CZ302152B6

CZ302152B6 - Nový kmen Bacillus pro kontrolu onemocnení rostlin a napadení brouky rodu Diabrotica

Info

Publication number: CZ302152B6
Application number: CZ0375799A
Authority: CZ
Inventors: Darlene Heins@Sherry; Carol Manker@Denise; Rito Jimenez@Desmond; Jay McCoy@Randy; Ensio Orjala@Jimmy; Gail Marrone@Pamela
Original assignee: Agraquest, Inc.
Priority date: 1997-05-09
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 2010-11-18
Also published as: CA2289916C; DE69835206T2; PL336716A1; IL132533A0; JP2001507237A; BG103855A; ATE332915T1; NZ500506A; MX214455B; TW592639B; PL198772B1; US6060051A; JP3471815B2; KR100616372B1; TR199902765T2; WO1998050422A1; MX244069B; SK149099A3; IL132533A; IL173027A0

Abstract

Kmen Bacillus subtilis, který produkuje antibiotika a metabolity mající insekticidní, antifugální a antibakteriální aktivitu. Supernatant tohoto nového kmene obsahuje úcinná insekticidní, antifugální a antibakteriální agens. Zpusob ochrany nebo lécby rostlin v prípade houbových a bakteriálních infekcí a napadení brouky rodu Diabrotica aplikací prostredku obsahujících produkty získané z kultur samotného nového kmene Bacillus subtilis nebo v jeho kombinaci s chemickými pesticidy a/nebo jinými agens biologické kontroly.

Description

Nový kmen Bacillus pro kontrolu onemocnění rostlin a napadení brouky rodu Diabrotica

Oblast techniky

Tato přihláška vynálezu se týká oblasti biopesticidů. Specifičtěji se tato přihláška týká zjištění, že nový kmen Bacillus subtilis AQ173 inhibuje radu houbových a bakteriálních onemocnění rostlin a rovněž vykazuje aktivitu proti broukům rodu Diabrotica (čeleď - mandelinkovití).

io ’ Přihláška vynálezu se rovněž týká íungicidních, baktericidních a insekticidních prostředků obsahujících tento nový kmen Bacillus subtilis spolu s antibiotiky a metabolity produkovanými tímto kmenem, které jsou použity samotné nebo v kombinaci s jinými chemickými a biologickými pesticidy.

Dosavadní stav techniky

Mnoho let je známo, že různé mikroorganismy vykazují biologickou aktivitu, takže jsou užitečné při potlačování onemocnění rostlin. Ačkoli byl učiněn pokrok v oblasti identifikace a vývoje bio20 logických pesticidů pro kontrolu různých onemocnění rostlin, důležitých z hlediska agronomického i zahradnického, představuje většina dosud používaných pesticidů syntetické látky. Mnoho z těchto chemických fungicidů je klasifikováno EPA jako karcinogeny, které jsou toxické pro organismy v přírodě i jiné druhy. Kromě toho mohou patogenní mikroorganismy vyvinout odolnost k chemickým pesticidům (viz např. Schwinn et al., str. 244, Advances in Plant Pathology.

Phytophtora infestans, the cause of latě blight of potato (Academie Press, San Diego 1991).

Každoročně jsou použity chemické pesticidy v ceně 250 až 300 milionů dolarů k zabránění škod působených brouky rodu Diabrotica. Řada z těchto chemických pesticidů jsou látky, které jsou toxické pro člověka, organismy v přírodě i ostatní druhy. Některé z těchto látek byly objeveny i v povrchových vodách. Vývoj nových chemických insekticidů vyžaduje náklady ve výši 100 milionů dolarů.

Biologická kontrola představuje přitažlivou alternativu k syntetickým chemickým fungicidům. Biopesticidy (živé organismy a látky těmito organismy přirozeně produkované) mohou být bez35 pečnější, lépe biodegradovatelné a méně nákladné z hlediska vývoje a výroby.

Selekční programy identifikovaly některé kmeny Bacillus spp. (Bacillus spp. zahrnuje B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis), které vykazují antifungální aktivitu. (Viz např. Stabb et al. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 60: 4404—4412). Ukázalo se, že tyto kmeny produkují zwit40 termicin-A a/nebo kanosamin (Milner et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 3061-3066), dvě antibiotika, která jsou účinná proti půdnímu onemocnění projevujícímu se vadnutím rostlin z přebytku vláhy, která je vyvolávána Phytophtora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum nebo Sclerotinia minor (viz výše Stabb et al.) Zwittermicin-A je ve vodě rozpustná lineární aminopolyolová molekula stálá v kyselém prostředí (viz He et al. (1994) Tetra. Lett. 35 (16)

2499-2502).

US Patent 5049379 udělený Handelsmanovi a spolupracovníkům popisuje jak zwittermicin-A vyvolává vadnutí rostlin z přebytku vláhy u vojtěšky a sóji. Jestliže bylo semeno pokryto vrstvou B. cereus ATCC 53522, byla patogenní aktivita houby způsobující hnilobu kořenů potlačena.

Podobně aplikace prostředků založených na sporách určitých kmenů B. cereus na semena sóji nebo na půdu obklopující tato semena se ukázala zlepšovat úrodu sójových bohů na poli. (Viz Osbume et al. (1995) Am. Phytopathol. Soc. 79 (6): 551—556). Metody aplikace biopesticidů jsou v oboru dobře známy a například zahrnují zvlhčovači prášky, přípravky v tekuté formě, účinná agens v podobě raikrokapsulí, a tekuté nebo pevné prostředky antibiotických frakcí vhodných

-1 CZ 302152 B6 kultur. (Viz např. US Patent 5061495 udělený Rossallovi nebo US Patent 5049379 udělený Handelsmanovi).

Smith et al. (1993) Plant Disease 77 (2) 139-142 ukázal, že aktivita vzduchem přenášené houby Pythium aphanidermatům, která vyvolává vatovitou mokrou hnilobu okurek, může být potlačena použitím kmene B. cereus UW85, který produkuje zwittermicin. Leifert et al. (1995) J. Appl. Bacteriol. 78: 97-108 popsali produkci antibiotik působících proti Botrytis a Altemaria dvěma kmeny bacillů, B. subtilis CL27 a B. pumilis CL45. Celé médium a bezbuněěné filtráty byly aktivní proti houbám Botrytis a Altemaria v testech in vitro i proti Botrytis v malých in vivo rostlinných testech používajících Astilbe. Leifert et al. (1997) US Patent 5597565 popisuje B. subtilis, B. pumilis a B. polymyxa, které jsou zvlášť účinné při potlačení hub vyvolávajících posklizňové onemocnění. Tito autoři rovněž popsali přítomnost antibiotik přítomných v bezbuněčném filtrátu kultury a jejich aktivitu při různých hodnotách pH, avšak tyto sloučeniny neidentifikovali.

Rossall (1994) US Patent 5344647 popisuje kmeny B. subtilis s širokou antifungální aktivitou. Sholberg et al. (1995) Can. J, Microbiol. 41: 247-252, Swinbume et al. (1975) Trans. Brit. Mycol. Soc. 65: 211-217, Singh and Deverall (1984) Trans. Br. Mycol. Soc. 83: 487-490 aFerreira et al. (1991) Phytopathology 81: 283-287. Baker et al. (1983) Phytopathology 73: 1148-1152 popisují použití Bacillus spp. a Bacillus subtilis jako agens pro biokontrolu houbových rostlinných patogenů. Baker et al. (1983) Phytopathology 73: 1148-1152 rovněž popisuje kmen B. subtilis s antifungálními účinky ajeho využití proti rostlinným patogenům. Pusey et al. (1988) Plant. Dis. 72: 622-626, Pusey and Robins (US Patent č. 5047239), a McKeen et al. (1986) Phytopathology 76: 136-139 popisují inhibici posklizňové hniloby plodů pomocí B. subtilis. McKeen et al. (viz výše) ukázal, že antibiotika podobná iturinovým cyklickým polypeptidům o nízké molekulové hmotnosti přispívají k této fungicidní aktivitě B. subtilis.

Liu et al. (1995) US Patent 5403583 popisují B. megaterium ATCC 55000 a způsob kontroly houbového rostlinného patogenního organismu Rhizoctonia solani. Islám and Nandi (1985) Journal of Plant Diseases and Protection 92 (3): 241-246 popisují B. megaterium s antagonismem proti Drechslera oryzae způsobujícímu hnědou skvrnitost rýže. Stejní autoři, Islám and Nandi (1985) Journal of Plant Diseases and Protection 92 (3) 233-240 rovněž popisují in vitro antagonismus B. megaterium proti Drechslera oryzae, Alternaria alternata a Fusarium roseum. Diskutují tři složky ve filtrátu kultury. Nejaktivnější antibiotikum bylo vysoce rozpustné ve vodě a v methanolu s UV maximem při vlnové délce 255 nm a vedlejším maximem při 260 nm, a ukázalo se být lipopeptidem polyoxinového typu. Cook (1987) Proceedings Beltwide Cotton Production - Mechanization Research Conference, Cotton Council, Memphis, str. 43—45) popisuje použití suspense B. megaterium ke snížení počtu bavlníkových rostlin zahubených Phymatotrichum omnivorum, které vyvolává hnilobu kořenů bavlníku.

Produkce antibiotik u B. megaterium byla zaznamenána Berdym (CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vols. I-XIV, (CRC Press, lne. Boča Raton, FL 1980-87), který popsal produkci peptidových antibiotik toxických pro nižší savce, jako jsou ansamitocin-PDM-O, bacimethrin, megacin, pentapeptid a homopeptidy.

O bakteriích rodu Bacillus se ví, že produkují sekundární metabolity s antifungálními a antibakteriálními vlastnostmi (Korzybski et al.(1978)). Vědečtí pracovníci z University of Wisconsin aComell University identifikovaly novou fungicidní sloučeninu, zwittermicin A, která je produkována Bacillus sp. (He et al. (1994) Tetra. Lett. 35 (16): 2499-2502). Další metabolit produkovaný stejným kmenem, mající rovněž fungicidní vlastnosti, byl nedávno identifikován jako známý aminocukr kanosamín (Milner et al. (1996) Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3065).

Další skupina dříve popsaných metabolitů u rodu Bacillus jsou cyklické lipopeptidy třídy iturinů, z nichž některé jsou účinná fungicidní agens. Tyto látky jsou složeny z cyklického oktapeptidu se sedmi alfa-aminokyselinami a jednou beta-aminokyselinou s alifatickým postranním řetězcem.

Ί _

Existuje několik skupin iturinů, které se liší v pořadí a složení aminokyselinové sekvence. Jsou uvedeny níže v tabulce 1. Obecně je produkována řada příbuzných molekul, rozlišených délkou a větvením alifatického aminokyselinového zbytku. Jestliže byly tyto látky testovány proti Saccharomyces cerevisiae, nejúčinnější z nich se ukázal být mykosubtilin (LC50 = lOmikrogra5 mů/mL), následovaný iturinem A a bacillomycinem L (oba LC50 = 30 mikrogramů/mL) (Beeson et al. (1979) J. Antibiotics 32 (8): 828-833). Bylo zjištěno, že mechanismus působení těchto cyklických lipopeptidů je na úrovni interakce s membránami houbových organismů, a že uvedené látky vytvářejí transmembránové kanály, kterými se uvolňují a unikají životně důležité ionty (Latoud et al. (1986) Biochem. Biophys. Acta 856: 526-535). Iturin C není aktivní proti io houbovým organismům včetně Penicillium chrysogenum (Peypoux et al. (1978) Tetrahedron 34:

1147-1152).

Tabulka 1

Struktura antibiotik skupiny iturinů

Antibiotikum	L-Asz(Xl)	X4	X5	X6	X7
Iturin A	L-Asn	L-GIn	L-Pro	D-Asn	L-Ser
Iturin C	L-Asp	L-Gln	L-Pro	D-Asn	L-Ser
Bacillomycin D	L-Asn	L-Pro	L-Glu	D-Ser	L-Thr
Bacillomycin L	L-Asp	L-Ser	L-Gln	D-Ser	L-Thr
Bacillomycin F	L-Asn	L-Gln	L-Pro	D-Asn	L-Thr
Mykosubtilin	L-Asn	L-Gln	L-Pro	D-Ser	L-Asn

R(CH₂)<r,₂CHCH₂CO-Xi-^O-Tyr -*-O-Asn

NH X7* Xg^x ^5 * ^4

R = CH_3l CH(CH₃)₂. ch₃ch₂ch ch₃

Výzkumná skupina na USDA zkoumala vztah struktury a aktivity u iturinů tím, že syntetizovali řadu analogů, které se lišily v délce aminokyselinového řetězce. Bylo zjištěno, že aktivita iturinů vzrůstala s délkou postranního řetězce mastných kyselin a s koncovým větvením v poradí iso>normální>anteiso (Bland et al. (1995) Proč. Plant Growth Regulation Soc. Am. 22^nd: 10525 107). Autoři na základě své práce s řadou kmenů Bacillus produkujících iturin rovněž uvádějí, že „množství iturinů získaných přirozenou produkcí není dostatečné z komerčního hlediska“.

Další skupina cyklických lipopeptidů izolovaných zB. cereus jsou plipastatiny. Tyto sloučeniny jsou skupinou acylovaných dekapeptidů, jejichž struktura je na obr. 1 (Nishikíori et al. (1986) J.

Antibiotics 39 (6): 755-761). Tyto sloučeniny byly původně izolovány jako inhibitory prasečí pankreatické fosfolipasy A₂ (Umezawa et al. (1986) J. Antibiotics 39 (6): 737-744), ale později se zjistilo, že inhibují některé patogenní houby způsobující onemocnění rostlin, například Botrytis, Pyricularia a Álternaria (Yamada et al, (1990) Nippon Noyaku Gakkaishi 15 (1): 95-96). Yamada rovněž popsal synergistický efekt pozorovaný mezi iturinem A a plipastatiny, z nichž oba jsou produkovány stejným kmenem B. subtilis.

Byly provedeny pokusy s cílem zlepšit výtěžky produkce iturinů během fermentace jak v tekutém mediu (Phae and Shoda (1991) J. Ferment. Bioeng. 71: 118-121); Ohno et al. (1993) J. Ferment.

-3CZ 302152 B6

Bioeng. 75: 463-465) tak i na pevném substrátu (Ohno et al. (1992) Biotech. Lett. 14 (9): 817822; Ohno et al. (1995) J. Ferment. Bioeng. 5: 517-519). Byla popsána synergie mezi blízce příbuznými surfaktiny, které jsou samy o sobě inaktivní, a ituriny, které byly produkovány stejným kmenem B. subtilis (Hiraoka et al, (1992) J. Gen. Appl. MicrobioL 38: 635-640). Byla publikována nukleotidové sekvence genu podílejícího se na koregulaci biosyntézy iturinu A asurfaktinu (Huang et al. (1993) J. Ferment. Bioeng. 76 (6): 445^150). Polní pokusy s kmeny produkujícími iturin se soustředily na aplikaci v půdě s cílem potlačit houbu Rhizoctonia (Asaka and Shoda (1996) Appl. Environ. MicrobioL 62: 4081—4085) a aplikace iturinů v polních pokusech na listy rostlin nebyla dosud popsána.

Další sloučeninou typu cyklického lipopeptidu, která je produkována B. subtilis je surfaktin, který vykazuje výjimečnou surfaktantní aktivitu (Kaninuma et al. (1969) Agric. Bioi. Chem. 33: 973-976). Surfaktin obsahuje beta-hydroxymastnou kyselinu mající v molekule 14 nebo 15 uhlíkových atomů, kteráje laktonovým kruhem vázána kheptapeptidové části molekuly mající sekvenci LLDLLDL (Arima et al. (1968) Biochem. Biophys. Res. Commun. 31: 488-494). Sandrin a spolupracovníci ((1990) Biotechnol. Appl. Biochem. 12: 370-375) nalezli kmeny B. subtilis, které produkovaly surfaktin, iturin A, bacillomyciny F a L a mykosubtilin.

Nový organismus AQ713, který byl objeven autory tohoto vynálezu, byl původně považován za kmen B. megaterium, ale nyní byl identifikován jako kmen B. subtilis. Tento kmen produkuje ituriny A, plipastatiny a surfaktiny. Produkce této kombinace lipopeptidů jedním mikroorganismem dosud nebyla popsána. Kromě toho autoři vynálezu zjistili, že kmen AQ713 rovněž produkuje nově popsanou skupinu látek nazvaných „agrastatiny“ Kombinace všech tří výše zmíněných látek s nově popsanými agrastatiny je rovněž nová.

Jedním z běžně používaných biopesticidních prostředků je grampozitivní bakterie Bacillus thuringiensis. Kmeny B. thuringiensis mající pesticidní vlastnosti, produkující během sporu láce krystalické proteiny, které jsou specificky toxické pro určité řády a druhy hmyzu a nematodů (viz např. US Patenty 4999192 a 5208017). Endotoxiny proteinové povahy, které jsou produkovány B. thuringiensis, rovněž působí jako insekticidní agens proti broukům rodu Diabrotica a jiným broukům (např. US Patent 5187091; Johnson, T. J. et al. (1993), J. Economic Entomology 86: 330-333). Endotoxiny B. thuringiensis jsou účinné v podobě purifi kovaných krystalů, promytých buněčných pelet a exprimovaných proteinů. Warren et al. (WO 96/10083) popisuje neendotoxinové proteiny, které jsou produkovány během vegetativního stadia B. cereus a B. thuringiensis. Tyto vegetativní proteiny nazvané Vipl a Vip2 vykazují vysokou účinnost proti broukům rodu Diabrotica (severnímu i západnímu) (Estruch et al. (1997) Nátuře Biotechnology 15:137-141 a Mullins et al. (1997) Appl. Environ. MicrobioL 63 (v tisku).

Jeden z termostabilních metabolitu B. thuringiensis, který byl nazván beta-exotoxin, má rovněž pesticidní vlastnosti. Burgjeron a Biache ((1979) Entomophaga 11: 279-284) popisují beta-exotoxin, který je aktivní proti mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata). Kromě toho vykazují známé beta-exotoxiny B. thuringiensis nespecifickou pesticidní aktivitu a zabíjejí nejen nematody, ale rovněž mouchy, vojnice, roztoče a brouky rodu Diabrotica. Sigma exotoxin má strukturu podobnou beta-exotoxin u a je aktivní vůči mandel ince bramborové (Argauer et al. (1991) J. Entomol. Sci. 26: 206-213). Alfa-exotoxin je toxický pro larvy Musea domestica (Cluthy (1980) FEMS MicrobioL Lett. 8: 1.7). Gama-exotoxiny jsou různé proteolytické enzymy, chitinasy a proteasy. Toxický účinek gama-exotoxinů se projeví pouze v kombinaci s betaexotoxinem nebo delta-endotoxinem (Forsberg et al. (1976),(Bacillus thuringiensis: Its Effects in Environmental Quality“ National Research Council of Canada). Stonard a spolupracovníci ((1994) ACS Symposium Series 551: 25) popsali ve vodě rozpustné sekundární metabolity aktivní proti broukům rodu Diabrotica v supematantu kultury kmene B. cereus.

Dosud nebyly popsány kmeny bacilů, které by měly jak fungicidní aktivitu, tak i byly aktivní proti broukům rodu Diabrotica. Nejsou známy žádné metabolity produkované B. subtilis, které

-4CZ 302152 B6 by měly molekulovou hmotnost menší než 10 000 a byly by extrahovatelné nepolárním rozpouštědlem.

Podstata vynálezu

Je popisován nový kmen B. subtilis produkující antibiotika a metabolity, který byl původně identifikován jako B. megaterium, který vykazuje širokou fungícidní a bakteriální aktivitu, a rovněž vykazuje aktivitu proti broukům rodu Diabrotica. Rovněž je popsán nový metabolit nového kmene B. subtilis vykazující aktivitu proti broukům rodu Diabrotica. Je rovněž popsán způsob jak léčit rostliny v případě houbových a bakteriálních infekcí a chránit je proti těmto infekcím, který zahrnuje krok aplikující účinné množství B. subtilis produkujícího antibiotikum. B. subtilis produkující antibiotikum lze používat v podobě kompletní bakteriální suspenze kultury v mediu nebo jako supematant této kultury kmene Bacillus produkujícího antibiotikum, který obsahuje toto antibiotikum. Rovněž je popsán způsob ochrany kořenů rostlin proti napadení brouky rodu Diabrotica nebo léčby v případě tohoto zamoření, který zahrnuje krok, kdy je aplikováno účinné množství kmene Bacillus subtilis produkujícího nový metabolit. Kmen B. subtilis produkující nový metabolit lze aplikovat jako kompletní suspenzi bakteriální kultury v mediu nebo jako supematant této kultury obsahující metabolit nebo jako purifikovaný metabolit připravený z kultury mikroorganismu v tekutém mediu. Rovněž jsou popsány nové sloučeniny, agrastatiny, které jsou produkovány novým kmenem AQ713, a nová kombinace sloučenin zahrnující iturin A, plipastatin, surfaktín a agrastatin.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje strukturu plipastatinových antibiotik.

Obr. 2 ukazuje HPLC chromatogram metabolitů kmene AQ713.

Způsoby provedení vynálezu

Tato přihláška vynálezu popisuje nový kmen B. subtilis AQ713, který byl původně identifikován jako B. megaterium, nebo jeho mutanty s širokou antifungální a antimikrobiální aktivitou, a novou kombinaci antifungální aktivity a aktivity proti broukům rodu Diabrotica. Tento nový kmen byl nazván AQ173 a byl uložen vNRRL 7. března 1997 podle ustanovení Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání sbírek mikroorganismů pro účely patentového postupu jako přírůstek č. B21661 (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Proceduře under Accession No. B2I661). Tato přihláška vynálezu rovněž zahrnuje způsoby zabraňující vzniku fungálních a bakteriálních onemocnění rostlin a jejich léčby s použitím těchto bakteriálních kmenů nebo supematantu jejich kultur obsahujících uvedená antibiotika nebo čistých antibiotik získaných z těchto bakteriálních kmenů. Přihláška vynálezu rovněž zahrnuje způsoby aplikace na úrovni kořenů rostlin nebo půdy s cílem potlačit larvy brouků rodu Diabrotica pomocí bakteriální suspenze kmene AQ713 nebo pomocí supernatantu kultury kmene AQ713 obsahujícího metabolity nebo pomocí purifíkovaných metabolitů kmene AQ713. Přihláška vynálezu rovněž zahrnuje metabolit, který je extrahovatelný organickým rozpouštědlem, a který vykazuje aktivitu proti broukům rodu Diabrotica a má molekulovou hmotnost nižší než 10 000 daltonů. Přihláška vynálezu dále zahrnuje nové sloučeniny, agrastatiny, které jsou produkovány novým mikroorganismem. Rovněž je zahrnuta nová kombinace představovaná iturinem A typu, plipastatinem, surfaktinem a agrastatinem.

Definice „Biologická kontrola“ používaná v přihlášce patentuje definována jako kontrola patogenu nebo hmyzu pomocí druhého organismu. Známé mechanismy biologické kontroly zahrnují enterobak-5CZ 302152 B6 terie, které působí proti hnilobě kořenů tím, že „vytěsní“ houby s nimiž soupeří o prostor na povrchu kořene. Bakteriální toxiny jako jsou antibiotika jsou používány ke kontrole patogenů. Toxin lze izolovat a přímo aplikovat na rostlinu nebo může být aplikován daný bakteriální druh, aby produkoval toxin in silu.

Termín „houba“ nebo „houby“ zahrnuje velmi různé jaderné sporulující organismy, které neobsahují chlorofyl. Příklady hub zahrnují kvasinky, plísně, sněti, rzi a kloboukaté houby.

Termín „bakterie“ zahrnuje jakýkoli prokaryontní organismus, který nemá buněčné jádro. „Fungicidní“ znamená schopnost látky zvyšovat mortalitu hub nebo inhibovat jejich růst.

„Antibiotikum“ představuje jakoukoli látku, která je schopna zabíjet nebo inhibovat mikroorganismus. Antibiotika mohou být produkována nějakým mikroorganismem nebo připravena pomocí syntetického nebo polosyntetického procesu. Termín proto zahrnuje látku, která inhibuje nebo zabíjí houby, například zwíttermicin A nebo kanosamin.

„Antifungální“ zahrnuje jakoukoli látku, která je schopna zabíjet nebo inhibovat růst hub.

Termín „kultivace“ znamená propagaci organismů v nebo na mediích různého typu. „Kompletní kultivační tekutina“ znamená tekutou kulturu obsahující jak buňky tak i medium. „Supematant“ znamená tekutinu kultury, která zůstane po oddělení buněk rostoucích v této tekutině, pomocí centrifugace, filtrace, sedimentace nebo jiného způsobu, který je v oboru dobře znám.

„Účinné množství“ je množství dostatečné pro navození požadovaného či pozitivního výsledku. Účinné množství lze podat v jedné nebo ve více dávkách. V termínech léčba (ošetření) a ochrana představuje „účinné množství“ takové množství, které je dostatečné pro zlepšení, stabilizaci, zastavení, zpomalení nebo zpoždění progrese stavu houbového nebo bakteriálního onemocnění.

V této přihlášce termín „hmyz“ zahrnuje všechny organismy třídy „Insecta-Hmyz“ „Nedospělý“ hmyz znamená jakoukoli formu organismu před dosažením dospělého stadia, například vajíčka, larvy a nymfy. „Insekticidní“ znamená schopnost látky zvyšovat mortalitu nebo inhibovat růst hmyzu. „N e matic id ní“ znamená schopnost látky zvyšovat mortalitu nebo inhibovat růst nematodů. „Pesticidní“ znamená schopnost látky zvyšovat mortalitu nebo inhibovat růst hmyzu, nematodů a roztočů.

„Pozitivní kontrola“ znamená sloučeninu, o níž se ví, že má pesticidní aktivitu. „Pozitivní kontrola“ zahrnuje komerčně dostupné chemické pesticidy, avšak není na ně omezena. Termín „negativní kontrola“ znamená sloučeninu, o níž je známo, že nemá žádnou pesticidní aktivitu. Příklady negativní kontroly jsou voda a ethylacetát.

Termín „solvent“ zahrnuje jakoukoli kapalinu, která udrží další látku v roztoku. „Solventem extrahovatelný“ znamená jakoukoli sloučeninu, která se rozpouští v solventů, a kterou potom lze ze solventů izolovat. Příklady solventů zahrnují organické solventy jako ethylacetát, avšak nejsou jimi limitovány.

Termín „metabolit“ představuje jakoukoli sloučeninu, látku nebo vedlejší produkt fermentace mikroorganismu, které mají pesticidní aktivitu. Antibiotikum, tak jak je definováno výše, je metabolitem, který vykazuje specifickou aktivitu proti mikroorganismu.

Termín „agrastatiny“ se týká skupiny nových látek, které mají následující strukturu:

-6CZ 302152 B6

RrCH-CHj-CO-Glx-Ora-Ty-Thr-Glx-Ala-Pro-Glx-Tyr-Val OR₂ O -1 kde Ri je větvený nebo přímý alifatický postranní řetězec, C8-C20; X je buď Ala nebo Val; R₂ je acetát nebo derivát esteru; a Glx je Gin nebo Glu. Tyto sloučeniny mají antibakteriální a antifun5 gální aktivitu i aktivitu proti broukům rodu Diabrotica.

Popisujeme nový metabolit a kmen : subtilis produkující antibiotika, který byl původně identifikován jako B. megaterium, má širokou antifungální a antibakteriální aktivitu, a který rovněž zabíjí nebo brání v růstu larvám brouků rodu Diabrotica. V dalším aspektu tato přihláška vynálezu io popisuje způsob ochrany rostlin před houbovými a bakteriálními infekcemi ajejich léčby pomocí aplikace účinného množství supematantu získaného z kultury B. subtilis AQ713 podle tohoto vynálezu. Supematant lze získat způsobem dobře známým v oboru jako například centrifugací, filtrací, sedimentací a podobně.

V dalším aspektu přihláška vynálezu zahrnuje způsob ochrany rostlin před houbovými a bakteriálními infekcemi ajejich léčby pomocí aplikace účinného množství kompletní kultivační tekutiny kultury nového kmene B. subtilis.

V dalším aspektu přihláška vynálezu zahrnuje způsob ochrany rostlin před houbovými a bakte20 riálními infekcemi ajejich léčby pomocí aplikace účinného množství antibiotika produkovaného novým kmenem B. subtilis.

V dalším aspektu tato přihláška vynálezu popisuje způsob ochrany rostlinných kořenů před napadením brouky rodu Diabrotica a jejich léčby pomocí aplikace účinného množství supematantu získaného z kultury B. subtilis AQ713 podle tohoto vynálezu. Supematant lze získat způsobem dobře známým v oboru jako centrifugací, filtrací, sedimentací a podobně.

V dalším aspektu přihláška vynálezu zahrnuje způsob ochrany rostlin před napadením brouky rodu Diabrotica a jejich léčby pomocí aplikace účinného množství kompletní kultivační tekutiny kultury nového kmene B. subtilis.

V dalším aspektu se přihláška vynálezu týká způsobu ochrany rostlinných kořenů před napadením brouky rodu Diabrotica ajejich léčby pomocí aplikace účinného množství metabolitů produkovaného novým kmenem B. subtilis.

Aby bylo dosaženo dobré disperze a adheze prostředků podle tohoto vynálezu, může být výhodné použít v jednom přípravku kompletní kultivační tekutinu, supematant a/nebo metabolit/antibiotikum spolu se složkami, které napomáhají disperzi a adhezi. Vhodné složení je odborníkům v oboru známo.

Přípravky podle tohoto vynálezu mohou mít podobu smáčivých prášků, granulí a podobně, nebo mohou mít podobu mikrokapsulí, kde je přípravek enkapsulován ve vhodném mediu, apod. Příklady jiných typů přípravků zahrnují rozpustné prášky, smáěivé granule, tekuté formy vodného nebo „suchého“ typu, smáěivé dispergovatelné granule, emulsifikovatelné koncentráty a vod45 né suspenze. Jiné vhodné typy přípravků jsou známy odborníkům v oboru,

V dalším aspektu tohoto vynálezu je popisována nová skupina sloučenin nazvaných „agrastatiny“. Tyto látky vykazují antibakteriální a antifungální aktivitu, kromě aktivity proti broukům rodu Diabrotica.

V dalším aspektu tohoto vynálezu je popsána nová kombinace zahrnující iturin typu A, plipastatin, surfaktin a agrastatin.

- 7 CZ 302152 B6

V dalším aspektu tohoto vynálezu jsou popisovány způsoby ochrany rostlin před houbovými a bakteriálními onemocněními ajejich léčby pomocí aplikace účinného množství nové kombinace látek zahrnujících iturin typu A, plipastatin, surfaktin a agrastatin.

Všechny patenty a publikace citované v této patentové přihlášce jsou uvedeny jako reference v úplné podobě. Následující příklady ilustrují tento vynález. Vynález však těmito příklady není nijak omezen.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Charakterizace kmene AQ713

Izolát byl identifikován na základě použití metody Biolog (Biolog microp latě panel, Biolog, Inc., Hayward, CA) tak jak je popisována Bochnerem (1989) Nátuře 339: 157-158. Mikrodeska

2o Biolog se skládá z jamek v panelu, které obsahují 95 různých uhlíkových substrátů, které jsou nejprve naneseny a poté vysušeny, a jsou voleny s ohledem na grampozitivní a gram negativní bakterie. Izolát byl kultivován v tekutém mediu při 28 °C, a po 24 hodinách byla promytá buněčná suspenze (0,85 % W/V chlorid sodný) inokulována do každého otvoru v panelu GP Microplate (Biolog, Inc.), Po inkubaci po dobu 24 hodin při teplotě 28 °C byly vyhodnoceny reakce utilizace uhlíku. Profily utilizace substrátů byly porovnány s databází Biolog Gram-Positive Data Base (verze 3,50) a vztaženy k nejbližším podobným druhům. Výsledky metody Biolog poskytly index podobnosti (similarity index) o hodnotě 0,883 pro B. megaterium.

Mnohem důkladnější charakterizace AQ713 byla provedena sbírkou mikroorganismů American

Type Culture Collection v Rockville v Marylandu.

Izolát dodán jako: neznámý; kmen AQ713.

Izolát identifikován jako: s použitím dostupných fyziologických a biochemických dat se tento kmen nejvíce podobá Bacillus subtilis.

Buněčná morfologie: pohyblivé buňky jsou nalézány jako jednotlivé, sjednou endosporou umístěnou v centrální nebo subterminální poloze. Buňky se uniformně barví jako Gram-pozitivní.

4(i Morfologie kolonie: kolonie jsou matné a nepravidelné s konvexním vyvýšením, povrch je hrubý, nebarvený a má nepravidelně zoubkovaný okraj.

Charakterizace dat kmene AQ713:

Tyčinky	+	Hydrolýza kaseinu	+
45 Rovné tyčinky	+	Ztekucení želatiny	+
Zahnuté tyčinky	-	Hydrolýza hippurátu	-
Jednotlivé buňky	+	Lecitinasová degradace	-
Řetízky buněk	-	Hydrolýza škrobu	+
Konce zašpičatělé	-	Hydrolýza Tweenu 80	+
50 Konce zakulacené	+	Rozklad tyrosinu	-
Konce hranaté	-	Růst v 2% NaCl
Vytvořená endospora	+	Růstv5%NaCl

-8CZ 302152 B6

„Nabobtnalé“ sporangium	-	Růst v 7 % NaCI	+
Jedna spora na buňku	+	Růst v 10% NaCI	+
Spora kulatá	-	Růst v 0,2% azidu	V
Spora válcovitá	+	Růst při pH 4,5	+
Spora oválná	+	Růst pri pH 6,0	+
Spora centrální	+	Kyselina z arabinózy	-
Spora terminální	-	Plyn z arabinózy	-
Spora subterminální	+	Kyselina z celobiózy	slabá
Gramovo barvení	+	Kyselina zpožděná>14 dní	slabá
Gram pozitivní	+	Plyn z celobiózy	-
Gram negativní	-	Kyselina z fruktózy	+
Gram variabilní		Kyselina zpožděná>14 dní	-
Vakuoly přítomny	-	Plyn z fruktózy	+
Kolonie průhledná	-	Kyselina z glukózy	+
Kolonie transparentní	-	Kyselina zpožděná>14 dní	-
Kolonie matná	+	Plyn z glukózy	-
Kolonie celistvá	-	Kyselina z laktózy	-
Kolonie zoubkovaná	+	Plyn z laktózy	-
Kolonie laločnatá	-	Kyselina z manitolu	-
Kolonie kruhová	-	Plyn z manitolu	-
Kolonie nepravidelná	+	Kyselina z manózy	-
Kolonie rhizoidní	-	Plyn z manózy	-
Kolonie konvexní nízká		Kyselina ze sacharózy	slabá
Kolonie konvexní vysoká	-	Kyselina zpožděná>14 dní	slabá
Kolonie plochá	-	Plyn ze sacharózy	-
Kolonie vypouklá	-	Kyselina ze sacharózy	-
Kolonie lesklá	-	Plyn z trehalózy	-
Kolonie bezbarvá	+	Kyselina z xylózy	-
Kolonie suchá	-	Plyn z xylózy	-
Kolonie hladká	-	Aerob	-
Kolonie drsná	+	Fakultativní	-
Hnědý rozpustný pigment	-	Mikroaerofil	+
Černý rozpustný pigment	-	Anaerob	-
Žlutý rozpustný pigment	-	Plyn z „uzavřeného“ nitrátu	-
Hnědý nerozpustný pigment	-	Plyn z „uzavřené“ glukózy	-
Černý nerozpustný pigment	-	Indol	-
Žlutý nerozpustný pigment	-	Nitrát na nitrit	+
Oranžový nerozpustný pigment	-	Nitrát na plyn	-
Červený nerozpustný pigment	-	Redukce methylenové modři	+
Buňky pohyblivé	+	Reoxidace methylenové modři	-
Růst při 15 °C	+	Lakmusové mléko kyselé	-
Růst při 20 °C	+	Lakmusové mléko koagul.	-

-9CZ 302152 B6

Růst při 26 °C	+	Lakmusové mléko alkalické	+
Růst při 30 °C	+	Lakmusové mléko reduk.	+
Růst při 37 °C	+	Lakmusové mléko pepton.	+
Růst při 45 °C	+	VP (5198) pozitivní	+
Růst při 50 °C	slabý	VP (5331) pozitivní	+
Růst při 55 °C	-	pH VP 5198 6,0 nebo méně	-
Růst při 60 °C	-	pH VP5198 6,6 až 7,5	+
Růst při 65 °C	-	pH VP 5198 8,0 nebo více	-
Kata lasa	+	Utilizace citrátu	+
Oxidasa	+	Utilizace propionátu	—

Poznámka: Jestliže použijeme dostupná fyziologická a biochemická data, tento kmen se nejvíce podobá Baciílus subtilis.

Nej důležitější výsledky charakterizace

Testy charakterizace	Kmen AO713	Baciílus subtilis
„Nabobtnalé“ sporangium	-	-
Anaerobní růst	mikroaerofilní	mikroaerofilní
VP reakce	+	+
pH VP reakce	7,0	5,0 až 8,0
Maximální růstová teplota	55 °C	45 až 55 ^ŮC
Růst v 7% NaCI	+	+
Kyselina z glukózy	+	+
Kyselina z arabinózy	-	+
Kyselina z xylózy	-	+
Kyselina z manitolu	-	+
Rozklad kase inu	+	+
Rozklad tyrosinu	-	-
Utilizace citrátu	+	+
Utilizace propionátu	—	—

Citace: Gordon, R. E., W. C. Haynes and C. Η. N. Pang. 1973. The Genus Baciílus. Handbook No. 427. US Department of Agriculture, Washington D.C.

Příklad 2

Aktivita AQ713 proti broukům rodu Diabrotica.

Vzorky bakterie Baciílus byly kultivovány v kultivačním mediu pro Baciílus. Medium 2 obsahovalo 5% pepton, 5 % dextrózu, 3 % kvasničný extrakt, 1,5% proflo extrakt z bavlníkových semen (59% proteinu, 4,26 % tuku, 6,73 % popela, 3,19% vlákna a stopová množství gossypolu; zbytek je voda), 10 % sojové mouky, a 0,5 % MgSO₄. 7 H₂O. Medium 3 obsahovalo stejné složky s výjimkou 20 % peptonu a 3,4 % KH₂PO₄ a 4,3 % K₂HPO₄. Jeden den staré kultury na agaru byly použity k inokulaci 250 mL třepacích buněk opatřených výstupky. Baňky byly třepány při 200 otáčkách za minutu při teplotě 29 °C po dobu 5 dní. K testu insekticidní aktivity byl objem 35 mL kultivační tekutiny centrifugován při rychlosti 5200 otáček za minutu po dobu 20 minut a supematant byl použit v mikrotestu, který je popsán níže.

- 10CZ 302152 B6

Stanovení bylo prováděno na mikrodestičkách majících 96 jamek. Každá jamka obsahovala pevný agarový substrát, testovaný organismus a pozitivní kontrolu nebo negativní kontrolu nebo supematant získaný tak jak je popsáno v Příkladu 1 z nového kmene Bacillus.

Pro testování insekticidní aktivity byl do jamek mikrodestiěky připraven agarový substrát podle Marrone et al. (1985), J. Econ. Entomol. 78: 290-293. Pro stanovení nematicidní aktivity byl v jamkách místo toho použit čistý agar (1,5 %).

Roztok Avid® (avermektin) o koncentraci 1 ppm byl použit jako pozitivní kontrola. Jako negativní kontrola byla použita deíonizovaná voda. Pro každé stanovení byly použity dvě paralely testovaného vzorku nebo kontroly. Do každé jamky bylo vneseno 40 mikrolitrů vzorku supematantu nebo kompletní kultivační tekutiny z kultury rostoucí v mediu 1, 2 nebo 3. Mikrodestiěky byly poté umístěny do laboratorního zařízení s odtahem, aby uschly, což trvalo přibližně 2 až 3 hodiny, než byl agarový roztok doopravdy suchý.

Organismy použité v testu byly buď nedospělí jedinci brouků rodu Diabrotica (Diabrotica undecimpunctatá), nedospělí jedinci švába (Blatella germanica), nedospělí jedinci voj nice (Spodoptera exigua), nedospělí jedinci mouchy octomilky (Drosophila melanogaster) nebo jedinci kmene N2 nematoda Caenorhabditis elegans. Testovací organismy byly „naředěny“ do 0,1 % agaru na finální koncentraci přibližně 5 jedinců na 25 mikrolitrů agaru, který byl vnese do každé jamky. Mikrodesticka byla uzavřena proti přístupu vzduchu pomocí zvláštní látky jako je např. Mylar® a ke každé jamce byl umožněn přístup vzduchu pomocí jehlového rámečku. Destičky byly inkubovány při teplotě 27 °C maximálně 7 dní.

Po inkubaci byly jamky vyhodnoceny zjištěním hodnoty mortality nebo stupně vývoje larev. Jamkám obsahujícím pouze mrtvé nebo zakrnělé larvy byla přiřazena hodnota 1, jamky obsahující některé mrtvé a některé silně zakrnělé larvy obdržely hodnotu 2, jamky obsahující živé, ale zakrnělé larvy byly hodnoceny jako 3 a jamky, v nichž nebyly nalezeny žádné mrtvé larvy obdržely hodnotu 4. Hodnoty paralel jednotlivých vzorků byly zprůměrovány. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulkách 2 a 3.

Tabulka 2: Hodnocení aktivity kompletní kultivační tekutiny kultury AQ713 proti hmyzím škůdcům.

C. elegans Rod Vojnice Octomilka Požit. Negat.

Diabrotica kontrola kontrola

Medium 2 NT 1,0 4,0 4,0 1,0 4,0

Medium 3 NT 2,0 4,0 4,0 1,0 4.0

NT = netestováno

- 11 CZ 302152 B6

Tabulka 3: Hodnocení aktivity supematantu kultury AQ713 proti hmyzím škůdcům.

	C. elegans	rod	Vojnice Octomilka Šváb	Požit.	Negat.
		Diabrotica		kontrola	kontrola
Medium 2	4,0	3,0	4,0 4,0 4,0	1,0	4,0
Medium 3	4,0	4,0	4,0 4,0 4,0	1,0	4,0

Tyto testy ukazují, že AQ713 byl aktivní při kultivaci v obou mediích, byl-li aplikován jako kompletní kultivační tekutina, nej lepší aktivita byla pozorována v případě použití media 2. Supernatant byl aktivní pouze jestliže byl AQ713 kultivován v mediu 2.

Příklad 3

Chemické vlastnosti metabolitů kmene AQ713 aktivního proti broukům rodu Diabrotica

Kmen AQ713 byl kultivován v mediu 2 v objemu 50 mL. Ke každé kultuře bylo přidáno 50 mL ethylacetátu a směs byla třepána v děličce po dobu 2 minut. Vodná vrstva byla odstraněna a frakce organického rozpouštědla byla převedena do baňky obsahující síran hořečnatý. Frakce v organickém rozpouštědle byla zfíltrována do baňky s kulatým dnem a organické rozpouštědlo odpařeno na rotační vakuové odparce.

Pro biologické stanovení byl odparek znovu rozpuštěn ve 2,5 mL acetonu. Alikvot o objemu 40 mikrolitrů byl naředěn na objem 800 mikrolítrů směsí aceton/voda (70 %). Tento roztok představuje 10 x koncentrovaný organický extrakt. Byla provedena série ředění, čímž byly získány vzorky, které byly testovány na čerstvě vylíhlých larvách brouků rodu Diabrotica (1 larva na jamku mikrotitrační destičky tak jak je uvedeno výše), a po 7 dnech byla vyhodnocena mortalita v procentech. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4: Aktivita ethy lacetáto vých extraktů kultur AQ713 proti broukům rodu Diabrotica.

Vzorek		Mortalita (v %)
AQ713	Organický extrakt 10 x	89
	Organický extrakt 5 x	93
	Organický extrakt 1 x	65
	Kompletní kultivační tekutina	100
	70 % směs aceton/voda	27
	Voda	59

Výsledky ukazují, že AQ713 produkuje metabolit, který je extrahovatelný organickým rozpouštědlem, a který usmrcuje brouky rodu Diabrotica.

Abychom stanovili molekulovou hmotnost aktivního metabolitů, byl AQ713 pěstován na mediu 2 v kultuře o objemu 50 mL. Jeden mililitr kultury byl přenesen do centrifugaění zkumavky a centrifugován pri rychlosti 12000 otáček za minutu po dobu 15 minut. Supematant byl oddělen.

-12 CZ 302152 B6

500 mikrolitrů supematantu bylo naneseno na centrikonový filtr (rozhraní molekulové hmotnosti, 10000 daltonů). Po centrifugaci podle instrukcí výrobce (12000 otáček/min, 35 minut) byl odebrán filtrát a vzorek zadržený nad filtrem byl oddělen centrifugaci a promytím filtru. Vzorky supematantu, filtrátu a tekutiny, která zůstala zadržena nad filtrem, byly testovány na čerstvě vylíhlých larvách brouků rodu Diabrotica (destička o 96 jamkách s obsahem jamek podle Mamone et al., viz výše; 40 mikrolitrů vzorku na jamku a 8 jamek pro každý vzorek, 1 larva na jamku). Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5: Určení molekulové hmotnosti metabolitu kmene AQ713.

Procento mortality proti broukům rodu Diabrotica

AQ713 Supernatant 43

Filtrát 63

Tekutina zadržená na filtru 17

Výsledky ukazují, že supematant a filtrát byly aktivní proti broukům rodu Diabrotica a tedy molekulová hmotnost metabolitu je nižší než 10000 daltonů.

Příklad 4

Chemické vlastnosti metabolitu kmene AQ713 aktivního proti rostlinným patogenům.

Kmen AQ713 byl pěstován na mediu 2 v kultuře o objemu 50 mL. Ke každé kultuře bylo přidáno 50 mL ethylacetátu a směs byla třepána v děličce po dobu 2 minut. Vodná vrstva byla odstraněna a vrstva organického rozpouštědla byla převedena do baňky obsahující síran hořečnatý. Frakce v organickém rozpouštědle byla přefiltrována do baňky s kulatým dnem a rozpouštědlo bylo odpařeno na vakuové odparce.

Pro biologické stanovení byl odparek rozpuštěn ve 2,5 mL acetonu. Byl odebrán alikvot o objemu 40 mikrolitrů a naředěn na celkový objem 800 mikrolitrů směsí aceton/voda (70%). Tento roztok je označován jako 10 x koncentrovaný organický extrakt. Byla provedeno stanovení aktivity organického extraktu proti rostlinným patogenů Pythium ultimum a Botrytis cinerea na mikrodestičce o 96 jamkách (viz níže). Vzorek celé kultury (kompletní kultivační tekutina) měl hodnotu 100% (hodnota = 1), avšak 10 x koncentrovaný organický extrakt nevykázal žádnou aktivitu proti oběma rostlinným patogenům (hodnota = 4). To znamená, že aktivní antibiotika produkovaná AQ713, na rozdíl od aktivních metabolitů působících proti broukům rodu Diabrotica, nejsou extrahovatelná organickým rozpouštědlem jako je ethylacetát.

Další testování zahrnulo izolaci nové sloučeniny, agrastatinu A. Z fermentační tekutiny byl připraven butanolový extrakt, nejprve dvojitou extrakcí s jedním objemem ethylacetátu. a vrstvy byly ponechány, aby se oddělily. Poté byla vodná frakce extrahována dvakrát jedním objemem butanolu. Butanolové extrakty byly spojeny a rozpouštědlo odstraněno odpařením na rotační odparce. Lyofilizací výsledného odparku byl připraven práškový produkt.

Prášek byl rozpuštěn ve směsi acetonitril/voda (80 %) a sonikován. Roztok byl extrahován pomocí extrakce na C-l8 pevné fázi (SPE extraction), která byla aktivována methanolem a ekvilibrována směsí aceton itril/voda (80 %). Náplň SPE byla eluována směsí ACN/voda (80 %) a eluát byl posléze odpařen. Eluované látky byly dále purifikovány pomocí HPLC, Byla použita kolona

- 13CZ 302152 B6

C—18 (1 cm x 25 cm) pro HPLC chromatografii (UV detekce pří 210 nm) s gradientem rozpouštědel acetonitril + 0,05 % směs TFA/voda + 0,05 % TFA v následujícím režimu: 0 až 20 minut, 33 % ACN; 20 až 30 minut, 40 % ACN; 30 až 45 minut 45 až 55 % ACN; a 45 až 63 minut, 55 % ACN.

HPLC chromatogram AQ713 ukazuje přítomnost iturinů, sloučenin iturinu podobných (plipastatiny a agrastatiny) a surfaktinů, viz obr. 1. lturiny A2, A3, A4, A7 a A6 byly identifikovány pomocí kombinace dat z NMR, kapalinové chromatografie-hmotnostní spektrometrie a porovnáním s údaji v literatuře. Surfaktiny byly identifikovány porovnáním s koupenými surfaktinovými to standardy pomocí HPLC a kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií.

Pomocí aminokyselinové analýzy a kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií bylo zjištěno, že iturinům podobné látky jsou směsí plipastatinů a nových agrastatinů. Pro jednu z nových sloučenin byl rovněž shromážděn rozsáhlý soubor dat NMR (HPLC, peak 20);

tato látka byla pojmenována agrastatin A. Bylo zjištěno, že agrastatin A obsahuje tyto aminokyseliny: Thr; 3 Glu; Pro; Ala; Val; 2 Tyr; a Om. To značí rozdíl proti plipastatinů A daný přítomností Val a ztrátou Ile. Molekulová hmotnost agrastatinů A byla stanovena 1448, což odpovídá následující struktuře:

CH3(CH2)i2-CH-CH2’CO-Glu-Om-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-GIn-Tyr-Val

Povaha přímého řetězce části obsahující mastnou kyselinu byla potvrzena ’HNMR. Poloha aminokyselin v cyklickém peptidu byla určena podrobnou analýzou pomocí souborů dat TOCSY a ROESY.

Hmotnostní spektrometrie a aminokyselinová analýza agrastatinů B (HPLC, peak 26) ukazují, že jeho struktura je podobná plipastatinů B2 s náhradou zbytku Ala Val. Struktura je uvedena níže:

C H,C H_zCH (CH₂)₁₀-CH-CH₂CO-Glu-Om-Tyr-Thr-Ghj-Va)-Pro-Gln-Tyr-VaJ CH, OH O-1

Příklad 5

Aktivita kmene AQ713 proti rostlinným patogenům v kultuře in vitro (mikrodestička o 96jam35 kách).

S cílem určit, zda AQ713 je účinný proti houbám Phytophtkora infestans, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani a Alternaria solemi, byly provedeny následující experimenty. Mikrodestičky o 96 jamkách (s plochým dnem, 400 mikrolitrů na jamku, Nunc) byly naplněny agarovým mediem (bramborový dextrózový agar, PDA, Difco). Kultury P. infestans byly kultivovány po dobu 3 dnů v tekutém mediu YPG-1 (0,4 % kvasinkový extrakt, 0,1 % KH₂PO₄, 0,5 % MgSO₄ . 7H₂O, 1,5 % glukóza). V případě ostatních druhů hub byly spory seškrábnuty z povrchu agarových ploten a alikvoty o objemu 0,1 až 0,2 mL deíonizované vody a sporové suspenze (o koncentraci přibližně 2 x 10⁶ spor/mL) patogenní houby byly naneseny na agar.

Kmen AQ713 byl kultivován po dobu 72 hodin v mediu 2 nebo 3 tak jak je popsáno v Příkladu 2. Supematanty byly získány centrifúgací kompletní kultivační tekutiny kultury při rychlosti 5200 otáček za minutu po dobu 20 minut. Houbové organismy patogenní pro rostliny byly napipetovány na destičky o 96 jamkách (8 jamek pro 1 patogenní organismus). Přítomnost a nepří- 14 CZ 302152 B6 tomnost růstu houby byla zaznamenávána pro všech 8 jamek. Do každé jamky bylo přidáno přibližně 40 mikrolitrů supematantu kultury AQ713 nebo 20 mikrolitrů kompletní kultivační tekutiny. Hodnota 1 znamená úplnou inhibici růstu houbového organismu. Hodnota 4 znamená nulovou inhibici růstu houby. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6: Inhibice růstu houbových organismů in vitro (destička s 96 jamkami)

Supematant AQ713	Medium 2 Hodnoty	Medium 3 Hodnoty
Phytophthora infestans	1	l
Pythium ultimum	1	1
Botrytis cinerea	l	1
Rhizoctonia solani	4	l
Alternaria solani	1	1

Kompletní kultivační tekutina kultury AQ713

Colletotrichum cocodes	1	NT
Alternaria brassicicola	1	NT
Botrytis cinerea	1	NT
Cladosporium cucumerinum	1	NT
Monilia fructicola	1	NT
Venturia pyrina	l	NT
Rhizoctonia solani	1	NT
Alternaria solani	1	NT

NT = netestováno.

Výsledky ukazují, že kmen AQ713 má široké fungicidní spektrum in vitro, a že jak kompletní kultivační tekutina tak i supematant jsou vysoce aktivní. Supematant byl aktivní proti houbě Rhizoctonia solani, jestliže byla bakterie AQ713 pěstována na mediu 3, ale ne jestliže byla pěstována na mediu 2,

Příklad 6

Aktivita kmene AQ713 proti rostlinným patogenům v kultuře in vitro (zónové stanovení)

Pro stanovení aktivity kmene AQ713 metodou difúze v agaru (zónová metoda), byly spory rostlinných patogenů naočkovány na povrch bramborového dextrózového agaru v Petriho miskách o průměru 10 cm. Do agaru byly udělány jamky o velikosti 7 mm a do těchto jamek byly vneseny 100 mikrolitrové vzorky supematantu kultury AQ713 narostlé v mediu 2. Supematant byl připra25 ven centrifugací při rychlosti 4200 otáček za minutu po dobu 40 minut. Supematant byl poté ještě jednou zcentrifugován za stejných podmínek (4200 ot./min, 40 minut). Typické výsledky zahrnovaly vznik zóny bez jakéhokoli růstu patogenního organismu okolo jamky a/nebo s redukovaným růstem tohoto patogenního organismu. Velikost zóny vyjádřená v milimetrech byla změřena a zaznamenána. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7.

- 15CZ 302152 B6

Tabulka 7: Inhibice růstu houbových rostlinných patogenů in vitro (zónový test)

	Velikost zóny (mm)
Alternaria brassicicola	Botrytis cinerea	Monilia fructicola
Supematant AQ713	16	23	14
Kompletní kultivační tekutina
kultury AQ713	22	15	18

Příklad 7

Aktivita kmene AQ713 proti bakteriálním rostlinným patogenům

Standardní stanovení pomocí difúze v agaru bylo založeno jako v Příkladu 6. Povrch Petriho misky byl zaoČkován bakteriálním patogenním mikroorganismem tak, aby mohl vytvořit souvislý nárůst. Do každé jamky bylo napipetováno 100 mikrolitrů kompletní kultivační tekutiny kultury kmene AQ713 rostoucího na mediu 2. Velikost zóny byla vyjádřena v milimetrech.

Tabulka 8: Inhibice bakteriálních rostlinných patogenů in vitro (zónový test)

Kompletní kultivační tekutina kultury AQ713

Inhibiční zóna (mm)

Acidovorax avenae subsp. citrulli 18

Pseudomonos syringae pv. tomato 11

Xanthomonas campestris pv. campestris 18

Erwinia carotovora subsp. carotovora 11

Clavibacter michiganense subsp. michiganense 22

AQ713 byl aktivní proti všem druhům bakteriálních rostlinných patogenů testovaným in vitro.

Příklad 8

Aktivita kmene AQ713 proti rostlinným patogenům v rostlinných testech

Aktivita kmene AQ713 byla testována proti šedé plísni Botrytis cinerea na fazolích a na listech pelargonie, proti Alternaria solani na semenáčcích rajčete, a proti plísni salátové Bremia lactucae na salátu.

V případě A. solani byly semenáčky rajčete ve stadiu 2 až 3 listů vysazeny ve skupinách po šesti rostlinách a byly postříkány, až přebytečná tekutina začala odtékat, kompletní kultivační tekutinou kultury kmene AQ713 rostoucí na mediu 2. Po postřiku byly semenáčky ponechány aby oschly (asi 1,5 hodiny). Semenáčky byly poté postříkány suspenzí obsahující 5,0 x 10⁴ spor/mL. Semenáčky byly zakryty plastikovým krytem a inkubovány při teplotě 28 °C v Percivalově inkubátoru. Voda bez AQ713, sa bez spor patogenního organismu, byla použita jako negativní kontrola a pozitivní patogenní kontrola. O čtyři dny později byl test vyhodnocen. Ve vodné kont- 16CZ 302152 B6 role A. solani byly zjištěny uniformní leze na všech listech a dělohy byly odděleny a silně infikovány (hodnota 5 = úplná infekce, žádná inhibice). Rostliny ošetřené kmenem AQ713 měly několik lehkých lézí rozptýlených na skutečných listech. Dělohy byly neoddělené, ale měly na sobě několik malých lézí (hodnota 1). Negativní kontrola nebyla infikována.

Druhý test byl proveden s oddělenými rajčatovými semenáčky (stonky ulomené na úrovni půdy) umístěnými do kameninových nádob naplněných vodou, které byly zakryty plastikovými kryty a uchovávány jak je uvedeno výše. Rostliny byly postříkány tak jak je uvedeno výše a příznaky infekce A. solani byly zaznamenány po čtyřech dnech. U negativních kontrol nebyly žádné io příznaky. U pozitivních kontrol byly na semenáčcích nalezeny uniformní léze. Ošetření pomocí kmene AQ713 bylo hodnoceno jako 1 (málo nebo žádné léze). O dva dny později byly rostliny pozitivní kontroly zničeny, avšak semenáčky ošetřené kmenem AQ713 byly naprosto čisté a vypadaly stejně jako negativní kontroly (vodou postříkané rostliny).

ís V případě testu sBotrytis cinerea byly první skutečné listy rostliny fazole poraněny přitlačením ústí kultivační zkumavky o rozměru 13 x 100 mm na každý list. Na každém listě byla takto vytvořena dvě poranění. Listy byly postříkány kompletní kultivační tekutinou kultury kmene AQ713 rostoucího na mediu 2 nebo samotnou vodou nebo samotným patogenním organismem. Po usušení byly listy opět postříkány sporami B. cinerea (0,8 χ 10⁶ spor/mL). Listy byly umístě20 ny v sadbovačích překrytých plastickými kryty a uchovávány při teplotě 18 až 20 °C v Pere i valově inkubátoru. Po pěti dnech byla pozitivní kontrola (samotný patogen) postižena hnilobou v oblasti mající průměr asi 25 mm. Negativní kontrola (samotná voda) nevykazovala žádné známky hniloby. V případě aplikace AQ713 nebyla zjištěna žádná infekce na 7 z 8 kruhů, kde listy byly poraněny. Jediný kruh, který vykazoval infekci, měl známky lehké infekce na dvou místech okolo kruhu.

V případě testu s houbou Bremia byla semena salátu umístěna do vrstvy sterilizované směsi užívané v květináčích, která obsahovala rašelinu, perlit a vermikulit v malých rostlinných kondominiích z čiré plastické hmoty, která byla asi 8 centimetrů vysoká a široká. Po vyklíčení semen (1 týden) byly semenáčky salátu postříkány kompletní kultivační tekutinou kultury AQ713 nebo vzorkem supematantu. Rostliny byly ponechány, aby oschly, a poté byla na semenáčky nastříkána suspenze spor salátové plísně z infikovaných semenáčků salátu. Přes rostliny byly umístěny kryty z plastické hmoty a rostliny byly inkubovány při teplotě 18 až 20 °C v Percivalově inkubátoru. Po jednom týdnu byl test vyhodnocen. Kmen AQ713 nezabránil rozvinutí salátové plísně

Bremia na semenáčcích salátu.

Příklad 9

4tí Účinnost kmene AQ713 proti rostlinným onemocněním (skleníkový test)

Nepravé padlí hroznů (grape downy mildew)

Kmen AQ713 byl kultivován v mediu obsahujícím sóju ve 400 litrovém fermentoru po dobu 45 48 hodin. Rostliny vinné révy (kultivar Chardonnay) byly postříkány kompletní kultivační tekutinou kultury zředěnou 2 x a 4 x sterilní vodou pomocí ruční stříkačky až do stupně kdy tekutina začala stékat po povrchu. Po oschnutí byly rostliny postříkány podruhé. Po osušení byly rostliny inokulovány patogenním organismem vyvolávajícím nepravé padlí hroznů, Plasmopara viticola.

Každou dávkou byly ošetřeny 3 rostliny. Každá rostlina byla hodnocena z hlediska procenta inhi50 biče onemocnění, které mělo hodnotu od 0 do 100 % kontroly. 100 % kontrola je rostlina, která nemá viditelné léze. Chemický fungicid metalaxyl byl použit pro srovnání. Získané výsledky byly následující:

AQ713 2 x zředěná kompletní kultivační tekutina 97,7 % kontroly 55 AQ713 4 x zředěná kompletní kultivační tekutina 100 % kontroly

- 17 CZ 302152 B6

Metalaxyl 30 ppm Metalaxyl Í0 ppm Metalaxyl 1 ppm

100 % kontroly 98,3 % kontroly % kontroly

Výsledky ukazují, že kmen AQ713 inhiboval nepravé padlí hroznů stejně jako chemický fungicid.

Příklad 10 io

Účinnost kmene AQ713 proti padlí tykve (squash powdery mildew)

Kmen AQ713 byl kultivován na sójovém mediu ve 400 litrovém fermentoru po dobu 48 hodin. Rostliny tykve (Crookneck a Acom) byly postříkány kompletní kultivační tekutinou z fermentace ve 400 litrovém fermentoru (viz výše) a touto tekutinou 2 x zředěnou sterilní vodou pomocí ruční stříkačky do stadia, kdy tekutina začala stékat. Po oschnutí byly rostliny inokulovány patogenem Sphaerotheca fuliginea působícím padlí tykve. Každou dávkou byly ošetřeny 2 rostliny. Rovněž byl testován prášek kompletní kultivační tekutiny kultury získaný sušením v sprej ové sušárně. Kompletní tekutina kultury z kultivace ve 400 litrovém fermentoru byla sušena ve sprejové sušárně. 10 % a 2,5 % roztoky tohoto prášku byly použity pro postřik rostlin až do stadia, kdy tekutina začala stékat (viz výše). Výskyt onemocnění padlí byl hodnocen v rozmezí 0 až 5. Hodnota 5 znamená 100 % onemocnění, zatímco 0 znamená žádné onemocnění. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 9

Testovaná Tykev Acom Tykev Acom Tykev Crookneck Tykev Crookneck suspenze rostlina 1 rostlina 2 rostlina 1 rostlina 2

AQ713 kompletní kultivační tekutina

AQ713 2 x zředěná kompletní kultivační tekutina

AQ713 sprejové

10% sušený prášek

AQ713 2,5 % sprejové sušený prášek

0 0

0 0,5

- 18CZ 302152 B6

Kompletní tekutina z kultivace kmene AQ713 a sprejově sušený prášek téměř úplně inhibovaly padlí tykve.

Příklad 11

Účinnost kmene AQ713 při použití ve skleníku proti plísni bramborové (latě blight), plísni šedé (gray mold), padlí révovému (grape powdery mildew), obilnému padlí (cereal powdery mildew), sněti pochvy působené korenomorkou bramborovou (sheath blight) a onemocnění rýže zvané „rice blast“.

Kmen AQ713 byl kultivován v sójovém mediu po dobu 72 hodin ve 250 ml třepacích bankách. Onemocnění, patogenní mikroorganismus vyvolávající toto onemocnění a hostitel jsou uvedeni níže v tabulce 10. Kompletní kultivační tekutina kultury kmene AQ713 byla testována na rostlinách tak, jak je uvedeno níže v tabulce 11.

Tabulka 10

Onemocnění Rostlinný patogen Hostitel

Plíseň bramborová (latě blight) Phytophthora infestans rajče

Plíseň šedá (gray mold) Botrytis cinerea paprika

Sněť pochvy (sheath blight) Rhizoctonia solani rýže

Rice blasť* Pyricularia oryzae rýže

Padlí révové (powdery mildew) Uncinula necator vinná réva

Padlí (powdery mildew) Drysiphe graminis f. sp. pšenice graminis

Kompletní kultivační tekutina kultury v neředěném stavu byla nanesena pomocí ruční stříkačky na testované rostliny až začala stékat z jejich povrchu. Po oschnutí byl postřik proveden podruhé. Tři rostliny byly ošetřeny pro každé onemocnění a léčbu. Po oschnutí byly rostliny inokulovány patogenními organismy. Každá rostlina byla hodnocena z hlediska procentuální inhibice onemocnění v rozsahu 0 až 100 % kontroly. 100 % kontrola znamená, že na rostlině nebyly viditelné léze. Chemické fungicidy byly použity pro srovnání. Index onemocnění znamená závažnost onemocnění na neošetrené kontrole.

- 19CZ 302152 B6

Tabulka 11

P. infestans	B. cinerea E. graminis CZ necatc	tr P. oryzae R. solani
AQ713 70	100 84	100	100	100
Metalaxyl 100 30 ppm
Metalaxyl 77 10 ppm
Propiconazol 10 ppm	87
Propiconazol 5 ppm	57
Propiconazol 0,5 ppm	100
Propiconazol 0,2 ppm	54
Myclobutanil 30 ppm		100
Myclobutanil 10 ppm		100
Pencycuron 50 ppm			100
Pencycuron 10 ppm			100
Benomyl 100 ppm				100
Benomyl 40 ppm				77
Index onemocnění (%) 80	95 70	50	60	80

Kmen AQ713 vykazoval aktivitu, která byla ekvivalentní chemickým fungicidům na všech testovaných patogenních mikroorganismech.

-20CZ 302152 B6

Příklad 12

Účinnost kmene AQ713 proti plísni Peronospora parasitica postihující rostliny rodu Brassica (Brassica downy mildew)

Bakterie Bacillus kmen AQ713 byla kultivována v 10 litrovém fermentoru na sójovém mediu po dobu 48 hodin. Kompletní naředěná kultivační tekutina byla nastříkána na třítýdenní rostliny květáku a růžičkové kapusty ve stadiu s plně vyvinutými dělohami pomocí kompresorové stříkací pistole. Při každém ošetření byly nastříkány tři paralely zahrnující 15 až 25 semenáčků v jednom květináči. Azoxystrobinový fungicid Quadris™ od firmy Zeneca byl rovněž nastříkán na rostliny (tři najedno ošetření) v koncentraci 250 a 125 ppm. Sporová suspenze houby Peronospora parasitica, způsobující plíseň, v koncentraci l až 5 x 10⁴ spor/mL byla nastříkána na rostliny Brassica poté, kdy oschly postřiky AQ713 a Quadris. Rostliny byly inkubovány při teplotě 15 až 17 °C po dobu 24 hodin z důvodů infikování. Poté byly semenáčky inkubovány při teplotě 20 až 24 °C po dobu šesti dnů. Květináče byly vráceny do teploty 15 až 17 °C na jednu noc, aby patogenní organismus vysporuloval před vyhodnocením testu. Každá rostlina byla hodnocena určením hodnoty procentní inhibice onemocnění v rozsahu 0 až 100 % kontroly. 100 % kontrola je rostlina, která nemá žádné sporulační léze. Průměrné výsledky ze tří paralel jsou uvedeny níže v tabulce

12.

Tabulka 12

	Hodnocení 23. prosince	Hodnocení 30. prosince	Hodnocení 6. ledna
Kompletní kultivační tekutina AQ713	100	90	75
Quadris 250 ppm	100	NT	NT
Quadris 125 ppm	NT	100	100
Kontrola voda	0	0	0

NT = netestováno

AQ713 účinně inhiboval plíseň Peronospora parasitica po dobu 3 týdnů.

Příklad 13

Synergísmus kmene AQ713 a komerčního fungicidu

Kmen AQ713 byl kultivován v 10 litrovém fermentoru na sójovém mediu po dobu 72 hodin. Bakteriální kultura byla zředěna 2 x a 4 x sterilní vodou. Naředěná kultura, 2 x ředěná kultura a 4 x ředěná kultura byly nastříkány na třítýdenní rostliny papriky kompresorovou stříkací pistolí. Tri rostliny byly nastříkány na jedno ošetření. Azoxystrobinový fungicid Quadris™ od firmy Zeneca byl rovněž nastříkán na rostliny (tri na jedno ošetření) v koncentracích 500, 250 a 125 ppm. Kromě toho byla na rostliny papriky nastříkána kombinace Quadris a kompletní kultivační tekutiny AQ713 v poměru 1:1 (tři rostliny najedno ošetření). Ošetření s a bez Quadris jsou uvedeny v tabulce 13. Sporová suspenze šedé plísně Botrytis cinerea v koncentraci lx 10^ spor/mL byla nastříkána na rostliny papriky po oschnutí postřiků AQ13 a Quadris. Rostliny

-21 CZ 302152 B6 byly inkubovány při teplotě 20 až 22 °C po dobu 3 dnů do vyhodnocení testu. Byl hodnocen výskyt onemocnění šedou plísní v rozsahu hodnot 0 až 5. Hodnota 5 znamená 100 % výskyt onemocnění, zatímco hodnota 0 znamená nepřítomnost onemocnění. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13.

Tabulka 13

Ošetření Hodnocení Paralela 1	Hodnocení Paralela 2	Hodnocení Paralela 3	Hodnocení Průměr
AQ713 neředěná	0.5	0,5	1,5	0,8
AQ713 2 x ředěná	2,0	2,5	2,0	2,2
AQ713 4 x ředěná	3,0	3,0	2,0	2,7
Quadris 500 ppm	4,0	3,5	4,0	3,8
Quadris 250 ppm	2,5	3,5	3,0	3,0
AQ713 neředěná* Quadris 500 ppm	0,5	1,0	1,0	0,8
AQ713 neředěná* Quadris 250 ppm	1,0	1,0	0,5	0,8
AQ713 2 x ředěná* Quadris 250 ppm	0,5	1,0	1,0	0,8
AQ713 4 x ředěná* Quadris 250 ppm	0,5	1,0	2,5	1,3
Kontrola voda	4,0	5,0	5,0	4,7
Kontrola voda 2	5,0	5,0	5,0	5,0

Výsledky jasně ukazují, že kombinace Quadris a kmene AQ713 inhibují onemocnění plísní šedou lépe než samotný Quadris nebo kmen AQ713.

Průmyslová využitelnost

Přihláška vynálezu se týká oblasti biopesticidů. Nový kmen Bacillus subtilis AQ713 inhibuje řadu houbových a bakteriálních onemocnění rostlin a rovněž vykazuje aktivitu proti broukům rodu Diabrotica. Přihláška vynálezu se rovněž týká fungicidních, bakterie i dn ích a insekticidních prostředků obsahujících tento nový kmen Bacillus subtilis spolu s antibiotiky a metabolity produkovanými tímto kmenem, které jsou použity samotné nebo v kombinaci s jinými chemickými a biologickými pesticidy.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1, Kmen Bacillus subtilis AQ713, uložený vNRRL pod přírůstkovým číslem B-21661 nebo mutant tohoto kmene, přičemž mutant vykazuje antifungální a antibakteriální aktivitu a aktivitu proti broukům rodu Diabrotica.
2. Kmen Bacillus subtilis AQ7I3 podle nároku 1, uložený v NRRL pod přírůstkovým číslem io B-21661.
3. Kompletní kultivační tekutina kmene podle nároku 1 nebo 2.
4. Supematant získaný z kultury kmene Bacillus subtilis AQ713 podle nároku 1, vyznai5 č u j í c í se t í m , že vykazuje antifungální a antibakteriální aktivitu a aktivitu proti broukům rodu Diabrotica.
5. Prostředek pro ošetření a ochranu rostlin proti fungální a bakteriální infekci, vyznačující se t í m, že obsahuje buď

i) kmen podle nároku 1 nebo 2, nebo i i) kompletní kultivační tekutinu podle nároku 3, nebo iii) supematant podle nároku 4,

25 a chemický fungicid nebo biologický pesticid nebo chemický pesticid.
6. Prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje chemický fungicid.
7. Způsob ochrany nebo léčení rostlin a plodů před houbovými a bakteriálními infekcemi nebo

30 napadením brouky rodu Diabrotica, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci účinného množství kmene Bacillus subtilis podle nároku 1 nebo 2, kompletní kultivační tekutiny podle nároku 3, supematantu podle nároku 4 nebo prostředku podle nároku 5 nebo 6.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že infekce jsou vyvolány alespoň

35 jedním mikroorganismem vybraným ze skupiny zahrnující Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria solani, Colletotrichum cocodes, Altemaria brassicicolia, Cladosporium cucumerinum, Monilia fructicola, Ven tur ia pyrina, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense, Plasmopara viticola, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator a Peronospora

40 parasitica.
9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že kmen Bacillus subtilis podle nároku 1 nebo 2, kompletní kultivační tekutina podle nároku 3, supematant podle nároku 4 nebo prostředek podle nároku 5 nebo 6 je ve formě zvlhčitelných prášků, granulí, v tekuté formě

45 nebo ve formě mikrokapsulí.
10. Způsob podle nároků 7až9, vyznačující se tím, že kmen Bacillus subtilis podle nároku 1 nebo 2, kompletní kultivační tekutina podle nároku 3, supematant podle nároku 4 nebo prostředek podle nároku 5 nebo 6 je aplikován na kořeny rostlin nebo půdu okolo kořenů.
11. Prostředek pro ošetření a ochranu rostlin proti fungální a bakteriální infekci, vyznačující se tím, že obsahuje iturin typu A, plipastatin a surfactin získatelné z kmene Bacillus subtilis AQ713 podle nároku 1 nebo 2.

-23CZ 302152 B6
12. Prostředek pro ošetření a ochranu rostlin proti fungální a bakteriální infekci podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále obsahuje agrastatin získatelný z kmene Bacillus subtilis AQ713 podle nároku I nebo 2.
13. Způsob ochrany nebo léčení rostlin a plodů proti fungální a bakteriální infekci, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci účinného množství sloučeniny:

R,-CH-CH₂-CO-Glx-Om-Ty-Thr-Glx-X-Pro-Glx-Tyr-Val or₂ o---1 kde R_t je rozvětvený nebo přímý alifatický postranní řetězec mající 8 až 20 atomů uhlíku; R₂ je acetát nebo derivát esteru; X je Ala; a Glx je Gin nebo Glu.
14. Způsob ochrany nebo léčení rostlin a plodů proti fungální a bakteriální infekci, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci účinného množství sloučeniny:

CH3(CH2)u-CH-CHj-CO-Glu-Om-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Val

OH O---1
15. Způsob ochrany nebo léčení rostlin a plodů proti fungální a bakteriální infekci, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci účinného množství prostředku podle nároku 11.
16. Způsob ochrany nebo léčení rostlin a plodů proti fungální a bakteriální infekci, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci účinného množství prostředku podle nároku 12.
17. Sloučenina obecného vzorce

Ri-CH-CH₂-CO-Glx-Om-T)jr-Thr-Glx-X-Pro-Glx-Tyr-Val or₂ o--kde R| je větvený nebo přímý alifatický postranní řetězec mající 8 až 20 atomů uhlíku; R₂ je acetát nebo derivát esteru a Glx je Gin nebo Glu.
18. Sloučenina obecného vzorce

CH3(CH2)i2-CH-CH₂-CO-Glu-OmOH <

yr-Thr-Giu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Val

2 výkresy

-24CZ 302152 B6

R-(pH-CH2-CO-Glu-Om-Tyr-Thr-Glu-X-Pro-Gln-Tyr-lle OH ⁰

Plipastatin Al, X - Ala, R = CH3(CH2)i2Plipastatin A2, X = Ala, R = CH3CH2CHCH3(CH2)ioPlipastatin Bl, X = Val, R = CH3<CH2)i2Plipastatin B2, X = Val, R = CH3CH2CHCH3(CH2ho-