkt erwies sich chromatographisch und bei IR-Untersuchung einer authentischen Probe von l¹⁴-Pregnadien-17i/,21-diol-3,l I-20-trion gleich. Eine chromatographische Prüfung zeigt, daß die Umwandlung vollständig und die Ausbeute hoch ist. Ausbeute: 75%·

B e i s ρ i e 1 2
l'-⁴-Pregnadien-17«,21-diol-3,ll -20-trion

Die Fermentierung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt mit dem Unterschied, daß der Nährboden Glukose (60 g/l) an Stelle der rohen Gasöl-Paraffin-Mischung enthält. Die chromatographische Analyse bestätigt das fast vollständige Verschwinden des Ausgangsproduktes unter gleichzeitiger Bildung eines Stoffes mit einem Rf-Wert, der dem des l'-⁴-Pregnadien-17«,21-diol-3,ll-20-trions gleich ist. Ausbeute: 85%·

•

Beispiel 3
I¹ -⁴-Pregnadien-l 7«,21 -diol-3,11,20-trion

Die Fermentierung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt mit dem Unterschied, daß der Nährboden folgende Zusammensetzung hat:

Glukose 20 g

Pepton*) 5 g

Tripton*) : 5 g

Hefeextrakt 5 g

CaCO₃ 2,5 g

Destilliertes Wasser 1000 ml

*) Handelsnamen für enzymatisch hydrolysiertc Fleischcxtrakte.

Die chromatographische Prüfung zeigt das fast völlige Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes mit einem Rf-Wert gleich dem des l'-⁴-Pregnadien-17ii,21-diol-3,l 1,20-trions. Ausbeute: 80%.

Beispiel 4
l'-⁴-Pregnadien-ll/i,17«,21-triol-3,20-dion

500 ml Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 werden in 2000-ml-Kolben sterilisiert, die mit drei Wellenbrechern versehen sind. Sie werden mit einer Mycelsuspension angeimpft, die durch Waschen einer halben, 3 Tage lang in einem Roux-Kolben auf Kartoffel-Glukose-Agar gezüchteten Kultur gewonnen wurde.

Die Kolben werden 36 Stunden bei 28 C auf einem Schüttelgerät mit 120 U/min und einer Exzentrizität von 70 mm inkubiert. 300 ml jener Kultur dienen zum Animpfen von 3 1 eines in 5-l-Laborfermentern sterilisierten Nährmediums der gleichen Zusammensetzung.

Die Fermentierung wird mit einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/min mit einer Luftzufuhr von 11 l/min bei einer Temperatur von 30 C ausgeführt.

Nach 48 Stunden Fermentierung werden 1,5 g I⁴- Prcgtien -I l/>\17<i,21 - triol - 3.20 - dion. gelöst in 60 ml Methylalkohol, zugefügt.

Dann wird unter den gleichen Bedingungen weitere 40 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse auf dünner Silicagelschicht, wobei als chromatographisches System Chloroform zu Methanol zu Wasser 92,5 : 7,5 :0,5 verwendet wird, bestätigt das Verschwinden der Ausgangsverbindung und die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des Prednisolons gleich ist.

Die Brühe wird mit Methylisobutylketon extrahiert, der organische Auszug über Natriumsulfat getrocknet und dann zur. Trockene eingedampft. Der trockene Rückstand wird zwischen 500 ml Petroläther mit einer Siedestrecke von 60 bis 80° C und 600 ml 80%igem wäßrigem Methanol verteilt.

Der Methanolexirakt wird abgetrennt und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft.

Das Konzentrat wird mit 600 ml Methylisobutylketon extrahiert, dann mit wenig Wasser gewaschen, worauf der organische Extrakt auf ein Volumen von etwa 5 ml eingedampft wird; dann werden 20 ml Äthyläther hinzugefügt, und die Mischung wird zum Auskristallisieren in einen Kühlschrank gebracht.

Man erhält 1,3g (87%) /l'-⁴-Pregnadien-l Ιβ,Πα, 21-triol-3,20-dion, das bei 240 bis 241°C schmilzt; [«]?=+100° (1% Dioxan), /_mflX= 242 m,x, E\t = 415; mit einer authentischen Probe von I^1<4-Pregna·: dien-ll/U7«,21-triol-3,20-dion erweist es sich bei der chromatographischen Prüfung als identisch und verschieden von ^-n

Beispiel 5 9«-Fluor- l^1A-pregnadien-l l/U7«,21-triol-3,20-dion

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 48 Stunden erreicht hat, 25 mg 9«-Fluor-, f-pregnen-11 ß, 17u,21 -triol·- 3,20-dion hinzugefügt werden, die in 1 ml Methanol in Gegenwart von 0,1 ml einer 20%igeri wäßrigen Lösung von Polyoxyäthylen - sorbitan - monooleat (»Tween 80«) gelöst sind. Nach 40 Inkubationsstunden bestätigt die chromatographische Analyse das vollständige Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 9fi-Fluor-. I¹⁴-pregnadien-l l/i,17«,21-triol-3,20-dions gleich ist.

Dann wird mit Methylisobutylketon extrahiert und anschließend zwischen 80%igem wäßrigem Methanol und Petroläther verteilt, worauf das Methanol abgedampft und der Rückstand nochmals mit Methylisobutylketon, wie im Beispiel 4, extrahiert wird. Man erhält mit 71%iger Ausbeute das 9u-Fluorl'-⁴-prcgnadien-llfi,17«,21-triol-3,20-dion, das bei 274 bis 275 C schmilzt; [«]'?'= +94 (Dioxan): / , = 238 ΐημ. El¹;: = 404.

Beispiel 6

9a-Fluor- l'-⁴-pregnadien-l l/i,16u,17«,21-tetrol-3,20-dion

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem einzigen Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 48 Stunden erreicht hat, 25 mg 9«-Fluor- f^-pregnen-11^,16«,17«,21 -tetrol-3,20-trion hinzugefügt werden, die in 1 ml Methanol in Gegenwart von 0,1 ml einer 20%igen wäßrigen Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat-l.ösung gelöst sind. Nach 40 Inkubationstagen bestätigt die chromatographische Analyse das Verschwinden dos Ausgangsproduktes und die Bildung

109 608 93

eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 9« - Fluor - . I¹-⁴ - pregnadien - 11/U6«,17u,21 - tetrol-3,20-dions gleich ist. Die nach der gleichen Methode, wie im Beispiel 4 beschrieben, ausgeführte Extraktion führt zur Trennung des 9a-Fluor-. I¹⁴-pregnadienll/U6u,17a,21 - tetrol - 3,20- dions in 60%iger Ausbeute, das bei 260 bis 266⁰C schmilzt; [α]?= +67° ' (l°/o Dioxan), l_max = 239 ηΐμ, EJ^ = 385. Drei Dünnschichtchromatogramme auf Silicagel zeigen, daß das Produkt mit Triamcinolon identisch ist.

B e i s ρ i e 1 7

9u-Fluor-, l^K4-pregnadien-l l/f,16u,17a,21-tetrol-3,20-dion

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 30 Stunden erreicht hat, diese im Verhältnis 1 Teil Kulturbrühe/ zu 2 Teile steriles Leitungswasser verdünnt wird. Nach der Verdünnung werden in jeden Kolben 25 mg 9«-Fluor-,l⁴-pregnen-ll£,16a,17u,21-tetrol-3,20-dion, gelöst in 0,125 ml Dimethylformamid in Gegenwart eines Tropfens einer 20%igen wäßrigen Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat-Lösung, zugefügt. Anschließend wird weitere 40 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse bestätigt das Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 9«-Fluor-,l'-⁴-pregnadien-llß,16a,17a,21-tetrol-3,20-dions entspricht. Das 20//-Hydroxyderivat ist praktisch abwesend.

Extraktion nach dem Verfahren gemäß Beispiel 4 führt zur Abtrennung des 9a-Fluor-, l^1A-pregnadienll/i,16«,17a,21-tetrol-3,20-dions. Ausbeute: 68%·

35 Beispiele

- l'-⁴-Pregnadien-17a,21-diol-3,ll,20-trion

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem einzigen Unterschied, daß bei der Zusammensetzung des Nährmediums das NaNO₃ und das Ca(H₂PO₄J₂ durch (NH₄J₂HPO₄ in einer Konzentration von 4,7 g/l ersetzt werden. Die chromatographische Analyse bestätigt das vollständige Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des /l^1A-Pregnadien-17u,21-diol-3,11,20-trions entspricht. Die wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführte Extraktion führt zur Abtrennung des Prednisons in einer Ausbeute von 65%-

50 Beispiel 9

17«-Methyl-/l¹'⁴-androstadien-3,17/i-diol-3-on

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 48 Stunden erreicht hat, 25 mg per Kolben 17a-MethyI-/i^-androsten-Sj^/f-dioW-on, gelöst in 0,125 ml Dimethylformamid in Gegenwart eines Tropfens einer 20%igen wäßrigen Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat-Lösung, zugefügt werden. Anschließend wird weitere 24 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse bestätigt die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 17«-Methyl-, l'*-androstadien-3,17/i-diol-3-ons entspricht.

Der Inhalt von 20 Kolben wird mit 200 ml Methylenchlorid extrahiert, worauf das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand aus Aceton Petroläther umkristallisiert wird. Es werden Kristalle von 17«-Methyll'-⁴-androstadien-3,17/^-diol-3-on erhalten, die bei 160 bis 162°C schmelzen; [u]?,⁰ = +85 (CHCl₃); /.„„« = 244 πΐμ, Ej°°_m = 260; 305 ηΐμ, Ej^ = 175. Ausbeute: 70%.

Beispiel 10
17(i-Methyl- l'-⁴-androstadien-17/^-ol-3-on

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem einzigen Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 48 Stunden erreicht hat, 25 mg per Kolben 17«-Methyl-I⁴-androsten-17ß-oI-3-on, gelöst in 0,125 ml Dimethylformamid, zugefügt werden. Hierauf wird weitere 24 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse bestätigt die Bildung eines Produktes, dessen Rf-Wert demjenigen des 17a-Methyk I¹⁴-androstadien-17/?-ol-3-ons entspricht. Durch die Extraktion erhält man Kristalle des 17a-Methyl-. I¹⁴-androstadien-17/i-ol-3-ons, die bei 163 bis 165°C schmelzen; Ia]V = 0° (CHCl₃); l_max= 245 ΐημ, E^= 510. Ausbeute: 72%.

Beispiel 11

6a,9u-Difluor-. I¹⁴-pregnadien-l l/J,17«,21-triol-3,20-dion

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 40 Stunden erreicht hat, 25 mg per Kolben 6a,9a-Difluor- ^-pregnen-li/U7u,21-triol-3,20-dion, gelöst in 0,125 ml Dimethylformamid in Gegenwart eines Tropfens einer 20%igen wäßrigen Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat-Lösung, zugefügt werden. Anschließend wird weitere 48 Stunden fermentiert. Die chromatographische Analyse bestätigt die Bildung eines Produktes mit einem Rf-Wert gleich dem des 6a,9f/-Difluorl'-⁴-pregnadien-ll/U7u,21-triol-3,20-dions. Der Inhalt der 20 Kolben wird mit 500 ml Methylisobutylketon extrahiert, der Auszug gewaschen und bis fast zur Trockene eingedampft. Gegen Ende der Konzentration kristallisiert das 6u,9u-Dinuor- I¹⁴-pregna-■dien-1 Iftl7«,21-triol-3,20-dion, das bei 220 bis 223°C schmilzt; Ia]²S= +88° (l%Dioxan), ?._mux = 237 ΐημ, Ej^_n, = 380. Ausbeute: 86%.

Beispiel 12
l^l4-Pregnadien-3,20-dion

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß, wenn die Kultur das Alter von 40 Stunden erreicht hat, 25 mg per Kolben Progesteron, gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid in Gegenwart eines Tropfens einer 20"/_oigen wäßrigen Lösung von Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat, zugefügt werden. Die Kultur wird dann 48 Stunden fermentiert und daraufhin in üblicher Weise aufgearbeitet. Man erhalt so l'-⁴-Pregnadien-3,20-dion.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 3 - Keto-I¹⁴-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe durch Bebrütung eines entsprechenden 3-Ketol⁴-steroids mit einer Kultur der Gattung Nocardia unter submersen und aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff-, Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, dadurch ge-

kennzeichnet, daß die Bebrütung mit einer Kultur von Nocardia lucida n. sp. durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle eine Mischung von aliphatischen Kohlenwasserstoffen der Art Gasöl-Paraffin, die vorzugsweise 12 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bei einer Temperatur zwischen 24 und 34° C, vorzugsweise bei 30 C, durchgerührt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8, vorzugsweise bei 7,5 bis 7,6, durchgeführt wird.