MX2014009095A

MX2014009095A - Composicion y metodo para el diagnostico y tratamiento de enfermedades asociadas con la degeneracion de neuritas.

Info

Publication number: MX2014009095A
Application number: MX2014009095A
Authority: MX
Inventors: John Memmott; Bernhard Mueller; Lili Huang; Philip D Bardwell; Yuliya Kutskova
Original assignee: Abbvie Deutschland
Priority date: 2012-01-27
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2015-06-02
Also published as: AU2017276338A1; CR20140360A; AU2013211939B2; RU2644337C2; RU2014134897A; NZ625403A; IL316441A; US9102722B2; PL2807192T3; JP2018111686A; IL322864A; SG11201404263TA; HUE039611T2; EP3369746A1; TR201809967T4; SG10201600316SA; AU2021290298A1; AU2013211939A1; ECSP14010817A; US20210238270A1

Abstract

Se proveen aquí anticuerpos y métodos de uso de los anticuerpos para tratar y diagnosticar enfermedades y trastornos degenerativos de las neuritas.

Description

l COMPOSICIÓN Y MÉTODO PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS CON LA DEGENERACIÓN DE NEURITAS INFORMACIÓN DE SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio del número de serie de EE. UU. 61 /591 ,324, presentada el 27 de enero de 2012, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

LISTA DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene una lista de secuencias que ha sido presentada en formato ASCII por medio de EFS-Web y se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Dicha copia de ASCII, creada el 25 de enero de 2013, se denomina 1 1423USO.txt y es de 100,936 bytes de tamaño.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos y métodos de uso de los anticuerpos para tratar y diagnosticar enfermedades asociadas con la degeneración de neuritas, tales como esclerosis múltiple.

ANTECEDENTES Las primeras etapas de muchas enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por daño de las neuritas y función sinóptica comprometida. La degeneración de neuritas lleva frecuentemente a la muerte de la célula neuronal y puede deteriorar la conducción de señales en los nervios afectados, causando deterioro de la sensación, movimiento, cognición u otras funciones, dependiendo de qué nervios están implicados. La degeneración de neuritas también es una marca distintiva patológica de la esclerosis múltiple (“MS”). La MS es una enfermedad neurodegenerativa autommune que afecta aproximadamente a 350,000 personas en los Estados Unidos y es una causa principal de discapacidad del sistema nervioso o muerte en adultos jóvenes. Una condición clínica común en los humanos que padecen MS es la formación degenerativa de lesiones neurales que se originan de degradación extensa de las vainas de mielina que rodean los axones de las neuronas, y degradación final de los axones mismos. Se cree que la desmielinización que ocurre en la MS se inicia por el ataque de enzimas proteasas sobre tres proteínas neurológicas principales: proteína básica de mielina (MBP), proteína proteo-lípido (PLP) y glicoproteína de mielina de oligodendrocito (MOG). Mecanísticamente, la MS es una enfermedad desmielinizante inflamatoria que es causada, por lo menos parcialmente, por una respuesta autoinmune a los productos de degradación de mielina. Estudios recientes han enfatizado la función de la lesión de neurita y axonal además de los mecanismos de desmielinización e inflamación muy conocidos.

Típicamente se diagnostica que los pacientes tienen una enfermedad degenerativa de neurita basándose en una combinación de la historia del paciente y examen neurológico, que incluye imagenología de resonancia magnética (MRI) del cerebro y la médula espinal, procedimientos electrodiagnósticos (p. ej . , pruebas de potencial evocado tales como potenciales visuales evocados, potenciales auditivos evocados del tallo cerebral, o potenciales somatosensoriales evocados), y punción lumbar, para buscar la evidencia de síntesis de inmunoglobulina en el fluido cerebroespinal.

Actualmente no hay curación para las enfermedades asociadas con la degeneración de neurita, de modo que típicamente el tratamiento incluye el manejo de los síntomas y el tratamiento de la frecuencia y severidad de las recaídas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa"). El anticuerpo comprende un dominio o región seleccionada de: (a) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 ; (b) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (c) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; (d) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (e) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (f) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 ; (g) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; (h) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; (i) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; (j) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37; (k) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 ; (I) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; (m) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49; (n) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; (o) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57; (p) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 61 ; (q) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; (r) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (s) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99; (t) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; (u) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107; (v) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 11 1 ; (w) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115; (x) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (y) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123; (z) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 ; (aa) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131 ; (bb) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135; (cc) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (dd) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68; (ee) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69; (ff) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70; (gg) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:71 ; (hh) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72; (ii) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (jj) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (kk) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:9 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (II) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ; (mm) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; (nn) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37; (oo) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; (pp) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; (qq) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61 ; (rr) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (ss) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; (tt) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 11 ; (uu) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 15 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (vv) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127; (ww) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135; (xx) una cadena pesada variable que comprende una región determinante de complementariedad (CDR)1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (yy) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; (zz) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 1 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ; (aaa) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (bbb) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; (ccc) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24; (ddd) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; (eee) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32; (fff) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; (ggg) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40; (hhh) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44; (iii) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; (jjj) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:52 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56; (kkk) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60; (III) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:62, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:63, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:64; (mmm) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92 o 153, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93 o 154, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:94 o 155; (nnn) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96 o 156, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 o 157, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98 o 158; (ooo) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:100, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (ppp) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; (qqq) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:108, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; (rrr) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 12, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 1 13, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (sss) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:117, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 18; (ttt) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (uuu) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (vvv) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; (www) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; (xxx) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NQ: 138; (yyy) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (zzz) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68; (aaaa) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69; (bbbb) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70; (cccc) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:71 ; (dddd) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72; (eeee) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (ffff) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; (gggg) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (hhhh) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92 o 153, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93 o 154, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:94 o 155 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96 o 156, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 o 157, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98 o 158; (iiii) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0: 100, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.? 06; (jjjj) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:109, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 12, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 14; (kkkk) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 16, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 17, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 121 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:122; (lili) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; (mmmm) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138; (nnnn) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 68 ; (oooo) una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69; (pppp) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70; (qqqq) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:71 ; (rrrr) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72; (ssss) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (tttt) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (uuuu) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0: 19, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24; (vvvv) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32; (wwww) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40; (xxxx) una cadena pesada de dominio variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44, y una cadena ligera de dominio variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; (yyyy) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56; (zzzz) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:62, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:63, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:64.

El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, una molecula de inmunoglobulina, un Fv enlazado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, uno de afinidad madura, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo injertado con CDR, un dianticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo específico doble, un DVD, un Fab’, un anticuerpo biespecífico, un F(ab’)2, o un Fv. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser humano. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en dominio constante de IgM humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de I g G 1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, o un dominio constante de IgA humana. El dominio constante de I g G 1 humana puede comprender, o consistir en, la SEQ ID NO: 140.

El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender una región variable pesada que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:91 , SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 1 15, SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 131.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender una región variable ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO:95, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 1 1 1 , SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO:135.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:68, o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:69, o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:70, o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:71 , o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:72, o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:73, o SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, o SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40, o SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:56, o SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64, o SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97 y SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 1 12, SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO:1 14, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO:122, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 y SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO: 137 y SEQ I D NO: 138, y SEQ ID NO: 156, y SEQ ID NO:157 y SEQ ID NO: 158.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, o SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO:12, o SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, o SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36, o SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52, o SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59 y SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 y SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 y SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO:1 10, SEQ ID NO: 1 16, SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO.118, SEQ ID NO:124, SEQ ID N0.125 y SEQ ID NO:126, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 153, y SEQ ID NO: 154 y SEQ ID NO: 155.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:1 1 y SEQ ID NO: 12, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO:16.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 18, SEQ ID N0:19 y SEQ ID NO:20, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:56.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59 y SEQ ID NO:60, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 y SEQ ID NO:44, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:48.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:92 o 153, SEQ ID NO:93 o 154, y SEQ ID NO:94 o 155, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:96 o 156, SEQ ID NO:97 o 157, y SEQ ID NO:98 o 158.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID N0:100, SEQ ID NQ: 101 y SEQ ID NO: 102, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NQ: 104, SEQ ID NO:105 y SEQ ID NO: 106.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:108, SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 1 10, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 1 12, SEQ ID NO:1 13 y SEQ ID NO: 1 14.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:116, SEQ ID NO: 1 17 y SEQ ID NO: 1 18, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO:121 y SEQ ID NO: 122.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO:129 y SEQ ID NO:130.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:132, SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 134, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO:137 y SEQ ID NO:138.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un agente seleccionado del grupo que consiste en: una molécula de inmunoadhesión, un agente de imagenología y un agente terapéutico. El agente de imagenología puede ser una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminescente, una marca bioluminescente, una marca magnética, o biotina. La radiomarca puede ser 3H, 14C, 35S, 90Y, "TC, 111 ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, o 153Sm.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une al epítopo de RGMa PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (SEQ ID NO:79). El anticuerpo que se une al epítopo de RGMa PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (SEQ ID NO:79) puede comprender un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID N 0.8.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa”). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-H1 , H2 y H3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5 (fórmula 1 - CDR-H1 ), en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, D, E, N, G y T; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, L, S y Q; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, D, A, T y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y W; y Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, N, H, A, T y Q; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa1 1— Xaa12— Xaa13— Xaa14— Xaa15— Xaa16-(Xaa)n (fórmula 2-CDR-H2), en donde n es 0 o 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en W, V, A, G, L, E, S y N; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y F; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, N, D, F y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, Y, G, W, H, A y S; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, N, D, E, S, K, G y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, D, T y N; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, I, E, N y R; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, L, R, S, T y Y; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, K, G, N, I, y Y; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, G, Y, T y K; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, F, N y H; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, T, V, P, L y S; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D, P y S; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, S, N y L; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, F, V, K y R; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, K, R y S; y Xaa17 es una glicina; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6-(Xaa)n (fórmula 3- CDR- H3), en donde n es 0-1 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, S, E, N, L, D, Q y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, T, R, Y, L, I, D y S; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L, Y, N, E, K, A y F; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, Y, A, V, G, T, E y W; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, S, L, D, G, H y P; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu y Cys; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Lys, Asp, Ala y Gln; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro y Tyr; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His y Phe; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp y Asp; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly y Asp; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Pro y Tyr; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Leu y Phe; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp y Gly; y Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Asp y Tyr.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa”). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable ligero que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR- L1 , L2 y L3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa1 1 -(Xaa)n (fórmula 1 - CDR-L1 ), en donde n es 0-3, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, R, G y Q; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, D, S, N y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, K, G, Q, N y E; Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, L, G, I, D y P; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, N, H y I; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, I, S, G y H; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, K, A, S, I, N, T y D; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Y, A, C, S y F; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, G, L, V y N; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, C, Y, H, R, N y S; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly, Ala y Val; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val y Asn; y Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser e His; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7-(Xaa)n (fórmula 2-CDR-L2), en donde n es 0-4, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Q, G, V, Y, S y E; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, N y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, Y, N y K; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, N, D, Q y T; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, G, S y L; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, I, y E; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, H, I, y T; Xaa8 es Asn; Xaa9 es Lys; y Xaa10 es Gly; Xaa1 1 es Asp; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9- (Xaa)n (fórmula 3- CDR-L3), en donde n es 0-2, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, T, Q y V; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, W y S; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, G, S, H y Y; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, N, P, D, V y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, T, S, G, L, F y Y; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, T, L, I, P y S; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, G, R, Y, D, N, W, L, F y P; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, V, G, T y H; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr e His; Xaa1 1 es Leu o Val.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa”), en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-H1 , H2 y H3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5 (fórmula 1 - CDR-H1 ), en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, D, E, N, G y T; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, L, S y Q; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, D, A, T y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y W; y Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, N, H, A, T y Q; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12— Xaa13— Xaa14— Xaa15— Xaa16-(Xaa)n (fórmula 2-CDR-H2), en donde n es 0 o 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, A, G, L, G, S y N; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y F; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, N, D, F y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, Y, G, W, H, A y S; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, N, D, E, S, K, G y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, D, T y N; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, I, E, N y R; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, L, R, S, T y Y; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, K, G, N, I, y Y; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, G, Y, T y K; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, F, N y H; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, T, V, P, L y S; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D, P y S; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, S, N y L; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, F, V, K y R; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, K, R y S; y Xaa17 es una glicina; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6-(Xaa)n (fórmula 3- CDR- H3), en donde n es 0-1 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, S, E, N, L, D, Q y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, T, R, Y, L, I, D y S; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L, Y, N, E, K, A y F; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, Y, A, V, G, T, E y W; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, S, L, D, G, H y P; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu y Cys; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Lys, Asp, Ala y Gln; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro y Tyr; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His y Phe; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp y Asp; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly y Asp; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Pro y Tyr; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Leu y Phe; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp y Gly; y Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Asp y Tyr; y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo también comprende un dominio variable ligero que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-L1 , L2 y L3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11-(Xaa)n(fórmula 1-CDR-L1), en donde n es 0-3, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, R, G y Q; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, D, S, N y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, K, G, Q, N y E; Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, L, G, I, D y P; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, N, H y I; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, I, S, G y H; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, K, A, S, I, N, T y D; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Y, A, C, S y F; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, G, L, V y N; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, C, Y, H, R, N y S; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly, Ala y Val; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val y Asn; y Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser e His; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7-(Xaa)n (fórmula 2-CDR-L2), en donde n es 0-4, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Q, G, V, Y, S y E; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, N y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, Y, N y K; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, N, D, Q y T; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, G, S y L; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, I, y E; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, H, I, y T; Xaa8 es Asn; Xaa9 es Lys; y Xaa10 es Gly; Xaa1 1 es Asp; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9-(Xaa)n (fórmula 3- CDR-L3), en donde n es 0-2, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, T, Q y V; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, W y S; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, G, S, H y Y; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, N, P, D, V y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, T, S, G, L, F y Y; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, T, L, I, P y S; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, G, R, Y, D, N, W, L, F y P; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, V, G, T y H; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr e His; Xaa1 1 es Leu o Val.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a una composición farmaceutica que comprende el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o mezcla o derivado del mismo, que se describen en la presente.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método de tratamiento, prevención, modulación o atenuación de una enfermedad o trastorno asociado con la degeneración de neuritas, que comprende administrarle al sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo descrito en la presente. El trastorno degenerativo de neuritas puede ser esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades motoneuronales; enfermedad de Tay-Sachs; enfermedad de Niemann-Pick; enfermedad de Gaucher; síndrome de Hurler; enfermedades desmielinizantes inflamatorias idiopáticas; deficiencia de vitamina B12; mielinólisis pontina central; tabes dorsal; mielitis transversa; enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva; neuritis óptica; lesión traumática del SNC; ataque cerebral isquémico; una retinopatía, tal como glaucoma, retinopatía diabética o degeneración macular dependiente de la edad; y una leucodistrofla.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para determinar si un sujeto tiene un trastorno degenerativo de neuritas. El método puede comprender medir el nivel de RGMa en una muestra del sujeto; y comparar el nivel de RGMa de la muestra con un control normal. Un nivel alterado de RGMa indica que el sujeto tiene un trastorno degenerativo de neuritas. Un aumento del nivel de RGMa en comparación con el control normal indica que el sujeto tiene trastorno degenerativo de neuritas. La muestra puede ser una muestra de sangre o una muestra de suero o una muestra de fluido cerebroespinal. El paso de medir el nivel de RGMa en una muestra puede ser realizado con un inmunoensayo. El inmunoensayo puede ser un ensayo de inmunoadsorbente enlazado a enzimas (ELISA). El ELISA puede ser un ELISA de sándwich.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 67.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 68.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 69.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 70.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 71.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 72.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 73.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado que comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 67, 68, 69, 70, 71 , 72, o 73, que se une al epítopo de RGMa PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (SEQ ID NO:79).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra los resultados del análisis de un ensayo de crecimiento de neurita usando 50 mI/mL de un fragmento de hRGMa. Este fragmento abarca los aminoácidos N-terminales 47-127 de SEQ ID NO:65 (véase SEQ ID NO: 139), y contiene dominios de interacción de neogenina y la proteína morfogénica de hueso de alta afinidad.

La figura 2 muestra los resultados del análisis del ensayo de crecimiento de neurita usando 50 mg/mL de hRGMa de longitud completa.

La figura 3 muestra una gráfica de barras que refleja el grado de crecimiento regenerativo in vivo de axones de células ganglionares retínales de manera perilesional (0-500 pm) en presencia del anticuerpo AE12-1.

La figura 4 muestra una gráfica de barras que refleja el grado de crecimiento regenerativo in vivo de axones de células ganglionares retínales (500-1000 pm) en presencia del anticuerpo AE12-1 , en comparación directa con 5F9.23 humana.

La figura 5 muestra espectros de MS de la fracción E1 reducida de hRGMa de E. coli cortada con tripsina/Asp-N, con mAb AE12-1 , que muestra los estados de carga +3 y +4 (enmarcados) de dos péptidos que corresponden a las secuencias mostradas en el espectro (SEQ ID NOs: 74 y 80, respectivamente, en orden de aparición). Los picos marcados con * son péptidos que no pudieron asignarse al antígeno hRGMa y pueden estar relacionados con el anticuerpo.

Las figuras 6A y 6B muestran los espectros de MS (figura 6A) y MS/MS (figura 6B) de la fracción E1 reducida desnaturalizada de hRGMa (construcción MYC) con mAb AE12-1 cortado con tripsina y Asp-N, confirmando la secuencia del péptido cortado como KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO:81 ).

Las figuras 7A y 7B muestran los espectros de MS (figura 7A) y MS/MS (figura 7B) de la fracción E1 reducida desnaturalizada de hRGMa (construcción MYC) con mAb AE12-1 cortado con tripsina y Asp-N, confirmando la secuencia del péptido cortado como AGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO:89).

La figura 8 muestra microfotografías de lesiones de nervio en ratas tratadas con un anticuerpo de control (hlgG a 10 mg/kg; véase el cuadro superior), anticuerpo AE12-1 a 1 mg/kg (véase el cuadro central), o anticuerpo h5F9.23 a 1 mg/kg (véase el cuadro inferior).

La figura 9 muestra los resultados de un análisis de crecimiento de neurita de células SH-SY5Y sobre placas de 96 pocilios recubiertos con fíbronectina como substrato después de tratamiento con RGMa humana de longitud completa y su neutralización con AE12-1 (gráfica de barras superior) y AE12-1 -H (gráfica de barras inferior). El anticuerpo y la hRGMa de longitud completa se agregaron al mismo tiempo y subsiguientemente los cultivos se incubaron 24 horas.

La figura 10 muestra los resultados de un análisis de crecimiento de neurita de células SH-SY5Y sobre placas de 96 pocilios recubiertos con fíbronectina como substrato después de tratamiento con RGMa humana de longitud completa y su neutralización con AE12-1 -K (gráfica de barras superior) y AE12-1 -F (gráfica de barras inferior). El anticuerpo y la hRGMa de longitud completa se agregaron al mismo tiempo y subsiguientemente los cultivos se incubaron 24 horas.

La figura 1 1 muestra los resultados de un análisis de crecimiento de neurita de células SH-SY5Y sobre placas de 96 pocilios recubiertos con fíbronectina como substrato después de tratamiento con RGMa humana de longitud completa y su neutralización con AE-12-1 -1 (gráfica de barras superior) y AE-12-L (gráfica de barras inferior). El anticuerpo y la hRGMa de longitud completa se agregaron al mismo tiempo y subsiguientemente los cultivos se incubaron 24 horas.

La figura 12 muestra los resultados de un análisis de crecimiento de neurita de células SH-SY5Y sobre placas de 96 pocilios recubiertos con fibronectina como substrato después de tratamiento con RGMa humana de longitud completa y su neutralización con AE12-1 -V (gráfica de barras superior) y AE-12-1 -Y (gráfica de barras inferior). El anticuerpo y la hRGMa de longitud completa se agregaron al mismo tiempo y subsiguientemente los cultivos se incubaron 24 horas.

La figura 13 muestra los resultados de un ensayo de unión de RGMa sobre células SH-SY5Y y neuronas primarias (HCA High Content Analysis) usando AE12-6, AE12-15 y AE12-23.

La figura 14 muestra los resultados de un ensayo de inhibición de la unión de RGMa sobre células SH-SY5Y (por medio de High Content Analysis (HCA)) usando AE12-1 y las variantes de cisteína de AE12-1.

La figura 15 muestra el efecto neutralizante de AE12-1 y AE12-6 sobre la repulsión de RGMa de crecimiento de neurita en un ensayo de crecimiento de neurita sobre neuronas primarias de hipocampo (He) de rata. Se usó como control el anticuerpo r5F9.

La figura 16 muestra que tres (3) anticuerpos monoclonales selectivos de RGMa, específicamente AE12-1 , AE12-1 Y y h5F9.23, inducen regeneración masiva de fibras GAP-43 positivas más allá del sitio de aplastamiento que se describe en el ejemplo 9. Eje Y = número de fascículos de axón en el área de 0-500 mm más allá del sitio de aplastamiento. *** p<0.001 : significancia contra hlgG; ** p<0.01 : significancia contra hlgG; * p <0.05: significancia contra IgG humana.

La figura 17 muestra que tres (3) anticuerpos monoclonales selectivos de RGMa, específicamente AE12-1 , AE12-1 Y y h5F9.23, aumentan el número de fascículos axonales retínales, protegiendo con ello la capa de fibra del nervio retinal. Eje Y = número de fascículos de fibra en la retina, como se describe en el ejemplo 10. ** p<0.01 : significancia contra hlgG; * p <0.05: significancia contra hlgG.

La figura 18 muestra que los mAbs de RGMa AE12-1 , AE12-1 Y y h5F9.23 aceleran la recuperación funcional en el modelo tEAE espinal como se describe en el ejemplo 11. El tratamiento con anticuerpo (i.v.) se inició aproximadamente una semana después de la inyección de citocina y se repitió una vez por semana. Las dosis administradas fueron de 10 mg/kg. *** p<0.001 : significancia contra hlgG; ** p<0.01 : significancia contra hlgG; * p<0.05: significancia contra hlgG.

La figura 19 muestra que los mAbs de RGMa AE12-1 , AE12-1 Y y ABT-207 (h5F9.23) aumentan el área de GAP-43 y MBP, y disminuyen la lesión inflamatoria en comparación directa con el anticuerpo de control de IgG humana, como se describe en el ejemplo 11. *** p<0.001 : significancia contra hlgG; ** p<0.01 : significancia contra hlgGM * p<0.05: significancia contra hlgG.

La figura 20 muestra que el mAb de RGMa AE12-1 Y-QL acelera la recuperación funcional en el modelo de tEAE espinal a tres dosis diferentes: 0.1 , 1 y 10 mg/kg, administradas una vez por semana por vía intravenosa como se describe en el ejemplo 1 1. El tratamiento con el anticuerpo (i.v.) se inició aproximadamente una semana después de la inyección de citocina y se repitió una vez por semana. * **** p<0.001 : significancia contra hlgG; ** p<0.01 : significancia contra hlgG; * p<0.05: significancia contra hlgG.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Los inventores han descubierto anticuerpos nuevos que se unen a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa”) y se puede usar para tratar enfermedades relacionadas con la degeneración de la neurita. Se proveen aquí anticuerpos específicos y no específicos que son capaces de atenuar los signos clínicos asociados con las enfermedades relacionadas con la degeneración de neurita. 1. Definiciones La terminología usada en la presente únicamente tiene la finalidad de describir modalidades particulares y no tiene la intención de ser limitativa. Como se usa en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un/una” y “el/la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. a. Aproximadamente “Aproximadamente”, como se usa aquí, se puede referir a una variación de aproximadamente +/- 10% del valor indicado. Se entiende que tal variación siempre está incluida en cualquier valor dado provisto en la presente, ya sea que se haga o no referencia específica a la misma. b. Anticuerpo de afinidad madura “Anticuerpo de afinidad madura” se usa aquí para referirse a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDRs, que resulta en un mejoramiento de la afinidad del anticuerpo (es decir, KD, kd o ka) por un antígeno objetivo, en comparación con un anticuerpo progenitor que no posee la alteración. Los anticuerpos de afinidad madura ejemplares tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno objetivo. Se conocen una variedad de procedimientos para producir anticuerpos de afinidad madura, que incluyen el cribado de una colección combinatoria de anticuerpo que ha sido preparada usando bio-presentación. Por ejemplo, Marks et al., BioTechnology, 10:779-783 (1992) describen la maduración de afinidad por barajado del dominio de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de armazón ha sido descrita por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 : 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol, 154(7): 3310-3319 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). La mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva y en posiciones de contacto o hipermutación con un residuo de aminoácido incrementador de actividad, se ha descrito en la patente de EE. UU. No. 6,914, 128 B1. c. Anticuerpo v anticuerpos “Anticuerpo” y “anticuerpos”, como se usa aquí, se refiere a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados (parcial o totalmente humanizados), anticuerpos de animal, tales como por ejemplo, sin limitación, anticuerpos de un ave (por ejemplo, un pato o un ganso), un tiburón, ballena y un mamífero, que incluye un mamífero no primate (por ejemplo, una vaca, cerdo, camello, llama, caballo, cabra, conejo, oveja, hámster, conejillo de indias, gato, perro, rata, ratón, etc.), o un primate no humano (por ejemplo, un mono, chimpancé, etc.), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, Fvs de una sola cadena (“scFv”), anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos de un solo dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), fragmentos F(ab’)2, Fvs enlazados por disulfuro (“sdFv”), anticuerpos anti-idiotípicos (“anti-ld”), anticuerpos de dominio doble, anticuerpos de dominio variable doble (DVD) o de dominio variable triple (TVD) (las inmunoglobulinas de dominio variable doble y los métodos para prepararlas se describen en Wu, C. , et al., Nature Biotechnology, 25(1 1 ): 1290-1297 (2007) y solicitud internacional de PCT WO 2001/058956, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia), y fragmentos de unión de epítopo funcionalmente activos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, particularmente moléculas que contienen un sitio de unión de analito. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e Ig Y) , clase (por ejemplo, IgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, Ig 1 e lgA2) o subclase. Para efectos de simplicidad, un anticuerpo contra un analito es referido frecuentemente en la presente como un “anticuerpo anti-analito” o únicamente como un “anticuerpo de analito” (p. ej . , un anticuerpo anti-RGMa o un anticuerpo de RGMa). d. Fragmento de anticuerpo “Fragmento de anticuerpo”, como se usa aquí, se refiere a una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión de antígeno o región variable. La porción no incluye los dominios constantes de cadena pesada (es decir, CH2, CH3 o CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fe del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, sin limitación, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, dianticuerpos, moléculas de Fv de una sola cadena (scFv), polipéptidos de una sola cadena que contienen sólo un dominio variable de cadena ligera, polipéptidos de una sola cadena que contienen las tres CDRs del dominio variable de cadena ligera, polipéptidos de una sola cadena que contienen sólo una región variable de cadena pesada, y polipéptidos de una sola cadena que contienen las tres CDRs de la región variable de cadena pesada. e. Constantes de unión Se describen aquí “constantes de unión”. Los términos “constante de velocidad de asociación”, “kon” o “ka”, como se usan aquí, se refieren al valor que indica la velocidad de unión de un anticuerpo a su antígeno objetivo, o la velocidad de formación de complejo entre un anticuerpo y un antígeno, como lo muestra la ecuación siguiente: Anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag) ® Ab-Ag.

Los términos “constante de la velocidad de disociación”, “koff" o “kd”, usados aquí intercambiablemente, se refieren al valor que indica la velocidad de disociación de un anticuerpo de su antígeno objetivo, o de separación en el tiempo del complejo Ab-Ag en el anticuerpo y antígeno libres, como lo muestra la ecuación siguiente: Anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag) <- Ab-Ag.

Los métodos para determinar las constantes de la velocidad de asociación y disociación son muy conocidos. El uso de téenicas basadas en fluorescencia ofrece alta sensibilidad y la capacidad de examinar las muestras en amortiguadores fisiológicos en el equilibrio. Se pueden utilizar otras aproximaciones experimentales e instrumentos tales como un ensayo BIAcore® (análisis de interacción biomolecular) (p. ej . , el instrumento disponible de BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Adicionalmente, también se puede usar el ensayo KinExA® (ensayo de exclusión cinética), disponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).

Los términos “constante de disociación en el equilibrio” o “KD", usados aquí intercambiablemente, se refieren al valor obtenido dividiendo la velocidad de disociación (k0ff) entre la velocidad de asociación (kon)· La velocidad de asociación, la velocidad de disociación y la constante de disociación en el equilibrio se usan para representar la afinidad de unión de un anticuerpo a su antígeno. f. Proteína de unión “Proteína de unión” se usa aquí para hacer referencia a una proteína monomérica o multimérica que se une con un socio de unión y forma un complejo con el mismo, tal como por ejemplo un polipéptido, antígeno, compuesto químico u otra molécula, o un substrato de cualquier tipo. Una proteína de unión se une específicamente a un socio de unión. Las proteínas de unión incluyen anticuerpos y también fragmentos de unión de antígeno de los mismos, y otras formas y derivados de los mismos como es conocido en la téenica y se describe más abajo en este documento, y otras moléculas que comprenden uno o más dominios de unión de antígeno que se unen a una molécula de antígeno o un sitio particular (epítopo) en la molécula de antígeno. Por consiguiente, una proteína de unión incluye, sin limitación, un anticuerpo, una inmunoglobulina tetramérica, una molécula de IgG, una molécula de IgG^ un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de afinidad madura, y fragmentos de cualquiera de estos anticuerpos que retienen la capacidad de unirse a un antígeno. q. Anticuerpo biespecífico “Anticuerpo biespecífico” se usa aquí para hacer referencia a un anticuerpo de longitud completa que es generado por tecnología de cuadroma (véase Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)), por conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase Staerz et al., Nature, 314(6012): 628-631 (1985)), o por medio de la tecnología denominada “botón en ojal” o aproximaciones similares, que introducen mutaciones en la región Fe (véase Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90(14):6444-6448 (1993)), dando como resultado múltiples especies diferentes de inmunoglobulina de las cuales sólo una es el anticuerpo biespecífico funcional. Un anticuerpo biespecífico se une a un antígeno (o epítopo) sobre uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC), y se une a un antígeno diferente (o epítopo) en su segundo brazo (un par de HC/LC diferente). Según esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión de antígeno distintos (tanto en especificidad como en secuencias de CDR), y es monovalente para cada antígeno al que se une. h. CDR “CDR” se usa aquí para hacer referencia a la “región determinante de complementariedad” dentro de una secuencia variable de anticuerpo. Existen tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que son designadas “CDR1”, “CDR2” y “CDR3”, para cada una de las regiones variables. El término “serie de CDR”, como se usa aquí, se refiere a un grupo de tres CDRs que ocurren en una sola región variable que se une al antígeno. Los límites exactos de estas CDRs han sido definidos diferentemente de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991 )) no sólo provee un sistema de numeración de residuos no ambiguo, aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también provee límites precisos de residuo que definen las tres CDRs. Estas CDRs pueden ser referidas como las “CDRs de Kabat”. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987), y Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) encontraron que ciertas subporciones dentro de las CDRs de Kabat adoptan conformaciones de esqueleto de péptido casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad en la secuencia de aminoácidos. Estas subporciones fueron designadas como “ L 1” , “L2” y “L3”, o “H1”, “H2” y “H3”, en donde la "L” y la “H” designan las regiones de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden ser referidas como “CDRs de Chothia”, que tienen límites que se traslapan con las CDRs de Kabat. Otros límites que definen las CDRs que se traslapan con las CDRs de Kabat han sido descritos por Padlan, FASEB J. 9: 133-139 (1995), y MacCallum, J. Mol. Biol. 262(5):732-45 (1996). Otras definiciones de límite de CDR pueden no seguir estrictamente los sistemas anteriores, pero no obstante se traslaparán con las CDRs de Kabat, aunque pueden ser acortadas o agrandadas a la luz de hallazgos de predicción o experimentales, de que residuos o grupos de residuos particulares o incluso CDRs completas no alteren significativamente la unión del antígeno. Los métodos usados en la presente pueden utilizar las CDRs definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque algunas modalidades utilizan las CDRs definidas por Kabat o Chothia. i. Componente o componentes “Componente”, “componentes”, o “por lo menos un componente” se refieren en general a un anticuerpo de captura, un calibrador de detección o conjugado, un control, un panel de sensibilidad, un recipiente, una solución amortiguadora, un diluente, una sal, una enzima, un cofactor para una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/solución de pretratamiento, un substrato (p. ej . , como una solución), una solución de detención, y similares, que se pueden incluir en un kit para el ensayo de una muestra de prueba, tal como una muestra de orina, suero o plasma de un paciente, de acuerdo con los métodos descritos en la presente y otros métodos conocidos. Algunos componentes pueden estar en solución o liofilizados para reconstitución para usarse en un ensayo. i. Consenso o secuencia de consenso “Consenso” o “secuencia de consenso”, como se usan aquí, se refieren a una secuencia de ácido nucleico sintético, o secuencia de polipéptido correspondiente, construida basándose en el análisis de una alineación de múltiples subtipos de un antígeno particular. La secuencia se puede usar para inducir inmunidad amplia contra múltiples subtipos o serotipos de un antígeno particular. Los antígenos sintéticos, tales como proteínas de fusión, se pueden manipular para hacer secuencias de consenso (o antígenos de consenso). k. Control “Control”, como se usa aquí, se refiere a una composición conocida que no contiene un analito de interés (“negativo”), por ejemplo, RGMa (tal como RGMa asociada a membrana, RGMa soluble, fragmentos de RGMa asociada a membrana, fragmentos de RGMa soluble, variantes de RGMa (RGMa asociada a membrana o soluble) o cualquier combinación de los mismos, o que contiene un analito de interés (“control positivo”), por ejemplo, RGMa (tal como RGMa asociada a membrana, RGMa soluble, fragmentos de RGMa asociada a membrana, fragmentos de RGMa soluble, variantes de RGMa (RGMa asociada a membrana o soluble) o cualquier combinación de los mismos. Un control positivo puede comprender una concentración conocida de RGMa. “Control”, “control positivo” y “calibrador”, se pueden usar aquí intercambiablemente para hacer referencia a una composición que comprende una concentración conocida de RGMa. Un “control positivo” se puede usar para establecer las características de rendimiento del ensayo y es un indicador útil de la integridad de los reactivos (p. ej . , analitos). Un “control normal” se puede referir a una muestra o un sujeto que está libre de una enfermedad o trastorno relacionado con el hierro.

I. Derivado “Derivado” de un anticuerpo, como se usa aquí, se puede referir a un anticuerpo que tiene una o más modificaciones en su secuencia de aminoácidos en comparación con un anticuerpo genumo o progenitor y exhibe una estructura de dominio modificada. El derivado todavía puede ser capaz de adoptar la configuración de dominio típica encontrada en los anticuerpos nativos, así como también una secuencia de aminoácidos, que es capaz de unirse a los objetivos (antígenos) con especificidad. Los ejemplos típicos de derivados de anticuerpo son los anticuerpos acoplados con otros polipéptidos, dominios de anticuerpo reordenados o fragmentos de anticuerpos. El derivado también puede comprender por lo menos un compuesto adicional, por ejemplo un dominio de proteína, dicho dominio de proteína estando enlazado por medio de enlaces covalentes o no covalentes. El enlace puede estar basado en la fusión genética de acuerdo con los métodos conocidos. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el anticuerpo utilizado de acuerdo con la invención, preferiblemente, puede estar enlazado por medio de un enlazador flexible, convenientemente un péptido enlazador, en donde dicho péptido enlazador comprende varios aminoácidos hidrófilos con enlaces peptídicos, de longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal del dominio de proteína adicional y el extremo N-terminal del anticuerpo, o viceversa. El anticuerpo puede estar enlazado a una molécula efectora que tiene una conformación adecuada para la actividad biológica o unión selectiva a un soporte sólido, a una sustancia biológicamente activa (p. ej . , una citocina u hormona de crecimiento), a un agente químico, un péptido, una proteína o un fármaco, por ejemplo. m. Anticuerpo doblemente específico “Anticuerpo doblemente específico” se usa aquí para hacer referencia a un anticuerpo de longitud completa que se puede unir a dos antígenos (o epítopos) diferentes en cada uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) (véase la publicación de PCT WO 02/02773). Por consiguiente, una proteína de unión doblemente específica tiene dos brazos de unión de antígeno idénticos, con especificidad idéntica y secuencias de CDR idénticas, y es bivalente para cada antígeno al que se une. n. Dominio variable doble “Dominio variable doble” se usa aquí para referirse a dos o más sitios de unión de antígeno sobre una proteína de unión, que puede ser una proteína de unión divalente (dos sitios de unión de antígeno), tetravalente (cuatro sitios de unión de antígeno) o multivalente. Los DVDs pueden ser monoespecíficos, es decir, capaces de unirse a un antígeno (o un epítopo específico), o multiespecíficos, es decir, capaces de unirse a dos o más antígenos (es decir, dos o más epítopos de la misma molécula de antígeno objetivo, o dos o más epítopos de antígenos objetivo diferentes). Una proteína de unión de DVD preferida comprende dos polipéptidos DVD de cadena pesada y dos poli pé pt idos DVD de cadena ligera, y es referida como una “inmunoglobulina DVD” o “DVD-lg”. Así, esta proteína de unión DVD-lg es tetramérica y reminiscente de una molécula de IgG, pero provee más sitios de unión de antígeno que una molécula de IgG. De esta manera, cada mitad de una molécula de DVD-lg tetramérica es reminiscente de una mitad de una molécula de IgG y comprende un polipéptido DVD de cadena pesada y un polipéptido DVD de cadena ligera, pero a diferencia de un par de cadenas pesada y ligera de una molécula de IgG que provee un solo dominio de unión de antígeno, un par de cadenas pesada y ligera de una DVD-lg provee dos o más sitios de unión de antígeno.

Cada sitio de unión de antígeno de una proteína de unión DVD-lg se puede derivar de un anticuerpo monoclonal donador (“progenitor”) y de esta manera comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), con un total de seis CDRs implicadas en la unión de antígeno por sitio de unión de antígeno. Por consiguiente, una proteína de unión DVD-lg que se une a dos epítopos diferentes (es decir, dos epítopos diferentes de dos moléculas de antígeno diferentes, o dos epítopos diferentes de la misma molécula de antígeno), comprende un sitio de unión de antígeno derivado de un primer anticuerpo monoclonal progenitor y un sitio de unión de antígeno de un segundo anticuerpo monoclonal progenitor.

Una descripción del diseño, expresión y caracterización de moléculas de unión de DVD-lg se provee en la publicación de PCT WO 2007/024715, patente de EE. UU. No. 7,612,181 , y Wu et al., Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007). Un ejemplo preferido de estas moléculas de DVD-lg comprende una cadena pesada que comprende la fórmula estructural VD1 -(X 1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlazador, con la condición de que no es CH1 , X2 es una región Fe, y n es 0 o 1 , preferiblemente 1 ; y una cadena ligera que comprende la fórmula estructural VD1-(X1 )n-VD2-C(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición de que no es CH1 , y X2 no comprende una región Fe; y n es 0 o 1 , preferiblemente 1. Tal DVD-lg puede comprender dos de estas cadenas pesadas y dos de estas cadenas ligeras, en donde cada cadena comprende dominios variables enlazados en tándem sin una región constante intermedia entre las regiones variables, en donde una cadena pesada y una cadena ligera se asocian para formar sitios de unión de antígeno funcionales en tándem, y un par de cadenas pesada y ligera se pueden asociar con otro par de cadenas pesada y ligera para formar una proteína de unión tetramérica con cuatro sitios de unión de antígeno funcionales. En otro ejemplo, una molécula de DVD-lg puede comprender cadenas pesadas y ligeras que comprenden, cada una, tres dominios variables (VD1 , VD2, VD3) enlazados en tándem sin una región constante intermedia entre los dominios variables, en donde un par de cadenas pesada y ligera se pueden asociar para formar tres sitios de unión de antígeno, y en donde un par de cadenas pesada y ligera se pueden asociar con otro par de cadenas pesada y ligera para formar una proteína de unión tetramérica con seis sitios de unión de antígeno.

En una modalidad preferida, una proteína de unión DVD-lg de acuerdo con la invención no sólo se une a las mismas moléculas objetivo enlazadas por sus anticuerpos monoclonales progenitores, sino que también posee una o más propiedades deseables de uno o más de sus anticuerpos monoclonales progenitores. Preferiblemente, tal propiedad adicional es un parámetro de anticuerpo de uno o más de los anticuerpos monoclonales progenitores. Los parámetros de anticuerpo a los que puede contribuir uno o más de los anticuerpos monoclonales progenitores de la proteína de unión DVD-lg, incluyen, sin limitación, especificidad de antígeno, afinidad de antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítopo, estabilidad de proteína, solubilidad de proteína, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada en el tejido, y unión de antígeno ortólogo.

Una proteína de unión DVD-lg se une a por lo menos un epítopo de RGMa. Ejemplos no limitativos de una proteína de unión DVD-lg incluyen una proteína de unión DVD-lg que se une a uno o más epítopos de RGMa, una proteína de unión DVD-lg que se une a un epítopo de una RGMa humana y un epítopo de una RGMa de otra especie (por ejemplo, ratón), y una proteína de unión DVD-lg que se une a un epítopo de una RGMa humano y un epítopo de otra molécula objetivo (por ejemplo, VEGFR2 o VEGFR1 ). o. Epítopo o epítopos “Epítopo” o “epítopos", o “epítopos de interés” se refieren a uno o más sitios sobre cualquier molécula, que son reconocidos por uno o más sitios complementarios de su socio de unión específico, y que se pueden unir a los mismos. La molécula y el socio de unión específico son parte de un par de unión específico. Por ejemplo, un epítopo puede estar sobre un antígeno de polipéptido, proteína, hapteno, carbohidrato (tal como por ejemplo, sin limitación, glicolípido, glicoproteína o lipopolisacárido), o un polisacárido. Su socio de unión específico puede ser, sin limitación, un anticuerpo. p. Armazón o secuencia de armazón “Armazón” (FR) o “secuencia de armazón”, como se usan aquí, pueden significar las secuencias remanentes de una región variable menos las CDRs. Como la definición exacta de una secuencia de CDR puede ser determinada por diferentes sistemas (véase más arriba, por ejemplo), el significado de una secuencia de armazón está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDRs (CDR-L1 , -L2 y -L3 de cadena ligera y CDR-H1 , -H2 y -H3 de cadena pesada) también dividen las regiones de armazón de la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1 , FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en donde CDR1 está colocada entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1 , FR2, FR3 o FR4, una región de armazón, referida por otros, representa las FRs combinadas dentro de la región variable de una sola cadena de inmunoglobulina que ocurre naturalmente. Como se usa aquí, una FR representa una de las cuatro subregiones, y FRs representa dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región de armazón.

Las secuencias de FR de cadena pesada y cadena ligera humanas son conocidas y se pueden usar como secuencias de armazón “aceptoras” de cadena pesada y cadena ligera (o simplemente secuencias “aceptoras”) para humanizar un anticuerpo no humano usando las téenicas conocidas. En una modalidad, las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humanas se seleccionan de las secuencias de armazón listadas en las bases de datos públicamente disponibles, tales como V-base (htp://vbase. mrc-cpe.carn.ac.uk/) o en el sistema de información internacional ImMunoGeneTics® (IMGT®) (htp: //i mgt.cines.fr/texts/I GTrepertoire/LocusGenes/). q. Sitio de unión de antígeno funcional “Sitio de unión de antígeno funcional”, como se usa aquí, puede significar un sitio sobre una proteína de unión (p. ej . , un anticuerpo) que es capaz de unirse a un antígeno objetivo. La afinidad de unión de antígeno del sitio de unión de antígeno puede no ser tan fuerte como el de la proteína de unión progenitora, por ejemplo, el anticuerpo progenitor del que se deriva el sitio de unión de antígeno, pero la capacidad para unirse al antígeno debe ser mensurable usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de una proteína, por ejemplo un anticuerpo, a un antígeno. Además, no es necesario que la afinidad de unión de antígeno de cada uno de los sitios de unión de antígeno de una proteína multivalente, por ejemplo un anticuerpo multivalente, sea cuantitativamente la misma. r. Anticuerpo humano “Anticuerpo humano”, como se usa aquí, puede incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (p. ej . , mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro, o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, el término “anticuerpo humano”, como se usa aquí, no incluye anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en las secuencias de armazón de humano. s. Anticuerpo humanizado “Anticuerpo humanizado” se usa aquí para describir un anticuerpo que comprende secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (p. ej., un ratón) pero en el que por lo menos una porción de la secuencia VH y/o VL ha sido alterada para ser más “de tipo humano”, es decir, más similar a las secuencias variables de línea germinal humanas. Un “anticuerpo humanizado” es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región de armazón (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Como se usa aquí, el termino “sustancialmente”, en el contexto de una CDR, se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos dominios variables (Fab, Fab’, F(ab')2, FabC, Fv) en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador), y todas o sustancialmente todas las regiones de armazón son de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene la cadena ligera y también por lo menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1 , bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado sólo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada.

El anticuerpo humanizado se puede seleccionar de cualquier clase de inmunoglobulinas que incluyen IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo que incluye sin limitación IgG 1 , lgG2, lgG3 e lgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y los dominios constantes particulares se pueden seleccionar para optimizar las funciones efectoras deseadas usando téenicas muy conocidas.

Las regiones de armazón y CDRs de un anticuerpo humanizado no requieren corresponder precisamente con las secuencias progenitoras, p. ej . , la CDR del anticuerpo donador o el armazón de consenso pueden ser mutados por sustitución, inserción y/o supresión de por lo menos un residuo de aminoácido, de tal manera que el residuo de CDR o armazón en ese sitio no corresponda con el anticuerpo donador o el armazón de consenso. Sin embargo, en una modalidad preferida estas mutaciones no serán extensas. Usualmente por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, de preferencia por lo menos 90% y muy de preferencia por lo menos 95% de los residuos de anticuerpo humanizado corresponderán con las secuencias de FR y CDR progenitoras. Como se usa aquí, el término “armazón de consenso” se refiere a la región de armazón en la secuencia de inmunoglobulina de consenso. Como se usa aquí, el término “secuencia de inmunoglobulina de consenso” se refiere a la secuencia formada de los aminoácidos (o nucleótidos) que ocurren más frecuentemente en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (véase, p. ej . , Winnaker, “From Genes to Clones” (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1987)). Así, una “secuencia de inmunoglobulina de consenso” puede comprender una o más “regiones de armazón de consenso” y/o una o más “CDRs de consenso”. En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia de consenso es ocupada por el aminoácido que ocurre más frecuentemente en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos ocurren igual de frecuentemente, cualquiera puede ser incluido en la secuencia de consenso. t. Idéntico o identidad “Idéntico” o “identidad”, como se usa aquí en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido o polinucleótido, puede significar que las secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos que son iguales sobre una región especificada. El porcentaje se puede calcular alineando de manera óptima las dos secuencias, comparando las dos secuencias sobre la región especificada, determinando el número de posiciones en las que el residuo idéntico ocurre en las dos secuencias para producir el número de posiciones comcidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la región especificada, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. En los casos en donde las dos secuencias son de longitudes diferentes, o la alineación produce uno o más extremos tambaleados y la región de comparación especificada incluye sólo una secuencia única, los residuos de la secuencia única se incluyen en el denominador pero no en el numerador del cálculo. u. Polinucleótido aislado “Polinucleótido aislado”, como se usa aquí, significa un polinucleótido (p. ej . , de origen genómico, ADNc, o sintético, o una combinación de los mismos) que en virtud de su origen, el “polinucleótido aislado”: no está asociado con una parte o todo un polinucleótido con el cual se encuentra en la naturaleza el “polinucleótido aislado”; está enlazado operativamente con un polinucleótido con el que no está enlazado en la naturaleza; o no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. v. Marca v marca detectadle “Marca” y “marca detectable”, como se usan aquí, se refieren a una porción unida a un anticuerpo o un analito para hacer detectable la reacción entre el anticuerpo y el analito, y el anticuerpo o analito así marcado es referido como “marcado detectablemente”. Una marca puede producir una señal que es detectable por medios visuales o instrumentales. Varias marcas incluyen sustancias productoras de señal, tales como cromógenos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos radioactivos, y similares. Ejemplos representativos de marcas incluyen porciones que producen luz, por ejemplo compuestos de acridinio, y porciones que producen fluorescencia, por ejemplo fluoresceína. Se describen aquí otras marcas. A este respecto, la porción misma puede no ser detectable pero puede hacerse detectable por reacción con otra porción más. El uso del término “marcado detectablemente” abarca tal marcación.

Se puede usar cualquier marca detectadle adecuada como es conocido. Por ejemplo, la marca detectadle puede ser una marca radioactiva (tal como 3H, 125l, 35S, 14C, 32P y 33P), una marca enzimática (tal como peroxidasa de rádano, peroxidasa alcalina, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, y similares), una marca quimioluminiscente (tal como ésteres de acridinio, tioésteres o sulfonamidas; luminol, ¡soluminol, ésteres de fenantridinio, y similares), una marca fluorescente (tal como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-cardoxifluoresceína, 3’6-cardoxifluoresceína, 5(6)-cardoxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 3’6-cardoxifluoresceína, 5(6)-cardoxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, y similares)), rodamina, ficodiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos cuánticos (por ejemplo, selenuro de cadmio coronado con sulfuro de zinc), una marca termométrica, o una marca de reacción inmune de cadena de polimerasa. Una introducción a las marcas, procedimientos de marcación y detección de marcas se encuentra en Polak y Van Noorden, “Introduction to Immunocytochemistry", 2a edición, Springer Verlag, N.Y. (1997), y en Haugland, “Handdook of Fluorescent Prodes and Research Chemicals” (1996), que es un manual y catálogo combinado publicado por Molecular Probes, I n c. , Eugene, Oregon. Se puede usar una marca fluorescente en FPIA (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093 y 5,352,803, que se incorporan aquí como referencia en su totalidad). Un compuesto de acridinio se puede usar como una marca detectable en un ensayo quimioluminiscente homogéneo (véase, por ejemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Meó. Chem. Lett. 4:2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14:3917-3921 (2004); y Adamczyk et al., Org. Lett. 5:3779-3782 (2003)).

En un aspecto, el compuesto de acridinio es acridinío-9-carboxamida. Los métodos para preparar acridinio 9-carboxamidas se describe en Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-1 14 (1991 ); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63:5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1 :779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 1 1 :714-724 (2000); Mattingly et al., en “Luminescence Biotechnology Instruments and Applications”, Dyke, K. V. ed. , CRC Press, Boca Ratón, p. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5:3779-3782 (2003); y patentes de EE. UU. Nos. 5,468,646, 5,543,524 y 5,783,699 (cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad por sus enseñanzas que se consideran iguales).

Otro ejemplo de un compuesto de acridinio es el éster de arilo de acridinio-9-carboxilato. Un ejemplo de un éster de arilo de acridinio-9-carboxllato de fórmula II es el fluorosulfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Los métodos para preparar ésteres de arilo de acridinio 9-carboxllato se describen en McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4: 1 1 11 -21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15:245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15:239-244 (2000); y patente de EE. UU. No. 5,241 ,070 (cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad por sus enseñanzas que se consideran iguales). Tales ásteres de arilo de acridinio 9-carboxilato son indicadores quimioluminiscentes eficientes para el peróxido de hidrógeno producido en la oxidación de un analito por al menos una oxidasa, en función de la intensidad de la señal y/o la rapidez de la señal. El curso de la emisión quimioluminiscente para el áster de arilo de acridinio 9-carboxilato es completamente rápido, es decir, debajo de 1 segundo, mientras que la emisión quimioluminiscente de acridinio 9-carboxamida se extiende durante 2 segundos. Sin embargo, el áster de arilo de acrídinío-9-carboxidato pierde sus propiedades quimioluminiscentes en presencia de proteína. Por lo tanto, su uso requiere la ausencia de proteína durante la generación y detección de la señal. Los métodos para separar o quitar proteínas de la muestra son muy conocidos para los expertos en la materia e incluyen, sin limitación, ultrafiltración, extracción, precipitación, diálisis, cromatografía, y/o digestión (véase, por ejemplo, Wells, “High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies”, Elsevier (2003)). La cantidad de proteína removida o separada de la muestra de prueba puede ser de aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95%. Detalles adicionales con respecto al áster de arilo de acridinio 9-carboxilato y su uso se exponen en la solicitud de patente de EE. UU. No. 11/697,835, presentada el 9 de abril de 2007. Los ásteres de arilo de acridinio 9- carboxilato se pueden disolver en cualquier disolvente adecuado, tal como /V,/V-dimetilformamida (DMF) anhidra desgasificada, o colato de sodio acuoso. w. Secuencia enlazante v secuencia de peptido enlazante “Secuencia enlazante” o “secuencia de péptido enlazante" se refiere a una secuencia de polipéptido natural o artificial que está unida a una o más secuencias de polipéptido de interés (p. ej . , de longitud completa, fragmentos, etc.). El término “unida” se refiere a la unión de la secuencia enlazante con la secuencia de polipéptido de interés. Tales secuencias de polipéptido, preferiblemente, están unidas por medio uno o más enlaces peptídicos. Las secuencias enlazantes pueden tener una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 aminoácidos. Preferiblemente, la longitud de la secuencia enlazante es de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 aminoácidos. Las secuencias enlazantes naturales se pueden modificar mediante sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos para crear secuencias enlazantes artificiales. Las secuencias enlazantes ejemplares incluyen, sin limitación: (i) etiquetas de histidina (His), tales como una etiqueta His 6X (SEQ ID NO: 148), que tiene una secuencia de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 148), son útiles como secuencias enlazantes para facilitar el aislamiento y purificación de polipéptidos y anticuerpos de interés; (i¡) sitios de escisión de enterocinasa, como las etiquetas de His, se usan en el aislamiento y purificación de proteínas y anticuerpos de interés. Frecuentemente, los sitios de escisión de enterocinasa se usan junto con las etiquetas de His en el aislamiento y purificación de proteínas y anticuerpos de interés. Se conocen varios sitios de escisión de enterocinasa. Los ejemplos de sitios de escisión de enterocinasa incluyen, sin limitación, la secuencia de aminoácidos DDDDK (SEQ ID NO: 149), y derivados de la misma (por ejemplo, ADDDDK (SEQ ID NO: 150), etc.); (iii) se pueden usar secuencias varias para enlazar o unir las regiones variables de cadena ligera y/o pesada de fragmentos de la región variable de una sola cadena. Ejemplos de otras secuencias enlazantes se pueden encontrar en Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883 (1988); y McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Las secuencias enlazantes también se pueden modificar para funciones adicionales, tales como unión de fármacos o unión a soportes sólidos. En el contexto de la presente revelación, el anticuerpo monoclonal, por ejemplo, puede contener una secuencia enlazante, tal como una etiqueta de His, un sitio de escisión de enterocinasa, o ambos. x. Proteína de unión multivalente La “proteína de unión multivalente” se usa aquí para hacer referencia a una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión de antígeno (también referidos en la presente como “dominios de unión de antígeno”). Una proteína de unión multivalente preferiblemente se modifica por ingeniería para tener tres o más sitios de unión de antígeno, y generalmente no es un anticuerpo natural. El término “proteína de unión multiespecífica” se refiere a una proteína de unión que se puede unir a dos o más objetivos relacionados o no relacionados, que incluyen una proteína de unión capaz de unirse a dos o más epítopos diferentes de la misma molécula objetivo. v. Corte predeterminado v nivel predeterminado “Corte predeterminado” y “nivel predeterminado” se refieren en general a un valor de corte de un ensayo que se usa para evaluar los resultados de la eficacia diagnóstica/pronóstica/terapéutica comparando los resultados del ensayo contra el corte/nivel predeterminado, en donde el corte/nivel predeterminado ya ha sido vinculado o asociado con varios parámetros clínicos (por ejemplo, la severidad de la enfermedad, avance/no avance/mejoramiento, etc.). La presente revelación provee niveles predeterminados ejemplares. Sin embargo, es muy conocido que los valores de corte pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (p. ej . , los anticuerpos utilizados, etc.). Además, es del dominio del experto en la materia adaptar la revelación de la presente para otros inmunoensayos para obtener valores de corte específicos de inmunoensayo para tales otros inmunoensayos, basándose en esta revelación. Mientras que el valor preciso del corte/nivel predeterminado puede variar entre los ensayos, las correlaciones aquí descritas serían generalmente aplicables. z. Reactivo de pretratamiento “Reactivo de pretratamiento”, por ejemplo, reactivo de lisis, precipitación y/o solubilización, como se usa en un ensayo diagnóstico descrito en la presente, es uno que lisa cualquier célula y/o solubiliza cualquier analito que está presente en una muestra de prueba. El pretratamiento no es necesario para todas las muestras como se describe aquí adicionalmente. Entre otras cosas, la solubilización del a na lito (es decir, RGMa (tal como RGMa asociada a membrana, RGMa soluble, fragmentos de RGMa asociada a membrana, fragmentos de RGMa soluble, variantes de RGMa (RGMa asociada a membrana o soluble) o cualquier combinación de los mismos)) abarca la liberación del analito de cualquier proteína de unión endógena presente en la muestra. Un reactivo de pretratamiento puede ser homogéneo (no requiriendo un paso de separación) o heterogéneo (que requiere un paso de separación). Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo hay remoción de cualquier proteína de unión de analito precipitada de la muestra de prueba antes de proceder al siguiente paso del ensayo. El reactivo de pretratamiento puede comprender opcionalmente: (a) uno o más disolventes y sal; (b) uno o más disolventes, sal y detergente; (c) detergente; (d) detergente y sal, o (e) cualquier reactivo o combinación de reactivos apropiados para la lisis celular y/o solubilización del analito. aa. Reactivos de control de calidad Los “reactivos de control de calidad”, en el contexto de los inmunoensayos y kits descritos en la presente, incluyen, sin limitación, calibradores, controles y paneles de sensibilidad. Un “calibrador” o “estándar” se usa típicamente (p. ej . , uno o más, tal como una pluralidad) para establecer curvas de calibración (patrón) para la interpolación de la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. Alternativamente, se puede usar un solo calibrador, que es casi un corte positivo/negativo predeterminado. Se pueden usar en conjunto múltiples calibradores (es decir, más de un calibrador o una cantidad variable de calibradores) a fin de comprender un “panel de sensibilidad”. bb. Anticuerpo recombinante v anticuerpos recombinantes “Anticuerpo recombinante’’ y “anticuerpos recombinantes” se refieren a anticuerpos preparados por uno o más pasos que incluyen clonar secuencias de ácido nucleico que codifican parcial o totalmente uno o más anticuerpos monoclonales en un vector de expresión apropiado, por medio de téenicas recombinantes, y subsiguientemente expresar el anticuerpo en una célula hospedera apropiada. Los términos incluyen, sin limitación, anticuerpos monoclonales producidos recombinantemente, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados (parcial o totalmente humanizados), estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas de fragmentos de anticuerpo, anticuerpos bifuncionales, Abs heteroconjugados, DVD-lg®s, y otros anticuerpos como se describen en el inciso (i) de la presente (las inmunoglobulinas de dominio variable doble y los métodos para prepararlas se describen en Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25: 1290-1297 (2007)). El término “anticuerpo bifuncional”, como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo que comprende un primer brazo que tiene una especificidad para un sitio antigénico y un segundo brazo que tiene especificidad por un sitio antigénico diferente, es decir, los anticuerpos bifuncionales tienen una especificidad doble. cc. Muestra muestra de prueba v muestra de paciente “Muestra”, “muestra de prueba” y “muestra de paciente” se pueden usar aquí intercambiablemente. La muestra, tal como una muestra de orina, suero, plasma, fluido amniótico, fluido cerebroespinal, células o tejido de placenta, células endoteliales, leucocitos o monocitos, se puede usar directamente tal como se obtiene de un paciente, o se puede pretratar, tal como por ejemplo por filtración, destilación, extracción, concentración, centrifugación, desactivación de componentes ¡nterferentes, adición de reactivos y similares, para modificar el carácter de la muestra en cierta manera como se expone aquí o como se conoce de otra manera en la téenica. dd. Series de composiciones de calibración Las “series de composiciones de calibración" se refieren a una pluralidad de composiciones que comprenden una concentración conocida de Cys-CRGMa, en donde cada una de las composiciones difiere de las otras composiciones de la serie por la concentración de Cys-CRGMa. ee. Fase sólida La “fase sólida” se refiere a cualquier material que es insoluble, o se puede hacer insoluble por una reacción subsiguiente. La fase sólida se puede elegir por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar un agente de captura. Alternativamente, la fase sólida puede tener adherida a la misma un agente enlazante que tiene la capacidad de atraer e inmovilizar el agente de captura. El agente enlazante puede incluir, por ejemplo, una sustancia cargada que tiene una carga opuesta con respecto al agente de captura mismo, o a una sustancia cargada conjugada con el agente de captura. En general, el agente enlazante puede ser cualquier socio de unión (preferiblemente específico) que se inmoviliza sobre (se une a) la fase sólida, y que tiene la capacidad de inmovilizar el agente de captura por medio de una reacción de enlace. El agente enlazante permite la unión indirecta del agente de captura a un material de fase sólida antes de la realización del ensayo o durante la realización del ensayo. La fase sólida, por ejemplo, puede ser de plástico, plástico modificado, metal magnetico o no magnético, vidrio o silicio que incluye por ejemplo un tubo de ensayo, pocilio de microtitulación, lámina, cuenta, micropartícula, chip, y otras configuraciones conocidas para los expertos en la materia. ff. Unión específica La “unión específica" o “que se une específicamente”, como se usa aquí, se puede referir a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, en donde la interacción depende de la presencia de una estructura particular sobre la especie química (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo); por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica, más que a las proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para un epítopo “A”, la presencia de una molécula que contiene el epítopo “A” (o A libre no marcado) en una reacción que contiene “A” marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado enlazado al anticuerpo. gg. Socio de unión específico El “socio de unión específico” es un miembro de un par de unión específico. Un par de unión específico comprende dos moléculas diferentes que se unen específicamente una a otra por medios químicos o físicos. Por lo tanto, además de los pares de unión específicos de antígeno y anticuerpo de los inmunoensayos comunes, otros pares de unión específicos pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, enzimas e inhibidores de enzima, y similares. Además, los pares de unión específicos pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específicos originales, por ejemplo un analito-análogo. Los miembros de unión específicos ¡nmunorreactivos incluyen antígenos, fragmentos de antígeno y anticuerpos, que incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales y también complejos y fragmentos de los mismos, ya sea aislados o producidos recombinantemente. hh. Condiciones severas “Condiciones severas” se usa aquí para describir la hibridación al ADN unido al filtro en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6x a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0.2x/0.1 % SDS a aproximadamente 50-65°C. El término “bajo condiciones altamente severas” se refiere a la hibridación del ácido nucleico unido al filtro en SSC 6x a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0.1 x/0.2% SDS a aproximadamente 68°C, o bajo otras condiciones de hibridación severas. Véase por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. , 1989, “Current Protocols in Molecular Biology”, volumen I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wilcy & Sons, Inc., Nueva York, p. 6.3.1 -6.3.6 y 2.10.3. ii. Tratar o tratamiento “Tratar” o “tratamiento” se usan aquí intercambiablemente para describir la reversión, alivio o inhibición del avance de una enfermedad, o uno o más síntomas de tal enfermedad a la que se aplica dicho término. Dependiendo de la condición del sujeto, el término también se refiere a prevenir una enfermedad, e incluye prevenir el inicio de una enfermedad, o prevenir los síntomas asociados con una enfermedad. Un tratamiento puede ser realizado de forma aguda o crónica. El término también se refiere a reducir la severidad de una enfermedad o los síntomas asociados con dicha enfermedad antes de padecer la enfermedad. Tal prevención o reducción de la severidad de una enfermedad, antes del padecimiento, se refiere a la administración de un anticuerpo o composición farmacéutica de la presente invención a un sujeto que en el momento de la administración no padece la enfermedad. “Prevenir” también se refiere a prevenir la recurrencia de una enfermedad o de uno o más de los síntomas asociados con dicha enfermedad. “Tratamiento” y “terapéuticamente” se refieren al acto de tratar, como se define arriba “tratar". ii. Rastreador “Rastreador”, como se usa aquí, se refiere a un analito o fragmento de analito conjugado con una marca, tal como Cys-CRGMa conjugado con una porción de fluoresceína, en donde el analito conjugado con la marca puede competir eficientemente con el analito por los sitios sobre un anticuerpo específico para el analito. kk. Variante “Variante” se usa aquí para describir un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, supresión o sustitución conservativa de aminoácidos, pero que retiene por lo menos una actividad biológica. Ejemplos representativos de “actividad biológica” incluyen la susceptibilidad de ser enlazado por un anticuerpo específico o promover una respuesta inmune. Variante también se usa aquí para describir una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína referida, con una secuencia de aminoácidos que retiene por lo menos una actividad biológica. Se reconoce que una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, el reemplazo de un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad, grado y distribución de regiones cargadas) implica típicamente un cambio menor. Estos cambios menores pueden ser identificados en parte considerando el índice hidropático de los aminoácidos, como se entiende en la téenica: Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Se sabe que los aminoácidos con índices hidropátícos similares pueden ser sustituidos y retener todavía la función de la proteína. En un aspecto se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropátícos de ±2. La hidrofilicidad de los aminoácidos también se puede usar para revelar sustituciones que resultarían en proteínas que retienen la función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la hidrofilicidad promedio local más grande de ese péptido, una medida útil que se ha reportado que se correlaciona bien con la antigenicidad e inmunogenicidad: patente de EE. UU. No. 4,554, 101 , que se incorpora aquí completamente como referencia. La sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad similares puede resultar en péptidos que retienen la actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, como se entiende en la téenica. Las sustituciones se pueden realizar con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ± 2 uno de otro. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos son afectados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. Consistentemente con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente las cadenas laterales de los aminoácidos, como revela la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y otras propiedades. “Variante” también se puede usar para hacer referencia a un fragmento antigénicamente reactivo de un anticuerpo anti-RGMa que difiere del fragmento correspondiente del anticuerpo anti-RGMa en la secuencia de aminoácidos, pero que todavía es antigénicamente reactivo y puede competir con el fragmento correspondiente de anticuerpo anti-RGMa para unirse a RGMa. “Variante” también se puede usar para describir un polipéptido o un fragmento del mismo que ha sido procesado diferentemente, tal como mediante proteólisis, fosforilación u otra modificación postraducción, y retiene todavía su reactividad de antígeno.

II. Vector “Vector" se usa aquí para describir una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un “plásmldo", que se refiere a un lazo de ADN circular de doble cadena en el que pueden estar ligados segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden estar ligados segmentos de ADN adicionales del genoma viral. Algunos vectores se pueden replicar de forma autónoma en una célula hospedera en la que se introducen (p. ej . , vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (p. ej. , vectores de mamífero no episómicos) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera por Introducción en la célula hospedera, y con ello se replican junto con el genoma del hospedero. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están enlazados operativamente. Estos vectores se refieren aquí como “vectores de expresión recombinante” (o simplemente “vectores de expresión”). En general, frecuentemente los vectores de expresión de utilidad en las téenicas de ADN recombinante están en forma de plásmidos. “Plásmido” y “vector” se pueden usar intercambiablemente ya que el plásmido es la forma de vector usada más comúnmente. Sin embargo, se pueden usar otras formas de vector de expresión, tales como vectores virales (p. ej., retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adenoasociados) que tienen funciones equivalentes. A este respecto, las versiones de ARN de vectores (que incluyen vectores virales de ARN) también pueden tener utilidad en el contexto de la presente revelación.

Para citar las escalas numéricas de la presente, se contempla específicamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para la escala 6-9 se contemplan los números 7 y 8 además del 6 y 9, y para la escala 6.0-7.0 se contempla específicamente el número 6.0, 6.1 , 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 y 7.0. 2. Anticuerpos anti-RGMa Se proveen aquí anticuerpos para usarse en métodos de tratamiento de enfermedades y trastornos degenerativos de la neurita. Varios de los anticuerpos aquí descritos han sido seleccionados para unirse a la RGMa, minimizando o eliminando la reactividad con la Molécula Repulsiva Guía c (“RGMc”). Por ejemplo, véase la tabla 4, en donde el anticuerpo monoclonal derivado de PRO-fusion AE12-1 y las variantes de AE12-1 (AE12-1 F, AE12-1 H, AE12-1 L, AE12-1V, AE12-1 I, AE 12-1 K y AE12-1 Y) exhiben actividad neutralizante de RGMa, sin reactividad cruzada (detección baja) con RGMc. Como los anticuerpos desarrollados contra RGMa frecuentemente pueden reaccionar cruzadamente con RGMc y, a dosis intravenosas altas pueden causar acumulación de hierro en los hepatocitos, la unión específica de los anticuerpos aquí descritos a RGMa es de beneficio terapéutico. Además, la alta selectividad de estos anticuerpos ofrece ventanas de dosis terapéuticas o escalas para tratamiento amplias. a. RGMa La RGMa humana, que puede existir como una proteína de 450 aminoácidos con un péptido señal N-terminal pronosticado de 47 aminoácidos y una señal de unión de GPI C-terminal, fue propuesta primeramente para regular la guía de los axones retínales uniéndose a neogenina, una proteína de transmembrana que también es un receptor de netrinas, que son moléculas secretadas que tienen una función en el desarrollo neuronal y la supervivencia celular. Además de regular la guía axonal retinal, se ha mostrado que la RGMa inhibe el crecimiento del axón en ratas adultas; véase Yamashita et al., Current Opinión in Neurobiology (2007)17: 1 -6. De manera consistente con estos mecanismos, la expresión de RGMa aumenta después de una lesión de la médula espinal, durante la cual la inhibición de RGMa incrementa el crecimiento axonal; véase Kitayama et al., PLoS One, (201 1 ) vol. 6(9), p. 1-9; y Hata et al., J. Cell Biol. (2006)173:47-58. La expresión de RGMa también es sobrerregulada en el sitio de la lesión y en el tejido cicatrizante de humanos que padecen isquemia cerebral focal o lesión traumática del cerebro; véase Yamashita et al., Current Opinión in Neurobiology (2007) 17: 1-6; Schwab et al., Arch Neurol (2005) 22:2134-2144; y Muramatsu et al., Nat. Medicine (201 1 ) 17:488-94.

La RGMa puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos: MQPPRERLVV TGRAGWMGMG RGAGRSALGF WPTLAFLLCS FPAATSPCKI LKCNSEFWSA TSGSHA PASDDTPEFC AALRSYALCT RRTARTCRGD LAYHSAVHGI EDLMSQHNCS KDGPTSQPRL RTLPPAGDSQ ERSDSPEICH YEKSFHKHSA TPNYTHCGLF GDPHLRTFTD RFQTCKVQGA WPLIDNNYLN VQVTNTPVLP GSAATATSKL TIIFKNFQEC VDQKVYQAEM DELPAAFVDG SKNGGDKHGA NSLKITEKVS GQHVEIQAKY IGTTIVVRQV GRYLTFAVRM PEEVVNAVED WDSQGLYLCL RGCPLNQQID FQAFHTNAEG TGARRLAAAS PAPTAPETFP YETAVAKCKE KLPVEDLYYQ ACVFDLLTTG DVNFTLAAYY ALEDVKMLHS NKDKLHLYER TRDLPGRAAA GLPLAPRPLL GALVPLLALL PVFC (SEQ ID NO:65).

La RGMa puede ser un fragmento o variante de SEQ ID NO:65.

El fragmento de RGMa puede tener una longitud de entre 5 y 425 aminoácidos, entre 10 y 400 aminoácidos, entre 50 y 350 aminoácidos, entre 100 y 300 aminoácidos, entre 150 y 250 aminoácidos, entre 200 y 300 aminoácidos, o entre 75 y 150 aminoácidos. El fragmento puede comprender un número contiguo de aminoácidos del SEQ ID NO:65.

El fragmento de RGMa puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos: PCKI LKCNSEFWSA TSGSHA PASDDTPEFC AALRSYALCT RRTARTCRGD LAYHSAVHGI EDLMSQHNCS KDGPTSQPRL RTLPPAGDSQ ERSDSPEICH YEKSFHKHSA TPNYTHCGLF GD (SEQ ID NO:66), que corresponde a los aminoácidos 47-168 de SEQ ID NO:65. El fragmento de RGMa puede ser un fragmento de SEQ ID NO:66. El fragmento de RGMa puede ser una variante de SEQ ID NO:66. El fragmento de RGMa puede tener la siguiente secuencia de RGMa: PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO:74).

La RGMa puede existir como una forma unida a la membrana celular y/o como una forma soluble. b. Anticuerpo de reconocimiento de RGMa El anticuerpo es un anticuerpo que se une a RGMa, un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El anticuerpo puede ser un fragmento del anticuerpo anti-RGMa o una variante o un derivado del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de una sola cadena, un anticuerpo de afinidad madura, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano o un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab, o una mezcla de los mismos. Los fragmentos o derivados de anticuerpo pueden comprender fragmentos F(ab’)2, Fv o scFv. Los derivados del anticuerpo pueden ser producidos mediante peptidomiméticos. Además, las téenicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena se pueden adaptar para producir anticuerpos de una cadena.

Los anticuerpos humanos se pueden derivar de tecnología de presentación de fago o de ratones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humano se puede generar como resultado de una respuesta inmune humana in vivo y se puede aislar; véase, por ejemplo, Funaro et al., BMC Biotechnology, 2008(8):85. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser un producto del repertorio humano y no animal. Como es de origen humano, el riesgo de reactividad contra autoantígenos se puede minimizar. Alternativamente, se pueden usar colecciones de presentación de levadura y técnicas de presentación estándares para seleccionar y aislar anticuerpos anti-RGMa humanos.

Por ejemplo, se pueden usar colecciones de fragmentos variables de una sola cadena (scFv) intactos de humano para seleccionar anticuerpos anti-RGMa humanos. Se pueden usar animales transgénicos para expresar anticuerpos humanos.

Los anticuerpos humanizados pueden ser moléculas de anticuerpo de un anticuerpo de especie no humana que se unen al antígeno deseado, que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la especie no humana y regiones de armazón de una molécula de inmunoglobulina humana.

El anticuerpo es distinguible de los anticuerpos conocidos porque posee funciones biológicas diferentes de las conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención no solo reconocen y se unen a RGMa, sino que también se caracterizan por tener una actividad biológica adicional, por ejemplo, la capacidad para atenuar los signos clínicos asociados con enfermedades relacionadas con la degeneración de la neurita.

El anticuerpo se puede unir específicamente a RGMa. El anticuerpo de RGMa, específico de RGMa, puede comprender: SEQ ID NOs: 1 y 5; SEQ ID NOs: 2-4 y 6-8; SEQ ID NOs; 2-4, 6, 7 y 67; SEQ ID NOs: 2-4, 6, 7 y 68; SEQ ID NOs: 2-4, 6, 7 y 69; SEQ ID NOs: 2-4, 6, 7 y 70; SEQ ID NOs: 2-4, 6, 7 y 71 ; SEQ ID NOs: 2-4, 6, 7 y 72; o SEQ ID NOs: 2-4, 6, 7 y 73. El anticuerpo se puede unir a SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, o un fragmento o variante de las mismas. El anticuerpo puede reconocer y unirse específicamente a un epítopo presente en un polipéptido RGMa o una variante del mismo como se describe arriba. El epítopo puede ser SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, o una variante del mismo. (1 ) Características de unión de anticuerpo El anticuerpo se puede unir inmunoespecíficamente a RGMa (SEQ ID NO:65), SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, un fragmento de la misma, o una variante de la misma, y puede tener una koff (o kd) de por lo menos 1.0x10 3 s \ de por lo menos. 1.0x10 4 s 1 , de por lo menos 1.0x10 5 s 1 , de por lo menos 1.0x10 6 s 1 , o tiene una koff (o kd) que varía de 1.0x10 3 s 1 a 1.0x10 6 s 1 , de 1.0x10 3 s 1 a 1 .0x10 5 s 1 , o de 1.0x10 3 s 1 a 1.0x10 4 s 1. El fragmento puede ser el SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:74. (2) Estructura del anticuerpo (a) CDRs de cadena pesada y cadena ligera: El anticuerpo se puede unir inmunoespecíficamente a RGMa (SEQ ID NO:65), SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:74, o a un fragmento de la misma o una variante de la misma, y comprende una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable, mostradas en la tabla 1. El anticuerpo se puede unir inmunoespecíficamente a RGMa, a un fragmento de la misma, o una variante de la misma, y comprende una o más de las secuencias de CDR de cadena pesada o cadena ligera mostradas también en la tabla 1. La cadena ligera del anticuerpo puede ser una cadena kappa o una cadena lambda; por ejemplo, véase la tabla 1.

Se provee aquí un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a RGMa, o a un fragmento de la misma o una variante de la misma. El ácido nucleico aislado puede comprender una secuencia de nucleótidos que se híbrida, bajo condiciones severas, con la molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de cadena pesada o cadena ligera mostradas en la tabla 1.

Tabla 1 Lista de secuencia de aminoácidos de las regiones VH v VL de anticuerpos monoclonales anti-RGMa completamente humanos (AE12-1 a AE12-8 AE12-13. AE12-15. AE12-20 AE12-21. AE12-23 v AE12-24) Tabla 1 (Continuación) Tabla 1 (Continuación) Tabla 1 (Continuación) Tabla 1 (Continuación) Tabla 1 (Continuación) Tabla 1 (Continuación) El anticuerpo o variante o derivado del mismo puede contener una o más secuencia de aminoácidos que tienen una identidad mayor de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, o 50% con uno o más de los SEQ ID NOs: 1 -64 y 67-73. El anticuerpo o variante o derivado del mismo puede ser codificado por una o más secuencias de ácido nucleico que tienen una identidad mayor de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, o 50% con uno o más de los SEQ ID NOs: 1 -64 y 67-73. La identidad y homología de los polipeptidos se pueden determinar, por ejemplo, por medio del algoritmo descrito en el reporte de Wilbur, W. J. y Lipman, D. J. , Proc. Nati. Acad. Sel. USA 80, 726-730 (1983). El anticuerpo o variante o derivado del mismo descrito en la presente puede ser codificado por un ácido nucleico que se híbrida bajo condiciones severas con el complemento de uno o más de los SEQ ID NOs: 3-42. El anticuerpo o variante o derivado del mismo aquí descrito puede ser codificado por un ácido nucleico que se híbrida bajo condiciones altamente severas con el complemento de uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más de los SEQ ID NOs: 1 -64 y 67-73.

El anticuerpo puede comprender el SEQ ID NO:8, en donde el residuo de Cys de SEQ ID NO:8 es sustituido por otro aminoácido. El anticuerpo puede comprender los SEQ ID NOs: 1 y 5, o 2-4 y 6-8, en donde el residuo de Cys de SEQ ID NO:8 es sustituido por otro aminoácido, o en donde el residuo de Cys en la posición 91 de SEQ ID NO:5 es sustituido con otro aminoácido. El residuo de Cys en la posición 91 de SEQ ID NO:5 puede ser sustituido con una fenilalanina, una histidina, una leucina, una valina, una isoleucina, una lisina, o una tirosina, por ejemplo. El residuo de Cys de SEQ ID NO:8 se puede sustituir con una fenilalanina (véase SEQ ID NO:67), una histidina (véase SEQ ID NO:68), una leucina (véase SEQ ID NO:69), una valina (véase SEQ ID NO:70), una isoleucina (véase SEQ ID NO:71 ), una lisina (véase SEQ ID NO:72), o una tirosina (véase SEQ ID NO:73), por ejemplo. Véase la tabla 2.

El anticuerpo puede ser de una clase o subclase de moléculas de IgG, IgE, IgM, IgD, I g A e Ig Y (por ejemplo, I gG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e I g A2) . Por ejemplo, el anticuerpo puede ser una molécula de IgG 1 que tiene la siguiente secuencia de región constante: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:140).

La región constante anterior de SEQ ID NO: 140 contiene dos (2) mutaciones de la secuencia de región constante de tipo silvestre en las posiciones 234 y 235. Específicamente, estas mutaciones son cambios de leucina a alanina en las posiciones 234 y 235 (que también se denominan mutaciones “LLAA”). Estas mutaciones se muestran arriba con negrita y subrayadas. La finalidad de estas mutaciones es eliminar la función efectora.

Alternativamente, una molécula de IgG 1 puede tener la secuencia de región constante anterior (SEQ ID NO: 140) con una o más mutaciones. Por ejemplo, la secuencia de región constante de SEQ ID NO: 140 puede contener una mutación en el aminoácido 250 en donde la treonina es reemplazada con glutamina (SEQ ID NO: 141 ), una mutación en el aminoácido 428 en donde la metionina es reemplazada con leucina (SEQ ID NO: 142), o mutaciones en el aminoácido 250 en donde la treonina es reemplazada con glutamina y una mutación en el aminoácido 428 en donde la metionina es reemplazada con leucina (SEQ ID NO: 143), como se muestra abajo en la tabla 2A.

Alternativamente, una molécula de I gG 1 puede contener una cadena pesada que comprende: AE12-1 (VH) CDR-H1 (SEQ ID NO: 2) , AE12-1 (VH) CDR-H2 (SEQ ID NO:3), AE12-1 (VH) CDR-H3 (SEQ ID NO:4), y una cadena ligera que comprende: AE12-1 (VL) CDR-L1 (SEQ ID NO:6), AE12-1 (VL) CDR-L2 (SEQ ID NO:7) y AE12-1 -V (VL) CDR-L3 (SEQ ID NO:70), y una secuencia constante de SEQ ID NO: 143, como se muestra abajo en la tabla 2B (este anticuerpo es referido como AE12-1V-QL y tiene una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 144 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 145).

Alternativamente, una molécula de I g G 1 puede contener una cadena pesada que comprende: AE12-1 (VH) CDR-H1 (SEQ ID NO:2), AE12-1 (VH) CDR-H2 (SEQ ID NO:3), AE12-1 (VH) CDR-H3 (SEQ ID N0:4), y una cadena ligera que comprende: AE12-1 (VL) CDR-L1 (SEQ ID NO:6), AE12-1 (VL) CDR-L2 (SEQ ID NO:7) y AE12-1 -Y (VL) CDR-L3 (SEQ ID NO:73), y una secuencia constante de SEQ ID NO:143, como se muestra abajo en la tabla 2B (este anticuerpo es referido como AE12-1Y-QL y tiene una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 146 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 147).

Tabla 2 Tabla 2A Tabla 2B El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender un dominio variable pesado que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-H1 , H2 y H3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5 (fórmula 1 - CDR-H1 ), en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, D, E, N, G y T; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, L, S y Q; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, D, A, T y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y W; y Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, N, H, A, T y Q; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa1 1— Xaa12— Xaa13— Xa a- 14— Xaa15— Xaa16— (Xaa)n (fórmula 2- CDR-H2), en donde n es 0 o 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en W, V, A, G, L, E, S y N; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y F; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, N, D, F y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, Y, G, W, H, A y S; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, N, D, E, S, K, G y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, D, T y N; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, I, E, N y R; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, L, R, S, T y Y; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, K, G, N, I, y Y; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, G, Y, T y K; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, F, N y H; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, T, V, P, L y S; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D, P y S; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, S, N y L; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, F, V, K y R; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, K, R y S; y Xaa17 es una glicina; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— (Xaa)n (fórmula 3- CDR-H3), en donde n es 0-11 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, S, E, N, L, D, Q y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, T, R, Y, L, I, D y S; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L, Y, N, E, K, A y F; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, Y, A, V, G, T, E y W; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, S, L, D, G, H y P; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu y Cys; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Lys, Asp, Ala y Gln; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro y Tyr; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His y Phe; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp y Asp; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly y Asp; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Pro y Tyr; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Leu y Phe; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp y Gly; y Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Asp y Tyr.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede comprender un dominio variable ligero que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-L1 , L2 y L3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— (Xaa)n (fórmula 1-CDR-L1), en donde n es 0-3, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, R, G y Q; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, D, S, N y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, K, G, Q, N y E; Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, L, G, I, D y P; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, N, H e I; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, I, S, G y H; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, K, A, S, I, N, T y D; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Y, A, C, S y F; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, G, L, V y N; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, C, Y, H, R, N y S; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly, Ala y Val; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val y Asn; y Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser e His; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— (Xaa)n (fórmula 2- CDR-L2), en donde n es 0-4, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Q, G, V, Y, S y E; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, N y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, Y, N y K; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, N, D, Q y T; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, G, S y L; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, I, y E; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, H, I, y T; Xaa8 es Asn; Xaa9 es Lys; y Xaa10 es Gly; Xaa1 1 es Asp; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— (Xaa)n (fórmula 3- CDR-L3), en donde n es 0-2, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, T, Q y V; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, W y S; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, G, S, H y Y; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, N, P, D, V y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, T, S, G, L, F y Y; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, T, L, I, P y S; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, G, R, Y, D, N, W, L, F y P; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, V, G, T y H; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr e His; Xaa1 1 es Leu o Val.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-H1 , H2 y H3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5 (fórmula 1- CDR-H1 ), en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, D, E, N, G y T; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, L, S y Q; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, D, A, T y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M, y W; y Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, N, H, A, T y Q: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa1 1— Xaa12— Xaa13— Xaa14— Xaa15— Xaa16— (Xaa)n (fórmula 2- CDR-H2), en donde n es 0 o 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, A, G, l, G, S y N; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y F; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, N, D, F y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, Y, G, W, H, A y S; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, N, D, E, S, K, G y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, D, T y N; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, I, E, N y R; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, L, R, S, T y Y; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, K, G, N, I, y Y; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, G, Y, T y K; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, F, N y H; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, T, V, P, L y S; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D, P y S; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, S, N y L; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, F, V, K y R; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, K, R y S; y Xaa17 es una glicina; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— (Xaa)n (fórmula 3- CDR-H3), en donde n es 0-1 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, S, E, N, L, D, Q y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, T, R, Y, L, I, D y S; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L, Y, N, E, K, A y F; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, Y, A, V, G, T, E y W; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, S, L, D, G, H y P; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu y Cys; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Lys, Asp, Ala y Gln; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro y Tyr; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His y Phe; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp y Asp; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly y Asp; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Pro y Tyr; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Leu y Phe; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp y Gly; y Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Asp y Tyr; y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo también comprende un dominio variable ligero que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-L1 , L2 y L3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa1 1— (Xaa)n (fórmula 1 - CDR-L1 ) en donde n es 0-3, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, R, G y Q; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, D, S, N y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, K, G, Q, N y E; Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, L, G, I, D y P; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, N, H y I; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, I, S, G y H; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, K, A, S, I, N, T y D; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Y, A, C, S y F; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, G, L, V y N; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, C, Y, H, R, N y S; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly, Ala y Val; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val y Asn; y Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser e His; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— (Xaa)n (fórmula 2- CDR-L2), en donde n es 0-4, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Q, G, V, Y, S y E; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, N y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, Y, N y K; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, N, D, Q y T; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, G, S y L; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, I, y E; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, H, I, y T; Xaa8 es Asn; Xaa9 es Lys; y Xaa10 es Gly; Xaa1 1 es Asp; y Xa a 1— Xa a 2— Xa a 3— X a a 4— Xaa 5— Xa a 6— Xa a 7— Xa a 8— Xa a 9— (Xaa)n (fórmula 3- CDR-L3), en donde n es 0-2, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, T, Q y V; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, W y S; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, G, S, H y Y; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, N, P, D, V y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, T, S, G, L, F y Y; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, T, L, I, P y S; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, G, R, Y, D, N, W, L, F y P; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, V, G, T y H; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr y His; Xaa1 1 es Leu o Val.

En la fórmula 1 - CDR-L1 , si n es 1 , entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12.

En la fórmula 1 - CDR-L1 , si n es 2, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12— Xaa13.

En la fórmula 1 - CDR-L1 , si n es 3, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8—Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12— Xaa13— Xaa14.

En la fórmula 2- CDR-L2, si n es 1 , entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8.

En la fórmula 2- CDR-L2, si n es 2, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9. En la fórmula 2- CDR-L2, si n es 3, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10.

En la fórmula 2- CDR-L2, si n es 4, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11.

En la fórmula 3- CDR-L3, si n es 1 , entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10.

En la fórmula 3- CDR-L3, si n es 2, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11.

En la fórmula 2- CDR-H2, si n es 1 , entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12— Xaa13— Xaa14— Xaa15— Xaa16— Xaa17.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 1 , entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 2, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 3, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 4, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 5, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa1 O— Xaa1 1.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 6, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa1 1— Xaa12.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 7, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12— Xaa13.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 8, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12— Xaa13— Xaa-14.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 9, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12— Xaa13— Xaa 14— Xaa15.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 10, entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa 10— Xaa11— Xaa12— Xaa13— Xaa 14— Xaa15— Xaa 16.

En la fórmula 3- CDR-H3, si n es 11 , entonces la fórmula será como sigue: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12— Xaa13— Xaa 14— Xaa15— Xaa16— Xaa17. c. Preparación/producción del anticuerpo Los anticuerpos se pueden preparar mediante una variedad de téenicas. En general, los anticuerpos se pueden producir por medio de técnicas de cultivo celular que incluyen la generación de anticuerpos monoclonales por medio de las técnicas convencionales, o por medio de transfección de genes de anticuerpo, cadenas pesadas y/o cadenas ligeras en células hospederas bacterianas o de mamífero adecuadas, para permitir la producción de anticuerpos, en donde los anticuerpos pueden ser recombinantes. Las diversas formas del término “transfección” abarcan una amplia variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedera procariota o eucariota, por ejemplo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospederas procariotas o eucariotas, es preferible la expresión de los anticuerpos en células eucariotas, y muy de preferencia en células hospederas de mamífero, porque es más probable que las células eucariotas (y en particular las células de mamífero) ensamblen y secreten un anticuerpo plegado apropiadamente e inmunológicamente activo que las células procariotas.

Las células hospederas de mamífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (que incluyen células dhfr-CHO, descritas en Uralub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980)), usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159:601 -621 (1982), células de mieloma NSO, células COS y células $P2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas durante un periodo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas, o más preferiblemente la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células hospederas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos estándares de purificación de proteína.

También se pueden usar las células hospederas para producir fragmentos de anticuerpo funcionales, tales como los fragmentos Fab o moléculas de scFv. Se entenderá que las variaciones del procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedera con ADN que codifica fragmentos funcionales ya sea de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de esta invención. También se puede usar teenología de ADN recombinante para quitar una parte o todo el ADN que codifica la cadena ligera y/o pesada que no es necesario para la unión a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas de tales moléculas de ADN truncas también están abarcadas por los anticuerpos de la invención. Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los cuales una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la invención (es decir, se une a RGMa humana), y las otras cadenas pesada y ligera son específicas para un antígeno diferente de RGMa humana, entrelazando un anticuerpo de la invención con un segundo anticuerpo por medio de métodos estándares de entrelazamiento químico.

En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo, o una porción de unión de antígeno del mismo de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo, se introduce en células dhfr-CHO por medio de transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se enlazan cada uno operativamente a elementos reguladores de incrementador de CMV /promotor de AdMLP para manejar altos grados de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospederas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se utilizan téenicas estándares de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospederas, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Además, la invención provee un método de síntesis de un anticuerpo recombinante de la invención, cultivando una célula hospedera de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención. El método puede comprender además aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.

Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales incluyen la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Tales líneas celulares se pueden producir a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado. El animal se puede inmunizar con RGMa o un fragmento y/o variante del mismo. Por ejemplo, se puede usar cualquiera de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74, un fragmento de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 o SEQ ID NO: 74, o una variante de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74, para inmunizar al animal. El péptido usado para inmunizar el animal puede comprender aminoácidos que codifican Fe humano, por ejemplo la región cristalizable del fragmento o la región de cola del anticuerpo humano. Después, las células de bazo se pueden inmortalizar, por ejemplo, mediante fusión con un socio de fusión de células de mieloma. Se puede utilizar una variedad de téenicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma se pueden combinar con un detergente no iónico durante algunos minutos y después se colocan a baja densidad sobe un medio selectivo que sostiene el crecimiento de las células híbridas, pero no de las células de mieloma. Una de estas técnicas utiliza selección por hipoxantina, aminopterina, ti m id i na (HAT). Después de un tiempo suficiente, usualmente cerca de una a dos semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y sus sobrenadantes de cultivo se analizan para determinar la actividad de unión contra el polipéptido. Se pueden utilizar hibridomas que tienen alta reactividad y especificidad.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en crecimiento. Además, se pueden utilizar varias téenicas para incrementar el rendimiento, tales como la inyección de la línea de células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedero vertebrado adecuado, tal como un ratón. Después, los anticuerpos monoclonales se pueden cosechar del fluido de ascitis o la sangre. Los contaminantes se pueden separar de los anticuerpos mediante las técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. La cromatografía de afinidad es un ejemplo de un método que se puede usar en un procedimiento para purificar los anticuerpos.

La enzima proteolítica papaína escinde preferentemente las moléculas de IgG para producir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)), comprenden un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión de antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proveer varios fragmentos, que incluyen el fragmento F(ab')2, que comprende los dos sitios de unión de antígeno.

El fragmento Fv se puede producir mediante escisión proteolítica preferente de una IgM, y en raras ocasiones moléculas de inmunoglobulina IgG o IgA. El fragmento Fv se puede derivar usando técnicas recombinantes. El fragmento Fv incluye un heterodímero VH::VL no covalente que incluye un sitio de unión de antígeno que retiene gran parte de la capacidad de reconocimiento y unión de antígeno de la molécula de anticuerpo nativo.

El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado puede comprender una serie de región determinante de complementariedad (“CDR") de cadena pesada y cadena ligera, interpuesta respectivamente entre una serie de armazón (“FR”) de cadena pesada y cadena ligera que provee soporte a las CDRs y define la relación espacial de las CDRs unas con respecto a otras. La serie de CDR puede contener tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. Procediendo desde el extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones son denotadas como “CDR1”, “CDR2” y “CDR3”, respectivamente. Por lo tanto, un sitio de unión de antígeno incluye seis CDRs, que comprenden la serie de CDR de cada región V de cadena pesada y ligera. Un polipéptido que comprende una sola CDR (p. ej. , una CDR1 , CDR2 o CDR3) puede ser referida como una “unidad de reconocimiento molecular”. El análisis cristalográfico de los complejos antígeno-anticuerpo ha mostrado que los residuos de aminoácido de las CDRs forman un contacto extenso con el antígeno enlazado, en donde el contacto más extenso con el antígeno es con la CDR3 de cadena pesada. De esta manera, las unidades de reconocimiento molecular pueden ser primariamente responsables de la especificidad de un sitio de unión de antígeno. En general, los residuos de CDR están directa y muy sustancialmente implicados en la influencia de la unión al antígeno.

Se pueden usar otros métodos adecuados para producir o aislar anticuerpos de la especificidad requerida, que incluyen, sin limitación, métodos que seleccionan el anticuerpo recombinante de una colección de péptidos o proteínas (p. ej . , sin limitación, un bacteriófago, ribosoma, oligonucleótido, ARN, ADNc, levadura o similar, colección de presentación); por ejemplo, los disponibles de varios proveedores comerciales tales como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, RU), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Escocia, RU), Biolnvent (Lund, Suecia), usando los métodos conocidos; véanse las patentes de EE. UU. Nos. 4,704,692; 5,723,323; 5,763, 192; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862. Métodos alternativos se basan en la inmunización de animales transgénicos (p. ej. , ratones SCID, Nguyen et al. (1997), Microbiol. Immunol. 41 :901 -907; Sandhu et al. (1996), Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998), Immunol. 93: 154-161 ), que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se conoce en la téenica y/o como se describe en la presente. Tales técnicas incluyen, sin limitación, presentación de ribosoma (Hanes et al. (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4937-4942; Hanes et al. (1998), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 14130-14135); tecnologías que producen anticuerpo en una sola célula (p. ej. , el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (“SLAM”) (patente de EE. UU. No. 5,627,052; Wen et al. (1987), J. Immunol. 17:887-892; Babcook et al. (1996), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-7848); microgota de gel y citometría de flujo (Powell et al. (1990), Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems (Cambridge, Massachusetts); Gray et al. (1995), J. Imm. Meth. 182: 155-163; Kenny et al. (1995), Bio/Technol. 13:787-790); selección de célula B (Steenbakkers et al. (1994), Motee. Biol. Reports 19: 125-134 (1994)).

Un anticuerpo de afinidad madura se puede producir mediante cualquiera de una variedad de procedimientos que son conocidos. Por ejemplo, véase Marks et al., BioTechnology, 10:779-783 (1992), que describe la maduración de afinidad por barajado del dominio de VH y VL. Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. , 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992), describen la mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de armazón. En la patente de EE. UU. No. 6,914, 128 B1 se describe la mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva y en posiciones de contacto o hipermutación con un residuo de aminoácido que incrementa la actividad.

También se pueden preparar variantes de anticuerpo de la presente invención usando el suministro de un polinucleótido que codifica un anticuerpo de esta invención a un hospedero adecuado, a fin de proveer animales o mamíferos transgénicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas, y similares, que producen tales anticuerpos en su leche. Estos métodos son conocidos y se describen por ejemplo en las patentes de EE. UU. Nos. 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362 y 5,304,489.

También se pueden preparar variantes de anticuerpo suministrando un polinucleótido de esta invención para proveer plantas y células de planta cultivadas transgénicas (p. ej . , sin limitación, tabaco, maíz y lenteja de agua) que producen tales anticuerpos, porciones especificadas o variantes en las partes de la planta o en celulas cultivadas de la misma. Por ejemplo, Cramer et al. (1999), Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118, y las referencias ahí citadas, describen la producción de hojas de tabaco transgénico que expresan grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo usando un promotor inducible. Se ha utilizado maíz transgénico para expresar proteínas de mamífero a niveles de producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificados de fuentes naturales; véase por ejemplo Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464: 127-147, y las referencias ahí citadas. También se han producido variantes de anticuerpo en grandes cantidades a partir de semillas de planta transgénica, que incluyen fragmentos de anticuerpo, tales como anticuerpos de una sola cadena (scFv’s), que incluyen semillas de tabaco y tubérculos de papa; véase, por ejemplo, Conrad et al. (1998), Plant. Mol. Biol. 38: 101-109, y la referencia ahí citada. De esta manera, los anticuerpos de la presente invención también se pueden producir usando plantas transgénicas de acuerdo con los métodos conocidos.

Los derivados de anticuerpo se pueden producir, por ejemplo, añadiendo secuencias exógenas para modificar la inmunogenicídad o reducir, incrementar o modificar la unión, afinidad, velocidad de asociación, velocidad de disociación, avidez, especificidad, vida media y otras características adecuadas. Generalmente se mantiene una parte o todas las secuencias de CDR humanas o no humanas, mientras que las secuencias no humanas de las regiones variables y constantes son reemplazadas con aminoácidos humanos u otros.

Los fragmentos de anticuerpo pequeños pueden ser dianticuerpos que tienen dos sitios de unión de antígeno, en donde los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH/VL); véase, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/1 1161 ; y Hollinger et al. (1993), Proc. Nati. Acad. Sel. USA 90:6444-6448. Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígeno. Véase también la patente de EE. UU. No. 6,632,926 de Chen et al., que se incorpora aquí como referencia en su totalidad, que revela variantes de anticuerpo que tienen uno o más aminoácidos insertados en una región hipervariable del anticuerpo progenitor, y una afinidad de unión por un antígeno objetivo que es por lo menos aproximadamente dos veces más fuerte que la afinidad de unión del anticuerpo progenitor por el antígeno.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo lineal. El procedimiento para preparar un anticuerpo lineal es conocido y se describe en Zapata et al. (1995), Protein Eng. 8(10): 1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1 -VH-CH1 ) que forman un par de regiones de unión de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Los anticuerpos se pueden recuperar y purificar de cultivos celulares recombinantes mediante los métodos conocidos que incluyen, sin limitación, purificación con proteína A, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción en ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Para la purificación también se puede usar cromatografía de líquidos de alto rendimiento (“HPLC”).

Puede ser útil marcar detectablemente o terapéuticamente el anticuerpo. Los métodos para conjugar anticuerpos con estos agentes son conocidos. Únicamente con fines de ilustración, los anticuerpos se pueden marcar con una porción detectadle, tal como un átomo radioactivo, un cromóforo, un fluoróforo, o similares. Estos anticuerpos marcados se pueden usar para téenicas diagnósticas, ya sea in vivo o en una muestra de prueba aislada. Los anticuerpos también se pueden conjugar, por ejemplo con un agente farmacéutico, tal como un fármaco quimioterapéutico o una toxina. Se pueden enlazar a una citocina, a un ligando, a otro anticuerpo. Los agentes adecuados para acoplamiento de los anticuerpos para obtener un efecto antitumoral incluyen citocinas tales como interleuclna (IL-2) y factor de necrosis de tumor (TNF); fotosensibilizadores para usarse en terapia fotodinámica, que incluyen ftalocianina tetrasulfonato de aluminio (III), hematoporfirina y ftalocianina; radionúclidos tales como yodo-131 (131 l), itrio-90 (90Y), bismuto-212 (212B¡), bismuto-213 (213B¡), tecnecio-99m (99mTc), renio-186 (186Re) y renio-188 (188Re); antibióticos tales como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina y carboplatino; toxinas bacterianas, de planta y otras, tales como toxina de difteria, exotoxina A de Pseudomonas , enterotoxina A estafilocócica, toxina abrin-A, ricino A (ricino desglicosilado A y ricino nativo A), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra china (naja naja atra), y gelonina (una toxina de planta); proteínas desactivadoras de ribosoma de plantas, bacterias y hongos, tales como restrictocina (una proteína desactivadora de ribosoma producida por Aspergillus restrictus), saporina (una proteína desactivadora de ribosoma de Saponaria officinalis), y ribonucleasa; inhibidores de tirosina cinasa; Iy207702 (un nucleósido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes anti-quísticos (p. ej . , oligonucleótidos de antisentido, plásmidos que codifican toxinas, metotrexato, etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, tales como F(ab).

Los anticuerpos se pueden secuenciar y replicar por medios recombinantes o sintéticos. También se pueden secuenciar adicionalmente hasta la secuencia lineal de nucleótidos que los codifican. Por consiguiente, esta invención provee estos polinucleótidos, solos o en combinación con un vehículo, vector o célula hospedera como se describe arriba, y codifican una secuencia de un anticuerpo de esta invención.

La producción de anticuerpo utilizando teenología de hibridoma, el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM), animales transgénicos y colecciones de anticuerpos recombinantes se describen más abajo en mayor detalle. (1 ) Anticuerpos monoclonales antí-RGMa usando teenología de hibridoma Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando una amplia variedad de técnicas conocidas, que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinación y presentación de fago, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando técnicas de hibridoma que incluyen las conocidas y enseñadas por ejemplo en Harlow et al., “Antibodies: A Laboratory Manual”, segunda edición (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., en “Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas” (Elsevier, N.Y., 1981 ). También es de notar que el término “anticuerpo monoclonal”, como se usa aquí, no se limita a los anticuerpos producidos por medio de tecnología de hibridoma. El término “anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, que incluye cualquier clon de eucariota, procariota o de fago, y no al método mediante el cual se produce.

En una modalidad, la presente invención provee métodos para generar anticuerpos monoclonales y también los anticuerpos producidos mediante tales métodos. El método puede comprender cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención, en donde preferiblemente el hibridoma es generado fusionando esplenocitos aislados de un animal, por ejemplo una rata o un ratón, inmunizado con RGMa, con células de mieloma, y después cribando los hibridomas que resultan de la fusión para seleccionar los clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de la invención.

Brevemente, las ratas se pueden inmunizar con un antígeno RGMa. En una modalidad preferida, el antígeno RGMa se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger al po I i péptid o de dispersión rápida, secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al hospedero a secretar factores que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Preferiblemente, si se administra un polipéptido, el programa de inmunización incluirá dos o más administraciones del polipéptido, extendidas durante varias semanas; sin embargo, también se puede usar una sola administración del polipéptido.

Después de la inmunización de un animal con un antígeno RGMa, los anticuerpos y/o células productoras de anticuerpo se pueden obtener del animal. El suero que contiene el anticuerpo anti-RGMa del animal se obtiene sangrando o sacrificando al animal. El suero se puede usar tal como se obtiene del animal, o se puede obtener una fracción de inmunoglobulina del suero, o los anticuerpos anti-RGMa se pueden purificar del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidas de esta manera son policlonales, teniendo así una variedad heterogénea de propiedades.

Una vez detectada una respuesta inmune, por ejemplo los anticuerpos específicos para el antígeno RGMa que son detectados en el suero de la rata, el bazo de la rata se cosecha y los esplenocitos se aíslan. Después, los esplenocitos se fusionan mediante téenicas muy conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo las células de la línea celular SP20 disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, Virginia, EE. UU.). Los hibridomas se seleccionan y se clonan mediante dilución limitada. Después, los clones de hibridoma se analizan mediante los métodos conocidos para seleccionar las células que secretan los anticuerpos capaces de unirse a RGMa. Inmunizando ratas con los clones de hibridoma positivos se puede generar fluido de ascitis, que generalmente contiene altas concentraciones de anticuerpo.

En otra modalidad se pueden preparar hibridomas inmortalizados productores de anticuerpo a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y las células B esplénicas se fusionan con células de mieloma inmortalizadas como es muy conocido; véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, citados arriba. En una modalidad preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea de células no secretorias). Después de fusión y selección por antibiótico, los hibridomas se criban usando RGMa, o una porción de la misma, o una célula que expresa RGMa. En una modalidad preferida, el cribado inicial se realiza usando un ensayo de inmunoadsorbente enlazado a enzimas (ELISA), o un radiommunoensayo (RIA), preferiblemente un ELISA. Un ejemplo de cribado con ELISA se provee en la publicación de PCT No. WO 00/37504.

Los hibridomas productores del anticuerpo anti-RGMa se seleccionan, se clonan y se criban adicionalmente para seleccionar características deseables, que incluyen crecimiento robusto del hibridoma, alta producción de anticuerpo y características deseables del anticuerpo, como se expone más abajo adicionalmente. Los hibridomas se pueden cultivar y expandir in vivo en animales singeneicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo ratones sin pelo, o en cultivo de células in vitro. Los métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son muy conocidos para los expertos en la materia.

En una modalidad preferida, los hibridomas son hibridomas de rata. En otra modalidad, los hibridomas son producidos en una especie no humana diferente de la rata, tal como ratones, ovejas, cerdos, cabras, reses o caballos. En otra modalidad preferida más, los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales un mieloma no secretorio humano se fusiona con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-RGMa.

Mediante las téenicas conocidas se pueden generar fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos. Por ejemplo, se pueden producir los fragmentos Fab y F(ab’)2 de la invención mediante la escisión proteolítica de moléculas de in unoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir dos fragmentos Fab idénticos) o pepsina (para producir un fragmento F(ab’)2). Un fragmento F(ab’)2 de una molécula de IgG retiene los dos sitios de unión de antígeno de la molécula de IgG más grande ("progenitora”), que incluye tanto cadenas ligeras (que contienen la cadena ligera variable y regiones de cadena ligera constantes), los dominios CH1 de las cadenas pesadas, y una región de bisagra formadora de disulfuro de la molécula de IgG progenitora. Por consiguiente, un fragmento F(ab’)2 todavía es capaz de entrelazar moléculas de antígeno igual que la molécula de IgG progenitora. (2) Anticuerpos monoclonales anti-RGMa utilizando SLAM En otro aspecto de la invención se generan anticuerpos recombinantes de linfocitos individuales aislados usando un procedimiento referido como el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM), como se describe en la patente de EE. UU. No. 5,627,052; la publicación de PCT WO 92/02551 ; y Babcock, et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996). En este método, células individuales que secretan los anticuerpos de interés, por ejemplo linfocitos derivados de cualquiera de los animales inmunizados se criban usando un ensayo de placa hemolítica específica de antígeno, en donde el antígeno RGMa, una subunidad de RGMa, o un fragmento del mismo, se acopla con eritrocitos de oveja usando un enlazador, tal como biotina, y se usan para identificar las células individuales que secretan anticuerpos con especificidad por RGMa. Después de la identificación de las células secretadoras de anticuerpo de interés, los ADNc de la región variable de cadena pesada y ligera se rescatan por medio de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), y estas regiones variables se pueden expresar entonces en el contexto de las regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (p. ej . , regiones constantes humanas), en células hospederas de mamífero, tales como células COS o CHO. Las células hospederas transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, derivadas de linfocitos seleccionados in vivo, pueden someterse entonces a análisis y selección ulterior in vitro, por ejemplo, analizando las células transfectadas para poder aislar las células que expresan los anticuerpos para RGMa. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas se pueden manipular adicionalmente in vitro, por ejemplo por métodos de maduración de afinidad in vitro ; véase, por ejemplo, la publicación de PCT WO 97/29131 y la publicación de PCT WO 00/56772. (3) Anticuerpos monoclonales anti-RGMa utilizando animales énicos En otra modalidad de la invención se producen anticuerpos inmunizando un animal no humano que comprende una parte o todo el locus de Inmunoglobulina humana con un antígeno RGMa. En una modalidad, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE®, una raza de ratón modificada por ingeniería que comprende fragmentos grandes de los locus de inmunoglobulina humana, y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón; véase, p. ej . , Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994), y las patentes de EE. UU. Nos. 5,916,771 ; 5,939,598; 5,985,615; 5,998,209; 6,075, 181 ; 6,091 ,001 ; 6, 1 14,598; y 6, 130,364; véanse también las publicaciones de PCT WO 91 /10741 ; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031 ; WO 99/53049; WO 00/09560; y WO 00/037504. El ratón transgénico XENOMOUSE® produce un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno. El ratón transgenico XENOMOUSE® contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos por medio de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal de tamaño megabases de los locus de cadena pesada humana y x locus de cadena ligera; véase Méndez et al. , Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia. (4) Anticuerpos monoclonales anti-RGMa utilizando colecciones de anticuerpos recombinantes También se pueden usar métodos in vitro para hacer los anticuerpos de la invención, en donde una colección de anticuerpos se examina para identificar un anticuerpo que tiene la especificidad de unión de RGMa deseada. Los métodos para tal examen o cribado de colecciones de anticuerpos recombinantes son muy conocidos e incluyen los métodos descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 5,223,409 (Ladner et a/.); publicación de PCT No. WO 92/18619 (Kang et al.): publicación de PCT No. WO 91/17271 (Dower et al.): publicación de PCT No. WO 92/20791 (Winter et al.): publicación de PCT No. WO 92/15679 (Markland et a/.); publicación de PCT No. WO 93/01288 (Breitling et a/.); publicación de PCT No. WO 92/01047 (McCafferty et al.)\ publicación de PCT No. WO 92/09690 (Garrard et al.): Fuchs et al. , Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991 ); Hay et al. , Hum. Antibod.

Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991 ); Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991 ); Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res. , 19: 4133-4137 (1991 ); Barbas et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991 ); publicaciónm de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2003/0186374; y publicación de PCT No. WO 97/29131 ; el contenido de cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia.

La colección de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto inmunizado con RGMa, o una porción de RGMa. Alternativamente, la colección de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto previamente no tratado, es decir, un sujeto que no ha sido inmunizado con RGMa, tal como una colección de anticuerpos humanos de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con RGMa humana. Los anticuerpos de la invención se seleccionan examinando la colección de anticuerpos recombinantes con el péptido que comprende RGMa humana para seleccionar así los anticuerpos que reconocen a RGMa. Los métodos para realizar tal examen y selección son muy conocidos y se describen en las referencias citadas en el párrafo anterior. Para seleccionar los anticuerpos de la invención que tienen afinidades de unión particulares por RGMa, como los que se disocian de RGMa humana con una constante de velocidad de disociación Koff particular, se puede usar el método conocido de resonancia de plasmón de superficie para seleccionar los anticuerpos que tienen la constante de velocidad de disociación K0ft deseada. Para seleccionar los anticuerpos de la invención que tienen una actividad neutralizante particular sobre hRGMa, como los que tienen una C 15o particular, se pueden usar los metodos estándares conocidos para evaluar la inhibición de la actividad de RGMa.

En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado, o una porción de unión de antígeno del mismo, que se une a la RGMa humana. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En varias modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.

Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar usando varios métodos de presentación en fago conocidos. En los métodos de presentación en fago, los dominios de anticuerpo funcionales son presentados sobre la superficie de partículas de fago que llevan las secuencias de polinucleótido que los codifican. Tal fago se puede utilizar para presentar los dominios de unión de antígeno expresados desde un repertorio o colección combinatoria de anticuerpos (p. ej . , humanos o murinos). El fago que expresa un dominio de unión de antígeno que se une al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con el antígeno, por ejemplo, usando el antígeno marcado o el antígeno unido o capturado sobre una superficie sólida o cuentas. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen dominios de unión de fd y M13 expresados del fago con dominios de anticuerpo Fab, Fv o Fv estabilizado por disulfuro, fusionados recombinantemente con la proteína del gen III o gen VIII del fago. Ejemplos de los métodos de presentación en fago que se pueden usar para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen los que se revelan en Brinkman et al. , J. Immunol. Methods 182:41 -50 (1995); Ames et al. , J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al. , Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al. , Gene 187 9-18 (1997); Burton et al. , Advances in Immunology 57: 191 -280 (1994); publicación de PCT No. WO 92/01047; publicaciones de PCT Nos. WO 90/02809; WO 91 /10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401 ; y patentes de EE. UU. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821 ,047; 5,571 ,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; y 5,969, 108.

Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección del fago, las regiones del fago que codifican el anticuerpo se pueden aislar y usarse para generar anticuerpos completos que incluyen anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión de antígeno deseado, y se pueden expresar en cualquier hospedero deseado, que incluye células de mamífero, células de insecto, células de planta, levaduras y bacterias, por ejemplo como se describe en detalle más abajo. Por ejemplo, también se pueden usar téenicas para producir recombinantemente los fragmentos Fab, Fab’ y F(ab’)2 usando los métodos conocidos, como los que se describen en la publicación de PCT No. WO 92/22324; Mullinax et al. , BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al. , Am. J. Reprod. Immunol. , 34: 26-34 (1995); y Better et al., Science, 240: 1041 -1043 (1988). Ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir Fvs y anticuerpos de una sola cadena incluyen los que se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al. , Methods in Enzymology, 203:46-88 (1991 ); Shu et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); y Skerra et al. , Science, 240: 1038-1040 (1988).

Para examinar colecciones de anticuerpos recombinantes por medio de presentación en fago, alternativamente se pueden aplicar otros metodos conocidos para examinar colecciones combinatorias grandes para la identificación de los anticuerpos de la invención. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en el que la colección de anticuerpos recombinantes es expresada como fusiones ARN-proteína, como se describe en la publicación de PCT No. WO 98/31700 (Szostak y Roberts), y en Roberts y Szostak, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997). En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteína codificada por el mismo, por medio de traducción in vitro de ARNm sintéticos que llevan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en su extremo 3’. De esta manera, un ARNm específico puede ser enriquecido de una mezcla compleja de ARNm (p. ej., una colección combinatoria) basándose en las propiedades del péptido o proteína codificados, por ejemplo el anticuerpo o porción del mismo, tales como la unión del anticuerpo o porción del mismo al antígeno de especificidad doble. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos o porciones de los mismos, recuperadas del examen de tales colecciones, se pueden expresar por los medios recombinantes que se describen arriba (p. ej., en células hospederas de mamífero), y además se pueden someter a una maduración de afinidad adicional ya sea por rondas adicionales de cribado de las fusiones ARNm-péptido en las que se han introducido mutaciones en las secuencias originalmente seleccionadas, o mediante otros métodos de maduración de afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se describe arriba. Un ejemplo preferido de esta metodología es la teenología de presentación PROfusion.

En otro enfoque, los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar usando métodos conocidos de presentación en levadura. En los métodos de presentación en levadura se usan métodos genéticos para atar dominios de anticuerpo a la pared celular de la levadura y presentarlos sobre la superficie de la levadura. En particular, tal levadura se puede utilizar para presentar dominios de unión de antígeno expresados desde un repertorio o colección combinatoria de anticuerpos (p. e j . , humanos o murinos). Ejemplos de los métodos de presentación en levadura que se pueden usar para preparar los anticuerpos de la presente invención incluyen los revelados en la patente de EE. UU. No. 6,699,658 (Wittrup et al.), que se incorpora aquí como referencia. d. Producción de anticuerpos de RGMa recombinantes Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir por medio de varias técnicas conocidas. Por ejemplo, expresión desde células hospederas, en donde vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras son transfectados en una célula hospedera por medio de las técnicas estándares. Se considera que las diversas formas del término “transfección” abarcan una amplia variedad de téenicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedera procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospederas procariotas o eucariotas, es preferible la expresión de anticuerpos en células eucariotas, muy de preferencia en células hospederas de mamífero, porque es más probable que tales células eucariotas (y en particular las células de mamífero) ensamblen y secreten un anticuerpo plegado apropiadamente e inmunológicamente activo, en comparación con las células eucariotas.

Las células hospederas de mamífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen las de ovario de hámster chino (células CHO) (que incluyen las células dhfr-CHO, descritas por Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220 (1980), usadas con un marcador seleccionadle de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601 -621 (1982), células de mieloma NS0, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo en células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas durante un periodo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, muy preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se desarrollan las células hospederas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando los métodos estándares de purificación de proteína.

En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo, o una porción de unión de antígeno del mismo de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo, se introduce en células dhfr-CHO por medio de transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se enlazan cada uno operativamente a elementos reguladores de incrementador de CMV /promotor de AdMLP para manejar altos grados de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante tambien lleva un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospederas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se utilizan téenicas estándares de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospederas, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Además, la invención provee un método de síntesis de un anticuerpo recombinante de la invención, cultivando una célula hospedera de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención. El método puede comprender además aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo. (a) Anticuerpo humanizado El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o porción del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región de armazón (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano, y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. El anticuerpo humanizado puede ser de una especie no humana que se une al antígeno deseado, que tiene una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la especie no humana, y regiones de armazón de una molécula de inmunoglobulina humana.

Como se usa aquí, el término “sustancialmente”, en el contexto de una CDR, se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos dominios variables (Fab, Fab’, F(ab')2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador), y todas o sustancialmente todas las regiones de armazón son de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. De acuerdo con un aspecto, un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene la cadena ligera y también por lo menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1 , bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado sólo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o de una cadena pesada.

El anticuerpo humanizado se puede seleccionar de cualquier clase de inmunoglobulinas que incluyen IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo que incluye sin limitación I g G 1 , lgG2, lgG3 e lgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y los dominios constantes particulares se pueden seleccionar para optimizar las funciones efectoras deseadas usando téenicas muy conocidas.

Las regiones de armazón y CDRs de un anticuerpo humanizado no requieren corresponder precisamente con las secuencias progenitoras, p. ej. , la CDR del anticuerpo donador o el armazón de consenso pueden ser mutados por sustitución, inserción y/o supresión de por lo menos un residuo de aminoácido, de tal manera que el residuo de CDR o armazón en ese sitio no corresponda con el anticuerpo donador o el armazón de consenso. Sin embargo, en una modalidad estas mutaciones no serán extensas. Usualmente por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de los residuos de anticuerpo humanizado corresponderán con las secuencias de FR y CDR progenitoras. Como se usa aquí, el término “armazón de consenso” se refiere a la región de armazón en la secuencia de inmunoglobulína de consenso. Como se usa aquí, el término “secuencia de inmunoglobulína de consenso” se refiere a la secuencia formada de los aminoácidos (o nucleótidos) que ocurren más frecuentemente en una familia de secuencias de inmunoglobulína relacionadas (véase, p. ej. , Winnaker, “From Genes to Clones” (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1987)). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia de consenso es ocupada por el aminoácido que ocurre más frecuentemente en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos ocurren igual de frecuentemente, cualquiera puede ser incluido en la secuencia de consenso.

El anticuerpo humanizado se puede diseñar para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia los anticuerpos anti-humano de roedor, lo que limita la duración y eficiencia de las aplicaciones terapéuticas de tales porciones en receptores humanos. El anticuerpo humanizado puede tener introducidos uno o más residuos de aminoácido de una fuente que no es humana. Frecuentemente estos residuos no humanos son referidos como residuos de “importación”, que típicamente se toman de un dominio variable. La humanización se puede realizar sustituyendo las secuencias de la región hipervariable con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos, en donde sustancialmente ha sido sustituido menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. Por ejemplo, véase la patente de EE. UU. No. 4,816,567, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo humano en el que algunos residuos de la región hipervariable, y posiblemente algunos residuos FR están sustituidos por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor. La humanización o modificación por ingeniería de los anticuerpos de la presente invención se puede realizar usando cualquier método conocido, tal como por ejemplo, sin limitación, los que se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763, 192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6, 180,370; 5,693,762; 5,530,101 ; 5,585,089; 5,225,539; y 4,816,567.

El anticuerpo humanizado puede retener alta afinidad por RGMa y otras propiedades biológicas favorables. El anticuerpo humanizado se puede preparar mediante un procedimiento de análisis de las secuencias progenitoras y varios productos humanizados conceptuales, usando modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y humanizadas. Comúnmente están disponibles modelos tridimensionales de inmunoglobulina. Están disponibles programas de computadora que ilustran y presentan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que afectan la capacidad de la inmunogloublina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar y combinar residuos de FR del receptor y secuencias de importación, de tal manera de lograr las características deseadas del anticuerpo, tales como mayor afinidad por RGMa. En general, los residuos de la región hipervariable pueden estar directa y muy sustancialmente implicados en la influencia de la unión al antígeno.

Como una alternativa a la humanización se pueden generar anticuerpos humanos (también denominados aquí “anticuerpos completamente humanos”). Por ejemplo, es posible aislar anticuerpos humanos de colecciones por medio de PROfusion y/o teenologías relacionadas con levadura. Véanse los ejemplos provistos más abajo. También es posible producir animales transgénicos (p. ej . , ratones que son capaces, por inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena). Por ejemplo, la supresión homocigótica del gen de la región de conexión de la cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la variedad de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos después de provocación con el antígeno. Los anticuerpos humanizados o completamente humanos se pueden preparar de acuerdo con los métodos descritos en las patentes de EE. UU. Nos. 5,770,429; 5,833,985; 5,837,243; 5,922,845; 6,017,517; 6,096,31 1 ; 6, 1 1 1 , 166; 6,270,765; 6,303,755; 6,365, 1 16; 6,410,690; 6,682,928; y 6,984,720, el contenido de cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. 3. Composiciones farmacéuticas El anticuerpo puede ser un componente en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención son para usarse, sin limitación, en el diagnóstico, detección o monitoreo de un trastorno, en la prevención, tratamiento, manejo o alivio de un trastorno o uno o más de sus síntomas, y/o en investigación. En una modalidad específica, la composición comprende uno o más anticuerpos de la invención. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos diferentes de los anticuerpos de la invención para tratar un trastorno en donde resulta nociva la actividad de una RGMa objetivo. En una modalidad adicional, los agentes profilácticos o terapéuticos conocidos tienen o han tenido utilidad para la prevención, tratamiento, manejo o alivio de un trastorno o uno o más de sus síntomas, o se usan actualmente para lo mismo. De acuerdo con estas modalidades, la composición puede comprender, además, un vehículo, diluente o excipiente.

Los anticuerpos de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, el “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y de retraso de absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguadora de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como también combinaciones de los mismos. En muchos casos será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender, además, cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de mojado o emulsionantes, conservadores o amortiguadores, que incrementan la vida útil en almacenamiento o la eficiencia del anticuerpo.

En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende por lo menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno como el que se describe en la presente.

Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden usar para administrar uno o más anticuerpos de la invención, o la combinación de uno o más anticuerpos de la invención y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, manejar, tratar o aliviar un trastorno o uno o más de sus síntomas, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (véase, p. ej . , Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de administración de un agente profiláctico o terapéutico de la invención incluyen, sin imitación, administración parenteral (p. ej., intradérmica, intramuscular, ¡ntraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral y administración mucosal (p. ej . , vía intranasal y oral). Además, se puede usar administración pulmonar, por ejemplo utilizando un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de formación de aerosol; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y las publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903; cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En una modalidad, un anticuerpo de la invención, terapia de combinación, o una composición de la invención, se administran usando la teenología de suministro de fármaco pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, Inc. , Cambridge, Massachusetts). En una modalidad específica, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administran por vía intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolo, por medio de absorción a través de los revestimientos epitelial o mucocutáneo (p. ej. , la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.), y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

En una modalidad específica, puede ser conveniente administrar los anticuerpos de la invención localmente en el área en necesidad de tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a manera de limitación, por infusión local, por inyección, o por medio de un implante, dicho implante siendo de un material poroso o no poroso, que incluye membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (p.ej., Tissuel®), o matrices de colágeno. En una modalidad, una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la invención se administra localmente en el área afectada a un sujeto para prevenir, tratar, manejar y/o aliviar un trastorno o un síntoma del mismo. En otra modalidad, una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la invención se le administra localmente a un sujeto en el área afectada, en combinación con una cantidad eficaz de una o más terapias (p. ej . , uno o más agentes profilácticos o terapéuticos), diferentes de un anticuerpo de la invención, para prevenir, tratar, manejar y/o aliviar un trastorno o uno o más de sus síntomas.

En otra modalidad, el anticuerpo se puede suministrar en un sistema de liberación controlada o liberación sostenida. En una modalidad se puede usar una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al. , 1980, Surgery 88:507; Saudek et al. , 1989, N. Engl. J. Med. 321 :574). En otra modalidad, se puede usar materiales poliméricos para obtener la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véase, p. ej., “Medical Applications of Controlled Release”, Langer y Wise (eds ), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); "Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance”, Smolen y Ball (eds.), Wilcy, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 ; véase tambien Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al. , 1989, Ann. Neurol. 25:351 ; Howard et al. , 1989, J. Neurosurg. 71 : 105); patentes de EE. UU. Nos. 5,679,377; 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; 5, 128,326; publicación de PCT No. WO 99/15154; y publicación de PCT No. WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros usados en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, sin limitación, poli(2-hidrox¡ etil metacrilato), poli(metil metacrilato), po li (ácido acrílico), poli(etilen-co-acetato de vinilo), poli (ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilam ida, poli(etilenglicol), polilactida (PLA), poli(lactida-co-g I icó I idos) (PLGA), y poliortoésteres. En una modalidad particular, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas I ixi vi ables , estable en almacenamiento, estéril y biodegradable. En otra modalidad, un sistema de liberación controlada o sostenida se puede colocar en la proximidad del agente profiláctico o terapéutico, requiriéndose así sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej . , Goodson, en “Medical Applications of Controlled Release", supra, volumen 2, p. 115-138 (1984)).

Los sistemas de liberación controlada se exponen en la revisión de Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Cualquier téenica conocida para el experto en la materia se puede usar para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más anticuerpos de la invención; véase, p. ej., la patente de EE. UU. No. 4,526,938; la publicación de PCT WO 91/05548; la publicación de PCT WO 96/20698; Ning et al. , 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cáncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39: 179-189; Song et al. , 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA 10urnal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. , 1997, "Mlcroencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

En una modalidad específica en donde la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su anticuerpo codificado, construyendolo como parte de un vector de expresión apropiado de ácido nucleico y administrándolo de tal manera que se convierta en intracelular, por ejemplo, usando un vector retroviral (véase la patente de EE. UU. No. 4,980,286), o mediante inyección directa, o usando bombardeo de micropartículas (p. ej . , una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en enlace con un péptido de tipo homeobox que se sabe que entra al núcleo (véase, p. ej. , Joliot et al., 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868). Alternativamente, un ácido nucleico se puede introducir intracelularmente y se puede incorporar dentro del ADN de la célula hospedera para su expresión por recombinación homologa.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con la vía de administración pretendida. Los ejemplos de vías de administración incluyen, sin limitación, administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (p. ej . , inhalación), transdérmica (p. ej . , tópica), transmucosal y rectal. En una modalidad específica, la composición se formula de acuerdo con los procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para su administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a los seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones amortiguadoras acuosas isotónicas estériles. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.

Si las composiciones de la invención se van a administrar por vía tópica, las composiciones se pueden formular en forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, espray, aerosol, solución, emulsión, u otra forma muy conocida para el experto en la materia; véase, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms", 19a edición, Mack Pub. Co. , Easton, Pa. (1995). Para las formas farmacéuticas tópicas no atomizables, típicamente se emplean formas viscosas a semisólidas o sólidas, que comprenden un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica, y que tienen una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que la del agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, pomadas y similares que, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares (p. ej. conservadores, estabilizadores, agentes de mojado, amortiguadores o sales) para alterar varias propiedades tales como por ejemplo la presión osmótica. Otras formas de dosis tópicas adecuadas incluyen las preparaciones de aerosol atomizables, en donde el ingrediente activo, preferiblemente en combinación con un vehículo sólido o líquido inerte se envasa en una mezcla con un material volátil presurizado (p. ej., un propulsor gaseoso como freón) o en una botella exprimible. Si así se desea también se le pueden añadir agentes de mojado o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas. Los ejemplos de tales ingredientes adicionales son muy conocidos.

Si el método de la invención comprende la administración intranasal de una composición, la composición se puede formular en forma de aerosol, espray, niebla o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para usarse de acuerdo con la presente invención se pueden suministrar convenientemente en forma de una presentación de espray de aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, utilizando un propulsor adecuado (p. ej. , diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede ser determinada suministrando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos (compuestos, por ejemplo, de gelatina) para usarse en un inhalador o insuflador, que contiene una mezcla del polvo del compuesto y una base de polvo adecuada como lactosa o almidón.

Si el método de la invención comprende administración oral, las composiciones se pueden formular para vía oral en forma de tabletas, cápsulas, obleas, gelcaps, soluciones, suspensiones y similares. Las tabletas o cápsulas se pueden preparar mediante los medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (p. ej . , almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); rellenos (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio); lubricantes (p. ej. , estearato de magnesio, talco o sílice); desintegradores (p. ej., almidón de papa o almidón glicolato de sodio); o agentes de mojado (p. ej. laurilsulfato de sodio). Las tabletas se pueden recubrir mediante métodos muy conocidos. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tener la forma de, sin limitación, soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Estas preparaciones líquidas se pueden preparar por los medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (p. ej. , jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p. ej. , aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (p. ej., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo, o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes, según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral se pueden formular adecuadamente para liberación lenta, liberación controlada o liberación sostenida de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos.

El método de la invención puede comprender administración pulmonar, por ejemplo usando un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente de formación de aerosol; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013, WO 98/31346; y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En una modalidad específica, un anticuerpo de la invención, terapia de combinación y/o composición de la invención se administran usando la teenología de suministro de fármaco pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, I nc. , Cambridge, Massachusetts).

El método de la invención también pueden comprender la administración de una composición formulada para administración parenteral por inyección (p. ej. por inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitaria (p. ej., en ampolletas o recipientes de dosis múltiples) con un conservador añadido. Las composiciones pueden tener formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones, en vehículos oleosos u acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado antes de usarse (p. ej . , agua estéril libre de pirógenos). Adicionalmente, los métodos de la invención pueden comprender la administración de las composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (p. ej., por vía subcutánea o intramuscular) o por medio de inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, las composiciones se pueden formular con materiales poli éricos o hidrófobos adecuados (p. ej. , como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles (p. ej., como una sal escasamente soluble).

Los métodos de la invención abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. , y las formadas con cationes tales como las derivadas de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones se proveen separadamente o mezclados en forma de dosis unitaria, por ejemplo como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua, en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolleta o bolsita, que indica la cantidad de agente activo. Cuando el modo de administración es la infusión, la composición se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina estéril grado farmacéutico. Cuando el modo de administración es por inyección, se puede proveer una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina, de tal manera que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

En particular, la invención también provee uno o más de los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la invención envasados en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolleta o bolsita que indica la cantidad del anticuerpo. En una modalidad, uno o más de los anticuerpos o las composiciones farmacéuticas de la invención se proveen como un polvo liofilizado seco esterilizado o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente, y se puede reconstituir (p. ej. con agua o solución salina) a la concentración apropiada para su administración a un sujeto. En una modalidad, uno o más de los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la invención se proveen como un polvo liofilizado seco estéril en un recipiente sellado herméticamente, en una dosis unitaria de por lo menos 5 mg, por ejemplo por lo menos 10 mg, por lo menos 15 mg, por lo menos 25 mg, por lo menos 35 mg, por lo menos 45 mg, por lo menos 50 mg, por lo menos 75 mg, o por lo menos 100 mg. Los anticuerpos o composiciones farmacéuticas liofilizadas de la invención se deben almacenar a entre 2°C y 8°C en su recipiente original, y los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la invención se deben administrar dentro de 1 semana, por ejemplo dentro de 5 días, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, o dentro de 1 hora después de ser reconstituidos. En una modalidad alternativa, uno o más de los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la invención se proveen en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente que indica la cantidad y concentración del anticuerpo. En una modalidad adicional, la forma líquida de la composición administrada se provee en un recipiente sellado herméticamente, a por lo menos 0.25 mg/mL, por ejemplo por lo menos 0.5 mg/mL, por lo menos 1 mg/mL, por lo menos 2.5 mg/mL, por lo menos 5 mg/mL, por lo menos 8 mg/mL, por lo menos 10 mg/mL, por lo menos 15 mg/kg, por lo menos 25 mg/mL, por lo menos 50 mg/mL, por lo menos 75 mg/mL o por lo menos 100 mg/mL. La forma líquida se debe almacenar a entre 2°C y 8°C en su recipiente original.

Los anticuerpos de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. En un aspecto, los anticuerpos se han de preparar como una solución inyectable que contiene 0.1 -250 mg/mL de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta de una forma farmacéutica líquida o liofilizada en un frasco o vial ámbar, ampolleta o jeringa prellenada. El amortiguador puede ser L-histidina (1 -50 mM), de manera óptima 5-10 mM, a pH 5.0 a 7.0 (de manera óptima, pH 6.0). Otros amortiguadores adecuados incluyen, sin limitación, succinato de sodio, cítrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Se puede usar cloruro de sodio para modificar la tonicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (de manera óptima, 150 mM para una forma de dosis líquida). Se pueden incluir crioprotectores para una forma de dosis liofilizada, principalmente 0-10% de sacarosa (de manera óptima, 0.5-1.0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Se pueden incluir agentes de volumen para una forma de dosis liofilizada, principalmente 1-10 % de manitol (de manera óptima, 2-4%). Se pueden usar estabilizadores en formas farmacéuticas tanto líquidas como liofilizadas, principalmente L-metionina 1 -50 mM (de manera óptima, 5-10 mM). Otros agentes de volumen adecuados incluyen glicina, arginina, que se pueden incluir como polisorbato 80 al 0-0.05% (de manera óptima, 0.005-0.01 %). Agentes tensoactivos adicionales incluyen, sin limitación, polisorbato 20 y agentes tensoactivos BRIJ. La composición farmacéutica que comprende los anticuerpos de la invención, preparada como una solución inyectable para administración parenteral, puede comprender adicionalmente un agente útil como adyuvante, tal como se usa para aumentar la absorción o dispersión del anticuerpo. Un adyuvante particularmente útil es la hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante). La adición de hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad humana después de administración parenteral, particularmente la administración subcutánea. También permite mayores volúmenes en el sitio de inyección (es decir, mayores de 1 mL), con menos dolor y molestia, e incidencia mínima de reacciones secundarias por inyección (véase la publicación de la solicitud internacional WO 04/078140, y la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. US2006104968, que se incorporan aquí como referencia).

Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (p. ej . , soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración deseado y la aplicación terapéutica. Las composiciones pueden estar en forma de soluciones inyectables o infundibles, como composiciones similares a las que se utilizan para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. En una modalidad, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.

Típicamente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración de fármaco alta. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (es decir, una proteína de unión, p. ej. , un anticuerpo de la presente invención), en la cantidad requerida, en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes anteriormente mencionados, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente las dispersiones se prepararan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los mencionados anteriormente. En el caso de polvos llofilizados estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por atomización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos, previamente esterilizada por filtración. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, utilizando un recubrimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión, y utilizando agentes tensoactivos. Las composiciones inyectables se pueden hacer de absorción prolongada incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos. Para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo de administración puede ser la inyección subcutánea, e inyección o infusión intravenosa. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En algunas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un vehículo que proteja al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o son conocidos generalmente para los expertos en la materia; véase, por ejemplo, “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc. , Nueva York, 1978.

En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención se puede administrar por vía oral, por ejemplo con un diluente inerte o un vehículo comestible asimilable. El anticuerpo (y otros ingredientes, si así se desea) también se pueden encerrar en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, se puede comprimir en tabletas, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, el anticuerpo se puede incorporar con excipientes y usarse en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un anticuerpo de la invención por medio de administración diferente de parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o administrar el compuesto conjuntamente con, un material para prevenir su desactivación.

También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos complementarios. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención se formula conjuntamente con, y/o se coadministra con, uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para el tratamiento de los trastornos o enfermedades aquí descritas. Por ejemplo, un anticuerpo anti-RGMa de la invención se puede formular y/o administrar conjuntamente con uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otros objetivos (p. ej . , anticuerpos que se unen a otros antígenos solubles o que se unen a moléculas de superficie celular). Además, uno o más anticuerpos de la invención se pueden usar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriormente mencionados. Estas terapias de combinación pueden utilizar convenientemente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posible toxicidad o complicación asociada con las diversas monoterapias.

En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención se enlaza con un vehículo conocido que prolonga la vida media. Estos vehículos incluyen, sin limitación, el dominio Fe, polietilenglicol y dextrano. Estos vehículos se describen, por ejemplo, en la solicitud de EE. UU. No. de serie 09/428,082, y la solicitud de PCT publicada No. WO 99/25044, que se incorporan aquí como referencia para cualquier propósito.

En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención se administran para tratar, prevenir, manejar o aliviar un trastorno o uno o más de sus síntomas por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresadle. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado de la invención que media un efecto profiláctico o terapéutico.

Cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles se puede usar de acuerdo con la presente invención. Para revisiones generales de los métodos de terapia génica véase Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991 , Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev.

Biochem. 62: 191 -217; mayo de 1993, TIBTECH 1 1 (5): 155-215. Los métodos conocidos comúnmente de teenología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al. (eds.), “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wilcy & Sons, NY (1993); y Kriegler, “Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual”, Stockton Press, NY (1990). La descripción detallada de varios métodos de terapia génica se revela en US20050042664 A 1 , que se incorpora aquí como referencia.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o en combinación para tratar enfermedades o afecciones asociadas con la degeneración de neurita, tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, demencia, enfermedad de Parkinson, una lesión traumática del sistema nervioso central, o cualquier otra enfermedad o afección asociada con RGMa.

Se debe entender que los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o en combinación con uno o más agentes adicionales, por ejemplo un agente terapéutico (por ejemplo, una molécula pequeña o agente biológico), dicho agente siendo seleccionado por el experto en la materia para la finalidad deseada. Por ejemplo, el agente terapéutico adicional puede ser un inmunosupresor o un agente que se usa para tratar uno o más síntomas asociados con la esclerosis múltiple. El fármaco adicional puede ser un interferón beta. Los interferones beta, tales como Avonex, Betaseron, Extavia y Rebif, pueden retardar la velocidad a la que los síntomas de la esclerosis múltiple se empeoran con el tiempo. El agente adicional puede ser Glatiramer (Copaxona), que puede bloquear el ataque del sistema inmune sobre la mielina. El agente adicional puede ser Fingolimod (Gilenya), que puede atrapar células inmunes en los nodulos linfáticos. El agente adicional puede ser Natalizumab (Tysabri), que puede alterar el movimiento de células inmunes potencialmente dañinas de la corriente sanguínea al cerebro y la médula espinal. El fármaco adicional puede ser mitoxantrona (Novantrona), que es un fármaco inmunosupresor.

El agente terapéutico adicional puede ser un “fármaco de mejoramiento cognitivo”, que es un fármaco que mejora las capacidades cognitivas humanas deterioradas del cerebro (particularmente, pensamiento, aprendizaje y memoria). Los fármacos de mejoramiento cognitivo funcionan alterando la disponibilidad de sustancias neuroquímicas (p. ej . , neurotransmisores, enzimas y hormonas), mejorando el suministro de oxígeno, estimulando el crecimiento de nervio, o inhibiendo el daño del nervio. Los ejemplos de fármacos de mejoramiento cognitivo incluyen un compuesto que aumenta la actividad de acetilcolina, tal como por ejemplo, sin limitación, un agonista del receptor de acetilcolina (por ejemplo, un agonista o modulador alostérico del receptor a-7 nicotínico, un agonista o moduladores alostéricos del receptor nicotínico a4b2), un inhibidor de acetilcolinesterasa (p. ej., donepezil, rivastigmina y galantamina), un inhibidor de butirilcolinesterasa, un antagonista del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) (p. ej., memantina), un agonista de la proteína neuroprotectora dependiente de actividad (ADNP), un agonista del receptor de serotonina 5-HTIA (p. ej., xaliproden), un agonista del receptor 5-HT4, un antagonista del receptor 5-HT6, un antagonista del receptor de serotonina 1A, un antagonista del receptor de histamina H3, un inhibidor de calpaína, una proteína o agonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un factor de crecimiento trófico, un compuesto anti-apoptótico, un activador del receptor de glutamato del tipo AMPA, un bloqueador o modulador del canal de calcio de tipo L o de tipo N, un bloqueador del canal de potasio, un activador del factor inducible por hipoxia (HIF), un inhibidor de prolil 4-hidroxilasa de HIF, un agente antiinflamatorio, un inhibidor del péptido amiloide Ab o la placa amiloide, un inhibidor de la hiperfosforilación de tau, un inhibidor de fosfodiesterasa 5 (p. ej . , tadalafil, sildenafil), un inhibidor de fosfodiesterasa 4, un inhibidor de monoamino oxidasa, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Los ejemplos específicos de estos fármacos de mejoramiento cognitivo incluyen, sin limitación, inhibidores de colinesterasa tales como donepezil (Aricept®), rivastigmina (Exelon®), galantamina (Reminyl®), antagonistas de N-metil-D-aspartato tales como memantina (Namenda®). Por lo menos un fármaco de mejoramiento cognitivo se puede administrar simultáneamente con los anticuerpos de la presente invención, o secuencialmente con los anticuerpos de la presente invención (y en cualquier orden), incluyendo los agentes actualmente reconocidos, o reconocidos en el futuro como útiles para tratar la enfermedad o afección tratada por un anticuerpo de la presente invención). Adicionalmente, se cree que las combinaciones aquí descritas pueden tener efectos aditivos o sinérgicos cuando se usan en el tratamiento anteriormente descrito. El agente adicional también puede ser un agente que imparte un atributo beneficioso a la composición terapéutica, por ejemplo un agente que afecta la viscosidad de la composición.

Además, se debe entender que las combinaciones son las combinaciones útiles para su propósito deseado. Los agentes expuestos arriba son para fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Las combinaciones pueden comprender un anticuerpo y por lo menos un agente adicional seleccionado de las listas que se dan más abajo. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo dos o tres agentes adicionales, si la combinación es tal que la composición formada puede realizar la función deseada.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad profilácticamente eficaz” de un anticuerpo. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos necesarios, para obtener el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo puede ser determinada por el experto en la materia y puede variar por factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que los efectos tóxicos o nocivos del anticuerpo, si los hubiera, son rebasados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos necesarios, para obtener el resultado profiláctico deseado.

Típicamente, puesto que se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes de la enfermedad o en una etapa inicial de la misma, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proveer la respuesta deseada óptima (p. ej . , una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en forma de dosis unitarias para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosis unitaria, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos por tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosis unitarias son dictadas por, y dependen directamente de: (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se pretende lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la téenica de la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Una escala ejemplar no limitativa de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del anticuerpo es una dosis entre 0.1 y 200 mg/kg, por ejemplo entre 0.1 y 10 mg/kg. La cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del anticuerpo puede ser entre 1 y 200 mg/kg, 10 y 200 mg/kg, 20 y 200 mg/kg, 50 y 200 mg/kg, 75 y 200 mg/kg, 100 y 200 mg/kg, 150 y 200 mg/kg, 50 y 100 mg/kg, 5 y 10 mg/kg, o 1 y 10 mg/kg. Es de notar que las dosis pueden variar con el tipo y severidad de la afección por aliviar. Además, la dosis de anticuerpo puede ser determinada por un experto en la materia y puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. También, la dosis es tal que los efectos tóxicos o nocivos del anticuerpo, si los hubiera, son rebasados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Además, se entiende que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se ajustarían con el tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que las escalas de dosis aquí expuestas son únicamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reclamada. 4. Método de tratamiento, prevención, modulación o atenuación de una enfermedad asociada con la degeneración de neuritas En cualquier sujeto se puede hacer una evaluación de si el sujeto tiene un trastorno degenerativo de neuritas. La evaluación puede indicar un curso de terapia apropiado, tal como terapia preventiva, terapia de mantenimiento o terapia de modulación. Por consiguiente, se provee aquí un método de tratamiento, prevención, modulación o atenuación de una enfermedad/trastorno de degeneración de neuritas. El anticuerpo se puede administrar a un sujeto en necesidad del mismo. El anticuerpo se puede administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz.

En general, la dosis de los anticuerpos administrados variará dependiendo de factores tales como la edad, peso, estatura, sexo, condición médica general e historia médica previa del paciente. Típicamente, es conveniente proveer al receptor una dosis del componente de anticuerpo, inmunoconjugado o proteína de fusión que está en la escala de 1 mg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del paciente), aunque también se puede administrar una dosis más alta o más baja conforme lo dicten las circunstancias. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proveer la respuesta deseada óptima (p. ej . , una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en forma de dosis unitarias para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosis unitaria, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos por tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosis unitarias son dictadas por, y dependen directamente de: (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se pretende lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la téenica de la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Una escala ejemplar no limitativa de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es de 0.1 -20 mg/kg, de preferencia 0.5-10 mg/kg. Es de notar que las dosis pueden variar con el tipo y severidad de la afección por aliviar. Además, se entiende que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar con el tiempo de acuerdo con las necesidades del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que las escalas de dosis expuestas en la presente son únicamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reclamada.

La administración de los anticuerpos a un paciente puede ser por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, intraocular, intravítrea, por perfusión a través de un catéter regional, o por medio de inyección intralesional directa. Cuando se administran proteínas terapéuticas por inyección, la administración puede ser por infusión continua o por bolos únicos o múltiples. La inyección intravenosa provee un modo de administración útil debido a que la circulación distribuye rápidamente los anticuerpos. El anticuerpo se puede administrar por vía oral, por ejemplo con un diluente inerte o un vehículo comestible asimilable. El anticuerpo y otros ingredientes, si se desea, se pueden encerrar en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, se pueden comprimir en tabletas, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.

Los anticuerpos anti-RGMa se pueden administrar a dosis de proteína bajas, tales como de 20 miligramos a 2 gramos de proteína por dosis, administrada una vez, o repetidamente, por vía parenteral. Alternativamente, los anticuerpos se pueden administrar en dosis de 20 a 1 ,000 miligramos de proteína por dosis, o 20 a 500 miligramos de proteína por dosis, o 20 a 100 miligramos de proteína por dosis.

Los anticuerpos se pueden administrar solos o se pueden conjugar con liposomas, y se pueden formular de acuerdo con los métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, con lo cual los anticuerpos se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un “vehículo farmacéuticamente aceptable” puede ser tolerado por un paciente receptor. La solución salina amortiguadora de fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados son muy conocidos para los expertos en la materia; véase, por ejemplo, “REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES”, 19a edición (1995).

Para fines de terapia, los anticuerpos se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es una cantidad que es fisiológicamente significativa. El anticuerpo es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectadle en la fisiología de un paciente receptor. En el presente contexto, el anticuerpo puede ser fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado, por ejemplo, la disminución de la secreción de interferón-g (INF-g), interleucina-2 (IL-2), IL-4 y/o IL-17 de celulas T CD4+. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado, por ejemplo, reducción de las respuestas proliferativas y/o la expresión de citocina proinflamatoria en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).

Se pueden utilizar métodos de tratamiento adicionales para controlar la duración de acción de un anticuerpo en una aplicación terapéutica. Se pueden hacer preparaciones de liberación controlada utilizando polímeros para formar complejos o para absorber el anticuerpo. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de poli(etileno-co-acetato de vinilo) y matrices de un copolímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebácico: Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). La velocidad de liberación de un anticuerpo de tal matriz depende del peso molecular de la proteína, la cantidad de anticuerpo dentro de la matriz y el tamaño de las partículas dispersas: Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., supra. Otras formas farmacéuticas sólidas se describen en “REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES”, 19a edición (1995). a. Trastornos/enfermedades degenerativas de neuritas El trastorno/enfermedad de neuritas puede ser cualquier enfermedad o trastorno en el que existe daño de las neuritas y la función sinóptica está comprometida. Este daño y función comprometida puede originarse de los nervios que carecen de suficiente mielinización y/o transección de axón. El trastorno o enfermedad degenerativa de neuritas puede ser esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades motoneuronales, enfermedad de Huntington, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Gaucher, síndrome de Hurler, enfermedades desmielinizantes inflamatorias idiopáticas, deficiencia de vitamina B12, mielinólisis pontina central, tabes dorsal, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica y otras retinopatías asociadas con la degeneración de la neurita, tales como glaucoma, neuropatía diabética y degeneración macular dependiente de la edad, lesión traumática del sistema nervioso central, o leucodistrofias, por ejemplo. El trastorno o enfermedad degenerativa de neuritas puede originarse de las fibras nerviosas que carecen de suficiente envoltura de capas de tejido compuestas de una grasa (lipoproteína) denominada mielina. Estas capas forman la vaina de mielina. La vaina de mielina puede permitir que los impulsos eléctricos sean conducidos a lo largo de la fibra nerviosa con velocidad y precisión. Cuando la vaina de mielina está dañada o ausente, los nervios no conducen normalmente los impulsos eléctricos. Algunas veces, como resultado del daño de la vaina de mielina o de su ausencia, las fibras nerviosas también se pueden dañar.

Los bebés normalmente pueden carecer de vainas de mielina maduras. Como resultado, sus movimientos son vacilantes, descoordinados y torpes. Conforme se desarrollan las vainas de mielina, los movimientos se hacen más suaves, con más propósito y más coordinados. Sin embargo, las vainas de mielina no se desarrollan normalmente en los niños con algunas enfermedades, tales como la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Niemann-Pick, la enfermedad de Gaucher y el síndrome de Hurler.

En los adultos, la vaina de mielina puede ser destruida por derrame cerebral, inflamación, trastornos inmunes, trastornos metabólicos y deficiencias nutricionales (tal como la falta de vitamina B12). Los venenos, drogas (tales como el antibiótico etambutol), y el uso excesivo de alcohol pueden dañar o destruir la vaina de mielina. Si la vaina es capaz de repararse y regenerarse por sí sola, la función nerviosa normal puede retornar. Sin embargo, si la vaina es dañada severamente, la fibra nerviosa subyacente puede morir. Debido a que las fibras nerviosas del sistema nervioso central (cerebro y médula espinal) raramente se regeneran, este daño es irreversible.

Algunos trastornos degenerativos de neuritas que causan desmielinización afectan principalmente el sistema nervioso central. Otros afectan principalmente nervios en otras partes del cuerpo. Los trastornos de degeneración de neuritas que causan desmielinización en el sistema nervioso central y no tienen causa conocida son denominados trastornos desmielinizantes primarios. La esclerosis múltiple es el más común de estos trastornos. (1 ) Esclerosis múltiple El curso clínico de la MS se puede dividir en cuatro categorías (o subtipos) principales: remitente con recidiva (RRMS), secundaria progresiva (SPMS), primaria progresiva (PMS) y recidiva progresiva (PRMS). Los pacientes que tienen recidivas clínicas cada pocos meses o años con periodos intermedios de estabilidad clínica definen la RRMS. La RRMS puede ser dos veces más común en mujeres que en hombres en la segunda o tercera década de la vida. En contraste con la RRMS, los pacientes con SPMS presentan deterioro progresivo entre recidivas. Los pacientes de RRMS se pueden convertir con el tiempo a SPMS, caracterizándose por una declinación gradual de la función neurológica. Aproximadamente 15% de los pacientes de MS tienen PPMS caracterizada por el inicio tardío y un deterioro inexorable de la función neurológica desde el inicio de la enfermedad. La MS benigna se define arbitrariamente como la de los pacientes de RRMS que después de más de 15 años después del diagnóstico inicial todavía son móviles y muestran sólo ligeros déficits (Escala de Estatus de Discapacidad Expandida [EDSS]). Típicamente, estos pacientes muestran poco o nada de progreso después de su ataque inicial y no requieren intervención terapéutica; sin embargo, no es posible diagnosticar esta forma de MS hasta después de 5 años del inicio de la MS. (2) Enfermedad de Parkinson La enfermedad de Parkinson está ampliamente extendida en todo el hemisferio occidental y fue reportada por primera vez por el médico James Parkinson en 1817. La enfermedad de Parkinson puede ser detectada por primera vez como un temblor en un miembro, y puede avanzar finalmente para incluir otras tres manifestaciones: (i) rigidez, que se caracteriza por movimiento de tipo “rueda dentada’ y rigidez de “tubo de plomo”; (ii) bradiqumesia o retardo de movimiento, y (iii) inestabilidad postural asociada con una postura agachada y un deterioro de la marcha. Estos movimientos alterados son características de una disfunción motora, pero además también puede haber un deterioro mental en hasta 40% de todos los pacientes de Parkinson.

La enfermedad de Parkinson puede ser causada por un estado deficiente de levodopamina en el cerebro. Más específicamente, la levodopamina puede inducir discinesia en los pacientes de Parkinson y producir desnervación de la sustancia negra. Hasta la fecha, la ciencia médica no ha encontrado un substrato que le permita a una forma inyectable de levodopa alcanzar el cerebro y atravesar exitosamente la barrera hematoencefálica. La terapia de reemplazo de dopamina actual está dirigida al reemplazo directo o a la imitación de la acción en los sitios receptores de dopamina del cerebro. Aunque la terapia con levodopa puede crear inicialmente algunos cambios beneficiosos, los cambios pueden disminuir con el tiempo y producir otros problemas tales como perturbación severa del sueño, discinesias y náusea constante. Las aproximaciones médicas a la enfermedad de Parkinson incluyen la destrucción quirúrgica del tejido del cerebro y la inserción de microelectrodos (estimulación eléctrica profunda del cerebro) en las porciones afectadas del cerebro. La inserción de los electrodos tiene la ventaja de ser reversible. Sin embargo, estas intervenciones generalmente son transitorias y ni producen un cambio permanente en el estado Parkinsoniano ni revierten los efectos de la enfermedad.

La enfermedad de Parkinson puede ser un trastorno neurodegenerativo multifactorial que evoluciona debido a la oxidación excesiva. La sustancia negra es susceptible al daño oxidativo que apoya esta teoría de la formación de la enfermedad de Parkinson. Las anormalidades de la fosforilación oxidativa deterioran la mitocondria de la sustancia negra e intensifican la generación de radicales libres. (3) Lesión originada por especies de oxígeno reactivas (radicales libres) Las especies de oxígeno reactivas (ROS) pueden atacar varios tipos de tejidos, y la exposición crónica a las ROS puede atenuar varias funciones biológicas y aumentar el riesgo de varios tipos de trastornos serios que incluyen trastornos y enfermedades degenerativos de la neurita. Las ROS pueden atacar a las neuronas e inducir muerte celular. Por ejemplo, el tratamiento de neuronas con concentraciones bajas de peróxido de hidrógeno puede inducir lesión de la neurita influyendo en cambios nocivos de la morfología de la neurita, algunas veces denominados formación de glóbulos de neurita. La formación de glóbulos de neurita puede ser uno de los eventos iniciales de la degeneración neuronal antes de la inducción de la muerte de las neuronas tratadas con peróxido de hidrógeno. (4) Enfermedad de Alzheimer La enfermedad de Alzheimer (AD) es la causa principal de demencia en las personas mayores. Aunque existen formas geneticas de AD raras, la mayoría de los pacientes se clasifican por tener AD esporádica, puesto que usualmente no se identifica historia familiar. Patológicamente, la AD se caracteriza por degeneración neuronal y sináptica con un aumento del número de placas seniles y marañas neurofibrilares en comparación con los individuos no dementes de edad comparable.

Las placas seniles, características de la enfermedad de Alzheimer, están compuestas de un núcleo central de beta-amiloide agregado, un producto de descomposición de la proteína precursora amiloide (APP). Las marañas neurofibrilares son estructuras de tipo hebra intracelulares insolubles constituidas de una forma hiperfosforilada de una proteína llamada tau, que se asocia con los microtúbulos.

Rebanadas de tejido cerebral post-mortem de víctimas de la enfermedad de Alzheimer exhiben la presencia de amiloide en forma de núcleos extracelulares proteináceos de las placas neuríticas que son características de la AD. Los núcleos amiloides de estas placas neuríticas están compuestos de una proteína denominada b-amiloide, que está dispuesta en una configuración de lámina predominantemente beta-plegada: Morí et al. 10urnal of Biológica! Chemistry 267: 17082 (1992); Kirschner et al., PNAS 83:503 (1986). Las placas neuríticas son un aspecto inicial y constante de la enfermedad: Mann et al., J. Neurol. Sci. 89: 169; Mann, Mech. Ageing Dev. 31 :213 (1985); Terry et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol 46:262 (1987).

La deposición inicial de Ab puede ocurrir antes de que sean notables los síntomas clínicos. Los “criterios microscópicos mínimos” actualmente recomendados para el diagnóstico de AD se basan en el número de placas neuríticas encontradas en el cerebro: Khachaturian, Arch. Neurol. supra (1985). Desafortunadamente, la evaluación de las cuentas de la placa neurítica debe esperar hasta después de la muerte.

Las placas neuríticas que contienen amiloide son una característica sobresaliente de áreas selectivas del cerebro en AD y también en el síndrome de Down, y en personas homocigóticas para el alelo de apolipoproteína E4 que muy probablemente desarrollen AD: Corder et al., Science 261 :921 (1993); Divry, P., J. Neurol. Psych. 27:643-657 (1927); Wisniewski et al., en Zimmerman, H. M. (ed.): “PROGRESS IN NEUROPATHOLOGY” (Gruñe y Stratton. N.Y. 1973) p. 1 -26. El amiloide cerebral es demostrado fácilmente tiñendo secciones de cerebro con tioflavina S o rojo de Congo: Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10:35 (1962). El amiloide teñido con rojo de Congo se caracteriza por una apariencia dicroica que exhibe un color de polarización amarillo-verde. La unión dicroica es el resultado de la estructura de lámina beta-plegada de las proteínas amiloides: Glenner, G. N. Eng. J. Med. 302: 1283 (1980). Una discusión detallada de la bioquímica e histoquímica del amiloide se puede encontrar en Glenner, N. Eng. J. Med. 302: 1333 (1980). (5) Lesión traumática del sistema nervioso central La incidencia de lesión traumática del cerebro (TBI) en los Estados Unidos se calcula conservativamente que es mayor de 2 millones de personas al año, con aproximadamente 500,000 hospitalizaciones. De éstas, aproximadamente de 70,000 a 90,000 supervivientes de lesión de cabeza quedan discapacitados permanentemente.

Las rutas neurales del sistema nervioso central de un sujeto están en riesgo si las neuronas son sometidas a trauma mecánico o químico o a degeneración neuropática suficiente para poner en riesgo de muerte las neuronas. Hasta la fecha se han identificado una multitud de neuropatías, algunas de las cuales afectan solamente a una subpoblación o un sistema de neuronas en los sistemas nerviosos periferico o central. Las neuropatías, que pueden afectar a las neuronas mismas o las células gliales asociadas, pueden resultar de disfunción metabólica celular, infección, exposición a agentes tóxicos, disfunción autommune, malnutrición o isquemia. Se piensa que en algunos casos la disfunción celular induce directamente la muerte celular. En otros casos, la neuropatía puede inducir suficiente necrosis de tejido para estimular al sistema inmune/inflamatorio del cuerpo, y los mecanismos de la respuesta inmune del cuerpo a la lesión neural inicial destruyen entonces las neuronas y la ruta definida por estas neuronas. b. Sujeto El sujeto puede ser un mamífero, que puede ser un humano. El sujeto puede tener, o estar en riesgo de desarrollar, un trastorno o enfermedad degenerativa de la neurita. El sujeto ya puede estar siendo sometido a tratamiento por un trastorno o enfermedad degenerativa de la neurita. 5. Método de diagnóstico Se provee aquí un método para determinar si un sujeto tiene una enfermedad o trastorno degenerativo de neuritas. El nivel de RGMa asociado a la membrana se puede medir y comparar con el nivel de una RGMa en una muestra de control. La muestra de control puede ser de un tejido normal. Un nivel alterado de RGMa en comparación con el control puede indicar que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno degenerativo de neuritas. Por ejemplo, un aumento del nivel de RGMa, en comparación con un control normal, puede indicar que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno degenerativo de neuritas. El nivel de RGMa se puede medir usando los anticuerpos aquí descritos. a. Muestra La muestra puede ser cualquier muestra de tejido del sujeto. La muestra puede comprender proteína del sujeto. La muestra puede ser suero sanguíneo, plasma o una biopsia de tejido. La muestra se puede usar directamente como se obtiene del sujeto o después de un pretratamiento para modificar una característica de la muestra. El pretratamiento puede incluir extracción, concentración, desactivación de compuestos interferentes, y/o la adición de reactivos.

Para obtener una muestra se puede utilizar cualquier tipo de célula, tejido o fluido corporal. Tales tipos de células, tejidos y fluido pueden incluir secciones de tejidos tales como biopsia y muestras de autopsia, secciones congeladas tomadas para fines histológicos, sangre, plasma, suero, esputo, heces, lágrimas, moco, saliva, pelo y piel. Los tipos de células y tejidos también pueden incluir fluido linfático, fluido de ascitis, fluido ginecológico, orina, fluido peritoneal, fluido cerebroespinal, un fluido recolectado por enjuague vaginal, o un fluido recolectado por irrigación vaginal. Un tejido o tipo de célula se puede proveer separando una muestra de células de un animal, pero también se puede obtener usando células previamente aisladas (p. ej . , aisladas por otra persona, en otro momento, y/o para otra finalidad). También se pueden usar tejidos de archivo, tales como los que tienen historia de tratamiento o resultado. Puede no ser necesaria la purificación de la proteína. b. Detección de RGMa La presencia o cantidad de RGMa presente en una muestra de cuerpo puede ser determinada fácilmente, por ejemplo, por espectrometría de masa, inmunoensayos o inmunohistoquímica (p.ej., con secciones de biopsias de tejido), usando los anticuerpos aquí descritos (monoclonales o policlonales) o fragmentos de los mismos contra RGMa. Los anticuerpos antí-RGMa y fragmentos de los mismos se pueden producir como se describe arriba. Otros métodos de detección incluyen los que se describen por ejemplo en las patentes de E.E. UU. Nos. 6, 143,576; 6, 113,855; 6,019,944; 5,985,579; 5,947, 124; 5,939,272; 5,922,615; 5,885,527; 5,851 ,776; 5,824,799; 5,679,526; 5,525,524 y 5,480,792, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. (1 ) Inmunoensavo La RGMa, y/o péptidos de la misma, se pueden analizar usando un inmunoensayo. La presencia o cantidad de RGMa se puede determinar usando los anticuerpos aquí descritos y detectando la unión específica a RGMa. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo se puede unir específicamente a un polipéptido que comprende el SEQ ID NO: 65, o un fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento del mismo se puede unir específicamente a un polipéptido que comprende el SEQ ID NO: 66, o un fragmento del mismo.

Se puede utilizar cualquier inmunoensayo. El inmunoensayo puede ser un inmunoensayo enlazado a enzima (ELISA), radiommunoensayo (RIA), un ensayo de inhibición competitiva, tal como ensayos de inhibición competitiva directa o inversa, un ensayo de polarización de fluorescencia, o un ensayo de unión competitiva, por ejemplo. El ELISA puede ser un ELISA de sándwich. La unión inmunológica específica del anticuerpo a la RGMa se puede detectar mediante marcas directas, tales como etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales y radionúclidos unidos al anticuerpo, o mediante marcas indirectas, tales como fosfatase alcalina o peroxidasa de rábano.

El uso de los anticuerpos o fragmentos del mismo inmovilizados se puede incorporar en el inmunoensayo. Los anticuerpos se pueden inmovilizar sobre una variedad de soportes, tales como partículas magnéticas o de matriz cromatográfica, la superficie de una placa de ensayo (tales como pocilios de icrotitulación), piezas de un material de substrato sólido, y similares. Se puede preparar una tira de ensayo recubriendo el anticuerpo o pluralidad de anticuerpos en un arreglo sobre un soporte sólido. Después, esta tira se puede sumergir en la muestra biológica de prueba y después se puede procesar rápidamente por medio de pasos de lavado y detección para generar una señal mensurable, tal como una mancha de color. (a) ELISA de sándwich El ELISA de sándwich mide la cantidad de antígeno entre dos capas de anticuerpos (es decir, el anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección). La RGMa por medir puede contener por lo menos dos sitios antigénicos capaces de unirse al anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales o policlonales se pueden usar como los anticuerpos de captura y detección en ELISA de sándwich.

Generalmente se utilizan por lo menos dos anticuerpos para separar y cuantificar RGMa o fragmento de RGMa en una muestra de prueba. Más específicamente, los dos anticuerpos se unen a ciertos epítopos de RGMa o fragmento de RGMa formando un complejo inmune que es referido como un “sándwich”. Se pueden usar uno o más anticuerpos para capturar la RGMa o fragmento de RGMa en la muestra de prueba (estos anticuerpos son referidos frecuentemente como un anticuerpo de “captura” o anticuerpos de “captura”), y se usan uno o más anticuerpos para unir una marca detectadle (particularmente cuantificable) al sándwich (estos anticuerpos son referidos frecuentemente como el anticuerpo de “detección” o anticuerpos de “detección”). En un ensayo de sándwich, los dos anticuerpos que se unen a su epítopo pueden no ser disminuidos por la unión de cualquier otro anticuerpo del ensayo a su epítopo respectivo. En otras palabras, los anticuerpos se pueden seleccionar de tal manera que uno o más primeros anticuerpos puestos en contacto con una muestra de prueba sospechosa de contener RGMa o fragmento de RGMa, no se unen a todo o una parte de un epítopo reconocido por los segundos anticuerpos o anticuerpos subsiguientes, interfiriendo así en la capacidad de los segundos anticuerpos de detección para unirse a la RGMa o fragmento de RGMa.

Los anticuerpos se pueden usar como un primer anticuerpo en dicho inmunoensayo. Preferiblemente, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente a epítopos que comprenden por lo menos tres (3) aminoácidos contiguos de SEQ ID NOs: 65, 66 o 74. Además de los anticuerpos de la presente invención, dicho inmunoensayo puede comprender un segundo anticuerpo que se une específicamente a epítopos que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres (3) aminoácidos contiguos de SEQ ID NOs: 65, 66 o 74, en donde los tres (3) aminoácidos contiguos a los que se une el segundo anticuerpo son diferentes de los tres (3) aminoácidos contiguos a los que se une el primer anticuerpo.

En una modalidad preferida, una muestra de prueba sospechosa de contener RGMa o un fragmento de RGMa se puede poner en contacto con al menos un primer anticuerpo (o anticuerpos) de captura, y por lo menos un segundo anticuerpo de detección, ya sea simultáneamente o secuencialmente. En el formato de ensayo de sándwich, una muestra de prueba sospechosa de contener RGMa o un fragmento de RGMa primero se pone en contacto con el primer anticuerpo de captura que se une específicamente a un epítopo particular bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de primer anticuerpo-RGMa. Si se usa más de un anticuerpo de captura, se forma un complejo de primer anticuerpo de captura múltiple-RGMa. En un ensayo de sándwich, los anticuerpos, preferiblemente, el anticuerpo de captura, se usan en cantidades en exceso molar de la cantidad máxima esperada de RGMa o fragmento de RGMa en la muestra de prueba. Por ejemplo, se pueden usar de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 1 mg/ml_ de anticuerpo por mL de amortiguador de recubrimiento de micropartícula.

Opcionalmente, antes de poner en contacto la muestra de prueba con el primer anticuerpo de captura, el primer anticuerpo de captura se puede unir a un soporte sólido que facilita la separación del complejo de primer anticuerpo-RGMa de la muestra de prueba. Se puede usar cualquier soporte sólido conocido que incluye, sin limitación, soportes sólidos hechos de materiales polimericos en forma de pocilios, tubos o cuentas. El anticuerpo (o anticuerpos) se puede adherir al soporte sólido por adsorción, por unión covalente usando un agente de acoplamiento químico, o por otros medios conocidos, siempre que tal adhesión no interfiera en la capacidad del anticuerpo para unirse a RGMa o el fragmento de RGMa. Además, si es necesario, el soporte sólido se puede modificar para darle reactividad con varios grupos funcionales sobre el anticuerpo. Tal modificación requiere el uso de algunos agentes de acoplamiento, tales como por ejemplo, sin limitación, anhídrido maleico, N-hidroxisuccinimida y 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida.

Después de que la muestra de prueba sospechosa de contener RGMa o fragmento de RGMa se pone en contacto con el primer anticuerpo de captura, la muestra de prueba se incuba para permitir la formación de un complejo de primer anticuerpo de captura (o anticuerpo múltiple)-RMGa. La incubación se puede efectuar a un pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 10.0, a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45°C, y durante un periodo de por lo menos aproximadamente un (1 ) minuto a aproximadamente dieciocho (18) horas, de aproximadamente 2-6 minutos, o de aproximadamente 3-4 minutos.

Después de la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo de captura-RGMa, el complejo se pone entonces en contacto con al menos un segundo anticuerpo de detección (bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de primer/múltiple anticuerpo-RGMa-segundo anticuerpo). Si el complejo de primer anticuerpo-RGMa se pone en contacto con más de un anticuerpo de detección, entonces se forma un complejo de primer/múltiple anticuerpo de captura-RGMa-múltiple anticuerpo de detección. Como con el primer anticuerpo, cuando el segundo anticuerpo (y subsiguientes) se pone en contacto con el complejo de primer anticuerpo-RGMa, se requiere un periodo de incubación bajo condiciones similares a las descritas anteriormente para la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo-RGMa-segundo/múltiple anticuerpo. Preferiblemente, por lo menos un segundo anticuerpo contiene una marca detectable. La marca detectable se puede unir al segundo anticuerpo antes, simultáneamente, o después de la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo-RGMa-segundo/múltiple anticuerpo. Se puede usar cualquier marca detectable conocida. (b) Inhibición competitiva directa En un formato competitivo directo, se usa una alícuota de RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa marcada, de concentración conocida, para competir con RGMa o un fragmento de RGMa en una muestra de prueba por ia unión al anticuerpo de RGMa (tal como un anticuerpo de la presente invención).

En un ensayo de competencia directa, un anticuerpo inmovilizado (tal como un anticuerpo de la presente invención) se puede poner en contacto secuencialmente o simultáneamente con la muestra de prueba y una RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa marcada. El péptido RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa se puede marcar con cualquier marca detectable, que incluye las marcas detectadles anteriormente expuestas con respecto a los anticuerpos anti-RGMa. En este ensayo, el anticuerpo se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Alternativamente, el anticuerpo se puede acoplar con un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-especie, que ha sido inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como una micropartícula.

El péptido RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa marcados, la muestra de prueba y el anticuerpo, se incuban bajo condiciones similares a las descritas anteriormente con respecto al formato del ensayo de sándwich. Entonces se pueden generar dos especies diferentes de complejos anticuerpo-RGMa. Específicamente, uno de los complejos generados de anticuerpo-RGMa contiene una marca detectable, mientras que el otro complejo anticuerpo-RGMa no contiene una marca detectable. El complejo anticuerpo-RGMa puede ser, aunque no necesariamente, separado del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación de la marca detectable. Sin considerar si el complejo anticuerpo-RGMa se separa del resto de la muestra de prueba, se cuantifica entonces la cantidad de marca detectable del complejo anticuerpo-RGMa. La concentración de RGMa o fragmento de RGMa en la muestra de prueba puede ser determinada entonces comparando la cantidad de marca detectable del complejo anticuerpo-RGMa con una curva patrón. La curva patrón se puede generar usando diluciones en serie de RGMa o fragmento de RGMa de concentraciones conocidas, por medio de espectrometría de masa, gravimetría, y otras téenicas conocidas.

El complejo anticuerpo-RGMa se puede separar de la muestra de prueba uniendo el anticuerpo a un soporte sólido, tal como los soportes sólidos anteriormente expuestos con respecto al formato del ensayo de sándwich, y después separando el resto de la muestra de prueba del contacto con el soporte sólido. (c) Ensayo de competencia inversa En un ensayo de competencia inversa, un péptido RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa inmovilizada, se puede poner en contacto secuencial o simultáneamente con una muestra de prueba y por lo menos un anticuerpo marcado. Preferiblemente, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres (3) aminoácidos contiguos de SEQ ID NOs: 65 o 66. El péptido RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa se puede adherir a un soporte sólido, tal como los soportes sólidos expuestos anteriormente con respecto al formato del ensayo de sándwich. El fragmento de péptido RGMa puede tener una secuencia de aminoácidos que contiene los SEQ ID NOs: 65 o 66.

El péptido RGMa, fragmento de péptido RGMa o variante de RGMa inmovilizada, la muestra de prueba y por lo menos un anticuerpo marcado, se incuban bajo condiciones similares a las descritas anteriormente con respecto al formato del ensayo de sándwich. Se generan entonces dos especies diferentes de complejos de RGMa-anticuerpo. Específicamente, uno de los complejos generados de RGMa-anticuerpo es inmovilizado y contiene una marca detectable, mientras que el otro complejo RGMa-anticuerpo no está inmovilizado y contiene una marca detectable. El complejo RGMa-anticuerpo no inmovilizado y el resto de la muestra de prueba son separados de la presencia del complejo RGMa-anticuerpo inmovilizado por medio de las téenicas conocidas, tales como lavado. Una vez que el complejo RGMa-anticuerpo no inmovilizado es separado, se cuantifica entonces la cantidad de marca detectable del complejo RGMa-anticuerpo inmovilizado. La concentración de RGMa o fragmento de RGMa en la muestra de prueba puede determinarse entonces comparando la cantidad de marca detectable del complejo de RGMa con una curva patrón. La curva patrón se puede generar usando diluciones en serie de RGMa o fragmento de RGMa de concentraciones conocidas, por medio de espectrometría de masa, gravimetría, y otras técnicas conocidas. (d) Polarización de fluorescencia En un ensayo de polarización de fluorescencia, un anticuerpo o fragmento funcionalmente activo del mismo se puede poner en contacto en primer lugar con una muestra de prueba no marcada sospechosa de contener RGMa o un fragmento de RGMa, para formar un complejo de RGMa no marcada-anticuerpo. Después, el complejo de RGMa no marcada-anticuerpo se pone en contacto con una RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa marcada fluorescentemente. La RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa marcada compite con cualquier RGMa o fragmento de RGMa no marcada de la muestra de prueba por la unión con el anticuerpo o fragmento funcionalmente activo del mismo. Se determina la cantidad formada de complejo de RGMa marcada-anticuerpo, y la cantidad de RGMa en la muestra de prueba se determina utilizando una curva patrón.

El anticuerpo utilizado en un ensayo de polarización de fluorescencia se une específicamente a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres (3) aminoácidos de SEQ ID NO: 65, o SEQ ID NO: 66, o SEQ ID NO: 74.

El anticuerpo, el péptido RGMa, fragmento de péptido RGMa o variante de RGMa marcado, y la muestra de prueba, y por lo menos un anticuerpo marcado, se pueden incubar bajo condiciones similares a las que se describen arriba con respecto al inmunoensayo de sándwich.

Alternativamente, un anticuerpo o fragmento funcionalmente activo del mismo se puede poner en contacto simultáneamente con una RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa marcada fluorescentemente, y una muestra de prueba no marcada sospechosa de contener RGMa o fragmento de RGMa, para formar tanto complejos de RGMa marcada-anticuerpo como complejos de RGMa no marcada-anticuerpo. Se determina la cantidad formada del complejo de RGMa marcada-anticuerpo, y la cantidad de RGMa en la muestra de prueba se determina utilizando una curva patrón.

Alternativamente, en primer lugar, un anticuerpo o fragmento funcionalmente activo del mismo se pone en contacto con una RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa marcada fluorescentemente, para formar un complejo de RGMa marcada-anticuerpo. El complejo de BNP marcada-anticuerpo se pone en contacto entonces con una muestra de prueba no marcada sospechosa de contener RGMa o un fragmento de RGMa. Cualquier RGMa o fragmento de RGMa no marcada en la muestra de prueba compite con la RGMa, fragmento de RGMa o variante de RGMa marcada por la unión al anticuerpo o fragmento funcionalmente activo del mismo. Se determina la cantidad formada del complejo de RGMa marcada-anticuerpo, y la cantidad de RGMa en la muestra de prueba se determina usando una curva patrón. El anticuerpo usado en este inmunoensayo se une específicamente a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres (3) aminoácidos contiguos de SEQ ID NOs: 65, 66 o 74. (e) Espectrometría de masa Se puede usar el análisis de espectrometría de masa (MS) solo o en combinación con otros metodos. Otros métodos incluyen inmunoensayos y los que se describen arriba para detectar polinucleótidos específicos. El método de espectrometría de masa se puede usar para determinar la presencia y/o cantidad de uno o más biomarcadores. El análisis de MS puede comprender análisis de MS de desorción/ionización de láser asistida por matriz (MALDI) en tiempo de vuelo (TOF), tal como por ejemplo MALDI-TOF dirigida a un punto, o análisis de espectrometría de masa MALDI-TOF con cromatografía de líquidos. En algunas modalidades, el análisis de MS comprende MS de ionización por electroaspersión (ESI), tal como ESI-MS con cromatografía de líquidos (LC). El análisis de masa se puede realizar usando los espectrómetros disponibles comercialmente. Para detectar la presencia y cantidad de péptidos biomarcadores en muestras biológicas se pueden utilizar métodos de análisis de MS que incluyen MS con MALDI-TOF y ESI-MS; para una guía, véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 6,925,389; 6,989, 100; y 6,890,763, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. c. Control Puede ser conveniente incluir una muestra de control. La muestra de control se puede analizar concurrentemente con la muestra del sujeto como se describe arriba. Los resultados obtenidos de la muestra del sujeto se pueden comparar con los resultados obtenidos en la muestra de control. Se pueden proveer curvas patrón con las cuales se pueden comparar los resultados del ensayo de la muestra biológica. Tales curvas patrón presentan los niveles del marcador en función de las unidades del ensayo, esto es, intensidad de la señal fluorescente, si se utiliza una marca fluorescente. Usando muestras tomadas de múltiples donadores se pueden proveer curvas patrón de los niveles de control de la RGMa en tejido normal, así como también de los niveles “de riesgo” de la RGMa en tejido tomado de donadores que pueden tener una o más de las características anteriormente expuestas. 6. Kit Se provee aquí un kit que se puede usar para el tratamiento o diagnóstico de un sujeto. El kit puede comprender el anticuerpo y medios para administrar el anticuerpo. Además, el kit puede comprender instrucciones para usar el kit y realizar el análisis, monitoreo o tratamiento.

El kit también puede comprender uno o más recipientes, tales como viales o botellas, cada recipiente conteniendo un reactivo separado. Además, el kit puede comprender instrucciones escritas que pueden describir la forma de realizar o interpretar un análisis, monitoreo, tratamiento o método descrito en la presente.

La presente invención tiene múltiples aspectos ilustrados por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Producción v aislamiento del anticuerpo monoclonal humano anti RGMa Usando la teenología de presentación de ARNm PROfusion, se seleccionaron colecciones de anticuerpos reunidos de bazo, amígalas, PBMC y nodulo linfático de humano por medio de ocho rondas contra antígenos de RGMa: RGMa humana o de rata marcada con biotina 100 nM. La tecnología PROfusion se describe en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. Nos. 20100099103 y 20100105569, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los fragmentos sc-Fv seleccionados se reformatearon en IgGs completamente humanas. Después de cribado de las IgGs en ELISAs basados en RGMa, se identificaron AE12-1 a AE12-8 como enlazantes positivos de RGMa humana y de rata.

Los anticuerpos AE12-13, AE12-15, AE12-20, AE12-21 , AE12-23 y AE12-24 son anticuerpos anti-RGMa completamente humanos identificados de colecciones grandes de scFv humano intacto de levadura seleccionadas contra RGMa humana utilizando la tecnología estándar de presentación en levadura. Se hicieron dos rondas de clasificación de células magnéticamente activadas (MACS) y 4 rondas de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) sobre las colecciones, usando RGMa humana biotinilada 10 nM como el antígeno de selección. Para la última ronda de clasificación, las células también se seleccionaron negativamente contra un antígeno RGMc-Fc de humano. Los fragmentos sc-Fv seleccionados se reformatearon en IgGs completamente humanas. Después del cribado en IgGs en ELISA de RGMa humana, se identificaron AE12-13, -15, -20, -21 , -23 y -24 como enlazantes positivos de RGMa humana. AE12-13, AE12-15 y AE 12-23 también reaccionaron cruzadamente con RGMc humana, según una evaluación por medio de ELISA.

Ejemplo 2 Caracterización del anticuerpo Los 8 mAbs de PROfusion (AE12-1 , AE12-2, AE12-3, AE12-4, AE12-5, AE12-6, AE12-7 y AE12-8), se analizaron por medio de ELISAS de unión directa para examinar la unión con RGMa humana (hRGMa) y RGMa de rata y reactividad cruzada con hRGMc. Se utilizó ELISA de competencia de hRGMa para probar si alguno de estos mAbs competiría con h5F9.23 por la unión a hRGMa. El h5F9.23 es un mAb guía anti-RGMa humanizado derivado de un hibridoma de rata, y se sabe que se une al dominio N-terminal de RGMa. El H5F9.23 tiene las siguientes secuencias: Se utilizó ELISA de competencia de neogenina o BMP-2/BMP-4 para determinar si estos mAbs bloquearían la unión de hRGMa a su receptor neogenina o BMP-2/BMP-4.

Basándose en los datos de ELISA, los 8 mAbs de PROfusion se enlazaron a RGMa de humano y de rata (tabla 3). Para la unión de RGMc en ELISA, 3 mAbs (AE12-6, -7 y -8) mostraron unión a hRGMc; AE12-4 mostró unión débil a concentraciones altas; y los otros 4 mAbs (AE12-1 , -2, -3 y -5) no mostraron unión a hRGMc a concentraciones de hasta 100 nM. En el ELISA de competencia de hRGMa, AE12-1 , AE12-3 y AE12-6 fueron capaces de competir con h5F9.23 para unirse a hRGMa, sugiriendo que los epítopos de unión de estos 3 mAbs son cercanos o se traslapan con el epítopo de h5F9.23. El ensayo de dot blotting con fragmentos de hRGMa mostró que AE12-1 y AE12-6 se unen al fragmento N-terminal, AE12-2 y AE12-4 se unen al fragmento C terminal, y los otros 4 Abs no muestran ninguna señal de unión detectable. Para bloquear la unión de hRGMa a la neogenina en el ELISA de competencia, sólo AE12-5 y AE12-6 mostraron un bloqueo de actividad comparativo o mejor que h5F9.23; AE12-1 y AE12-4 mostraron inhibición debil; y AE12-2, -3, -7 y -8 no mostraron inhibición a concentraciones de hasta 100 nM. En el ELISA de competencia de BMP-2/BMP-4, solamente AE12-1 , AE12-4 y AE12-6 bloquearon la unión de hRGMa a BMP-2/BMP-4.

Los mAbs de PROfusion se analizaron adicionalmente en ensayos de unión basados en célula para determinar su capacidad para bloquear la unión de hRGMa a las células neuronales. En un ensayo de unión de célula basado en MSD en donde las células se incubaron con hRGMa-Fc biotinilado a temperatura ambiente, y la unión de hRGMa se detectó por medio de estreptavidina-Sulfo-Tag, solamente AE12-1 y AE12-6 bloquearon la unión de hRGMa a las células neuronales humanas SH-SY5Y, de forma similar a h5F9.23 (tabla 3).

Sin embargo, en un ensayo de cribado de alto contenido (HCS), en donde las células se incubaron con hRGMa-Fc a 37°C, y la unión de hRGMa se detectó por medio del Ab anti-Fc marcado con Cy3 y se calculó por análisis de imagen fluorescente de alto contenido, solamente AE12-6 entre los anticuerpos de PROfusion mostraron una fuerte inhibición sobre la unión de RGMa tanto en células neuronales SH-SY5Y como en neuronas primarias de hipocampo de rata (tabla 3, figura 13). También se muestra en la figura 13 que AE12-15 y AE12-23, los anticuerpos derivados de las colecciones de scFv humano intacto de levadura, inhibieron la unión de hRGMa a las células.

El elemento responsivo a BMP (BRE) se construyó usando oligonucleótidos de traslape basados en la secuencia descrita por Korchynskyi y ten Dijke ( J . Biol. Chem. 2002, 277:4883), y se clonaron en un vector reportero de luciferasa básico pGL4.27 [luc2P/minP/Hygro] (Promega) para generar una construcción reportera de luciferasa de BRE. Los miembros de la familia RGM (RGMa, RGMb y RGMc) son correceptores para la señalización de BMP. Se establecieron ensayos de reportero de BMP tanto de RGMa como de RGMc por cotransfección de células 293HEK con el plásmido reportero BMP y el plásmido de expresión de RGMa o RGMc, y se usaron para cribar mAbs con actividad neutralizante hacia RGMa y RGMc. En el ensayo de reportero de BMP de RGMa, AE12-1 y AE12-6 neutralizaron la actividad de RGMa, consistentemente con los datos del ensayo de unión de célula basado en MSD (tabla 3). En el ensayo de reportero de BMP de RGMc, AE12-6 neutralizó la actividad de RGMc, mientras que AE12-1 no lo hizo. De esta manera, AE12-1 es un mAb neutralizante específico para RGMa.

Los mAbs de PROfusion se probaron adicionalmente para determinar su capacidad para neutralizar RGMa en un ensayo de quimiotaxis con células neuronales SH-SY5Y. En este ensayo, RGMa actúa como una molécula repulsiva para inhibir la quimiotaxis celular. El AE12-1 mostró fuerte actividad neutralizante hacia hRGMa (tabla 3). AE12-4 y AE12-6 mostraron algo de actividad neutralizante.

El AE 12-1 se probó en el ensayo de crecimiento de neurita con células neuronales SH-SY5Y humanas. En este ensayo, la RGMa, ya sea de longitud completa o el fragmento N-terminal, inhibe el crecimiento de la neurita. Consistentemente con su actividad funcional en el ensayo de reportero BMP de RGMa, y el ensayo de quimiotaxis, AE12-1 exhibió fuerte actividad neutralizante hacia hRGMa de longitud completa o el fragmento N-terminal (tabla 3).

El análisis de BIAcore de AE12-1 sobre hRGMc y RGMa de humano, mono cynomolgus (cyno) y rata, demostró que AE12-1 no inhibe hRGMc, pero exhibe buena reactividad cruzada hacia RGMa de humano, cyno y rata, con afinidad comparable; véase la tabla 4.

Tabla 3 Tabla 3 (Continuación) Con respecto a la tabla 3, “aNeg” corresponde a unión negativa con todos los fragmentos probados en dot blotting. “bMSD” corresponde al uso de hRGMa-Fc biotinilada en complejo con estreptavidina-Sulfo-Tag, e incubación con células a temperatura ambiente (t.a.)· “cHCS” corresponde al uso de hRGMa-Fc en complejo con Ab anti-Fc marcado con Cy3, e incubación con las células a 37°C. “dAE12-r corresponde a una unión de RGMa-Fc notablemente incrementada a las células, en contraste con la inhibición de la unión de biotina-RGMa-Fc a las células SH-SY5Y por MSD. “e?” corresponde a datos que no son concluyentes para AE12-7. “fAE12-4” -la concentración de AE12-4 en el ensayo de quimiotaxis se correlaciona inversamente con la actividad neutralizante.

En un ensayo de reportero responsivo a BMP en el cual RGMa o RGMc incrementa la señalización de BMP interaccionando con BMPs, un anticuerpo que comprende los SEQ ID NOs: 1 y 5 (AE12-1 ) bloqueó la actividad de RGMa pero no la actividad de RGMc, de forma consistente con su antagonismo funcional y especificidad de unión por RGMa.

Las figuras 13 y 14 ilustran los efectos neutralizantes de los anticuerpos especificados sobre la unión de RGMa a células neuronales usando un ensayo de unión de célula viva sobre células SH-SY5Y y neuronas primarias de hipocampo de rata. La RGMa etiquetada con Fe y anticuerpos anti-Fc marcados con Cy3 se unen en complejo a 4°C por 60 minutos, seguido por una incubación del complejo con un anticuerpo bloqueador a temperatura ambiente por 10 minutos. Después, el complejo de RGMa-anticuerpo Cy3+ se agrega a las células junto con Hoechsts 33342 durante 30 minutos a 37°C, para permitir la unión sobre las células. Después, las células se lavan dos veces en medio de cultivo y se fijan con PFH. Se realiza imagenología celular con el BD Pathway y las imágenes se analizan con el software Definiens Architect.

Como se mencionó arriba, AE12-6, AE12-15 y AE12-23 bloquearon la unión de RGMa a las células SH-SY5Y y las neuronas primarias; véase la figura 13. En el ensayo de HCS, el AE12-1 no inhibe la unión de RGMa sobre las células SH-SY5Y; véase la figura 14. Las concentraciones más altas de AE12-1 incrementaron la unión de RGMa-Fc a las células, mientras que a las concentraciones más bajas los valores fueron iguales a los valores de unión de RGMa de control. Esto en contraste con la inhibición de la unión de biotina-RGMa-Fc a las células SH-SY5Y por MSD (MSD corresponde al uso de hRGMa-Fc biotinilada en complejo con estreptavidina-Sulfo-Tag, e incubación con las células a temperatura ambiente). La diferencia entre los ensayos de MSD y HCS se puede deber a las diferentes condiciones de los ensayos.

La figura 15 muestra los efectos de neutralización sobre la repulsión de RGMa por r5F9 (control), AE12-1 y AE12-6 en un ensayo de crecimiento de neurita. Se cultivaron 6,500 neuronas primarias de hipocampo de rata por pocilio sobre placas de imagenología de 96 pocilios recubiertos con poli-l-lisina. Las células se trataron por 24 horas con el fragmento de RGMa 47-127 de SEQ ID NO: 65 (SEQ ID NO: 139), en combinación con anticuerpos anti-RGMa. Las células se fijaron y se tiñeron con Blll-tubulina usando el protocolo del kit de crecimiento de neurita de Millipore. Las imágenes se adquirieron con un BD Pathway y se analizaron con Definiens Architect para medir el crecimiento de neurita por neurona.

Ejemplo 3 Variantes de anticuerpo v datos de unión La tabla 4 muestra que sustituyendo el residuo de Cys en VL CDR3 de AE12-1 (SEQ ID NO:8), se pueden generar variantes que tienen afinidad mejorada por hRGMa; véanse los SEQ ID NOs: 67-73. Por ejemplo, véase la tabla 4 en donde el clon de anticuerpo AE12-1 -Y mostró un aumento de afinidad de por lo menos 10 veces por hRGMa, y AE12-1 -F mostró un aumento de 5 veces de la afinidad por hRGMa. Otros mostraron afinidad comparable al AE12-1 progenitor. Todas las variantes bloquearon la unión de hRGMa a las células SH-SY5Y en el ensayo de unión de célula basado en MSD, neutralizaron la actividad de RGMa pero no de RGMc en los ensayos de reportero de BMP, y exhibieron alta estabilidad térmica y buena solubilidad en estudios de preformulación.

Tabla 4 15 Ejemplo 4 Crecimiento de neurita Como se muestra en las figuras 1 , 2 y 15, AE12-1 neutralizó completamente la hRGMa de longitud completa y un fragmento de hRGMa, como se muestra sobre las células SH-SY5Y y las neuronas primarias de hipocampo de rata. Este fragmento de hRGMa corresponde a los aminoácidos 47-127 de SEQ ID NO: 65, como se muestra aquí: PCKI LKCNSEFWSA TSGSHAPASD DTPEFCAALR SYALCTRRTA RTCRGDLAYH SAVHGIEDLM SQHNCSKDGP TSQPRLR (SEQ ID NO: 139).

Además, se hicieron experimentos de crecimiento de neurita para evaluar los efectos de AE12-1 y también las variantes de AE12-1 , en donde el anticuerpo comprende los SEQ ID NOs: 1 y 5, o 2-4 y 6-8, en donde el residuo de Cys de SEQ ID NO:8 es sustituido por otro aminoácido, o en donde el residuo de Cys en la posición 91 de SEQ ID NO:5 es sustituido con otro aminoácido (es decir, AE12-1 -F, AE12-1 -H, AE12-1 -L, AE12-1 -V, AE12-1 -I, AE12-1 -K y AE12-1 -Y). Véanse las figuras 9-12, en donde se muestra la inhibición por el anticuerpo descrito (incubación de 24 horas) sobre el crecimiento de neurita de células SH-SY5Y tratadas con FL-hRGMa.

Ejemplo 5 Estudios in vivo Como se muestra en las figuras 3 y 4, AE12-1 incrementó el crecimiento regenerativo de los axones de células ganglionares retínales de forma perilesional (0-500 mhh) (n = 3-5 ratas/grupo); véase la figura 3. El anticuerpo AE12-1 también incrementó el crecimiento regenerativo de los axones de células ganglionares retínales en áreas más allá de la lesión (500-1000 pm) (n = 3-5 ratas/grupo).

Ejemplo 6 Experimentos de aplastamiento del nervio óptico de rata El AE12-1 fue activo en experimentos de aplastamiento del nervio óptico de rata; véase la figura 8. Se hizo una lesión de aplastamiento unilateral del nervio óptico en ratas Wistar machos, 2-4 mm detrás del ojo. Se dio seguimiento a las ratas durante 6 semanas (8 grupos, n = 6), y los anticuerpos se administraron una vez a la semana por vía intravenosa a 10 mg/kg, 1 mg/kg, o 0.1 mg/kg. La h1 gG1 de control se administró por vía intravenosa una vez a la semana a 10 mg/kg (n = 6 ratas). En las ratas tratadas con AE12-1 , las fibras regenerantes pudieron crecer más allá de la lesión de aplastamiento del nervio óptico, mientras que en las ratas de control tratadas con anticuerpo h I gG 1 , las fibras regenerantes se acumulan en la lesión debido a su incapacidad para superar las lesiones; véase la figura 8.

Ejemplo 7 Mapeo de epítopos de RGMa humana (hRGMa) con el anticuerpo monoclonal AE12-1 Se hicieron estudios de mapeo de epítopos para el anticuerpo monoclonal AE12-1. Los datos sugirieron que el epítopo para AE12-1 está localizado en la región N-terminal de RGMa. Se utilizaron varias construcciones de hRGMa para intentar determinar el epítopo para AE12-1. Estas construcciones incluyeron: pelB-M-[RGMA(47-168)]-6His (“6His” revelado como SEQ ID NO: 148) (E. coli) producida recombinantemente. El antígeno está a 0.41 mg/mL en amortiguador ChemTag#1621 1 , S100, pH8, Tris 25 mM, NaCI 100 mM, DTT 1 mM, 10% (v/v) glicerol. La secuencia de esta primera construcción de antígeno es: MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MAMPC KILKC NSEFW SATSG SHAPA SDDTP EFCAA LRSYA LCTRR TARTO RGDLA YHSAV HGIED LMSQH NCSKD GPTSQ PR LPPAG DSQER SDSPE ICHYE KSFHK HSATP NYTHC GLFGD HHHHHH (SEQ ID NO: 75). [lgk-leader]-AttB1 -[hRGMA(47-422)]-AttB2-MYC-6His (“6His” revelado como SEQ ID NO: 148) producida recombinantemente, 0.85 mg/mL en PBS. La secuencia de esta segunda construcción de antígeno es: METDT LLLWV LLLWV PGSTG DAAQP ARRAR RTKLG TELGS TSPVW WNSAD ITSLY KKAGS PCKIL KCNSE FWSAT SGSHA PASDD TPEFC AALRS YALCT RRTAR TCRGD LAYHS AVHGI EDLMS QHNCS KDGPT SQPRL RTLPP AGDSQ ERSDS PEICH YEKSF HKHSA TPNYT HCGLF GDPHL RTFTD RFQTC KVQGA WPLID NNYLN VQVTN TPVLP GSAAT ATSKL TIIFK FNQEC VDQKV YQAEM DELPA AFVDG SKNGG DKHGA NSLKI TEKVS GQHVE IQAKY IGTTI VVRQV GRYLT FAVRM PEEVV NAVED WDSQG LYLCL RGCPL NQQID FQAFH TNAEG TGARR LAAAS PAPTA PETFP YETAV AKCKE KLPVE DLYYQ ACVFD LLTTG DVNFT LAAYY ALEDV KMLHS NKDKL HLYER TRDLP GNPAF LYKVV ISSTV AAARG GPEQK LISEE DLNSA VDHHH HHH (SEQ ID NO: 76). [lgK-leader]-AttB1 -[hRGMA(47-168)]-Xa-[hlgG L Fc (257-481 )] (construcción de mamífero), producida recombinantemente, 1.18 mg/mL en PBS. La secuencia de esta tercera construcción de antígeno es: METDT LLLWV LLLWV PGSTG DAAQP ARRAR RTKLP CKILK CNSEF WSATS GSHAP ASDDT PEFCA ALRSY ALCTR RTART CRGDL AYHSA VHGIE DLMSQ HNCSK DGPTS QPRLR TLPPA GDSQE RSDSP EICHY EKSFH KHSAT PNYTH CGLFG DLNSA DIEGR MDPPC PAPEL LGGPS VFLFP PKPKD TLMIS RTPEV TCVVV DVSHE DPEVK FNWYV DGVEV HNAKT KPREE QYNST YRVVS VLTVL HQDWL NGKEY KCKVS NKALP APIEK TISKA KGQPR EPQVY TLPPS REEMT KNQVS LTCLV KGFYP SDIAV EWESN GQPEN NYKTT PPVLD SDGSF FLYSK LTVDK SRWQQ GNVFS CSVMH EALHN HYTQK SLSLS PGK (SEQ ID NO:77).

Todos los antígenos usados contienen la secuencia de aminoácidos de RGMa (47-168), en donde la numeración usada para identificar posiciones de secuencia corresponde con la numeración de la proteína progenitora. La secuencia de hRGMa (47-168) es: PCKI LKCNS EFWSA TSGSH APASD DTPEF CAALR SYALC TRRTA RTCRG DLAYH SAVHG IEDLM SQHNC SKDGP TSQPR LRTLP PAGDS QERSD SPEIC HYEKS FHKHS ATPNY THCGL FGD (SEQ ID NO:78).

Los amortiguadores usados para cortar los epítopos fueron como sigue: Amortiguador A: NaHCO3 100 mM, NaCI 500 mM, pH 8; Amortiguador B: NaHC03 100 mM, NaCI 100 mM, pH 8; Amortiguador C: NaOAc 100 mM, NaCI 500 mM, pH 4; y Amortiguador D: Tris-HCI 100 mM, NaCI 500 mM, pH 8.

El anticuerpo monoclonal se inmovilizó de la siguiente manera. Se pesaron veinte miligramos de cuentas de Sepharose activadas con CNBr (GE Healthcare, Uppsala Suecia) en una columna de reacción compacta (USB Corp. , Cleveland, OH) con una frita de 35 mm, y se lavó 3 veces con 200 mI de HCI 1 mM, seguido por lavado 3 veces con 200 ml del amortiguador A.

Aproximadamente 5-6 nmol de la solución de mAb AE12-1 se dializaron contra PBS usando una unidad de minidiálisis 10,000 MWCO Slide-A-Lyzer (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 40 minutos para remover el amortiguador de histidina que podría interferir en la unión del anticuerpo a la Sepharose. La solución de mAb dializada se agregó a la resina activada y se dejó mezclando sobre un rotador (Mix-AII Laboratory Tube Mixer, Torrcy Pines Scientific, San Marcos, CA) durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de la unión se recolectó el flujo pasante de la resina y la resina se lavó tres veces con 200 mI del amortiguador A. La resina se suspendió en 200 mI del amortiguador D y se hizo girar a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear el exceso de sitios de unión en la resina. La solución amortiguadora D se separó y la resina se lavó alternativamente con 200 mI de amortiguador C y amortiguador D (lavado de pH bajo/alto), un total de tres veces cada uno. La resina se lavó tres veces con 200 ml de amortiguador B para dejarla lista para el acoplamiento con el antígeno.

El anticuerpo monoclonal AE12-1 inmovilizado se acopló con hRGMa. Se prepararon columnas de reacción compactas (CRC) para el acoplamiento del antígeno lavando tres veces la frita de 35 mm de la CRC con 200 mI del amortiguador B. La resina con el anticuerpo unido se mezcló suavemente para resuspender homogéneamente la resina, y 50 mI de la resina se pusieron en cada CRC preparada. La resina se lavó tres veces con 200 mI de amortiguador B. Se agregaron a la resina aproximadamente 1.5 nmol del antígeno hRGMa con suficiente amortiguador B para hacer un volumen total de por lo menos 200 mI. Antes del acoplamiento del antígeno, el antígeno producido por E. coli se dializó contra amortiguador PBS durante aproximadamente 30 minutos usando una unidad de minidiálisis 3500 MWCO Slide-A-Lyzer para remover DTT del amortiguador del antígeno. La mezcla antígeno/resina se dejó mezclar sobre un rotador durante 4 horas a temperatura ambiente. Se recolectó el flujo pasante (FT), y la resina se lavó tres veces con 200 mI de amortiguador B.

Los epítopos se cortaron usando tripsina y endoproteinasa Asp-N. La resina que contenía el complejo anticuerpo/antígeno inmovilizado se suspendió en 200 mI de amortiguador B. En un vial se disolvieron 20 pg de tripsina (Promega, Madison, Wl) en 100 pl del amortiguador de resuspensión (HOAc 50 mM), para una concentración de 0.2 mg/mI, y en un vial se disolvieron 2 mg de endoproteinasa Asp-N (Roche) en 50 mI de agua (0.04 mg/mI). Los cortes de antígeno se hicieron con proporciones de enzima:antígeno de 1 : 100 (p/p). La reacción procedió por 4-6 horas con rotación a temperatura ambiente.

Después de la digestión, el FT se recolectó y la resina se lavó dos veces con 200 mI de amortiguador B, recolectando cada lavado separadamente (lavado 1 y 2), con 200 mI de amortiguador A (lavado 3) y después 200 mI de amortiguador B (lavado 4). Los péptidos del antígeno que se unieron al anticuerpo se eluyeron de la resina con tres alícuotas de 200 mI de ácido fórmico al 2%, y cada elución se recolectó separadamente (elución 1 , 2 y 3). La fracción de la elución 1 se analizó por espectrometría de masa (LC-MS/MS) para determinar la región del epítopo.

Las fracciones de la elución 1 que se recolectaron después de la digestión se analizaron por LC-ESI-MS/MS (ion positivo) usando una bomba de carga de HPLC capilar Agilent 1100 (Santa Clara, CA) y una bomba de gradiente 1200 nano-HPLC, con un Chip Cube (columna de enriquecimiento de 40 nL, columna analítica de 75 mm x 43 mm, C8 ZORBAX chip) interconectado con un MS QTOF Agilent 6510. Se usaron inyecciones de hasta 7 mI y la MS/MS se realizó sobre los 3 iones superiores que satisfacen los criterios especificados de señal de MS.

El análisis de MS inicial de las fracciones de corte de epítopo (elución 1 ) indicaron la presencia de especies de péptido grandes que no podrían comcidir con los péptidos proteolíticos esperados debido a la probable presencia de péptidos con enlaces disulfuro. Para reducir los enlaces disulfuro, el pH de alícuotas de 10 mI se ajustó a pH ~8 usando NaOH diluido, y se redujeron en ditiotreitol (DTT) 5 mM a 37°C durante 30 minutos antes de reanálisis por MS. Algunas fracciones requirieron desnaturalización para obtener la reducción, en cuyo caso la alícuota se diluyó en un volumen igual de clorhidrato de guanidina 8M, Tris 100 mM (pH 8) antes de la adición de DTT.

El análisis de LC-ESI-MS/MS de todas las fracciones de la elución 1 de la digestión enzimática de mAb AE12-1 acoplada con las diversas construcciones de hRGMa, indicó la presencia de varias especies de peptidos grandes con pesos moleculares en la escala de 8.5-12 kDa. Las masas y fragmentación de las especies grandes no fueron suficientes para identificar los péptidos. Para identificar los péptidos del epítopo fue necesaria la reducción de los enlaces disulfuro. En todos los casos, la intensidad de la señal de MS de los péptidos disminuyó significativamente después de la reducción, en algunos casos siendo indetectable a menos que se redujera en presencia de un desnaturalizante.

Después de la reducción de la fracción de la elución 1 con DTT, las fracciones se volvieron a analizar por LC-MS/MS. En el experimento de corte usando hRGMa producida por E. coli, la mayoría de los picos observados en el cromatograma de iones fueron especies con cargas simples, muchas relacionadas con polímeros u otros aditivos. Se identificaron dos péptidos relacionados con la construcción de hRGMa utilizada; véase la figura 5. El primero fue un péptido con un peso molecular monoisotópico de 2420.2 Da. El peso molecular del péptido y las masas de algunos fragmentos observados en los espectros de MS/MS (no mostrados) son consistentes con la secuencia PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (SEQ ID NO:79), aunque la asignación fue inconsistente con la especificidad de la enzima. El segundo péptido del epítopo potencial con un peso molecular monoisotópico de 2551.2 Da, reveló sólo 2-3 fragmentos identificables por MS/MS que fueron consistentes con la secuencia M PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO:80). La especificidad de la enzima no fue consistente; sin embargo, puesto que el peso molecular del antígeno inicial no comcide con la masa calculada de la secuencia completa, es posible que el antígeno tenga heterogeneidad N-terminal que explicaría la aparente inconsistencia de la especificidad de la enzima.

Usando la segunda construcción de antígeno no se pudieron observar péptidos en el espectro de MS después de reducción con DTT. El análisis de MS después de la reducción bajo condiciones desnaturalizantes revela péptidos entre los iones de fondo con cargas simples. Se identificaron cuatro péptidos del antígeno en la fracción E1 desnaturalizada y reducida. El primer péptido relacionado con el antígeno tiene un peso molecular monoisotópico de 2763.3 Da que, junto con la fragmentación de MS/MS, fue consistente con la secuencia KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO:81 ) (hRGMa 47-69 con 4 residuos N-terminales adicionales). El espectro asociado con este péptido se muestra en la figura 6B. Una señal de péptido de intensidad muy baja en el mismo espectro (MW 2878.4 Da; +4 a m/z 720.84, marcado con un asterisco en la figura 6A) fue consistente con la secuencia KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPPASD (SEQ ID NO:82). Un péptido de MW 2635.2, mostrado en la figura 7B, fue consistente con la secuencia AGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPPAS (SEQ ID NO:9Q). Un péptido adicional a m/z 688.82 (isótopo más abundante, estado de carga +4), marcado con un asterisco en la figura 7A, se eluyó conjuntamente con el péptido de MW 2635.2. Los datos limitados de MS/MS obtenidos en este componente de baja intensidad fueron consistentes con la secuencia AGSPCKILKC SEFWSATSGSHAPPASD (SEQ ID NO:83) (MW 2750.3 Da).

La tercera construcción de hRGMa se usó para intentar confirmar el epítopo con AE12-1. En la fracción de elución 1 que fue reducida con DTT se observó muy poca reducción, pero se pudo identificar un péptido relacionado con el antígeno hRGMa, y es consistente con los resultados de las otras construcciones de antígeno. El péptido se observó a m/z 691.60 (estado de carga +4), dándole un peso molecular monoisotópico de 2762.4 Da. Los datos limitados de MS/MS obtenidos para este péptido (no mostrado) sugieren la secuencia como TKLPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO:84). Otros péptidos que se observaron en el espectro de MS que podrían ser asignados como relacionados con la región hRGMa (47-168) incluyeron DSPEICHYEK (SEQ ID NO:85); GDLAYHSAVHGIE (SEQ ID NO:86); DLAYHSAVHGIE (SEQ ID NO:87); y DDTPEFCAALR (SEQ ID NO:88).

En las fracciones de la elución 1 (digestión con tripsina/Asp-N) del experimento de corte de epítopo de hRGMa unido a AE12-1 , el péptido hRGMa (47-69) fue identificado desde tres construcciones de antígeno. El péptido identificado como el epítopo para hRGMa con AE12-1 es: PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (SEQ ID NO:79).

Ejemplo 8 Estudios de toxicología Como la acumulación de hierro en los hepatocitos y la disminución de hierro en el bazo pueden originarse de la neutralización de RGMc, se estudió la cinética toxicológica y tolerancia de los anticuerpos monoclonales selectivos de RGMa aquí descritos. Se espera que los estudios muestren que la acumulación de hierro en los hepatocitos y el agotamiento del hierro en el bazo no ocurran cuando se administren los anticuerpos monoclonales selectivos de RGMa a ratas Sprague-Dawlcy.

Ejemplo 9 Los anticuerpos monoclonales selectivos de RGMa. AE12-1 v AE12- 1Y. igual que el anticuerpo monoclonal humanizado 5F9. inducen la regeneración de axones de nervio óptico aplastado dañado en un modelo de rata de lesión del nervio óptico El modelo de aplastamiento de nervio óptico (denominado también “lesión del nervio óptico”) provee un modelo de animal para probar varias sustancias que estimulan la regeneración de las fibras nerviosas ópticas y reducen la muerte celular masiva de las células ganglionares retínales.

Los experimentos se efectuaron en ratas Wistar machos adultos obtenidas de Charles River (D) Laboratories (Alemania). Los animales se mantuvieron en jaulas simples en un ciclo de luz/oscuridad de 12: 12 horas, con alimento y agua libremente disponibles. El aplastamiento del nervio óptico siempre se hizo únicamente en el ojo izquierdo por medio de cirugía anterior mínima como describen P. Monnier et al., J. Neurosci., 31 : 10494-10505 (201 1 ), el contenido de la cual se incorpora aquí como referencia, y siguiendo métodos quirúrgicos de la visión anterior de humano. Antes y durante la operación, los animales del procedimiento se anestesian con anestesia inhalable usando Sevoflurane (Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Alemania) y se sujetan en la mesa de operación utilizando mordazas de sujeción y cinta adhesiva para los miembros. Se impide la caída de la temperatura corporal montando los animales sobre una almohadilla de calentamiento. Para la cirugía de aplastamiento anterior del nervio óptico de la rata, el ojo izquierdo se libera cuidadosamente del ligamento y tejido conectivo. Como un primer paso se realiza un corte microquirúrgico (2-3 mm) del tejido adyacente en la esquma externa del ojo. Como siguiente paso, el nervio óptico se expone utilizando un par de fórceps para mover a un lado los músculos del ojo y la glándula lagrimal, salvándolos asi. Como un paso adicional, las meninges se abrieron longitudinalmente utilizando microtijeras para exponer el nervio óptico. Esto resulta en una movilidad más alta del ojo y permite la rotación lateral del ojo y el acceso a su nervio óptico izquierdo. El nervio óptico se lesiona aproximadamente 1 -3 m detrás del ojo, utilizando un par de fórceps puestos para proveer una presión máxima fija durante 10-20 segundos. Se debe tener especial cuidado de no dañar el suministro vascular hacia el ojo.

Después de la cirugía invasiva mínima, los animales se colocan sobre toallas de papel en la jaula limpia colocada en el calentador para controlar la temperatura corporal hasta que empiezan a moverse. Se aplica en el ojo un ungüento que contiene antibiótico (Gentamytrex, Dr. Mann Pharma) para evitar infección bacteriana y desecación de la esclerótica.

Se aplica carprofen (Rimadyl, 5 mg/kg) por vía intraperitoneal para terapia postoperatoria del dolor inmediatamente después de la cirugía y después dos veces al día durante un periodo de 3 días. Los animales se observan y se controlan regularmente durante varias horas inmediatamente después de la cirugía y los siguientes 2-4 días para asegurarse de que todos los animales sobrevivan y se recuperen de la anestesia y cirugía.

La aproximación anteriormente descrita del aplastamiento del nervio óptico anterior modificado tiene ventajas significativas en comparación con el procedimiento estándar de aplastamiento del nervio óptico que se origina desde la parte posterior del ojo. Específicamente, en el procedimiento aquí descrito, no se generan heridas abiertas grandes que requieran sutura y se reduce significativamente el riesgo de infección de las heridas muy pequeñas. Además, como resultado del menor tiempo necesario para el aplastamiento (el método arriba descrito es aproximadamente 3 veces más rápido que el método posterior conocido), los animales sufren menos y de esta manera se estresan menos. Además, se reduce significativamente la cantidad de dolor sufrido por los animales y estos se recuperan mucho más rápidamente.

Administración sistemica de los anticuerpos Para el suministro sistémico de anticuerpo, las ratas Wistar macho se trataron sistémicamente por vía intravenosa (i . v. ) con un anticuerpo 5F9 humanizado (h5F9) bloqueador de RGMa y RGMc (n = 8 animales) (el anticuerpo humanizado 5F9 se describe en la publicación de patente de EE. UU. No. 2010/0028340, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia), con un anticuerpo humano RGMa-selectivo, AE12-1 , aquí descrito, y con un mAb de RGMa estrechamente relacionado, AE12-1 Y, también descrito aquí, y con un anticuerpo de control de isotipo humano (hlgG) (n = 8 animales). Se inyectó a las ratas 10 mg/kg de anticuerpo por vía intravenosa una vez por semana, y las inyecciones se iniciaron inmediatamente después del aplastamiento del nervio óptico. Todas las ratas recibieron 5 inyecciones y los animales se sometieron a eutanasia 6 semanas después de la lesión de aplastamiento. Los experimentos fueron en ciego y el aislamiento de tejido, procesamiento, preparación de secciones y análisis cuantitativo se hicieron como lo describen P. Monnier et al. , J. Neurosci . , 31 : 10494-10505 (201 1 ), y Koeberle et al., Neuroscience, 169:495-504 (2010), el contenido de cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. Se prepararon imágenes compuestas de nervios ópticos de rata, el sitio de aplastamiento se identificó, y se contaron las fibras GAP-43 positivas que se extienden más allá del sitio de aplastamiento por 500 pm. Como se muestra en la figura 16, los tres anticuerpos de RGMa -h5F9, AE12-1 y AE12-1 Y-indujeron crecimiento regenerativo significativo más allá del sitio de aplastamiento, a diferencia de los animales de control tratados con hlgG.

Ejemplo 10 Los anticuerpos monoclonales selectivos de RGMa. AE12-1 v AE12- 1Y. igual que el anticuerpo humanizado 5F9. protegen a la capa de fibra nerviosa retinal de la degeneración Para observar la protección de la degeneración de RNLF, se usó un nuevo método de ensayo de laboratorio. Este método se basa en el explante y análisis de la retina ocular de la rata adulta con aplastamiento del nervio óptico y tratada sistémicamente con el anticuerpo SF9, AE12-1 , AE2-1Y y anticuerpo de control, I g G humana. Este método es una adaptación de los métodos descritos por P. Monnier et al., J. Neurosci., 31 : 10494-10505 (2011 ), y Koeberle et al., Neuroscience , 169:495-504 (2010), P. Monnier et al. , J. Neurosci, 31 : 10494-10505 (201 1 ), y Koeberle et al., Neuroscience, 169:495-504 (2010). A ratas Wistar machos adultos obtenidas de Charles River Laboratories (Alemania) se les inyectó 10 mg/kg de anticuerpo por vía intravenosa una vez por semana, y las inyecciones se iniciaron inmediatamente después del aplastamiento del nervio óptico. Todas las ratas recibieron 5 inyecciones y los animales se sometieron a eutanasia 6 semanas después de la lesión de aplastamiento.

Preparación de la retina v tinción inmunofluorescente Los animales se anestesiaron profundamente con Sevoflurane (8%; Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Alemania), y después se les sacrificó inmediatamente por apertura de la caja torácica y se perfundieron con solución de paraformaldehído (PFA) al 4% a través del ventrículo izquierdo del corazón. Los ojos se disecaron y el tejido conectivo se ajustó, y se colocaron en PFA al 4% hasta la preparación de la retina.

La preparación de la retina se hizo en solución salina balanceada de Hank (HBSS, libre de magnesio y calcio; Invitrogen, #14170070). El ojo se fijó en el tejido conectivo por medio de pinzas y se hizo un corte redondo en la esclerótica justo alrededor de la córnea. La semiesfera de retina se cortó en cuatro porciones, se abrió y se extendió sobre una membrana de nitrocelulosa gris (Sartorius, #13006-50-N). Si es necesario, la membrana, con la retina sobre ella, se deja secar al aire durante 5-10 segundos. Posteriormente, la retina sobre la membrana se colocó en solución amortiguadora neutra de fosfato con formaldehído al 50% (pH 7.3; Fisher Scientific, #F/1520/21 ) a +4°C, hasta realizar la tinción inmunofluorescente. La tinción se hizo de acuerdo con el protocolo que se describe más abajo.

El preparado de la retina se lavó con TBS, seguido por bloqueo y permeabilización por 30 minutos con BSA 5%, Tritón X-100 1 % en TBS, y después se volvió a lavar con TBS. Se agregaron los anticuerpos primarios, particularmente Ab monoclonal TUJ-1 , un Ab anti-b III tubulina de ratón, AbCam, # ab14545; dilución 1 :500 en TBS, BSA 5%, durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad, seguido por lavado con TBS, Tween 20 a 0.1 %. Después se agregó un anticuerpo secundario, particularmente anti-Cy3 de ratón de asno; Jackson ImmunoResearch (Dianova) 715-165-151 , dilución 1 : 1000; y Blsbenzimid (50 mg/mL, dilución 1 : 100 en TBS, BSA 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad, seguido por lavado con TBS, Tween 20 a 0.1 %, y lavado subsiguiente con H2O desalada. Después, el preparado se montó con Fluoromount G y se guardó a +4°C en la oscuridad.

Análisis cuantitativo del efecto protector de los anticuerpos de RGMa sobre la capa de fibra de nervio retinal en el oio (la RNFL) Usando el software Axiovision, se eligieron imágenes seleccionadas aleatoriamente (n = 12) de cada retina y se determinó el número de fibras nerviosas de cada imagen. Para estos experimentos, se usaron 5-8 retinas con nervios ópticos aplastados de cada grupo: el grupo de MAb h5F9, el grupo de MAb de control hlgG, y los grupos de MAb AE12.1 y AE12-1 Y. Se hizo análisis de los datos y análisis estadístico usando el programa GraphPad prism.

Los resultados se ¡lustran en la figura 17. Específicamente, se observa un número de fascículos de fibra nerviosa significativamente más alto en las retinas de los animales tratados sistémicamente con los anticuerpos de RGMa de la presente invención, en comparación con los animales tratados con el anticuerpo de control hlgG.

Los anticuerpos de RGMa aceleran la recuperación funcional en un modelo de encefalomielitis autommune experimental (EAE) espinal focal Kerschensteiner et al. ( Am . J. Pathol. 164: 1455-69, 2004) desarrollaron un modelo de EAE localizado focal en donde las lesiones inflamatorias grandes no son extendidas aleatoriamente en la médula espinal, cerebro y nervio óptico, sino que pueden ser inducidas selectivamente ya sea en la médula espinal o en otras áreas del cerebro. Usando este modelo de EAE focal o dirigida, son inducidas lesiones inflamatorias grandes, muy similares a las lesiones de la médula espinal de MS, en las columnas dorsales de la médula espinal, afectando el aparato corticoespinal. En este modelo, primero las ratas se inmunizan con la proteína de mielina MOG. De dos a tres semanas después de la inmunización se determinan los títulos del anticuerpo MOG y a los animales con una respuesta inmune positiva se les inyecta una mezcla de citocina (TNFa 250 ng, IFNg 150 U) localmente a nivel torácico 8 (T8). Dentro de una semana después de la inyección de citocina, las ratas desarrollan defectos motores de los miembros posteriores, parálisis de la cola y perturbaciones de la marcha que alcanzan una puntuación EAE de 2.5. Cuatro semanas después de la inyección de la citocina, esta puntuación mejoró a una puntuación EAE de 1 (Kerschensteiner et al., Am. J. Pathol. 164: 1455-69, 2004).

A ratas Lewis hembras se les inyectó por vía subcutánea 75 mI de MOG (75 m g , 1 -125 aa, BlueSky Biotech, Worcester, MA) disuelto en solución salina y después emulsionado con 75 mI de adyuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma, #F5506). Justo antes de la inyección, y luego cada 7-8 días, se tomaron muestras de sangre de los animales para análisis para determinar los anticuerpos de MOG.

Dos o tres semanas después de la inmunización con MOG se recolectó sangre de las ratas inmunizadas y se hizo una ELISA para detectar los anticuerpos específicos de MOG. La inmunización resulta en inducción de anticuerpos de MOG en más de 90% de las ratas inmunizadas. En esta raza, sin embargo, la inducción del anticuerpo de MOG no resulta en ningún síntoma de la enfermedad. Las ratas de Lewis sólo desarrollan déficit motores después de la inyección local de 2 citocinas inflamatorias (TNFa, IFNg) en la médula espinal torácica a nivel torácico 8 (T8).

Para la inyección de citocina, las ratas se sometieron a anestesia por inhalación con Sevoflurane (8%, Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Alemania), y se hizo una laminectomía mediante un procedimiento estándar. Específicamente, la piel del dorso de la rata se rasuró y desinfectó con etanol al 70%; después, el área rasurada se limpió con la prodine y se hizo un corte de 2-3 cm con un escalpelo empezando aproximadamente desde T3-4 hasta T11 -12. La grasa superficial se separó de los músculos con tijeras finas y los músculos se cortaron por la línea media a lo largo de la médula desde un costado. Se localizó el espacio entre T8 y T9, y se despejó T8 del tejido adyacente. Se utilizó un microtaladro para hacer un orificio redondo de aproximadamente 1 -2 mm de diámetro en T8, y se usaron fórceps ladeados pequeños para quitar el periostio y cualquier fragmento de hueso. Después se quitó la duramadre con microtijeras y se hizo una inyección estereotáctica con un capilar de vidrio muy delgado conectado a una jeringa de Hamilton de 10 ml con Luer Tip (LT), y se llenó con el aceite mineral (Sigma Aldrich).

Usando un inyector automático, el capilar se llenó con 3 pl de la mezcla de citocinas en PBS o sólo PBS con rastros de azul de Evans. Se usó una dosis cuatro veces (4x) más alta de TNFa (1 ,000 ng) y la misma dosis de IFNy (150 U), como lo reportan Kerschensteiner et al. (2004). La dosis cuatro veces más alta resultó en una extensión significativa del proceso de recuperación en las ratas tratadas con vehículo o control.

En el siguiente paso se insertó un capilar de vidrio a una profundidad de 0.7 mm y se inyectaron 2 mI de la mezcla de citocinas en la mitad de la médula espinal a (T8) durante un periodo de 5 minutos usando un inyector automático. Después de aplicar lidocaína y cerrar la herida, las ratas se trataron con el fármaco analgésico Rimadyl (inmediatamente después de la cirugía y diariamente durante otros 3-4 días). Después, las ratas se colocaron en una jaula limpia sobre toallas de papel y se mantuvieron tibias hasta que se despertaron.

Las ratas desarrollaron los primeros síntomas en el transcurso de una semana después de la inyección de citocina. El tratamiento con anticuerpo empezó el día 7 u 8 después de la aplicación de citocina. Se usó un anticuerpo de control hlgG y varios anticuerpos de RGMa diferentes (particularmente, AE12-1 , AE12-1 Y y 5F9.23 humanizado (h5f9.23, que se describe en la publicación de patente de EE.UU. No. 2010/0028340)), y las ratas se trataron por vía intravenosa una vez a la semana. Se tomó la puntuación EAE diariamente y las puntuaciones se documentaron. Las personas que realizaron los experimentos no conocían los diferentes grupos de tratamiento. Despues de un periodo de 27-29 días posteriores a la administración de la citocina, los animales se sacrificaron, las médulas espinales se aislaron y se analizaron para determinar la expresión de las siguientes proteínas: GAP-43 (marcador de regeneración), CD68 (marcador inflamatorio de células de la microglia activadas y macrófagos) y MPB (proteína básica de mielina, un marcador de remielinización o conductos de mielina preservados). El área de estos marcadores se midió, se analizó y se evaluó estadísticamente usando una ANOVA monofactorial y una prueba de significancia de Bonferroni. Como se muestra en la figura 18, los tres anticuerpos de RGMa aceleraron la recuperación funcional en el modelo de tEAE espinal.

En el modelo de tEAE espinal, todos los anticuerpos de RGMa mostraron regeneración similar -y actividad estimuladora de neuroprotección. Los anticuerpos selectivos de RGMa AE12-1 y AE12-1 Y mostraron actividad similar en comparación con h5F9.23, que neutraliza tanto RGMa como RGMc. La neutralización de RGMc no parece ser necesaria para la eficacia. Por lo tanto, para entender mejor el mecanismo de acción de los tres mAbs de RGMa en este modelo de EAE espinal focal, se evaluaron varios marcadores en secciones seriadas de médulas espinales de ratas tratadas con anticuerpo; AE12-1 Y, AE12-1 y h5F9.23 aumentaron el área de regeneración (GAP-43), el área de remielinización (proteína básica de mielina (MBP)), y disminuyeron el área inflamatoria de CD68 (CD68-positiva) alrededor del sitio de la lesión espinal (véase la figura 19).

El anticuerpo selectivo de RGMa, AE12-1 Y-QL se probó para determinar qué dosis de este anticuerpo son activas en este modelo de tEAE espinal. Específicamente, se administraron sistémicamente a las ratas 4 dosis diferentes de anticuerpo (particularmente 0.01 , 0.1 , 1 , 10 mg/kg), por vía i.v. una vez a la semana. El AE12-1Y-QL mostró actividad significativa a 0.1 , 1 y 10 mg/kg (figura 20). Sin embargo, una dosis de 0.01 mg/kg no mostró eficacia.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa”), caracterizado porque comprende un dominio o región seleccionada del grupo que consiste en: (a) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 1 ; (b) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (c) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; (d) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (e) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (f) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 ; (g) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; (h) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; (i) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; (j) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37; (k) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 ; (I) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; (m) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49; (n) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; (o) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57; (p) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61 ; (q) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; (r) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (s) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99; (t) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; (u) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (v) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 1 1 ; (w) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 115; (x) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 19; (y) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; (z) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0: 127 ; (aa) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 131 ; (bb) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135; (cc) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (dd) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68; (ee) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69; (ff) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70; (gg) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:71 ; (hh) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72; (ii) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (jj) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (kk) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (II) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 ; (mm) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; (nn) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 37 ; (oo) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; (pp) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; (qq) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61 ; (rr) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95; (ss) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:99 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; (tt) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 1 ; (uu) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 19; (vv) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127; (ww) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135; (xx) una cadena pesada variable que comprende una región determinante de complementariedad (CDR)1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (yy) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; (zz) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 1 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (aaa) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (bbb) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; (ccc) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24; (ddd) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; (eee) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32; (fff) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; (ggg) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40; (hhh) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44; (iii) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; (jjj) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56; (kkk) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60; (III) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:62, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:63, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:64; (mmm) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92 o 153, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93 o 154, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:94 o 155; (nnn) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96 o 156, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 o 157, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98 o 158; (ooo) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:100, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (ppp) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; (qqq) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:109, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 10; (rrr) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 12, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 13 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (sss) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 16, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 17, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 118 ; (ttt) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 120 , una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (uuu) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (vvv) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; (www) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134; (xxx) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138; (yyy) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (zzz) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68; (aaaa) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69; (bbbb) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70; (cccc) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO;71 ; (dddd) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 ; (eeee) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (ffff) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ; (gggg) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (hhhh) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 o 153, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 o 154, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 o 155, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 o 156, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 o 157, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98 o 158; (iiii) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0: 100, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106; (jjjj) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:109, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (kkkk) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 117, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (lili) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; (mmmm) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.? 33, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NQ: 136, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:138; (nnnn) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68; (oooo) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69; (pppp) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70; (qqqq) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NQ:71 ; (rrrr) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72; (ssss) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0.4, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (tttt) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 1 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 12 , y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N 0 : 16 ; (uuuu) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 19 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24; (vvvv) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32; (wwww) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40; (xxxx) una cadena pesada de dominio variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44, y una cadena ligera de dominio variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; (yyyy) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51 , y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56; (zzzz) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60, y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:62, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:63, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:64.

2.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv enlazado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, uno de afinidad madura, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo injertado con CDR, un dianticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo específico doble, un DVD, un Fab’, un anticuerpo biespecífico, un F(ab’)2, o un Fv.

3.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 3, caracterizado además porque es humano.

4 - El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo comprende un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de I g G 1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, y un dominio constante de IgA humana.

5.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 4, caracterizado además porque el dominio constante de I gG 1 humana comprende el SEQ ID NO: 140.

6.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 4, caracterizado además porque el dominio constante de I gG 1 humana consiste en el SEQ ID NO: 140.

7.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una región pesada variable que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:91 , SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 1 15, SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 131.

8.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una región ligera variable que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO:95, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 1 11 , SEQ ID NO: 1 19, SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO: 135.

9.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID N0:8, o SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7 y SEQ ID NO:67, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7 y SEQ ID NO:68, o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:69, o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:70, o SEQ ID NO:6, SEQ I D NO:7 y SEQ ID NO:71 , o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:72, o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:73, o SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, o SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40, o SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:56, o SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64, o SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97 y SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO:106, SEQ ID NO: 1 12, SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO:1 14, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO: 129 y SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 y SEQ ID NO: 138, y SEQ ID NO:156, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO:158.

10.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, o SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO:20, o SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, o SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36, o SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52, o SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59 y SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 y SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 y SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 1 10, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, y SEQ ID NO:126, SEQ ID NO.? 32, SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 134, y SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154 y SEQ ID NO: 155.

11.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementaríedad (CDR) de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementaríedad (CDR) de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8.

12.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementaríedad (CDR) de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO:12, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementaríedad (CDR) de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.

13.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la reglón determinante de complementaríedad (CDR) de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO:20, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementaríedad (CDR) de SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24.

14.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID N0.28, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32.

15.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40.

16.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:56.

17.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59 y SEQ ID NO:60, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64.

18.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 y SEQ ID NO:44, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO:48.

19.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 92 o 153, SEQ ID NO: 93 o 154, y SEQ ID NO: 94 o 155, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 96 o 156, SEQ ID NO: 97 o 157, y SEQ ID NO: 98 o 158.

20.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID N0: 100, SEQ ID NO:101 y SEQ ID NO:102, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NQ:104, SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106.

21.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 1 10, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO: 114.

22.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 1 16, SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 118, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:120, SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 122.

23.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO:126, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:128, SEQ ID NO: 129 y SEQ ID NO: 130.

24.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un dominio variable pesado que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 134, y un dominio variable ligero que comprende los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) de SEQ ID NO:136, SEQ ID NO: 137 y SEQ ID NO:138.

25.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un agente seleccionado del grupo que consiste en: una molécula de inmunoadhesión, un agente de imagenología, y un agente terapéutico.

26.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 25, caracterizado además porque el agente de imagenología se selecciona del grupo que consiste en una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética, y biotina.

27.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 26, caracterizado además porque la radiomarca se selecciona del grupo que consiste en 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, 1111n, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho y 153Sm.

28.- Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 , o una mezcla o derivado de los mismos.

29.- Un método de tratamiento, prevención, modulación o atenuación de una enfermedad o trastorno asociado con la degeneración de neuritas, que comprende administrarle a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la reivindicación 1.

30.- El método de la reivindicación 29, en donde el trastorno degenerativo de neuritas se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Gaucher, síndrome de Hurler, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades desmielinizantes inflamatorias idiopáticas, deficiencia de vitamina B12, mielinólisis pontina central, tabes dorsal, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, lesión traumática del SNC, un ataque cerebral isquémico, glaucoma, retinopatía diabética, degeneración macular dependiente de la edad, y una leucodistrofia.

31.- Un método para determinar si un sujeto tiene un trastorno degenerativo de neuritas, que comprende: (a) medir el nivel de RGMa en una muestra del sujeto; y (b) comparar el nivel de RGMa de la muestra con un control normal, en donde un nivel alterado de RGMa indica que el sujeto tiene un trastorno degenerativo de neuritas.

32.- El método de la reivindicación 31 , en donde el aumento del nivel de RGMa en comparación con el control normal indica que el sujeto tiene un trastorno degenerativo de neuritas.

33.- El método de la reivindicación 31 , en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre, una muestra de fluido cerebroespinal, y una muestra de suero.

34.- El método de la reivindicación 31 , en donde el paso (a) es un inmunoensayo.

35.- El método de la reivindicación 34, en donde el inmunoensayo es un ensayo de inmunoadsorbente enlazado a enzimas (ELISA).

36.- El método de la reivindicación 35, en donde el ELISA es un ELISA de sándwich.

37.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 67.

38.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 68.

39.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 69.

40.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 70.

41.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 71.

42.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 72.

43.- El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los SEQ ID NOs: 1 -7 y 73.

44 - El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 37-43, caracterizado además porque se une al epítopo de RGMa PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (SEQ ID NO:79).

45.- Un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa”), caracterizado porque comprende un dominio variable pesado que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5 (fórmula 1 - CDR-H1 ), en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, D, E, N, G y T; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, L, S y Q; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, D, A, T y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y W; y Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, N, H, A, T y Q; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa1 1— Xaa12-Xaa13— Xaa14— Xaa15— Xaa16— (Xaa)n (fórmula 2 - CDR-H2), en donde n es 0 o 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, A, G, L, G, S y N; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y F; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, N, D, F y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, Y, G, W, H, A y S; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, N, D, E, S, K, G y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, D, T y N; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, I, E, N y R; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, L, R, S, T y Y; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, K, G, N, I, y Y; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, G, Y, T y K; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, F, N y H; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, T, V, P, L y S; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D, P y S; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, S, N y L; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, F, V, K y R; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, K, R y S; y Xaa17 es una glicina; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— (Xaa)n(fórmula 3-CDR- H3), en donde n es 0 -1 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, S, E, N, L, D, Q y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, T, R, Y, L, I, D y S; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L, Y, N, E, K, A y F; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, Y, A, V, G, T, E y W; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, S, L, D, G, H y P; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu y Cys; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Lys, Asp, Ala y Gln; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro y Tyr; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His y Phe; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp y Asp; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly y Asp; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Pro y Tyr; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Leu y Phe; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp y Gly; y Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Asp y Tyr.

46.- Un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa”), caracterizado porque comprende un dominio variable ligero que comprende tres regiones determinantes de comple entariedad (CDR) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa1 1— (Xaa)n (fórmula 1 - CDR-L1 ), en donde n es 0-3, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, R, G y Q; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, D, S, N y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, K, G, Q, N y E; Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, L, G, I, D y P; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, N, H e I; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, I, S, G y H; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, K, A, S, I, N, T y D; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Y, A, C, S y F; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, G, L, V y N; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, C, Y, H, R, N y S; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly, Ala y Val; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val y Asn; y Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser e His; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— (Xaa)n(fórmula 2 -CDR-L2), en donde n es 0-4, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Q, G, V, Y, S y E; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, N y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, Y, N y K; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, N, D, Q y T; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, G, S y L; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, I, y E; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, H, I, y T; Xaa8 es Asn; Xaa9 es Lys; Xaa10 es Gly; Xaa1 1 es Asp; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— (Xaa)n (fórmula 3 - CDR-L3), en donde n es 0-2, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, T, Q y V; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, W y S; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, G, S, H y Y; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, N, P, D, V y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, T, S, G, L, F y Y; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, T, L, I, P y S; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, G, R, Y, D, N, W, L, F y P; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, V, G, T y H; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr e His; Xaa1 1 es Leu o Val.

47.- Un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la Molécula Repulsiva Guía a (“RGMa”), caracterizado porque comprende un dominio variable pesado que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-H1 , H2 y H3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5 (fórmula 1 - CDR-H1 ), en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, D, E, N, G y T; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, L, S y Q; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, D, A, T y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y W; y Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, N, H, A, T y Q; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— Xaa12-Xaa13— Xaa14— Xaa15— Xaa16— (Xaa)n (fórmula 2 - CDR-H2), en donde n es 0 o 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, A, G, L, G, S y N; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, M y F; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, N, D, F y Y; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, Y, G, W, H, A y S; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, N, D, E, S, K, G y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, D, T y N; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, I, E, N y R; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, L, R, S, T y Y; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, K, G, N, I, y Y; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, G, Y, T y K; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, F, N y H; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, T, V, P, L y S; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D, P y S; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, S, N y L; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, F, V, K y R; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, K, R y S; y Xaa17 es una glicina; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— (Xaa)n (fórmula 3 CDR-H3), en donde n es 0 -1 1 , y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, S, E, N, L, D, Q y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, T, R, Y, L, I, D y S; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L, Y, N, E, K, A y F; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, Y, A, V, G, T, E y W; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, V, S, L, D, G, H y P; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu y Cys; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Lys, Asp, Ala y Gln; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro y Tyr; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His y Phe; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp y Asp; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly y Asp; Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Pro y Tyr; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, Leu y Phe; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp y Gly; y Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Asp y Tyr; y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo tambien comprende un dominio variable ligero que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR-L1 , L2 y L3) que corresponden a las siguientes fórmulas, respectivamente: Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— Xaa10— Xaa11— (Xaa)n(fórmula 1-CDR-L1), en donde n es0-3,y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, R, G y Q; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, D, S, N y A; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, K, G, Q, N y E; Xaa5 es una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en S, L, G, I, D y P; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, G, N, H e I; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, I, S, G y H; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, K, A, S, I, N, T y D; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Y, A, C, S y F; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, G, L, V y N; Xaa1 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, C, Y, H, R, N y S; Xaa12 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Gly, Ala y Val; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val y Asn; y Xaa14 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser e His; Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— (Xaa)n (fórmula 2 - CDR-L2), en donde n es 0-4, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, Q, G, V, Y, S y E; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, D, N y A; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, S, Y, N y K; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, N, D, Q y T; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, G, S y L; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en P, S, I, y E; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, H, I, y T; Xaa8 es Asn; Xaa9 es Lys; Xaa10 es Gly; Xaa11 es Asp; y Xaa1— Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5— Xaa6— Xaa7— Xaa8— Xaa9— (Xaa)n (fórmula 3 - CDR-L3), en donde n es 0-2, y en donde Xaa1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, y A; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, T, Q y V; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, W y S; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, G, S, H y Y; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, S, N, P, D, V y T; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, T, S, G, L, F y Y; Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, T, L, I, P y S; Xaa8 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en T, G, R, Y, D, N, W, L, F y P; Xaa9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, V, G, T y H; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, Tyr e His; Xaa1 1 es Leu o Val.