MXPA99010078A - Cepa novedosa de bacillus para controlar enfermedades de plantas y gusano de raiz de maiz - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una cepa novedosa de Bacillus subtilis de producción de antibiótico y producción de metabolito que exhibe actividad insecticida, antifúngica y antibacteriana. El sobrenadante de esta cepa novedosa contiene agentes efectivos insecticidas, antifúngicos y antibacterianos. También se incluye en la invención un solvente extraíble, un metabolito activo en el gusano de la raíz del maíz con un peso molecular pequeño (<10,000 daltons) producido en el sobrenadante. También se incluyen en la invención métodos para proteger o tratar plantas de infecciones fúngicas y bacterianas y plagas por gusano de la raíz del maíz, que comprende el paso de aplicar a la planta una cantidad efectiva de la cepa de Bacillus subtilis novedosa de producción antibiótica/metabolito, el antibiótico/metabolito producido por la cepa novedosa de Bacillus subtilis o una combinación de los mismos, opcionalmente además comprende otra cepa bacteriana de producción de antibiótico y/o un pesticida químico. La invención también incluye métodos para prevenir o evitar infecciones fúngicas y bacterianas utilizando cultivos de caldo entero o sobrenadantes obtenidos de cultivos de la cepa novedosa de Bacillus subtilis solos o en combinación con pesticidas químicos y/u otros agentes de biocontrol. La invención también incluye compuestos novedosos antifúngicos y antibacterianos designados como agrastatinas y una composición novedosa que comprende una iturina de tipo A, una plipastina, una surfactina y una agrastatina. También se proporcionan métodos para tratar o proteger plantas de infecciones fúngicas o bacterianas y plagas por gusanos de la raíz del maíz que comprenden administrar las agrastatinas novedosas y la combinación novedosa que comprende una iturina de tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina.

Description

CEPA NOVEDOSA DE BACILLÜS PARA CONTROLAR ENFERMEDADES DE PLANTAS Y GUSANO DE RAÍZ DE MAÍZ DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de biopesticidas . Más particularmente se refiere al hallazgo cepa novedosa de Bacill us subtilis, AQ713, puede inhibir una amplia variedad de enfermedades de plantas fúngicas y bacterianas y también tiene actividad contra el gusano de raíz de maíz. La invención también se refiere a composiciones fungicidas, bactericidas e insecticidas que comprenden está cepa novedosa de Bacillus y los antibióticos y metabolitos producidos a través de esta cepa ya sea sola, o en combinación con otros pesticidas químicos y biológicos. Esta solicitud es una continuación en parte de la Serie No. 08/853,753, presentada el 9 de mayo de 1997. Durante varios años, se ha sabido que diversos microorganismos exhiben actividad biológica con el fin de ser útiles para controlar enfermedades de plantas. Aunque el progreso se ha hecho en el campo para identificar y desarrollar pesticidas biológicos para controlar varias enfermedades de plantas de importancia agronómica y horticultural, la mayoría de los pesticidas en uso siguen siendo compuestos sintéticos. Muchos de estos fungicidas químicos son clasificados como carcinógenos por la EPA, son tóxicos a la vida salvaje y otras especies no objetivos.

Además, los patógenos pueden desarrollar resistencia a pesticidas químicos (ver, por ejemplo Sch inn et al., p 244, ADVANCES IN PLANT PATHOLOGY: PHYTOPHPHTHORA INFESTANS, THE CAUSE OF LATE BLIGHT OF POTATO (Academic Press, San Diego 1991) . Cada año se utilizan 250-300 millones de dólares de pesticidas químicos para controlar plagas de gusano de raíz de maíz. Muchos de estos pesticidas químicos son tóxicos para seres humanos, la vida silvestre y otras especies no objetivo. También se ha encontrado en el agua subterránea. Nuevos insecticidas químicos cuestan 100 millones de dólares para su desarrollo. El control biológico ofrece una alternativa atractiva para fungicidas químicos sintéticos. Los biopesticidas (organismos vivientes y los compuestos naturalmente producidos que se producen a través de estos organismos) pueden ser más seguros, más biodegradables y menos costosos de desarrollar. Los programas de clasificación han identificado ciertas cepas de Bacill us spp. (Bacillus spp. Incluye B subtil is , B . cereus, B . mycoides , B . thuringiensis) que exhiben actividad antifúngica. (ver por ejemplo. Stabb et al . (1990) Applied Environ . Microbiol 60: 4404-4412). Estas cepas se han mostrado que producen zwittermicina-A y/o canosamina (Milner et ai. (1996) Appl . Environ . Microb . 62: 3061-3066), dos agentes antibióticos que son efectivos contra enfermedad de humectación excesiva que surge del suelo causada por Phytophthora medicaginis , P. nicotianae, P. aph a nider ma tura o Scl erotinia minor (Ver Stabb et al . , supra ) . La zwittermicina-A es una molécula de aminopoliol lineal e.stable al ácido, soluble en agua (ver, He et al , (1994) Tetra Left . 35 (16) 2499-2502. La Patente Norteamericana No. 5,049,379 de Handelsman et ai. describe como la zwittermicina-A produce la enfermedad de humectación excesiva en alfalfa y soya. Cuando la semilla fue revestida con B . cereus ATCC 53522, la actividad patogénica del hongo de la raíz se inhibió. Similarmente, la aplicación de formulaciones a ba.be de esporas de ciertas cepas de B . cereus a semillas de soya o al suelo circundante de las semillas ha mostrado mejorar el rendimiento de soya en estos sitios de campo (Ver, Osburne et al (1995) Am . Phytopa thol . Soc . 79(6): 551-556). En la técnica son bien conocidos los métodos para aplicar biopesticidas e incluyen, por ejemplo, polvos humectables, productos fluibles secos, microencapsulación de agentes efectivos, formulaciones líquidas o sólidas de fracciones antibióticas de cultivos adecuados (Ver por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,061,495 de Rossall o Patente Norteamericana No. 5,049,379 de Handelsman) .

Smith et al. (1993) Plant Disease 77(2) 139-142 reportan que la actividad del hongo que se desarrolla en el suelo Pythium aphanidermatum, que ocasiona la falta de capacidad de formación de algodón del pepino, puede ser suprimida utilizando la cepa de B. cereus de producción de zwittermicina U 85. Leifert et al. (1995) J. Appl. Bacteriol . 78: 97-108 reporta que la producción de antibióticos anti-Botrytis y anti-Alternaria a través de dos cepas de Bacillus, B. subtilis CL27 y B. pumilis CL 45. El caldo completo y los filtrados libres de célula fueron activos contra Botrytis y Alternaría en pruebas in vitro y fueron activos contra Botrytis en pequeñas pruebas en plantas in vivo de A tilbe. Leifert et al. (1997) Patente Norteamericana No. 5,597,565 describen que B. subtilis , B. pumilis , y B. polymyr.a son particularmente efectivos para inhibir hongos que causan enfermedades después de la cosecha. También describen la presencia de antibióticos producida en el filtrado de cultivo libre de célula y su actividad a diferentes valores de pH, pero no identifican estos compuestos. Rossall (1994) Patente Norteamericana No. 5,344,647 describe cepas de Bacillus subtilis con una amplia actividad antifúngica. Sholberg et al. (1995) Can. J. Microbiol . 41 247-252, Swinburne et al. (1975) Trans. Brit. Mycol . Soc. 65 211-217, Singh and Deverall (1984) Trans. Br. Mycol. Soc. 83 487-490, y Ferreira, et al. (1991) Phytopathology 81: 283 287. Baker et al. (1983) Phytopathology 73: 1148-1152 describen el uso de Bacillus spp. y Bacillus subtilis como agente de biocontrol de patógenos de planta fúngicos . Baker et al. (1983) Phytopathology 73:1148-1152 también reportan un Bacillus subtilis antifúngico para utilizarse en patógenos de plantas. Pusey et al. (1988) Plant Dis . 72: 622-626, Pusey and Robins (Patente Norteamericana No. 5,047,239), y McKeen et al. (1986) Phytopathology 76: 136-139 describen el control de pudrición de fruta después de la cosecha utilizando B. subtilis . McKeen et al, supra , han mostrado que los antibióticos similares a los polipéptidos cíclicos de utirina de peso molecular bajo contribuyen a esta actividad fúngica de B. subtilis . Liu et al. (1995) Patente Norteamericana No. 5,403,583 describen un Bacillus megaterium, ATCC 55000 y un método para controlar el patógeno de planta fúngico, Rhizactonia solani. Islam and Nandi (1985) Journal of Plant Diseases and Protection 92(3): 241-246 describen un Bacillus megaterium con antagonismo a Drechslera oryzae, el agente de causa de mancha parda de arroz. Los mismos autores, Islam and Nandi (1985) Journal of Plant Diseases and Protection 92(3) 233-240 también describen el antagonismo in-vitro de B. megaterium contra Drechslera oryzae, Alternaría alternata y Fusarinm roseum. El antibiótico más activo fue altamente soluble en agua y metanol con un pico V a 255 nm y un respaldo a 260 nm, que probó ser un lipopéptido similar a polioxina. Cook ((1987) Proceedings Bel t wide Cot ton Production -Mechaniza tíon Research Conference, Cotton Council, Memphis, p. 43-45) describen el uso de una suspensión de Bacill us mega terium para reducir el número de plantas de algodón aniquiladas por Phymatotrichum omnivorum, una causa de pudrición de la raíz del algodón. La producción del antibiótico B . mega teri um ha sido registrada por Berdy (CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vols. I-XIV, (CRC Press, Inc. Boca Ratón, FL 1980-87) quien reporta la producción de anticuerpos de péptidos tóxico en mamíferos inferiores tales como ansamitocina-PDM-O, bacimetrina, megacina, pentapéptido, homopéptidos . Bacilli se sabe que producen metabolitos secundarios antifúngicos y antibacterianos (Korzybski et al . (1978)). Los investigadores de la Universidad de Wisconsin y Cornell han identificado un compuesto fúngico novedoso, zwittermicina A, producida por Bacill us sp . (He et al . (1994) Tetra Left . 35 ( 16) : 2499-2502 ) . Un segundo metabolito fúngico producido por la misma cepa fue identificado recientemente como el aminoazúcar conocido, canosamina (Milner ev al . (1996) Appl . Environ Microb . 62:3061-3065). Otro grupo de metabolitos de Ba cill us previamente descrito son los lipopéptidos cíclicos de la clase iturina, algunos de los cuales son potentes agentes fúngicos. Estos agentes consisten de un octapéptido cíclico con siete - aminoácidos y un ß-aminoácido con una cadena lateral alifática. Existen varios grupos de iturinas que difieren en orden y contenido de la secuencia de aminoácidos. Estas se muestran en la Tabla 1 a continuación. Generalmente, se produce un grupo de moléculas relacionadas con diferencias en longitud y ramificación del residuo de aminoácidos alifáticos. Cuando se probaron contra Sa ccharomyces cerevesiae, se encontró que la micosubtilina es el agente más activo (LC50 = 10 µg/mL) seguido por iturina-A y bacilomicina L (ambas teniendo LC50 = 30 µg/mL) (Beeson et al . (1979) J. An tibiotics 32 (8 ): 828-833) . El modo de acción de estos lipopéptidos cíclicos ha sido reportado debido a la interacción con membranas fúngicas creando canales de transmembrana que permiten la liberación de iones vitales. (Latoud et al . (1986) Biochem . Biophys . Acta 856:526-535). La Iturina-C es inactiva contra hongos incluyendo Peníci ll iam chrysogenum (Peypoux et al . (1978) Tetrahedron 34:1147- 1152) . Tabla 1 Estructuras de la familia de iturina de antibióticos R = CH3, CH(CH3)2, CH3CH2CH CH, Un grupo de investigación en USDA ha investigado la relación de estructura/actividades de las iturinas sintetizando un número de análogos que difieren en la longitud de cadena de aminoácido. Los investigadores reportaron que la actividad de las iturinas se incrementó con la longitud de la cadena lateral del ácido graso y la ramificación terminal en el orden iso>normal>anteiso (Bland et al . (1995) Proc . Plant Growth Regula tion Soc . Am . 22nd: 105-107). También establecieron que las "cantidades de iturinas obtenidas de producción natural son inadecuadas para ser comercialmente viables", con base en su trabajo con un número de cepas de Bacill us de producción de iturina.

Otros grupos de lipopéptidos cíclicos aislados de ß. cereus son las plipastatinas . Estos compuestos son una familia de decapéptidos acilados, las estructuras de los cuales se muestran en la Figura 1 (Nishikiori et al . (1986) J. An tibiotics 39 (6) : 755-761) . Estos compuestos tueron originalmente aislados como inhibidores de fosfolipasa A? pancreática de porcino (Umezawa et ai. (1986) J. An tibiotics 39 ( 6) : 737-74 ) , pero después se encontró que inhiben algo de hongos patogénicos de plantas incluyendo Botrytis , Pyricularia y Al ternaría (Yamada et al . (1990) Nippon Noya tu Gakkaishi 15 ( 1 ): 95-96) . Yamada también reportó un efecto sinergístico observado entre iturina A y las plipastatinas, ambas producidas por la misma cepa B . subtil is . Se ha realizado un trabajo sobre las mejoras de fermentación para incrementar la producción de las iturinas en fermentaciones tanto de estado líquido (Phae and Shoda (1991) J. Ferment. Bioeng. 71:118-121); Ohno et al . (1993) J. Ferment . Bioeng. 75:463-465) como en estado sólido. (Ohno et al . (1992) Biotech . Left . 1 ( 9) : 817-822 ; Ohno et al . (1995) J. Fermen t . Bioeng. 5:517-519). Existe un reporte de sinergia entre las surfactinas estrechamente relacionadas, que por sí mismas son inactivas, y las iturinas producidas por la misma cepa B. Subtilis (Hiraoka et al . (1992) J. Gen . Appl . Mi crobiol . 38:635-640). La secuencia de nucleótido para el gen que co-regula la biosíntesis de iturina A y surfactina ha sido publicada (Huang et al . (1993) J. Ferment . Bioeng. 76(6) : 445-450) . El trabajo de campo en las cepas que producen íturina se ha concentrado en el tratamiento del suelo para controlar Rhi?octonia (Asaka and Shoda (1996) Appl . Environ . Microbiol . 62:4081-4085) y no se han reportado aplicaciones de campo foliar de iturinas. Otro compuesto de lipopéptido cíclico producido por B . subtil is es surfactma, la cual posee una actividad excepcional de agente tensioactivo (Kanmuma et al . (1969) Agrie . Biol . Chem . 33:973-976). Las surfaetma contiene un acido ß-hidroxigraso de C14 o C15 enlazado a través de un anillo de lactona a una porción de heptapeptido con una secuencia LLDLLDL (Apma et al . (1968) Biochem . Biophys . Res . Commun . 31:488-494. Sandrin et al . ((1990) Biotechnol . Appl . Biochem . 12:370-375) encontraron que la cepas B . Subtilis producen tanto surfactina como íturina A, las bacilomicmas F y L y micosubtilma . El microorganismo novedoso AQ713 descubierto por los inventores, previamente se pensó que era una c pa de Ba cill us mega terium y ahora se identificó como una c<-pa de Ba cillus subt ilis , y produce íturinas A, plipastatmas y surfaetmas. La producción de esta combinación de lipopéptidos a través de un microorganismo no ha sido previamente reportada. Además, los inventores han descubierto que AQ713 también produce un grupo recientemente descrito de compuestos designados como "agrastatinas" . La combinación de estos tres compuestos conocidos anteriores con las agrastatinas novedosas también es novedosa. Un biopesticida comúnmente utilizado es la bacteria gram positiva Bacill us thuringiensis . Las cepas B . thuringiensis pesticidas se sabe que producen proteínas de cristal durante la esporulación, las cuales son específicamente tóxicas a ciertos órdenes y especies de insectos y nematódos . (Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,999,192 y 5,208,017). Las endotoxinas proteináceas producidas por B . thuringiensis también actúan como agentes insecticidas contra el gusano de la raíz del maíz y otros escarabajos, (por ej emplo, Pa ten te Norteamericana No . 5,187,091; Johnson, T.J. et al . (1993), J. Economic En tomology 86:330-333). Las exotoxinas B . thuringiensis han mostrado que son efectivas como cristales purificados, pellas de células lavadas y proteínas expresadas. Warren et al . (WO 96/10083), describen proteínas no endotoxinas producidas durante la etapa vegetativa de Bacill us cereus y B . thuringiensis . Estas proteínas vegetativas denominadas Vipl y Vip2, tiene una potente actividad contra el gusano de la raíz del maíz (norte y occidente) (Estruch et al . (1997) , Na ture Biotechnology 15:137-141 y Mullins et al . (1997), Appl . Environ . Microbiol . 63, (en imprenta) Un metabolito termoestable B . Thuringiensis, denominado beta-exotoxina también ha mostrado que tiene propiedades pesticidas. Burgjeron and Biache (1979), Entomophaga 11:279-284 reportan una beta-exotoxina que es activa contra el escarabajo de la papa de Colorado ( Leptinotarsa decemlineata ) . Además, las beta-exotoxinas de B . thuringiensis conocidas exhiben actividad pesticida no específica, aniquilando no solamente nemátodos, sino que también moscas, gusanos, piojos y gusanos de la raíz del maíz. La sigma-exotoxina tiene una estructura similar a la beta-hexotoxina, y es activa contra el escarabajo de la papa de Colorado (Argauer et al . (1991) J. Entomol . Sci 26:206-213) . La alfa-exotoxina es tóxica contra las larvas de Musca domestica (Cluthy (1980) FEMS Microbiol . Let t . 8:1-7). Las gamma-exotoxinas son varias enzimas protiolíticas, quitinasas y proteasas. Los efectos tóxicos de gamma-exotoxinas son solamente expresados en combinación con beta-exotoxina o delta-endotoxina . Forsberg et al. (1976) " Ba cill us thuringiensis : Its effects in Environmental Quality", National Research Council of Canadá. Stonard et al (1994) ACS Symposium Series 551: 25 reportaron un activo de metabolito secundario soluble en agua contra el gusano de raíz del maíz en el sobrenadante de una cepa de Bacillus cereus . No existen cepas documentadas de Bacill us tanto con actividad fúngica como para el gusano de la raíz del maíz. No existen metabolitos conocidos producidos por Ba cil l us subtilis que sean de un peso molecular menor que 10,000 y que puedan ser atraídos en un solvente no polar. Se proporciona una cepa novedosa productora de antibiótico y productora de metabolito de Ba cil l us subtil is, previamente identificado como Bacillus mega terium, que exhibe una amplia actividad fúngica y bacteriana y también exhibe actividad contra el gusano de la raíz del maíz. También se proporciona un metabolito novedoso a partir de Bacill us subtilis novedoso con actividad en el gusano de la raiz del maíz. También se proporciona un método para tratar o proteger plantas de infecciones fúngicas y bacterianas que comprende el paso de aplicar una cantidad efectiva de Ba cil l us subtil is productos de antibióticos. El Bacill us subtil is producto de antibiótico puede ser provisto como una suspensión on un cultivo de caldo entero o como un sobrenadante que contiene antibiótico obtenido de un cultivo de caldo entero de la cepa de producción de antibiótico de Bacil l us . También se proporciona un método para tratar o proteger raíces de plantas de plagas del gusano de la raíz del maíz que comprende el paso de aplicar una cantidad efectiva del Ba cill us subtil is novedoso de producción de metabolito. El Bacill us subtil is de producción de metabolito novedoso puede ser provisto como una suspensión en el cultivo de caldo entero o como un sobrenadante que contiene metabolito o un metabolito purificado obtenido a partir de un cultivo de caldo entero del microorganismo. También se proporcionan compuestos novedosos, agrastatmas, producidas por Id cepa novedosa AQ713 y una combinación novedosa de compuestos que comprenden ínturma A, una plipastatma, una surfactina y una agrastatma . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la estructura de los antibióticos de plipastatma . La Figura 2 muestra el cromatograma de HTLC de metabolitos A0713. La presente invención proporciona una cepa novedosa, AQ713, de Bacill us subtil is, previamente identificada como un Bacillus mega terium, o mutantes del mismo con una amplia actividad antifungica y antibacteriana y la combinación novedosa de actividad antifungica y contra el gusano de la raíz del maíz. Esta cepa novedosa es designada romo AQ713 y fue depositada con NRRL el 7 de marzo cl^ 1997 bajo las provisiones del tratado de Budapest en International Recog ition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure ajo el No. de Acceso B21661. La invención también incluye métodos para prevenir y tratar enfermedades fúngicas y bacterianas en plantas utilizando tales cepas bacterianas o sobrenadates que contienen antibiótico o antibióticos puros obtenidos a partir de tales cepas bacterianas. La invención también incluye métodos para tratar raíces de plantas o el suelo para controlar el desarrollo de larvas del gusano de la raíz del maíz con una suspensión bacteriana de AQ713 o un sobrenadante conteniendo metabolito de un cultivo de AQ713 o metabolitos purificados a partir de la cepa A0713. La invención también incluye un metabolito extraíble con solvente con actividad en el gusano de la raíz del maíz con un peso molecular menor que 10,000 daltons. La invención también incluye compuestos novedosos, agrastatinas, producidas por el microorganismo novedoso. También incluida está una combinación novedosa que comprende una iturina de tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina . Definiciones Como se utiliza en la presente "control biológico" se define como el control de un patógeno o insecto a través del uso de un segundo organismo. Los mecanismos conocidos de control biológico incluyen bacterias entéricas que controlan la pudrición de raíces haciendo competir hongos para espacio en la superficie de la raíz. También se han utilizado toxinas bacterianas, tales como antibióticos, para controlar patógenos . La toxina puede ser aislada y aplicada directamente a la planta o las especies bacterianas pueden administrarse a medida que producen la toxina in si tu .

El termino "hongo" u "hongos" incluye una amplia variedad de organismos que llevan esporas nucleaclas que carecen de clorofila. Ejemplos de hongos incluyen levaduras, mantillos, moho, roya y setas. El termino "bacterias" incluyen cualquier organismo procariótico que contiene un núcleo distinto. "Fungicida" representa la habilidad de una sustancia para incrementar la mortalidad o inhibir la escala de crecimiento de hongos. "Antibióticos" incluye cualquier sustancia que sea capaz de aniquilar o inhibir un microorganismo. Los antibióticos pueden ser producidos por un microorganismo o a través de un proceso sintético o procesos semisintéticos . Por lo tanto, el término incluye una sustancia que inhibe o aniquila hongos, por ejemplo, zwittermicma-A o canosamma. "Antifúngico" incluye cualquier sustancia que sea rapaz de aniquilar o inhibir el crecimiento de hongos. El termino "cultivarse" se refiere a la propagación de organismos sobre o en un medio de diversos tipos. "Cultivo de caldo entero" se refiere a un cultivo líquido que contiene células de caldo y medios. "Sobrenadante" se refiere al caldo liquido que queda cuando las células desarrolladas n el caldo son removidas por centrifugación, filtración, sedimentación u otros medios conocidos en la técnica.

Una "cantidad efectiva" es una cantidad sufn lente para efectuar resultados benéficos o deseados. Una cuitidad efectiva puede ser administrada en una o mas administraciones. En términos de tratamiento y protección, una "cantidad efectiva" es aquella cantidad suficiente para mitigar, estabilizar, invertir, reducir o retrasar la progresión de estados de enfermedad por hongos o bacterias. Como se utiliza en la presente, el termino "insecto" incluye todos los organismos en la clase de "Insectos". Los insectos "Preadultos" se refieren a cualquier forma de un organismo antes de la etapa adulta, incluyendo, por ejemplo, huevos, larvas y ninfas. "Insecticida" se refiere a la habilidad de una sustancia para incrementar la mortalidad o inhibir la escala de crecimiento de insectos. "Nematicida" se refiere a la habilidad de una sustancia para incrementar la mortalidad o inhibir el régimen de crecimiento de nematodos. "Pesticida" se refiere a la habilidad e una sustancia para incrementar la mortalidad o inhibir el régimen de desarrollo de insectos, nemátodos y acaros . "Control positivo" significa un compuesto cjue se sabe que tiene actividad pesticida. "Controles positivos" incluyen, pero no se limitan a, pesticidas químicos comercialmente disponibles. El termino "control negativo" significa un compuesto que se sabe que no tiene actividad pesticida. Ejemplos de controles negativos son agua o acetato de etilo. El término "solvente" incluye cualquier líquido que mantiene otra sustancia en solución. "Solvente extraible" se refiere a cualquier compuesto que se disuelve en un solvente y que después puede ser aislado del solvente. Los ejemplos de solventes incluyen pero no se limitan a, solventes orgánicos como el acetato de etilo. El término "metabolito" se refiere a cualquier compuesto, sustancia o subproducto de una fermentación de un microorganismo que tiene actividad pesticida. El antibiótico como se definió anteriormente es un metabolito específicamente activo contra un microorganismo. El término "agrastatinas" se refiere a un grupo de compuestos novedosos que tienen las siguientes estructuras: donde Ri es una cadena lateral alifática rf-cta o ramificada, C8-C20; X es ya sea Ala o Val; R. es un acetato o un derivado de éster; y Glx es Gln o Glu. Estos compuestos tienen actividad antibacteriana y antifúngica así como actividad contra el gusano de la raíz del maíz. Se describe un metabolito novedoso y un cepa de producción de antibiótico de Bacill us subtil is , previamente identificada como Bacill us mega teri um, que tiene una amplia actividad antifúngica y antibacteriana y que también aniquila o impide el crecimiento de larvas del gusano de la raiz del maíz. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar o proteger plantas de infecciones fúngicas y bacterianas, que comprende aplicar una cantidad efectiva de un sobrenadante obtenido de un cultivo de caldo entero de Bacill us subtil is AQ713 dentro de la presente invención, El sobrenadante puede ser obtenido como es bien conocido en la técnica mediante centrifugación, filtración, sedimentación y similares. En otro aspecto, la invención abarca un método para tratar o proteger plantas de infecciones fúngicas o bacterianas que comprende aplicar una cantidad efectiva del caldo entero de la cepa novedosa Bacillus subtilis . En otro aspecto más, la invención abarca un método para tratar o proteger plantas de enfermedades fúngicas y bacterianas que comprende aplicar una cantidad efectiva del antibiótico producida por la cepa novedosa de Ba cill us subtilis . En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar o proteger raíces de plantas de plagas del gusano de la raíz del maíz, que comprende aplicar una cantidad efectiva de un sobrenadante obtenido de un cultivo ele caldo entero de Bacill us subtilis AQ713 dentro ele la presente invención. El sobrenadante puede ser obtenido como es bien conocido en la técnica mediante centrifucjación, filtración, sedimentación y similares. En otro aspecto, la invención abarca un método para tratar o proteger plantas de plagas de gusanos de la raíz del maíz que comprende aplicar una cantidad efectiva del caldo entero de la cepa novedosa Bacill us subtil is . En un aspecto más, la invención abarca un método para tratar o proteger raíces de plantas de plagas de gusanos de la raíz del maíz que comprende aplicar una cantidad efectiva del metabolito producido por la cepa novedosa de Bacillus subtilis . Con el fin de lograr una buena dispersión y adhesión de las composiciones dentro de la presente invención puede ser ventajoso formular el cultivo de caldo entero, el sobrenadante y/o metabolito/antibiótico con componentes que ayuden a la dispersión y a la adhesión. Las formulaciones adecuadas serán bien conocidas para aquellos expertos en la técnica . Se pueden formular composiciones dentro de la presente invención como polvos humectables, granulos, y similares, o pueden ser microencapsulados en un medio adecuado y similares. Ejemplos de otras formulaciones incluyen, pero no se limitan a, polvos solubles, granulos humectables, productos fluibles secos, productos fluibles acuosos, granulos dispersables o humectables, concentrados emulsificables, y suspensiones acuosas. Otras formula iones adecuadas ser n bien conocidas para aquellos expertos en la técnica . En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un grupo novedoso de compuestos designados como "agrastatina" . Estos compuestos exhiben actividad antibacteriana y antifúngica además de una actividad < ontra el gusano de la raíz del maíz. En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una composición novedosa que comprenda una ítunna de tipo A, una plipastatma, una surfactina y una agrastatma . En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para tratar o proteger plantas de enfermedades fúngicas y bacterianas, que comprende aplicar una cantidad efectiva de una combinación novedosa de compuestos que comprende una ítupna de tipo A, una pl pastatina, una surfactma y una agrastatina. Todas las patentes y publicaciones citadas en la presente se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Los siguientes ejemplos son provistos para ilustrar la invención. Estos ejemplos no están construidos como limitantes .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Caracterización de la Cepa AQ713 El aislado fue identificado con base <-n la utilización del panel de microplaca Biolog (Biolog, Inc., Hayward, CA) como se describe en Bochner (1989) Na tur-e 339: 157-158. La microplaca Biolog está compuesta de cavidades de panel prellenadas y secas con 95 diferentes placas de sustratos de carbono disponibles para bacterias gram positivas y gram negativas. El aislado se desarrolló en un medio líquido a 28°C y después de 24 horas se inoculó una suspensión de célula lavada (0.85?. composición salina) en cada cavidad de panel de una Microplaca GP (Biolog, Ene.) . Después de 24 horas a 28°C, se analizaron las reacciones de utilización de carbono. Después se compararon los perfiles de utilización de sustrato con la Base de Datos Gram Positiva Biolog (liberación 3.50) y se aislaron a especies muy similares. Los resultados de Biolog dieron un índice de similitud de 0.883 a Bacillus mega terium . Se condujo una caracterización más extensa de AQ713 a través de American Type Culture Collection, Rockville, Md. Aislado sometido como: Desconocido; Cepa AQ713 Aislado identificado como: Utilizando los datos fisiológicos y bioquímicos disponibles, estas cepas se asemeja demasiado a Bacill us subtil is .

Morfología celular: Las células móviles se encontraron individualmente, con una endospora formada en la región central o subterminal . Las células son uniformemente teñidas con Gram positivo. Morfología de colonia: Las colonias son opacas e irregulares con elevación convexa, una superficie rígida, inactiva, y un margen de erosa. Datos de Caracterización de la Cepa AQ 713: Comentarios: Utilizando los datos disponibles fisiológicos y bioquímicos, esta cepa se asemeja muy cercanamente a Bacill us subtilis Resultados de Caracterización Clave Re erencia : Gordon, R.E., W.C. Haynes and C.H.N. Pang. 1973. The Genus Bacillus. Handbook No. 427. U.S. Department of Agriculture, Washington, D.C. Ejemplo 2 Actividad de AQ 713 Contra el Gusano de la Raíz del Maíz Se desarrollaron muestras Bacillus en un medio de cultivo de Ba cill us subtil is . El medio 2 contuvo 57. de peptona, 57 de dextrosa, 3% de extracto de levadura, 3% de extracto de malta, 1.5% de extracto de semilla de algodón proflo (59% de proteína, 4.26% de grasa, 6.737. de ceniza, 3.19% de fibra y cantidades huella de gosipol; el resto siendo agua), 10% de harina de soya, y 0.5% de MgS04x7HO. El medio 3 contuvo los mismos ingredientes, excepto con 207 de peptona y 3.4?, de KH2P04 y 4.3% de K2HP0 . Se utilizaron cultivos rayados de un día de edad para inocular 250 mi de matraces de agitación marcados. Los matraces se agitaron a 200 rpm a 29°C durante 5 días. Para ayudar a la actividad insecticida, se centrifugaron 35 mi del caldo de cultivo a 5200 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se utilizó en el microensayo descrito más adelante. Se realizaron ensayos en microplacas de 96 cavidades. Cada cavidad contuvo un sutrato de agar sólido, un organismo de prueba y ya sea un control positivo, un control negativo o un sobrenadante obtenido como se describió en el Ejemplo 1 a partir de la cepa novedosa Bacillus . Para analizar la actividad insecticida, se preparó un sustrato de agar para las cavidades de la microplaca de acuerdo con Marrone et al (1985), J. Econ . En tomol . 78:290- 293. Para analizar la actividad nematicida, se utilizó agar plano (1.5%) en las cavidades también. Se utilizó una solución de 1 ppm de Avidcy (avermectina) como un control positivo. Se utilizó agua desionizada como un control negativo. Se utilizaron dos réplicas de la muestra de prueba o control para cada ensayo. Se surtieron en cada cavidad de la muestra 40 µL de la muestra de sobrenadante o el caldo entero desarrollado en el medio 1, 2 ó 3. Las placas después se colocaron en una cubierta de humo para secar durante aproximadamente 2-3 horas hasta que se secó la solución de agar. Los organismos de prueba fueron ya sea gusanos de la raíz del maíz preadultos (Diabrotica undecimpuneza ta) , cucarachas alemanas preadultas (Bla tella germánica) , gusanos de remolacha preadultos (Spodoptera exigua ) , moscas preadultas (Drosophila melanogos ter) , o la cepa N2 del nemátodo Caenorhabditis elegans . Los organismos de prueba se diluyeron en 0.1% de agar a una concentración de aproximadamente 5 organismos por 25 µL de agar surtido en cada cavidad. La microplaca se selló con una sustancia hermética al aire tal como Mylar(-), y cada cavidad se ventiló con una prensa de pasador. Las placas se incubaron a 27°C durante hasta 7 días. Después de la incubación, se clasificaron las cavidades observando la mortalidad de neonato o el grado de desarrollo de larvas. En las cavidades de muestra conteniendo todas las larvas muertas o con crecimiento impedido se les dio una clasificación de 1, las cavidades conteniendo algunas larvas muertas y otras severamente impedidas para crecer, se les dio una clasificación de 2, las larvas vivas pero sin dejar que crezcan se clasificaron como 3 y las cavidades de muestra que no contienen ninguna larva muerta se les dio una clasificación de 4. Las clasificaciones se promediaron entre réplicas dentro de cada muestra. Los resultados se resumen en los Tablas 2 y 3. Tabla 2: Clasificación de AQ713 Contra Caldo Completo de Plagas de Insectos C. Gusano de Gusano de Mosca de Control Control elegans la raíz remolacha fruta positivo Negativo del maíz Medio 2 NT 1 . 0 4 . 0 4 . 0 1 . 0 4 . 0 Medio 3 NT 2 . 0 4 . 0 4 . 0 1 . 0 4 . 0 NT= no probado Tabla 3: Clasificación de AQ713 Contra Sobrenadante de Plagas de Insectos ('. Susano de Gusano de MO.S.M Cuchara 'ti... 'ontrol ..ntroi i i/jn.': la raíz remolacha de alemana osi i o .-.jdtivo del maíz fruta Midió 2 4.0 3.0 4.0 4.0 4.0 1.0 4.0 Medio 2 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 ] .0 4.0 Estas pruebas muestran que AQ713 fue activo en ambos medios como un cultivo de caldo completo, con la mejor actividad en el medio 2. El sobrenadante solo fue activo cuando se desarrollo AQ713 en el medio 2. Ejemplo 3 Propiedades Quimicas del Metabolito Activo AQ713 Contra el Gusano de la Raíz del Maíz Se desarrollaron en el medio 2 50 mi de AQ713. A cada cultivo se le agregó 50 mi de acetato de etilo y la mezcla se agitó en un embudo de separación durante 2 minutos.

La capa acuosa se removió y la capa orgánica se recogió en una botella conteniendo sulfato de magnesio. El filtrado orgánico después se filtró en un matraz de fondo redondo y el solvente se removió en un vaporizador giratorio. Para el bioensayo, el extracto orgánico seco se vuelve a disolver en 2.5 mL de acetona. Se removió una alícuota de 40 µL y se diluyó con 800 uL con 70% de acetona/agua. Esto es una concentración de 10X del extracto orgánico. Se realizaron dilusiones en serie para obtener muestras en el gusano de la raíz del maíz neonato con el porcentaje de mortalidad registrado de larvas neonatas. Uno por cavidad en una placa de microtitulación como se preparó anteriormente) después de 7 días. Los resultados se presentan en la Tabla 4. Tabla 4: Actividad de Extracto de Acetato de Etilo de AQ713 Contra el Gusano de la Raíz del Maíz Muestra % de Mortalidad AQ713 Extracto orgánico 10X 89 Extracto orgánico 5X 93 Extracto orgánico IX 65 Caldo entero 100 70% de agua/acetona 27 agua 59 Los resultados muestran que AQ713 produce un metabolito extraíble con solvente que aniquila los gusanos de la raíz del maíz. Para determinar la escala de peso molecular del metabolito activo, se desarrollaron en el medio 2 50 mi de cultivo de AQ713. Uno mi se colocó en un tubo de centrífuga y se hizo girar a 12,000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se removió, se colocaron 500 microlitros de sobrenadante sobre la parte superior de un filtro de centricon de 10,000 dantons de peso molecular. Esto se centrifugo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (12,000 rpm durante 35 minutos). El filtrado se recogió y el retentato se recuperó a través de centrifugación y se lavó el filtro. Las muestras del sobrenadante filtrado y retentato se probaron contra las larvas del gusano de la raíz de maíz neonata (placas de 96 cavidades con dieta de insecto, Marrone et al., supra como en lo anterior; 40 uL de la muestra por cavidad y 8 cavidades por cada muestra, una larva/cavidad) . Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 5. Tabla 5: Corte de Peso Molecular de AQ713 Por ciento de Mortalidad Contra Gusano de la Raíz del Maíz AQ713: sobrenadante 43 Filtrado 63 Retentato 17 Los resultados muestran que el sobrenadante y el filtrado fueron activos, de esta manera el peso molecular del metabolito es menor que 10,000 daltons. Ejemplo 4 Propiedad químicas de metabolito AQ713 contra patógenos de planta Se desarrollaron en el medio 2 50 mi de AQ713. A cada cultivo se le agregaron 50 mi de acetato de etilo y la mezcla se agitó en un embudo de separación durante 2 minutos.

La capa acuosa se removió y la capa orgánica se recogió en una botella conteniendo sulfato de magnesio. El filtrado orgánico después se filtró en un matraz de fondo redondo y el solvente se removió en un vaporizador giratorio. Para el bioensayo, el extracto orgánico seco se volvió a disolver en 2.5 mi de acetona. Se removió una alícuota de 40 uL y se diluyó con 80 uL con 707 de acetona/agua. Esto es una concentración 10X del extracto orgánico. Se condujo un ensayo de placa de 96 cavidades (descrito más adelante) de patógeno de planta con Pythium ul timun y Botrytis cinérea para determinar la actividad del extracto orgánico. El caldo entero dio 100?; de control (clasificación de 1), pero el extracto orgánico 10X no dio ningún control de los patógenos de dos plantas (clasificación de ) . Esto indica que los antibióticos activos, a diferencia de los metabolitos activos del gusano de la raíz del maíz producidos a través de AQ713 no son extraíbles en un solvente orgánico tal como acetato de etilo. La prueba adicional proporcionó el aislamiento del compuesto novedoso, agrastatina A. Se hizo un extracto de butanol del caldo de fermentación extrayendo primero dos veces el caldo con un volumen igual de acetato de etilo y separando las capas. La fracción acuosa después se extrajo dos veces con un volumen igual de butanol. Los extractos de butanol se combinaron y el solvente se removió con un evaporador giratorio. Se obtuvo un polvo a través de secado por congelación dando como resultado el extracto. El polvo se disolvió en 80% de acetonitrilo/agua y se le aplicó sonido. La solución fue aplicada a un cartucho de extracción de fase sólida C-18 (SPE) que había sido activado con metanol y equilibrado con 80 de acetonitrilo/agua. El cartucho SPE se eluyó con 80?. de ACN/agua y este eluyente se recogió y los solventes se removieron. El eluyente se purificó a través de HPLC. Se utilizó una columna de C-18 HPLC (1 cm X 25 cm) (detección de UV a 210 nm) con acetonitrilo más 0.05% de TFA/agua más 0.05% del gradiente de solvente de TFA como sigue: 0-20 minutos, 33% ACN; 20-30 minutos, 40% ACN; 30-45 minutos, 45-55?, ACN; y 45-63 minutos, 55% ACN. Un cromatograma de HPLC de AQ713 muestra la presencia de iturinas, compuestos de tipo iturina (plipastatinas y agrastatinas) y sufactinas. Ver Figura 1.

Las inturinas A2, A3, A , A7 y A6 fueron identificadas a través de la combinación de los datos de RMN y los datos de espectrometría de masa LC y comparación con valores de literatura. Las surfactinas fueron identificadas a través de comparación con los estándares de surfactina comparada mediante HPLC y mediante espectroscopia de masa LC . Los compuestos del tipo iturina se determinaron como una mezcla de plipastatinas y las agrastatinas novedosas a través de una combinación de análisis de aminoácido y espectrometría de masa LC . Los datos RMN extensos también fueron recopilados para uno de los compuestos novedosos (HPLC pico 20) , designado como agrastatma A. Se encontró que la agrastatma A contiene los siguientes aminoácidos: Thr; 3 Glu; Pro; Ala; Val; 2 Tyr; y Orn. Este desarrollo difiere de plipastatina A por la presencia de Val y la pérdida de lie. El peso molecular de agrastatina A se determinó como 1448, el cual corresponde a la siguiente estructura: La naturaleza de cadena recta de la porción de ácido graso se confirmó a través de XH RMN. La posición de los aminoácidos en el péptido cíclico se determinó a través de análisis detallado de los grupos de datos TOCSY y ROESY. La espectroscopia de masa y el análisis de aminoácido de agrastatina B (HPLC pico 26) sugieren que su estructura es similar a plipastatma B2 con la sustitución del residuo Ala con Val. La estructura se muesrra a continuación : CH3CH2CH (CH2)10-CH-CH2-CO-Glu-Orn-Tyr.Thr-Glu-Val-ProGln-tyr-Va! CH3 OH Ejemplo 5 Actividad de AQ713 Contra Patógenos de Planta en Cultivos in vitro (placa de 96 cavidades) Para determinar si AQ713 es efectivo contra los hongos, Phytophthora infestans , Pythium ul timum, Botrytis cinérea , Rhizoctonia solani , Al ternarla solani , se realizaron los siguientes experimentos. Se llenaron placas de 96 cavidades (de fondo plano, 400 microlitros por cavidad, marca Nunc) con un medio de agar (agar de dextrosa de papa) (PDA, Difco) . Se desarrollaron cultivos Phytoph thora infestans durante tres días en el medio YPG-1 líquido (0.4 g de levadura, 0.1'. KH2P0, 0.5% MgS04 X 7 H20, 1.5% glucosa). Para los otros hongos, se rasparon esporas de la superficie de placas de petri y alícuotas de 0.1-0.2 mL de agua desionizada y la suspensión de esporas (concentración de aproximadamente 2 X 106 esporas/mL) de patógeno se extendieron sobre el agar. Se desarrollo AQ713 durante 72 horas en el medio 2 ó 3 como se describió en el Ejemplo 2. Para obtener los sobrenadantes, el cultivo de caldo entero se centrifugó a 5200 rpm durante 20 minutos. Los patógenos de la planta fúngica fueron colocados en pipeta en las placas de 96 cavidades (8 cavidades/patógeno). La presencia o ausencia del desarrollo de hongos se registró para cada una de las 8 cavidades. Aproximadamente 40 uL del sobrenadante AQ713 o 20 uL del caldo entero se agregaron a cada cavidad. Una clasificación de "1" Representa una inhibición completa del crecimiento de hongos. Una clasificación de "4" significa ninguna inhibición de desarrollo de hongos. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Tabla 6 Inhibición In Vitro del Crecimiento de Hongos (Placa de 96 cavidades) Sobrenadante AQ713 Medio 2 Medio 3 Clasificación Clasificación Phytoph thora infestans 1 1 Pythíum ul timum 1 1 Botrytis cinérea 1 1 Rhi zoctonia solani 4 1 Al ternarla solani 1 1 Caldo Entero de AQ713 Col letotrichum cocodes 1 NT Al ternarla brassicicola 1 NT Botrytis cinérea 1 NT Cladospori um cucumerinum 1 NT Monil inia fructicola 1 NT Venturia pyrina 1 NT Al ternarla solani 1 NT NT No probado Los resultados muestran que AQ713 tuvo un amplio espectro fungicida in vi tro y que tanto el caldo entero como el sobrenadante son altamente activos. El sobrenadante fue activo sobre Rhizoctonia solani en el medio 3 pero no en el medio 2. Ejemplo 6 Actividad de A 713 Contra Patógenos de Planta en Cultivo in vitro (ensayo de zona) Para determinar la actividad de AQ713 en un ensayo de difusión de agar (zona), se extendieron esporas de patógeno de plantas sobre la superficie de agar de dextrosa de papa en cajas de petri de 10 cm. Se removieron cavidades de 7.0 mm del agar, si colocaron en la cavidad 100 uL de la muestra del sobrenadante de Aq713 desarrollado en el medio 2. El sobrenadante se preparó centrifugando a 4200 rpm durante 40 minutos. El sobrenadante después se hizo girar otra vez a 4200 rpm durante otros 40 minutos. Los resultados típicos consistieron de una zona sin crecimiento y/o crecimiento reducido del patógeno alrededor de la cavidad. El tamaño de la zona en milímetros se midió y se registró. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7 : Inhibición In Vitro del Crecimiento de Patógeno de Planta Fúngico (Prueba de Zona) Al ternarla Botrytis Monil inia Sobrenadante AQ713 brassicicola cinérea fructicola Tamaño de zona (mm) 16 23 !4 Caldo entero de AQ713 22 15 18 Ejemplo 7 Actividad de AQ713 Contra Patógenos de Planta Bacterianos Se realizó un ensayo de difusión de agar estándar como en el Ejemplo 6. Se extendió una capa de cada patógeno bacteriano sobre la superficie de una caja de petri. Se colocaron en cada cavidad 100 uL del medio entero de AQ713 desarrollado en el medio 2. El tamaño de la zona se midió en milímetros . Tabla 8: Inhibición In Vitro de Patógenos de Planta Bacterianos (Prueba de Zona) AQ713 caldo completo Zona de Inhibición (mm) Acidovorax avenae subs . Ci trull i 18 Pseudomonas syríngae pv. Toma to 11 Xanthomonas campestris pv . Campestris 18 Erwinia carotovora subs. Carotovora 11 Clavibacter míchiganense subs. Michiganense 22 El AQ713 fue activo contra todas las especies de patógenos de plantas bacterianos probados in vi tro .

Ejemplo 8 Actividad de A 713 contra Patógenos de Planta en Pruebas de Planta Se probó la actividad de AQ713 contra moho gris, Botrytis cinérea , en larvas de frijoles y geranio, Alternarla solani en sembradíos de jitomate y moho suave de lechuga Bremia la ctucae . Para A . solani, se rociaron sembradíos de jitomate en la etapa de hoja 2-3 plantadas en 6 paquetes para operar con caldo en entero de AQ713 (medio 2) . Después de rociar, las siembras se dejaron secar (aproximadamente 1.5 horas). Las siembras después se rociaron con 5.0 x 104 esporas/ml. Las siembras se cubrieron con un domo de plástico y se mantuvieron a 28°C en un incubador Percival . Se utilizo agua sin nada de AQ713, con y sin esporas del patógeno como un control negativo y un control de patógeno positivo. Después de cuatro días la prueba estuvo lista. En el control de A . solani de agua, existieron lesiones uniformes sobre todas las hojas y las cotiledóneas se desprendieron y se infectaron severamente (clasificación de 5= infección completa, sin control) . Las plantas tratadas con AQ713 tuvieron pocas lesiones ligeras sobre las hojas verdaderas. Las cotiledóneas se unieron pero con pequeñas lesiones (clasificación de 1) El control negativo no fue infectado.

Se realizó una segunda prueba utilizando siembras de jitomate separadas (tallos rotos al nivel de la tierra) se colocaron en recipientes llenos de agua colocados bajo domos y almacenados como se hizo anteriormente. Las plantas fueron rociadas como se hizo anteriormente y se registraron los síntomas de A . solani después de cuatro días. No se vieron síntomas en el control negativo. En el control positivo, existieron lesiones uniformes sobre los sembradíos. El tratamiento con AQ713 se clasificó como 1 (pocas o ninguna lesión) . Dos días después, las plantas en el control positivo fueron destruidas, pero los sembradíos tratados con AQ713 quedaron virtualmente limpios y se vieron iguales a los controles negativos (plantas rociadas con agua) . Para la prueba en Botrytis cinérea , las primeras hojas verdaderas de una planta de frijol se curaron comprimiendo la boca de un tubo de cultivo de 13 X 100 sobre cada hoja. Cada hoja recibió dos heridas/hoja. Las hojas se rociaron con caldo entero de AQ713 (medio 2) o solamente agua o solamente patógeno. Cuando se secaron, otra vez se rociaron con esporas de B . Cinérea (0.8 X 10° esporas/ml). Las placas se colocaron en cubiertas planas cubiertas con domos de plástico y almacenadas a 18-20°C en un incubador Percival. Cinco días después, el control positivo (solo patógeno) se pudrió en un área de aproximadamente 25 mm de diámetro. El control negativo (solamente agua) no se pudrió. El AQ713 no mostró ninguna infección en 7 de los 8 círculos en donde se hirieron las hojas. La única que fue infectada tuvo una ligera infección en dos sitios alrededor del círculo. Para la prueba de Bremia , se plantaron semillas de lechuga en una capa de mezcla de cultivo esterilizada conteniendo turba, perlita y vermiculita en un condominio de planta de plástico limpio pequeño con una altura y una anchura de aproximadamente 8 centímetros. Después de que la lechuga germina (una semana) , las siembras de la lechuga se rociaron con un caldo de AQ713 o muestra de sobrenadante. Las plantas se dejaron secar y después se roció una suspensión de esporas de moho blando de las siembras de lechuga infectadas sobre la siembra. Las cubiertas de plástico se colocaron sobre las plantas y se incubaron a 18-20°C en un incubador Percival. Una semana después la prueba se evaluó. AQ713 no evitó el moho blando de Bremia en lo sembradíos de lechuga. Ejemplo 9 Eficacia de AQ713 Contra Enfermedades de Planta (Prueba de Invernadero) Moho Blando de Uvas Se desarrolló AQ713 en un medio a base de soya en un termentador de 400 litros durante 48 horas. Las plantas de uva (cultivo Chardonnay) se rociaron con un aspersor manual para operar con el caldo entero de fermentación de 400 litros diluida con agua estéril a concentraciones de 0.5X y 0.25X.

Cuando el follaje se secó, las plantas se rociaron una segunda vez. Después del secado, las plantas fueron inoculadas con el patógeno que causa moho blando en Id uva, Plasmopara vi ticola . Se trataron 3 plantas para cada dosis. Cada planta se evaluó estimando el porcentaje de control de enfermedad con base en una escala de 0 a 100% de control. Un 100% de control es una planta sin lesiones visibles. Se utilizó un fungicida químico, metalaxilo, para comparación. Los resultados fueron como sigue: Caldo entero de AQ713 0.5X 97.7% de control Caldo entero de AQ713 0.25X 1007, de control Metalaxilo 30 ppm 1007 de control Metalaxilo 10 ppm 98.3% de control Metalaxilo 1 ppm 807 de control Los resultados demuestran que AQ713 efectuó el control de moho blando en uvas así como el fungicida químico. Ejemplo 10 Eficacia de AQ713 Contra Moho en Polvo de Calabaza Se desarrolló AQ713 en un medio a base de soya en un fermentador de 400 litros durante 48 horas. Se rociaron plantas de calabaza (Crookneck and Acorn) con un aspersor manual para operar con el caldo entero a partir de la operación de fermentación de 400 litros y una muestra diluida con agua estéril a 0.5X de concentración. Después de secar, las plantas fueron inoculadas con el patógeno de moho en polvo de calabaza, sphaerotheca ful ginea . Dos plantas Lueron tratadas para cada dosis. El polvo secado por aspersión del caldo entero también se probó. El caldo de fermentación de 400 litros se roció para remover el agua. Se rociaron soluciones en polvo seco de aspersión de 10% y 2.5% sobre las plantas para operar como se hizo anteriormente. Se clasificó la incidencia de enfermedad de moho en polvo en una base de 0 a 5. El número 5 se valora como 100% de enfermedad, mientras que la clasificación 0 es ninguna enfermedad. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 9. Tabla 9 El caldo entero de AQ713 y el polvo seco por aspersión proporcionaron un control absolutamente completo del moho en polvo de calabaza. Ejemplo 11 Eficacia de AQ713 en Plaga Tardía, Mantillo Gris, Moho en Polvo de Uva, Moho en polvo de Cereal, Plaga de Vaina y Reventamiento de Arroz en el Invernadero Se desarrolló AQ713 en un medio a base de soya durante 72 horas en un matraz de agitación de 250 mL . La enfermedad, el patógeno de causa y el huésped se elistan en la Tabla 10 a continuación. Este cultivo de caldo entero se probó en plantas como se muestra en la Tabla 11 más adelante . Tabla 10 Cada caldo se roció para operar a una concentración de IX sobre las plantas de muestra con un aspersor manual, seguido por secado y después rociado una segunda vez. Se trataron tres plantas para cada enfermedad y tratamiento. Después del secado, las plantas fueron inoculadas con los patógenos, cada planta se evaluó estimando el porcentaje de control de enfermedad con base en una escala de 0 a 100% de control. 100% de control se refiere a una planta que no tiene lesiones visibles. Se utilizaron fungicidas químicos para la comparación. El índice de enfermedad es la severidad de la enfermedad en el control no tratado. Tabla 11 AQ713 mostró actividad que fue equivalente a fungicidas químicos en todos los patógenos probados. Ejemplo 12 Eficacia de AQ713 Contra Moho Moderado de Brassica Se desarrolló AQ713 de la cepa bacill us en un termentador de 10 litros en un medio a base de soya durante 48 horas. El cultivo de caldo entero a una resistencia de IX se roció sobre plantas con manchas de coliflor y de brúcelas de 3 semanas de edad en la etapa total de cotiledónea con un cepillo de aire de artista activado a través de aire comprimido. Se rociaron por tratamiento 3 réplicas de 15-25 siembras/recipiente. Quadris™ un fungicida de azoxistrobina de Zeneca, también se roció sobre las plantas (tres por tratamiento) a velocidades de 250 ppm y 125 ppm. Una suspensión de espera de moho moderado, Peronospora parasí tica , a 1-5 X 104 esporas/mL se roció sobre las plantas de Brassi ca después de que se secaron por rociado AQ71 í . Las plantas se mantuvieron a 15-17 °C durante 24 horas para infección, después las siembras se incubaron a 20-24°C durante 6 días. Los recipientes fueron regresados a 15-17°C durante la noche para permitir la esporulación del patógeno hasta que se evaluó la prueba. Cada planta fue evaluada estimando el porcentaje de control de enfermedad con base en una escala de 0 a 100% de control. Un 100% de control es una planta que no mostró lesiones de esporulación. Los resultados promediados a través de recipientes por réplica, se muestran a continuación en la Tabla 12. Tabla 12 NT = No Probado AQ713 controló efectivamente el moho blando durante Ejemplo 13 Sinergismo de AQ713 y un Fungicida Comercial Se desarrolló AQ713 en un termentador de diez litros en un medio a base de soya durante 72 horas. El cultivo bacteriano se diluyó con agua estéril a concentraciones de 0.5X y 0.25X. El cultivo a concentraciones de IX, 0.5X y 0.25X se roció sobre plantas de pimienta de tres semanas de edad con un cepillo de aire artístico activado mediante aire comprimido. Se rociaron por tratamiento tres plantas. Quadris™, un fungicida de azoxistrobina de Zeneca, también se roció sobre las plantas (tres por tratamiento) a concentraciones de 500 ppm, 250 ppm y 125 ppm. Además, combinaciones de Quadris más el cultivo de caldo entero de AQ713 en una relación de 1:1 se rociaron sobre las plantas de pimienta (3 por tratamiento) . Los tratamientos con y sin Quadris se presentan en la Tabla 13 a continuación. Una suspensión de espora de Botrytis cinérea , mantillo gris, a 1 x 105 esporas/mL se roció sobre las plantas de pimienta después de secar las aspersiones con AQ713 y Quadris. Las plantas se mantuvieron a 20-22°C durante 3 días hasta que la prueba se evaluó. La incidencia de enfermedad por mantillo gris se evaluó en una escala de 0 a 5. La clasificación de 5 indica 100% de enfermedad, mientras que la clasificación de 0 indica nada de enfermedad. Los resultados se muestran en la Tabla 13 a continuación.

Tabla 13 Los resultados claramente muestran que las combinaciones de Quadris y AQ713 enfermedad de mantillo gris de control, significativamente son mejores que Quadris o AQ713.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES 1. Un cultivo puro, aislado de la cepa Ba us s ubtil is AQ713, NRRL No. de Acceso B21661 y sus mutantes.
2. 2. El metabolito producido a través de la cepa Ba cill us subtil is de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque exhibe actividad contra el gusano de la raíz de maíz, es un solvente extraíble y tiene un peso molecular menor que 10,000 daltons.
3. 3. El sobrenadante obtenido a partir de un cultivo de la cepa Ba cill us subtilis AQ713 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque exhibe actividad antifúngica y antibacteriana y actividad contra el gusano de la raíz del maíz.
4. 4. La composición caracterizada porque comprende el cultivo de caldo entero de la cepa Bacillus subtílis AQ713 de conformidad con la reivindicación 1, y un fungicida químico.
5. 5. La composición caracterizada porque comprende el cultivo de caldo entero de la cepa Bacillus subtil is AQ713 de conformidad con la reivindicación 1 y un pesticida biológico o químico.
6. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además un fungicida químico.
7. 7. La composición caracterizada porque comprende un metabolito de conformidad con la reivindicación 2 y un fungicida químico.
8. 8. La composición caracterizada porque comprende el metabolito de la reivindicación 2 y un pesticida biológico o químico .
9. 9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende además un fungicida químico.
10. 10. La composición caracterizada porque comprende el sobrenadante de la reivindicación 3 y un fungicida químico .
11. 11. La composición caracterizada porque comprende el sobrenadante de conformidad con la reivindicación 3 y un pesticida biológico o químico.
12. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque comprende además un pesticida químico.
13. 13. El método para proteger o tratar plantas y frutas de infecciones fúngicas y bacterianas y de plagas por gusanos de la raíz de maíz, caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva de la cepa Bacil l us subti l is de conformidad con la reivindicación 1.
14. 14. El método para proteger o tratar plantas y frutas de infecciones fúngicas y bacterianas y de plagas del gusano de la raíz del maíz caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva del metabolito de conformidad con la reivindicación 2.
15. 15. El método para proteger y tratar plantas y fruta de infecciones fúngicas y baterianas y plagas por gusano de la raíz del maíz caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva del sobrenadante de conformidad con la reivindicación 3.
16. 16. El método para proteger o tratar plantas y frutas de infecciones fúngicas y bacterianas y de plagas de gusano de la raíz del maíz caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva de la composición de conformidad con las reivindicaciones 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 13, 14 ó 15, caracterizado porque las infecciones son causadas al menos por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de Phytoph thora infes tans , Rhizoctonia solani , Pythium ul timum, Botrytis cinérea , Al ternarla solani , Colletotrichum cocodes, Al ternarla brassicicola , Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola , Venturia pyrina , Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae , Xanthomonas campestris , Erwinia carotovora , Clavibacter michiganense, Plasmopara vi tícola , Sphaerotheca fuliginea , Uncinula neca tor, y Peronospora parasí tica .
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las infecciones son causadas al menos por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de Phytophthora infestans , Rhizoctonia solani , Pythium ul timum, Botrytis cinérea , Al ternarla solani , Colletotrichum cocodes, Al ternarla brassicicola , Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola , Ven turia pyrina ,
19. Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris , Erwinia carotovora , Clavibacter michiganense, Plasmopara vi tícola , Sphaerotheca fuliginea , Uncinula neca tor, y Peronospora parasí tica . 19. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la cepa Ba cill us subtilis AQ713 es aplicada como un cultivo de caldo entero.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la cepa de Ba cill us subtil is AQ713 es aplicada como un sobrenadante.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la cepa de Ba cill us subtil is AQ713 es aplicada como polvos humectables, granulos, productos fluibles o microencapsulaciones .
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la cepa de Bacill us subtil is AQ713 es aplicada como polvos humectables, granulos, productos fluibles o microencapsulaciones.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 13, 14 ó 15, caracterizado porque las raíces de plantas o la tierra alrededor de las raíces son tratadas.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las raíces de las plantas o la tierra alrededor de las raíces son tratadas.
25. 25. Un compuesto que tiene la fórmula: R?-CH-CH2-CO-Glx-Orn-Tyr-thr-Glx-X-Pro-Glx-Tyr-Val 0R2 O caracterizado porque Rx es una cadena lateral alifática ramificada o recta de C8-C20; X es Val, R2 es un acetato o un derivado de éster y Glx es Gln o Glu.
26. 26. Un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula : CH3(CH2)i2-CH-CH2-CO.Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Val OH O
27. 27. Un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula CH3CH2CH(CH2)?o-CH-CH2-CO-Glu-Orn-Tyr.Thr-Glu-Val-Pro-Gln-Tyr-Val
28. 28. Un compuesto caracterizado porque comprende iturina tipo A, una plipastatina, un agente tensioactivo y una agrastatina.
29. 29. El método para proteger o tratar plantas y frutas de infecciones fúngicas y bacterianas y plagas de gusano de la raíz del maíz, caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva de la composición de conformidad con las reivindicaciones 25, 26, 27 ó 28.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque las infecciones son causadas al menos por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de Phytophthora infestans , Rhizoctonia solani , Pythium ul timum, Botrytis cinérea , Al ternarla solani , Colletotrichum cocodes, Al ternarla brassicicola , Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola , Ven turia pyrina , Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris , Erwinia carotovora , Clavibacter michiganense, Plasmopara vi tícola , Sphaerotheca fuliginea , Uncinula neca tor, y Peronospora parasítica .
31. 31. El método para proteger o tratar plantas de plagas por gusanos de la raíz del maíz caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 25, 26, 27 ó 28 a las raíces de las plantas o a la tierra alrededor de las raíces. RESUMEN La presente invención se refiere a una cepa novedosa de Ba cill us subtilis de producción de antibiótico y producción de metabolito que exhibe actividad insecticida, antifúngica y antibacteriana. El sobrenadante de esta cepa novedosa contiene agentes efectivos insecticidas, antifúngicos y antibacterianos. También se incluye en la invención un solvente extraible, un metabolito activo en el gusano de la raíz del maíz con un peso molecular pequeño (<10,000 daltons) producido en el sobrenadante. También se incluyen en la invención métodos para proteger o tratar plantas de infecciones fúngicas y bacterianas y plagas por gusano de la raíz del maíz, que comprende el paso de aplicar a la planta una cantidad efectiva de la cepa de Ba cill us subtil is novedosa de producción antibiótica/metabolito, el antibiótico/metabolito producido por la cepa novedosa de Bacill us subtil is o una combinación del mismo, opcionalmente además comprende otra cepa bacteriana de producción de antibiótico y/o un pesticida químico. La invención también incluye métodos para prevenir o evitar infecciones fúngicas y bacterianas utilizando cultivos de caldo entero o sobrenadantes obtenidos de cultivos de la cepa novedosa de Ba cill us subtil is solos o en combinación con pesticidas químicos y/u otros agentes de biocontrol . La invención también incluye compuestos novedosos antifúngicos y antibacterianos designados como agrastatinas y una composición novedosa que comprende una iturina de tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina. También se proporcionan métodos para tratar o proteger plantas de infecciones fúngicas o bacterianas y plagas por gusanos de la raíz del maíz que comprenden administrar las agrastatinas novedosas y la combinación novedosa que comprende una iturina de tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina .