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MX2012014043A - Anticuerpos contra el virus sincitial respiratorio (rsv) humano y metodos de uso. - Google Patents

Anticuerpos contra el virus sincitial respiratorio (rsv) humano y metodos de uso.

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MX2012014043A
MX2012014043A MX2012014043A MX2012014043A MX2012014043A MX 2012014043 A MX2012014043 A MX 2012014043A MX 2012014043 A MX2012014043 A MX 2012014043A MX 2012014043 A MX2012014043 A MX 2012014043A MX 2012014043 A MX2012014043 A MX 2012014043A
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MX2012014043A
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Jehangir Wadia
Gabriel Pascual
Elissa Keogh
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Crucell Holland Bv
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Publication date
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Abstract

Se proporcionan en la presente anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos que enlazan inmunoespecíficamente a la proteína de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV). También se proporcionan métodos para la prevención, tratamiento y diagnóstico de infección vírica y/o el tratamiento de uno o más síntomas de enfermedad mediada por RSV. También se proporcionan métodos para generar anticuerpos que enlazan inmunoespecíficamente la proteína F de RSV.

Description

ANTICUERPOS CONTRA EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO (RSV) HUMANO Y MÉTODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan anticuerpos y fragmentos de ' enlace a antigeno de los mismos que se enlazan inmunoespecificamente a la proteina F del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) y/o a RSV y/o neutralizan el RSV. También se proporcionan métodos de diagnóstico y terapéuticos que emplean anticuerpos anti-RSV y fragmentos de enlace a antigeno de los mismos.. Los métodos terapéuticos incluyen administrar los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos para la prevención o tratamiento de una¦ infección por RSV y/o mejoramiento de uno o más síntomas de una infección por RSV, tales como . infecciones en; bebés e infecciones asociadas con el transplante de órganos. Las combinaciones de una pluralidad de diferentes anticuerpos anti-RSV y fragmentos de enlace a antígeno de los mismos proporcionados en este documento y/o con otros anticuerpos anti-RSV y fragmentos de enlace a antígeno de los mismos se pueden usar para terapia de combinación. También se proporcionan composiciones que contienen las mezclas de anticuerpos anti-RSV y fragmentos de enlace a antígeno de los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus sincitial- respiratorio (RSV) es ' la causa principal de enfermedad respiratoria grave en.: bebés y niños jóvenes y la causa principal de bronquiolitis infantil (Welliver (2003) J Pediatr 143:S112). Un estimado de 64 millones de casos de enfermedades respiratorias y 160,000 muertes en el mundo son atribuibles a la enfermedad inducida por RSV. Solo en los Estados Unidos, decenas de miles de hospitalizaciones de bebés son debidas a infecciones por paramixovirus , tales como RSV y virus de parainfluenza (PIV) (Shay y colaboradores (1999) JAMA 282:1440-1446). La infección por RSV grave ocurre más frecuentemente en niños: y bebés, especialmente en bebés prematuros. Los problemas de salud fundamentales tales como enfermedad pulmonar crónica o enfermedad cardiaca congénita pueden incrementar significativamente el riesgo de una enfermedad seria. Las infecciones por RSV también pueden causar enfermedad seria en los ancianos, individuos con enfermedad pulmonar crónica y adultos inmunocomprometidos, tales como los receptores de transplante de médula ósea.
Se han investigado varios procedimientos · para la prevención y tratamiento' de infección por RSV, incluyendo desarrollo de vacunas, compuestos antivirales . (ribaviri'na) , fármacos antisentido, tecnología de interferencia de RNA, y productos de anticuerpo, tales como anticuerpos de inmunoglobulina o monoclonales intravenosos. La inmunoglobulina intravenosa (RSV-IGIV; RespiGamMR) aislada de donadores y un anticuerpo monoclonal, palivizumab (SYNAGISM-) , se han aprobado para la profilaxis de RSV en niños con alto riesgo. Una vacuna o tratamiento comércialmerite disponible para RSV, sin embargo, todavía no está disponible. Solamente la ribavirina está aprobada para el tratamiento de infección por RSV. A fin de ser efectiva, para el tratamiento de infección por RSV, se requieren altas dosis, administraciones frecuentes y/o volúmenes de producto de anticuerpo, tal como RSV-IG y palivizumab, debido a la baja especificidad. Además, el uso de productos, tal como inmunoglobulina intravenosa, es dependiente en la disponibilidad de donantes. Por consiguiente, existe una necésidad por agentes adicionales para la prevención o tratamiento de infecciones por RSV.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan en este documento polipéptidos aislados, anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos para la profilaxis y tratamiento de la infección por virus Sincitial Respiratorio (RSV) y enfermedades o condiciones mediadas por RSV. También se proporcionan en este . documento polipéptidos aislados, anticuerpos o fragmentos de enlace" a antígeno de los mismos para el diagnóstico y/o supervisión de la infección por RSV. Se proporcionan en esté ¦ documento polipéptidos aislados, anticuerpos o fragmentos de enlace . a antigeno de los mismos. que se enlazan inmunoespecificamente a y neutralizan el RSV. En. algunos ejemplos, los polipéptidos proporcionados en este documento se . ¦ enlazan inmunoespecificamente 'a y neutralizan el RSV cuando el polipéptido proporcionado en este documento está contenido en un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno. También se proporcionan en este documento anticuerpos y fragmentos de enlace a antigeno que contienen un polipéptido proporcionado en este documento, donde el anticuerpo o fragmento- de enlace a antigeno se enlaza inmunoespecificamente a,, y neutraliza el RSV. Los polipéptidos, anticuerpos y fragmentos de enlace a antigeno proporcionados en este documento se pueden enlazar específicamente a la proteína F así como también puede neutralizar el RSV. ' Se proporcionan en este documento polipéptidos aislados, anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos que puede neutralizar subtipos A y B de RSV. Se proporcionan en este documento polipéptidos aislados, anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos que se enlazan inmunoespecificamente a la proteína F de RSV.
Se proporcionan en la presente anticuerpos o fragmentos de enlace a antigenos de los .mismos que contienen una VH CDR1 que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 o 482-484 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80 %, 90 %,' 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencias con SEQ ID NOS: . 405, 411, 417, 423,' 429, 437-441, 458, 464, 470 o 482-484 ; una VH CDR2 que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 o 471 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos- o al menos alrededor de 80 %, 90 %, 91 %, 92 %,. 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97; %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencias con SEQ ID NOS: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 o 471; una VH CDR3 que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos establecida- en SEQ ID NOS: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 o 472 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, o al menos alrededor de 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %; 98 %, 99 % o más identidad de secuencias con SEQ ID- NOS: 407, .413, 419, 425, 431, 460, 466 o 472; una VL CDR1 que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos establecida en SEQ. ID NOS: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 o 473 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencias con SEQ ID NOS: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 o 473; una VL CDR2 que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 o 474 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80 ¾, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %.o más identidad de secuencias con SEQ ID NOS: 409, .415, 421, 427, 433, 462, 468 o 474 ; y una VL CDR3 que tiene una secuencia de residuos .de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 o 475 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80 %, 90 %, 91 %, 92 %,. 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencias con SEQ ID NOS: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 o 475, en donde el anticuerpo o. fragmento de enlace a antigenos se' enlaza inmunoespecificamenté a la proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) y/o neutraliza a RSV.
En particular, se proporciona en la presente un anticuerpo que contiene una VHCDR1 establecida en SEQ ID NO: 405 o 437, una VHCDR2 establecida en SEQ ID NO: 406, una VHCDR3 establecida en SEQ ID NO: 407, una VLCDR1 establecida en SEQ ID NO: 408, una VLCDR2 establecida en SEQ ID NO: 09, y una VLCDR3 establecida en SEQ ID NO: 410, o un anticuerpo que contiene CDRs que tiene al menos o alrededor.de 80%, '90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencias con cualquiera de SEQ ID NOS: 405-410 o 437..
También se proporciona en la presente un anticuerpo que contiene una VHCDR1 establecida en SEQ ID NO: 464 o 483, una VHCDR2 establecida en SEQ ID NO: 465, una VHCDR3 establecida en SEQ ID NO: 466, una VLCDR1 establecida en SEQ. ID NO: 467, una VLCDR2 establecida en SEQ ID NO- . 68, y una VLCDR3 establecida en SEQ ID NO: 469, o un anticuerpo que contiene CDRs que tiene al menos o alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencias con cualquiera de SEQ ID NOS: 464-469 o 483.
También se proporciona en la presente un anticuerpo que contiene una VHCDR1 establecida en SEQ ID NO: 411 o 438, una VHCDR2 establecida en SEQ ID NO: 412, una VHCDR3 establecida en SEQ ID NO: 413, una VLCDR1 establecida en SEQ ID NO: 414, una VLCDR2 establecida en SEQ ID NO: 415, y una VLCDR3 establecida en SEQ ID NO: 416, o un anticuerpo' que contiene CDRs que tiene al menos o alrededor de 80%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más .identidad de secuencias con cualquiera de SEQ ID NOS: 411-416 o 438..
También se proporciona en la presente un anticuerpo que contiene una VHCDR1 establecida en SEQ ID NO: 417 p 439, una VHCDR2 establecida en SEQ ID NO: 418, una VHCDR3 establecida en SEQ ID NO: 419, una VLCDR1 establecida en SEQ ID NO: 420, una VLCDR2 establecida en SEQ ID NO: 421, y una VLCDR3 establecida en SEQ ID.NO:422, o un anticuerpo que contiene CDRs que tiene al menos o alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencias con cualquiera de SEQ ID NOS: 417-422 o 439.
También se proporciona en la. presente un anticuerpo que contiene una VHCDR1 establecida en. SEQ ID NO:423 o 440, una VHCDR2 establecida en SEQ ID NO:424, una VHCDR3 establecida en SEQ ID NO:425, una ' VLCDR1 establecida- en SEQ ID NO:426, una VLCDR2 establecida en SEQ ID NO: 427, y una VLCDR3 establecida en SEQ ID NO: 428, o un anticuerpo que contiene CDRs que tiene al menos o alrededor de 80%, 90%, 91%, .92%, 93%, 94%, 95%, 96%,. 97%, 98%, 99% o más identidad de ' secuencias con cualquiera de SEQ ID NOS: 423-428 o 440.
También se proporciona en la presente un anticuerpo que contiene una VHCDR1 establecida en SEQ ID NO: 429 o 441, una VHCDR2 establecida en SEQ ID NO: 4.30, una VHCDR3 establecida en SEQ ID NO:431, una VLCDR1 establecida en SEQ ID NO:432, una VLCDR2 establecida en SEQ ID NO: 433, y una VLCDR3 establecida en SEQ ID NO: 434, o un anticuerpo que contiene CDRs que tiene al menos o alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más / identidad de secuencias con cualquiera de SEQ ID NOS: 429-434 o 441.
También se proporciona en la presente un anticuerpo que contiene una VHCDR1 establecida en SEQ ID NO: 458 o 482, una VHCDR2 establecida en SEQ ID NO: 59, una VHCDR3 establecida en SEQ ID NO: 460, una VLCDR1 establecida en SEQ ID NO: 461, una VLCDR2 establecida en SEQ ID NO: 462, y una VLCDR3 establecida en SEQ ID NO: 463, o un anticuerpo que contiene CDRs que tiene al menos o alrededor de 8.0%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencias con cualquiera de SEQ ID NOS: 458-463 o 482.
También se proporciona en la presente un anticuerpo que contiene una VHCDR1 establecida en . SEQ ID NO: 470 o 484, una VHCDR2 establecida en SEQ ID NO: 471, una VHCDR3 establecida en SEQ ID NO: 472, una VLCDR1 establecida en SEQ ID NO: 473, una VLCDR2 establecida en SEQ ID NO:474, y una VLCDR3 establecida en SEQ ID 'NO: 475, o un anticuerpo que contiene CDRs que tiene al menos o alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencias con cualquiera de SEQ ID NOS: 470-475 o 484.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o¦ fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en- este documento contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 396. En algunos ejemplos, un anticuerpo, aislado o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento contiene un dominio VH, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 396. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento contiene una cadena ligera, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 395. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento contiene un dominio VL, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como aminoácidos 1-110 de SEQ ID NO: 395. En un ejemplo particular, el anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigeno, del mismo es 30D8.
Se¦ proporcionan en este documento anticuerpos anti-RSV aislados o fragmento de enlace a antigeno de los mismos que contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) , donde el anticuerpo o fragmentó de enlace a antigeno se enlaza, inmunoespecifreamente al mismo epitopo en una proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) como un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 396 y una cadena ligera expuesta en SEQ. ID NO: 395.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado' en este documento contiene una región determinante de complementariedad 1 (CDRl) VH, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 405 o 437; una CDR2 VH, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 406; y una CDR3 VH, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 407.· En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado, en este documento contiene una CDRl VL, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 408; una CDR2 VL, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID. O: 09; y una CDR3 VL, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:410.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado- o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento contiene una cadena pesada, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 398. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento contiene un dominio VH, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO:398. En algunos ejemplos, un anticuerpo . aislado o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento contiene una cadena ligera, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 397. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de . enlace a antigeno proporcionado en este documento contiene un dominio VL, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en 1-107 de SEQ ID NO: 397. En un ejemplo particular, el anticuerpo aislado o fragmento de -enlace a antigeno es 104E5.
Se proporcionan en este documento anticuerpos anti-RSV aislados o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos que contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) , donde el anticuerpo o fragmento ' de enlace a antígeno se enlaza inmunoespecificamente al mismo. · epitopo en una proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) como un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID. NO:'398 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 397.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígeno proporcionado en este documento contiene una CDR1 VH, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 411 o 438; una CDR2 VH, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 412; y una CDR3 VH, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 413.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado, en. este documento contiene una CDR1 VL, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 414; una CDR2 VL, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:415; y una CDR3 VL, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 416.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena pesada, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:400. En algunos .ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aquí proporcionado contiene un dominio VH, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-124 de SEQ ID NO: 400. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena ligera, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:399. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aquí proporcionado contiene un dominio VL, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-108 de SEQ ID NO: 399. En un ejemplo particular, el anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo es 38F10.
Se proporcionan aqui anticuerpos aislados anti-RSV o fragmentos de enlace a. antigenos de los mismos que. contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) , donde el anticuerpo o fragmento de. enlace a antígenos se enlaza inmunoespecíficamente al mismo epitopo sobre una proteina de fusión (F) del Virus -Sincitial Respiratorio (RSV) como un anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos que contiene una cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 400 y la cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 399.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una VH CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 17 o 439; una VH CDR2 , que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 418; y una VH CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 419.
En algunos ejemplos, · un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos del mismo aquí proporcionado contiene una VL CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 420; una VL CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 421; y una VL CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 422.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena pesada, que tiene la . secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 402. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aquí proporcionado contiene un dominio VH, el cual . tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 402. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aqui proporcionado contiene una cadena ligera, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 401. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento' de . enlace a antigenos aqui proporcionado contiene un dominio VL,- el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO:401. En un ejemplo particular, el anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo es 14G3.
Se proporcionan aqui anticuerpos aislados anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos que' contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) , donde el anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos se enlaza inmunoespecificamente al mismo epítópo sobre una proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) como un anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos que contiene una cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 402 y una cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 401.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aqui proporcionado contiene una VH CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:423 o 440; una VH CDR2, que' tiene, la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 424; y una VH CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 425.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una VL CDR1, que tiene la secuencia de' aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 426; una VL CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 427; y una VL CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 428.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena pesada, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 404.. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aqui proporcionado contiene un dominio VH, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-123 de SEQ ID NO: 04. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aqui proporcionado contiene una cadena ligera, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 403. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aqui proporcionado contiene un dominio VL, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida, como los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 03. En un ejemplo particular, el anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo es 90D3.
Se proporcionan aquí anticuerpos aislados anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos que contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) , donde el anticuerpo¦ o fragmento de enlace a antigenos se enlaza inmunoespecificamente al mismo epitopo sobre una proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) como un anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos que contiene una cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 404 una cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 403.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aqui proporcionado contiene una VH CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 429 o 441;. una. VH CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: .430; y una VH CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 431.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o . fragmento de enlace a antigenos -del mismo aqui proporcionado contiene una VL CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 432; una VL CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 433; y una VL CDR3, que tiene la secüencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 434.
En algunos ejemplos, un anticuerpo' aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena pesada, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:.452. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos aquí proporcionado contiene un dominio VH, el cual ' tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1— 124 de SEQ ID NO: 452. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena, ligera, que .tiene' la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 53. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos aquí proporcionado contiene un dominio VL, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-111 de SEQ ID NO: 453. En un ejemplo particular, el anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos del mismo es 56E11.
Se proporcionan aquí anticuerpos aislados ahti-RSV o fragmentos de enlace a antígenos de los mismos que contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) , donde el anticuerpo o fragmento de enlacé a antígenos se enlaza inmunoespecíficamente al mismo epítopo sobre una proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) como un anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos que contiene una cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 452 y una cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 453.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una VH CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 458 o 482; una VH CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 459; y una VH CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 460.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una VL CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 461; una VL CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: -462; y una VL CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 463.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o .fragmento de enlace a antigenos del. mismo aquí proporcionado contiene una cadena pesada, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 454. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aqui proporcionado contiene un dominio VH, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-133 de SEQ ID NO: 54. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena ligera, que . tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 55. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aquí proporcionado contiene un dominio VL, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 455. En un ejemplo particular, el anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo es 17C9.
Se proporcionan aquí anticuerpos aislados anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos, que contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) , donde el anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos se enlaza inmunoespecificamente al mismo epitopo sobre una proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) as an anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos que contiene una cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 454 y una cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 455.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o. fragmento de enlace a antigenos del mismo aqui proporcionado contiene una VH CDR1, que tiene la ' secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 464 o 483; una VH CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en.SEQ ID NO: 465; y una VH CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 466.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos del mismo aquí proporcionado contiene una VL CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 467; una VL CDR2 , que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 468; y una VL CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 469.
En algunos ejemplos, un. anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena pesada, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 56. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aquí proporcionado contiene un dominio VH, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-118 de SEQ ID NO: 456. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado contiene una cadena ligera, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 457. En algunos ejemplos, un. anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aqui proporcionado contiene un dominio VL, el cual tiene la secuencia de aminoácidos establecida como los aminoácidos 1-109 de SEQ ID NO:457. En un ejemplo particular, el anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos del mismo es 69F6.
Se proporcionan aquí anticuerpos aislados anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos que contienen una cadena pesada variable (VH) y. una cadena ligera variable (VL) , donde el anticuerpo o fragmento de enlace a . antigenos se enlaza inmunoespecificamente al mismo epitopo sobre una proteína de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) como un anticuerpo o fragmento de enlace a antígenos que contiene una cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 456 y una cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 457.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado- o fragmento de enlace a antígenos del mismo · aquí proporcionado contiene una VH CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 70 o 484; una VH CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 471; y una VH CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 472.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o , fragmento de enlace a antígenos del mismo aquí proporcionado contiene una VL CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 473; una VL CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:. 474; y una VL CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 475.
Se proporcionan aquí anticuerpos aislados anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos que contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) , where the anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos se enlaza inmunoespecificamente al mismo epitopo sobre una proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) como un anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos del mismo que contiene una cadena pesada establecida en SEQ ID NOS: 396, 398, 400, 402, 404, 452, 45 o 456 y una cadena ligera establecida en SEQ ID NOS: 395, 397, 399, 401, 403, 453, 455 o 457.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aquí proporcionado contiene una región determinantes de la complementariedad VH 1 (CDRl) , que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ. ID NOS: 405, 41 1, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 o 482-484. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aquí proporcionado contiene una . VH CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 o 471.. En algunos/ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigenos aquí proporcionado contiene una VH. CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 o 472. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos aquí proporcionado contiene una VL CDR1, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 o 473. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos aquí proporcionado contiene una VL CDR2, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 409, 415,. 421, 427, 433, 462, 468 o 474. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos aquí proporcionado contiene una VL CDR3, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 o 475.
En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o. fragmento de enlace a antígenos del mismo aquí proporcionado contiene una VH CDR1, en donde la secuencia de aminoácidos de la VH CDR1 se establece en SEQ ID NOS: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 o 482-484; una VH CDR2, en donde la secuencia de aminoácidos de la VH CDR2 se establece en SEQ ID NOS: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 o 471; y una VH CDR3, en donde la secuencia de aminoácidos de la VH. CDR3 se establece en SEQ ID NOS: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 o 472. En algunos ejemplos, un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígenos del mismo aquí proporcionado contiene una VL CDR1, en donde la secuencia de aminoácidos de la VL CDR1 se establece en SEQ ID NOS: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 o 473; una VL CDR2, en donde la secuencia de aminoácidos de la VL CDR2 se establece en SEQ ID NOS: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 o 474 ; and a VL CDR3, en donde la secuencia de aminoácidos de la VL CDR3 se establece en SEQ ID NOS: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 o 475.
Se proporcionan en este documento polipéptidos . aislados, anticuerpos o fragmento de enlace a antígenos de ' los mismos que se enlazan inmunoespécificamente a una porción de una proteina F de RSV, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:25.
Se proporcionan en este documento polipéptidos . aislados, anticuerpos o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos que contienen un. dominio de enlace a antigeno que es un anticuerpo humano o humanizado o fragmento de enlace a antigeno del mismo-. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a . antigeno proporcionado en este documento es un anticuerpo quimérico. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno es un Fv de cadena individual (scFv), Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, dsFv, diacuerpo, Fd, o fragmento de Fd' . En algunos ejemplos, el polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento contiene una ligadura de péptido. En algunos ejemplos, el ligadura de péptido contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 aminoácidos..
En algunos ejemplos,- el polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a .antigeno del mismo proporcionado en este documento se conjuga con polietilenglicol (PEG) . En algunos ejemplos, el polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en¦ este documento contiene un agente terapéutico o de diagnóstico. Agentes de diagnóstico ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una enzima, un compuesto fluorescente, un agente de transferencia de electrones y una radioetiqueta .
Se proporcionan en este documento polipéptidos aislados, anticuerpos o fragmento de enlace a . antigenos de los mismos que contienen un dominio de transducción de proteínas. En algunos ejemplos, el dominio de transducción de proteínas se selecciona de entre un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 284-355. En algunos ejemplos, el dominio de transducción. de proteínas es . un dominio de transducción de proteínas HIV-TAT.
Se proporcionan en este documento anticuerpos multivalentes , que contienen una primera porción de enlace a antígeno que contiene un polipéptido, anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento conjugado con un dominio. de multimerización; y una segunda porción dé enlace a . antigeno gue contiene un fragmento de enlace a antigeno de un anticuerpo antiviral conjugado con un segundo dominio de multimerización. En estos ejemplos, el primer dominio de multimerización y el segundo dominio de multimerización son complementarios o los mismos, mediante lo cual la primera porción de enlace a. antigeno y la segunda porción de enlace a antigeno forman un anticuerpo multivalente . En algunos ejemplos, los · anticuerpos multivalentes proporcionados en este documento contienen 1, 2, 3, 4, o 5 porciones de enlace a antigeno adicionales. Anticuerpos multivalentes ejemplares incluyen anticuerpos bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pe tavalentes , hexavalentes , o heptavalentes . Los anticuerpos multivalentes proporcionados en este documento incluyen anticuerpos heterobivalentes u homobivalentes . Los anticuerpos multivalentes proporcionados en este documento incluyen anticuerpos multiespecificos . En algunos ejemplos, el anticuerpo multiespecifico es un anticuerpo biespecifico, triespecifico o tetraespecifico . En algunos ejemplos, los anticuerpos multivalentes proporcionados en este documento contienen un fragmento de enlace- a antigeno que es' un Fv de cadena individual (scFv)., Fab, Fab' , ' F(ab' )2r ' Fv, . dsFy, diacuerpo, Fd, ó fragmento de Fd' . La primera porción de enlace a antígeno y/o la segunda porción de enlace a antígeno de los anticuerpos multivalentes proporcionados en este documento se pueden conjugar a un dominio de multimerización mediante una ligadura covalente o' no covalente . En algunos ejemplos, la porción de enlace a antígeno se conjuga con el dominio de multimerización a través de un ligadura, tal como una ligadura química o. una ligadura de polipéptido. En algunos ejemplos, el dominio de multimerización . del anticuerpo multiválente proporcionado en este documento se selecciona de entre ¦ una región constante, de inmunóglobúlina (Fe), una cremallera de leucina, regiones hidrofóbicas complementarias, regiones hidrofílicas complementarias, o dominios de interacción de proteína-proteína compatibles. En algunos ejemplos, el dominio Fe es un dominio .IgG, IgM o IgE Fe. ' En algunos ejemplos, los anticuerpos multivalentes proporcionados en este . documento contienen- dos o más anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos. En un ejémplo particular, los anticuerpos multivalentes proporcionados en este documento contienen dos o más anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígenos de los mismos.
Se proporcionan en este documento anticuerpos multivalentes, que contienen una primera porción de enlace a antígeno que contiene un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento conjugado con un dominio de multimerización; y una segunda porción de enlace a antígeno que contiene un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno del mismo, seleccionado de entre palivizumab, motavizumab, AFFF, Pl2f2, P12'f4, Plld4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF ( 1 ) , 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13all, Alh5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 o un fragmento de enlace a antígeno de los mismos, conjugados con un segundo dominio de multimerización.
Se proporcionan en este documento · anticuerpos multivalentes , que contienen una primera porción de enlace a antígeno que contiene un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este" documento conjugado con un dominio de multimerización; y una segunda porción de enlace a antígeno que contiene un anticuerpo antiviral que se enlaza inmunoespecíficamente a un antígeno de virus de parainfluenza (PIV) o metaneumovirus humano (hMPV), conjugados con un segundo dominio de multimerización.
Se proporcionan en este documento combinaciones, que contienen un polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento o un anticuerpo multivalente proporcionado en este documento, y un agente antiviral. En algunos ejemplos, el agente ' antiviral es ribavirina. Se proporcionan en este documento combinaciones, un polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento y un agente antiviral formulado como una sola composición o como composiciones separadas.
Se proporcionan en este documento combinaciones, que contienen un polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento o un anticuerpo multivalente proporcionado en este documento, y uno o más anticuerpos antivirales adicionales. En algunos ejemplos, la combinación contiene dos o más anticuerpos anti-RSV diferentes o fragmento de enlace a antigeno de los mismos. En algunos ejemplos, la combinación contiene dos o más anticuerpos anti-RSV diferentes o fragmento de enlace a antígenos seleccionados de entre un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno proporcionado en este documento. En algunos ejemplos, la combinación contiene un anticuerpo ó fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento y un anticuerpo seleccionado de entre palivizumab, motavizumab, AFFF, P12f2,. P12f4, Plld4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, . DG, AFFF ( 1 ) , 6H8, L1-7E5; L2-15B10, A13all, Alh5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 o fragmento de enlace a antígenos de los mismos. En algunos ejemplos, la combinación que contiene un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento y un anticuerpo seleccionado de entre un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que se enlaza inmunoespecificamente a uri antigeno de virus de parainfluenza (PIV) o metaneumovirus humano (hMPV) . En algunos ejemplos, el antigeno PIV es un antigeno de PIV humano tipo 1, PIV humano tipo 2, PIV humano tipo 3, y/o PIV humano tipo 4. En algunos ejemplos, el antigeno PIV se selecciona de entre una fosfoproteina de nucleocápside de PIV, una proteina de fusión (F) de PIV, una fosfoproteina de PIV, una proteina grande' (L) de PIV, una proteina ' de matriz (M) de PIV, una glicoproteina de hemaglutinina-neuraminidasa (HN) de PIV, una RNA-polimerasa dependiente de^ PIV RNA, una proteina PIV Yl, una proteina PIV D, una proteina PIV C, y variantes alélicas de las mismas. En algunos ejemplos, el antigeno hMPV es un antígeno de hMPV tipo A o hMPV tipo B. En algunos ejemplos, el antigeno hMPV es un antigeno de hMPV subtipo Al, hMPV subtipo A2, hMPV subtipo Bl, o hMPV subtipo B2. En algunos ejemplos, el antigeno hMPV se selecciona de entre una nucleoproteina hMPV, una fosfoproteina hMPV, una proteina de matriz hMPV, una proteina hidrofóbica pequeña hMPV, una RNA-polimerasa dependiente de hMPV RNA, ' una proteina hMPV F, una proteina hMPV G y variantes alélicas de las mismas.
Se proporcionan en este documento combinaciones, que contienen un polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento o un anticuerpo multivalente proporcionado en este documento, · y uno o más anticµerpos ant'ivirales adicionales, donde el uno o más anticuerpos antivirales adicionales es un Fv.de cadena individual (scFv) , Fab, Fab' , F(ab' )2 Fv, dsFv, diacuerpo, Fd, o fragmento Fd' .
Se proporcionan en este documento composiciones farmacéuticas que contienen cualquier polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento, cualquier anticuerpo multivalente proporcionado en este documento, o cualquier combinación proporcionada en este documento y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas proporcionadas '. en este documento se formulan como un gel, ungüento, líquido, suspensión, aerosol, tableta, pildora, polvo o rocío nasal. En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se formulan para administración pulmonar, intranasal o parenteral. En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se formulan para la administración de una sola dosificación En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se formulan para liberación sostenida.
Se proporcionan en este documento composiciones farmacéuticas, que contienen · un polipéptido · aislado, anticuerpo o fragmento .de enlace a antígerio del mismo proporcionado en. este documento o un anticuerpo multivalente proporcionado en este documento, y uno o más anticuerpos antivirales adicionales. En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas contienen dos o más anticuerpos anti-RSV diferentes o fragmento de enlace a antigenos de los mismos. En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas contienen dos o más anticuerpos anti-RSV diferentes o fragmento de enlace a antigenos seleccionados de entre un anticuerpo o fragmento de enlace' a antigeno proporcionado en este documento. En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas contienen un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento y un anticuerpo seleccionado de entre palivizumab, motavizumab, AFFF, P12f2, P12f4, Plld4, Ale9, Al2a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, . IX-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF ( 1) , 6H8, L1-7E5,, L.2-15B10, A13all, Alh5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9, . rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 o fragmento de enlace a antigenos de los mismos. En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas contienen un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento y un anticuerpo seleccionado de entre un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que se enlaza inmunoespecificamente a un antigeno del virus de parainfluenza (PIV) ' o metaneumovirus humano (hMPV) . En algunos ejemplos, el antigeno PIV es un antigeno de PIV humano tipo 1, PIV humano tipo 2, PIV humano tipo 3, y/o PIV humano tipo 4. En algunos ejemplos, el antigeno PIV se selecciona de entre una fosfoproteína de la nucleocápside de PIV, una proteina de fusión (F) de PIV, una fosfoproteina de PIV, una proteina grande (L) de PIV, una proteina de matriz (M) de PIV, una glicoproteina de hemaglutinina-neuraminidasa (HN) de PIV, una RNA polimerasa dependiente de RNA de PIV, una proteina Yl de PIV, una proteina D de PIV, una proteina C de PIV y variantes alélicás de. las mismas. En algunos ejemplos, el antigeno hMPV es un antigeno de hMPV tipo A o hMPV tipo B. En algunos ejemplos, el antigeno hMPV, es un antigeno de hMPV subtipo Al, hMPV subtipo A2 , hMPV subtipo Bl, o hMPV subtipo B2. En algunos ejemplos, el antigeno hMPV se selecciona de entre una nucleoproteina de hMPV, una fosfoproteina de hMPV, una proteina de matriz, de hMPV, una proteina hidrofóbica pequeña de hMPV,. una RNA pol'imerasa dependiente de RNA de hMPV, una proteina F de hMPV, una proteina G de hMPV y variantes alélicas de las mismas.
Se proporcionan en este documento composiciones farmacéuticas, que contienen un polipéptido . aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento o un anticuerpo multivalente proporcionado en este documento, y uno o más anticuerpos antivirales adicionales, donde el uno o más anticuerpos antivirales adicionales es un Fv de cadena individual (scFv) , Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, dsFv, diacuerpo, Fd, o un fragmento de Fd' .
Se proporcionan . en este documento composiciones farmacéuticas, que contienen un polipéptido aislado, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento o un anticuerpo multivalente proporcionado en este documento, y un agente antiviral. En algunos ejemplos, el agente antiviral es ribavirina.
Se proporcionan en este documento métodos para tratar una infección viral en un sujeto, que implica administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva, de una composición farmacéutica proporcionada en este documento. Se proporcionan en este documento métodos para tratar o inhibir uno o más síntomas de una infección viral en un sujeto, que implican administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica proporcionada en este documento. También se proporcionan en este documento métodos para prevenir una infección viral en un sujetó, que implican administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición proporcionada en este documento. En un ejemplo particular,' la infección viral es una' infección por RSV. En un ejemplo particular, la infección por RSV es una infección del tracto respiratorio superior.
La administración se puede efectuar mediante cualquier vía adecuada, incluyendo pero no limitada a, tópica, parenteral, local, o sistémicamente, tal como por ejemplo intranasal, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, oralmente, o mediante administración pulmonar. En algunos ejemplos, una composición farmacéutica proporcionada en este documento se administra mediante un nebulizador o un inhalador. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se pueden administrar a cualquier sujeto adecuado, tal como un mamífero, por ejemplo, un humano.
En algunos ejemplos, una composición farmacéutica proporcionada en este documento se administra a un bebé humano, un bebé humano nacido prematuramente o en riesgo de hospitalización por una infección por RSV, un humano anciano, un sujeto humano que tiene fibrosis cística, displasia broncopulmonar, enfermedad cardíaca congénita, inmunodeficiencia congénita, inmunodeficiencia- adquirida, leucemia, o linfoma no de Hodgkin .o un sujeto humano quien, ha tenido un transplante, tal como, por ejemplo, un transplante de médula ósea o un transplante de hígado.
En algunos ejemplos, una composición . farmacéutica proporcionada en este documento se administra una- vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o . cinco veces durante la temporada de RSV (por ejemplo, de Octubre a Mayo). En algunos ejemplos, una composición farmacéutica proporcionada en este documento se administra una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces dentro de un mes, dos meses o tres meses, antes de una temporada, de RSV.
En algunos ejemplos, una composición . farmacéutica proporcionada en este documento se puede administrar con uno o más agentes antivirales. En algunos ejemplos, el agente antiviral es ribavirina. En algunos ejemplos, la composición farmacéutica y el agente 'antiviral se formulan - como- una sola composición o como composiciones separadas. En los métodos proporcionados en este documento, la composición farmacéutica y el agente antiviral se pueden administrar secuencia!, simultánea o intermitentemente.
En algunos ejemplos, . una composición farmacéutica proporcionada en este documento se puede administrar con una terapia hormonal, inmunoterapia o un agente antiinflamatorio. En algunos ejemplos, una composición farmacéutica proporcionada en este documento se puede administrar con uno o más anticuerpos antivirales adicionales o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos.. La composición farmacéutica y el uno o más anticuerpos antivirales adicionales se formulan como una sola composición o como composiciones separadas. La composición farmacéutica y el uno o más anticuerpos anti-RSV adicionales se pueden administrar secuencial, simultánea o intermitentemente. En algunos ejemplos, el fragmento de enlace a antigeno es un Fv de cadena individual (scFv) , Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, dsFv, diacuerpo, Fd, o un fragmento de Fd' .
En algunos ejemplos, una composición farmacéutica proporcionada en este documento se puede administrar con . uno o más anticuerpos antivirales adicionales seleccionados de entre anticuerpos anti-RSV o fragmentos '.de enlace a antigenos de los mismos, tales como, por . ejemplo, . palivizumab, motavizumab, AFFF, Pl2f2, P12f , Plld4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, 3H9, Y10H6, DG, AFFF ( 1 ) , 6H8, L1-7E5, .L2-15B10, A13all, Alh5, A4B4\(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9, rs'v21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos.
En algunos ejemplos, una composición farmacéutica proporcionada en este documento se puede administrar con uno o más anticuerpos antivirales adicionales seleccionados entre un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que se enlaza inmunoespecificamente a un antigeno de virus de parainfluenza (PIV) o metaneumovirus humano (hMPV). En algunos ejemplos, el antigeno PIV es un antigeno de PFV humano tipo 1, PIV humano tipo 2, PIV humano tipo 3, y/o PIV humano tipo 4. En algunos ejemplos, el antigeno PIV se seleccionado de entre una fosfoproteina de la nucleocápside de PIV, una proteina de fusión (F) de PIV, una fosfoproteina de PIV, una proteina grande (L) de PIV, una proteina de matriz (M) de PIV, una glicoproteina de hemaglutinina-neuraminidasa (HN) de PIV, una RNA polimerasa dependiente de RNA de PIV, una proteina Yl de PIV, una proteina D de PIV, una proteina C de PIV, y variantes alélicas de las mismas. En algunos ejemplos, el antigeno hMPV es un antigeno de hMPV tipo A o hMPV tipo B. En algunos ejemplos, el antigerio hMPV es un antigeno de hMPV subtipo Al, hMPV subtipo A2,. hMPV subtipo Bl, o hMPV subtipo B2. .En algunos . ejemplos, el antigeno hMPV se seleccionado de entre una nucleoproteina de hMPV, una fosfoproteina de hMPV, una proteina- de matriz de hMPV, una proteina . hidrofóbica pequeña de hMPV, una . RNA polimerasa dependiente de RNA de ' hMPV, una proteina F de hMPV, una proteina G de hMPV, y variantes alélicas de las mismas.
Se proporcionan en este documento métodos para detectar la infección por RSV, que implican (a) someter a ensayo el nivel del antigeno RSV en un fluido, 'célula, o muestra de tejido usando un anticuerpo o fragmento de enlace a antigenos del mismo proporcionados en este documento; (b) comparar el nivel sometido a ensayo de antigeno RSV con un nivel de control mediante lo .cual un incremento en el nivel sometido a ensayo de antigeno RSV comparado con el nivel de control del antigeno RSV es indicativo de una inspección por RSV. En algunos ejemplos, la muestra de células o tejidos se obtiene de un sujeto humano. En algunos ejemplos, la muestra de células o tejido es una muestra de sangre, orina, saliva, esputo de pulmón, lavado o muestra linfática.
Se proporcionan .en este documento ácidos nucleicos aislados que codifican el polipéptido, anticuerpo o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento. Se proporcionan en este documento vectores que contienen un ácido nucleico que codifica el polipéptido, anticuerpo o fragmentos de enlace a antigeno .del mismo proporcionados en este documento.
Se proporcionan en este documento células aisladas que contienen un anticuerpo o fragmento de enlace á antigeno del mismo proporcionado en este documento, un ácido, nucleico proporcionado en este documento, o un vector proporcionado en este documento. Las células proporcionadas en este documento pueden ser, por ejemplo, células procarióticas o eucarióticas . También ' se proporcionan en este documento animales transgénicos que tienen un ácido ¦ nucleico proporcionado en este documento o un vector proporcionado en este documento. También se proporcionan en este documento métodos para expresar un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antigeno del mismo, que implica cultivar las células aisladas proporcionadas en este documento bajo condiciones que expresan el anticuerpo codificado o mediante aislamiento del anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno . del animal transgénico proporcionado- en este documento. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno se aisla del suero o leche del animal transgénico.
Se proporcionan en este documento kits que contienen un polipéptido, anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento, un anticuerpo multivalente proporcionado en este documento, o una combinación proporcionada en este documento, en uno o más recipientes, e instrucciones para el uso.
También se proporcionan en' este documento usos de un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento para la prevención y/o tratamiento de infección viral en un sujeto. También se proporcionan en este documento usos de un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento para tratar o inhibir uno o más síntomas de una infección viral en un sujeto.
También se proporcionan en este documento usos de un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno proporcionado en este documento para la formulación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de infección viral en un sujeto. También se proporcionan en este documento usos' de un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno proporcionado en este documento para . la formulación de un medicamento para el tratamiento de una infección viral' en un sujeto. También se proporcionan en este documento usos de un anticuerpo o fragmento de enlace a ' antígeno proporcionado ert este documento para la formulación de un medicamento para tratar . o inhibir uno o más síntomas de una infección, viral en un sujeto.
Se proporcionan- en¦ la presente ' anticuerpos neutralizantes anti-RSV o fragmentos de enlace a antígenos de los mismos, en donde RSV no produce un virus que escape a la neutralización por los anticuerpos o fragmentos de' enlace a antigenos de los mismos, después de más de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más rondas de replicación viral en la presencia del anticuerpos o del fragmento de enlace a antigenos del mismo.. También se proporcionan en la presente anticuerpos neutralizadores anti-RSV o fragmentos ed enlace a antigenos de los mismos, en donde RSV no produce un virus que escape a la neutralización por los anticuerpos o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos después de. hasta 20 rondas de replicación viral en la presencia de los anticuerpos o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-RSV o. fragmento de enlace a antigenos del mismo especialmente se enlaza al mismo epitopo como el anticuerpo designado 30D8. En otros ejemplos, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígenos del mismo se designa 30D8. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigenos se enlaza específicamente a la proteína F del RSV. En otros ejemplos, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígenos es un Fab o scFv..
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: La Figura 1 es un modelo en 3D de la proteína F del RSV en su conformación de prefusión. Los residuos de aminoácidos identificados en el Ejemplo 12 al ser importantes para el enlace del anticuerpo 58C5 se indican¦ en modelos rellenados en el espacio, en negro. Cuando los residuos se despliegan en el modelo 3D de la proteina F del RSV de prefusión, se agrupan en un área restringida del pico e ilustran la huella, del anticuerpo del anticuerpo 58C5.
Figura 2: La Figura 2 muestra una estructura de rayos X del modelo en 3D de la región D3 de la proteína F del RSV que contiene los residuos de proteína F del RSV importantes para el. enlace del anticuerpo 58C5 en una conformación de prefusión y postfusión. Como se muestra en la Figura 2, los residuos importantes para el enlace del anticuerpo 58C5 se agrupan solamente en el modelo de prefusión. En el modelo de post-fusión, los residuos se distribuyen sobre un área grande de la superficie de las proteínas. .
Figura 3: La Figura 3 es un modelo en 3D de la proteína F del RSV en su conformación de prefusión. Los residuos de aminoácidos identificados en el Ejemplo 12 como importantes para el enlace del anticuerpo 30D8 se indican en modelo de relleno de espacio en negro. Los residuos se agrupan en el dominio DI en la base de la paleta justo arriba de la región¦ de tallo/pedúnculo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE IA INVENCIÓN Introducción A. DEFINICIONES B. INFORMACIÓN GENERAL 1. Virus Sincitial Respiratorio C. ANTICUERPOS ANTI-RSV 1. Estructura General ' del Anticuerpo y Dominios Funcionales a. Dominios Estructurales y Funcionales de Anticuerpos b. Fragmentos de Anticuerpo 2. Anticuerpos Anti-RSV Ejemplares a. Anticuerpos Derivados i. Anticuerpos de Cadena Individual ii. Anticuerpos Anti-idiotipicos iii. Anticuerpos Multi-especificos y Multimerización de Anticuerpos D. MODIFICACIONES ADICIONALES DE ANTICUERPOS ANTI-RSV 1. Modificaciones para reducir la inmunogenicidad 2. Modificaciones Fe 3. Pegilación 4. Conjugación de una Porción Detectable 5. Conjugación de una Porción Terapéutica 6. Modificaciones para mejorar la especificidad de enlace E. MÉTODOS PARA AISLAR ANTICUERPOS ANTI-RSV F. MÉTODOS PARA PRODUCIR ANTICUERPOS ANTI-RSV, Y FORMAS MODIFICADAS O VARIANTES DE LOS MISMOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN ANTICUERPOS 1. Ácidos Nucleicos 2. Vectores 3. Sistemas de Expresión Celular a. Expresión Procariótica b. Células de levadura c. Células de insectos d. Células de Mamífero e. Plantas 4. Purificación de Anticuerpo.s G. EVALUACIÓN DE LAS. PROPIEDADES Y ACTIVIDADES DEL ANTICUERPO ANTI-RSV 1. Ensayos de Enlace . Modelos animales In vivo para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-RSV H. USOS DE DIAGNÓSTICO 1. Detección in vitro de infección patogénica 2. Detección in vivo de infección patogénica 3. Supervisión de la Infección I. USOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOS 1. Sujetos para, terapia 2. Dosificaciones 3. Vías de administración 4. Terapias de combinación a. Anticuerpos antivirales para terapia de combinación i. Anticuerpos anti-RSV ¦ ii. Anticuerpos contra otros virus respiratorios terapia génica Composiciones farmacéuticas, Combinaciones y Artículos de fabricación/Kits 1. Composiciones farmacéuticas 2. Artículos de fabricación/Kits 3. Combinaciones K. Ejemplos A. DEFINICIONES A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia en la técnica a la cual la invención (es ) pertenece. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias de GenBank, base de datos, sitios en la red y otros materiales publicados referidos por toda la descripción completa en este documento a menos que se observe de otra manera, se incorpora a manera de referencia en. su totalidad. En caso de que exista una pluralidad de definiciones para términos en este documento, prevalecen aquellos' en esta sección. Donde se hace referencia a la ' : URL u otro identificador o dirección, se entiende que estos identificadores pueden cambiar y la información particular en el internet puede venir e ir, pero la información equivalente se puede encontrar al buscar en el internet. Las referencias a lo mismo ponen en evidencia la disponibilidad y diseminación pública de esta información.
Como se usa en este documento, "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas y fragmentos de inmunoglobulina,. ya sea naturales o parcial o completamente sintéticos, ' tal como recombinantemente, producidos, incluyendo cualquier fragmento del mismo que contiene por lo menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que retiene la capacidad de especificidad de enlace de la inmunoglobulina de longitud completa. Por consiguiente, un anticuerpo incluye cualquier proteina que tenga un dominio de enlace que sea homologa u sustancialmente homologa a un dominio de enlace a antigeno de inmunoglobulina (sitio de combinación de anticuerpo) . Los anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos de anticuerpo' anti-RSV. Como se usa en este documento, el término anticuerpo, de esta manera, incluye anticuerpos sintéticos, anticuerpos recombinantemente producidos, anticuerpos multiespecificos, (por ejemplo, anticuerpos biespecificos ) , anticuerpos humanos, anticuerpos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, intracuerpos, y fragmentos de anticuerpo, tal como, pero no se limita a, fragmentos de Fab, fragmentos de Fab', fragmentos de F(ab' )2? fragmentos de Fv, Fvs enlazado a disulfuro (dsFv) , fragmentos de Fd, fragmentos Fd' , Fvs de cadena individual (scFv) , Fabs de cadena individual (scFab), diacuerpos, anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) , o fragmento de enlace a antigenos de cualquiera de lo anterior. Los anticuerpos proporcionados en este documento incluyen miembros de cualquier tipo de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, Ig , IgD, IgE, IgA e IgY) , cualquier clase (por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2) o' subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b)'.
Como se usa en este documento, un "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de enlace a antígeno" de un anticuerpo se refiere a cualquier porción de un anticuerpo de longitud completa que es menor que la longitud pero contiene por lo menos una porción de la región variable. del anticuerpo que se enlaza al antigeno (por ejemplo una o más CDRs y/o uno o más sitios de combinación de anticuerpo) y de esta manera retiene la especificidad de enlace, y por lo menos una porción de la capacidad de enlace especifica del anticuerpo de longitud completa. De esta manera, un fragmento de enlace a antigenos se refiere a un fragmento de anticuerpos que contiene una porción de enlace a antigenos, que se enlaza al mismo antigeno como el anticuerpo - a partir del cual se deriva el fragmento de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpo incluyen derivados de anticuerpo producidos por tratamiento enzimático de anticuerpos de longitud completa, asi como también sintéticamente, por ejemplo, derivados recombinantemente producidos. Un fragmento de anticuerpo se incluye entre los .anticuerpos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se' limitan a, Fab, Fab' , F(ab' )2, Fvs de cadena individual (scFv) , Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y fragmentos de Fd' y otros fragmentos, incluyendo fragmentos modificados (véase, por ejemplo, Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cáncer Therapy Methods and Protocols (2003) ; Capitulo 1; página 3-25, Kipriyanov) . El fragmento puede incluir múltiples cadenas enlazadas conjuntamente, tal como mediante puentes de disulfuro y/o mediante ligaduras de péptido. Un fragmento de anticuerpo contiene en general por lo menos o aproximadamente 50 aminoácidos y típicamente por lo menos o aproximadamente 200 aminoácidos.' Un fragmento de. enlace a antígenos incluye cualquier fragmento de anticuerpos que cuando se inserta dentro de un armazón de anticuerpos (tal como la reemplazar una región correspondiente) resulta en un anticuerpo que enlaza inmunoespecificamente (es decir, muestra una Ka de al menos o' al menos alrededor de 107 - 108 M"1) para el antigeno.
Como se usa en este documento, un "anticuerpo terapéutico" se refiere a cualquier anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que se administra para el tratamiento de un animal, incluyendo un humano. Estos anticuerpos se pueden preparar mediante cualquier método conocido para la producción de polipéptidos , y por consiguiente, incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos recombinantemente producidos, anticuerpos sintéticamente producidos, y anticuerpos terapéuticos extraídos de células o tejidos y otras fuentes. Como se. aisle de. cualquier fuente o como se produzca, los anticuerpos terapéuticos pueden ser heterogéneos en longitud o diferir en la modificación postraduccional, tal como glicosilación (es decir, contenido de carbohidratos). La heterogeneidad de los anticuerpos terapéuticos también puede diferir dependiendo de la fuente de los anticuerpos terapéuticos. Por consiguiente, la referencia a los anticuerpos terapéuticos se refiere a la población heterogénea como es producida o aislada. Cuando se propone una preparación homogénea, será establecida de esta manera. Las referencias a los anticuerpos terapéuticos en este documento, son a sus formas monoméricas, diméricas u otras multiméricas, como sea apropiado. ; Como se usa en este documento, un "anticuerpo neutralizante" es cualquier anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que se enlaza .a un patógeno e interfiere con la capacidad del patógeno a infectar una .célula y/o causar una enfermedad en un sujeto. Ejemplares de anticuerpos neutralizantes son anticuerpos neutralizantes que se enlazan a virus, bacterias, y patógenos fúngicos. Típicamente, los anticuerpos neutralizantes proporcionados en este '· documento se enlazan a la superficie del patógeno. En ejemplos donde el patógeno es un virus, un anticuerpo neutralizante que se enlaza al virus se enlaza típicamente a una proteína en la superficie del virus. Dependiendo de la clase del virus, la proteína de superficie puede ser una proteína de la cápside (por ejemplo una proteína de la cápside de un virus no envuelto) o una proteína de envoltura viral (por ejemplo, una proteína de envoltura viral de un virus envuelto) . En algunos ejemplos, la proteína es una glicoproteína . La capacidad del virus para inhibir la infectividad del virus se puede medir por ejemplo, mediante un ensayo de neutralización in vitro, tal como, por ejemplo, un ensayo de reducción de placas usando células hospederas Vero.
Como se usa en este documento, un "virus envuelto" es un virus de animal que posee una membrana o envoltura . exterior , que es una bicapa de lipidos que contiene proteínas virales, que circundan la cápside del virus. Las . proteínas de envoltura del virus participan en el ensamble . de las partículas infecciosas y también se implican en la entrada del virus al enlazarse a los receptores presentes en la célula hospedera y al inducir la .fusión¦ entre la envoltura viral y una membrana de la célula hospedera. Los virus envueltos pueden ser ya . sea esféricos o filamentosos (en forma de barra) . Virus envueltos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, . miembros de las familias de virus Herpesviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae , Togaviridae , Arenaviridae , Flaviviridae, Ortnomyxoviridae, Paramixovirídae, Buniaviridae, Rabdoviridae, Filoviridae, Coronaviridae, y Bornaviridae . El virus sincitial respiratorio (RSV) es un virus envuelto de RNA de hebra individual de sentido negativo de la familia Paramyxoviridae, subfamilia Pneumoviridae .
Como se usa en este documento, un "virus no envuelto" . o "virus desnudo" es un virus que carece de una envoltura viral. Para la infección de una célula hospedera, un virus no envuelto usa proteínas de la cápside viral para unirse a la célula objetivo. Virus no envueltos ejemplares- incluyen pero no se limitan a, Adenoviridae, Papillomavirinae, Parvoviridae, Polyomaviridae, Circoviridae, Reoviridae, Picornaviridae, Calieiviridae, y familias de virus de Astroviridae .
Como se usa en este documento, una "proteína de superficie" de un patógeno es cualquier proteína que se localiza sobre la superficie externa del patógeno. La proteína de superficie se puede exponer parcial o completamente al medio · ambiente externo (es decir superficie exterior). Ejemplar de proteínas de superficie son . proteínas de membrana, tales como, por ejemplo, una proteína localizada sobre la superficie de una envoltura viral o membrana exterior bacteriana (por ejemplo, una glicoproteína de membrana) . Las proteína de membrana pueden ser proteínas de transmembrana (es decir proteínas que atraviesan la bicapa de lípidos) o proteínas que son proteínas asociadas a la superficie celular no transmembrana (por ejemplo, ancladas o unidas covalentemente a la superficie de la membrana, tal como la unión a otra's proteínas sobre la superficie del patógeno). Otras proteínas de superficie ejemplares incluyen proteínas de la cápside viral de virus envueltos no envueltos que son por lo menos parcialmente expuestos al medio ambiente externo.
Como se usa en este documento, "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos idénticos, significa que cada molécula de anticuerpo individual en una población de anticuerpos monoclonales es idéntica a las otras. Esta propiedad está en contraste con aquella de una población policlonal de anticuerpos, que contiene anticuerpos que tiene una pluralidad de diferentes secuencias. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante una variedad de métodos bien- conocidos (Smith colaboradores (2004) J. Clin. Pathol. 57, 912-917; y Nelson y colaboradores, J Clin Pathol (2000), 53, 111-117). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales^ se pueden producir mediante inmortalización de una célula B, por ejemplo a través de la fusión con una célula de mieloma para generar una linea de células de hibridoma o mediante la infección se células B con virus tal como EBV. También se puede usar tecnología recombinante para producir anticuerpos in vitro de poblaciones clónales de células hospederas al transformar las células hospederas con · plásmidos que llevan secuencias artificiales de nucleotidos que codifican los anticuerpos.
Como se usa en este documento, un "anticuerpo convencional" se refiere a un anticuerpo que contiene dos cadenas pesadas (que se pueden indicar H y H') y dos cadenas ligeras (que se pueden indicar L y L') y los sitios de combinación de anticuerpos, donde cada cadena pesada puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa o cualquier región funcional de la misma que retiene capacidad de enlace a antigenos (por ejemplo cadenas pesadas incluyen, pero no se limitan a, VH, cadenas VH-CH1 y cadenas VH-CH1-CH2-CH3) , y cada cadena ligera puede ser una cadena ligera de longitud completa o cualquier región funcional de (por ejemplo cadenas ligeras incluyen, pero no se limitan a, cadenas VL y cadenas VL-CL) · Cada cadena pesada (H y h") se parea con una cadena ligera (L y 1/ ., respectivamente) .
Como se usa en este documento, un anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas de longitud completa (por ejemplo VH-CH1-Ch2-Ch3 o VH-CH1-CH2-CH3-Ch4) y dos cadenas ligeras de longitud completa (VL-CL) y regiones bisagras, tales como anticuerpos humanos producidos naturalmente por células B secretoras de anticuerpos y anticuerpos con los mismos dominios que se producen sintéticamente.
Como se usa en este documento, un fragmento de anticuerpo Fv se compone de un dominio pesado variable (VH) y un dominio ligero variable (VL) enlazados por interacciones no covalentes.
Como se usa en este documento, un dsFv se. refiere a un Fv con un enlace de disulfuro intermolecular diseñado, que estabiliza el par VH-VLi Como se usa en este documento, un fragmento de Fd es un fragmento de un anticuerpo que contiene un dominio variable (VH) y un dominio de región constante (CH1) de una cadena pesada de anticuerpo.
Como se usa en este documento, un fragmento de · Fab es un fragmento dé anticuerpo que resulta de la digestión de una inmunoglobulina de longitud completa con papaina, o una fragmento que tiene la misma estructura que se produce sintéticamente, por ejemplo mediante métodos recombinantes . Un fragmento de Fab contiene una cadena ligera (que contiene una VL y CL) y otra cadena que contiene un dominio variable de una cadena pesada (VH) y un dominio de región constante de la cadena pesada (CH1) .
Como se usa en este documento, un fragmento de F(ab' ) 2 es un fragmento de anticuerpo que resulta de la digestión de una inmunoglobulina con pepsina en pH 4.0-4.5, o un fragmento que tiene la misma estructura que se produce sintéticamente, por ejemplo mediante métodos recombinantes. El fragmento de F(ab')2 contiene esencialmente dos fragmentos de Fab donde cada porción de cadena pesada contiene pocos aminoácidos adicionales, incluyendo residuos . de cisterna que forman enlaces de disulfuro que unen los dos fragmentos. · Como se usa en este documento, un fragmento dé Fab' es un fragmento que contiene una mitad (una cadena pesada y una cadena ligera) del fragmento de F(ab')2.
Como se usa en este documento,, un fragmento de Fd' es un fragmento de un anticuerpo que contiene una porción de cadena pesada de un fragmento de F(ab' )2- Como se usa en este documento, un fragmento de. Fv' es un fragmento que contiene solamente los dominio de VH y. VL de una molécula de anticuerpo.
Como se usa en este documento, hsFv .se refiere a fragmentos de anticuerpo en los cuales los 'dominios constantes presentes normalmente en un fragmento de Fab se han sustituido con un dominio de súper hélice heterodimérica (véase, por ejemplo, Arndt y colaboradores (2001). J Mol Biol. 7:312:221-228) .
Como se usa en este .documento, un fragmento, de scFv se refiere a un fragmento' de anticuerpo que contiene una cadena ligera variable (VL) y una cadena pesada variable (VH) , conectadas covalentemente por una ligadura de polipéptido en cualquier orden. La ligadura es de una longitud tai que los dos dominios variables se conectan sin interferencia sustancial. Ligaduras ejemplares son residuos de (Gly-Ser)n con algunos residuos de Glu o Lys dispersados completamente para completar la solubilidad.
Como se usa en este documento, el término' "derivado" se refiere a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-RSV o un fragmento del mismo que se ha modificado, por ejemplo,, mediante la introducción de sustituciones de residuo de aminoácido, supresiones o adiciones, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido (por ejemplo, . mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación · por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolitica, enlace a un ligando celular o a otra proteina) . Un derivado de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace antigeno del mismo se puede, modificar por modificaciones químicas usando técnicas conocidas por aquellas personas de experiencia en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, escisión química especifica, acetilación, formilación. Además, un derivado de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace antígeno del- mismo puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Típicamente, un derivado de polipéptido posee una ' función similar o idéntica como un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace antígeno - del mismo proporcionado en este documento (por ejemplo neutralización de RSV) . .
Como se usa en este documento, la frase "derivado de" al referirse a fragmentos de anticuerpo derivados' de otro anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, se refiere a la ingeniería de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab'), F(ab' )2 Fvs de cadena individual (scFv) , Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y. fragmentos de Fd' ) que retienen la especificidad de enlace en el anticuerpo original. Estos fragmentos se pueden derivar por una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, escisión enzimática, reticulación química, medios recombinantes o combinaciones de' los mismos. En general, el fragmento de anticuerpo derivado comparte la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) idéntica o sustancialmente idéntica del anticuerpo precursor, tal que el fragmento de anticuerpo y el anticuerpo precursor se enlazan al. mismo epítopo.
Como se usa en este documento, un "anticuerpo precursor" o "anticuerpo de origen" se refiere al anticuerpo del cual un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fvs de cadena individual (scFv) , Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y fragmentos de Fd' ) se. deriva.
Como se usa en este documento, el término "epítopo" se refiere a cualquier determinante antigénico sobre un antígeno al cual el parátopo de un anticuerpo se enlaza. Determinantes epitópicos contienen típicamente agrupamientos de superficie químicamente activos . de moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcar y tienen típicamente tres características estructurales dimensionales específicas, así como también características de carga específicas.
Como se usa en este documento, un polipéptido quimérico se refiere a un polipéptido que contiene porciones de por lo menos dos polipéptidos diferentes o de dos porciones no contiguas de un solo polipéptido. De esta manera, un polipéptido quimérico incluye en general una' secuencia de residuos de aminoácido de todo o parte de un polipéptido y una secuencia de aminoácidos de todo o parte de otro polipéptido diferente. Las dos porciones- se pueden enlazar directa o indirectamente y se pueden enlazar a través de enlaces de péptido, ' otros enlaces covalentes u otras interacciones no covalentes de resistencia suficiente para mantener la integridad de una porción sustancial del polipéptido quimérico, bajo condiciones de equilibrio y condiciones fisiológicas, tal como en solución- salina amortiguada de pH 7 isotónica. Para propósitos en este documento, los polipéptidos quiméricos incluyen aquellos que contienen todo o parte de un anticuerpo anti-RSV enlazado a otro polipéptido tal como, pdr . ejemplo, un dominio de multimerización, un dominio constante de inmunoglobulina heterólogo o región de estructura, o un polipéptido de diagnóstico o terapéutico.
Como se usa en este documento, una proteína de fusión es un polipéptido diseñado para contener secuencias de aminoácidos que corresponden a dos polipéptidos distintos, que se unen conjuntamente, tal como mediante la expresión de la proteina de fusión de un vector que contiene dos ácidos nucleicos, que codifican los dos polipéptidos, en proximidad cercana, por ejemplo adyacentes, uno al otro a lo largo de la longitud del vector. ¦ En general, una proteina de fusión proporcionada en este documento se refiere a un polipéptido que contiene un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo y un polipéptido o péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o péptido heterólogo, tal como, por ejemplo, un polipéptido de diagnóstico o terapéutico. Por consiguiente, una proteina de fusión se refiere a una proteina quimérica que contiene . dos · porciones de dos o más proteínas o péptidos que se enlazan directa o indirectamente a través de enlaces de péptido.' Las dos moléculas pueden ; estar adyacentes en el constructo o se pueden separar por una ligadura, o polipéptido espaciador. El espaciador puede codificar un polipéptido que altera las propiedades del polipéptido, tal como solubilidad o tráfico intracelular .
Como se usa en este documento, péptido de "ligadura" o "espaciador" se refiere a secuencias cortas de aminoácidos que unen las dos secuencias de polipéptido (o ácido nucleico que codifica esta secuencia de aminoácidos). "Ligadura de péptido" se refiere a la secuencia corta de aminoácidos que une las dos secuencias de polipéptido. Ejemplo de ligaduras de polipéptidos son las ligaduras que unen un dominio de transduccion de péptido a un anticuerpo o ligaduras que unen dos cadenas de anticuerpo en un fragmento de anticuerpo sintético tal como un fragmento de scFv. Las ligaduras son bien conocidas y cualquier ligadura conocida se. puede usar en los métodos proporcionados. Ejemplos de ligaduras de polipéptidos son las secuencias de aminoácidos . (Gly-Ser)n con algunos residuos de Glu o Lys dispersados completamente para incrementar la solubilidad. ' Otras, ligaduras ejemplares se describen en este documento; cualquiera, de estas y otras ligaduras conocidas se pueden usar con las composiciones y métodos proporcionados.
Como se usa en este documento, "región bisagra de anticuerpo" o "región bisagra" se refiere a una región de polipéptido que existe naturalmente en la cadena pesada de los isotipos de anticuerpo gamma, delta y alfa, entre los dominios CHI y CH2 que no tienen homología con los otros dominios de anticuerpo. Esta región es rica en residuos de prolina y proporciona flexibilidad a los anticuerpos IgG, IgD e IgA, permitiéndoles dos "brazos" (que contienen cada uno µ? sitio de combinación de anticuerpos) de la porción Fab para ser móviles, asumiendo varios ángulos con respecto uno al otro conforme se enlacen al antigeno. Esta flexibilidad permite que los brazos Fab se muevan a fin de. alinear los sitios de combinación de anticuerpos para interactuar con los epitopos en las superficies celulares u otros antigenós. Dos enlaces de disulfuro de inter-cadena dentro de la región de bisagra estabilizan la interacción entre las dos cadenas pesadas. En algunas . modalidades proporcionadas en este documento, los fragmentos de anticuerpos sintéticamente producidos contienen una o más regiones bisagras, . por ejemplo, para promover la estabilidad a través de interacciones entre dos cadenas de anticuerpo. Las regiones bisagras son ejemplares de dominios de dimerizacion.
Como se usa en ' este documento, los diacuerpos son scFv; diacuerpos que tienen típicamente ligaduras de péptido más cortas que los scFvs, y se dimerizan de manera preferente.
Como se usan en este documento, anticuerpos humanizados se refieren a anticuerpos que se modifican para incluir secuencias "humanas" de aminoácidos para que la administración a un humano no provoque una respuesta inmunitaria. Un anticuerpo humanizado contiene típicamente regiones determinantes de complementariedad (CDRs) derivadas de una inmunoglobulina de especie no humana y el resto.de la molécula de anticuerpo derivada principalmente de una inmunoglobulina humana. Los métodos para la preparación de estos anticuerpos son conocidos. Por ejemplo, DNA que codifica un anticuerpo, monoclonal se puede alterar mediante técnicas de DNA recombinante para codificar el anticuerpo del cual la composición del aminoácido de las regiones no variables se basa en anticuerpos humanos. Son conocidos métodos para identificar estas regiones, incluyendo programas de computadora, que están diseñados para identificar las regiones variables y no variables de las inmunoglobulinas .
Como se usa en este documento, idiotipo se refiere a un conjunto de uno o más determinantes antigénicos específicos a la región variable de una molécula de inmunoglobulina.
Como se usa en .este documento, un anticuerpo anti-idiotipo se refiere a un anticuerpo dirigido contra la parte especifica de antigeno de la secuencia de un anticuerpo o receptor de células T. En principio un anticuerpo anti-idiotipo inhibe una respuesta inmunitaria especifica.
Como se usa en este documento, un dominio Ig es un dominio, reconocido como · tal por aquellas personas en la técnica, que se distingue por una estructura, llamada el pliegue de Inmunoglobulina (Ig) , que contiene dos láminas plegadas beta, que contiene cada una hebras beta antiparalelas de aminoácidos conectados por rizos. Las dos láminas beta en el pliegue Ig se intercalan conjuntamente por interacciones hidrofóbicas' y un enlace de disulfuro de' intra-cadena conservado. Los dominios de inmunoglobulina individuales dentro de una cadena de anticuerpos .se pueden distinguir además con base en la función. Por ejemplo, una cadena ligera contiene -un dominio de región variable (VL) , y un dominio de región constante (CL) , con una cadena pesada que contiene un dominio de región variable (VH) y tres o cuatro dominios de región constante (CH) . Cada dominio VL, CL, H, y CH es un ejemplo de un dominio de inmunoglobulina.
Como se usa en este documento, un dominio . variable o región variable es un dominio Ig especifico de una cadena pesada o ligera de anticuerpo qué contiene una secuencia de aminoácidos que varia entre diferentes anticuerpos. Cada cadena ligera y cada cadena pesada tienen un dominio de región variable, VL y VH, respectivamente. Los dominios variables proporcionan especificidad de antigeno, de esta manera son responsables por el reconocimiento de antigenos . Cada región variable contiene CDRs que son parte del dominio de sitio de antigeno y regiones estructura (FRs) .
Como se usa en este documento, "dominio de enlace a antigeno", "sitio de enlace a. antigeno", "sitio de combinación de antigenos" y "sitios de combinación de anticuerpos" se usan sinónimamente para referirse ¦ a un dominio dentro de un anticuerpo que reconoce e interactúa físicamente con un antígéno cognado. Una' molécula de anticuerpo de longitud completa convencional nativa .tiene dos sitios de enlace a antígeno convencionales, que contiene cada una porciones de una · región variable de cadena pesada y porciones de una región variable de cadena ligera.. Un sitio de enlace a antígeno convencional contiene los rizos que conectan las hebras beta ánti-paralelas dentro de los dominios de región variable. Los sitios de combinación de antígenos pueden contener otras porciones de los dominios de región variable. Cada sitio de enlace antígeno convencional contiene tres regiones hipervariables de¦ la cadena pesada y tres regiones hipervariables de la cadena ligera. Las regiones hipervariables . también son llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs).' Como se usa en este documento, "región hipervariable" , "HV" "región, determinante de complementariedad" y "CDR" y "CDR de anticuerpos" se usan intercambiablemente para referirse a una pluralidad de porciones dentro de cada región variable que forman conjuntamente un sitio de enlace antígeno de un anticuerpo. Cada dominio de región variable contiene tres CDRs, llamadas CDR1, CDR2 y CDR3. Las tres. CDRs no son contiguas a lo largo de la secuencia de aminoácidos lineal, pero están próximas en el polipéptido plegado. Las CDRs se localizan dentro de los rizos que unen las hebras paralelas de las láminas betas del dominio variable. Como se describe en este documento,, una persona de experiencia en la técnica conoce y puede identificar las CDRs con base en la numeración de Kabat o Chothia (véase, por . ejemplo, Kabat, E.A. y colaboradores (1991) Sequences of Proteins oí Immunological Interest, Quinta Edición, E.U.A. Department of Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242, y .Chothia, C. y colaboradores (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917).
Como se usa en este documento, regiones de estructura (FRs) son los dominios dentro de los dominios de región variable de anticuerpo que se localizan dentro de las láminas beta; las regiones FR son comparativamente más conservadas, en términos de sus secuencias de aminoácidos, que las regiones hipervariables .
Como se usa en este' documento, un dominio "de región constante" es un dominio en una cadena pesada o ligera del anticuerpo que contiene una secuencia de aminoácidos que es comparativamente más conservada que aquella del dominio de región variable. En moléculas de anticuerpo de' .longitud completa convencionales, cada cadena ligera tiene un solo dominio de región constante de cadena ligera (CL) y cada cadena pesada contiene uno o más dominios de región constante de cadena pesada (CH) , que incluye, CH1, CH2, ,CH3 y CH4. Los isotipos de IgA, IgD e IgG de longitud completa contienen CH1, CH2 CH3 y una región de bisagra, mientras que IgE e IgM contienen CH1, CH2 CH3 y CH4. Los dominios CH1 y CL. extienden el brazo Fab de la molécula de anticuerpo, contribuyendo de esta manera a la interacción con el antigeno y la rotación de los brazos del anticuerpo. Las regiones constantes de anticuerpo pueden servir como funciones efectoras, tales como pero no se limitan a, eliminación de antigenos, patógenos y toxinas a los cuales el anticuerpo se enlaza específicamente, por ejemplo, a través de interacciones con varias células, biomoléculas y tejidos.
Como se usa en este documento, una región funcional de un anticuerpo es una porción del anticuerpo qué contiene por lo menos un VH, VL, CH (por ejemplo CH1, CH2 o CH3) , CL o dominio de región bisagra del anticuerpo, o por lo menos una región funcional de los mismos.
Como se usa en' este documento, una región funcional de un dominio VH es por lo menos una porción de dominio VH completo que retiene · por lo menos una porción de la especificidad de enlace del dominio VH completo (por ejemplo al retener una o más CDR del dominio VH completo) , tal que la región funcional del dominio VH, ya sea solo o en combinación con otro dominio de anticuerpo (por ejemplo dominio VL) o región del mismo, se enlaza al antígeno. Regiones funcionales ejemplares de los dominios VH son regiones que contienen la CDRl, CDR2 y/o CDR3 del dominio VH. ¦ Como se usa en este documento, una región funcional de un dominio VL es por lo menos una porción del dominio VL completo que retiene por lo menos una porción de la especificidad de enlacé del dominio VL completo (por ejemplo, al retener una o más CDRs del dominio VL completo) , tal que la región de función del dominio VL, ya sea solo . o en combinación con otro dominio de anticuerpo (por ejemplo dominio VH) o región del mismo, se enlaza al antigeno. Regiones ejemplares del dominio VL son regiones que' contienen las CDRl, CDR2 y/o CDR3 del dominio VL.
Como se usa en este documento "enlazar específicamente" o "enlazar inmunoespecíficamente" con respecto a un anticuerpo o fragmento de enlace antígeno del mismo se usa intercambiablemente en este documento y se refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento de enlace antígeno para formar uno o más enlaces no covalentes con un antígeno cognado, mediante interacciones no covalentes entre el(s) sitio (s) de combinación de anticuerpos del anticuerpo y el antígeno. El antígeno puede ser un antígeno aislado o presentado en un virus. Típicamente, un anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente (o que se · enlaza específicamente) a un antígeno de virus o virus que es uno que se enlaza al antígeno. de virus (o al antígeno én el virus vi o al virus) con una constante de afinidad Ka de aproximadamente o 1 x 107 M"1 o 1 x 108 M_1 o mayor (o una constante de disociación (Kd) de 1· x. 10"7 o 1 x 10"8 M o menor) . Las constantes de afinidad se pueden determinar por metodología cinética estándar para reacciones de anticuerpos, por ejemplo, inmunoensayos, resonancia de plasmones superficiales (SPR) (Rich y Myszka (2000) Curr. Opin . Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599), calorimetría de titulación isotérmica (ITC) u otros ensayos interacción cinética conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Paul, ed.,' Fundamental Immunology, 2nd ed. , Raven Press, New York, páginas 332-336 (1989); también véase la patente de E.U.A No. 7,229,619 para una descripción de métodos SPR e ITC ejemplares para calcular la afinidad de enlace de los anticuerpos anti-RSV) . Instrumentación ' y métodos para la detección en tiempo real y la supervisión de las velocidades de enlace son conocidos y son comercialmente disponibles (por ejemplo, BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335). Un anticuerpo que se enlace inmunoespecíficamente a un antígeno de virus (o virus) se puede enlazar a otros péptidos, polipéptidos , o proteínas o virus con igual o inferior afinidad de enlace. Típicamente, un anticuerpo o fragmento de enlace antígeno del mismo proporcionado en este documento que se enlaza es inmunoespecíticamente a una proteina F de RSV (o virus de RSV) no tiene reacción cruzada con otros antígénos o tiene reacción cruzada con sustancialmente afinidad inferior (por lo menos 10-100 veces) para estos antigenos. Los anticuerpos o fragmentos de . enlace a antigeno que se enlazan inmunoespecificamente a un antigeno de virus particular (por ejemplo, una proteina de RSV) se puede identificad, por ejemplo, mediante · inmunoensayos, tales como radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzimas (ELISA), resonancia de plasmones superficiales, u otras técnicas conocidas por aquellas personas de experiencia en la técnica. Un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que se enlaza inmunoespecificamente' a. un epitopo sobre una proteina F de RSV es típicamente uno' que se enlaza de epitopo (presentado en la proteina o virus) con una mayor afinidad de enlace que a cualquier epitopo . con' reacción cruzada como es determinado usando técnicas experimentales, tales como, pero río limitados a, inmunoensayos, resonancia de plasmones superficiales, u otras técnicas conocidas ' por aquellas personas de experiencia en el campo. El enlace inmunoespecífico a una proteína RSV aislada (es decir, una proteína recombinantemente producida) , tal como proteína F de RSV, no significa necesariamente que el anticuerpo mostrará el mismo enlace inmunoespecifico y/o. neutralización del virus. Estas mediciones y propiedades son distintas. La afinidad para el anticuerpo o fragmentos de enlace antigeno para el virus o el antigeno como es presentado en el virus se puede determinar. Para propósitos en este documento, al describir una afinidad o término relacionado, el' objetivo, tal como la proteina aislada o el virus, será identificado.
Como se usa en este documento, el término "resonancia de plasmones superficiales" se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las¦ concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensor, por ejemplo, usando el sistema BiaCore (GE Healthcare Life Sciences) .
Como se usa en este documento, un anticuerpo "multivalente" es un anticuerpo que contiene dos o más sitios de enlace a antígeno. Anticuerpos multivalentes abarcan anticuerpos bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes , hexavalentes, heptavalentes o de . mayor valencia .
Como se usa en este documento, un "monoespecífico" es un anticuerpo que contiene dos o más sitios de enlace a antígeno, donde cada sitio de enlace, antígeno se enlaza inmunoespecificamente al mismo epítopo.
Como se usa en este documentó, un anticuerpo "multiespecifico" es un anticuerpo que contiene dos o más sitios de enlace a antig.eno, donde por lo menos dos de los sitios de enlace a antigeno se enlazan inmunoespecificamente a diferentes epitopos.
Como se usa en este documento, un- anticuerpo "biespecifico" es un anticuerpo multiespecifico que contiene dos o más sitios de enlace a antigeno y pueden enlazarse inmunoespecificamente a dos epitopos diferentes. Un anticuerpo "triespecifico" es un anticuerpo multiespecifico que contiene tres o más sitios de enlace a antigeno y se pueden enlazar inmunoespecificamente a tres epitopos diferentes, un anticuerpo "tetraespecifico" es . un anticuerpo multiespecifico que contiene cuatro o más sitios de enlace a antigeno y pueden enlazarse inmunoespecificamente, a cuatro epitopos diferentes, y asi sucesivamente.
Como se usa en este documento, un anticuerpo "heterobivalente" es. un anticuerpo biespecifico que contiene dos sitios de enlace a antigeno, donde cada sitio de enlace antigeno se enlaza inmunoespecificamente ' a un epitopo diferente.
Como se usa en ' este documento, un anticuerpo "homobivalente" es un anticuerpo monoespecifico que. contiene dos sitios de enlace a antigeno, donde cada sitio de enlace a antigeno enlaza inmunoespecificamente el mismo epitopo. Los anticuerpos homobivalentes incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos convencionales de longitud completa, anticuerpos de longitud completa diseñados o sintéticos, cualquier multimero de dos fragmentos de enlace antigeno idénticos, o cualquier multimero de dos fragmentos de enlace antigeno que contengan el mismo dominio de enlace antigeno.
Como se usa en ' este documento un · dominio de multimerización se refiere a una secuencia de aminoácidos que promueve la interacción estable de una molécula de polipéptido con una o más moléculas de polipéptido adicionales, que contienen cada una un dominio de multimerización complementario, que pueden ser el mismo o un dominio de multimerización diferente para formar un multimero estable con el primer dominio. En general, un polipéptido se une directa o indirectamente al dominio de multimerización. Dominios de multimerización ejemplares incluyen las secuencias de inmunoglobulina o porciones de las mismas, cremalleras de leucina, regiones hidrofóbicas, regiones hidrofilicas y dominios de interacción de proteína-proteína compatible. El dominio de multimerización, por ejemplo, puede ser una región o dominio constante de inmunoglobulina, tal como, por ejemplo, el dominio F.c o porciones del- mismo de IgG, incluyendo los subtipos IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD e IgM y formas modificadas de las mismas.
Como se usa en este documento, los dominios de dimerización son dominios de multimerización que facilitan la interacción entre dos secuencias de polipéptidos (tal como, pero no se limitan a, cadenas de anticuerpos) . Los dominios de dimerización incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de aminoácidos que contiene un residuo de cisteina que facilita la formación de un enlace de disulfuro entre dos secuencias de polipéptidos, tal como todo o parte de una región bisagra de anticuerpo de longitud completa, o una o más secuencias de dimerización, que son secuencias de aminoácidos conocidas por promover la interacción entre los polipéptidos (por ejemplo, cremalleras de leucina, cremalleras de GCN4) .
Como se usa en este documento, "Fe" o "región Fe" o "dominio Fe" se refiere a un polipéptido que contiene la región constante de . una cadena pesada de anticuerpo, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante. De esta manera, Fe se refiere a los últimos dos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD, e IgE, o los últimos tres dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM. Opcionalmente, un dominio Fe puede incluir todo o parte de la N-terminal de bisagra flexible a esos dominios. Para IgA e IgM, Fe puede incluir la cadena J. Para un dominio Fe ejemplar de igG', Fe contiene 77 ¦' -. ·¦. ·; dominios de inmunoglobulina Cy2 y Cy3, y opcionalmente, todo o parte de la bisagra entre Cyl y Cy2. Los limites de la . región Fe pueden variar, pero típicamente, incluyen por: lo menos parte de la región bisagra. Además, Fe también incluye cualquier variante alélica o · de especie o cualquier variante o forma modificada, tal como cualquier variante o forma modificada que altere el enlace a una FcR o altere una función efectora mediada por Fe.
Como se usa en este documento, "quimeras de Fe" se refiere a un polipéptido quimérico en el cual se. enlazan uno o más polipéptidos, directa o indirectamente, a ' una región Fe o a un derivado del mismo. Típicamente, una quimera de Fe combina la región Fe de una inmunoglobulina con otro polipéptido, tal como por ejemplo un fragmento de anticuerpo anti-RSV. Derivados de o polipéptidos de Fe modificados son conocidos por aquellas personas d.e experiencia en la técnica..
Como se usa en este documento, un "dominio de transducción de proteínas" o "PTD" es un. dominio de péptido que se puede conjugar a una proteína, tal como a un anticuerpo proporcionado en este documento, para · promover la unión y/o captación de la proteína en una célula objetiva.
Como se usa en este documento, una "etiqueta" o una "etiqueta de epítopo" se refiere a una secuencia de aminoácidos, agregadas típicamente a la N- o C- terminal de un polipéptido, tal como un anticuerpo proporcionado en este documento. La inclusión de etiquetas fusionadas a un polipéptido puede facilitar la. purificación y/o . detección del polipéptido. Típicamente, una etiqueta o polipéptido etiqueta se refiere a un polipéptido que tiene, suficiente residuos para proporcionar un epítopo reconocido con anticuerpo o puede servir para la detección o purificación, todavía . es suficientemente corta de modo que no interfiere con la actividad del polipéptido quimérico al cual se. énlazá. Él polipéptido etiqueta es típicamente suficientemente único de modo que un anticuerpo que se enlaza específicamente al mismo no tiene sustancialmente reacción cruzada con los epítopos en el polipéptido al cual se enlaza. Polipéptidos . etiqueta adecuados tienen en general por lo menos 5. o 6 o seis residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8-50 residuos de aminoácido, típicamente entre 9-30 residuos. Las etiquetas se pueden enlazar a uno o más polipéptidos quiméricos en un multímero y permiten la detección del multímero o su recuperación de una muestra o mezcla. Estas etiquetas son bien conocidas y se pueden sintetizar y diseñar fácilmente. Polipéptidos etiqueta ejemplares incluyen aquellos usados para la purificación por afinidad e incluyen, etiquetas His, el polipéptido de etiqueta de hemaglutinina de influenza (HA) y su anticuerpo 12CA5, (Field y- colaboradores (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165); la etiqueta . c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G , B7 y 9E10 a los mismos (véase, por ejemplo., Evan y colaboradores (1985) Molecular . y Cellular Biology 5:3610-3616); y la etiqueta de . glicoproteína D (gD) del virus dé Herpes Simple y su anticuerpo (Paborsky y colaboradores (1990) Protein Engineering 3:547-553 (1990)·. Un anticuerpo usado para detectar un anticuerpo etiquetado con epitopo es referido típicamente en este documento como un anticuerpo secundario.
Como se usa en este documento, "polipéptido" se refiere a dos o más aminoácidos unidos covalentemente . Los términos "polipéptido" y "proteínas" se usan intercambiablemente en este documento.
Como se usa en este documento, un "péptido" se refiere a un polipéptido que tiene de 2 a aproximadamente 40 aminoácidos en longitud.
Como se usa . en este documento, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. · Un polipéptido contiene uno o más aminoácidos. Para propósito en este documento, los aminoácidos contenido en los anticuerpos proporcionados incluyen los veinte aminoácidos de origen natural (Tabla 1) , aminoácidos no naturales, y análogos . de aminoácido (por ejemplo aminoácidos en donde el carbono OÍ tiene una cadena lateral. Como se usa en este documento, los aminoácidos, que ocurren en las diversas .secuencias de aminoácidos de polipéptidos que se presentan en este documento, se identifican de acuerdo con sus abreviaciones de tres letras o una letra, bien conocidas (véase Tabla 1) Los' nucleótidos, que ocurren en las diversas moléculas de ácido nucleico y fragmentos, son designadas con las designaciones de una letra estándares usadas rutinariamente en la técnica.
Como se usa en este documento, "residuo de aminoácidos" se refiere a un aminoácido formado en la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus ligaduras de péptido. Los residuos de aminoácido descritos en este documento están en general en la forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D" se pueden sustitui por residuo de L-aminoácido, siempre y cuando la propiedad funcional deseada sea retenida por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en la amina terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el carboxilo-terminal de un polipéptido. De acuerdo, con la nomenclatura de polipéptidos estándar descrita en J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968) y adoptada en 37 C.F.R.. §§. 1.821 - 1.822, las abreviaciones para residuos de los aminoácidos se muestran en la Tabla 1: TABLA 1 - Tabla de Correspondencias Todas las secuencias de residuos de aminoácidos presentadas en este documento por una fórmula tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de la amino-terminal a la carboxilo-terminal . Además, la frase "residuos de aminoácidos" se define para incluir los aminoácidos . listados en la Tabla de Correspondencia (Tabla ¦ 1) , aminoácidos modificados, no naturales e inusuales. Adicionalmente, . una diagonal en el inicio o final en una secuencia de residuos de aminoácido indica un péptido que . se enlaza a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido o a un grupo amino-terminal tal como NH2 a un grupo carboxilo-terminal tal como COOH.
En un péptido o proteina, las sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos, son conocidas por aquellas personas de experiencia en esta técnica y en general se pueden hacer sin alterar una actividad biológica de una molécula resultante. Aquellas personas de experiencia en esta técnica reconocen que, . en general las sustituciones- de aminoácido individual en las regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, atson y colaboradores, Molecular Bíology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benj amin/Cummings Pub. co. , p.224) .
Estas sustituciones se pueden hacer de acuerdó con aquellas expuestas en la Tabla 2 como sigue: TABLA 2 Otras sustituciones también son aceptables y se pueden determinar empíricamente o de acuerdo con otras sustituciones conservadoras o no conservadoras conocidas.
Como se usa en este documento, "aminoácidos de. origen natural" se refiere a los 20 L-aminoácidos que ocurren en los polipéptidos .
Como se usa en este documento, el término "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural pero se ha modificado estructuralmente para · imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Aminoácidos no de origen natural incluyen además, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero no se limitan a, los D-isostereómeros de aminoácidos. Aminoácidos no naturales ejemplares son bien .conocidos por aquellas' personas de experiencia en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, 2-Aminoadipico (Aad) , 3-ácido Aminoadípico (Baad) , ß-alanina/p-ácido Aminopropiónico (Bala), 2-ácido Aminobutírico (Abu) , 4-ácido Aminobutírico/ácido piper'idinico (4Abu) , 6-ácido Aminocaproíco (Acp) , 2-ácido . Aminoheptanóico (Ahe) , 2-ácido Aminoisobutírico · (Aib) , 3-ácido Aminoisobut'írico (Baib) , 2-ácido Aminopimélico (Apm) , 2, -ácido Diaminobutírico (Dbu) , Desmosina (Des), 2, 2' -ácido Diaminopimélico (Dpm) , 2, 3-ácido Diaminopropiónico (Dpr), N-Etilglicina (EtGly) , N-Etilasparagina (EtAsn) , Hidroxilisina (Hyl) , alohidroxilis.ina (Ahyl) , 3-Hidroxiprolina (3Hyp) , 4-Hidroxiprolina (4Hyp) , Isodesmosina (Ide), alo-Isoleucina (Alie) , N-Metilglicina, sarcosina (MeGly) , N-Metilisoleucina (Melle), 6-N-Metilisina (MeLys), N-Metilvalina (MeVal) , Norvalina (Nva) , Norleucina (Nle)' y Ornitina (Om) . .' Como se usa en este documento, una molécula de "polipéptido nativo" o "ácido ¦ nucleico nativo" es una molécula de polipéptido o ácido nucleico, respectivamente, que se pueden encontrar en la naturaleza. Una molécula de polipéptido nativo o ácido nucleico puede ser la forma de tipo natural de una molécula de polipéptido o ácido nucleico. Una molécula de polipéptido o ácido nucleico nativa puede ser la forma predominante del polipéptido, o cualquier, variante alélica o natural del mismo. Los' polipéptidos variantes y moléculas de ácido nucleico proporcionadas en este . documento pueden tener modificaciones comparadas con las moléculas de polipéptido y ácido nucleicos nativos.
Como se usa en este documento, la forma de tipo natural de una molécula de polipéptido o ácido nucleico es una forma modificada por un gen o por una secuencia de codificación codificada por el gen. Típicamente, . una forma de tipo natural de un gen, o molécula codificada por el mismo, no contiene mutaciones u otras modificaciones que alteren la función o estructura. El término tipo natural también abarca formas con variación alélica como ocurre entre las especies. Como se usa en este documento, una forma predominante de una molécula de polipéptido o ácido nucleico se refiere a una forma de la molécula que es la forma principal producida de un gen. Una "forma predominante" varía de fuente a fuente. Por ejemplo, diferentes células o tipos de . tejidos pueden producir diferentes formas de polipéptidos, por ejemplo, mediante el empalme alternativo y/o mediante el procesamiento de proteínas alternativo. En cada tipo de célula o tejido, un polipéptido diferente puede ser una "forma predominante".
Como se usa en este documento, una "variante alélica" o "variación alélica" se refiere a . cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen · que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar por resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término "variante alélica" también se usa en este documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente la forma de referencia' del gen qué codifica una forma de tipo natural y/o forma predominante de un polipéptido de una población o miembro de referencia individual de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre las especies tienen típicamente por lo menos o aproximadamente 80%, 85% 90%, 95% o mayor identidad de aminoácido con una forma de tipo natural y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y si la comparación es inter-específica o intra-específica . En general, las variantes alélicas intra-especificas tienen pór lo menos o aproximadamente 80 %, 85 %, 90 % o 95 % identidad o mayor con una forma de tipo natural y/o predominante, incluyendo 96 %, 97 %, 98 %, 99- % o mayor identidad con una forma de tipo natural y/o predominante de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en este documento se refiere en general a variaciones de proteínas entre los miembros de la misma especie.
Como se usa en este documento, "alelo",' se usa intercambiable en este documento con "variante alélica" se refiere a las formas alternativas de un gen de porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo sitio o posición en los cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, el sujeto se dice que es homocigoto para ese gen alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, el sujeto se dice que es heterocigoto para el gen. Los alelos para un gen específico pueden diferir entre sí en un solo nucleótido o varios nucleótidos, y pueden incluir sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de' un - gen que contiene una mutación.
Como se usa en este documento, "variantes de especie" se refiere a variantes en¦¦ los polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo especies de¦ mamífero diferentes, tales como ratón y humano, y especies de micro organismos, tales como virus y bacterias.
Como se usa en este documento, . un "dominio" de polipéptido" es una parte de un polipéptidp (una secuencia de tres o más, en general 5, 10 o más aminoácidos) es decir estructural y/o funcionalmente distinguible o definible. Ejemplar de un dominio de polipéptido es una parte del polipéptido . que puede formar una . estructura independientemente plegada dentro de un polipéptido que constituye uno o más motivos estructurales . (por ejemplo combinaciones de hélices alfa y/o hebras beta conectados por regiones de rizo) y/o que és reconocida por una actividad funcional particular, tal como actividad enzimática, dimerización o enlace a antigeno. Un polipéptido .puede tener uno o más, típicamente más de uno, dominios distintos. Por ejemplo, el polipéptido puede tener uno o más. dominios estructurales y uno o más dominios funcionales. Un solo dominio de polipéptido se puede distinguir con base' en la estructura y función. Un dominio puede abarcar una secuencia lineal contigua de aminoácidos. Alternativamente, un dominio puede abarcar una pluralidad de porciones de aminoácido no contiguas, que no son contiguas a lo largo de la secuencia lineal de aminoácidos del polipéptido. Típicamente, un polipéptido contiene una pluralidad de dominios. Por ejemplo, cada cadena pesada y cada cadena ligera de una molécula de anticuerpo contiene · una pluralidad de dominios de inmunoglobulina dg), cada uno de aproximadamente 110 aminoácidos en longitud.
Aquellas personas de experiencia en la técnica están familiarizados con los dominios de polipéptido y pueden identificarlos en virtud de la homología estructura y/o funcional con otros dominios. Para ej emplificación en este documento, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está muy dentro de la experiencia en la técnica reconocer os dominios particulares por nombre. Si es necesario, se puede emplear un software apropiado para identificar los dominios.
Como se usa en este documento, una región, funcional de un polipéptido es una región del polipéptido que contiene por lo menos un dominio funcional (que imparte una función particular, tal como una capacidad interactuar con una biomolécula, por ejemplo, a través del enlace a.-, antigeno, enlace de DNA, enlace de ligando, o dimerización, o mediante actividad enzimática, por ejemplo, actividad de cinasa o actividad proteolítica) ; ejemplar de las regiones funcionales de los polipéptidos son los dominios de anticuerpo, tales como VH, VL, CH, CL, y' porciones de los mismos, tales como CDRs, incluyendo CDR , CDR2 y CDR3, o porciones de enlace a antígeno, tal como sitios de combinación de anticuerpos.
Como se usa en este documento, una región estructural de un polipéptido es una región del polipéptido que contiene por lo menos un dominio estructural.
Como se usa en este documento, una "propiedad" de un polipéptido, tal como un anticuerpo, se refiere a cualquier propiedad mostrada, por un polipéptido, incluyendo, pero no limitado a, especificidad de enlace, configuración o conformación estructural, estabilidad de proteínas, resistencia a la proteólisis, estabilidad de conformación, tolerancia térmica, y tolerancia a condiciones de pH. Los cambios en las propiedades pueden alterar una "actividad" del polipéptido. Por ejemplo, un cambio en la especificidad de enlace del polipéptido de anticuerpo puede alterar la capacidad de enlazarse a un antígeno, y/o varias actividades de enlace, tal como afinidad o avidez, o actividades in vivo del polipéptido.
Como se usa en este documento, una "actividad" o una "actividad funcional" de un polipéptido, tal como un anticuerpo se refiere a cualquier actividad mostrada por el polipéptido. Estas actividades se- pueden determinar empíricamente. Actividades ejemplares incluyen, pero no se limitan a, capacidad de interactuar con una biomolécula, por ejemplo, a través de enlace a antígeno, enlace de DNA,' enlace de ligando, o dimerización, actividad enzimática, por ejemplo, actividad de cinasa o actividad proteolítica . Para un anticuerpo (incluyendo fragmentos de anticuerpo) , las actividades incluyen, pero no se limitan a, la capacidad de enlazarse específicamente a un antígeno particular, afinidad de enlace a antígeno (por ejemplo alta o baja afinidad), avidez del enlace a antígeno (por ejemplo, alta o baja avidez), constante de asociación, constante de disociación, funciones efectuadas, tal como la capacidad de promover la neutralización o eliminación de antígenos, neutralización de virus, y actividades in vivo, tal como la capacidad de prevenir infección o invasión de un patógeno, o promover la eliminación, o penetrar un tejido o fluido o célula particular en el cuerpo. La actividad se puede evaluar in vitro o in vivo usando ensayos reconocidos, tal como ELISA, citometría de flujo, resonancia de plasmones superficiales o ensayos equivalentes para medir la constante de asociación o disociación, inmunohistoquímica e histología de inmunofluorescencia y microscopía, ensayos basados en células, citometría de flujo y ensayos de enlace (por ejemplo, ensayos de inmunoplaqueteo) . Por ejemplo; para un polipéptido de anticuerpo, las actividades se pueden evaluar al medir las afinidades de enlace, avideces, y/o coeficientes de enlace (por ejemplo, para constantes de asociación/disociación), y otras actividades in .vitro. o .al medir varios efectos in vivo, tal como efectos inmunes, por ejemplo eliminación de antigenos,' penetración o localización del anticuerpo en los tejidos, protección de enfermedad, por ejemplo infección, suero u otros títulos, de anticuerpos en el fluido, u otros ensayos que son bien conocidos en la técnica. Los resultados de estos . ensayos que indican que . un polipéptido muestra una actividad se pueden correlacionar con la actividad del polipéptido in vivo, en el cual la actividad in vivo se puede referir como actividad' terapéutica, o actividad biológica. La actividad de un polipéptido modificado puede ser cualquier nivel de porcentaje de actividad del polipéptido no modificado, incluyendo pero no limitado a, 1% de la actividad, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%,. 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más de actividad comparado con el .polipéptido no modificado. Los ensayos para determinar la funcionalidad o actividad de los anticuerpos modificados (por ejemplo variante) \ son bien conocidos en la técnica.
Como se usa en este documento, "actividad terapéutica" se refiere a la actividad in vivo de un polipéptido terapéutico. En general; la. actividad terapéutica es la actividad que se usa para tratar una enfermedad o afección. La actividad terapéutica de un polipéptido puede ser cualquier nivel de porcentaje de actividad terapéutica del polipéptido no modificado, incluyendo pero no , limitado a 1% de la actividad, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, -97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más de la ¦ actividad terapéutica comparado con el polipéptido no modificado.
Como se usa en este documento, "muestra por lo, menos una actividad" o "retiene por lo menos una actividad" se refiere a la actividad mostrada por un polipéptido modificado, tal como un polipéptido variante producido de acuerdo con los métodos proporcionados, tal como ' uno modificado, por ejemplo anticuerpo variante u otro polipéptido terapéutico (por ejemplo un anticuerpo anti-RSV modificado o fragmento de enlace a antigeno del mismo), comparado con el polipéptido objetivo, o no modificado, que no contiene la modificación. Un polipéptido modificado, o variante, que retiene una actividad de un polipéptido objetivo puede mostrar actividad mejorada o mantener la actividad del polipéptido no modificado. En algunos casos, un polipéptido modificado, o variante, puede retener una actividad que se incrementa comparado con un polipéptido objetivo o no modificado. En algunos casos, un polipéptido modificado, o variante, puede retener una actividad que se disminuye comparado con un polipéptido no modificado u objetivo. La actividad de un polipéptido modificado, o variante, puede ser cualquier de porcentaje de actividad del polipéptido no modificado u objetivo, incluyendo pero no . limitado a, 1% de la actividad, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%,. 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más de la actividad comparada con el polipéptido no modificado. U objetivo. En otras modalidades, el cambio en la actividad es por lo menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, o más veces mayores que el polipéptido no modificado u objetivo. . Los ensayos para la retención de una actividad dependen de la actividad que se retiene. Estos ensayos se pueden realizar in vitro o in vivo. La actividad se puede medir, por ejemplo, usando ensayos conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos posteriores para actividades tales como pero no se limita a ELISA y ensayos de inmunoplaqueteo . Las actividades de un polipéptido modificado, o variante, comparado con un polipéptido no modificado u objetivo también se pueden evaluar en términos de una actividad o resultado terapéutico o biológico in vivo después de la administración del polipéptido.
Como se usa en este documento, el término "evaluar" se propone para incluir la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteasa, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también de obtener un índice, relación, porcentaje, visual u otro valor indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser. directa o indirecta y las especies químicas detectadas actualmente no necesitan por supuesto ser el producto de proteólisis misma sino pueden por ejemplo ser un derivado del mismo- o alguna sustancia adicional. Por ejemplo, la detección de un producto de escisión de una proteína de complemento, tal como por SDS-PAGE y la tinción de proteínas con azul de Coomassie.
Como se usa en este documento, el término "ácido nucleico" se refiere a por lo menos dos nucleótidos enlazados o derivado de .nucleótido, incluyendo un ácido desoxirribonucleico (DNA) y un' ácido ribonucleico (RNA) , unidos conjuntamente, ¦ típicamente por enlaces de fosfodiéster . También se incluyen en el término "ácido nucleico" análogos de ácidos nucleicos tales como ácido nucleico de péptido (PNA), DNA de fosforotioato, y otros análogos y derivados .o combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos también incluyen derivados de DNA RNA que contienen, por ejemplo, un análogo de nucleótido o un enlace de "cadena principal" diferente a un enlace de fosfodiéster, por ejemplo, un enlace de fosfodiéster , un enlace de fosforamidato, un enlace de fosforotioato, un enlace de tioéster, o un enlace de péptido (ácido nucleico de péptido) . El término también incluye, equivalentes, derivados, y análogos de cualquier RNA o DNA hecho de análogos de nucleótido, ácidos nucleicos de hebra individual (sentido o antisentido) y de doble hebra. Los desoxirribonucleótidos incluyen desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina y desoxitimidina . Para el RNA, la base de uracilo es uridina.
Los ácidos nucleicos pueden contener análogos de nucleótido, incluyendo, por ejemplo, nucleótidos modificados en masa, que permiten la diferenciación de masa de las moléculas de ácido nucleico; nucleótidos que contienen una etiqueta detectable tal. como una etiqueta fluorescente, radioactiva, luminiscente o quimioluminiscente , que permite la detección de una molécula de ácido nucleico; o nucleótidos que contienen un grupo reactivo tal como biotina o grupo tiol, que facilita la inmovilización de una molécula de ácido nucleico a un soporte sólido. Un ácido nucleico también puede contener uno o más enlaces de cadena principal que son selectivamente escindibles, por ejemplo, química, enzimática o fotolíticamente escindibles. Por ejemplo, un ácido nucleico puede incluir uno o más desoxirribonucleótidos, seguido por uno o más ribonucleótidos, que pueden ser seguidos por uno o más desoxirribonucleótidos, tal como una secuencia que es escindible en la secuencia de ribonucleótidos por la hidrólisis base. Un ácido nucleico también puede contener uno o más enlaces que son relativamente resistentes a la escisión, por ejemplo, un cebador de oligonucleótido quimérico que puede incluir nucleótidos enlazados por enlaces de ácido nucleico de péptido y por lo menos un nucleótido en el extremo 3' , que se enlaza por un enlace de fosfodiéster u otro enlace adecuado, y es capaz de ser extendido por una polimerasa. Las secuencias de ácidos nucleicos de péptido se pueden preparar usando métodos bien conocidos (véase, por ejemplo, eiler y colaboradores (1997) Ácido nucleicos Res. 25:2792-2799) .
Como se usa en este documento, los . términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico" se refieren a un oligómero o polímero que contienen por lo menos dos nucleótidos enlazados o derivados de nucleótido, incluyendo un ácido desoxirribonucleico (DNA) y un ácido ribonucleico (RNA) , unidos conjuntamente, típicamente por enlaces de fosfodiéster. Los polinucleótidos también incluyen derivados de DNA y RNA que contienen, por ejemplo, un análogo de nucleótido o un enlace de "cadena principal" diferente a un enlace de fosfodiéster, por ejemplo, un enlace de fosfotriéster , un enlace de fosforamidato, un enlace de fosforotioato, un enlace de tioéster, o un enlace de péptido (ácido nucleico de péptido) . Los polinucleótidos (moléculas de ácido nucleico) , ¦ incluyen polinucleótidos de hebra individual y/o. . doble hebra, tal como ' ácido desoxirribonucleico (DNA) , y ácido ribonucleico (RNA) asi como también análogos o derivados de ya sea RNA o DNA. El término también incluye, como equivalentes, derivados, variantes y análogos de ya sea RNA o DNA hechos de análogos de nucleótido, . polinucleótidos de hebra individual (sentido o antisentido) y de doble hebra. Los desoxirribonucleótidos incluyen desoxiadenosina , desoxicitidina, desoxiguanosina y desoxitimidina . Para el RNA, la base de uracilo es uridina . Los polinucleótidos pueden contener análogos de nucleótido, incluyendo, por ejemplo, nucleótidos modificados, en masa,' que permiten la diferenciación en masa de los polinucleótidos; nucleótidos que contienen una etiqueta detectable ' tal como una etiqueta fluorescente, radioactiva, luminiscente o quimioluminiscente, que permite la detección de un polinucleótido; o nucleótidos que contienen un grupo reactivo tal como grupo biotina . o tiol, que facilita la inmovilización de un polinucleótido a un soporte sólido. Un polinucleótido también puede contener uno o más enlaces de cadena principal que son selectivamente escindibles, por ejemplo, química, enzimática o fotoliticamente escindibles. Por ejemplo, un polinucleótido puede incluir uno o más desoxirribonucleótidos, o seguido por uno ' o más ribonucleótidos , que pueden ser seguidos por uno o más desoxirribonucleótidos, tal como una secuencia' que es escindible en la secuencia de ribonucleótidos por .la hidrólisis base. Un polinucleótido también puede contener uno o más enlaces que son relativamente resistentes a la escisión, por ejemplo, un cebador de oligonucleótido quimérico, que puede incluir nucleótidos enlazados por enlaces de ácido nucleico de péptido y por lo menos un nucleótido en el extremo 3', que se enlaza por un enlace de fosfodiéster u otro enlace adecuado, y es capaz de ser extendido por una polimerasa. Las secuencias de ácido nucleico de péptido se pueden preparar usando métodos bien conocidos (véase, por ejemplo, eiler y colaboradores (1997) Acido nucleicos Res. 25:2792-2799). Ejemplares de las moléculas de ácido nucleico (polinucleótidos ) proporcionadas en este documento son oligonucleotidos, incluyendo oligonucleotidos sintéticos, dúplex de oligonucleótido, cebadores, incluyendo cebadores de relleno y casetes de dúplex de oligonucleotidos.
Como se usa en este documento, un "constructo de DNA" es una molécula de DNA linear o circular, de hebra individual o doble hebra que . contiene segmentos de DNA combinados y yuxtapuestos en una manera no encontrada en la naturaleza. Los constructos de DNA existen como un resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.
Como se usa en este documento., un "segmento.de DNA" es una porción de una molécula de DNA más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de DNA que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de DNA más grande, tal como un plásmido o fragmento de plásmido, que cuando se lee de la dirección 5' a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado.
Como se usa en este documento, un polinucleótido de hebra positiva se refiere a la "hebra de sentido" o un. dúplex de polinucleótido, que es complementario con la hebra negativa o la hebra "antisentido". En el caso de los polinucleótidos que codifican genes, la hebra de sentido es la hebra que es idéntica a la hebra de mRNA que se traduce en un polipéptido, mientras que la hebra antisentido es complementaria con aquella hebra. Las hebras positivas y negativas de un dúplex son complementarias entre si.
Como se usa en este documento, un elemento genético se refiere a un gen, o. cualquier región del mismo., que codifica un polipéptido o proteína o región del . mismo. En algunos ejemplos, un elemento, genético codifica una proteína de fusión.
Como se usa en este documento, la región reguladora de una molécula de ácido nucleico significa una secuencia de nucleótidos de acción cis que afecta la expresión positiva o negativamente, de un gen ligado operativamente. Las regiones reguladoras incluyen secuencias de nucleótidos que confieren la expresión inducible (es decir, requieren una sustancia o estímulo para la transcripción, incrementada) de- un gen. Cuando un inductor está presente o en concentración incrementada, la expresión génica se puede incrementar. Las regiones reguladoras también pueden incluir secuencias que confieren represión de la expresión génica (es decir, una sustancia o estímulo disminuye la transcripción) . Cuando un represor está presente o en concentración incrementada la expresión génica se puede disminuir. Se sabe que las regiones reguladoras se afectan, modulan o controlan muchas actividades biológicas in ' vivo . incluyendo proliferación celular, crecimiento y muerte celular, diferenciación celular y modulación inmune. Las regiones reguladoras se enlazan típicamente a una o más proteínas de acción trans, que resulta en ya sea la transcripción incrementada o disminuida del gen.
Ejemplos particulares de reg.iones reguladoras de genes son promotores y potenciadores . Los promotores son secuencias localizadas alrededor del sitio de inicio' de transcripción o traducción, posicionados típicamente 5' del sitio.de inicio de traducción .. Los promotores se localizan usualmente dentro de 1 Kb de sitio de inicio de traducción, pero se pueden localizar lejos, por ejemplo, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb., 5 · Kb o más, hasta incluyendo 10 Kb. Se sabe que los potenciadores afectan la expresión génica cuando se posicionan 5' o 3' del gen, o cuando se posicionan en o una parte de un exón o un intrón. Los potenciadores también pueden funcionar en una distancia significativa del gen, por ejemplo, en, una distancia de aproximadamente 3 Kb, 5 Kb, 7 Kb, 10 Kb, 15 Kb o más.
Las regiones reguladoras también incluyen,, además de las regiones promotoras, secuencias que facilitan la traducción, señales de empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto del gen. para permitir la traducción dentro del marco de RNA y, codones de detección, secuencias líderes y secuencias asociadas de fusión, elementos del sitio de enlace de ribosoma interno (IRES) para la., creación dé múltiples genes, o policistrónico, mensajes, . señales de poliadenilación para proporcionar la poliadenilación apropiada del transcripto de un gen de interés y codones de detección, y se pueden incluir opcionalmente en un vector de expresión.
Como se usa en este, documento, "ligado operativamente" con referencia a las secuencias de ácido nucleico, las regiones, elementos o dominios significan que la's regiones de ácido nucleico se relacionan funcionalmente entre si. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un péptido líder, se puede enlazar operativamente al ácido nucleico qué codifica un polipéptido, mediante lo cual los ácidos . nucleicos se pueden transcribir y traducir para expresar una proteína de fusión funcional, en donde el péptido líder efectúa la secreción del polipéptido de fusión. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica un primer polipéptido '.(por ejemplo, un péptido líder) se enlaza operativamente al ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido y los ácidos nucleicos se transcriben como un solo transcripto de mRNA, pero la traducción del transcripto de mRNA puede dar por resultado uno de dos polipéptidos que se expresan. Por ejemplo, un codón de detección ámbar se puede localizar entre el ácido nucleico que codifica el' primer polipéptido y el ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido tal que, cuando se introducen en una célula supresora ámbar parcial, el único transcripto de mRNA. resultante se puede, traducir para producir ya sea una proteína de fusión que contiene el primero y segundo polipéptidos, o se puede traducir para producir solamente el primer polipéptido. En otro ejemplo, un promotor se puede enlazar operativamente al ácido nucleico que codifica un polipéptido, mediante lo cual el promotor regula o media la transcripción del ácido nucleico. .
Como se usa en este documento, "sintético", con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintético o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se produce por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química.
Como se usa en este documento, la producción por medios recombinantes al usar métodos de DNA recombinante significa el uso de los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por el DNA clonado.
Como se usa en este documento, "expresión" se refiere al proceso por el cual los polipéptidos se producen mediante transcripción y traducción de los polinucleótidos . El nivel de expresión de un polipéptido se puede evaluar usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, métodos para determinar la cantidad del polipéptido producido de la célula hospedera. Estos métodos pueden incluir, pero no se limitan a, cuantificación del polipéptido en el lisado celular' por el ELISA, tinción de azul de Coomassie seguido por electroforesis en gel, ensayo de proteina Lowry y ensayo de proteína Bradford.
Como se usa en este documento, una "célula hospedera" es una célula que se usa para recibir, mantener, reproducir y amplificar un vector. Una célula hospedera también se puede usar para expresar el polipéptido codificado por- el vector. El ácido nucleico contenido en el vector se replica cuando la célula hospedera se divide, amplificando en consecuencia los ácidos nucleicos. En un ejemplo, la célula hospedera es un paquete genético, que se puede inducir para expresar el polipéptido variante sobre su superficie. En otro ejemplo, la célula hospedera se infecta con el paquete genético. Por ejemplo, las células hospederas pueden ser células hospederas compatibles de despliegue de fagos, que se pueden transformar con vectores fago o fagémidos y adaptan el empaquetamiento de las proteínas de fusión de despliegue de fagos que', contienen los polipéptidos variantes.
Como se usa en este documento, un "vector" es un ácido nucleico replicable del cual se pueden expresar una o más proteínas heterólogas cuando el vector se transforma en una célula hospedera apropiada. La referencia a un vector incluye aquellos vectores en los cuales un ácido nucleico que codifica un polipéptido o fragmento del mismo se puede introducir, típicamente por digestión ligación de restricción. Con la referencia a un vector también incluye aquellos vectores que contienen ácido nucleico que codifican un polipéptido. El vector se usa para introducir, el ácido nucleico que codifica el polipéptido en la célula hospedera para amplificación del ácido nucleico o para la expresión del polipéptido codificado por el ácido nucleico. Los vectores siguen siendo típicamente episomales, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un' gen o. porción del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. La selección y uso de estos vehículos son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica.
Como se usa en este documento, un vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales." Los vectores virales son virus diseñados que se enlazan operativamente a genes exógenos para transferir (como vehículos o elementos de transferencia) los genes exógenos en las células.
Como se usa en este documento, un "vector de expresión" incluye vectores capaces de expresar el DNA que se enlaza operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de estos fragmentos de DNA . Estos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un- potenciador, una señal de poliadenilación, y similar. Los vectores de expresión se derivan en general de DNA plásmido o viral, o pueden contener elementos de ambos. De esta manera, un vector de expresión se refiere a un constructo de DNA o RNA recombinante,' tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, en la introducción en una célula hospedera apropiada, da por resultado la expresión del DNA clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica e incluyen aquellos que son replicables en células eucarióticas y/o células procarióticas y aquellas que siguen siendo episomales o aquellas que se integran en el genoma de la célula hospedera.
Como se usa . en este documento, los términos "oligonucleótido" y "oligo" se usan sinónimamente. Los oligonucleótidos son polinucleótidos que contienen un número limitado de nucleótidos en longitud. Aquellas personas en la técnica reconocen que los oligonucleótidos son en' general menores que o aproximadamente doscientos cincuenta, típicamente menor que en o aproximadamente doscientos, típicamente menor que en o aproximádamente cien,' nucleótidos en longitud. Típicamente, los oligonucleótidos proporcionados en este documento son · oligonucleótidos sintéticos. Los oligonucleótidos sintéticos contienen poco menos que .o aproximadamente 250 o 200 nucleótidos en longitud, poco menos que aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 1^0, 180, 190 o 200 nucleótidos en longitud. Típicamente, los oligonucleotidos son oligonucleotidos de hebra individual. La terminación "mer" se puede usar para indicar la longitud de un o.ligonucleótido . Por ejemplo, "100-mer" se puede usar para- referirse a un oligonucleótido que contiene 100 nucleótidos en longitud. Ejemplares de los oligonucleótidos sintéticos proporcionados en este documento son oligonucleótidos de hebra positiva y negativa, oligonucleótidos aleatorizados, oligonucleótidos de secuencia de referencia, oligonucleótidos de plantilla y cebadores de relleno.
Como se usa en este documento, los oligonucleótidos sintéticos son oligonucleótidos producidos mediante síntesis química. Son bien conocidos los métodos de síntesis química de oligonucleótidos. Cualquiera de- los métodos de síntesis conocidos se puede usar para producir los oligonucleótidos diseñados y usados en- los métodos proporcionados. Por ejemplo, los oligonucleótidos sintéticos se hacen típicamente al unir químicamente monómeros de nucleótidos individuales o trímeros de nucleótidos que contienen grupos' protectores. Típicamente, fosforamiditas, los nucleótidos individuales que contienen grupos protectores se agregan uno a la vez. Las síntesis comienzan típicamente con el extremo 3' del oligonucleótido . La fosforamidita más alejada del extremo 3' se une a un soporte sólido y procede la síntesis al agregar cada fosforamidita al extremo 5' del último. Después de cada adición, el grupo protector se remueve del grupo fosfato 5' en la base más recientemente agregada, permitiendo la adición de otra fosforamidita . Los sintetizadores automatizados pueden sintetizar en general oligonucleótidos hasta de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 nucleótidos en longitud. Típicamente, los oligonucleótidos diseñados y usados en los métodos proporcionados se sintetizan usando química de cianoetilo estándar de monómeros de fosforamidita . Los oligonucleótidos sintéticos producidos mediante este método estándar se pueden adquirir de Integrated DNA Technologies (IDT) (Coralville, IA) o TriLink Biotechnologies (San Diego, CA) .
Como se usa en este documento, "cebador" se refiere a una molécula de ácido nucleico (más típicamente, a una agrupación de estas moléculas que comparten identidad de secuencia) que pueden actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico dirigida en plantilla bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, en presencia de. cuatro trifosfatos de nucleósido diferentes y un agente de polimerización, tal como DNA polimerasa RNA polimerasa - o transcriptasa inversa) en una . solución amortiguadora apropiada y a una temperatura adecuada. Se apreciará que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como una "sonda" y como un "cebador". Un cebador, sin embargo, tiene un grupo hidroxilo 3' para la extensión. Un cebador se puede usar en una variedad de métodos, incluyendo,, po ejemplo, réacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcriptasa inversa (RT)-PCR, RNA PCR, LCR, PCR multiplex, PCR panhandle, PCR de captura, PCR de expresión, RACE 3' y 5' , PCR in situ, PCR mediada por ligación y otros protocolos de amplificación.
Como se usa en este documento, "par cebador" se refiere a un conjunto de cebadores (por ejemplo, dos acumulaciones de cebadores) que incluye' un cebador 5' (cadena arriba) que se híbrida específicamente con el extremo 5' con una . secuencia que se amplifica (por ejemplo mediante PCR) y un cebador 3' (cadena abajo) que se híbrida específicamente con el complemento 3' de la secuencia que se amplifica. Debido a que "cebador" puede referirse a una acumulación de moléculas de ácido nucleico idénticas, un par cebador es típicamente un par de dos agrupaciones de cebadores.
Como se usa en este documento, "un solo cebador" y "un solo grupo de cebadores" se refiere sinónimamente a un grupo de cebadores, donde cada cebador en el grupo contiene identidad de secuencia con los otros miembros de cebadores, por ejemplo, un grupo de cebadores donde los miembros comparten por lo menos en o aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad. Los cebadores en un solo grupo de cebadores (comparten la densidad de secuencia) actúan como cebadores 5' (cadena arriba) que se hibridan específicamente con el extremo 5' de una secuencia que se amplifica (por ejemplo, mediante PCR) ) y como cebadores 3' ' (cadena abajo) (que se hibridan específicamente con el complemento del extremo 3' de la secuencia que se amplifica) . De esta manera, se puede usar un solo cebador, sin otros cebadores, para cebar la síntesis de hebras complementarias y amplificar un ácido nucleico en una reacción de amplificación de polimerasa.
Como se usa en este documento, la complementariedad, con respecto a los dos nucleótidos, se refiere a la capacidad de los dos nucleótidos para parearse en base entre sí en la hibridación de las dos moléculas de ácido nucleico. Las dos moléculas de ácido nucleico que comparten complementariedad son referidas como moléculas de ácido nucleico complementarias; ejemplares de moléculas de ácido nucleico complementarias las hebras positivas y negativas en un dúplex de polinucleótido . Como se usan en este documento, cuando una molécula de ácido nucleico o región, de la misma es complementaria a otra molécula de ácido nucleico o región de la misma, las dos moléculas o regiones se' hibridan específicamente entre sí. Dos moléculas de ácido nucleico complementarias se pueden describir en términos de porcentaje de complementariedad . Por ejemplo, dos moléculas de ácido nucleico, cada una con 100 nucleótidos en longitud, que se hibridan específicamente entre sí pero contienen 5 incompatibilidades con respecto al otro, se dicen que tienen 95% de complementariedad. Para que dos moléculas de ácido nucleico se hibriden con 100 % de complementariedad, no es necesario que exista la complementariedad a lo largo de la longitud completa de ambas moléculas. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene 20 nucleótidos contiguos en longitud se puede hibridar específicamente a una porción a 20 nucleótidos contiguos de una molécula de ácido nucleico que contiene 500¦ nucleótidos contiguos en longitud. Si no se llevan a cabo' incompatibilidades a lo largo de esta porción de 20 nucleótidos, la molécula de 20 nucleótidos se híbrida con 100 % de complementariedad. Típicamente, las moléculas de ácido nucleico de complementariedad se alinean con menor que 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 4%, 3%, 2% o 1% de incompatibilidades entre los nucleótidos complementarios (en otras palabras, por lo menos en aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de complementariedad). En otro ejemplo, las moléculas de ácido nucleico complementarios contienen a o aproximadamente por lo menos a aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de complementariedad. En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico complementarias contienen poco menos que 5, 4, 3, 2 o 1 de nucleótidos incompatibles. En un ejemplo, los nucleótidos complementarios son 100% de . complementariedad . Si es necesario, el. porcentaje de complementariedad se especificará. Típicamente las dos moléculas se seleccionan tal que se hibridaran específicamente bajo condiciones de alta severidad.
Como se usa en este documento, una hebra complementaria de una molécula de ácido nucleico se refiere a una secuencia de nucleótidos, por ejemplo molécula de ácido nucleico, se híbrida específicamente a la molécula, tal como la hebra opuesta a la molécula de ácido nucleico en . un dúplex de polinucleótidos . Por ejemplo, en un dúplex de polinucleótidos, la hebra complementaria de un oligonucleótido de hebra positiva es un oligonucleótido de hebra negativa que se híbrida específicamente al nucleótido de hebra positiva en un dúplex. En un< ejemplo de los métodos proporcionados, se usan reacciones . de polimerasa para sintetizar hebras complementarias de polinucleótidos para formar dúplex, comenzando típicamente al hibridar un cebador de oligonucleótido al polinuc.leótido .
Como se usa en este documento, "se 'hibridiza específicamente" se refiere a la combinación de pares de bases, mediante el pareo de bases complementario,, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido o polinucleótido) a otra molécula de ácido nucleico.. Aquellas personas de experiencia en la técnica están familiarizadas con los parámetros in vitro y in vivo que afectan la hibridación especifica, tal como longitud y composición de la molécula particular.' Los parámetros particularmente relevantes a la hibridación in vitro¦ incluyen además combinación de pares de bases y temperatura de lavado, composición de la solución amortiguadora y concentración de sal. No es necesario que las dos moléculas de ácido nucleico muestren 100% de complementariedad a fin de hibridarse específicamente entre sí. Por ejemplo, dos moléculas de ácido nucleico complementarias que comparten la complementariedad de secuencia, tal como en o aproximadamente por lo menos o aproximadamente 99%, 98%, -97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o' 50% de complementariedad, se pueden hibridar específicamente entre sí. Los parámetros, por ejemplo,, componentes de la solución amortiguadora,' tiempo y temperatura, usados en. los métodos de hibridación in vitro proporcionados en este ' documento, se. pueden ajustar en severidad para variar el porcentaje de complementariedad requerido para la hibridación especifica de dos moléculas de ácido nucleico. La persona experta puede ajustar fácilmente estos parámetros para lograr la hibridación especifica de una molécula de ácido, nucleico a una molécula de ácido nucleico objetivo apropiada para una aplicación particular.
Como se usa en este documento, "secuencia primaria" se refiere a la secuencia de residuos de aminoácido en. un polipéptido o la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico.
Como se usa en este documento, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud se puede basar en el grado de identidad de las secuencias de residuos y los residuos contenidos en la misma. Los' métodos para evaluar el grado de similitud entre las proteínas o ácidos nucleicos son conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, se alinean dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos en una forma que. produce un nivel máximo de identidad entre las secuencias. "Identidad" se refiere al grado al cual las secuencias de ¦ aminoácidos ¦ o nucleótidos son invariantes. La alineación de las secuencias de aminoácidos, y algún grado de las secuencias de nucleótidos, también pueden tomar en cuenta diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos) . Las diferencias conservadoras son aquellas que conservan las propiedades fisico-quimicas de los residuos implicados. Las alineaciones pueden ser globales (alineación de las secuencias comparadas sobre la longitud completa de las secuencias e incluyendo todos los residuos) o locales (la alineación de una porción de las secuencias que incluyen solamente la región o regiones más similares).
Como se usa en este documento, cúando una molécula de polipéptido o ácido nucleico o región de la misma contiene o tiene "identidad" u "homología" a otra molécula de polipéptido o ácido nucleico o región, las dos moléculas y/o regiones comparten mayor que o igual a aproximadamente 40% de identidad de secuencia, y mayor que típicamente o igual a aproximadamente 50% de identidad de secuencia, tal como por lo menos o aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,' 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia; el porcentaje específico de identidad puede especificar si es necesario. Una molécula de ácido nucleico, o región de la misma, que idéntica u homologa a una segunda molécula o región de ácido nucleico pueden hibridarse específicamente a una molécula o región de ácido nucleico que es 100 % complementaria a la segunda molécula o región de ácido nucleico. La identidad se puede comparar alternativamente entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos teóricas o entre una molécula de ácido nucleico o polipéptido y una secuencia teórica.
"Identidad" de secuencia, per. se, tiene un significado reconocido en la técnica- y el porcentaje de identidad de secuencia entre dos moléculas o regiones de ácido nucleico o polipéptido se pueden calcular usando técnicas publicadas. La identidad de secuencia se puede medir a lo. largo de la longitud completa de un polinucleótido o polipéptido o a lo largo de una región de la molécula. (véase, por ejemplo Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genoine Projects, Smith, D.W., ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of. Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, vpn Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Mientras que exista una variedad de métodos para medir la identidad entre dos polinucleotidos o polipéptidos , el término "identidad" es bien conocido por los artífices expertos (Carrillo,. H. & Lipman, D. , SIAM J Applied Math 48 : 1013 (1988) ) .
La identidad de secuencia comparada a lo largo de la longitud completa de dos polinucleótidos o polipéptidos se refiere al porcentaje de residuos de nucleótido o aminoácido idéntico a lo largo de la longitud completa de la molécula. Por ejemplo, si urt polipéptido A tiene 100 aminoácidos y el polipéptido B tiene 95 aminoácidos, los cuales, son idénticos a los aminoácidos 1-95 del polipéptido A, entonces el polipéptido B tiene 95 % de identidad cuando la identidad de secuencia se compara a lo largo de la longitud completa de un polipéptido A comparado¦ con la longitud completa con un polipéptido B. Alternativamente, la identidad de secuencia entre un polipéptido A y polipéptido B se puede comparar a lo largo de una región, tal como una región análoga de 20 aminoácidos, de cada polipéptido. En este caso, si el polipéptido A y B tienen 20 aminoácidos idénticos a lo largo de la región, la identidad de secuencias para las regiones es de 100%. Alternativamente, la identidad de secuencias se puede comparar a lo largo de la longitud de una molécula, comparada con la región de otra molécula. Alternativamente, la identidad de secuencia entre el polipéptido A y el polipéptido B se puede . comparar a lo largo de la misma longitud del polipéptido pero con los reemplazos de aminoácidos, tal como los reemplazos dé aminoácidos conservadores o reemplazo de aminoácidos no conservadores.
Como se plantea posteriormente, y se sabe ' por' aquellas personas de experiencia en la técnica, varios programas y métodos para evaluar la identidad son conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica. Los altos niveles de identidad, tales como 90% o 95% de identidad, se pueden determinar fácilmente sin software.
Si cualquiera de dos moléculas de ácido nucleico tienen secuencias de nucleótidos que son por lo menos . o aproximadamente 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, '97%, 98% o 99% "idénticas" se puede determinar usando algoritmos de computadora conocidos tal como el programa "FASTA"', que usa por ejemplo, los parámetros por omisión como en Pearson. y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci USA 85 : 2444 (otros programas incluyen el paquete del programa GCG ' ( Devereux, J. y colaboradores. (1984) Nucleic Acids Research 12(1) :387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S . F. y colaboradores (1990) J. Molec. Biol. 215:403; Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carrillo y colaboradores (1988) - SIAM J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, la función .BLAST de la base de datos de la información del Centro Nacional para Biotecnología se puede usar para determinar la identidad. Otros programas comercial o públicamente disponibles incluyen, programa "MegAlign" Enastar (Madison, WI) y el programa "Gap" del. Grupo de Computadora de Genética de la Universidad de Wisconsin (UWG) (Madison WI)). El porcentaje de homología o identidad de las proteínas y/o moléculas de ácido nucleico se puede determinar, por ejemplo, al comparar la información de secuencia usando un programa de computadora GAP. (por ejemplo, Needleman y colaboradores (1970) J. Mol. Biol. 48:4.43, como es revisado por Smith y Waterman ((1981) Adv. Appl . Math. 2:482). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácido) , que son similares divididos por el número total de símbolos en la parte más corta de las dos secuencias. Los parámetros por omisión' para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y colaboradores (1986) Nucí. Acids Res. 14:6745, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds . , ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358 (1979); (2) una .penalización de 3.0 para cada espacio y una penalización de 0.10 adicional para cada símbolo en cada espacio; y (3) sin penalización para espacios finales.
En general,, para la determinación del porcentaje de identidad de secuencia, las secuencias se alinean para que se obtenga la compatibilidad de orden más alto (véase, por ejemplo Computational. Molecular Biology, Lesk, A. ., ed. , Oxford University Press, New ' York, 1988; BLocomputing: Informatics y Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., y Griffin, H. G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J. , eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo y colaboradores (1988) SLAM J Applied Math 48:1073) . Para, la identidad de secuencia, el número de aminoácidos conservados se determina por programas de algoritmo de alineación estándar, y sé pueden usar con penalizaciones de espacio- por omisión establecidos por cada proveedor. Sustancialmente las moléculas de ácido nucleico homologas se hibridan específicamente de manera típica en severidad moderada o en alta severidad a lo largo de la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de los codones en la hibridación en la molécula de ácido nucleico.
Por lo tanto, el término "identidad" cuando se asocia con un número particular, representa una comparación entre las secuencias de un primer y un segundo polipéptido o polinucleótidos o regiones de los mismos y/o entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos teóricas. Como se usa en este documento, el término "90% idéntica a" se refiere al porcentaje de identidades de 90% o 99.99 relativo a la primera secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos del polipéptido. La identidad de un nivel del 90% o más es indicativa del hecho de que, asumiendo los propósitos de ej emplificación, un primer y segundo longitud de polipéptido de 100 aminoácidos se compara, no más de 10% (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el primer polipéptido que difiere de aquel del segundo polipéptido. Se pueden hacer comparaciones similares entre el primer y segundo polinucleótidos. Estas diferencias entre la primera.- y segunda secuencias se pueden representar como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente sobre la longitud completa de un polipéptido o se pueden agrupar en una o más ubicaciones de longitud variante hasta el máximo permisible, por ejemplo diferencia de 10/100 .aminoácidos (aproximadamente 90 % de identidad) . Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones, adiciones o supresiones de residuos de nucleótido o aminoácido. En el nivel de homologías o identidades arriba de aproximadamente 85-90%, el resultado es independiente del programa y el ajuste de los parámetros de espacio; estos altos niveles de identidad se pueden valuar fácilmente, frecuentemente por la alineación manual sin depender del software..
Como se usa en est.e documento, la alineación de una secuencia se refiere al uso de homología para alinear dos o más secuencias de. nucléótidos o aminoácidos. Típicamente, se alinean dos o más secuencias que se relacionan por 50% o más de identidad. Un conjunto alineado de secuencias se refiere a dos o más secuencias que se alinean en posiciones correspondientes y pueden incluir secuencias de alineación derivadas de RNAs, tales como ESTs y otros cDNAs , ' alineados con la secuencia de DNA genómico.
Las moléculas de polipéptido o ácido nucleico relacionados o variantes se pueden alinear mediante' cualquier método conocido por aquellas personas de ' experiencia en la técnica. Estos . métodos maximizan típicamente las compatibilidades, e incluyen métodos, tales como el uso de alineaciones manuales y mediante el uso de los programas de alineación numerosos disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica. Al alinear las secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos, una persona experta · en la técnica puede identificar porciones o posiciones análogas, usando residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. Además, una persona experta en la técnica también puede ampliar residuos de aminoácido o nucleótido conservados como guías para encontrar los residuos de aminoácidos o- nucleótidos correspondientes entre las secuencias humanas y no humanas. Las posiciones correspondientes también se pueden basar en alineaciones estructurales, por ejemplo al usar alineaciones simuladas por computadora de la estructura de la proteina. En otros casos, se pueden identificar regiones correspondientes. Una persona experta en la técnica también .'puede emplear residuos de aminoácidos conservados como guias para encontrar los residuos de aminoácidos correspondientes entre las secuencias humanas y. no humanas.
Como se usa en este documento, las porciones, posiciones o regiones "análogas" .· y "correspondientes" son porciones, posiciones o regiones que se alinean entré si en la alineación de dos o más secuencias de polipéptidos . o ácidos nucleicos relacionadas (incluyendo secuencia de moléculas, regiones, de moléculas y/o secuencias teóricas) de modo que se obtiene el orden más alto de compatibilidad, usando un método de alineación conocido por aquellas personas de experiencia en la técnica para maximizar las compatibilidades. En otras palabras, dos posiciones análogas (o porciones o regiones) se alinean en la alineación mejor adaptada de dos o ' más frecuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos. Las porciones/posiciones/regiones análogas se identifican con base en la posición a lo largo de la secuencia lineal de ácido nucleico o aminoácidos cuando las dos o más secuencias se alinean. Las porciones análogas no necesitan compartir una similitud de secuencia entre si . Por ejemplo, · la alineación (tal que maximiza las compatibilidades) de las secuencias de las dos moléculas de ácido nucleico homologas, cada 100 nucleótidos e " longitud, pueden revelar que 70 de los 100 nucleótidos son idénticos. Las porciones de estas moléculas de ácido nucleico contienen algo o todos los 30 aminoácidos no idénticos, que son porciones análogas qué no comparten identidad de .secuencia. Alternativamente, las porciones análogas pueden contener algún porcentaje de identidad, de secuencia entre si, tal como aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o fracciones de los mismos. En un ejemplo, las porciones análogas son 100 % idénticas .
Como se usa en este documento, una. "modificación" es en referencia a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o de una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye supresiones, inserciones, y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Los métodos, para modificar un polipéptido son de rutina para aquéllas personas de experiencia en la técnica, tal como al usar metodologías de ?? récombinante .
Como se usa en este documento, "supresión", cuando se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos , se refiere a la supresión de uno o más nucleótidos o aminoácidos comparados con una secuencia, tal como un polinucleótido o' polipéptido objétivo o una secuencia nativa o de tipo natural.
Como se usa en este documento, "inserción" cuando se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos, describe la inclusión de uno o más nucleótidos o aminoácidos adicionales, dentro de una secuencia relacionada objetivo, nativa, de tipo natural u otra. De esta manera, una molécula de ácido nucleico que contiene una o más inserciones comparada con una secuencia de tipo natural, contiene uno o más nucleótidos adicionales dentro de la longitud lineal de la secuencia. Como se usa en este documento, "adiciones", a las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos describe la adición de nucleótidos o aminoácido en cualquier, terminal comparada con otra secuencia.
Como se usa en este documento, "sustitución" se refiere al reemplazo de uno o. más nucleótidos o aminoácidos en la secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos nativa> objetivo, de tipo natural u otra con un . nucleótido o aminoácido alternativo, sin cambiar la longitud (como se describe números de residuos) de lá molécula. De esta manera, una o más sustituciones en una molécula no cambian el número de residuos de aminoácidos o nucleótidos de la molécula. Las mutaciones de sustitución comparadas con un polipéptido particular se pueden expresar en términos del número de residuo de aminoácido a lo largo de la longitud de la secuencia de polipéptidos . Por ejemplo, un polipéptido modificado que tiene una modificación en el aminoácido en la posición 19 de la secuencia de · aminoácidos que es una sustitución de Isoleucina (lie; I) para cisteina (Cys; C) se puede expresar como I19C, Ilel9C, o simplemente C19, para indicar que el aminoácido, en la posición 19 modificada es una cisteina. En este ejemplo, la molécula que tiene la sustitución tiene ' una . modificación en lie 19 del polipéptido no modificado.
Como se usa en este documento, una propiedad de enlace es una característica de una molécula, por ejemplo un polipéptido, relacionándose a sí o no, y como, se enlaza a uno o más compañeros de enlace. Las propiedades de enlace incluyen la capacidad de enlazarse al (los) socio (s) de enlace, la afinidad en la cual se enlaza al compañero de enlace (por ejemplo alta afinidad), la avidez con la cual se enlaza al compañero de enlace, la resistencia del enlace con el compañero de enlace y la especificidad para enlazarse con el compañero de enlace.
Como se usa en este documento, la afinidad describe la resistencia de la interacción entre dos o más moléculas, tales como compañeros de enlace, típicamente la resistencia de las interacciones no covalentes entre dos compañeros de enlace. La afinidad de un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo para un epítopo de antígeno es la medición de la resistencia de las interacciones no covalentes totales entre un solo sitio de combinación de anticuerpos y el epítopo. La interacción de anticuerpo-antígeno de baja afinidad es débil, y las moléculas tienden a desasociarse rápidamente, mientras que el enlace de anticuerpo-antígeno de alta afinidad es fuerte y las moléculas permanecen enlazadas durante una cantidad de tiempo más prolongada. Los métodos para calcular la afinidad son bien conocidos, tales como métodos para determinar las constantes de asociación/disociación. La afinidad se puede evaluar empíricamente o las afinidades se¦ pueden, determinar comparativamente, al comparar la · afinidad de un anticuerpo y otro anticuerpo para un antígeno particular.
Como se usa en este documento, la avidez del anticuerpo se refiere a la resistencia de múltiples interacciones entre un anticuerpo multivalente y su antígeno cognado, tal como con anticuerpos que contienen múltiples sitios de enlace asociados con un antígeno con epítopos de repetición o un arreglo de epítopos. Un anticuerpo con alta avidez tiene una mayor resistencia de estas interacciones comparado con un anticuerpo de baja avidez-.
Como se usa en este documento, "enlazar" se refiere a la participación de una molécula en cualquier interacción atractiva con otra . molécula, dando por resultado una asociación estable en la cual las dos moléculas están en proximidad cercana entre sí. El enlace incluye, pero no se limita a, enlaces no covalentes, enlaces covalentes. (tales como enlaces covalentes reversibles e irreversibles), e incluye interacciones entre las moléculas tales como, pero no se limitan a, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, y moléculas pequeñas, tales como compuestos químicos incluyendo fármacos. Ejemplares de enlace son interacciones de antígeno a , anticuerpo e interacciones de ligando a receptor. Cuando ' un anticuerpo se "enlaza" a' un antígeno particular, el enlace se refiere al reconocimiento específico del antígeno por el anticuerpo, a través de la interacción de anticuerpo-antígeno cognado, en los sitios de combinación de anticuerpos. El enlace también puede incluir la asociación de múltiples cadenas en ün polipéptido, . tales como cadenas de anticuerpos que interactúan a través, de los enlaces de disulfuro.
Como se usa en este, documento, "constante de afinidad" se refiere a una constante de asociación (Ka) usada para medir la afinidad de un anticuerpo para un antigeno. Mientras es mayor la constante .de afinidad es mayor la' afinidad del anticuerpo para el antigeno. Las constantes de afinidad se expresan en unidades de modalidad reciproca (es decir "1)· y se pueden calcular de la constante de velocidad para la reacción de asociación-disociación como es medida- por la metodología cinética estándar para reacciones de anticuerpos (por ejemplo, inmunoensayos , resonancia de plasmones superficiales, u otros ensayos de interacción cinética conocidos en la técnica) .
Como se usa en este documento, el término "el mismo" cuando se usa en referencia con la afinidad de enlace al anticuerpo, significa que la constante de asociación (Ka) está dentro de aproximadamente 1 a 100. veces o 1 a 10 veces del anticuerpo de referencia (1-100 veces mayor afinidad o 1-100 veces menor afinidad, o cualquier valor o intervalo numérico o valor dentro de estos intervalos, que el anticuerpo de referencia) .
Como se usa en este documento, "sustancialmente el mismo" cuando se usa con la constante de asociación (Ka), significa que la constante de asociación está' dentro de aproximadamente 5 a 5000 veces mayor o menor que la constante de asociación, Ka, del anticuerpo de referencia (5-5000 veces mayor o 5-5000 veces menor que el anticuerpo de referencia) . La afinidad de enlace de un anticuerpo también se. puede expresar como una constante de. disociación, o Kd. La constante de disociación es lo recíproco de la constante de asociación, Kd = I/Ka.
Como se usa en este documento, la frase "que' tiene la misma especificidad de enlace" cuando se usa para describir el anticuerpo en referencia a otro anticuerpo, significa que el anticuerpo se enlaza específicamente (se enlaza inmunoespecíficamente o se enlaza específicamente al virus) a todo o parte del mismo epítopo antigénico como el anticuerpo de referencia. De esta manera, un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace antígeno del .mismo que tiene la misma especificidad de enlace como el anticuerpo indicado como 58c5 se enlaza específicamente a todo o una parte del mismo epítopo como el anticuerpo anti-RSV o fragmento .de enlace antígeno del mismo indicado como 58c5. El epítopo puede estar en la proteína aislada o en la proteína en' el virus. La capacidad de dos anticuerpos de enlazarse al mismo epítopo se puede determinar mediante ensayos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, ensayo de resonancia de plasmones superficiales y ensayos de competición de anticuerpos. Típicamente, los anticuerpos que se¦ enlazan inmunoespecíficamente al mismo epítopo pueden competir para enlazarse al epítopo, lo cual se puede medir, por ejemplo, mediante un ensayo de competición de enlace in vitro (por ejemplo, ELISA de competición) , usando técnicas conocidas en el campo. Típicamente, un primer anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente al mismo epítopo como un segundo anticuerpo puede competir para enlazarse al¦ epítopo por aproximadamente o 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,' 95%, 100%, donde el porcentaje de competición es la capacidad medida del segundo anticuerpo de desplazar el enlace del primer anticuerpo al epítopo. En los ensayos de competición ejemplares, el antígeno se incuba en presencia de una dilución limitante predeterminada de un anticuerpo etiquetado (por ejemplo, 50-70% de concentración de saturación) , y diluciones en serie de un anticuerpo de competición no etiquetado. La competición se determina al medir el enlace del anticuerpo etiquetado al antígeno para cualquier disminución en el enlace en presencia del anticuerpo de competición. Las variaciones de estos ensayos incluyendo varias técnicas de etiquetado y métodos de detección que incluyen, por ejemplo, detección radiométrica, fluorescente, enzimática y colorimétrica, son conocidas en el campo. La capacidad de un primer anticuerpo de enlazarse al mismo epítopo como un segundo anticuerpo también se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de neutralización de virus usando Mutantes Resistentes a Anticuerpos Monoclonales (MARMs) . Por ejemplo, donde un primer anticuerpo anti-RSV neutraliza el RSV de tipo natural pero no un RSV mutante particular, un segundo anticuerpo que neutraliza el RSV de tipo natural pero no RSV mutante particular se enlaza en general al mismo epitopo al RSV como el primer anticuerpo. Donde un primer anticuerpo. anti-RSV neutraliza el RSV de tipo natural pero no un RSV mutante particular, un segundo anticuerpo que neutraliza el RSV de tipo natural y el RSV mutante particular no se enlaza en general al mismo epitopo al RSV como el primer anticuerpo.
Como se usa en este documento, un "mutante resistente a anticuerpos monoclonales" (MARM) también referido como un "mutante de escape de anticuerpo monoclonal" es un virus sincitial respiratorio (RSV) mutante que muestra resistencia incrementada a la neutralización por un anticuerpo, monoclonal que neutraliza el virus RSV de tipo natural. En la práctica, la concentración, de anticuerpos necesaria para neutralizar 50% de un MARM de RSV debe ser al menos alrededor de o al menos 10 veces mayor que aquella requerida para neutralizar una cantidad equivalente de partículas infecciosas de virus de tipo natural de referencia para que se considere que el MARM haya escapado del anticuerpo.
Los MARMs son generados al cultivar RSV de tipo natural en presencia de un anticuerpo monoclonal sobre . corridas sucesivas de replicación. viral en presencia del anticuerpo tal que después de cada corrida sucesiva de replicación del virus, son requeridas concentraciones de incremento de anticuerpos para producir efectos de neutralización de virus. Los efectos citopáticos (CPE) se observan solamente en presencia de concentraciones de incremento de anticuerpos hasta que resulta que un virus mutante ya no se neutraliza eficientemente por el anticuerpo. Si más . corridas de replicación son requeridas para la emergencia de un MARM en presencia de un primer anticuerpo comparado con un segundo anticuerpo, se puede concluir que el primer anticuerpo se enlaza a un epitopo que es diferente del epitopo al cual el segundo anticuerpo se enlaza. Si un primer anticuerpo puede neutralizar un MARM generado contra un segunde anticuerpo, puede concluir que los anticuerpos se enlazan específicamente a o interactúan con diferentes epítopos. Los MARMs pueden mapear más finamente un epitopo de enlace a antigeno de un anticuerpo como es comparado con un ensayo de enlace de competición, tal que un anticuerpo puede competir contra otro para enlazarse a un antígeno, pero aún puede neutralizar el MARM de su competidor. Para algunos anticuerpos, solamente se requiere de unas cuantas rondas de selección para generar un MARM; para¦ otros anticuerpos son requeridas más rondas. Para determinados anticuerpos aqui proporcionados, no se generan ningunos MARMS después de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 o más rondas. En algunos casos, no es posible generar un MARM.
Como se usa en este documento, .EC50 se refiere a la concentración efectiva en la cual un anticuerpo" puede inhibir 50% de infección por virus en un ensayo de neutralización in vitro, tal como, por ejemplo, un ensayo de reducción de placas de virus como es descrito en este documento (por ejemplo, un ensayo de reducción de placas usando células hospederas Vero u otra célula hospedera para infección) u otros ensayos de neutralización de virus conocidos en la técnica. Típicamente, un virus neutralizante es uno que tiene una EC50 de 2 nM o menos para inhibición del virus en un ensayo de neutralización in vitro, tal como un ensayo de reducción de placas de virus.
Como se usa en . este documento, "compañero de enlace" se refiere a una molécula (tal como un polipéptido, lípido, glicolípido, molécula de ácido nucleico, carbohidrato u otra molécula) , con la cual otra molécula interactúa específicamente, por ejemplo, a través de interacciones covalentes y no covalentes, tal como la interacción, de un anticuerpo con un antígeno cognado. El compañero de enlace puede producirse natural o sintéticamente. En un ejemplo,, los péptidos variantes deseados se seleccionan usando ' uno o más compañeros de enlace, por ejemplo, usando métodos in vitro o in vivo. Ejemplar de los métodos in vitro incluyen la selección usando un compañero de enlace acoplado a un soporte sólido, tal como una cuenta, placa, columna, matriz u otros soportes sólido; o un compañero de enlace acoplado a otra molécula seleccionable, tal como una molécula de biotina, seguido por la selección subsecuente al acoplar la otra molécula seleccionable a un soporte sólido. Típicamente, ' los métodos in vitro incluyen etapas de lavado para remover los polipéptidos no enlazados, seguido con la elución del polipéptido ( s ) variante (s) seleccionado. El proceso se puede repetir una o más veces en un proceso interactivo para seleccionar polipéptidos variantes de entre los polipéptidos seleccionados.
Como se usa en este documento, un enlace de disulfuro (también llamado un enlace S-S o un puente de disulfuro) es un solo enlace covalente derivado del acoplamiento de grupos tiol. Los enlaces de disulfuro en las proteínas se forman entre los grupos tiol de residuos de cisteína, y estabilizan las interacciones entre los dominios de polipéptido tales como los dominios de anticuerpo.
Como se usa en este documento, "acoplado" o "conjugados" significa unido a través de una interacción covalente o no covalente.
Como se usa en este documento, la frase "conjugado a un anticuerpo" o "ligado a un anticuerpo" o variaciones gramáticas de los mismos, al referirse a la unión de una porción a un anticuerpo o fragmentos de enlace antigeno del mismo, tal como una porción de diagnóstico o terapéutica, significa que la porción se une al anticuerpo o fragmento de enlace antigeno del mismo mediante cualquier medio conocido para ligar péptidos, tales como, por ejemplo, mediante la producción de la proteina de fusión por medios recombinantes o postraduccionalmente por medios, químicos. La conjugación puede emplear cualquier variedad de agentes de enlace para efectuar la conjugación, incluyendo, pero no limitado a, ligaduras de péptido o compuestos o agentes reticuladores químicos.
Como se usa en este documento, "despliegue de fagos" se refiere a la expresión de polipéptidos en la superficie del bacteriófago filamentoso.
Como se usa en este documento, una "célula compatible" de despliegue de fagos o "célula hospedera compatible de despliegue de fagos" es una célula hospedera, típicamente una célula hospedera bacteriana, que se puede infectar por el fago y de esta manera . puede soportar la producción de proteínas de fusión de despliegue de fagos que contiene polipéptido, por ejemplo, polipéptidos variantes y de esta manera se puede usar para el despliegue de fagos. Ejemplar de células compatibles de despliegue de fagos incluyen, pero no se limitan a, células XLl-azul.
Como se usa en este documento, "inmunoplaqueteo" se refiere a un procedimiento de selección basado en afinidad para el aislamiento del despliegue- de fagos de una molécula con una especificidad para un compañero de enlace, por ejemplo, una molécula de captura (por ejemplo, un antigeno)¦ o secuencia de aminoácidos o nucleótidos o epitopos, región, porción o sitio en el mismo.
Como se usa en este documento, "proteína de expresión" o "proteína de expresión de paquete genético" ¦ significa cualquier polipéptido de paquete genético para la expresión de un polipéptido en el paquete genético, tal que cuando la proteína de expresión se fusiona a (por ejemplo,, incluido como parte de una proteína de fusión con) un polipéptido de interés (por ejemplo, un polipéptido por el cual la expresión reducida se desea) , el polipéptido se expresa en la superficie exterior del . paquete genético. La proteína de expresión está presente típicamente sobre o dentro de la superficie exterior o' compartimiento exterior del paquete genético (por ejemplo, membrana, pared celular, .recubrimiento u otra superficie exterior o compartimiento) de un paquete genético, por ejemplo un paquete genético viral, tal como un fago, tal que en la fusión a un polipéptido de interés, el polipéptido se expresa sobre el paquete genético.
Como se usa en este documento, una , proteina de recubrimiento es . una proteina de expresión, por lo menos una porción de la cual se presenta en la superficie exterior del paquete genético, tal que cuando se fusiona al polipéptido de interés, el polipéptido se expresa .sobre la superficie exterior del paquete genético. Típicamente, las proteínas de recubrimiento son proteínas de recubrimiento virales, tales como proteínas de . recubrimiento en fago. Una proteina de recubrimiento viral, tal como una proteína de recubrimiento en fago se asocia con la partícula de virus durante- el ensamble en una célula hospedera. En un ejemplo, las proteínas de recubrimiento se usan en este documento para expresar los polipéptidos sobre los paquetes genéticos; las proteínas de recubrimiento se expresan como porciones de proteína de fusión, que contienen las secuencias de. proteínas de recubrimiento de los aminoácidos y una secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado. La proteína de recubrimiento puede ser una proteína de recubrimiento de longitud completa o cualquier porción de la misma, capaz de efectuar la expresión del polipéptido sobre la superficie del paquete genético.
Ejemplos de proteínas de recubrimiento, son las proteínas de recubrimiento en fago, tales como, pero no se limitan a, (i) proteínas de recubrimiento menores de fago filamentoso, tal como proteína del gen III (glllp, cp3) , y (ii) proteínas de recubrimiento mayores (que están presentes en el recubrimiento viral en 10 copias o más, , por ejemplo, decenas, cientos o miles de copias) de fago filamentoso tal como proteína del gen VIII (gVIIIp, cp8); las fusiones a otras proteínas de recubrimiento en fago tales como proteína del gen VI, proteína del gen VII, o proteína del gen IX (véase, por ejemplo, el documento WO 00/71694); y porciones (por ejemplo, dominios o fragmentos) de estas proteínas, tales como, pero no se limitan a dominios que se incorporan establemente en la partícula de fago, por ejemplo. tal como el dominio de anclaje de glllp, o gVIIIp. Adicionalmente , se pueden usar imitantes de gVIIIp que se optimizan para l expresión de péptidos más grandes, tales como imitantes que tienen propiedades de expresión superficial mejoradas, tal como mutante gVIIp (véase, por ejemplo Sidhu y colaboradores (2000) J. Mol. Biol. 296:487-495).
Como se usa en este documento,, "enfermedad o trastorno" se refiere a una afección patológica en un organismo que resulta de la causa o afección que incluye, pero no; se limita a, infecciones, afecciones adquiridas, afecciones genéticas, y caracterizadas por síntomas identificables . Las enfermedades y trastornos de interés en este documento son aquellas que implican la . infección por RSV o aquellas que incrementan el riesgo de una infección por RSV.
Como se usa en este documento, "infección" e "infección por RSV" se refiere a todas las etapas de un ciclo de vida del RSV en un hospedero (incluyendo, pero no limitado a la invasión por y replicación del RSV en una célula o tejido corporal), así como también el estado patológico que resulta de la invasión por y replicación de un RSV. La invasión por y multiplicación de un RSV incluye, pero no se limita a, las siguientes etapas: el acoplamiento de la partícula- de RSV a una célula, fusión de un virus con una membrana celular, la introducción de información genética viral en una célula, la expresión de proteínas de RSV la producción de nuevas partículas de RSV y la liberación de partículas de RSV de una célula. Una infección por RSV puede ser una infección por RSV del tracto respiratorio superior (URI ) , una infección por RSV del tracto respiratorio inferior (LRI), o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, el estado patológico que resulta de invasión .por y replicación de un¦ RSV es una enfermedad aguda por RSV.
Como se usa en este documento, "enfermedad aguda por RSV" se refiere a la enfermedad clínicamente significativa en los pulmones o tracto respiratorio inferior como' resultado de una infección por RSV, que puede manifestarse como neumonía y/o bronquiolitis, donde estos síntomas pueden incluir, por ejemplo, hipoxia, apnea, dificultad respiratoria, respiración rápida, jadeo y cianosis. La enfermedad por' RSV aguda requiere que un individuo afectado obtenga intervención médica, tal como hospitalización, administración de oxígeno, intubación y/o ventilación.
Como se usa en este documento, "tratar" un sujeto con una enfermedad o condición significa que los síntomas del sujeto se alinean parcial o totalmente, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por consiguiente el tratamiento abarca profilaxis, , terapia y/o cura. La profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o una prevención de empeoramiento de síntomas o progresión de. una enfermedad. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de cualquier anticuerpo o fragmento de enlace a ántígeno del mismo proporcionado o composiciones proporcionadas en este documento.
Como se usa en este documento, "prevención" o profilaxis, y formas gramáticamente equivalentes de los mismos, se refiere a métodos en los cuales el riesgo de desarrollar una enfermedad o condición se reduce.
Como se usa en este documento, un "agente farmacéuticamente efectivo" incluye cualquier agente terapéutico o agentes bioactivos, incluyendo, pero no limitado, por ejemplo, anestésicos, vasoconstrictores, agentes dispersantes, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos de moléculas pequeñas y proteínas terapéuticas.
Como se usa en este documento, un "efecto terapéutico" significa un efecto que resulta de tratamiento de . un sujeto que altera, mejora o alivia típicamente los síntomas de una enfermedad o condición o que cura una enfermedad o condición.
Como se usa en este documento, una ¦ "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "dosis terapéuticamente efectiva" se refiere a' la cantidad de un agente, compuesto, material, o composición que contiene un compuesto que es por lo menos suficiente para producir un efecto terapéutico después de la administración a un sujeto. Por consiguiente, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, aliviar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad . o trastorno.
Como se usa en este documento, "eficacia terapéutica" se refiere a la capacidad de un agente, compuesto, material, o composición que contiene un compuesto para producir un efecto terapéutico en un sujeto a quien el agente, compuesto, material, o composición que contiene un compuesto se le ha administrado.
Como se usa en este documento, una "cantidad profilácticamente efectiva" o una "dosis profilácticamente efectiva" se refiere a la cantidad de una agente, compuesto, material, o composición que contiene un compuesto que cuando se administra un sujeto, tendrá . el efecto, profiláctico compuesto, por ejemplo, previene o retrasa el principio, o recurrencia, de la enfermedad o síntomas 'o reduce la incidencia de infección viral. El efecto ' profiláctico completo no se lleva a cabo necesariamente por la administración de una dosis, y puede, llevarse, a cabo solamente después de la administración de. una serie de dosis. De esta manera, una cantidad profilácticamente efectiva se puede administrar en una ó más administraciones.
Como se usa en este documento, los términos "inmunoterapéuticamente" o "inmunoterapia" en conjunción con los anticuerpos proporcionados indica la administración profiláctica así como también terapéutica. De esta manera, los anticuerpos terapéuticos . proporcionados se pueden administrar a un sujeto en riesgo de contraer una infección por virus (por ejemplo, una infección por RSV) a fin de disminuir la probabilidad y/o gravedad de la enfermedad, o se puede administrar a sujetos ya que muestran infección activa por virus (por .ejemplo, una infección por RSV) .
Como se usa en este documento, la mejora de los síntomas de una enfermedad o trastorno particular' mediante un tratamiento, tal como , la administración de una' composición farmacéutica u otra composición terapéutica, se .refiere a cualquier disminución, ya sea permanente o temporal, de larga duración o transitoria, de los síntomas que se pueden atribuirse a o . asociar con la administración de la composición o producto terapéutico.
Como se usa en este documento, el término cantidad "diagnósticamente efectiva" se refiere a' la cantidad de un agente, compuesto, material o composición que contienen un compuesto detectable que es por lo menos, suficiente para la detección del compuesto después de la administración de un sujeto. En general, una cantidad diagnósticamente efectiva de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace antígeno. del mismo, tal como, un anticuerpo detectablemente etiquetado o fragmento de enlace antígeno del mismo o un anticuerpo o fragmento de enlace antígeno del mismo que se puede detectar por un agente secundario, administrada a un sujeto para la detección es la cantidad del anticuerpo o fragmento de ' enlace antígeno del mismo que es suficiente para permitir la detección del sitio que tiene el antígeno de. RSV por lo cual en anticuerpo o fragmento de enlace antígeno del mismo es específico. Al usar los anticuerpos proporcionados en este documento para la detección in vivo del antigeno, . un anticuerpo detectablemente etiquetado o fragmento de enlace a antigeno del mismo se proporciona en una dosis que es diagnósticamente efectiva.
Como se usa en este documento, una etiqueta o porción detectable es un marcador detectable (por ' ejemplo, una molécula fluorescente, . molécula quimioluminiscente, una molécula bioluminiscente, un agente de contraste (por ejemplo, un metal) un radionúclido, un cromóforo, un péptido detectable o un enzima que cataliza la formación de un producto detectable) que se puede unir o enlazar directa o indirectamente de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a . antigeno del mismo proporcionado en este documento) o se asocia con los mismos y se puede detectar in vivo y/o in vitro. El método de detección puede ser cualquier método conocido- en el campo, incluyendo métodos de detección in vivo y/o in vitro conocidos (por ejemplo, formación de imágenes mediante la inspección visual, espectroscopia de resonancia magnética (MR), señal de ultrasonido, rayos X, espectroscopia de rayos gamma (por ejemplo, exploración de tomografia de emisión de positrones (PET), tomografia computarizada de emisión de fotón único (SPECT) , espectroscopia de fluorescencia o absorción) . La detección indirecta se refiere a la medición de un fenómeno físico, tal como energía o emisión o' absorción de partículas, de un átomo, molécula o composición que se enlaza directa o indirectamente a la porción detectable (por ejemplo, detección de un anticuerpo secundario etiquetado o fragmento de enlace a antígeno del mismo que se enlaza a un anticuerpo primario (por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento) .
Como se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un ser humano .
Como se usa en este documento, un paciente se refiere a un paciente humano.
Como se usa en este documento, animal incluye cualquier animal, tal como, pero no se limitan a primates incluyendo a humanos, gorilas y monos; roedores, tales como' ratones y ratas; aves, tales como pollos, rumiantes, tales como cabras, vacas, venados, oveja; bovinos, tales como cerdos y otros animales. Animales no humanos excluyen humanos como el animal contemplado. Los polipéptidos proporcionados en este documento son de cualquier fuente, animal, vegetal, procariótica y fúngica. La mayoría de polipéptidos son de origen animal, incluyendo origen mamífero.
Como se usa en este documento, un "anciano" se refiere a un sujeto, quien- debido a la edad tiene una respuesta inmunitaria disminuida y tiene una respuesta a la vacunación disminuida. Típicamente, un sujeto anciano es uno que es humano que es de 65 años de edad y mayor, más típicamente, 70 años de edad y mayor.
Como se usa en este documento, un "bebé humano" se refiere a un humano menor' que o de aproximadamente 24 meses (por ejemplo, menor que o de aproximadamente 16 meses, menor que o de aproximadamente 12 meses, menor que . o de aproximadamente 6 meses, menor que o de aproximadamente 3 meses, menor que o de aproximadamente 2 meses, o menor que o aproximadamente de 1 mes de edad). Típicamente,- el bebé humano nace en más de 38 semanas de edad gestacional.
Como se usa · en este documento, un "bebé humano prematuramente nacido" se refiere a un humano nacido en menos de o aproximadamente 40 semanas de edad gestacional, típicamente, menos de o aproximadamente 38 semanas de. edad gestacional.
Como se usa en este documento, una "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y se empacan individualmente como es conocido en el campo.
Como se usa en este documento, una "formulación de dosificación individual" se refiere a una formulación para la administración directa.
Como se usa en este . documento, un "artículo de manufactura" es un producto que se hace y se vende.. Como se usa por toda esta solicitud, el término se propone para abarcar cualquiera de las composiciones proporcionadas en este documento contenido en los¦ artículos de empaquetamiento.
Como se usa en este documento, un ."fluido" se refiere a cualquier composición que puede fluir.' Los fluidos abarcan de esta manera composiciones que están en la forma de semisólidos, pasta, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones.
Como se usa en este documento, un polipéptido o proteína aislados o purificados (por ejemplo un anticuerpo aislado o fragmento de enlace a antígeno del mismo) o porción biológicamente activa del mismo (por ejemplo un fragmento de enlace a antígeno aislado) . está sustancialmente libre' de material celular u otras proteínas contaminantes de la' célula o tejido del cual, la proteína se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Las . preparaciones. sé pueden determinar para estar sustancialmente libres si se . presentan sin impurezas fácilmente detectables- como es determinado por métodos de análisis estándares, tales como cromatografía de capa delgada (TLC), electroforesis . en gel y cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC.) , usados por aquellos de experiencia en el campo para evaluar esta pureza, o suficientemente pura tal que la purificación adicional no altera detectablemente las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y o biológicas, de la sustancia. Los métodos para purificación de los compuestos para producir compuesto sustancialmente de manera química puros son conocidos por aquellas personas de éxperiencia en el campo. Un compuesto sustancialmente de manera química puro, sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros . En tales casos, la purificación adicional podría incrementar la actividad específica del compuesto. Como se usa en este documento, un "extracto celular" o "lis do" se . refiere a una preparación o fracción, que se hace de una célula- lisada o alterada.
Como se usa en este documento, la molécula de ácido nucleico aislada es . una que se separa de otras moléculas de ácido nucleico que' están presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. Una' molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de cDNA, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes , . o sustancialmente libre de precursores químicos ' u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Moléculas de ácido nucleico aisladas ejemplares proporcionadas en · este' documento incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo o fragmentos de enlace a .. antigeno proporcionados.
Como se usa en este documento, un "control" se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con el parámetro de prueba, o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado con la condición de interés. Un control también puede ser un control interno.
Como se usa en este documento, una "composición" se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuosa o no acuosa, o cualquier combinación de los mismos. .
Como se usa en este documento, una "combinación" se refiere a cualquier asociación entre dos o más artículos. La combinación puede ser dos o más artículos separados, tal como dos composiciones o dos recolecciones, pueden ser una mezcla de los mismos, tal como una sola mezcla de los dos o más artículos, o cualquier variación de los mismos. Los elementos de una combinación se asocian o se relacionan funcionalmente en general .
Como se usa en este documento, terapia de combinación se refiere a la administración de dos o más ' productos terapéuticos diferentes, tal como dos o más anticuerpos anti-RSV diferentes y/o anticuerpos- anti-RSV y fragmentos de enlace a antigeno de los. mismos. Los agentes terapéuticos diferentes se pueden proporcionar y administrar separada, secuencial, intermitentemente, o se pueden proporcionar en una sola composición.
Como se usa en este documento, un kit es una combinación empaquetada que incluye opcionalmente otros elementos, tales como reactivos adicionales o instrucciones para el uso de la combinación o elementos de los mismos, para un propósito que incluye, pero no se limita a, activación, administración, diagnóstico, y evaluación de una actividad o propiedad biológica.
Como se usa en este documento, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a un polipéptido, que comprende "un dominio de inmunoglobulina" incluye polipéptidos con uno o una pluralidad de dominios de inmunoglobulina .
Como se usa en este documento, el término "o" se usa para proponer "y/o" a menos que se indique explícitamente para . referirse a alternativas solamente o a las alternativas que son mutualmente exclusivas.
Como se usa en este documento, intervalos y cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por consiguiente "aproximadamente 5 aminoácidos" significa "aproximadamente 5 aminoácidos" .y también "5 aminoácidos".
Como se usa en · este documento, "opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o . circunstancia subsecuentemente descrita se lleva a cabo o no y que la descripción incluye casos donde el evento o circunstancia se lleva a cabo en casos donde no. Por ejemplo, una porción opcionalmente variante significa que la porción es variante o no variante.
Como se usa en este documento, las abreviaciones para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos, son, a menos que se indique de otra manera, de acuerdo, con su uso común, abreviaciones reconocidas, o la comisión IUPAC-IUB en la Nomenclatura Bioquímica (véase, Biochém. (1972) 11(9): 1726-1732) .
B. INFORMACIÓN GENERAL Se proporcionan anticuerpos . anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno . de los mismos que se enlazan a y neutralizan el virus sincitial respiratorio. Los anticuerpos anti-RSV proporcionados en este documento son anticuerpos neutralizables que reconocen uno o más epítopos sobre la superficie de RSV. En particular, los anticuerpos proporcionados en este documento se enlazan a una proteína de fusión (F) de RSV. Los anticuerpos proporcionados en este documento se pueden usar en terapias de profilaxis. Los anticuerpos proporcionados en este documento también se pueden usar como agentes terapéuticos.
Por ejemplo, los anticuerpos proporcionados se pueden emplear para la prevención y/o propagación de enfermedad patogénica, incluyendo, pero no limitado a la inhibición de transmisión viral entre sujetos, inhibición de establecimiento de la infección viral en un hospedero, y reducción de la carga viral en un sujeto. Los anticuerpos también se pueden emplear para prevenir, tratar, y/o aliviar uno o más síntomas de una infección por RSV o para reducir la duración de una infección por RSV. -Por consiguiente, el tratamiento de pacientes con anticuerpos proporcionados en este documento puede disminuir la tasa de mortalidad y/o morbidez asociada con la infección por RSV.
La persistencia del RSV se asocia con la generación de mutantes de escape que no se pueden neutralizar por un anticuerpo. De esta manera, los retos principales para el desarrollo de anticuerpos antivirales terapéuticos son la generación o identificación de anticuerpos que tienen .un epitopo de neutralización que 1) se conserva a través de varias cepas o serotipos y 2) es difícil para' la evolución del virus para generar mutantes de escape. Los- anticuerpos proporcionados en este documento se enlazan a varios grupos de RSV y cepas. Los anticuerpos proporcionados en este documento también muestran actividad de neutralización de virus mejorada comparada con los anticuerpos existentes en la técnica anterior. Los anticuerpos proporcionados neutralizan efectivamente el ' virus sobre corridas sucesivas de replicación, donde el RSV generarla típicamente mutantes de escape para resistir la neutralización. La capacidad para limitar la generación de MARMs significa que los anticuerpos proporcionados en este documento se enlazan a un epitopo que es menos susceptible a la variación en la forma de mutantes de, escape generados. Este epitopo, por lo tanto, es diferente de los epitopos de otros anticuerpos anti-RSV conocidos. De esta manera, los anticuerpos anti-RSV proporcionados, además de la terapia de profilaxis, también son útiles para el tratamiento de la infección por RSV. Actualmente, no existen agentes terapéuticos de . anticuerpos conocidos y aprobados contra la infección por RSV. Como tal, los anticuerpos proporcionados en este documento son especialmente importantes para el tratamiento de infección por RSV entre pacientes ancianos, por ejemplo aquellos en el grupo o casas de retiro, donde la proximidad incrementa el riesgo de propagación viral entre los pacientes. El tratamiento con los anticuerpos proporcionados en este documento también es importante en situaciones donde el no cumplimiento con los regímenes de dosificación incrementa el riesgo de escape viral, como el no cumplimiento en el tratamiento de profilaxis del RSV con palivizumab es la causa conducente de incremento de resistencia viral (véase, por ejemplo, Adams y colaboradores, (2010) Clin Infect Dis. 51 (2) : 185-188) .
En general, los anticuerpos anti-RSV proporcionados en este documento se enlazan a la proteína F de RSV con alta afinidad. Comparados con los anticuerpos anti-RSV aprobados existentes (por ejemplo, palivizumab; Synagis) , los anticuerpos anti-RSV de alta afinidad proporcionados en este documento permiten administración menos frecuente. para prevenir y/o tratar una infección por RSV, para prevenir, tratar, y/o aliviar uno o más síntomas de una infección por RSV, o para reducir la duración de una infección por RSV. De esta manera, los anticuerpos anti-RSV proporcionados en este documento son útiles como anticuerpos terapéuticos, es decir, para el tratamiento de infección por RSV. La administración menos frecuente permite cumplir más fácilmente con los regímenes de dosificación y por lo tanto disminuyen la posibilidad de dosificaciones perdidas que conducirían a una resistencia viral incrementada al anticuerpo anti-RSV. Dosis menores de anticuerpos que se enlazan inmunoespecíficamente al RSV también pueden reducir la probabilidad de efectos advérsos de la terapia .con inmunoglobulina.
En general, los anticuerpos anti-RSV proporcionados en este documento tienen la capacidad de inhibir o reducir una o más actividades del virus, tales como, por · ejemplo, asociación de virus con una membrana celular objetivo, fusión del virus con la membrana celular objetivo y/o entrada a la célula, producción de nuevas partículas virales, incluyendo inhibición de replicación viral, o fusión de célula a célula de una célula infectada con otra célula (es decir, formación de sincitios) . Los anticuerpos anti-RSV proporcionados también se pueden emplear para incrementar la respuesta inmunitaria contra una infección por RSV. 1. Virus Sincitial Respiratorio El RSV humano, es un miembro de la subfamilia de Pneumovirus de la familia Paramyxoviridae. Existen dos subgrupos distintos de RSV humano, grupo A y . grupo B. Adicionalmente, cada subtipo se divide adicionalmente en dos cepas, Al y A2, y Bl y B2. El RSV es un virus de RNA de sentido negativo, no segmentado, envuelto con un genoma compuesto de aproximadamente 15,000 nucleótidos que codifican once proteínas virales.
El RSV codifica dos glicoproteínas superficiales principales, glicoproteína G y glicoproteína F. La glicoproteína G, o la proteína de unión, media el virus que se enlaza al receptor celular mientras que la. glicoproteína F, o la proteína de fusión, promueve la fusión de las membranas virales y celulares, permitiendo la penetración de la ribonucleoproteína viral en el citoplasma celular (López y colaboradores (1998) J. Virology 72:6922-6928). La glicoproteína F también promueve la fusión de las membranas de células infectadas con aquellas de células adyacentes que conducen a la formación de sincitios. La proteína F contiene dos subunidades enlazadas a disulfuro Fi y F2, que se producen por la escisión proteolítica de un precursor N-glicosilado, inactivo. La proteína G es una glicoproteína de transmembrana tipo II de 80-90 kDa, que contiene oligosacáridos N- y 0-enlazados unidos a una proteína precursora de 32 kDa.
Los anticuerpos preparados contra las glicoproteínas F o G de RSV se han mostrado que neutralizan el RSV con alta eficiencia in vitro y tienen efectos profilácticos in vivo (véase, por ejemplo, Walsh y colaboradores (1986) J. Gen. Microbiol. 67:505; Beeler y colaboradores (1989) J. Virol 63:2941-2950, Garcia-Borreno y colaboradores (1989) J. Virol. 63:925-932, Taylor y colaboradores (1984; Immunology 52:137-142, y las Patentes de EUA Nos. 5,824,307 y 6,818,216). Los anticuerpos dirigidos contra la proteína F de RSV también son efectivos en inhibir la fusión de células infectadas con RSV con células no infectadas vecinas.
El análisis de varios anticuerpos monoclonales ue se enlazan inmunoespecíficamente a' la proteína F .de RSV ha conducido a la identificación de tres sitios antigénicos no de solapamiento, A, B, y C y un sitio de puente, AB (Beeler y colaboradores (1989) J. Virol. 63:2941-2950). Cada uno de los sitios antigénicos contiene epítopos distintos ... En un estudio de un panel de 18 anticuerpos monoclonales, cinco epítopos de sitio A antigénico, cuatro epítopos de sitio B antigénicos, y cuatro epítopos de sitio C antigénicos se identificaron con base en los imitantes de escape del anticuerpo monoclonal (MARMs) (véase, por ejemplo, Beeler y colaboradores (1989) J. Virol. 63:2941-2950). El anticuerpo monoclonal 1129, que se enlaza al epítopo 4 de sitio A antigénico (Beeler y colaboradores (1989) J. Virology 63 (7 ): 2841-2950) , es el anticuerpo precursor del cual 'Se generó el palivizumab humanizado (SYNAGISMR) (véase Johnson y colaboradores (1997) J. Infect. Diseases 176:1215-1224 y la Patente de EUA No. 5,824,307). Los epítopos de la proteína F de RSV adicionales también se han identificado. Por ejemplo, el fragmento Fab 19 anti-RSV humano (véase Barbas y colaboradores (1992) Proc.
Nati. Acad. Sci. EUA 9:10164-10168 y Crowe y colaboradores, (1994) Proc. Nati. Acad Sci EUA 91:1386-1390) se enlaza a un epitopo en el sitio A antigénico que difiere de los epitopo identificados por Beeler y colaboradores (véase' Crowe y colaboradores (1998) Virology 252:373-375) ' y Barbas y colaboradores (1992) Proc. Nati., Acad. Sci. USA 89:10164-10168) .
La proteina F de RSV muestra arriba de 91% de'' similitud a través de los subgrupos A y B · de RSV, mientras que la proteina G de RSV muestra solamente 53% de similitud de aminoácido entre los subgrupos A de RSV y B de RSV B (Sullender (2000) Clin. Microbiol. Rev. 13:1-15). Debido- a que los subtipos de virus A y B co-circulan en la mayoría de epidemias de RSV, es deseable un anticuerpo que neutralice los subtipos A y B de RSV, tal como los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígenos proporcionados en este documento.
El RSV humano, como la mayoría de los virus de RNA tiene la capacidad de someterse a mutaciones rápidas- bajo presión selectiva. La selección de los mutantes de escape RSV (MARMs) in vitro al usar anticuerpos monoclonales está bien documentada (por ejemplo, Gracia-Barrena et al. .(1989) J. Virol 63:925-932). Por ejemplo, se ha demostrado que las mutaciones sencillas de aminoácidos en los residuos de aminoácidos N262, 1266, N268, K272, S275, N276, P389 o R429, o las mutaciones dobles de aminoácidos en F32 y K272 o A241 y K421 en la proteina F A2 de RSV efectúan el escape de anticuerpos monocl.onales conocidos anti-RSV (ver por ejemplo, Crowe et al., (1998) Virology 252:373-375; Zhao . et al., (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946 y Liu et al., (2007) Virology Journal 4:71). Adicionalmente, el palivizumab (SYNAGIS®) ha demostrado seleccionar a los mutantes de escape in vitro asi como in vivo, y que algunos de los mutantes aislados son completamente resistentes a la profilaxis con palivizumab en ratas del algodón (ver por ejemplo, Zhao et al., (2005) J. Virol 79:3962-3968 y Zhao et al. (2004) J. Infect. Dis. 190:1941-1946). Por ejemplo. Se ha demostrado que una mutación sencilla de aminoácidos en la proteina F de RSV resulta en el escape de palivizumab (ver, Zhao et al., (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946). Asi, se prefiere un anticuerpo que neutralice efectivamente el virus RSV sobre rondas sucesivas de replicación, sin la generación . de un mutante de escape, tal como los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos aquí proporcionados.
La infección por virus sincitial respiratorio (RSV) es una causa principal de enfermedad del tracto respiratorio inferior en bebés y niños pequeños. La infección por RSV también es la causa más común de bronquiolitis , o inflamación de las vías respiratorias pequeñas en los pulmones, y neumonía en niños menores de un año de edad en los Estados Unidos. Además, la infección por RSV también se reconoce como una causa importante de . enfermedad respiratoria én adultos ancianos. Los síntomas y condiciones asociadas con la infección por RSV incluyen, por ejemplo, jadeo, enfermedad de vías respiratorias reactivas (RAD) , y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) . Por consiguiente, como se describe en este documento, los anticuerpos anti-RSV proporcionados en este documento se pueden emplear para la profilaxis RSV, para el tratamiento de la infección por RSV y/o para aliviar uno o más síntomas de las enfermedades mediadas por RSV.
C. ANTICUERPOS ANTI-RSV Se proporcionan en este documento anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos que se pueden emplear para uso terapéutico, profiláctico y de diagnóstico. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace antígeno de los mismos proporcionados en este documento se pueden usar, por ejemplo, para inmunización pasiva de un sujeto contra RSV o para tratamiento de un sujeto con una infección viral. En un ejemplo, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos proporcionados en este documento se usan para profilaxis, es decir, la prevención de la infección por RSV. En otro ejemplo, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento se usan como anticuerpos terapéuticos, es decir, para el tratamiento de una infección viral por RSV. En todavía otro ejemplo, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos proporcionados en este documento se usan para inmunización pasiva de un sujeto contra RSV. Los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos también se puede usar para la detección de una infección por RSV o para supervisar la infección por RSV in vitro e in vivo. 1. Estructura General del Anticuerpo y Dominios Funcionales Los anticuerpos se producen naturalmente por células B en formas enlazadas a la ' membrana y secretadas. Los anticuerpos reconocen específicamente y se enlazan a epítopos de antígeno a través de interacciones cognadas. El anticuerpo que se enlaza a los antígenos cognados puede iniciar múltiples funciones efectoras, que llevan a cabo la neutralización y eliminación de- toxinas, patógenos y otros agentes infecciosos.
La diversidad en la especificidad del anticuerpo surge naturalmente debido a eventos de recombinación durante el desarrollo de células B. A través de estos eventos, varias combinaciones de múltiples segmentos de genes V, D y J del anticuerpo, que codifican regiones variables dé moléculas de anticuerpo, se unen con los genes de región constante para generar un repertorio de anticuerpos naturales con números grandes de anticuerpos diversos. Un repertorio de anticuerpos humanos contiene más de 1010 diferentes especificidades de anticuerpos y de ésta manera pueden reconocer teóricamente de manera especifica . cualquier antigeno extraño. Los anticuerpos incluyen estos anticuerpos naturalmente producidos, asi como también anticuerpos sintéticamente, es decir, recombinantemente producidos, tales como fragmentos de anticuerpo, incluyendo los anticuerpos anti-RSV o' fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento.
En los polipéptidps de anticuerpos plegados, la especificidad de enlace se confiere por los dominios de sitio de enlace al antigeno,¦ que contiene porciones de dominios de región variable de cadena pesada y/o ligera. Otros dominios en la molécula del anticuerpo sirven como funciones efectoras al participar en eventos tales como transducción dé señal e interacción con otras células, polipéptidos y. biomoléculas . Estas funciones efectoras pueden llevar . a-' -, cabo la neutralización y/o eliminación del agente de infección reconocido por el anticuerpo. Los dominios de polip.éptidos de anticuerpo se pueden variar de acuerdo con los métodos en este documento para alterar las propiedades especificas. a. Dominios Estructurales y Funcionales de los Anticuerpos Los anticuerpos de longitud completa contienen múltiples cadenas, dominios y regiones. Un anticuerpo convencional de longitud completa contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, cada una de las cuales contiene una pluralidad de dominios de inmunoglobulina (Ig). Un dominio Ig se caracteriza por una estructura llamada el pliegue Ig, que contiene dos láminas plegadas beta, que contienen cada una hebras beta anti-páralelas conectadas por rizos. Las dos láminas beta en el pliegue Ig se intercalan con untamente por interacciones hidrofóbicas y un enlace de disulfuro de intra-cadena conservado. Los dominios Ig en las cadenas de anticuerpo son dominios de región variable (V) y : constante (C) . Cada cadena pesada se enlaza a una cadena, ligera por un enlace de disulfuro, y las dos cadenás pesadas se enlazan entre si por enlaces de disulfuro. La ligadura de las cadenas pesadas es mediada por una región flexible de la cadena pesada, conocida como la región bisagra.
Cada cadena ligera de anticuerpo convencional de cadena completa contiene un dominio de región variable (VL) y un dominio de región constante (CL) . Cada cadena pesada convencional de longitud completa contiene un. dominio de región variable (VH) y tres o cuatro dominios de región constante (CH) y, en algunos casos, región bisagra. Debido a los eventos de recombinación planteados en lo anterior, las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios de región variable difieren entre los anticuerpos y confieren especificidad de antigeno a un anticuerpo particular. Las regiones constantes, por otra parte, se codifican . por secuencias que son mas conservadas entre los anticuerpos. Estos dominios confieren propiedades funcionales a los anticuerpos, por ejemplo, la capacidad de interactuar con células del sistema inmunitario y proteínas de suero a fin de llevar a cabo la eliminación de agentes infecciosos. Las diferentes clases de anticuerpos, por ejemplo, IgM,- IgD, IgG, igE e IgA, tienen regiones . constantes diferentes, permitiéndoles servir como funciones efectoras distintas.
Cada dominio de región variable contiene tres: porciones llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs). o regiones hipervar.iables (HV) , que son codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos sumamente variables.' Las CDRs se localizan dentro de los rizos que conectan . las láminas beta del dominio Ig de región variable. Conjuntamente, las tres CDRs de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) y las CDRs de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) constituyen un sitio de enlace a antigeno convencional (sitio de combinación de anticuerpo) del anticuerpo, que inte.ractúa físicamente con el antígeno cognado y proporciona la especificidad del anticuerpo. Un anticuerpo completo contiene dos sitios de combinación de anticuerpos idénticos, cada uno constituido de CDRs de una cadena pesada y ligera. Debido a que están contenidos dentro de los rizos que conectan las hebras beta, las tres CDRs no están contiguas a lo largo de la secuencia de aminoácido lineal de la región variable. En el plegamiento del polipéptido de anticuerpo, los rizos CDR están en proximidad cercana, constituyendo el sitio de combinación de antígenos. Las láminas betas de los dominios de región variable forman las regiones de estructura (FRs), que contienen secuencias más conservadas que son importantes para otras propiedades del anticuerpo, por ejemplo, estabilidad. b. Fragmentos de Anticuerpo Los anticuerpos proporcionados en este documento incluyen fragmentos de anticuerpo, que son derivados del anticuerpo de longitud completa que contiene menos que la secuencia completa de los anticuerpos de longitud completa pero retienen por lo menos una porción de capacidades de enlace especificas del anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos de anticuerpo también pueden incluir porciones de enlace a antigeno de un anticuerpo que se puede insertar en una estructura de -anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos quiméricos) a fin de retener la afinidad de enlace del anticuerpo precursor. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' , F(ab' )2, Fv de cadena individual (scFv) , Fv, dsFv, diacuérpo, · Fd y fragmentos de Fd' , y otros ¦ fragmentos, . incluyendo fragmentos modificados (véase, por ejemplo, Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cáncer Therapy Methods and Protocols (2003);. Capítulo 1; página 3-25, Kipriyanov) . Los fragmentos de anticuerpo pueden incluir múltiples cadenas enlazadas conjuntamente, tales como por puentes de disulfuro y se pueden producir recombinantemente . Los fragmentos de anticuerpo también pueden contener ligaduras sintéticas, tales como ligaduras de péptido, para enlazar dos o más dominios. Los métodos para generar fragmentos de enlace a antígeno' ¦ son. bien conocidos en el campo y se pueden usar para modificar cualquier anticuerpo proporcionado en este documento. Los fragmentos de moléculas de anticuerpos se pueden generar, tal como por ejemplo, mediante escisión enzimática. . Por ejemplo, en la escisión de proteasa por papaína, un' dimero de las regiones constantes de cadena pesada, el dominio Fe, se escinde de las dos regiones Fab (es decir, las porciones que contienen las regiones variables) .
Los anticuerpos de cadena individual se pueden diseñar recombinantemente al unir una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera. (VL) de un anticuerpo especifico. Las . secuencias de ácidos nucleicos particulares para las regiones variables se pueden clonar mediante métodos estándar de . biología molecular, tales como, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras tecnologías de ácidos nucleicos de recombinación. Los métodos para producir sFvs se describen, por ejemplo, por Whitlow and Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; Pack y colaboradores (1993) Bio/Technology¦ 11 :1271-77; y patentes de EUA Nos. 4, 946, 778., 5, 840, 300, 5,667,988, 5,658,727, 5,258,498). Los anticuerpos . de cadena individual también se pueden identificar al clasificar las bibliotecas de anticuerpos de cadena individual para enlazarse a un antígeno objetivo. Los métodos, para la construcción y clasificación de estas bibliotecas son bien conocidos en la técnica. 2. Anticuerpos Anti-RSV Ejemplares Se proporcionan en este documento anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos que se enlazan a y neutralizan el RSV. En particular, los anticuerpos o fragmentos de ¦ enlace a antigeno se enlazan inmunoespecíficamente a una proteina F de RSV.' Por ejemplo, los anticuerpos anti-RSV aqui proporcionados, se enlazan inmunoespecificamente á una proteina F de RSV recombinante o purificada o aislada. En otros ejemplos, los anticuerpos anti-RSV aqui proporcionados se enlazan inmunoespecificamente al virión de RSV o glicoproteina F de superficie que codifica el virus RSV (proteina F RSV).
Los anticuerpos anti-RSV aqui proporcionados muestran propiedades que son ventajosas . o diferentes de los anticuerpos anti-RSV en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos aqui proporcionados incluyen anticuerpos anti-RSV que muestran una afinidad de enlace inferior o mejorada para la proteina F del RS'V, tal como una afinidad de enlace inferior o mejorada para una proteina F de RSV aislada o purificada o recombinante o para ¦ el virus RSV o virión que expresa la proteina F nativa. En otros ejemplos, los anticuerpos aqui proporcionados incluyen anticuerpos anti-RSV que muestran una actividad de neutralización mejor o mejorada de RSV. En ejemplos particulares, . los anticuerpos anti-RSV aquí proporcionados incluyen anticuerpos que se enlzana a un epitopo sobre RSV que son menos susceptibles a la variación en la forma de mutantes de escape generados (MARMs) en comparación con los otros anticuerpos anti-RSV existentes o del arte previo. Por ejemplo, en la presencia de un anticuerpo anti-RSV aquí proporcionado, por ejemplo el anticuerpo 30D8 o un fragmento de longitud completa u otra forma de anticuerpo del mismo, RSV mno puede g.enerar un mutante de escape después de más de 10 rondas de replicación viral, y generalmente después de más de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 rondas.
Los anticuerpos anti-RSV incluyen los anticuerpos. sc5 o 58c5, o formas de fragmentos de anticuerpos de longitud completa u otras formas ed los mismos (ver por ejemplo, publicación de patente de E.U. No. US2011/0076268 y solicitud internacional PCT publicada No. WO2011/020079) . 58c5 es un fragmento de ' Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5. Las formas de anticuerpos o de fragmento de antigenos de 58c5 y que enlazan al mismo epitopo como 58c5 contienen una cadena pesada que tiene regions determinantes de la complementariedad (CDRs) VH CDR1 establecida como GASINSDNYYWT (SEQ ID NO: 2) o SEQ ID NO: 435, una VH CDR2 establecida como HISYTGNTYYTPSLKS (SEQ ID NO: 3), y una VH CDR3 establecida como CGAYVLISNCGWFDS (SEQ ID NO:4; y una cadena ligera que tiene VL CDR1 de CDRs establecida como QASQDISTYLN (SEQ ID NO: 6), una VL CDR2 establecida como GASNLET (SEQ ID NO:7), y una VL CDR3 establecida como QQYQYLPYT (SEQ ID NO:8). Generalmente, la forma de fragment de anticuerpos de 58c5 incluye el dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en los amnoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 1 y un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 5. sc5 es un fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 13. Las formas de anticuerpos o fragmentos de antigeno de sc5 y que enlazan al mismo epitopo como sc5 contienen una cadena pesada- que . tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) VH CDR1 establecida como GDSISGSNWWN (SEQ ID NO: 10) o SEQ ID NO:436, una VH CDR2 establecida . como EIYYRGTTNYKSSLKG (SÉQ ID NO: 11), y una VH CDR3 establecida como GGRSTFGPDYYYYMDV (SEQ ID NO: 12); y una ' cadena ligera que tiene CDRs VL CDR1 establecida como RASQNIKNYLN (SEQ ID NO: 14),. una ' VL CDR2 establecida como AASTLQS (SEQ ID NO: 15), y una VL CDR3 establecida como QQSYNNQLT (SEQ ID NO: 16) . Generalmente, la forma del fragmento de anticuerpo de sc5 incluye el dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 13.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este . documento incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpos multiespecificos , anticuerpos biespecificos , ' anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fvs de cadena individual (scFv) , anticuerpos de cadena individual, anticuerpos de dominio individual, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab'), Fvs enlazados a disulfuro (sdFv), y anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) , intracuerpos , o fragmento de enlace a antigenos de cualquiera de lo anterior. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de enlace a antigeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA y IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2) o subclase.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos proporcionados en este documento se pueden usar en los métodos de tratamiento y diagnóstico en formas que incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpos multiespecificos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos,' Fvs de cadena individual (scFv), anticuerpos de cadena individual, anticuerpos de dominio individual, fragmentos de Fab, fragmentos de. F(ab'), Fvs enlazados a disulfufo (sdFv), y anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) , intracuerpos , o fragmento de enlace a- antigenos de cualquiera de lo. anterior . En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas qµe contienen un sitio de enlace a antigeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden' ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA y IgY) , clase (por ejemplo,. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2) o subclase.
Los anticuerpos anti-RSV ejemplares o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento que se enlazan inmunoespecí ficamente a una proteina F RSV incluyen 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 y 69F6, que son fragmentos de Fab descritos con detalle en algún lugar en este documento. Los anticuerpos anti-RSV ejemplares o fragmento de enlace a antigenó de. los mismos proporcionados' en este documento también incluyen anticuerpos anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno de los mismos que contienen una cadena pesada, que contiene un dominio de cadena . variable (VH) y un dominio 1 de cadena constante (CH1) y/o una cadena que contiene .un dominio ligero variable (VL) y un dominio ligero constante (CL) de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C y .69F6. Por ejemplo, los anticuerpos anti-RSV . ej emplares o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento incluyen anticuerpos anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno de los mismos que contienen una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 396, 398, 400, 402, 404 , 452, 454 ó 456 y/o una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 395, 397, 399, 401, 403, 453, 455 o 457. En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV es un fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID. NO: 396 y una cadena ligera que tiene la secuencia de . aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 395. En' un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV es un fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:. 398 y una cadena ligera' que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 397. En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV es- un fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 400 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 399. En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV es un fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:. 402 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 401. En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV es un fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta' en SEQ ID NO: 404 y una cadena ligera que tiene la ' secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 403. En un. ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV es un fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 452 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 453. En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV es un¦ fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 454 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 455. En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV es un' fragmento de Fab que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 456 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 457.
Los anticuerpos proporcionados en este documento incluyen formas de anticuerpo de longitud completa de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, '56E11, 17C9 y 69F6. Los anticuerpos proporcionados en este documento también incluyen formas de anticuerpo de longitud completa que contienen el-' sitio de enlace a antigeno (por ejemplo CDRs) de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17G9 y 69F6. Los anticuerpos anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento pueden contener cualquier región constante conocida en la técnica, tal como cualquier región constante humana conocida en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos de longitud completa aquí proporcionados pueden contener una región constante de cadena ligera (CL) que tiene una cadena ligera humana kappa (?) , cadena ligera humana lambda (?) . Los anticuerpos de longitud cpmpleta aqui proporcionados pueden contener una región constante de cadena pesada (CHl-ligadura-CH2-CH3) que es de cualquier isotipo, y en particular que es una IgG. La región constante puede ser la región constante de la subíase IgGl (SEQ ID NO:356), la región constante de IgG2 (SEQ ID NO: 357), la ' región constante de IgG3 (SEQ ID NO: 358) o la región constante de IgG4 (SEQ ID NO: 359). En particular, las formas de anticuerpos de longitud completa de cualquiera de los anticuerpos aquí proporcionados contienen la región constante de IgG, subclase IgGl.
Los anticuerpos proporcionados en este documento incluyen otras formas de fragmento de anticuerpo de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 1-7C9 y 69F6 que se enlazan inmunoespecíficamente a una proteína F de RSV. Estos fragmentos incluyen cualquier fragmento de enlace a antígeno del mismo o un anticuerpo diseñado que contiene un fragmento (s) de enlace a antígeno de 30D8, 104E-5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 y 69F6 que retienen la capacidad de enlazarse a una proteína F de RSV. Estos anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, Fvs de cadena individual (scFv) , anticuerpos de cadena individual, anticuerpos de dominio individual, fragmentos de F(ab'), Fvs enlazados a disulfuro (sdFv), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) , intracuerpos , o fragmentos de enlace a antígeno de cualquiera de lo anterior. En ejemplos particulares, el anticuerpo es el Fab 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6.
Los anticuerpos anti-RSV ejemplares o fragmento de enlace a antígenos de los mismos proporcionados en este documento incluyen anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos que contienen' un dominio VH y/o un dominio VL ligero variable que tiene una secuencia de aminoácidos del dominio VH y/o dominio VL, respectivamente, de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 398 o 402, aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 396, aminoácidos 1-123 de SEQ ID NO: 404, aminoácidos 1-124 de SEQ ID NO: 400 o 452, aminoácidos 1-133 de SEQ ID ' NO: 454 o aminoácidos 1-118 de SEQ ID NO: 456 y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 397, 403 o 455, aminoácidos 1-108 de SEQ ID NO:399, aminoácidos 1-110 de SEQ ID NO: 395, aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO: 401, aminoácidos 1-111 de SEQ ID NO: 453 o aminoácidos 1-109 de SEQ ID NO:457.
Los anticuerpos anti-RSV ejemplares o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento incluyen anticuerpos anti-RSV o fragmento de enlace a antigenos de los mismos qué contienen un dominio VH y/o un dominio VL que tiene' una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 80% idéntica al dominio VH y/o dominio VL, respectivamente, de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento puede contener un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos que es 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 398 o 402, aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 396, aminoácidos 1-123 de SEQ ID NO: 404., aminoácidos L-124 de SEQ ID NO: 400 o 452, aminoácidos 1-133 de SEQ ID NO: 454 o aminoácidos 1-118 de SEQ ID NO: .456 y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO:397, 403 o 455, aminoácidos 1-108 de SEQ ID NO: 399, aminoácidos 1-110 de SEQ ID NO: 395, aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO: 401, aminoácidos 1-111 de SEQ ID. NO: 453 o aminoácidos 1-109 de SEQ ID NO: 457 En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento puede contener un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos o aproximadamente 81%, por lo menos o aproximadamente 82%, por lo menos o aproximadamente 83%, por lo menos o aproximadamente 84%, por lo menos o aproximadamente 85%, por lo menos o aproximadamente 86%, por lo menos o aproximadamente 87%, por lo menos o aproximadamente 88%, por lo menos o aproximadamente 89%, por lo menos o aproximadamente 90%, por lo menos o aproximadamente 91%, por lo menos o aproximadamente 92%, por lo menos o aproximadamente 93%, por lo menos o aproximadamente 94%, por lo menos o aproximadamente 95%, por lo menos o aproximadamente 96%, por lo menos o aproximadamente 97%, por lo menos o aproximadamente 98%, o por lo menos o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 398 o 402, aminoácidos 1-¦121 de SEQ ID NO: 396, aminoácidos 1-123 de SEQ ID NO: 404 , aminoácidos 1-124 de SEQ ID NO: 400 o 452, aminoácidos 1-¦133 de SEQ ID NO: 454 o aminoácidos 1 -118 de SEQ ID NO: 456 y/o y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos o aproximadamente 81%, por lo menos o aproximadamente 82%, por lo menos o aproximadamente 83%, por lo menos o aproximadamente 84%, por lo menos o aproximadamente 85%, por lo menos o aproximadamente 86%, por lo menos o aproximadamente 87%, por lo menos o aproximadamente 88%,. por lo menos o aproximadamente 89%, por lo menos o aproximadamente 90%, por lo menos o aproximadamente 91%, por lo menos d aproximadamente 92%, por lo menos o aproximadamente 93%, por lo menos o aproximadamente 94%, por lo menos o aproximadamente 95%, por lo menos o aproximadamente 96%, por lo .menos . o aproximadamente 97%, por lo menos ; o aproximadamente 98% , o por lo menos o aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO:397, 403 o 455, aminoácidos 1-108 de SEQ ID NO:399, aminoácidos 1-110 de SEQ ID NO: 395, aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO: 01, aminoácidos. 1-111 de SEQ ID NO: 453 o aminoácidos 1-109 de SEQ ID NO:457.
De esta manera, se proporcionan en este documento un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es' aproximadamente .80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90%· a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%., 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 396 y que, contiene un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 9.0%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-110 de SEQ ID NO: 395.
De esta manera, se proporcionan en este documento un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del .mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos .o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 398 y que contiene un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, ' 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 397.
De esta manera, se proporcionan en este . documento un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos o . que es aproximadamente 80% a ' 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-124 de SEQ ID NO: 400 y que contiene un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, ' 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-108 de SEQ ID NO: 399.
De esta manera, se proporcionan en este documento un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, .90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%., 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 402 y que contiene un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos que es,, por lo menos · .0 que es aproximadamente 80% a 99%¦ idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO: 401.
De esta manera, se proporcionan, en este documento un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es ' por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-123 de SEQ ID NO: 404 y que contiene un dominio VL que. tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%., 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 403.
De esta manera, se proporcionan en este.- documento un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia dé aminoácidos que es por lo menos o que. es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, :89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,' 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-124 de SEQ ID NO: 452 y que contiene un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como.81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-111 de SEQ ID NO: 453..
De esta manera, se proporcionan en este documento un anticuerpo o fragmento de enlacé a¦ antígeno del mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,. 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, -96%, 97%, 98% o' 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-133 de SEQ ID NO: 454 y que contiene un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos que es por ; lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, ' 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 455.
De esta manera, se proporcionan en este documento un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, .95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-118 de SEQ ID NO: 456 y que contiene un dominio VL que¦ tiene la secuencia de aminoácidos que es por lo menos o que es aproximadamente 80% a 99% idéntico, por ejemplo, 90% a 99% o por lo menos 95% idéntico, tal como 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, .90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1-10.9 de SEQ ID NO: 457.
También se proporcionan anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno del mismo que contienen una o más regiones determinantes de la complementariedad VH (CDRs) seleccionadas de entre las CDRs de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6. Por ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 o 482-484. Por ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VH' CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GFTFSGHTIA (SEQ ID NO: 405), GGTFDTYTIS (SEQ ID NO: 411), GFSITDFGIH (SEQ ID NO; 417), GASISSDNHY S (.SEQ ID NO:423), GFTLKNYE N (SEQ ID NO:429), GHTIA (SEQ ID NO: 437 ) , TYTIS (SEQ ID NO:438), DFGIH (SEQ ID NO: 439), SDNHYWS (SEQ ID NO: 440), NYEMN (SEQ ID' NO: 441), GVSINSNNYFWA (SEQ ID NO: 458), GDSFNDYF T (SEQ ID NO: 64), GYSFTSYWIA (SEQ ID NO:470), SNNYFWA (SEQ ID NO:482), DYFWT (SEQ ID NO:483) o SYWIA (SEQ ID NO:484).
En otro ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 o 471. Por ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos WVSTNNGNTEYAQKIQG (SEQ ID NO:406), RI I PSLGETNYAHKLQG (SEQ ID NO:412), LISYNEVNIHYGESVRG (SEQ ID NO: 418), SIYYTGGTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 424), YISSSGNVVKYVDSVQG (SEQ ID NO: 430), NIYYGGSTHYNASLQS . (SEQ ¦ ID ' NO: 59), EISHSGSTNYSPSLKS (SEQ ID NO:465) o IIFPNDSDATYSPSFQG (SEQ ID N0.471).
En otro ejemplo, el · anticuerpo anti-RSV o' fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS:407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 o 472. Por ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos EWLVMGGFAFDH (SEQ ID NO:407), RITGPVDWV DYGMDV (SEQ ID NO: 413), DVWEDSWLSLACFQE (SEQ ID NO: 19), GLFFITARPYWYFDL (SEQ ID NO: 25) o GFSIDKYDSSVDEY (SEQ ID NO: 431), SESI F DYYYGLDV (SEQ ID NO: 460), GVRSRPPPSYRGSGSPPYYHYGMDV (SEQ ID NO: 66) o QYYLGSFES (SEQ ID NO: 472) .
En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 405, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:406, y una VH CDR3 que. tiene la secuencia de aminoácidos' establecida en SEQ ID NO: 407. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1. que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 437, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:406, y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 407.
En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV · o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:412, y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 13. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 438, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 412, y una. VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 413.
En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno' del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 417, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID' NO: 418, y. una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 19. En otro ejemplo particular, el anticuerpo ' anti-RSV o¦ fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:439, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 418, y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 419.
En un ejemplo particular, ' el anticuerpo .anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una vH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 23, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:424, y una VH CDR3 que" tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 425. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o . fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 440, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 424, y una VH CDR3 'que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en- SEQ ID NO:425.
En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 429, una VH CDR2. que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 430, y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 431. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o · fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 441, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 430, y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 431.
En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 58, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 459, y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 460. En otro ejemplo particular, · el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 82, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 459, y una VH CDR3 que tiene la. secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 460.
En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en ' SEQ ID NO: 64, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 465, y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 66. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 83, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 465, y una VH CDR3 que tiene la. secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 466.
En un ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 470, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 471, y un VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 472. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o . fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 484, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 471, y una VH CDR3 que tiene la. secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 472.
También se proporcionan anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno del mismo que contienen una o más regiones determinantes de la complementariedad VL . (CDRs) seleccionadas de entre las CDRs de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6. Por ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS:408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 o 473. Por ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VL CDR1 que. tiene la secuencia de aminoácidos GANNIGSQNVH (SEQ ID' NO:408), RASQNIKTYLN (SEQ ID NO:414), RASQSISNWLA (SEQ ID NO: 4-20), RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 26), RASQSISNFLN (SEQ ID NO: 32), TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 461), RASQNINTWLA (SEQ ID NO:467) o QASDISNYLN (SEQ ID NO:473).
En otro ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS:409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 o 474. Por ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos DDRDRPS (SEQ ID NO: 409) , AVSNLQS (SEQ ID NO: 415), KASNLED (SEQ ID NO: 21), TLSYRAS (SEQ ID NO: 427), AASSLQG (SEQ ID NO: 33), EVTKRPS (SEQ ID NO: 62), AASFLQS (SEQ ID NO:468) o DASYLDT (SEQ ID NO:474).
En otro ejemplo, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOS: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 o 475. Por ejemplo, el anticuerpo anti-RSV. o fragmento de enlace a antigeno del mismo puede contener una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos QV DSSRDQAVI (SEQ ID NO: 410), QQSFSIPLT (SEQ ID NO: 416), QQYNSYSGLS (SEQ ID NO: 422), . QR EFPFT . (SEQ ID NO:428), QQTYISLYT (SEQ ID NO:434), SSYAGSRHVV (SEQ ID NO: 463), QQANSFPRT (SEQ ID NO: 469) o QQYDDLRGGFT (SEQ ID NO:475).
En un ejemplo particular, el anticuerpo ahti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida · en SEQ ID NO: 408, a VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 409, y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 10. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VL CDRl que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:415, y una VL CDR3 que tiene' la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 416. En. otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una ' VL CDRl que ' tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 420, una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 421, y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 422.
En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 426, una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 427, y una VL . CDR3 que' tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:428. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o .. fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VL CDRT que' tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 32,- una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 433, y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 434. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo contiene una VL CDR1 que tiene la secuencia de .aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 61, una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 62, y un VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:463. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno . del mismo contiene una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 467, una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 468, y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 69. En otro ejemplo particular, el anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a. antigeno del mismo contiene una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 473, una VL: CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 474, y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 475.
Cualquier combinación de CDRs proporcionadas en este documento se puede seleccionar para la generación de un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo, con la condición de que el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno retenga la capacidad de enlazarse inmunoespecificamente a una proteina F de RSV. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos pueden contener una región de estructura de anticuerpo conocida en el campo. Regiones de estructura ejemplares incluyen regiones de estructura de origen natural aisladas o consensas, incluyendo regiones de estructura humanas (véase, por ejemplo, Chothia y colaboradores (1998) J. Mol. Biol. 278: 457-479). En algunos ejemplos, la región de estructura de anticuerpo es una región de estructura de' anticuerpo humano. En algunos ejemplos, el fragmento de enlace a antigeno contiene una región de estructura de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6.
Los anticuerpos anti-RSV aislados ejemplares o fragmento de enlace a antigeno de. los mismos proporcionados en este documento incluyen cualquier anticuerpo anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno del mismo que se enlaza inmunoespecificamente al mismo epitopo en una proteina dé fusión (F) de Virus Sincitial Respiratorio (RSV) como cualquiera de los anticuerpos proporcionados ' en este documento. En un ejemplo, se proporciona en este documento un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo como 30D8, que es el anticuerpo que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 396 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 395. En otro ejemplo, se proporciona en este documento un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo como 104E5, que es el anticuerpo que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 398 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 397. En otro ejemplo, se proporciona en este documento un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo como 38F10, que es el anticuerpo que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 00 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 399. En otro ejemplo, se proporciona en este documento un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo como 14G3, que es el anticuerpo que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 02 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 401. En otro ejemplo, se proporciona en este documento un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo como 90D3, que es el anticuerpo que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 404 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 403. En otro' ejemplo, se proporciona en este documento un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo como 56E11, que es el anticuerpo que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 452 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO:453. En otro ejemplo, se proporciona en este documento un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo como 17C9, que es el anticuerpo que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 454 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 455. En otro ejemplo, se proporciona en este documento un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo como 69F6, que es el anticuerpo que contiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 456 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID. NO: 57. Típicamente, estos anticuerpos contienen una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) o fragmentos de enlace a antígeno de las mismas.
Los anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno proporcionado en este documento muestran una constante de afinidad de enlace (Ka) para el epitopo de proteína F de RSV de por lo menos o aproximadamente ????8 M"1, por lo menos o aproximadamente 2.5xl08 M"1, por lo menos o aproximadamente 5xl08 M"1, por lo menos o aproximadamente lxlO9 M_1, por lo menos o aproximadamente 5xl09 · M"1, por lo menos o aproximadamente lxlO10 M"1, por lo menos o aproximadamente 5xl010 M"1, por lo menos o. aproximadamente lxlO11 M"1, por lo menos o aproximadamente 5x1o11 M_1, por lo menos o aproximadamente lxlO12 M_1, por lo menos o aproximadamente 5xl012 M"1, por lo menos o aproximadamente lxlO13 M"1, por lo menos o aproximadamente 5xl013 M-1, por lo menos o aproximadamente lxlO14 "1, por lo menos o aproximadamente 5xl014 M"1, por lo menos o aproximadamente lxlO15 M"1, o por lo menos o aproximadamente 5xl015 M"1. Los anticuerpos proporcionados en este documento pueden mostrar una afinidad de enlace para una proteina F recombinantemente purificadas, tal como el dominio extracelular de la proteina F de la cepa A2 de RSV expuesta en los SEQ ID NO: 25. Los anticuerpos proporcionados en este documento también pueden mostrar una afinidad de enlace para la proteina F de RSV nativa, tal como se genera por la infección y expresión del RSV en las células. Los anticuerpos proporcionados en este .documento pueden tener afinidades de enlace que son las mismas .o diferentes para la proteina F recombinantemente purificada contra la proteina F de RSV F nativa. Por ejemplo, el Ejemplo 5 muestra que 30D8 tiene una mayor afinidad de enlace para la proteina F de RSV nativa que para la,- proteína F recombinanteme . . En contraste, sc5 . (ver por ejemplo, publicación de patente de E.U.A. No. US2011/0076268 y solicitud internacional PCT publicada No. O2011/020079) muestra afinidad de enlace similar si la proteína F de RSV es nativa o es una proteína F recombinante.
En algunos ejemplos, los anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos proporcionado en este documento tiene una constante de disociación (¾)¦ para el epítopo de proteina F de RSV de menor que o aproximadamente lxlO"8 M, menor que o aproximadamente 4xl0~9 M, menor que o aproximadamente 2xl0"9 M, menor que o aproximadamente lxlO"9 M, menor que o aproximadamente 2xl0-10 M, menor que o aproximadamente lxlO-10 M, menor que o aproximadamente 2xl0-11 M, menor que o aproximadamente lxlO-11 M, menor que o aproximadamente 2xl0"12 M, menor que o aproximadamente lxlO"12 M, menor que o aproximadamente ' 2xl0~13 M, menor que o aproximadamente lxlO-13 M, menor que o aproximadamente- 2xl0~14 M, menor que o aproximadamente lxlO-14 M, menor que o aproximadamente 2xl0~15 M, menor que o aproximadamente lxlO"15 M, o menor que o aproximadamente 2xl0~16 M.
En algunos ejemplos, los anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno proporcionados en este documento tienen EC50 de menor que o aproximadamente 0.005 nM, menor que o aproximadamente 0.01 nM, menor que o aproximadamente 0.025 nM, menor que o aproximadamente 0.05 nM, menor que o aproximadamente 0.075 nM, menor que o aproximadamente 0.1 nM, menor que o aproximadamente 0.5 nM, menor que o aproximadamente 0.75 nM, menor que o aproximadamente 1 nM, menor que o aproximadamente menor que o aproximadamente 1.25 nM, menor que o aproximadamente 1.5 nM, menor que o aproximadamente 1.75. nM, menor que o aproximadamente 2 nM en un ensayo de microneutralización in vitro para la neutralización de RSV. En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-RSV aislados o fragmento de enlace a antigenos proporcionado en este documento tiené una EC50 para la neutralización de RSV en un ensayo de reducción de placas in vitro de menor que o aproximadamente 0.005 nM a menor que o aproximadamente 2 nM; menor que o aproximadamente 0.005 nM a menor que o aproximadamente 1 nM; menor que o aproximadamente 0.005 nM a menor que o aproximadamente 0.5 nM; menor que o aproximadamente 0.01 nM a menor que o aproximadamente 1 nM; menor que o aproximadamente' 0.05 nM a menor que o aproximadamente 1 nM; menor que · o aproximadamente 0.05 nM a menor que o aproximadamente 0.5 nM; o menor que o aproximadamente 0.1 nM a menor que o aproximadamente 0.5 nM.
En algunos ejemplos, un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento neutraliza los mutantes de escape de anticuerpos monoclonales (MARMs) contra varios anticuerpos anti-RSV en un ensayo de microneutralización in vitro para la neutralización de RSV. En un ejemplo particular, un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a. antigeno del mismo proporcionado en este documento neutraliza un MARM con una EC50 para la neutralización de es decir o es de aproximadamente la misma como la EC50 para . la neutralización de una cepa de RSV precursor de la cual se generó el MAR . Si un primer anticuerpo puede neutralizar uh ..MARM generado · contra un segundo anticuerpo, se puede concluir que los anticuerpos se enlazan específicamente a o interactúan con diferentes epítopos.
En algunos ejemplos, un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígenos .del mismo aquí proporcionado enlaza a un epítopo que es menos susceptible a una variación en la forma de mutantes de escape generados (MARMS) . En algunos ejemplos, RSV es incapaz de generar un mutante de escape después de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más rondas sucesivas de replicación viral en la presencia de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno del mismo aquí proporcionado. En un ejemplo en particular, RSV no genera un mutante de escape después de 11, 12,. 13,' 14, 15 o más rondas sucesivas de replicación viral en la presencia de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígenos del mismo aquí proporcionado. En otro ejemplo en particular, RSV no puede efectuar el escape de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígenos del mismo aquí proporcionado. Por ejemplo, el Ejemplo 11a muestra que después de 12 rondas de replicación viral en la presencia de 30 D8, RSV no pudo efectuar el escape. En contraste, RSV pudo escapar Motavizumab® después de solamente 7 rondas de replicación viral.
En algunos ejemplos, un · anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento inhibe el enlace de RSV a su receptor de célula hospedera mediante por .lo menos o aproximádamente 99%, por lo menos o aproximadamente 95%, por lo menos o aproximadamente 90%, por lo menos o aproximadamente 85%, por lo menos o aproximadamente 80%, por lo menos o aproximadamente 75%, por lo menos o aproximadamente 70%, por lo menos o aproximadamente 65%, por lo menos o aproximadamente 60%, por lo menos o aproximadamente 55%, por lo menos o aproximadamente 50%, por lo menos o aproximadamente 45%, por lo menos o aproximadamente 40%, por lo menos o aproximadamente 35%, por lo menos o aproximadamente 30%, por lo menos o aproximadamente 25%, por lo menos o aproximadamente 20%, por lo menos : o aproximadamente 15% , . o por lo menos o aproximadamente 10% relativo con el enlace de RSV a su receptor de célula hospedera en ausencia del anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo. En algunos ejemplos, el. anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno proporcionado ; en este documento inhibe la replicación de RSV mediante por lo menos o aproximadamente 99%, por lo menos o aproximadamente 95%, por lo menos o aproximadamente 90%, por . lo menos o aproximadamente 85%, por lo menos o aproximadamente 80%, por lo menos o aproximadamente 75%, por lo menos o aproximadamente 70%, por lo menos o aproximadamente 65%, por lo menos o aproximadamente 60%, por lo menos o aproximadamente 55%, por lo menos o aproximadamente 50%, por lo menos o aproximadamente 45%, por lo menos o aproximadamente 40%, por lo menos o aproximadamente 35%, por lo menos o aproximadamente 30%, por lo menos o aproximadamente 25%, por lo menos o aproximadamente 20%, por lo menos o aproximadamente 15%, o por lo menos o aproximadamente 10% ' relativa con la replicación de RSV en ausencia del anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo.
En algunos ejemplos los anticuerpos o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en' este documento tienen una vida media de 15 días o- más prolongado, 20 días o más prolongado, 25 días o más prolongado, 30 días o más prolongado, 40 días o más prolongado, 45 días o más prolongado, 50 días o más prolongado, 55· días o más prolongado, 60 días o más prolongado, 3 meses o más prolongado, 4 meses o más prolongado o 5 meses o más prolongado. Los métodos para incrementar la vida media de un anticuerpo o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos proporcionados en este documento se conoce en el campo. Estos métodos incluyen por ejemplo, PEGilación, gli'cosilación, y sustitución de aminoácido como se describe en cualquier lugar en este documento. a. Anticuerpos Derivados Los anticuerpos anti-RSV .o fragmentos de · enlace a antígeno de los mismos proporcionados en este' documento se pueden usar para generar anticuerpos derivados tales como anticuerpos quiméricos u otros fragmentos de enlace a antígeno, tal como por ejemplo, Fab, Fab', F(ab' .) 2 , Fv de cadena individual (scFv) , Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y fragmentos de Fd' . En general, el anticuerpo derivado o fragmento de enlace a antígeno derivado de un anticuerpo precursor retiene la especificidad de enlace del anticuerpo precursor. Los fragmentos de anticuerpo se pueden generar mediante cualquier técnica conocida por aquellas personas de experiencia en el campó. Por ejemplo, los fragmentos de Fab y F(ab')2 se pueden producir mediante escisión proteolitica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas . tales como papaina (para producir fragmentos de Fab) o pepsina (para producir fragmentos de F(ab')2). Los fragmentos de F(ab')2 contienen la región variable, la región constante; de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Además, los anticuerpos anti-RSV o fragmento de enlace a antigenos de los mismos proporcionados en. este documento también se pueden generar usando varios métodos de despliegue de fagos conocidos en el campo. En algunos ejemplos, las regiones variables de enlace a antigeno de los anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigenos de los mismos proporcionados en este documento sé pueden fusionar recombinantemente a una o más regiones constantes conocidas en la técnica para generar anticuerpos de longitud completa quiméricos, Fab, Fab', F(ab' )2 u otros fragmentos de enlace a antigeno. Los métodos ejemplares para generar anticuerpos de. longitud completa de fragmentos de anticuerpo son conocidos en la técnica y se proporcionan en este documento. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos ' en la técnica (véase, por ejemplo, Morrison (1985) Science 229:1202; Oi y colaboradores (1986) Bio Techniques 4:214; Gillies y colaboradores (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; y Patentes de EUA Nos. 5,807,715, 4,816,567, y 4,816,397).
Los anticuerpos quiméricos que comprenden una o más CDRs de un anticuerpo anti-RSV proporcionado en este documento y regiones de estructura de una molécula de inmunoglobulina heteróloga se pueden producir usando una variedad de técnicas conocidas en el campo incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (EP 239,400; publicación de PCT No. WO 91/09967; y Patentes de EUA Nos. 5,225,539, 5,530,101, y 5,585,089), enchapado o revestimiento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan (1991) Molecular Immunology 28 ( 4 /5 ) : 489-498 ; Studnicka y colaboradores (1994) Protein Engineering 7 ( 6) : 805-814 ; y Roguska y colaboradores (1994) PNAS 91:969-973), y entrelazado de cadena (Patente de EUA No. 5,565,332).
En algunos ejemplos, los anticuerpos contienen una o más CDRs de 30D8 (por ejemplo, una o más CDRs expuestas en los SEQ ID NOS: 405-410 y 437) y una región de estructura heteróloga. En algunos ejemplos, los anticuerpos contienen una o más CDRs de 104E5 (por ejemplo, una o más CDRs expuestas en los SEQ ID NOS: 411-416 y 438) y una región de estructura heteróloga. En algunos ejemplos, los anticuerpos contienen una o más CDRs de 38F10 (por ejemplo, una o más CDRs expuestas en los SEQ ID NOS: 417-422 y 439) y una región de estructura heteróloga. En algunos ejemplos, los anticuerpos contienen una o más CDRs de 14G3. (por ejemplo, una o más CDRs expuestas en los SEQ ID NOS: 423-428 y 440) y una región de estructura heteróloga. En algunos ejemplos, los anticuerpos contienen una o más CDRs de 90D3 (por ejemplo, una o más CDRs expuestas en los SEQ ID NOS: 429-434 y 441) y una región de estructura heteróloga. En algunos, ejemplos, los anticuerpos contienen una o más CDRs de 56E11 (por ejemplo, una o más CDRs expuestas en los SEQ ID NOS: 458-463 y 482) y una región de estructura heteróloga. En algunos ejemplos, los anticuerpos contienen una o más CDRs de 17C9 (por ejemplo, una o más CDRs expuestas en los SEQ ID NOS: 464-469 y 483) y una región de estructura heteróloga. En algunos ejemplos, los anticuerpos contienen una o más CDRs de 69F6 (por ejemplo, una o más CDRs expuestas en los SEQ ID NOS: 470-475 y 484) y una región de estructura heteróloga. Los residuos de estructura en las regiones de estructura se pueden sustituir con el residuo correspondiente para el anticuerpo donador de CDR para alterar,' tal como mejorar el enlace a antigeno. Estas sustituciones de estructura se identifican por métodos bien conocidos en el campo, pór ejemplo, mediante la modelación de las interacciones de . la CDR y los residuos de estructura para identificar los' residuos de estructura que es importante para la comparación de enlace a a tigeno y secuencia para, identificar los residuos de · estructura inusuales en las posiciones particulares (véase, por ejemplo, Patente de EUA No.. 5, 585, 089; y Riechmann y colaboradores (1988) Nature 332:323) .
En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV ' derivados o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos tienen una constante de afinidad de enlace (Ka) para el epitopo de proteina F de RSV de por lo menos o aproximadamente lxlO8 M"1, por lo menos o aproximadamente 2.5xl08 M"1, por lo menos o aproximadamente 5xl08 M"1 por lo menos o aproximadamente' lxlO9 M"1, por lo menos o aproximadamente 5xl09 M"1, por lo menos o aproximadamente lxlO10 M"1, por lo menos o aproximadamente 5xl010 M"1, por lo menos o aproximadamente lxlO11 M"1, por lo menos o aproximadamente 5x1o11 M"1, por lo- menos ¦ o aproximadamente lxlO12 M_1, por lo menos o aproximadamente 5xl012 M-1, por lo menos o aproximadamente lxlO13 M"1, por lo menos o aproximadamente 5xl013 M_1, por lo menos o aproximadamente lxlO14 M"1, por lo menos o aproximadamente 5xl014 M_1, por lo menos o aproximadamente lxlO15 M'1-, o por lo menos o aproximadamente 5xl015 M"1.
En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV derivados o" fragmentos de enlace a antigeno de los mismos tiene una constante de disociación (Ka) para el 'epitopo de^ proteina F de RSV de menor . que o. aproximadamente lxlO-8 M, menor que o aproximadamente 4xl0"9 M, menor que o aproximadamente 2xl0"9 M, menor que o aproximadamente lxlO-9 M, menor que o aproximadamente 2xl0"10 M, menor que o aproximadamente lxlO"10 M, menor que o aproximadamente 2xl0-11 M, menor que o aproximadamente lxlO-11 M, menor que o aproximadamente 2xl0"12 M, menor que o aproximadamente lxlO"12 M, menor que o aproximadamente 2xl0"13 M, menor que o aproximadamente lxlO"13 M, menor que o aproximadamente 2xl0~14 M, menor que o aproximadamente lxl0_14-M, menor que o aproximadamente 2xl0~15 M, menor que o Aproximadamente lxlO-15 M, o . menor que o aproximadamente 2xl0~16 .
En algunos ejemplos, los anticuerpos, derivados anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos, neutralizan mutantes de escape de anticuerpos monoclonales . ' (MARMs ) en contra de diversos anticuerpos anti-RSV en un ensayo de microneutralización in vitro para la neutralización de RSV. En un ejemplo en particular, un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigenos del mismo aquí proporcionado neutraliza un ARM con¦ una EC50 para neutralización que es de o alrededor de la misma como la EC50 para neutralización de una cepa precursora de RSV a partir de la cual se genera el MARM .
En algunos ejemplos, los anticuerpos derivados anti-RSV o fragmentos de enlace a antigenos de los mismos,' se enlazan a un epitopo que es menos susceptible á la variación en la forma de mutantes de escape generados. En algunos ejemplos, RSV es incapaz de generar un mutante de escape después de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más rondas sucesivas de replicación viral en la presencia de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo aquí proporcionado. En otro ejemplo en particular, RSV no puede efectuar el escape desde un anticuerpo- derivado anti-RSV o fragmentod' e enlace a antigenos aquí proporcionado.
En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV derivados o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos tiene una EC50 de menor que o aproximadamente 0.005 nM, menor que o aproximadamente 0.01 nM, menor que o aproximadamente 0.025 nM, menor que o aproximadamente 0.05 nM, menor que o aproximadamente 0.075 nM, menor que o aproximadamente 0.1 nM, menor que o aproximadamente 0.5 nM, menor que o aproximadamente 0.75 nM, menor que o aproximadamente 1 nM, menor que o aproximadamente 1.25 nM, menor que o aproximadamente 1.5 nM, menor .que o aproximadamente 1.75 nM, o menor que o aproximadamente 2 nM en un ensayo de microneutralización in vitro para la neutralización de RSV. En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-RSV derivados o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos tienen ' una EC50 para la neutralización de RSV en un ensayo de reducción de placas in vitro de menor que o aproximadamente 0.005 nM a menor que o aproximadamente 2 nM; menor que o aproximadamente 0.005 nM a menor que o aproximadamente 1 nM; menor que o aproximadamente 0.005 nM a menor que o aproximadamente 0.5 nM; menor que o aproximadamente 0.01 nM a menor que o aproximadamente 1 nM; menor que o aproximadamente 0.05 nM a menor que o aproximadamente 1 nM; menor que o aproximadamente 0.05 nM a menor que o aproximadamente 0.5 nM; o menor que o aproximadamente 0.1 nM a menor que o aproximadamente 0.5 nM.
Cualquier derivado de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a .antigeno del mismo proporcionado en este documento se puede usar en regímenes terapéuticos, terapias de profilaxis y/o técnicas de diagnóstico, tal como en los métodos proporcionados. Por ejemplo, los anticuerpos derivados o fragmentos de enlace a . antígeno de los mismos se pueden usar para enlazarse a . RSV para el tratamiento, prevención y/o supresión de la infección por RSV o alivio de uno o más síntomas de una infección por RSV. i. Anticuerpos de Cadena Individual En ejemplos particulares,' el anticuerpo anti-RSV es un anticuerpo de cadena individual. Un anticuerpo de cadena individual se puede generar a partir de los dominios de enlace a antígeno de cualquiera de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de. los mismos proporcionados en este documento. Los métodos para generar anticuerpos de cadena individual que usan técnicas recombinantes son conocidos en el campo, tales como aquellos descritos en, por ejemplo, Marasco y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. 90:7889-7893, hitlow and Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; Pack y colaboradores (1993) Bio/Technology 11:1271-77; y . Patentes de EUA Nos. 4,946,778, 5,840,300, 5,667,988, 5,658,727.
Un anticuerpo de. cadena individual puede contener un dominio variable de cadena ligera (VL) o región funcional del mismo y un dominio variable de cadena pesada (VH) o región funcional del mismo en cualquier anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento. En algunos ejemplos, el dominio VL o región funcional del mismo del anticuerpo de cadena individual contiene una región determinadora de complementariedad 1 (CDR1), una región determinadora de complementariedad 2 (CDR2) y/o una región determinadora de complementariedad 3 (CDR3) de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento. En algunos ejemplos, el dominio VH o región funcional del mismo del anticuerpo de cadena individual contiene una región determinadora de complementariedad 1 (CDR1) ,. una región determinadora de complementariedad 2 (CDR2) y una región determinadora de complementariedad 3 (CDR3) de cualquier anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento. En algunos ejemplos, el anticuerpo de cadena individual contiene además una ligadura de péptido. En estos ejemplos, una ligadura de péptido se puede localizar entre el dominio variable de cadena ligera. (VL) y el dominio variable de cadena pesada (VH) .
El anticuerpo de cadena individual puede contener un espaciador de péptido, o ligadura, entre el uno o más dominios del anticuerpo. Por ejemplo, el dominio' variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo se puede acoplar a un dominio variable de cadena .pesada (VH) a través de un péptido de ligadura flexible. Varias ligaduras de péptido son bien conocidas en el campo y se pueden emplear en los métodos proporcionados. Una ligadura de péptido puede incluir una serie de residuos de glicina (Gly) o residuos de Serina (Ser). Ligaduras de polipéptido ejemplares son péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos (Gly-Ser)n, (GlymSer)n o (SermGly)n, en los cuales m es 1 a 6, en general 1 a 4, y típicamente 2 a 4, y n. es l a 30, . o l a 10, y típicamente 1 a 4, con algún ácido glutámico. (Glu) o residuos de lisina (Lys) dispersados completamente para incrementar la solubilidad (véase, por ejemplo, solicitud de PCT Internacional No. WO 96/06641, que proporciona ligaduras ejemplares para el uso en conjugados) . Las ligaduras de péptido ejemplares incluyen, pero no se limitan a péptidos que tiene la secuencia GGSSRSSSSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 267), GSGRSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 268), EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 269), EGKSSGSGSESKSTQ (SEQ ID NO: 270) , EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 271), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 272), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 273), y ESGSVSSEELAFRSLD (SEQ ID NO: 274) . En general, ' los péptidos de ligaduras tienen aproximadamente 1^-50 aminoácidos en longitud. Las ligaduras usadas en este documento también pueden incrementar la disponibilidad intracelular , estabilidad en suero, especificidad y solubilidad o · proporcionan flexibilidad incrementada o aliviar el' impedimento estérico. Las porciones de enlace, se describen, ¦ por ejemplo, por Huston y colaboradores (1988) Proc Nati Acad Sci EUA 85:5879-5883, Whitlow y colaboradores (1993) Protein Engineering 6:989-995, y Newton y colaboradores, (1996) Biochemistry 35:545-553. Otras ligaduras de péptido adecuadas incluyen cualquiera de aquellas descritas' en la Patente de EUA No ..4 , 751 , 180 o 4,935, 233, que se incorporan en este documento a manera de referencia. ii. Anticuerpos Anti-idiotipicos Los anticuerpos anti-RSV o fragmento de enlace a antigenos de los mismos proporcionados en este, documento se pueden usar para generar anticuerpos . anti-idiotipicos que "imitan" el antigeno de ' proteina F de RSV, a la cual el anticuerpo se enlaza inmunoespecificamente, usando técnicas bien conocidas por aquellas personas expertas en el campo (véase, por ejemplo, Greenspan & Bona (1989) , FASEB J. 7 (5) : 437-444; and Nissinoff (1991) J. Immunol ¦ 147 (8) : 2429-2438) . Por ejemplo, los anticuerpo anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno . de los mismos proporcionados en este documento que se enlazan a, e inhiben competitivamente el enlace de RSV a su receptor de célula hospedera, como es determinado por los ensayos bien conocidos en el campo, se pueden usar para generár anti-idiotipos que "imitan" un antigeno de RSV y se enlazan a los receptores de RSV, es decir, compiten con el virus para enlazarse a la célula hospedera, disminuyendo por lo tanto la tasa de infección de las células hospederas con el virus. En algunos ejemplos, los anti-anti-idiotipos se pueden generar mediante técnicas bien conocidas por el artífice experto. Los anti-anti-idiotipos imitan el dominio de enlace del anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo y, como consecuencia, se enlaza a y neutraliza el RSV. iii. Anticuerpos Multi-especí icos y Multimerización de Anticuerpos Dos o más anticuerpos o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento se pueden diseñar para formar anticuerpos derivados multivalentes, o multimeros, tales como anticuerpos derivados bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes, hexavalentes , heptavalentes , o de mayor valencia (es decir, que contienen 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más sitios de enlace a antigenos). Estos anticuerpos derivados multivalentes pueden ser monoespecificos , biespecificos, triespecificos o de mayor multiespecificidad . En algunos ejemplos, los anticuerpos derivados multivalentes son monoespecificos , que contienen dos o más dominios de enlace a antigeno que se enlazan inmunoespecificamente al mismo epitopo. En algunos ejemplos, los anticuerpos derivados multivalentes son multiespecificos , que contienen dos o más dominios de enlace a antigeno que se enlazan inmunoespecificamente a dos o más epitopos diferentes. En algunos ejemplos particulares, los anticuerpos derivados multivalentes son bivalentes, que contienen dos dominios de enlace a antigeno. Estos anticuerpos bivalentes pueden ser anticuerpos homobivalentes o heterobivalentes , que se enlazan inmunoespecificamente' a los mismos o. diferentes epitopos, respectivamente.- En algunos ejemplos, los anticuerpos multiespecíficos se pueden enlazar inmunoespecíficaménte a dos o. más epítopos diferentes de RSV. Las técnicas para diseñar anticuerpos multiespecíficos son conocidas en el campo, e¦ incluyen, por ejemplo, enlace de dos o más fragmentos de enlace a antígeno a través del enlace covalente, no coval'ente o químico. En algunos casos, los anticuerpos derivados · multivalentes se pueden formar mediante dímerización de dos o más anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos. La multimerización entre dos anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos puede ser espontánea, o puede llevarse a cabo debido al enlace forzado de dos o más polipéptidos . En algunos ejemplos, los multímeros de los anticuerpos anti-RSV se pueden enlazar por enlaces de disulfuro formados entre los residuos de cisteína o diferentes anticuerpos anti-RSV. En otro ejemplo, los anticuerpos derivados multivalentes pueden incluir anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos unidos a través de interacciones covalentes o no covalentes a las porciones de péptido fusionadas al anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo. Estos péptidos pueden ser ligaduras de péptido (espaciadores) , o péptidos que tienen la . propiedad de promover la multimerización. En algunos ejemplos, los anticuerpos derivados multivalent.es se pueden formar entre dos anticuerpos a través de enlace químico, tal como por ejemplo, al usar ligaduras heterobifuncionales .
Cualquier anticuerpo derivado multiespecífico y/o multivalente se puede generar a . partir de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlacé a antígeno de .los mismos proporcionados en este documento con la condición de que el anticuerpo sea biocompatible .(por ejemplo, para la administración a animales, incluyendo humanos) y mantenga su actividad, tal como el enlace a uno o más epítopos de y/o neutralización de RSV. Para los anticuerpos derivados multiespecífieos y multivalentes proporcionados en este documento, el anticuerpo derivado es por lo menos inmunoespecífico para un epítopo reconocido por 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6. El anticuerpo derivado multiespecífico y multivalente aquí proporcionado también puede ser inmunoespecífico para el epítopo reconocido por 58c5 o sc5.
Eñ algunos ejemplos, el anticuerpo multiespecífico y/o multivalente contiene una VH CDR1 VH que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta e.n SEQ ID NOS: 2, 10, 405, 411, .417, 423, 429, 435-441, 458, 464, 470 o 482-484, una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 3, 11, 406, 412, 418,. 424, 430, 459, 465 o 471, una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 4, 12, 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 o 472, una CDR1 VL- que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 6, 14, 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 o 473, una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 7, 15, 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 o 474, una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 8, 16, 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 o 475 o' cualquier combinación · de las mismas.
En algunos ejemplos, los anticuerpos multiespecificos que se pueden generar se enlazan inmunoespecificamente a dos o más epitopos de. una proteina F de RSV (por ejemplo, una proteina F de RS que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en los SEQ ID NO: 282, 382. o 485). Por ejemplo, los anticuerpos multiespecificos se pueden enlazar inmunoespecificamente a dos o más epitopos diferentes en las regiones antigénicas A, B o C de una proteina- F de RSV. En algunos ejemplos, los anticuerpos multiespecificos que se pueden generar se enlazan inmunoespecificamente a un epitopo de una proteina F de RSV y a otro epitopo de RSV. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecificos se pueden enlazar inmunoespecificamente a un epitopo de una protéina F de RSV y a un epitopo de otra glicoproteina superficial de RSV. En algunos ejemplos, los anticuerpos multiespecificos. se pueden enlazar inmunoespecificamente a un epitopo de una proteína F de RSV y a un epítopo de una proteína de RSV seleccionada de entre una proteína de unión de RSV (por ejemplo que. tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 275),· una proteína estructural grande (proteína L) de subu.nidad beta de RNA polimerasa de RSV (por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en los SEQ ID NO: 276), una proteína de la nucleocápside de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en los SEQ ID NO: .' 277),. una nucleoproteína¦ (N) de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 278), una fosfoproteína P de RSV (por ejemplo que tiene una. secuencia de aminoácidos expuesta en los SEQ ID NO: 279), una proteína de matriz de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 280) , . una proteína hidrofóbica pequeña (SH) de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en los SEQ ID NO: 281), una polimerasa dependiente de RNA de RSV, una proteína G de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en los SEQ ID NO: 282) , o una variante alélica de cualquiera de lo anterior. En. algunos ejemplos, los anticuerpos multiespecífieos se pueden enlazar inmunoespecificamente a un epítopo de una proteína F de RSV y un epítopo dé una proteína G de RSV.
En algunos ejemplos, el anticuerpo multiespecifico contiene un fragmento de enlace a antigeno de anti-RSV derivado de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3," 90D3, 56E11, .17C9 o 69F6 y un fragmento de enlace a antigeno de anti-RSV derivado de otro anticuerpo anti-RSV. Por ejemplo,, el otro anticuerpo anti-RSV puede ser un anticuerpo o fragmentod e . enlace a antigenos derivado de 58c5 o sc5. En algunos ejemplos, el anticuerpo multiespecifico contiene un fragmento de enlace a antigeno de anti-RSV derivado de 30D8, 104E5, . 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6 y un fragmento de enlace a antigeno anti-RSV derivado de un anticuerpo anti-RSV seleccionado entre palivizumab ( SYN7AGISMR) , y derivados del mismo, tal como, pero no se limita a, motavizumab (NUMAXMR) , AFFF, P12f2, P12f4, Plld4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, ?4?4,· . A8c7-, IX-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF ( 1 ) , 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13all, Alh5, A4B4(1),. A4B4L1FR-S28R, . A4B4-F52S (véase, por ejemplo, Patentes de EUA Nos., 5,824,307 y 6,818,216). En algunos ejemplos, el anticuerpo multiespecifico contiene un fragmento de enlace a antigeno anti-RSV derivado de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6 y un fragmento de enlace a antigeno anti-RSV derivado de un anticuerpo anti-RSV humano, tal como, pero no se limita a, rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9 (es decir Fab' 9) , rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, y RF-2 . (véase, por ejemplo Patentes de EUA Nos. 6,685,942 y 5,811,524). En algunos ejemplos, el anticuerpo multiespecifico contiene un fragmento de enlace a antigeno anti-RSV derivado de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 6'9F6 y . un fragmento de enlace a antigeno anti-RSV derivado de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-RSV tal como, pero no se limita a, MAbs 1153, 1142, 1200, 1214, 1237-, 1129, 1121, 1107, 1112, 1269, 1269, 1243 (Beeler y colaboradores (1989) J. Virology 63(7):2841-2950), MAbl51 (Mufson y colaboradores (1987) J. Clin. Microbiol. 25:1635-1539), MAbs 43-1 y 13-1 (Fernie y colaboradores (1982) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 171:266-271) , MAbs 1436C, 1302A, 1308F, y 1331H (Anderson y colaboradores (1984) J. Clin. Microbiol. 19:934-936), y derivados humanizados de los mismos. Anticuerpos ejemplares adicionales o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos que se pueden usar para generar un. anticuerpo multiespecifico que tiene un fragmento de enlace a- antigeno anti-RSV derivado de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6 incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos descritos en, por ejemplo, Patentes de EUA Nos. 6,413,771, 5,840,298, 5,811,524, 6,656,467, 6,537,809, 7,364,742, 7,070,786, 5,955,364, 7,488,477, 6,818,216, 5,824,307, 7,364,737, 6,685,942, y 5,762,905 y Publicación de patente de ' EUA .Nos. 2007-0082002, 2005-0175986, 20.04-0234528, 2006-0198840, 2009-0110684, 2006-0159695, 2006-0013824,· 2005-0288491, 2005-0019758, 2008-0226630, 2009-0137003, y 2009-0092609. Las Tablas -2A y 2B a continuación establecen SEQ ID Nos para cadenas ligeras (Tabla 2B) y cadenas pesadas (Tabla 2A) de anticuerpos anti-RSV. Se incluyen secuencias de longitud completa de cadenas ligeras y pesadas, secuencias para dominios variables ligeros y pesados, y secuencias de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDR11, DRL2 y/o CDR13, donde se indique.
En algunos ejemplos, los anticuerpos multiespecificos o fragmentos de enlace a antigeno se pueden enlazar inmunoespecificamente a un epitopo de una proteina F de RSV y un epitopo de otro polipéptido heterólogo u otro material antigér.ico, tal como, por ejemplo, un material de soporte sólido (véase, por ejemplo, Publicaciones' . de- PCT Internacional Nos. O 93/17715, WO . 92/08802,. WO 91/00360, y WO 92/05793; Patentes de EUA Ños. 4,474,893, 4,714,681, 4,925,648, 5,573,920, y. 5,601,819; Tutt, y colaboradores, (1991) J. Immunol. 147:60-69; y. Kostelny y colaboradores, (1992) J. Immunol 148:1547-1553. (1) Multimerización a través de Ligaduras de Péptido Las ligaduras de péptido se pueden usar para producir anticuerpos multivalentes, tales como, por ejemplo, un multimero donde un compañero dé multimerización es un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento. En un ejemplo, las ligaduras de péptido se pueden fusionar al extremo C-terminal de un primer polipéptido y al extremo N-terminal de un segundo polipéptido. ' Esta estructura, se puede repetir múltiples veces tal que por lo menos uno, tal como 2, 3, 4, o más polipéptidos solubles se enlazan entre ' a través de ligaduras de péptido en sus terminales respectivas. Por-ejemplo, un polipéptido multímero puede tener una' secuencia Zi-X-Z2f donde Z1 y Z2 cada una son una secuencia de un fragmento de enlace a antigeno anti-RSV (por ejemplo un anticuerpo de cadena individual de anti-RSV; véase, por ejemplo, Patente de EUA No. 6,759,518, que describe la multimerización de anticuerpos de cadena individual) y donde X es una secuencia de una ligadura de péptido. En algunos casos, Zi y/o Z2 es un fragmento de enlace a antigeno anti-RSV proporcionado en este documento. En' otro ejemplo, ?? y Z2 son fragmentos de enlace a antigeno anti-RSV diferentes, donde por lo menos Zx o Z2 se deriva de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento. En algunos ejemplos, el polipéptido multímero tiene una secuencia de Zi~X-Z2- (X-Z ) n, donde "n" es cualquier número entero, es decir en general 1 o 2. Típicamente, la ligadura de péptido es de longitud suficiente para permitir que cada fragmento de enlace a antigeno anti-RSV se enlace a su epítopo respectivo sin interferir con la especificidad de enlace del anticuerpo. (2) Multimerización a través de Agentes de Enlace Heterobifunclonales El ligado de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento a otro anticuerpo anti-RSV o fragmento de . enlace a antígeno para crear un anticuerpo multivalente puede ser directo o indirecto. Por ejemplo, el ligado de dos o más anticuerpos anti-RSV o fragmentos -de enlace a antigeno sé puede lograr mediante el enlace . químico o facilitar por las · ligaduras heterobifuncionales , tales como cualquier conocido en el campo o proporcionado en este documento.
Numerosos reactivos de reticulación heterobifuncionales que se usan para formar enlaces covalentes entre grupos amino y grupos tiol y para introducir grupos tiol en las proteínas son conocidos por aquellas personas de . experiencia en este campo (véase, por ejemplo, the PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993, que describe la preparación y uso -de estos reactivos y proporciona una fuente comercial para estos reactivos; véase, también, por ejemplo, Cumber y colaboradores,. (1992) Bioconjugate Chem. 3:397-401; Thorpe ¦ y colaboradores, ' (1987) Cáncer Res. 47:5924-5931; Gordon y colaboradores, (1987) Proc. Nati. Acad Sci. 84:308-312; Walden y colaboradores, (1986) J. Mol. Ce.ll Immunol. 2:191-197; Carlss'on y colaboradores,. (1978) Biochem. J. 173: 723-737; Mahan . y colaboradores, (1987) Anal. Biochem'. 162:163-170; Wawryznaczak y colaboradores, (1992) Br. J. Cáncer 66:361-366; Fattom y colaboradores, (1992) Infection & Immun. 60:584-589). Estos reactivos se pueden usar para formar enlaces covalentes . entre dos anticuerpos o entre cada uno de los anticuerpos' y una ligadura. Reactivos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP; ligadura de disulfuro) ; sulfosuccinimidil-6- [ 3- (2-piridilditio) propionamido]hexanoato ( sulfo-LC-SPDP) ; tiosulfato de succinimidiloxicarbonil-a-metil-bencilo (SMBT, ligadura de disulfato impedido) ; succinimidil- 6- [3- (2-piridilditio) -propionamido] -hexanoato (LC-SPDP) ; sulfosuccinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) ; . succinimidil-3- (2-piridilditio) butirato (SPDB; ligadura de unión de disulfuro impedido); sulfosuccinimidil 2- (7-azido-4-metilcumarin-3-acetamida) -etil-1 , 3' -ditiopropionato (SAED); sulfosuccinimidil-7-azido-4-metilcumarin-3-acetato (SAMCA); sulfosuccinimidil-6- [alfa-metil-alfa- (2-piridilditio) -toluamido] -hexanoato (sulfo-LC-SMPT) ; 1, -di- [3' 2' -piridilditio) propion-amido] butano (DPDPB) ; 4-succinimidiloxicarbo.nil-a-metil-a- (2-piridiltio) tolueno (SMPT, ligadura impedida de disulfuro) ; sulfosuccinimidil-6-[oí-metil-a- (2-pirimiildi-tio) toluamido] hexanoato . (sulfo-LC-SMPT) ; éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida (MBS) ; éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfo-succinimida (sulfo-MBS) ; N-succinimidil-4-yodoacetil ) aminobenzoato (SIAB; ligadura de tioéter) ; sulfosuccinimidil- (4-yodoacétil) amino benzoato ( sulfo-SIAB) ; succinimidil-4- (p-maleimi-dofenil ) butirato (SMPB) ; sulfosuccinimidil-4- (p-maleimido-fenil) butirato (sulfo-SMPB) ; y azidobenzoil-hidrazida (ABH).. En algunos ejemplos, las ligaduras, se pueden usar' en combinación con ligaduras de péptido, tales como aquellas que incrementan la flexibilidad o solubilidad o que proporcionan o eliminan el impedimento esférico. Cualquier otra ligadura conocida por aquellas .personas de. experiencia en el campo para enlazar una molécula de polipéptido a otra molécula se puede emplear. (3) Dominios de Multimerizacioh de Polipeptidos La interacción de dos o más fragmentos de , enlace a antigeno para formar anticuerpos derivados multivalentes y/o multiespecificos se puede facilitar por su enlace, ya sea directa o indirectamente, a cualquier porción b a otro polipéptido que por. si mismos son capaces de interactuar para formar una estructura 'estable. Por ejemplo, las cadenas de polipéptido codificada separadas se pueden unir por multimerización, mediante lo cual, l'a multimerización de los polipéptidos es mediada por un dominio de multimerización. Típicamente, el dominio de multimerización proporciona la formación de una interacción de proteína-próteína estable entre un primer polipéptido quimérico y' un segundo polipéptido quimérico . _ Los polipéptidos quiméricos incluyen, por ejemplo, ligadura (directa o indirectamente) de una cadena (por ejemplo, un dominio de cadena pesada variable o dominio de cadena ligera variable) de un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo con un dominio de multimerización . Típicamente, el dominio de multimerización se enlaza a un dominio de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo. Estos polipéptidos quiméricos se pueden generar como proteínas de fusión usando técnicas recombinantes para fusionar l ácido nucleico que codifica la cadena de anticuerpos al ácido nucleico que codifica el dominio de multimerización.
Para los anticuerpos derivados multivalentes y/o multiespecíficos proporcionados en este documento, por lo menos un compañero de . multimerización es un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno del mismo enlazado directa o indirectamente a- un dominio de multimerización. Los polipéptidos homo- o heteromultiméricos se pueden generar de la co-expresión de polipéptidos quiméricos separados. El primero y segundo polipéptidos quiméricos pueden ser los mismos o diferentes.
En general, un dominio de multimerización incluye cualquier polipéptido capaz de formar una interacción de proteína-proteína estable con otro polipéptido. Los dominios de multimerización pueden interactuar, por ejemplo, a través de una secuencia de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio Fe) , una cremallera de leucina, una región hidrófóbica, una región hidrofilica, o un tiol libre que forma un enlace de disulfuro intermolecular entre las moléculas quiméricas de un homo- o heteromultímero . Además, un dominio de multimerización puede incluir una secuencia de aminoácidos que comprende una complementariedad de protuberancia a una secuencia de aminoácidos que comprende un agujero o cavidad, tal como se describe, por. ejemplo, en la Patente de EUA No. 5,731,168. Se puede diseñar tal región de multimerización tal que las interacciones estéricas no promuevan solamente la interacción estable, sino promuevan adicionalmente la formación de heterodimeros sobre los homodímeros de una mezcla de monómeros quiméricos.
En algunos ejemplos, los anticuerpos multivalentes y/o multiespecificos son generados por la ligadura de dos fragmentos de enlace a antigeno anti-RSV a través del dominio de multimerización. En estos ejemplos, por lo menos uno de los fragmentos de enlace a antigeno se deriva de un anticuerpo anti-RSV o' fragmento . de enlace a antigeno del mismo proporcionado en este documento, tal como por ejemplo, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6. · Un polipéptido de enlace a antigeno, tal como por ejemplo fragmento de enlace', a antígeno anti-RSV, se puede conjugar a un dominio de polimerización para formar un polipéptido quimérico. Para los fragmentos de enlace a antigeno anti-RSV que- contengan más de una cadena (por ejemplo un dominio de cadena pesada variable y un dominio de cadena ligera variable), el dominio de multimeri.zación se puede conjugar, a una de las cadenas, típicamente la cadena pesada. El fragmento de enlace a antígeno se enlaza típicamente al dominio de multimerización típicamente a través de sus terminales N o C a la terminal N o C del dominio de multimerización: Típicamente, el dominio de multimerización se conjuga con la C-terminal del fragmento de enlace a antígeno (por ejemplo, la C-terminal de un anticuerpo de cadena individual o la C-terminal de una cadena del fragmento de enlace a antígeno) . El enlace puede ser directo o indirecto a través de una ligadura. También, el polipéptido quimérico puede sér una proteína de fusión o se puede formar del enlace químico, tal como a través de interacciones covalentes o no covaléntes. Por ejemplo, al preparar un polipéptido quimérico que contenga un dominio de multimerización, el ácido nucleico . que codifica todo o parte de un fragmento de enlace a antígeno anti-RSV . se puede enlazar operativamente al ácido nucleico que codifica a la secuencia de dominio de multimerización, directa o indirectamente u opcionalmente a través de un dominio de ligadura. Típicamente, el constructo codifica una proteína quimérica donde el C-terminal del fragmento' de ' enlace a antígeno anti-RSV (o cadena individual, del fragmento de enlace a antígeno) se une al N-terminal del dominio de multimerizacion. · .
Un anticuerpo multivalente proporcionado en este documento contiene dos . proteínas quiméricas creadas al enlazar, directa o indirectamente, dos de los mismos fragmentos de enlace a antígeno anti-RSV o diferentes directa o indirectamente a un dominio de. multimerizacion'. En algunos ejemplos, donde el dominio de multimerizacion es · un polipéptido, una fusión génica que codifica el polipéptido quimérico de dominio de multimerizacion de fragmento de enlace a antígeno anti-RSV (o cadena ligera del fragmento de enlace a antígeno) se inserta en un vector de expresión apropiado. Las proteínas quiméricas de · dominio de multimerizacion de fragmento de enlace a antígeno anti-RSV resultante se pueden expresar en las células hospederas transformadas con el vector de expresión recombinante , y se dejan ensamblar en multímeros donde los dominios de multimerizacion interactúan para . formar modalidades multivalentes . El enlace químico de los . dominios de multimerizacion a fragmentos de enlace a antígeno anti-RSV también se puede efectuar usando ligaduras heterobifuncionales como se plantea en lo anterior. En algunos ejemplos, los anticuerpos multivalentes son anticuerpos multiespecificos que se derivan de dos . o más fragmentos de enlace a antigeno' anti-RSV que se enlazan a diferentes epitopos.
Los polipéptidos quiméricos resultantes, y los anticuerpos multivalentes formados de los mismos, se pueden purificar mediante · cualquier método adecuado conocido en el campo, tal como, ¦ por. ejemplo, mediante cromatografía por afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G. Donde las dos moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos quiméricos de enlace a antígeno anti-RSV diferente se transforman en células, la formación de homo y heterodímeros se llevará a cabo. Las condiciones para la expresión se pueden ajusfar para que · la formación de heterodímeros se favorezca sobre la formación de homodímeros. (a) Dominio de Inmunoglobulina Los dominios de multimerización incluyen aquellos que comprenden una porción de tiol libre capaz de reaccionar para formar un enlace de disulfuro intermolecular con un dominio de multimerización . de una secuencia de aminoácidos adicional. Por ejemplo, un dominio de multimerización puede incluir una porción de una molécula de inituanoglobulina, tal como de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, e IgE. En general, la porción de una inmunoglobulina seleccionada para el uso como un dominio de multimerización es la región constante (Fe). Se han descrito preparaciones . de proteínas de fusión que contienen polipéptidos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpo, incluyendo el dominio Fe (véase, por ejemplo, Ashkenazi y colaboradores (1991) PNAS 88: 10535; Byrn y colaboradores (1990) Nature, 344:677; and Hollenbaugh and Aruffo, (1992) "Construction of Immunoglobulin Fusión Proteins," in Current . Protocole in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11).
En humanos, existen cinco isotipos de anticuerpos clasificados con base en sus cadenas pesadas indicadas como delta (d), gamma (?) , mu (µ),· alfa (o¡) y épsilon (e), que dan origen a las clases IgD, IgG, IgM, IgA, e IgE de anticuerpos, respectivamente. Las clases IgA e IgG contienen las subclases IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, IgG3, e IgG . Las diferencias de secuencia entre las cadenas pesadas de inmunoglobulina hacen que varios isotipos difieran, por ejemplo, en el número de dominios constantes (C) , la presencia de una región bisagra, y el número y ubicación de enlaces de disulfuro de inter-cadena. Por ejemplo, las cadenas pesadas de IgM e IgE contienen un dominio C extra (C4), que reemplaza la región bisagra. Las regiones Fe de IgG, IgD, e IgA se parean entre si a través de sus dominios Cy3, C53, y Ca3, mientras que las regiones Fe de IgM e IgE se dimerizan a través de sus dominios Cp4 y Cs4. IgM e IgA forman, estructuras multivalentes con diez y cuatro sitios de enlace a antigeno, respectivamente.
Los polipéptidos quiméricos de enlace a antigeno proporcionados en este documento incluyen polipéptidos de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, incluyendo todos los dominios de inmunoglobulinas de longitud completa) . En algunos ejemplos, el . polipéptido quimérico de enlace a antigeno es menor que la longitud completa (por ejemplo, el polipéptido quimérico puede contener el dominio de enlace a antigeno y uno o más dominios de inmunoglobulina para la multimerización, donde el polipéptido quimérico no es una inmunoglobulina de longitud completa) . En algunos ejemplos, los polipéptidos quiméricos de enlace a antigeno anti-RSV se ensamblan como anticuerpos monovalentes o hetero- u homo-multivalentes , tales como anticuerpos bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes, hexavalentes , heptavalentes o de mayor valencia. Las cadenas ó unidades básicas de estructuras variantes (por ejemplo, una o más regiones o dominios constantes heterólogos) se pueden usar para ensamblar los anticuerpos monovalentes y hetero- y homo-multivalentes . Los polipéptidos quiméricos de- enlace a antigeno anti-RSV se pueden producir fácilmente y secretar por células de mamífero transformadas con la molécula de ácido nucleico apropiada. En algunos ejemplos,1 una¦ o más de una molécula de fusión, de ácido nucleico se puede transformar en células hospederas para producir un .anticuerpo multivalente donde las porciones de enlace a antígeno. anti-RSV del anticuerpo multivalente son las mismas, o diferentes. Típicamente, por lo menos una de las porciones de. enlace a antígeno anti-RSV del anticuerpo multivalente se deriva de un anticuerpo anti-RSV o . fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento,- tal como por ejemplo, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11,. 17C9 o 69F6. ¦' (i) Dominio Fe Los dominios de multimerización ejemplares .que se pueden usar para generar anticuerpos multivalentes y/o multiespecífieos que contienen un fragmento¦ de enlace a antígeno anti-RSV proporcionado . en este documento incluyen polipéptidos derivados de una región o' dominio constante de cadena pesada de · una molécula de inmunoglobulina seleccionada. Secuencias ejemplares de regiones constantes de cadena pesada para subtipos de IgG humana se exponen en SEQ ID NOS: 356 (IgGl), SEQ ID O:357 (IgG2), SEQ ID NO:358 (IgG3), y SEQ ID NO:359 (IgG4). Por ejemplo, para la región constante de cadena pesada ejemplar expuesta en SEQ ID NO:356, el dominio CH1 corresponde a los aminoácidos 1-103, la región bisagra corresponde a los- aminoácidos 104-119, él dominio CH2 corresponde a los aminoácidos 120-223, y el dominio CH3 corresponde a los aminoácidos 224-330.
En un ejemplo, una proteina quimérica de polipéptido de inmunoglobulina puede incluir la región Fe de un polipéptido de inmunoglobulina. Típicamente, esta fusión retiene por . lo menos una bisagra funcionalmente activa,, dominios CH2 y CH3 de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Por ejemplo, la secuencia Fe de longitud completa de IgGl incluye los aminoácidos 104-330 de la secuencia expuesta en SEQ ID. NO: 356. Una secuencia Fe ejemplar para hlgGl se expone en SEQ ID NO: 360, y contiene la secuencia bisagra que corresponde a los aminoácidos 104-119 de SEQ ID NO: 3.56, y la secuencia completa para el dominio CH2 y CH3 como se. expone en SEQ ID NO: 356. Otro polipéptido Fe ejemplar se expone en la solicitud de PCT O 93/10151., y es un polipéptido de cadena individual que se extiende desde la región bisagra N-terminal hasta la C-terminal nativa de la región Fe de un anticuerpo IgGl humano (SEQ ID NO: 361) . El sitio preciso en el cual el enlace se hace no .es crítico: sitios . particulares' son bien conocidos en el campo y se pueden seleccionar a fin de optimizar la actividad biológica,' secreción, o características de enlace del polipéptido quimérico de enlace a antígeno anti-RSV. Por ejemplo, otras secuencias de polipéptido Fe ejemplares comienzan en el aminoácido C109 o P113 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 356 (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0024298) .
Además de hlgGl Fe, otras regiones Fe también se pueden incluir en los polipép'tidos quiméricos de enlace a antígeno anti-RSV proporcionado en este documento. Por ejemplo, las fusiones Fe pueden contener secuencias de inmunoglobulina que se codifican sustancialmente por genes de inmunoglobulina que pertenecen a cualquiera de las clases de anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a IgG (incluyendo ' subclases humanas IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4), ¦ IgA (incluyendo subclases humanas IgAl e IgA2), clases de anticuerpos IgD, IgE, e IgM.
En algunos ejemplos,- un dominio Fe se puede seleccionar con base en las propiedades funcionales del dominio, · tal como, por ejemplo, las funciones efectoras del dominio Fe en la mediación de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, donde las funciones efectoras mediadas por interacciones Fc/FcyR se van a minimizar, la función, con isotipos IgG que reclutan eficientemente células de complemento efectoras, tales como por ejemplo, la Fe de IgG2 o IgG4, se pueden usar.
Los dominios Fe modificados también se contemplan en este documento para el uso en las quimeras con fragmentos de enlace a antígeno anti-RSV, véase por ejemplo la Patente de EUA No. 7, 217, 797; y la Publicación de Patentes' de EUA Nos. 2006/0198840, 2006/0024298 y. 2008/0287657; y la Publicación de Patente Internacional No. WO 2005/063816 para modificaciones ejemplares. La modificación de aminoácido ejemplar de los dominios Fe también se proporcionan en cualquier lugar en este documento.
Típicamente, un anticuerpo bivalente es un' dimero de dos proteínas quiméricas creadas al enlazar,. directa o indirectamente, dos de los mismos fragmentos de enlace a antígeno anti-RSV o diferentes a un . polipéptido Fe. En algunos ejemplos, una fusión génica que codifica la proteína quimérica se inserta en un vector de expresión apropiado. Las proteínas quiméricas resultantes se pueden expresar en células hospederas transformadas con el vector de expresión recombinante, y se dejan ensamblar, donde se forman los enlaces de disulfuro de ínter-cadena entre las porciones Fe para producir anticuerpos anti-RSV divalentes. Típicamente, una célula hospedera y un sistema de expresión es un sistema de expresión de mamífero para permitir la glicosilación de la proteína quimérica. Los polipéptidos quiméricos resultantes contienen porciones Fe, y anticuerpos multivalentes formados de las mismas, se pueden . purificar fácilmente mediante cromatografía por afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G. Donde los dos ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos quiméricos anti-RSV diferentes se transforman en células, la formación de heterodímeros se debe lograr bioquímicamente puesto que las moléculas quiméricas anti-RSV que llevan el dominio Fe se expresarán como homodímeros enlazados a disulfuro también. De esta manera, los homodímeros se pueden reducir bajo condiciones que favorecen la alteración de los disulfuros de inter-cadena, pero no afectan los disulfuros intra-cadena . Típicamente los monómeros quiméricos con diferentes porciones extracelulares se mezclan en cantidades equimolares y se oxidan para formar una mezcla de homo y heterodímeros. Los componentes de esta mezcla se separan por técnicas cromatográfleas .
Alternativamente, la formación de un heterodímero se puede alterar al diseñar y al expresar genéticamente las moléculas de fusión de enlace a antígeno anti-RSV que contienen un fragmento de enlace a antígeno anti-RSV, seguido por el dominio Fe de hlgG, seguido por cremalleras de leucina c-jun o c-fos. Puesto que las cremalleras de leucina forman predominantemente heterodímeros, se pueden usar para conducir la formación de los heterodímeros cuando se desee, los polipéptidos quiméricos anti-RSV que contienen regiones Fe también se pueden, diseñar para incluir una etiqueta con quelatos de metal u otro epítopo. El dominio etiquetado se puede usar para rápida purificación por cromatografía de quelato de metal, y/o mediante anticuerpos, para permitir la detección de técnicas de western blot, inmunoprecipitación , o agotamiento/bloqueo de actividad en los bioensayos.
D. MODIFICACIONES ADICIONALES DE ANTICUERPOS ANTI-RSV Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos proporcionados en este- documento se pueden modificar adicionalmente . Las modificaciones de un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno pueden mejorar una o más propiedades, del anticuerpo, incluyendo pero no limitado a, disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno, mejorar la vida media del anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno, tal como reducir la susceptibilidad a la proteólisis y/o reducir la susceptibilidad a la oxidación, y alterar o mejorar las propiedades de enlace del anticuerpo, o fragmento de. enlace a antígeno del mismo. Modificaciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de la secuencia de aminoácidos primaria del anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno del mismo .y alteración de la modificación postraduccional del anticuerpo anti-RSV.o fragmento de' enlace a antígeno del mismo. Las modificaciones postraduccionales ejemplares incluyen, . por ejemplo, glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación con grupo protector/de bloqueo, escisión proteolitica, enlace a un ligando celular o a otra proteina. Otras modificaciones ejemplares incluyen la unión de uno o más. péptidos heterólogos al anticuerpo' anti-RSV o fragmento de enlace a antigeno para alterar o mejorar una o más propiedades del anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del.mismo. .
En general, las modificaciones no dan por resultado la inmunogenicidad incrementada del anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo o afectan significativamente de manera negativa el enlace del anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo al RSV. Los métodos para evaluar el enlace de los anticuerpos modificados o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos a una proteina F de RSV se proporcionan en este documento y son conocidos en el campo. Por ejemplo, los anticuerpos modificados o fragmento de enlace a antigenos de los mismos se puede someter a ensayo para enlazarse a una proteina F de RSV mediante métodos tales como, pero no se limitan a, ELISA, resonancia- de plasmones superficiales (SPR) , o a través de los ensayos dé microneutralización in vitro.
Se proporcionan en este documento métodos para mejorar la vida media de los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos. El incremento de la vida media de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento pueden incrementar la efectividad terapéutica de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos y permitir una administración menos frecuente de los anticuerpos o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos para profilaxis y/o tratamiento, tal como prevenir o tratar una infección por RSV, prevenir, tratar, y/o aliviar uno o más síntomas de una infección por RSV, o reducir la duración de una infección' or RSV.
La modificación de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos producidos en este documento puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos, supresiones, o- adiciones, ya sea de mutación natural o manipulación humana del anticuerpo precursor. Los métodos para la modificación de los polipéptidos, tales como anticuerpos, son conocidos en el campo y se pueden emplear para la modificación de cualquier anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento. En algunos ejemplos, las propiedades farmacocinéticas de los anti-RSV o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos proporcionados en este documento se. pueden mejorar a través de modificaciones de Fe mediante técnicas conocidas por aquellas personas expertas en el campo. Las' técnicas estándares conocidas por aquellas personas expertas en el campo se pueden usar para introducir mutaciones en la molécula de nucleótidos que codifican un anticuerpo o un fragmento de enlace a antigeno proporcionado en este documento a fin de- producir un polipéptido con una o más sustituciones de aminoácidos. Técnicas ejemplares para introducir mutaciones incluyen, preo no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis medida por PCR.
Los anticuerpos anti-RSV y los fragmentos de enlace a antigeno de los mismos proporcionados en este documento se pueden modificar por la unión de un péptido heterólogo para facilitar la purificación. En general estos péptidos se expresan como una proteina de fusión que . contiene el anticuerpo fusionado al péptido en la C o N-terminal del anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo. Péptidos ejemplares comúnmente usados para purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos de hexahistidina , péptidos de hemaglutinina (HA) , . y péptidos de etiqueta bandera (véase por ejemplo, Wilson y colaboradores (1984) Cell 37:767; Witzgall y. colaboradores (1994) · Anal Biochem 223:2, 291-8). La fusión no necesita necesariamente ser dirigida, pero puede llevarse a cabo a través de un péptido de ligadura. En algunos ejemplos, el péptido de' ligadura contiene un sitio de · escisión de proteasa que permite la remoción del péptido de purificación después de la purificación mediante escisión con una proteasa que reconoce específicamente el sitio de escisión de proteasa.
Los anticuerpos anti-RSV y los fragmentos de enlace a antígeno de los mismos proporcionados en este · documento también se pueden modificar por la unión de un polipéptido heterólogo que fija como objetivo el anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno a un tipo de célula particular (por ejemplo células epiteliales respiratorias), ya sea in vitro o in vivo. En algunos · ejemplos un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace a antígeno del mismo proporcionado en este documento se puede fijar como objetivo a un tipo de célula particular al fusionar o al conjugar el anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo a un anticuerpo específico para un receptor de superficie celular particular o a otro polipéptido que interactúa con un receptor de células específicas.
En algunos ejemplos, un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente puede dirigirse a una superficie celular objetivo y/o tomarse por la célula objetivo al fusionar o conjugar el anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo a un péptido que enlaza a glicoproteínas de superficie celular, tal como un dominio de transducción de proteina (por ejemplo, ' un péptido TAT) . Los dominios de transducción de proteina ejemplares incluyen, pero no se limitan a, PTDs derivados de · proteínas tales como virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) TAT (Rubén et al. (1989) J. Virol. 63:1-8; por ejemplo, SEQ ID NOS: 326-337, tal como por ejemplo, GRKKRRQRRR (TAT 48-57) SEQ ID NO: 330)) , la proteína de tegumento del ' virus de herpes VP22 (Elliott y O'Hare (1997) Cell 88:223-233; por ejemplo, SEQ ID NO:' 342), la proteína homeótica de proteína Antennapedia (Antp) de Drosophila melanogaster (Penetratin PTD; Derossi et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 : 18188-18193; por ejemplo, SEQ ID NOS: 311-314), el péptido SynB antimicrobiano de protegrina 1 (PG-1) (por ejemplo, SynBl, SynB3, y Syn B4; Kokryakov et al.. (1993) FEBS Lett . 327:231-236; por ejemplo, SEQ ID NOS: 323-325, respectivamente) y factor de crecimiento de fibroblasto básico (Jans (1994) FASEB J. 8:841-847; por ejemplo, SEQ ID NOS: 307). Los PTDs también incluyen PTDs sintéticos, tales como, pero no limitados a, péptidos de poliarginina (Futaki et al. (2003) J. Mol. Recognit. 16:260-264; Suzuki et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840; por ejemplo SEQ ID NOS: 315-316) , transportan (Pooga et al. (1988) FASEB J. 12:67-77; Pooga' et al. (2001) FASEB J. 15:1451-1453; por ejemplo, SEQ ID NOS: 338-341), MAP (Oehlke et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta ..' 141 : 127-139 ; por ejemplo, SEQ ID NO: 305), KALA ( yman et al. (1997) Biochemistry 36:3008-3017; por ejemplo, SEQ ID NO: 303) y otros péptidos catiónicos, tales como, por ejemplo, varios péptidos ß-catiónicos (Akkarawongsa et al. (200.8) Antimicrob. Agents y Chemother. 52 ( 6) : 2120-2129) .
Los anticuerpos anti-RSV y fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden modificarse por la unión de porción de diagnóstico y/o terapéutica al anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo. Los anticuerpos anti-RSV y fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden modificarse por la unión covalente de cualquier tipo de molécula, tal como una molécula de diagnóstico o terapéutica, al anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo de tal manera que la unión covalente no previene al anticuerpo. o fragmento enlazado, al antigeno del mismo de enlazar a su epitopo correspondiente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente puede modificarse además por la unión covalente de una molécula de tal manera que la unión covalente no previene al anticuerpo o fragmento enlazado al .antigeno del mismo de enlazar a. RSV. En algunos ejemplos, los anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden fusionarse recombinantemente a un polipéptido heterólogo en la terminal o terminal C o conjugarse- químicamente, incluyendo conjugación covalente y no covalente, a un polipéptido heterólogo u otra composición. Por ejemplo, la composición o polipéptido heterólogo puede ser un polipéptido de diagnóstico u otra porción de diagnostico o un polipéptido terapéutico u otra porción terapéutica. Las porciones de diagnóstico y terapéuticas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, fármacos, radionucleótidos, toxinas, moléculas fluorescentes (ver, por ejemplo Publicaciones PCT Internacionales Nos. WO 92/08495; WO 9.1/14438 ; WO. 89/12624; Patente de E.U.A. No. 5, 314, 995; y EP 396,387).· Pueden ' usarse polipéptidos de diagnóstico o porciones de diagnóstico, por ejemplo, como etiquetas para detección in vivo o · in vitro. Pueden usarse polipéptidos terapéuticos o . porciones terapéuticas, por ejemplo, para terapia de una infección vírica, tal como infección por RSV, o para tratamiento de uno o más síntomas de una -infección vírica.
Las proteínas de fusión adicionales de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden generarse a través de las técnicas de transposición del gen, transposición de porción, transposición, de exón, y/o transposición- de codón (colectivamente referida como "Transposición de .ADN") . La transposición de ADN puede emplearse para alterar . las actividades de anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados . en la presente, por ejemplo, para producir anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos con afinidades superiores y. tasas de disociación inferiores (ver, generalmente, Patentes' de . E . U . A . Nos. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; y 5,837,458, y Patten et al. (1997) Curr. Opinión Biotechnol. 8:724-33; Harayama (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al, (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco (1998) Biotechniques 24 (2) :308-13) .
Los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos también pueden unirse a soportes sólidos, que son útiles para inmunoensayos o purificación del antigeno objetivo. Los soportes sólidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vidrio,' celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. 1. Modificaciones para reducir inmunogenicidad En algunos ejemplos, los . anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden modificarse además . para reducir la inmunogenicidad en un sujeto, tal como un sujeto humano. Por ejemplo, uno o más aminoácidos en el anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo pueden modificarse para alterar epítopos potenciales para células T humanas con objeto de eliminar o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo cuando se expone al sistema inmunitario del sujeto. Las modificaciones ejemplares incluyen sustituciones, eliminaciones e inserción de uno o más aminoácidos, que eliminan o reducen la ' inmunogenicidad del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo. Generalmente, tales modificaciones no alteran la especificidad de enlace del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo para su antigeno respectivo. Reducir la inmunogenicidad del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo puede mejorar una o más propiedades del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno . del mismo, tal como, por ejemplo, mejorar la eficacia terapéutica del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo e/o incrementar la vida media del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo in vivo. 2. Modificaciones Fe Los anticuerpos anti- SV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden contener una región Fe modificada o de tipo natural. Como se describe en cualquier lugar en la presente, una .región Fe puede ligarse a un fragmento enlazado al antigeno anti-RSV proporcionado en la presente, tal como, por ejemplo, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6, o un fragmento enlazado al antigeno derivado de. 58c5, sc5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 o 69F6. En algunos ejemplos, la región Fe puede modificarse para alterar una o más propiedades del polipéptido Fe. Por ejemplo, la región Fe puede modificarse para alterar (esto es más o menos) funciones efectoras comparadas con la función efectora de una región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina de tipo natural. Las regiones Fe de un anticuerpo interactúan con un número de receptores Fe, y ligandos, que imparten una configuración de capacidades funcionales importantes referidas como funciones efectoras. Las funciones efectoras Fe incluyen, por ejemplo, enlace del receptor Fe, fijación del complemento, y actividad que reduce la célula T (ver por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,136,310). Los métodos para poner en ensayo la actividad que reduce la célula T, función efectora Fe, y estabilidad de anticuerpo se conocen en la técnica. Por ejemplo, la región Fe de una molécula IgG interactúa con el FcyRs . Estos receptores se expresan en una variedad de células inmunitarias, incluyendo por ejemplo, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendriticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, · células de Langerhans, . células exterminadoras naturales (NK, por sus siglas en inglés) , y células T ?d . La formación del complejo Fc/FcyR recluta estas células efectoras a sitios de antigeno de enlace, típicamente resultando en eventos de señalización dentro de las células y respuestas inmunitarias posteriores importantes . tales como liberación de mediadores de inflamación, activación de células B, endocitosis, fagocitosis, y ataque citotóxico. La capacidad para mediar funciones efectoras citotóxicas y fagocíticas es un mecanismo potencial por el. cual los anticuerpos destruyen células dirigidas. El reconocimiento de y lisis del anticuerpo de enlace en células dirigidas' por células citotóxicas que expresan FcyRs se refiere como citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) . Otros receptores Fe para varios isotipos de anticuerpo incluyen FceRs (IgE), . FCOÍRS (IgA) , y FcpRs (IgM) .
De esta manera, un dominio Fe modificado puede tener afinidad alterada, incluyendo pero no' limitada a, afinidad incrementada o baja o sin afinidad para el receptor Fe. Por ejemplo, las diferentes subclases IgG tienen afinidades diferentes para .los FcyRs, con IgGl e IgG3 típicamente enlazan sustancialmente mejor a los receptores que IgG2 e IgG4. Además, diferentes FCYRS median, diferentes "funciones efectoras. FcyRl, FcyRIla/c, y FcYRIIIa son reguladores positivos de la activación dirigida al complejo inmunita'rio, caracterizados por tener un dominio intracelular que tiene una porción de activación basada en tirosina del inmunoreceptor (ITAM, por sus siglas en inglés). FcyRIIb, sin embargo, tiene una porción de inhibición basada en tirosina del inmunoreceptor (ITIM, por sus siglas en inglés) y por lo tanto es inhibidora. De esta manera, alterar la afinidad de una región Fe para un receptor puede modulár las funciones efectoras inducidas por el dominio Fe.
En un ejemplo, una región Fe se usa que se modifica para enlace optimizado a ciertos . FcyRs para mediar mejor las funciones efectoras, tal como por ejemplo, . citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, ADCC. Tales regiones Fe modificadas pueden contener modificaciones en uno o más de los residuos de aminoácidos, (de acuerdo con el esquema de numeración Kabat, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health' y Human Services), incluyendo, pero no limitados a, posiciones de aminoácidos 249, 252, 259, 262, 268, 271, 273, 277, 280, 281, 285, 287, 296, 300, 317, ' 323, 343, 345, 346, 349, 351, 352, 353, y 424. Por ejemplo, las modificaciones en .'una región .Fe pueden hacerse correspondientes a cualquiera de una o más de G119S, G119A, S122D, S122E, S122N, S122Q, S122T, K129H, K129Y, D132Y, R138Y, . E141Y, T143H, V147I, S150E, H151D, E155Y, E155I, E155H, K157E, G164D, E166L, E166H, S181A, S181D, S187T, S207G, S307I, K209T, K209E, K209D, A210D, A213Y, A213L, A213I, I215D, I215E, I215N, I215Q, •E216Y, E216A, K217T, K217F, K217A, y P279L de la secuencia IgGl ejemplar establecida en SEQ ID NO: 356, o combinaciones de las mismas. Un Fe modificado que contiene estas mutaciones puede tener enlace potenciado a un FcR tal como, por ejemplo, el receptor activado FoylUa y/o puede tener enlace reducido al receptor inhibidor FcyRIIb (ver por ejemplo, US 2006/0024298). Las regiones Fe modificadas para tener enlace incrementado a FcRs pueden ser más efectivas al facilitar la destrucción de células infectadas víricas (por ejemplo RSV) en pacientes.
En algunos ejemplos, los anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno proporcionados en la presente pueden modificarse además para mejorar la interacción del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo con el receptor FcRn con objeto de incrementar, la vida media in vivo y farmacocinética del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo (ver, por ejemplo Patente de E.U.A. No. 7,217,797, Publicaciones de Patente , de E.U.A. Nos. 2006/0198840 y 2008/0287657). FcRn es el FcR neonatal, el enlace del cual recicla anticuerpo de endocitosis o fragmento enlazado al antigeno del mismo de los endosomas vuelve al torrente sanguíneo. Este proceso, acoplado con la preclusión de filtración de riñon debido al tamaño grande de la molécula de longitud completa, resulta en vidas medias de .suero del anticuerpo favorable en el intervalo de una hasta tres semanas. El enlace de Ec hasta FcRn también juega un. papel en el transporte del anticuerpo.
Las modificaciones ejemplares de la región Fe incluyen pero no se limitan a, mutación de la Fe descrita en la Patente de E.U.A. No. 7, 217, 797; Publicaciones de Patente de E.U.A. Nos. 2006/0198840, 2006/0024298 y 2008/0.287657, y Publicación de Patente Internacional No. WO 2005/063816, tales como mutaciones en uno o más de los residuos de aminoácidos (numeración Kabat, Kabat et al. (1991)) 251-256, 285-90, 308-314, en el dominio CH2 y/o residuos de aminoácidos 385-389, y ·428-436 en el dominio CH3 de la región constante de cadena pesada Fe, donde la modificación altera la afinidad de enlace del receptor Fe y/o vida media del suero con relación al anticuerpo no modificado o fragmento enlazado al antígeno del mismo. En algunos ejemplos, el dominio constante IgG se modifica en la región Fe en una o más de las posiciones de aminoácidos 250, .251, 252, 254, 255, 256, 263, 308, 309, 311, 312 y 314 en el dominio CH2 y/o posiciones de aminoácidos 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434, 436, y 459 en el dominio CH3 de la región constante de cadena pesada IgG. Tales modificaciones corresponden a aminoácidos Glyl20, Prol21, Serl22, Phel24, Leul25, Phel26, Thrl33, Prol74, Argl75, Glul77, Glnl78, y Asnl80 en el dominio CH2 y aminoácidos Gln245, Val246, Ser247, Thr249, Ser283, Gly285, Ser286, Phe288, y Met311 en el dominio CH3 en una secuencia IgGl ejemplar establecida en SEQ ID NO: 356. En algunos ejemplos, la modificación está en uno o más residuos expuestos a la superficie, y la modificación es una sustitución con un residuo de carga similar, polaridad o hidrofobicidad al residuo que- se sustituye.
En ejemplos particulares, una región constante de cadena pesada Fe se modifica en una o más de las posiciones de aminoácidos 251, 252, 254, 255, y 256 (numeración Kabat), donde la posición 251 se sustituye con Leu o Arg, lá posición 252 se sustituye con Tyr, Phe, Ser, Trp o Thr, la posición 254 se sustituye con Thr o Ser, la posición 255 se sustituye con Leu, Gly, lie o Arg, y/o la posición 256 se sustituye con Ser, Arg, Gln, Glu, Asp, Ala, Asp o Thr. En algunos, ejemplos, una región constante de cadena pesada Fe se modifica en una o más de las posiciones de aminoácidos 308, 309, 311, 312, y 314, donde la posición 308 se sustituye con Thr o lie, la posición 309 se sustituye con Pro, la posición 311 se sustituye con serina o Glu, la posición 312 se sustituye con Asp, y/o posición 314 se sustituye con Leu. En algunos ejemplos, una región constante de cadena pesada Fe se modifica en una o más de las posiciones de aminoácidos 428, 433, 434, y 436, donde la posición 428 se sustituye con Met, Thr, Leu, Phe, o Ser, la .posición 433 se sustituye con Lys, Arg, Ser, lie, Pro, Gln, o His, la posición 434 se sustituye con Phe, Tyr, o His, y/o la posición 436 se sustituye con His, Asn, Asp, Thr, Lys, Met, o Thr. En algunos ejemplos, una región constante de cadena pesada Fe se modifica en una o más de las posiciones de aminoácidos 263 y 459, donde la posición 263 se sustituye con Gln o Glu y/o la posición 459 se sustituye con Leu o Phe.
En algunos ejemplos, una región constante de cadena pesada Fe puede modificarse para potenciar enlace a la proteina de complemento Clq. Además de interactuar con FcRs, Fe también interactúa con la proteina de complemento Clq para mediar la citotoxicidad dependiendo del complemento' (CDC, por sus siglas en inglés) . Clq forma un complejo con las serina proteasas Clr y Cls para formar el complejo Cl. Clq es capaz de enlazar seis anticuerpos, aunque enlazar a dos IgGs es suficiente para activar la cascada de complemento. Similar a la interacción Fe con FcRs, diferentes subclases IgG tienen afinidad diferente para Clq, con IgGl e IgG3 típicamente se enlazan sustancialmente mejor que' IgG2 e IgG4. De esta manera, un Fe modificado que tiene enlace incrementado a Clq puede medir el CDC potenciado, y puede · potenciar la destrucción de células infectadas víricas (por ejemplo, . RSV) . Las modificaciones ejemplares en una región Fe que incrementa el enlace a Clq incluyen, pero no se. limitan a, modificaciones de aminoácidos en las posiciones 345 y 353 (numeración Kabat) . Las modificaciones ejemplares incluyen aquellas correspondientes a K209W, K209.Y, y E216S .en una secuencia IgGl ejemplar establecida en SEQ ID NO: 356, En otro ejemplo, una . variedad de mutantes Fe con sustituciones para reducir o eliminar el enlace con FcyRs también se conoce. Tales muteínas son útiles en casos donde existe una necesidad para la función efectora- reducida o eliminada mediada por Fe. Esto es a menudo el caso donde se desea el antagonismo, pero no la exterminación de las células que portan un antígeno objetivo. Lo ejemplar de tal Fe es una muteína Fe descrita en la Patente¦ de E.U.A. No. 5,457,035, que se modifica en las posiciones de aminoácidos 248, 249 y 251 (numeración Kabat).' En una secuencia IgGl'. ejemplar establecida en SEQ ID NO: 356, el aminoácido 117 se modifica de Leu a Ala, el aminoácido 118 se modifica de Leu a Glu, y el aminoácido 120 se modifica de Gly a Ala. Pueden hacerse mutaciones similares en cualquier secuencia Fe tal como, por ejemplo, la secuencia Fe ejemplar. Esta muteina muestra afinidad reducida para los receptores Fe.
Los anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden prepararse por ingeniería para contener regiones Fe modificadas. Por ejemplo, los métodos para fusionar o conjugar polipéptidos a las regiones constantes de anticuerpos (esto es hacer proteínas de fusión Fe) se conocen en la técnica y describen en, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,336,603, 5,622, 929, 5, 359, 046,' 5, 349, 053, 5, 447, 851, 5,723,125, 5,783,181, 5, 908, 626, 5, 844, 095, y 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; Publicaciones PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, y WO 99/04813; Ashkenazi et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Traunecker et al. (1988) Nature 331:84-86; Zheng et al (1995) J. Immunol . 154:5590-5600; y Vil et al. (1992) Proc. Nati. Acad.. Sci. USA 89:11337-11341 (1992) y descritos en cualquier lugar en la presente. En algunos ejemplos, una región Fe modificada que tiene una o más modificaciones que incrementan la afinidad de enlace a FcRn y/o mejora la vida media pueden fusionarse a un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente. . 3. Pegilación Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden conjugarse a moléculas de polímero tales como polietilen glicol (PEG) de peso molecular alto para incrementar la vida media y/o mejorar sus perfiles farmacocinéticos . La conjugación puede llevarse a cabo por técnicas conocidas para aquellos experimentados en la técnica. La conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG ha demostrado .potenciar la farmacodinámica aunque no interfiere con la función (ver, por ejemplo, Deckert et al., Int. J. Cáncer 87: 382-390, 2000; Knight et al, Plateléts 15: 409-418, 2004; Leong et al, Cytokine 16: 106-119, 2001; y Yang et al, Protein Eng. 16: 761-770, 2003) . El PEG puede unirse a los anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno con o sin una ligadura multifuncional ya sea a través de conjugación específica del sitio del PEG a la terminal N o C de los anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno o por medio de grupos epsilon-amino presentes en residuos de lisina. Puede usarse derivatización del polímero lineal o ramificado que resulta en pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación puede monitorearse por SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar conjugación apropiada de moléculas PEG a los anticuerpos. El PEG no reaccionado puede separarse de conjugados de anticuerpo-PEG por, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones o exclusión de tamaño. Los anticuerpos derivados de PEG o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden probarse para actividad de enlace para antígenos RSV así como para eficacia in. vivo usando métodos conocidos para aquellos experimentados en la técnica, por ejemplo, por inmunoensayos descritos en la presente. 4. Conjugación de una Porción Detectable En algunos ejemplos, los anticuerpos . anti-RSV y fragmentos de anticuerpo proporcionados en la presente pueden modificarse además por conjugación a una porción detectable. Las porciones detectables pueden detectarse directamente o indirectamente. Dependiendo de la porción detectable seleccionada, la porción detectable. puede detectarse in vivo e/o in vitro. Las porciones detectables pueden emplearse, por ejemplo, en métodos de diagnóstico para detectar la exposición a RSV o localización de RSV o ensayos, de enlace para determinar la afinidad de enlace del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo para RSV. Las porciones detectables también pueden emplearse en métodos de preparación de los' anticuerpos anti-RSV, tales como, por ejemplo, purificación del anticuerpo o. fragmento enlazado al antígeno del mismo. Típicamente, las porciones detectables se seleccionan de tal manera que la conjugación de la porción detectable no interfiere con el enlace del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo al epítópo objetivo. Generalmente, la elección de .la porción. detectable depende de la sensibilidad requerida, facilidad de conjugación con el compuesto, requerimientos de estabilidad, instrumentación disponible, y provisiones de eliminación.'- Alguien de experiencia en la técnica está familiarizado con etiquetas y puede identificar una etiqueta detectable adecuada para' y compatible con el ensayo empleado. Los métodos de anticuerpos etiquetados con porciones detectables se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes y químicos.
La porción detectable puede ser cualquier material que tiene una propiedad física o química detectable. Tales etiquetas detectables se han desarrollado bien en el campo de inmunoensayos y, en general, la mayoría de cualquier etiqueta útil en tales métodos puede aplicarse en '. los métodos proporcionados. De esta manera, una etiqueta' es .cualquier composición detectable por medio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico, eléctrico, óptico o químico. Las etiquetas útiles incluyen, pero no se limitan a, pigmentos fluorescentes (por ejemplo, isotiocianafo de fluoresceina, rojo Texas, rodamina, y. similares), radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 1C, o' 32P) , en particular, radioisótopos que emiten gamma y positrón (por ejemplo, 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, y 56Fe) , iones metálicos (por ejemplo, i In, 97Ru, 67Ga, 68Ga, 2As, 89Zr, y 201T1), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de raíz de rábano, fosfatasa alcalina y otros comúnmente usados en un ELISA), agentes de transferencia de electrones (por . ejemplo, . incluyendo proteínas y compuestos ' enlazados a metal) , etiquetas luminiscentes y quimioluminiscentes (por ejemplo, luciferina y 2 , 3-dihidroftalazindionas , por ejemplo, luminol) , perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS™) , y etiquetas colorimétricas tales como perlas plásticas o de vidrio de color o de oro coloidal (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Para una revisión de varios sistemas que producen señal o etiqueta que pueden usarse, ver por ejemplo Patente de E.U.A. No. 4,391,904. 5. Conjugación de una Porción Terapéutica En algunos ejemplos, los anticuerpos- anti-RSV y fragmentos enlazados al antígeno proporcionados en la presente pueden modificarse además por conjugación a . una porción terapéutica. Las porciones terapéuticas ejemplares incluyen, pero no. se limitan a, una citotoxina. (por ejemplo, un agente citostático o citocida) , un agente terapéutico o un ión de metal radioactivo (por ejemplo, emisores alfa) . Los agentes citotóxicos o de citotoxina ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cualquier agente que es perjudicial para las células, tales como, pero no limitadas, paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicinas D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , procaina, tetracaina, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos ej emplares ' incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina,- 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina ) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC) ) , agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) , y- antiviricos, tales como, pero no limitados a, análogos dé . nucleósido, tales como zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, y ribavirina; ¦ foscamet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, e in.terferones alfa.
En algunos ejemplos, los anticuerpos' anti-RSV y fragmentos enlazados al antígeno proporcionados en la presente pueden modificarse además por conjugación a una porción terapéutica, que es un polipéptido terapéutico. Los polipéptidos terapéuticos ejemplares incluyen, ¦ pero · no se limitan a, una toxina, tal como'abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria; o un agente inmunoestimulador , tal como una citoquina, tal como, pero no limitada a, un interferón (por ejemplo, IFN- , ß, y, ?) , una linfocina, un factor de crecimiento hematopoyético, tal como, por ejemplo, GM-CSF .(factor que estimula la colonia de macrófago de granulocito) , Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-3 (IL-3), Interleucina-4 (IL-4), Interleucina-7 (IL-7), Interleucina-10 (IL-10) , Interleucina-12 (IL-12), Interleucina-14 (IL-14), y Factor de Necrosis del- Tumor (TNF) . 6. Modificaciones para mejorar la especificidad de enlace La especificidad de enlace de los anticuerpos ánti-RSV y fragmentos de anticuerpo proporcionados puede alterarse o mejorarse por técnicas, tales como despliegue de fagos. Los métodos para despliegue de fagos generalmente involucran el uso de un sistema del vector de expresión de la superficie de fago filamentoso (fagémido) para clonar y expresar especies de anticuerpo de la biblioteca. Varios sistemas de clonación del fagémido para producir colecciones combinatorias se han descrito por otros. Ver, por ejemplo la preparación de colecciones de anticuerpo combinatorias en fagémidos como se describe por Kang et al, (1991) Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 88:4363-4366; Barbas et al, . (1991) Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 88:7978-7982; Zebedee et al, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 89:3175-3179; Kang et al, (1991) Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 88:11120-11123; Barbas et al, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 89:4457-4461; y Gram et al, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci.r USA, 89:3576-3580, que se incorporan en . la presente como referencia.
En ejemplos particulares, las secuencias de ADN que codifican dominios VH y VL se amplifican de colecciones de cADN de animal (por ejemplo, colecciones de cADN humanas o de murino de tejidos linfoides) . El ADN que codifica los dominios VH y VL se recombina junto con una ligadura scFv por PCR y se clonan en un vector fagémido (por ejemplo, p CANTAB 6 o pComb 3 HSS) . El vector se electropora en E. coli y el E. coli se infecta con el fago auxiliar. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fago filamentoso incluyendo fd y M13 y los dominios VH y VL se fusionan r.ecombinantemente de forma usual a ya sea el gen III o gen VIII del.' fago. El fago que expresa un dominio enlazado al antígeno que enlaza a un antígeno RSV, por ejemplo, proteína F de RSV, puede seleccionarse o identificarse con el antígeno, por ejemplo, usando antígeno etiquetado o enlace de antígeno o capturado a una superficie sólida o perla. Los ejemplos de métodos de despliegue de fagos que pueden usarse para hacer , los anticuerpos por despliegue de fagos incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J.' Immunol. 24:952-958; Persic et al. .(1997) Gene 187 : 9-18 ;, 'Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57.: 191-280; Publicaciones PCT Nos. O 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, O 92/18619, WO 93/11236, WO.95/15982, WO 95/20401, y W097/13844; y Patentes de E.U.A. Nos. 5, 698, 426, 5, 223, 409, 5, 403, 8 , 5,580, 717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
Como se describe en las referencias de arriba, después de la selección de fagos, las regiones que codifican el anticuerpo ' del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos · humanos, o cualquier otro fragmento enlazado al .antigeno deseado, y expresado en cualquier hospedero deseado, incluyendo . células mamiferas, células de insectos, células, de planta,' levadura, y bacterias, por ejemplo, como se describen en. la presente. Las técnicas para producir recombinantemente Fab, .Fab' y fragmentos F(ab' )2 también pueden emplearse usando métodos conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en la Publicación PCT No. WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12 (6) : 864-869; Sawai et al. (1995) AJRI .34:26-34; y Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043.
La biblioteca de fagémidos resultante puede manipularse para incrementar y/o alterar las inmunoespecificidades de los anticuerpos o fragmentos enlazados al · antigeno' para producir e identificar posteriormente anticuerpos adicionales con propiedades mejoradas, tales como enlace incrementado a un antigeno objetivo. Por ejemplo, cualquiera o tanto el ADN que codifica la cadena, ligera como pesada puede mutagenizarse en una región que determina la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la región variable del polipéptido de inmunoglobulina, y posteriormente seleccionarse para inmunoreacción deseable y capacidades de neutralización. Los anticuerpos resultantes luego pueden seleccionarse, en uno o más de los ensayos descritos en la presente para determinar la capacidad de neutralización.
Para algunos usos, incluyendo uso in vivo de anticuerpos en humanos y ensayos de detección in vi tro, se usan anticuerpos humanos o quiméricos. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden hacerse ' por una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de despliegue de fagos descritos arriba usando colecciones de anticuerpo derivados de secuencias de inmunoglobulina humana .o secuencias sintéticas homologas a secuencias de inmunoglobulina humana. Ver Patentes de E.U.A. Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y Publicaciones PCT Nos. O 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, W098/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741; cada una de la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
E. MÉTODOS PARA AISLAR ANTICUERPOS ANTI-RSV Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden identificarse y aislarse por una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica incluyendo, pero no limitadas a, hibridomas de murino (ver, por ejemplo, Olsson y Kaplan (1980) Proc Nati Acad Sci. USA 77:5429-5431; tales anticuerpos pueden humanizarse como se describe en cualquier lugar en la presente para uso en humanos) , ratones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Kellerman y Green (2000) Curr. Opin Biotechnol. 13:593-597), despliegue de fagos (ver, por ejemplo, Mancini (2004) New Microbiol. 27:315-28), y aislamiento de células inmunitarias humanas maduras, tales como células B (ver,' por ejemplo, Bánchereau y Rousset (1992) Adv Immunol . 52: .125-262, Crotty y Ahmed (2004) Semin Immunol. 16: 197-203, Carsetti (2004) Methods Mol Biol. 271:25-35., Mc.Heyzer-Williams y McHeyzer-Williams (2005) Annu Rev Immunol. 23:487-513). En un método ejemplar proporcionado en la ' presente, los anticuerpos anti-RSV humanos y fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente se identifican y aislan de células B humanas.
Dada la dificultad de obtener hibridomas estables de células que secretan el anticuerpo humano, un método ejemplar que se ha usado extensivamente para . producir y aislar células que secretan el anticuerpo humano es la inmortalización de células B humanas con el Virus Epstein Barr ( EBV, por sus siglas en inglés), que también se conoce para inducir la activación y proliferación de célula B policlonal (ver, por ejemplo, Sugimoto et al., (2004) Cáncer Res. 64:3361-3364.; Bishop y Busch (2002) Microbes Infect. 4:853-857). Las células que secretan el anticuerpo se han producido, por ejemplo, por inmortalización de EBV de células B humanas, tales como la sangre periférica, ganglios linfáticos, bazo, amígdalas, o fluidos pleurales de pacientes u otros individuos que pueden exponerse al antígenó o sujetos saludables preseleccionados usando un antigeno etiquetado (ver, por ejemplo, Casali et al. (1986) Science 234:476-9, Yamaguchi et al. (1987) Proc Nati Acad Sci USA 84:2416-2420, Posner et al. (1991) J Immunol. 146:4325-4332, Raff et al. (1988) J Exp Med. 168:905-917, Steenbakkers et al. (1993) Hum Antibod Hybrid. 4:166-173, Steenbakkers et al. (1994) Mol Biol Rep. 19:125-134, Evans et al. (1988) J Immunol. 140:941-943, y Wallis R et al. (1989) J Clin Invest 84:214-219). ' Debido a la baja transformabilidad, baja c.lonabilidad, y la inestabilidad inherente y heterogeneidad de células B humanas infectadas con EBV (Chan M et al. (1986) J Immunol 136:106- 112 y James y Bell .(1987) J Immunol Methods . 100:5-40), las técnicas conocidas tales como fusión celular, tal como, por ejemplo con una línea celular de mieloma puede emplearse (ver, por ejemplo, Bron et al (1984) PNAS 81:3214-3217; Yamaguchi et al (1987) Proc Nati Acad Sci USA 84:2416-2420; Posner et al. (1991) J Immunol. 146:4325-4332, Niedbala y Stott (1998) Hybridoma 17.: 299-304; Li et al (2006) Proc Nati Acad Sci USA 10.3:3557-62) . Las técnicas adicionales para mejorar inmortalización EBV incluyen, por ' ejemplo, inmortalización con virus oncogéñico, transformación con oncogenes, mini-electrofusión, y heterofusión ratón-humano en un proceso sencillo (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,997,764; Steenbakkers et al. (1993) Hum Antibod Hybrid. 4:166-173; Dessain. et al (2004) J Immunol ethods. .291:109-22) . Los anticuerpos monoclonales humanos pueden aislarse de células B que se han activado e inmortalizado en presencia o en ausencia de un antigeno y al combinar varias manipulaciones en el cultivo celular como se describe en la técnica (ver por ejemplo, Borrebaeck C et al. (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85: 3995-3999, Davenport et al. (1992) FEMS Microbiol Immunol. 4:335-343, Laroche-Traineau et al. (1994) Hum Antib Hybrid. 5:165-177, Morgenthaler et al. .(1996) J. Clin Endocrinology. 81:3155-3161, Niedbala y Kurpisz . (1993) Immunol Lett. 35:9.3-100, Mulder et al. (1993K Hum .Immunol. 36:186-192, Hur et al (2005) Cell Prolif. 38:35-45, Traggiai et al (2004) Nat Med 10:871-875, Tsuchiyama et al (1997) Hum Antibodies 8:43-47; y Pub-. PCT Nos. WO .'91109115, WO 041076677, WO 88101642, WO 90102795, WO 96140252, y WO 02146233) .
Los métodos, para el aislamiento de anticuerpos humanos de células B maduras, generalmente involucran el aislamiento de una población de célula B madura y anticuerpos seleccionados expresados por las células B contra un antigeno particular. Una variedad de diferentes poblaciones de las células que secretan el anticuerpo puede aislarse de donadores humanos que tienen perfiles específicos (por ejemplo individuos nativos, vacunados, más .o menos recientemente infectados y seropositivos ) y de diferentes tejidos (por ejemplo sangre, amígdalas, bazo, ganglios linfáticos) donde las células B residen y ejercen sus actividades (Viau y Zouali (2005) Clin Immunol 114:17-26). En un método ejemplar proporcionado en la presente, los anticuerpos anti-RSV proporcionados en la presente pueden aislarse de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, por sus siglas en inglés), que contienen células B, aisladas de donadores humanos y/o de donadores humanos saludables que han tenido o tienen una alta probabilidad . de haber estado expuestos a RSV, ' tales como trabajadores del cuidado de la salud.
Después del aislamiento de PBMCs de las' muestras biológicas, puede realizarse una selección específica de las células que secretan el anticuerpo, usando uno de los varios métodos descritos en la técnica, en la base de la expresión de marcadores de la superficie celular en su superficie y, si es apropiado, de otras proteínas, así como la actividad de proliferación, el. estado metabólico y/o morfológico de las células. En particular, varias tecnologías para la purificación de las células que secretan el anticuerpo de muestras humanas hacen uso de medios diferentes y condiciones para selección positiva o negativa. Estas células se seleccionan más fácilmente y eficientemente al separar físicamente aquellos que expresan marcadores de superficie celular específicos para células que expresan y secretan anticuerpos (por ejemplo células B humanas). Los -protocolos específicos se conocen ' y pueden encontrarse en la literatura (ver, por ejemplo Callará y Kotowicz "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F. (ed.) Oxford University Press, 2000, 17-31).
La selección de células inmunitarias específicas' tales como células B, se realiza típicamente usando anticuerpos que enlazan específicamente a una proteína de. superficie celular específica de célula B y que puede ligarse a soportes sólidos (por ejemplo microperlas .o placas de plástico) o etiquetarse con un fluorocromo que puede detectarse usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, las células B humanas se han seleccionado en la base áe su afinidad para soportes (tales como microperlas) que enlazan microperlas con CD19, CD27, y/o CD22, o para la carencia de afinidad de enlace para anticuerpos específicos para ciertos isotipos antes de la inmortalización EBV (ver, por ejemplo, Li et al. (1995) Biochem Biophys Res Commun 207:985-993, Bernasconi et al. (2003) Blood 101:4500-4504 y Traggiai et al (2004) Nat Med 10:871-875). La selección del marcador celular para purificación puede afectar la eficiencia del proceso de inmortalización, por ejemplo, debido a señales intracelulares que se disparan por el proceso de selección y que pueden alterar el crecimiento celular y la viabilidad. Por ejemplo, CD22, que es una proteína de transmembrana restringida de células B que controla las trayectorias de transducción de señal relacionadas con el reconocimiento de antígeno y activación de células B es una molécula ejemplar para selección de células B inicial. Ya que la población positiva de CD22 contiene células que. expresan anticuerpos que tienen especificidades e isotipos diferentes, otros marcadores de superficie celular también pueden usarse para seleccionar las celular, ya sea antes o después de la fase de estimulación.
En algunos ejemplos, un enriquecimiento específico de las células que secretan el anticuerpo puede obtenerse al aplicar una selección basada en CD27 además de la selección basada en CD22. CD27 se conoce para ser un marcador para células B humanas que tiene genes de región variable somáticamente mutados (Borst J' et al. (2005) ¦ Curr Opin Immunol. 17:275-281.). Los marcadores adicionales tales como CD5, CD24, CD25, CD86, CD38, CD45, CD70, o CD69 también pueden usarse para ya sea eliminar o enriquecer la:' población deseada de células. De esta manera, dependiendo de los factores, tales como la historia del donador de' la exposición al antigeno (por ejemplo un antigeno RSV) y la titulación del anticuerpo, pueden seleccionarse células B enriquecidas con CD22 total, o subpoblaciones de célula B enriquecidas adicionales tales como células B positivas CD27.
Después de la selección celular, y antes de la inmortalización de las células, la población de células puede exponerse a un agente estimulante apropiado. Los agentes estimulantes ejemplares incluyen, por ejemplo, activadores de célula B policlonales , tales como, pero no limitados a, agonistas de respuestas inmunitarias innatas (por ejemplo agonistas del receptor tipo Toll tales como oligonucleótidos CpG (Bernasconi et al. (2003) Blood 101:4500-4504, Bernasconi et al. (2002) Science 298:2199-2202, Bourke et al. (2003) Blood 102:956-63; por- ejemplo, nucleótidos CpG, tales como, por ejemplo, CpG2006, CpG2395, y CpG2395, disponibles de Cell Sciences, Cantón, MA) y ' moléculas inmunomoduladoras tales como citoquinas (por ejemplo, iriterleucinas conocidas para tener actividades inmunoestimuladoras, por ejemplo,: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, e IL-13 (ver Callará y Kotowicz "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F (ed.) Oxford University Press, 2000, 17-31) y agonistas de receptores de membrana celular de la familia del receptor TNF, ¦ en particular aquellos que activan la trayectoria NF-?? y proliferación en células B, tales como, pero no limitados a, APRIL, BAFF, ligando CD .40 (CD40L) (ver, por ejemplo, Schneider (2005) ' Curr Opin' Immunol. 17:282-289, He et al. .(2004) J Immunol. 172:3268-79, Craxton et al. (2003) Blood .101: 4464-4471, y Tangye et al. (2003) J Immunol .170 : 261-269) . Los métodos ejemplares para estimular células B usando inmortalización EBV en combinación con o secuencialmente con uno o más activadores policlonales se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Traggiai et al. (2004) Nat Med 10:871-875, Tsuchiyama et al. (1997) Hum Antibodies 8:43-47,. Imadome et al. (2003) Proc Nati Acad Sci USA 100:7836-7840, y Pub. PCT Nos. WO 2007/068758, WO 04/76677, WO 91/09115, y WO 94/24164). La combinación de agentes estimulantes puede agregarse al medio de cultivo celular antes de la fase de inmortalización al mismo tiempo o secuencialmente (por ejemplo agregar un primer agente estimulante inmediatamente después de la selección celular inicial y un segundo agente estimulante horas o días después) . Los agentes estimulantes pueden · . agregarse directamente en el medio de cultivo celular ' de soluciones madre diluidas, o después de formularse apropiadamente, por ejemplo, usando liposomas u otros compuestos que pueden mejorar su absorción y actividad inmunoestimuladora (Gursel et al. (2001) J Immunol. 167:3324-3328). . Los agentes estimulantes también pueden unirse . a matrices sólidas (microperlas o directamente en ¦ las placas de cultivo celular) , que pueden permitirse para eliminación efectiva de los agentes. Las células pueden lavarse con medio fresco una o más veces y, opcionalmente, mantenerse en medio de cultivo celular normal (por ejemplo, desde 1 hasta 6 días) con objeto de diluir y eliminar además cualquier efecto restante de los agentes estimulantes. Los agentes estimulantes también pueden inhibirse al agregar compuestos específicos dentro · del cultivo celular.
Las células pueden seleccionarse además ' sobre la' base del isotipo del anticuerpo expresado después de estimular las células y antes de exponer las células seleccionadas y estimuladas al agente de- inmortalización (esto es entre la fase de estimulación y la fase de inmortalización).. La selección basada en isotipo de las células puede realizarse al aplicar medios para ya sea selección positiva (permitiendo el aislamiento de las células especificas) o negativa (permitiendo la eliminación de células no deseadas). Por ejemplo, una población de células positivas IgG estimuladas puede seleccionarse positivamente (por FACS o separadores de célula magnética) o al eliminar células que expresan IgM de la población de células, y por consiguiente enriquecimiento para células que expresan IgG. Las tecnologías de separación para las células que secretan el anticuerpo usando separadores de célula magnética o activada por fluorescencia se conocen en la literatura (ver, por ejemplo,- Li et al. (1995) Biochem Biophys .Res Commun 207:985-93, Traggiai et al. (2004) Nat Med 10:871-875). Dependiendo de la fuente de las células que secretan el anticuerpo, y su uso final, eliminación (o enriquecimiento) de otras células que expresan isotipo, tales como células que expresan IgD ó IgA, también pueden realizarse. Un enfoque similar puede usarse para aislar células sobre la base de la subclase especifica, si tal selección precisa se desea (por ejemplo, selección de células B humanas que expresan anticuerpos IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) .
Varios agentes de · inmortalización víricos se conocen en la técnica y pueden usarse en las células que secretan el anticuerpo para obtener células que secretan el anticuerpo inmortalizado. Los virus que infectan e inmortalizan las células que secretan el anticuerpo se conocen comúnmente como virus linfotrópicos . Los ejemplos de tales virus son aquellos incluidos en la clase gamma de herpesvirus. Los miembros de esta familia de virus infectan los linfocitos en una manera especifica de la especie, y se asocian con trastornos linfoproliferativos y -el desarrollo de varias malignidades (Nicholas (2000) J. Mol Pathol. 53:222-237 y Rickinson (2001) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sd. 356:595-604). Los virus ejemplares para uso¦ como un agente de inmortalización en los métodos proporcionados incluyen EBV (virus Epstein-Barr, también conocido como virus del herpes 4), ,y HHV-8' .(virus del herpes 8, también conocido como KSHV, Virus del Herpes asociado con el Sarcoma de Kaposi) , que pueden infectar e inmortalizar linfocitos humanos. Otros virus ejemplares para uso en los métodos incluyen, pero no se limitan a, MHV-68 (virus del herpes de- murino 68), HVS (virus del herpes Samiri) , RRV (Rhadinovirus Rhesus) , LGV (virus. Lymphocrypto de primate) , EHV-2 (virus del herpes 2 de equino) HVA (virus del herpes Ateles) , y AHV-I (virus del herpes Alcelaphine 1) , que son otros virus del herpes linfotrópico, oncogénico que tienen algunas características genéticas comunes .conservadas entre ellos y efectos patogénicos similares en células hospederas mamíferas diferentes.
Los constructos de. ADN recombinante que contienen proteínas víricas específicas de virus empleados para inmortalizar también se han usado para inmortalizar células B (ver Damania (2004) Nat Rev Microbiol. 2:656-668 y Kilger et al. (1998) EMBO J. 17:1700-1709). Los vectores similares que contienen genes víricos pueden transducirse en células en los métodos proporcionados. ' Los métodos para hacer tales constructos son bien conocidos, en la técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de sistemas retrovíricos o partículas tipo virus y líneas celulares empacadas, que proporcionan todos los factores necesarios en trans para la formación de tales partículas.
La fase de inmortalización puede durar entre una y varias horas, hasta 2-4 días. La longitud de la fase de inmortalización puede ajustarse dependiendo de varios factores tales como eficiencia y viabilidad celular de inmortalización, en algunos ejemplos, las células se inmortalizan con EBV durante un periodo de alrededor de 4 hasta alrededor de 24 horas. En un ejemplo particular, las células se inmortalizan con EBV . durante un periodo de alrededor de 16 horas.
La inmortalización mediada por EBV de células B requiere la expresión del receptor CD21 de la superficie celular, que se considera como el receptor EBV principal. El CD21 está presente en la mayoría de las subpoblaciones de célula B y regula las respuestas de célula B al formar un complejo con CD19 y el receptor de antígeno de célula B (Fearon.y Carroll (2000) Ann Rev Immun. 18:393-422). La capacidad para transformar células con EBV puede potenciarse por la adición de agentes estimulantes de células B, pero las condiciones deben asegurar que CD21 se mantiene en la superficie celular, permitiendo la inmortalización EBV en alta eficiencia.
Después de la fase, de inmortalización, las células inmortalizadas pueden cultivarse a una densidad baja en capas celulares alimentadoras . La capa alimentadora puede constituirse por preparaciones celulares de sangre periférica no alogénicas irradiadas, linfoblastoide o lineas celulares de fibroblasto, linfocitos de sangre del cordón umbilical, o diferentes tipos de células embriónicas. Un ejemplo de una linea celular que tiene tales propiedades es EL4-B5, lineas celulares de timoma EL4 de mutante que soportan eficientemente el crecimiento y la proliferación de células B. Otras células alimentadoras ejemplares incluyen células alimentadoras PMBC eliminadas de célula B' irradiadas como se describe en cualquier lugar en la presente. Los agentes que promueven el crecimiento tales como aquellos usados para estimular la población de célula B también pueden usarse para mantener la población de célula B inmortalizada después de la inmortalización.
Las poblaciones inmortalizadas de células pueden usarse para una serie de aplicaciones, en particular relacionadas con aislamiento, caracterización y producción de anticuerpos. En algunos ejemplos, las colecciones de ADN que codifican los anticuerpos expresados por las células o fragmentos de tales anticuerpos pueden construirse de ADN aislado de la población en volumen de células usando técnicas recombinantes comunes. En algunos ejemplos como se describe, en la presente, las células inmortalizadas pueden cultivarse y dividirse además en grupos de células que secretan el anticuerpo. Los grupos de células pueden cultivarse, por ejemplo, sobre, capas de célula alimentadoras .
En algunos ejemplos, los sobrenadantes de cultivo celular de los grupos de células se seleccionan en una¦ o más rondas, para la identificación de células que expresan anticuerpos que tienen una especificidad de antigeno particular (por ejemplo, anticuerpos que enlazan inmunoespecificamente una proteína F de RSV) . Los métodos ejemplares para seleccionar anticuerpos ¦ y ' 'medir la especificidad de enlace se' describen en cualquier lugar en la presente y se conocen en la técnica. Una vez que un anticuerpo particular se¦ identifica, el ADN que codifica el anticuerpo o porciones enlazados al antígeno del mismo puede aislarse de los grupos de células usando métodos recombinantes bien conocidos. Como se describe en la presente, el ADN aislado de los grupos de células luego- puede expresarse (por ejemplo, en una célula hospedera procariótica o eucariótica) y re-selección para la identificación de clones individuales que expresan el anticuerpo deseado o fragmento enlazado al antigeno del mismo. Los métodos de expresión y purificación de anticuerpos son bien' conocidos por alguien experto en la técnica y se describen en la sección F.
En algunos ejemplos como se describe en la presente, las células inmortalizadas pueden clasificarse en célula sencilla usando un clasificador ' de célula (por ejemplo, FACS) , usando un antigeno etiquetado. En un ejemplo particular, las células que expresan anticuerpos anti-RSV pueden aislarse usando un antigeno F de RSV. etiquetado con Flúor 647 Alexa con objeto de etiquetar las células deseadas. Después de la clasificación, el ADN que codifica el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo luego puede aislarse usando métodos recombinantes bien conocidos. El ADN aislado de los grupos de células puede expresarse (por ejemplo, en una célula hospedera procariótica o eucariótica) para confirmar enlace al antigeno RSV.
Típicamente, los métodos de selección empleados para la identificación de anticuerpos individuales que enlazan a un antigeno particular r.esultan en la identificación de la porción enlazada al antigeno de tales anticuerpos. Para generar anticuerpos de longitud completa u otros derivados del fragmento enlazado al antigeno, las secuencias de nucleótido que codifican · la cadena de VH y/o VL o porciones enlazadas al antigeno de las mismas pueden aislarse · y clonarse en vectores que expresan una región constante VH (por ejemplo, la región constante gamma 1 humana), región constante VL (por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas), respectivamente. Los dominios VH y VL también pueden clonarse en un vector que expresa las regiones constantes seleccionadas. Los vectores de conversión de cadena pesada y vectores de conversión de cadena ligera luego se co-transfectan en lineas celulares para generar líneas · celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, usando técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica.
F. MÉTODOS PARA PRODUCIR ANTICUERPOS ANTI-RSV, Y FORMAS MODIFICADAS O VARIANTES DE LOS MISMOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LOS ANTICUERPOS Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden generarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica para la preparación de anticuerpos, incluyendo técnicas de síntesis química y. expresión recombinante . Varias combinaciones de vectores y células hospederas pueden usarse para recibir, mantener, . reproducir y amplificar ácidos nucleicos (por ejemplo ácidos nucleicos que codifican anticuerpos tales como los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados) , y para expresar polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En general, la elección de célula hospedera y vector depende de si se desea la amplificación, expresión de polipéptido, y/o despliegue en un paquete genético, tal como un fago. Los métodos para transformar células hospederas son bien conocidos. Cualquier método de transformación conocido (por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación) puede usarse para transformar la célula hospedera con ácidos nucleicos. Los procedimientos para la producción de anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo, tales como, pero no limitados a, fragmentos Fab y anticuerpos de cadena sencilla son bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitadas a, el uso de tecnologías de hibridoma, expresión recombinante, despliegue de fagos o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de¦ hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlo et al., Antibodies:. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor . Laboratory Press;, 2a, ed. 1988) ; Hammerling, Monoclonal Antibodies' and T-Cell . Hybridomas 5630681 (Elsevier N. Y. 1981).
Los polipéptidos , tales como cualquiera establecidos en la presente, incluyendo los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente, pueden producirse por cualquier método conocido para aquellos de experiencia en la técnica incluyendo métodos in vivo e in vitro. Los. polipéptidos deseados pueden expresarse en. cualquier organismo adecuado para producir las cantidades requeridas y formas de las proteínas, tal como por ejemplo, necesarias para análisis, administración y tratamiento. Los hospederos de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tales como E. coli, levadura, plantas, células de insectos,, células mamíferas, incluyendo líneas celulares , humanas y animales transgénicos (por ejemplo, conejos, ratones, ratas, y ganado, tal como, pero no limitado a, cabras, ovejas, y reses) , incluyendo prodücción en suero, leche y huevos. Los hospederos de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteína así como los tipos de modificaciones post-traduccionales que se presentan en las proteínas expresadas. La elección del hospedero de expresión puede hacerse basada en estos y otros factores, tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, costos de producción y la necesidad y métodos para purificación. 1. Ácidos nucleicos Se proporcionan en la presente moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo anti-RSV . o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que es 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 O 69F6. En algunos' ejemplos, la molécula de ácido . nucleico aislada codifica una forma de anticuerpos u otro fragmento enlazado al antigeno de 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 O 69F6.
En. algunos ejemplos,' la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada aquí codifica un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo contiene una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida én SEQ ID NOS:396, 398, 400, 40.2, 404, 452, 454 o 456. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada contiene un ácido nucleico que tiene una . secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 443, 445, 447, 449, 451, 477, 479 o 481.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido.' nucleico aislada proporcionada ' codifica un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:395, 397, 399, '401, 403, 453, 455 o 457. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada contiene un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID ÑO: 442, 444, 446, 448, 450, 476, 478 o 480.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que contiene una CDR1 VH que tiene una. secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 o 482-484. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que contiene una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos establecida ' en SEQ ID NO:406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 o 471. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que contiene una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 o 472.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada codifica un ' anticuerpo o fragmento del mismo que contiene una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 o 473. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que contiene uña CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:.409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 o' 474. ¦ En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que contiene una CDR3 VL que tiene una secuencia de ' aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 o 475.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden prepararse usando técnicas recombinantes bien usadas para manipulación de moléculas de ácido nucleico (ver, por ejemplo, técnicas descritas en Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Láboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., eds . (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY) . En algunos ejemplos, los métodos, tales como, pero no limitados a, técnicas de ADN recombinantes, mutagénesis dirigida al sitio, y reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) pueden usarse para ¦ generar anticuerpos modificados o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, para crear, sustituciones, eliminaciones, e/o inserciones de aminoácidos.
En algunos ejemplos, una o más de las CDRs de un anticuerpo anti-RSV · o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente se inserta dentro de las regiones de . estructura usando técnicas de ADN recombinante de rutina. Las regiones de estructura pueden seleccionarse de regiones de estructura de consenso o que se presentan naturalmente, incluyendo regiones de estructura humanas (ver, por ejemplo, Chothia et al. (1998) J. Mol. Biol. 278: 457-479 para regiones de estructura ejemplares). Generalmente, el polinucleótido generado por la combinación de las regiones de estructura y las CDRs' codifican un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que mantiene la especificidad enlazada al antigeno del anticuerpo anti-RSV .precursor o fragmento enlazado al antigeno del mismo. Las alteraciones al polinucleótido pueden hacerse para . mejorar una o más propiedades del anticuerpo codificado o fragmento enlazado al antigeno del mismo y dentro de la experiencia en la técnica. En algunos ejemplos, una o más modificaciones del polinucleótido pueden hacerse para producir sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones de estructura, que, por ejemplo, mejoran el enlace del anticuerpo . o fragmento enlazado al antigeno del mismo a su antigeno. Adicionalmente, tales métodos pueden usarse para hacer sustituciones de aminoácidos o eliminaciones de uno o más residuos de cisteina de región variable que participan en un enlace de disulfuro de intracadena^ para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces de disulfuro de intracádena. 2. Vectores Se proporcionan en la presente vectores que contienen ácido nucleico o ácidos nucleicos (que codifican la cadena ligera y pesada) que codifican los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos. Generalmente, el ácido nucleico¦ que codifica la cadena pesada de un anticuerpo se clona en un vector y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo se clona en el vector. Los genes pueden clonarse en un vector sencillo para expresión doble del mismo, o en vectores separados. Si se desea, los vectores pueden también contener secuencias adicionales que codifican regiones constantes adicionales o regiones de bisagra para generar otras formas de anticuerpos.
Muchos vectores de expresión están disponibles y se conocen por aquellos de experiencia en la técnica' y pueden usarse para expresión de polipéptidos . La elección del vector de expresión será influenciada por la elección. del sistema de expresión hospedero. Tal selección está bien dentro' del . nivel de experiencia del técnico experimentado. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales y opcionalmente potenciadores ,. señales traduccionales, y señales de terminación trariscripcional y traduccional . Los vectores de expresión que., se usan para transformación estable típicamente tienen . un marcador seleccionable que permite selección y mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, un origen de replicación puede usarse para amplificar el número. de copias del vector en las células.
Los vectores también pueden contener secuencias de nucleótido adicionales operablemente ligadas a la molécula de ácido nucleico ligada, tal como, por ejemplo, una etiqueta de epítopo tal como para localización, por ejemplo una. etiqueta hexa-his tag o una etiqueta myc, o una etiqueta para purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la secreción de proteína y/o asociación de membrana.
La expresión de' los anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos puede controlarse por cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores bacterianos adecuados son bien conocidos en la técnica y descritos en la presente a continuación. Otros promotores adecuados para células mamíferas, células de levadura y células de insectos . son bien conocidos en la técnica y algunos, se ejemplifican a continuación. La selección del promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular y está dentro del nivel de experiencia del técnico experimentado. Los promotores gue pueden usarse incluyen pero no se limitan a vectores de expresión eucarióticos que contienen el promotor anticipado SV40 (Bernoist y Chambón, (1981) Nature 290:304-310), el promotor contenido en la terminal larga 3' repetida del virus de sarcoma Rous (Yamamoto et al (1980) Cell 22:787-797), el promotor de timidina cinasa del herpes ( agner et al, (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441 - 1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster et al., (1982) Nature 296:39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor ß-lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:5543) o el promotor tac (DeBoer et al, (1983) .Proc. Nati. Acad. Sci. USA 50:21-25); ver también "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": en Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expresión de planta que contienen el promotor de sintetasa nopalina (Herrera-Estrella et al, (1984) Nature 303:209-213) o el promotor de ARN del virus 35S de mosaico de coliflor (Gardner et al, (1981) Nucleic Acid Res. 9:2871), y el promotor de la ribulosa bisfosfato carboxilasa de enzima fotosintética (Herrera-Estrella et al, (1984) Nature 310:115-120); elementos del promotor de levadura y otros hongos tales como el promotor Gal4, el promotor de alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol cinasa, el promotor de'' fosfatase alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional de animal que muestran especificidad de tejido y se han usado en animales transgénicos : región de control del gen de elastasa I que está activa en células acinares pancreáticas (Swift et al, (1984) Cell 38:639-646; Ornitz et al, (1986) . Cold Spring Harbor Symp. Quánt. Biol. 50:399-409; MacDonald,¦ (1987) Hepatology 7:425-515); región de control del gen de insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan et al, (1985) Nature 315:115-122), región de control del gen de inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., (1984). Cell 55:647-658; Adams et al., (1985) Nature 318:533-538; Alexander et al., (1987) Mol. Cell Biol. 7:1436-1444), región de control del virus del tumor mamario de ratón que está ' activa en testicular, mama, linfoide y mastocitos (Leder et al., (1986) Cell 45 : 485-495) , región de control del. gen de' albúmina que está activa en el hígado (Pinckert et al, (1987) Genes and Devel. 7:268-276), región, de control del gen alfa-fetoproteína que está activa en el hígado (Kr.umlauf et al, (1985) Mol Cell Biol¦ 5:1639-1648); Hammer et al, (1987) Science 235:53-58), región de control del gen antitripsina alfa-1 que esté activa en el hígado (Kelsey et al, (1987) Genes and Devel . 7:161-171), región de control del gen de globina beta que está activa en células mieloide (Magram et al, (1985) Nature 375 : 338-340) ; ' Kollias et al, (1986), Cell 46:89-94), región de control del gen de proteína básica mielina que está activa en células de oligodendrocito del cerebro (Readhead et al, (1987) Cell 48 : 103-112) , región de control del gen de cadena ligera-2 de miosina que está activa en el músculo esqueletal (Shani (1985) Nature 314:283-286), y región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrófica que está activa en gonadotrópodos del hipotálamo (Masón et- al, (1986) Science 23.4:1312-1318).
Además del promotor, el vector de expresión típicamente contiene una unidad de transcripción o cásete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del anticuerpo, o porción del mismo, en células hospederas. Un cásete .de expresión típico contiene un promotor operablemente ligado a la secuencia de ácido nucleico que codifica · la cadena de anticuerpo de la línea germinal y señales requeridas para poliadenilación eficiente del transcripto, sitios enlazados a ribosoma y terminación de traducción. Los elementos adicionales del cásete pueden incluir potenciadores . Además, el cásete típicamente contiene una región de terminación de transcripción cadena abajo del gen estructural para proporcionar terminación eficiente. La región de terminación puede obtenerse del mismo gen como la secuencia promotora o pueden obtenerse de genes diferentes.
Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan amplificación del gen tal como timidina cinasa y dihidrofolato reductasa. Alternativamente, los sistemas de expresión de alto rendimiento que no involucran amplificación del gen también son adecuados, tales como usando un vector de baculovirus en células de insectos, con una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena de anticuerpo de línea germinal bajo la dirección del promotor de poliedro u otro promotor baculovirus fuerte.
Para los propósitos en la presente, se proporcionan vectores que contienen una. secuencia de nucleótidos ¦ que codifica la región, variable de cadena pesada y/o cadena ligera de un anticuerpo anti-RSV. En algunos ejemplos, los vectores aquí proporcionados contienen ' una secuencia de nucleótidos que codifican la región constante de un anticuerpo ligado operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable del anticuerpo. El vector puede incluir la secuencia para uno o todos de un CH1, CH2, articulación, CH3 o CH4 y/o CL. Generalmente,- tal como para la expresión de Fabs, el vector contiene la secuencia para una CH1 o CL (cadenas ligeras kappa o larabda) . La secuencia de las regiones constantes o ¦ regiones de articulación se conocen por aquellos expertos en la técnica (ver por ejemplo, solicitud publicada de E.U. ·· No. 20080248028) aquí descrita.
Cualquiera de los métodos conocidos para aquellos de experiencia en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifican un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente. Estos métodos pueden incluir ADN recombinantes in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo ·( recombinación genética) . La inserción en un vector de clonación puede, por ejemplo, realizarse al ligar el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene terminales cohesivas complementarias. Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar ' el ADN no se presentan en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente . Alternativamente, cualquier sitio deseado puede producirse al ligar secuencias de nucleótido (ligaduras) en la terminal de ADN; estas ligaduras ligadas pueden contener ácidos nucleicos químicamente sintetizados específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción.' Los vectores de plásmido ejemplares útiles para producir los anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno proporcionados en la presente contienen un promotor fuerte, tal como el potenciador/promotor anticipado inmediato HCMV o el promotor de clase I MHC, un intrón para potenciar el procesamiento del transcripto, tal como el intrón A del gen anticipado inmediato HCMV, y una señal de poliadenilación (polyA) , tal como la señal .polyA SV40 tardío. El plásmido puede ser multicistrónico para permitir la expresión' de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa del anticuerpo, un fragmento Fe dé cadena sencilla u otros fragmentos de inmunoglobulina . 3. Sistemas de Expresión Celular Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden expresarse en un hospedero adecuado. Se proporcionan células que contienen los vectores y ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la . presente. Generalmente, es adecuado cualquier tipo celular que pueda prepararse por ingeniería para expresar ADN heterólogo y tenga una trayectoria secretora. Los hospederos de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos , tales como células bacterianas (por ejemplo E. coli) , células de levadura, células de hongos, Arqueas, células de planta, células de insecto y células de animal incluyendo células humanas. Los hospederos de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteina así como los tipos de modificaciones post-traduccionales que se presentan en las proteínas expresadas. Además, la elección de hospedero de expresión se relaciona a menudo a la elección de vector y elementos de transcripción y traducción usados. Por ejemplo, la' elección de hospedero de expresión es a menudo, pero no siempre, dependiente de la elección de la secuencia precursora utilizada. Por ejemplo, muchas secuencias de señal heterologas pueden sólo expresarse en una célula hospedera de la misma especie (esto es, una secuencia de señal, de célula de insecto está óptimamente expresada en una célula de insecto). En contraste, otras secuencias de señal pueden usarse en hospederos heterólogos tales como, por ejemplo, la secuencia de señal de albúmina de suero humana (hHSA,¦ por sus siglas en inglés) que trabaja bien en células hospederas de levadura, insecto, o mamíferas y la pre/pro secuencia activadora de plasminógeno . de tejido que se ha demostrado para ser funcional en células de insecto y mamíferas (Tan et al., (2002) Protein Eng. 15:337). La elección del hospedero de expresión puede hacerse basada en estos y otros factores, . tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, costos de producción y la necesidad y métodos para purificación. De esta manera, el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedera usada .
La expresión en hospederos eucarióticos puede incluir expresión en levaduras tales como Saccharomyces cer.evisiae y Pichia pastoris, células de insecto tales como células de Drosophila y células de lepidopteran, plantas y células de planta tales como tabaco, maiz, arroz, algas, y lemna (género de plantas acuáticas) . Las células eucariót.icas para expresión también incluyen lineas celulares mamiferas ¦ tales como células de ovario de hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) o células de riñon de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) . Los hospederos de expresión eucarióticos también incluyen producción en animales transgénicos , por ejemplo, incluyendo producción . en suero, leche y huevos.
Las moléculas recombinantes pueden introducirse en células hospederas por medio de, por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de manera que muchas copias de la secuencia del gen se generan. Generalmente, los métodos de transfección estándares se usan para producir lineas celulares bacterianas, mamiferas, de levadura, o insecto que expresan cantidad grande de cadenas de anticuerpo, que luego se purifica usando técnicas estándares (Ver por. ejemplo, Colley et al. (1989)· J. Biol. Chem., 264:17619-17622; Guide to ' Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 ' (Deutscher, ed.), 1990). La transformación de células eucarióticas y procarióticas se realiza de acuerdo a técnicas estándares (ver, por ejemplo, Morrison (1977) J. Bact. 132:349-351; Clark-Curtiss. y Curtiss (1983) Methods in Enzymology, 101, 347-362). Por ejemplo, cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias de nucleótido extranjeras en' células hospederas pueden usarse. Estos incluyen el uso de transfección de fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos , electroporación, biolistica, liposomas, microinyección, vectores de plasma, vectores víricos (por ejemplo, baculovirus, virus de vacuna,- adenovirus y otros virus), y cualquier, otro de los otros métodos bien conocidos para introducir ADN genómico clonado, cADN, ADN plásmido, ADN cósmido, ADN sintético u otro material genético exterior en una célula hospedera.
Generalmente para los propósitos en la presente,' las células hospederas se transfectan con un primer vector que codifica al menos ¦ una cadena VH o cadena epsada de un anticuerpo anti-RSV y un segundo vector que codifica al menos una cadena VI o cadena ligera del anticuerpo anti-RSV. Las células hospederas también pueden ' transfectarse con un vector sencillo que codifica tanto a la cadena pesada como ligera. o porción del mismo.
En un ejemplo, el ' ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo se liga en un primer vector de expresión y el ácido nucleico que codifica la- cadena ligera de un anticuerpo se- liga en un segundo vector de expresión. Los vectores de expresión pueden ser iguales o diferentes, aunque generalmente son lo suficientemente compatibles para permitir una expresión comparable de las proteínas (cadena ligera y pesada) de las mismas. El primero y segundo vectores de expresión se co-transfectan generalmente en células hospederas, típicamente a una relación de 1:1. Los vectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, pylHC, y 'picLC (tiller et al., (2008) Journal of Immunological methods, 329:112-24). Otros vectores de expresión incluyen el ector de expresión de la cadena L pAG4622 y el vector de expresión de cadena pesada pAH4604 . (Coloma et al¿, (1992) J Immunol . Methods, 152:89-104). El vector pAG4622. contiene la secuencia genómica que codifica el dominio de la región C. de la cadena L K humana y el marcador de selección gpt . Los- vectores pAH4604 contiene el marcador de selección hisD y ais secuencias que codifican el dominio de la región- C, ?? de cadena H humana.
En otro ejemplo, la cadena pesada y ligera puede clonarse en un vector sencillo que tenga casestes de expresión tanto para la cadena ligera como pesada.' En un ejemplo, los genes que codifican las cadenas pesada y ligera se pueden clonar dentro del vector de expresión mamífero pTT5 (NRC Biotechnology Research) . En otro ejemplo, los. genes que codifican las cadenas pesada y ligera, o porciones de las mismas, se pueden clonar dentro de pCALM (SEQ ID NO:102) .
Para la expresión de una Ig de longitud completa, las secuencias que codifican la VH-CHl-bisagra-CH2-CH3 pueden clonarse en un primer vector de expresión y las secuencias eu codifiquen los dominios VL-CL pueden clonarse en un segundo vector de expresión. Para generar un Fab, las secuencias que codifican VH-CH1 pueden clonarse en un primer vector de expresión y las secuencias que codifiquen los dominios VL-CL pueden clonarse en un segundo vector de expresión. Para un anticuerpo convencional, los pares de cadena pesada con una cadena ligera y un monómero Fab se generan.
La expresión puede ser en cualquier sistema de expresión celular conocido por alguien de. experiencia en la técnica. Las células ejemplares para expersión incluyen, pero no se limitan a, células 293-FS, células HEK-293-6E o células CHO. Otros vectores de expresión y células hospederas se describen a continuación. Con la expresión, el par de cadenas ligera y pesada del anticuerpo por el enlace bisulfuro forma un anticuerpo de longitud completa o fragmentos de los mismos. a. Expresión Procariótica Las procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir cantidades grandes de proteínas y pueden usarse para ' expresar los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos. Típicamente, las células hospederas E. coli se usan para amplificación y expresión de los polipéptidos variantes proporcionados. La transformación de E. coli es una técnica sencilla y rápida bien conocida para aquellos de experiencia en la técnica. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles, tales promotores son útiles para inducir niveles altos de expresión de proteína y para expresar proteínas que muestran alguna toxicidad a las células hospederas. Lós ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el · promotor tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6 y el promotor ? que regula la temperatura.
Las proteínas, tales como cualquiera proporcionadas en la presente, pueden expresarse en él ambiente citoplásmico de E. coli. Para algunos polipéptidos, . el ambiente citoplásmico, puede resultar en la formación de cuerpos de inclusión insolubles que contienen agregados de las proteínas. Los agentes de reducción tales como ditiotreitól y ß-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCl y urea pueden usarse para resolubilizar las proteínas, seguido por repliegue posterior de las proteínas solubles. Un enfoque alternativo es la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de bacterias que proporcionan un ambiente oxidante e isomerasas dé disulfuro y tipo chaperonina y pueden llevar a la producción de proteína soluble. Por ejemplo, para despliegue de fagos de las proteínas, las proteínas se exportan al periplasma de manera que pueden ensamblarse en el fago. Típicamente, una secuencia líder se fusiona a la proteína para expresarse lo que dirige la proteína al periplasma. El líder luego se remueve por peptidasas de señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias líder dirigidas periplásmicas incluyen el líder pelB del gen de pectato liasa y el líder derivado del gen de fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite el escape de la proteína expresada en el medio de cultivo. La secreción de proteínas permite purificación sencilla y rápida del sobrenadante de cultivo. Las proteínas que no se secretan pueden obtenerse del periplasma por lisis osmótica. Similar a la .expresión citoplásmica, en algunos casos las proteínas pueden volverse insoluble y los desnaturalizantes y agentes reductores pueden usarse para facilitar la solubilización y repliegue. La temperatura de inducción y crecimiento también pueden influir en los niveles de expresión y solubilidad, típicamente se usan temperaturas entre 25°C y 37°C. Típicamente,. las bacterias producen proteínas no glicosiladas . De esta manera, si las proteínas requieren glicósilación para función, la glicosilación puede agregarse in vitro después de la purificación de las células hospederas. b. Células de Levadura Las levaduras tales como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica , Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son hospederos de expresión de levadura bien conocidos que pueden usarse para expresar los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados, al antígeno de los mismos proporcionados en la presente. La levadura puede transformarse con vectores de replicación episoma es. o por integración cromosomal estable por recombinación- homologa. Típicamente, los promotores inducibles se usan para regular la expresión del gen. Los ejemplos de tales promotores incluyen promotores de GAL1, GAL7 y GAL5 y metalotioneina, tales como CUP1, AOX1 u otro promotor Pichia u otro promotor de levadura. Los. vectores de expresión a menudo incluyen un marcador seleccionadle tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del ADN transformado. Las- proteínas expresadas en levadura a menudo son solubles. La co-expresión con chaperoninas tal como Bip e isomerasa de disulfuro de proteína puede mejorar los niveles . de . expresión y solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en levadura pueden dirigirse para secreción usando fusiones de péptidc de señal de¦ secreción tales como la' señal de secreción del factor alfa tipo unión de levadura de Saccharomyces cerevisae y fusiones . con proteínas de superficie celular de levadura tales como el receptor de adhesión de unión Aga2p o. la glucoamilasa Arxula adeninivorans . Un sitio de escisión de proteasa. tal-' como para la proteasa Kex-2, puede prepararse por ingeniería para remover las secuencias fusionadas de los ¦ polipéptidos expresados ya que salen de la trayectoria de secreción. La levadura también es capaz de glicosilacion en porciones Asn-X-Ser/Thr. c . Células de Insectos Las células de insectos, particularmente usando expresión de baculovirus, pueden usarse para expresar los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la' presente. Las células de insectos expresan niveles, altos de proteina y son capaces de la mayoría de las modificaciones post-traduccionales usadas por eucariotas superiores. El baculovirus tiene un intervalo hospedero restrictivo que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de la expresión eucariótica. Los vectores de expresión típicos usan un promotor para expresión de nivel alto tal como el promotor de polihedrina de baculovirus. Los sistemas de baculovirus comúnmente usados incluyen los baculovirus tales como virus de polihedrosis nuclear Autographa- californica (AcNPV, por sus siglas en inglés), y el virus de. polihedrosis nuclear. Bombyx mori (BmNPV, por sus siglas en inglés) y una línea de célula de insecto tal como Sf9' derivado de Spodoptera frugiperda , Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpNl). Para expresión de nivel alto, la secuencia de nucleótidos de la molécula para expresarse se fusiona inmediatamente cadena abajo del codón de inicio de polihedrina del virus. Para generar baculovirus recombinantes que puedan · expresar anticuerpos humanos, se utiliza una transferencia de expresión doble, tal como pAcUW51 (PharMingen) . Las señales de secreción mamíferas se. preparan exactamente en las células de insectos y pueden usarse para secretar la proteína expresada en el medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpNl) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a los sistemas de célula mamifera.
Un sistema de expresión alternativo en las células de insectos es el uso de células establemente transformadas. Las líneas celulares tales como las células Schnieder 2 (S2) y Kc {Drosophila melanogaster) y células C7 [Aedes albopictus) pueden usarse para expresión. El promotor de metalotioneina de Drosophila puede usarse para inducir niveles altos de expresión en presencia de inducción de metal pesado con cadmio o cobre. Los vectores de expresión se mantienen típicamente por el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.
Vectores de baculovirus ejemplares para expresión de anticuerpos son los vectores bicistrónicos pAc-K-Fc (Progen, Biotechnik; Catálogo. No. PR3001) ; pAc-X-Fc (Progen; PR3003) ; pAc-K-CH3 (progen; PR3000) y pAc--X-CH3 (Progen; PR3002). d. Células Mamíferas Los sistemas de expresión mamíferos pueden usarse para expresar los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente. Los constructos de expresión pueden transferirse a células mamíferas por infección vírica, tal como, pero no limitada a adenovirus o virus de vacuna, o por transferencia de ADN directa tal como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medio físico, tal como electroporación y microinyección . Los vectores de expresión para células mamíferas típicamente incluyen un sitio de cierre de mARN, una caja TATA, una secuencia de inicio de traducción (secuencia de consenso Kozak) y elementos de poliadenilación . Tales vectores a menudo incluyen promotor-potenciadores transcripcionales para expresión de nivel alto,¦ por ejemplo el promotor-potenciador SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV) y la terminal larga repetida del virus del sarcoma Rous . Estos promotor-potenciadores son activos en muchos tipos celulares. Las regiones potenciadoras y promotores de tipo celular y tejido también pueden usarse para expresión. Las regiones de promotór/potenciador ejemplares incluyen, pero, no se limitan a, aquellos de genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus del tumor mamario de ratón, albúmina, fetoproteína alfa, antitripsina alfa 1, beta globina, proteína básica de mielina, miosina de cadena ligera 2, y control del gen de la hormona liberada gonadotrópica . Los marcadores seleccionables pueden usarse para seleccionar y mantener células con el constructo de expresión. Los ejemplos de genes de marcador seleccionable incluyen, pero no se limitan a, fosfotransferasa de higromicina B, adenosina desaminasa, fosforibosil transferasa de · xantina-guanina, aminoglicósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa y timidina cinasa. Los anticuerpos pueden producirse usando un sistema NEOR/G418, un sistema de dihidrofolato reductasa '( DH R) o un sistema de glutamina sintetasa (GS) . El sistema GS usa vectores de expresión conjuntos, tales como pEE12/pEE6, para expresar tanto cadena pesada como cadena ligera. La fusión con moléculas de señalización de superficie celular tales como TCR-? y FCERI-Y pueden dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular.
Muchas líneas, celulares están disponibles para expresión mamífera incluyendo células de ratón, rata, humano, mono, pollo y hámster. Las líneas celulares ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ' CHO, Balb 3T3, BHK, HeLa, MDCK, MT2 , NSO (no secretadas) de ratón y otras líneas celulares de mieloma, hibridoma- y líneas celulares de heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, W138, BT483, HS578T, H B2 , BT20, T47D, 293S, 2B8, y" células HKB . Las líneas celulares también están disponibles para' adaptarse a medio libre de suero que facilita la purificación de proteínas secretadas del medio de cultivo celular. Un ejemplo es la línea celular EBNA-1 libre de suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng..84 : 332-42. ) Los vectores mamíferos ejemplares para expresión dé anticuerpos incluyen pYY5 (NRC Biotechnology Research Institute) y pCALM (establecida en SEQ ID NO:102). e. Plantas Las plantas y células de planta transgénicas puede ser para expresar polipéptidos tales como cualquiera descritos en la presente. Los constructos de expresión se transfieren típicamente a plantas usando transferencia de ÁDN directa, tal como bombardeo de micrüproyectil y transferencia mediada por PEG en protoplastos , y con transformación mediada por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias de promotor y potenciador, elementos de terminación transcripcionales y elementos de control traduccionales . Los vectores de expresión y técnicas de transformación se dividen usualmente entre hospederos de dicotiledóneas, tales como Arabidopsis y tabaco, y hospederos de monocotiledóneas , tales como maíz y arroz. Los ejemplos de promotores de planta usados para expresión incluyen .el promotor del virus de' mosaico de coliflor, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de carboxilasa de bisfosfato de ribosa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Los marcadores seleccionables tales como higromicina, isomerasa . de fosfomanosa y fosfotransferasa de neomicina se usan a. menudo para facilitar .selección y mantenimiento de células transformadas. Las células de planta transformadas pueden mantenerse en el cultivo como células, agregados (llamado tejido) o regeneradas en plantas completas. Las células de planta transgénicas también pueden incluir algas preparadas por ingeniería para producir proteasas o . proteasas modificadas (ver por ejemplo, Mayfield et al.' (2003) Proc Nati Acad Sci USA 100:438-442).. Debido a que las plantas tienen patrones de glicosilación diferentes que las células mamíferas, esto puede influir en la elección de proteína producida en estos, hospederos.
. Purificación de Anticuerpos Los métodos para purificación de polipéptidos , incluyendo los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente, a partir de células hospederas dependerán de la elección de células hospederas y sistemas de expresión. Para moléculas secretadas, las proteínas generalmente se purifican · del medio de cultivo después de remover las células. Para expresión intracelular, las células pueden lisarse y las proteínas purificarse del extracto. En un ejemplo, los polipéptidos se aislan de las células hospederas por centrifugación y lisis celular (por ejemplo por congelación-descongelación repetida en un baño de hielo seco/etanol) , seguido por centrifugación y retención del sobrenadante que contienen los polipéptidos. Cuando los organismos' transgénicos tales como animales y plantas transgénicas se usan para expresión, tejidos u órganos pueden usarse como material de partida para hacer un extracto de célula lisada. Adicionalmente, la producción animal transgénica puede incluir . la producción de polipéptidos en leche o huevos, que puede recolectarse, y si es necesario además las proteínas pueden extraerse y purificarse además usando métodos estándares en la técnica.
Las proteínas, tales como los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente, pueden purificarse, por ejemplo, de extractos de célula lisada, usando técnicas de purificación de proteína estándares conocidas en la técnica incluyendo pero no limitadas a, SDS-PAGE, cromatografía de exclusión de tamaño y fracción de tamaño, precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónica, tal como intercambio de aniones. Las técnicas de purificación de afinidad también pueden utilizarse para mejorar la eficiencia y pureza, de las preparaciones. Por ejemplo, los anticuerpos, receptores y otras moléculas que enlazan las proteasas pueden usarse en purificación de · afinidad. Los constructos de expresión también pueden prepararse por ingeniería para agregar una etiqueta de afinidad a una proteína tal como un epítopo myc, fusión GST o His6 y afinidad purificada con anticuerpo myc, resina de glutationa y resina Ni, respectivamente. La pureza puede evaluarse por cualquier ' método conocido en la técnica incluyendo electroforesis de gel y técnicas de tinción y espectrofotométricas .
Típicamente, los anticuerpos y porciones de los mismos se purifican por cualquier proceduimiento conocido por alguien experto en la técnica.- Los anticuerpos se pueden purificar hasta pureza . substancial usando técnicas de purificación estándar de proteínas conocidas en la técnica, incluyeno pro no limitado a, SDS-PAGE, cromatografía de exclusión de tamaño y fracción de tamaño, precipitación por sulfato de amonio, cromatografía de quelatos, . cromatografía de intercambio iónico o cromatografía en columna. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse por cromatografía en columna, en donde un material en columna con soporte sólido se liga a la Proteína G, una proteína asociada con superficie celular a partir de- Streptococcus, que enlaza inmunoglobulinas con alta, afinidad. Los anticuerpos pueden purificarse hasta 60%,' 70%, 80% de pureza y típicamente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%. o 99% de pureza. La pureza puede evaluarse por métodos estándar tales como por SDS-PAGE y tinción de Coommassie.
Los polipéptidos aislados luego pueden analizarse, por ejemplo, por separación en un gel (por ejemplo SDS-Page gel), fraccionamiento.de tamaño (por ejemplo separación en una columna de exclusión de tamaño, Sephacryl™ S-200 HiPrep™ 16x60 (Amersham from GE Healthcare Life . Sciences, Piscatawa.y, NJ) . Los polipéptidos aislados también pueden analizarse en ensayos de enlace, típicamente ensayos dé enlace usando un patrón de enlace enlazado a un soporte sólido, por ejemplo, a una placa (por ejemplo ensayos de enlace basados en ELISA) o una perla, para determinar su capacidad para enlazar patrones de enlace deseados. Los ensayos de enlace descritos en ¦ las secciones a continuación, que se usan para evaluar el enlace de fagos precipitados que despliegan los polipéptidos, también pueden usarse para evaluar polipéptidos ¦ aislados directamente de lisadós de célula hospedera. Por ejemplo, los ensayos de enlace pueden llevarse a cabo para determinar si los polipéptidos de anticuerpo enlazan a uno o más antígenos, por ejemplo, al recubrir el antígeno en un soporte sólido, tal como un pozo de una placa de ensayo e incubar los polipéptidos aislados en el soporte sólido, seguido por lavado y detección con reactivos secundarios, por ejemplo anticuerpos etiquetados con enzima · y substratos. 6. EVALUACIÓN DE ACTIVIDADES Y PROPIEDADES DEL ANTICUERPO ANTI-RSV Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden caracterizarse en una variedad de formas bien conocidas para alguien de experiencia en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno 'de los mismos proporcionados en la presente pueden, colocarse en ensayo para la capacidad de enlazar inmunoespecificamente a una proteina F de Virus Sincitial Respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) humano. Tales ensayos pueden realizarse, por ejemplo, en solución (por ejemplo, Houghten- (1992) Bio/Techniques 13:412-421), en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), en chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), en bacterias (Patente de E.U.A. No. 5,223,409), en esporas (Patentes de E.U.A. Nos. " 5, 571, 698; 5, 403, 484 ; . y .5,'223, 409) , en plásmidos (Culi et al . (1992) Proc. Nati. Acad. · Sci . ' USA 89:1865-1869) o en fago (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 2.49 : 404- 06 ; .Cwirla et ál . (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87': 6378-6382 ; y '.Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310) . Los anticuerpos' o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos que se han identificado para enlazar inmunoespecificamente .a · un antigeno RSV o un fragmento del mismo también pueden ' colocarse en ensayo para su especificidad y afinidad para un antigeno RSV. La especificidad de. enlace, o epitopo, puede determinarse, por ejemplo, por ensayos de competencia con otros anticuerpos anti-RSV y/o ensayos de neutralización de virus usando Mutantes Resistentes al Anticuerpo Monoclonal (MARMs, por sus siglas en inglés). Además, los ensayos in vitro y modelos de animal in vivo usando los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden ' emplearse para medir el nivel de neutralización RSV efectuada por contacto o administración de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos. 1. Ensayos de Enlace Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden evaluarse por su capacidad para enlazar un: objetivo seleccionado (por ejemplo, virus RSV o proteína. F de. RSV aislada) y la especificidad para tales objetivos por cualquier método conocido para alguien de experiencia en la técnica. Los ensayos ejemplares se proporcionan en los Ejemplos, y se describen en la presente a continuación. Los ensayos de enlace pueden realizarse en solución, suspensión o en un soporte sólido. Por ejemplo, los antígenós. objetivo pueden inmovilizarse a un soporte sólido (por ejemplo un carbono o superficie plástica, un plato de cultivo, de tejido o chip) y conectado con el anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo. El anticuerpo no enlazado o proteina objetivo puede lavarse y los complejos de enlace luego pueden detectarse. Los ensayos de enlace pueden realizarse bajo condiciones para reducir el enlace no especifico, tal como al usar una solución amortiguadora fuerte iónica alta (por ejemplo, NaCl 0.3-0.4 M) con detergente no iónico (por ejemplo Tritón X-100 al 0.1% o Tween 20) y/o proteínas de bloqueo (por ejemplo albúmina de suero de bovino o gelatina) . Los controles negativos también pueden incluirse- en tales ensayos como una medición de enlace de fondo. Las afinidades de enlace pueden determinarse usando análisis Scatchard ( unson et al, (1980) Anal. Biochem. , 107:220), resonancia de plasmón de superficie, calorimetría isotérmica, u otros métodos conocidos para alguien de experiencia en la técnica.
Los inmunoensayos ejemplares que pueden usarse para analizar enlace inmunoespecífico y reactividad cruzada incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivo y no competitivo usando técnicas tales como, pero no limitadas a, western blots, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a la enzima) , Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland) , inmunoensayos de "intercalado", ensayos de inmunoprecipitación, ELISPOT, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunoradiométricos,' inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteina A. Tales ensayos son de rutina y bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Gurrent Protocols in Molecular Biology, Vol . 1, John iley & Sons, Inc., New York, que se incorpora como referencia en la presente- en su totalidad) . Otros formatos de ensayo incluyen inmunoensayos de liposoma (LIA, por sus siglas en inglés), que' usan liposomas diseñados para enlazar moléculas especificas (por ejemplo, anticuerpos) y marcadores o reactivos encapsulados libres. Los químicos liberados luego se detectan de acuerdo a técnicas estándares (ver Monroe et al., (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41).. Los inmunoensayos ejemplares no se pretenden a ' manera de limitación se describen brevemente a continuación.
Los protocolos de inmunoprecipitación generalmente involucran lisar una población de células en' una solución amortiguadora de lisis tal como solución amortiguadora RIPA (NP-40 o Tritón X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 1%, SDS al 0.1%, NaCl 0.15 M, fosfato de sodio 0.01 M en pH 7.2, Trasylol al 1%) complementado con fosfatasa de proteína e/o inhibidores de proteasa (por ejemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio), agregar el anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo de interés al lisado celular, incubado durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 1 hasta 4 horas) a 40°C, agregar perlas de sefarosa de proteina A y/o proteina G al lisado celular, incubar durante alrededor de una hora o más a 40°C, lavar las perlas- en solución amortiguadora de lisis y volver, a suspender las perlas en SDS/solución amortiguadora de muestra. La capacidad del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del . mismo de interés para inmunoprecipitar un antigeno particular puede evaluarse por, por ejemplo, análisis de western blot. Alguien de experiencia en la técnica está informado en' cuanto a los parámetros que pueden modificarse para incrementar el enlace del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo para un antigeno y disminuir el fondo (por ejemplo, pre-compensar el lisado celular con perlas de sefarosa) . Para discusión adicional con respecto a los protocolos de inmunoprecipitación ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1.
El análisis Western blot generalmente involucra preparar muestras de proteina, electroforesis de las' muestras de proteina en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE al 8%-20% dependiendo del peso molecular del antigeno), transferir la muestra de proteina del gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVDF o nylon, bloqueando la membrana en solución de bloqueo (por ejemplo, PBS con BSA al 3% o leche sin grasa), lavar la membrana en solución amortiguadora de lavado (por ejemplo, PBS-Tween .20), bloquear la membrana con anticuerpo primerio o fragmento enlazado al antigeno del mismo (esto es, el anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo de interés) diluido en solución amortiguadora de bloqueo, lavar la membrana en solución amortiguadora de lavado, bloquear la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-humano) conjugado a un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de raíz de rábano o fosfatasa alcalina) o molécula radioactiva (por ejemplo, 32P o 125I) diluida en solución amortiguadora de bloqueo, lavar la membrana en solución amortiguadora de lavado, y detener la presencia del antigeno. Alguien de experiencia en la técnica está informado en cuanto a los parámetros que pueden modificarse para incrementar la señal detectada y para reducir el ruido.de fondo. Para discusión adicional con respecto a los protocolos western blot ver, por ejemplo, Ausubel et al,, eds, 1994, Current Prótocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc.-, New York en 10.8.1.
Los ELISAs involucran preparar el antígeno,' recubrir el pozo de una placa de microtitulacion de 96 pozos con el antigeno, agregar el anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo de interés conjugado a un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de raíz de rábano- o fosfatasa alcalina) -al pozo e incubar durante un periodo de tiempo, y detectar la presencia del antigeno. En ELISAs, el anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo de interés no tiene que ser conjugado a un compuesto detectable; en cambio, un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo de interés) conjugado con un compuesto detectable puede agregarse al pozo. Además, en lugar de recubrir el pozo con el antigeno, el anticuerpo puede recubrirse con el pozo. En este caso, un segundo anticuerpo conjugado con un compuesto detectable puede agregarse después de la adición del antigeno de interés al pozo recubierto. Alguien de experiencia en la técnica está informado en cuanto a los parámetros que pueden modificarse para incrementar . la señal detectada asi ' como otras variaciones de ELISAs conocidos en la técnica. Para discusión adicional con respecto a ELISAs ver, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocole in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York en 11.2.1. Los ejemplos 5 y 8 ejemplifican un ensayo de enlace para enlace de anticuerpos anti-RSV a la proteina F de. RSV.
La afinidad de enlace de un anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo a un antigeno y la constante de disociación de una interacción ' anticuerpo-antigeno puede determinarse, por ejemplo, por ensayos de enlace competitivos. Un ejemplo de un ensayo de enlace competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antígeno etiquetado (por ejemplo, 3H o 125I) con el anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo de interés en la presencia de cantidades incrementada de '. antígeno no etiquetado, y la detección del anticuerpo o · fragmento enlazado al antígeno del mismo enlazado al antígeno etiquetado. La afinidad de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente para un antígeno RSV y las constantes de disociación de enlace pueden determinarse de los . datos por análisis de gráfica Scatchard. La competencia con un segundo anticuerpo también puede determinarse usando radioinmunoensayo.s. En este caso, un antígeno RSV se incuba con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente conjugado con un compuesto etiquetado (por ejemplo, 3H o 125I) en la presencia de cantidades incrementadas de un segundo anticuerpo no etiquetado. En algunos ejemplos, el análisis cinético de resonancia de plasmón de superficie (por ejemplo, BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, . Suecia y GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335) puede usarse para determinar las constantes de asociación y disociación de enlace de anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos a un antigeno RSV. El análisis cinético de resonancia de plasmón de superficie involucra analizar el enlace y disociación de un antigeno RSV de chips con anticuerpos inmovilizados o fragmentos de los mismos en su superficie.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente también pueden colocarse en ensayo por su capacidad para inhibir el enlace de RSV a su receptor de célula hospedera usando técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica. Por ejemplo, células que expresan el receptor para RSV pueden ponerse- en contacto con RSV en presencia o ausencia de un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo y la capacidad del anticuerpo o fragmento del mismo para inhibir enlace RSVs puede medirse por, por ejemplo, citometria de flujo o un ensayo de escintilació . RSV (por ejemplo, un antigeno RSV tal como glicoproteina F o glicoproteina G) o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede etiquetarse con un compuesto . detectable tal como una etiqueta radioactiva (por ejemplo, 32P, 35S, y 125I) o una etiqueta fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina) para permitir la detección de una. interacción entre RSV y su receptor de célula hospedera.
La capacidad de anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos para inhibir RSV de enlace a su receptor también puede determinarse en ensayos · libres de célula. Por ejemplo, RSV o un antigeno RSV tal como glicoproteina F puede ponerse en contacto con un anticuerpo. o fragmento del mismo y la capacidad del anticuerpo o' fragmento de anticuerpo para inhibir RSV o el antigeno RSV de enlace a su receptor de célula hospedera puede determinarse.. En algunos ejemplos, el anticuerpo o el fragmento enlazado al antigeno se inmoviliza en un soporte sólido y RSV o un antigeno RSV se etiqueta con un compuesto detectable. En algunos ejemplos, RSV o un antigeno RSV se inmoviliza en un soporte sólido y el anticuerpo o fragmento del . mismo se etiqueta con un compuesto' detectable. El RSV o antigeno RSV puede purificarse parcialmente o completamente (por ejemplo, parcialmente o completamente libre de otros polipéptidos ) o parte de un lisado celular. En algunos ejemplos, un antigeno RSV puede ser una proteína de fusión que. comprende el antígeno RSV y un dominio tal como glutationina-S-transferasa. En algunos ejemplos, un antígerio · RSV puede biotinilarse usando técnicas bien conocidas para aquellos de experiencia en la técnica (por ejemplo, . kit de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford, 111.). 2. Especificidad de Enlace La especificidad de enlace, o epitopo, de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la . presente puede determinarse por cualquier ensayo conocido para alguien de experiencia en la técnica, incluyendo, pero no limitado a ensayos de resonancia de plasmón de superficie, ensayos de competencia y ensayos de neutralización de virus usando Mutantes Resistentes al Anticuerpo Monoclonal (MARMs). El epitopo puede estar en la¦ proteína aislada, esto es, la proteína F aislada, o en la proteína en el virus. La capacidad de dos anticuerpos para enlazar al mismo epitopo puede determinarse por ensayos conocidos en la técnica tales como,, por ejemplo, ensayos de resonancia de plasmón. de superficie y ensayos de competencia de anticuerpo. Típicamente, los anticuerpos que enlazan inmunoespecíficamente al mismo epitopo pueden competir para enlazar al epitopo, que puede medirse, por ejemplo, por un ensayo de competencia de enlace in vi tro (por ejemplo ELISA de competencia) , usando técnicas conocidas en la técnica. Típicamente, un primer anticuerpo que enlaza inmunoespecíficamente al · mismo epítopo como un segundo anticuerpo puede competir para, enlazar al epítopo por alrededor de o 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, .65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, donde el porcentaje de competencia es la cap.acidad medida del segundo anticuerpo para desplazar el enlace del primer anticuerpo al epítopo. En ensayos de competencia ejemplares, el antígeno se incuba en presencia de una dilución limitada predeterminada de un anticuerpo etiquetado, (por ejemplo', 50-70% de concentración de saturación), y diluciones en. serie de un anticuerpo competente no etiquetado; La competencia se determina al medir el enlace del anticuerpo etiquetado al antígeno para cualquiera de las disminuciones en enlace en presencia del anticuerpo que compite. Las variaciones de tales ensayos, incluyendo varias técnicas de etiquetado y métodos de detección incluyendo, por ejemplo, detección radiométrica, fluorescente, enzimática y colorimétrica, se conocen en la técnica. Por ejemplo, como se ejemplifica en el Ejemplo 10 a continuación, el anticuerpo 30D8 y motavizumab no compiten para enlace a la proteína F de RSV,. de esta manera indica que el anticuerpo 30D8 enlaza un epítopo diferente que motavizumab.
También puede determinarse la capacidad de un primer anticuerpo para enlazar al ¦ mismo epitopo como un segundo anticuerpo, por ejemplo, por ensayos de neutralización de virus usando Mutantes Resistentes al Anticuerpo · Monoclonal . Un MARM es un virus sincitial respiratorio mutante (RSV) que no se neutraliza por un anticuerpo monoclonal que neutraliza el virus RSV de tipo natural, esto es, un MARM es un mutante de escape RSV. Los MARMs se generan al cultivar RSV de tipo natural en presencia de un anticuerpo monoclonal para rondas sucesivas de replicación vírica en presencia del .anticuerpo de tal manera que después de cada ronda sucesiva de la replicación de virus, los efectos citopáticos (CPE, por sus siglas en inglés) se observan en presencia de concentraciones incrementadas de anticuerpos hasta que un virus mutante resulta que no se neutraliza por el anticuerpo. Si un primer anticuerpo puede neutralizar un MARM generado contra un segundo anticuerpo, se puede concluir que los . anticuerpos específicamente enlazan a o interactúan con diferentes epítopos. Por ejemplo, donde un primer anticuerpo anti-RSV neutraliza RSV . de tipo natural pero no un. RSV mutante particular (esto es, MARM) , un segundo anticuerpo que neutraliza el RSV de tipo natural pero no el RSV mutante particular generalmente enlaza el mismo epítopó en RSV como el primer anticuerpo. Donde un primer anticuerpo anti-RSV neutraliza RSV de tipo natural pero no un RSV mutante particular, un segundo anticuerpo que neutraliza el RSV de tipo natural y el RSV mutante particular generalmente no enlaza el mismo epitopo en RSV como el primer anticuerpo.
Por ejemplo, como se ejemplifica en el Ejemplo 9 a continuación, el 58c5 proporcionado en la presente es capaz de neutralizar MARMs previamente generados contra varios anticuerpos anti-RSV, incluyendo MARM 1129, generados con MAb 1129, el anticuerpo precursor para palivizumab y motavizumab (ver, Johnson et al. (1997) J. Infect. Diseases 176:1215-1224 y Patente de E.U.A. No. 5,824,307), MARM 19, generado con Fab 19 (ver Barbas et al (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89:10164-10168) y MARM 151, generado con MAb 151 (ver, Mufson et al, (1985) J. Gen. Virol, 66:2111-2124). De esta manera, 58c5 enlaza un epitopo diferente en la proteina' F que los anticuerpos Fab 19, MAb 151 y MAb 1129.
Como se ejemplifica en el Ejemplo 11 a continuación, los MARMs se generaron contra, motavizumab y la forma IgG de. 58c5. El MARM motavizumab, generado después de 5-7 rondas de selección, contiene una mutación de aminoácido sencillo (K272E, SEQ ID NO: 486) comparado con la proteina F de RSV de tipo natural. La mutación en- el aminoácido K272 es consistente con mutaciones conocidas que interrumpen el enlace del anticuerpo precursor de motavizumab. (ver, Zhao et al, (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946)·. El MARM IgG 58c5, generado después de 10 rondas de selección, contiene 3 mutaciones de aminoácidos (N63K, M115K y E295G, SEQ ID NO: 487) comparado con la proteina F de RSV de tipo natural. Las mutaciones que efectúan escape en el MARM 58c5 no se han identificado previamente como sitios antigénicós para varios anticuerpos monoclonales que enlazan inmunoespecificamente a la proteina F de RSV (ver, por ejemplo, Beeler et al (1989) J. Virology 63 (7) :,2841-2950, Crowe et al. (1998)' Virology 252:373-375; Zhao et al, (2004) J.. Infectious Disease 190:194.1-1946; Liu. et al, (2007) Virology Journal -4:71). Después de 12 rondas de replicación viral en la presencia de la forma IgG de 30D8, el virus RSV no pudo . escaper a la neutralización (ver el Ejemplo 11 a continuación) . La capacidad del anticuerpo 30D8 a limitar la generación de MARMs significa que 30D8 enlaza, a un epitopo' que es menos susceptible a la generación de mutantes de escape, y como resultado, el anticuerpo 30D8 es útil como un anticuerpo terapéutico para el tratamiento de una infección por RSV.
Adicionalmente, como se muestra en el Ejemplo 11 a continuación, 30D8 neutraliza el MARM motavizumab y el MARM 58c5, 58c5 neutraliza el MARM motavizumab, y motavizumab neutraliza el MARM 58c5. De esta manera, 30D8 enlaza un epitopo diferente de la proteina F de RSV que 58c5 y motavizumab. Adicionalmente 58c5 enlaza un epitopo' diferente de la proteína F de RSV que 30D8 y motavizumab.. 3. Ensayos in vltro para analissar efectos de neutralización del virus de los anticuerpos Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden analizarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica para la detección de neutralización vírica. Los métodos para detección de neutralización vírica incluyen, pero no se limitan a, ensayos de placa y ensayos para inhibición de formación de sincitio. Tales ensayos pueden emplearse para evaluar, por ejemplo, inhibición de unión vírica, entrada vírica y extensión célula a célula del virus (ver, por ejemplo Burioni et al, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A..91:355-359; Sanna et al (2000) Virology 270:386-3961; y De Logu et al, (1998) J Clin Microbiol 36 : 3198-3204 ) . Alguien de experiencia en la técnica puede .'identificar cualquier ensayo capaz de medir la neutralización vírica.
Los ensayos de placa estándares incluyen, por ejemplo, ensayos de reducción de placa, ensayos de reducción: de tamaño de placa, ensayos de neutralización y ensayos cinéticos de neutralización. Estos ensayos miden la- formación de placas víricas (esto es áreas de células lisadas), seguido de infección de monocapas de célula objetiva por un virus. Las lineas celulares objetivo ejemplares que pueden usarse en ensayos de reducción de placa incluyen, pero no se limitan a, células Vero, células MRC-5,. células RC-37, células BHK-21/C13 y células HEp-2. Alguien de experiencia en la técnica puede identificar lineas celulares objetivo apropiadas para uso en un ensayo de placa. La selección de una linea celular apropiada para un ensayo de placa puede depender de factores conocidos, tales como, por ejemplo, infectividad celular y la capacidad del virus para propagarse en y lisar la célula objetivo. Los ejemplos 6 y 9 ejemplifican ensayos de neutralización in vitro.
Los ensayos de reducción de placa pueden usarse para medir la capacidad del' anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo para efectuar neutralización vírica en solución. En los ensayos de reducción de placa ejemplares, el anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo y el virus se pre-incuban antes de la adición de células objetivo. Las células dirigidas . luego se infectan con la mezcla de anticuerpo/virus y un ensayo de placa se realiza después de un periodo de infección predeterminado. Alguien de experiencia en la técnica puede determinar los tiempos de incubación requeridos basados en ejemplos conocidos en la técnica. Una reducción en el número de placas de virus producida después de. la infección de las células dirigidas indica la capacidad del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo para prevenir enlace del virus a las células dirigidas independientes del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo unido a la célula objetivo y/o anticuerpo, o fragmento enlazado al antigeno del mismo, internali zación .
Los ensayos de reducción de tamaño de placa pueden usarse para medir . la capacidad del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo para inhibir la extensión de célula a. célula vírica. En ensayos ejemplares de reducción de tamaño de placa, las células dirigidas primero se infectan con el virus durante un periodo de infección predeterminado y luego el anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo se agrega a la célula infectada. Alguien de experiencia en la técnica puede determinar los tiempos de incubación requeridos basados en ejemplos conocidos en la técnica. Una reducción en el tamaño (esto es diámetro) de las placas de virus indica que el anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo es capaz de prevenir la extensión célula a célula vírica.
Los ensayos de neutralización . de virus pueden usarse para medir la capacidad del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo para efectuar neutralización vírica en la superficie de la célula objetivo por asociación del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo con la célula objetivo antes de la exposición ' al virus. En ensayos de neutralización de virus ejemplares, el anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo y células dirigidas se pre-incuban durante un periodo de tiempo predeterminado para permitir el enlace del. anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo a la célula objetivo. Después del periodo de pre-incubación, el anticuerpo no enlazado se remueve y las células dirigidas se infectan con el virus. Una reducción en el número de placas en este ensayo indica la capacidad del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo para prevenir infección vírica dependiente de la unión a la célula objetivo e/o internalización del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo. Esté ensayo también puede usarse para medir la cinética de ?ßµ^3???3???? al . variar las concentraciones anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno y tiempos de pre-incubación.
Los ensayos ejemplares para inhibición de formación de sincitio pueden emplearse para medir la inhibición mediada por anticuerpo de efectos citopáticos víricos al bloquear la formación de sincitios cuando se usa una cepa vírica fusogénica. Alguien de experiencia en la técnica puede identificar una cepa vírica fusogénica apropiada para uso en el ensayo.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno dé los mismos proporcionados en la presente también pueden colocarse en ensayo por su capacidad para inhibir o sub-regular la replicación RSV usando técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica. Por ejemplo, la replicación RSV puede colocarse en ensayo por un ensayo de placa tal como se. describe, por ejemplo, por Johnson et al. (1997) Journal of Infectious Diseases 176:1215-1224. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente también pueden colocarse en ensayos por su capacidad para inhibir o sub-regular la expresión de polipéptidos RSV. Las técnicas conocidas para aquellos · de experiencia en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, análisis Western blot, análisis Northern blot, y RT-PCR pueden usarse para medir la expresión de polipéptidos RSV.
. Modelos de animal in vivo para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-RSV Los estudios in vivo usando modelos de animales pueden realizarse para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al . antígeno de los mismos proporcionados en la presente. Los estudios in vivo usando modelos de animal pueden realizarse para evaluar, cualquier toxicidad de administración de tales anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos. Una variedad de ensayos, tales como aquellos, que emplean modelos de animal in vivo, están disponibles para aquellos de experiencia en la técnica para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-RSV para inhibir o tratar infección del virus RSV y para colocar en ensayo cualquier toxicidad. Los efectos terapéuticos de lós anticuerpos anti-RSV pueden evaluarse usando modelos- de animal de la infección patogénica, incluyendo modelos de animal de infección vírica. Tales modelos de animal se conocen en la técnica, e incluyen, péro no se limitan a, modelos de animal para infección por RSV, tal como pero no limitados a rata de algodón, ratón endogámico, becerro, hurón, hámster, conejillo de indias, chimpancé, mono nocturno, mono rhesus, mono verde Africano, mono, capuchino, mono saimirí, mono macaco, babuino, (ver, por ejemplo,- Prince et al. (1978) Am. J. Pathol. 93:771-791; Prince et al. (1979) Infect. Immunol. 26:764-766; Byrd y Prince (1'997). Clinical Infectious Diseases 25:1363-1368, incluyendo referencias citadas en la presente, para modelos ejemplares de infección de RSV) . Para prueba in vivo de un anticuerpo ' o fragmento enlazado al antígeno o toxicidad de composición, cualquier sistema de modelo animal conocido en la técnica puede usarse, incluyendo, pero no limitado a, ratas, ratones, vacas, monos, y conejos. 5. Ensayos in vitrq e in vivo para Medir la Eficacia del Anticuerpo La eficacia al tratar o prevenir ¦ la infección vírica puede demostrarse al detectar la capacidad de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente para inhibir la replicación del virus, para inhibir la transmisión o prevenir el virus de establecerse por sí mismo en su hospedero, para reducir la incidencia de infección por RSV, o para prevenir, mejorar o aliviar uno o más síntomas asociados con infección por RSV. El tratamiento se . considera terapéutico si existe, por ejemplo, una reducción en carga vírica, mejora de uno o más síntomas, una reducción en la duración de una infección por RSV, o una disminución en mortalidad y/o morbilidad después de la administración de un anticuerpo o composición proporcionada en la presente. Además, el tratamiento se considera terapéutico si existe un incremento en la respuesta inmunitaria después de la administración de uno o más anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos que enlazan inmunoespecíticamente a uno o más antígenos RSV.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden probarse in vitro e in vivo por . la capacidad de inducir la expresión de citoquinas tales como IFN-a, IFN-ß, IFN-?, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 e IL-15. Las técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica pueden usarse para medir el nivel de expresión de citoquinas. Por ejemplo, el nivel de expresión de citoquinas puede medirse al analizar el nivel de ARN de citoquinas por, por ejemplo, RT-PCR y análisis Northern blot, y al analizar el nivel de citoquinas por, por ejemplo, inmunoprecipitación seguida por análisis Western blot o ELISA.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden probarse in vitro e in vivo por su capacidad para modular la actividad biológica de células inmunitarias ,. incluyendo células inmunitarias humanas (por ejemplo, células T, células B, y células Exterminadoras Naturales) . La capacidad de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno para modular la actividad biológica de células inmunitarias puede evaluarse al detectar la expresión de antigenos, detectando la proliferación de células inmunitarias, detectando la activación de moléculas de señalización, detectando la función efectora de células inmunitarias, o detectando la diferenciación de células inmunitarias . Las técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica pueden usarse para medir estas actividades. Por ejemplo, la proliferación celular puede colocarse en ensayo por ensayos de incorporación 3H-timidina y. conteos de células de azul de tripano. La expresión de antigeno puede colocarse en ensayo, por ejemplo, por inmunoensayos incluyendo, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivo y no competitivo usando técnicas tales como western blots, radioinmunoensayos de inmunohistoquimica, ELISA (ensayo inmunosorbente ligada a la enzima) , inmunoensayos de "intercalado", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de complemento-fijación, ensayos inmunoradiométricos , inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteina A y análisis FACS. La activación de moléculas de señalización puede colocarse en ensayo, por ejemplo, por ensayos de cinasa y ensayos de cambio electrcforético (EMSAs) . · Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente también pueden probarse por su capacidad para inhibir replicación vírica o reducir la carga vírica en ensayos in vitro, ex vivo e in vivo. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos también pueden colocarse en ensayo por su capacidad para disminuir el curso del tiempo de infección de RSV. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos también pueden colocarse en. ensayo por su capacidad para incrementar el periodo de sobrevivencia de humanos que padecen de infección por RSV por al menos o alrededor de 25%, al menos o. alrededor de 50%, al menos o alrededor de 60%, al menos o- alrededor de 75%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 95%, o al menos o alrededor de 99%. Además, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden colocarse en ensayo por su capacidad para reducir el periodo de hospitalización de humanos que padecen de infección por RSV por al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 95%, o al menos o alrededor de 99%. Las técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica pueden usarse para analizar la función de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente in vivo.
De acuerdo con los métodos y usos proporcionados en la presente, las pruebas clínicas con sujetos humanos no necesitan réalizarse con objeto de demostrar la eficacia profiláctica y/o terapéutica de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente. Los estudios de modelo animal e in vitro usando los anticuerpos anti-RSV o fragmentos · enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden extrapolarse a humanos y son suficientes para, demostrar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno.
H. USOS DE DIAGNÓSTICO Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden usarse en ensayos de diagnóstico para la detección, purificación, y/o neutralización de RSV. Los ensayos de diagnóstico ejemplares incluyen detección in vitro e in vivo de RSV. Por ejemplo, los ensayos usando los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente, para- medir cualitativamente y cuantitativamente los niveles de RSV en una muestra biológica asilada (por ejemplo, esputo) o se proporcionan in vivo.
Como se describe en la presente, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden conjugarse a una porción detectable para detección in vitro o in vivo. Tales anticuerpos pueden emplearse, por ejemplo, para evaluar la localización y/o persistencia del anticuerpo anti-RSV o' fragmento enlazado al antigeno del mismo en un sitio in vivo, tal como, por ejemplo, un sitio mucosal. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos que se acoplan a una porción detectable pueden detectarse in vivo por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos anti-RSV". o fragmentos enlazados al antigeno, de los mismos que se acoplan a una porción detectable también pueden detectarse en muestras biológicas aisladas, tales como muestras de tejido o fluido obtenidas del sujeto después de la administración del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo. 1. Detección in vltro de infección patogénica En general, el RSV puede detectarse en un sujeto o paciente basado en la presencia de una o más proteínas y/o polinucleótidos de RSV que codifican tales proteínas en una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, orina, esputo y/u otras células o tejidos apropiados) obtenidos de un sujeto o paciente. Tales proteínas pueden usarse como marcadores para indicar la presencia o ausencia de RSV en un sujeto o paciente. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden emplearse para detección del nivel de antigeno y/o epitopo que enlaza al agente en la muestra biológica.
Una variedad de formatos de ensayo se conocen para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica para usar un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo para detectar marcadores de polipéptido en una muestra (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) . En general, la presencia o ausencia de RSV. en un sujeto o paciente puede determinarse al poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto o paciente con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente y detectar en la muestra un nivel de polipéptido que enlaza al anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo.
En algunos ejemplos, el ensayo involucra el uso de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente inmovilizado en un soporte sólido para enlazar a y remover el polipéptido objetivo del resto de la muestra. El polipéptido de enlace luego puede detectarse usando un reactivo de detección que contiene un grupo reportero, y específicamente enlaza al complejo de anticuerpo/polipéptido . Tales reactivos de detección pueden contener, por ejemplo, un agente enlazado que específicamente enlaza al polipéptido o un. anticuerpo u otro agente que enlaza específicamente al agente de enlace.
En algunos ejemplos, un ensayo competitivo puede utilizarse, en el cual un polipéptido se etiqueta con un grupo reportero y se permite para enlazar al anticuerpo anti-RSV inmovilizado o fragmento enlazado al antígeno del mismo después de la incubación del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo con la muestra.. La extensión para la cual los componentes de la muestra inhiben el enlace del polipéptido etiquetado para el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo es indicativa de la reactividad de la muestra con el . anticuerpo anti-RSV inmovilizado o fragmento enlazado al antígeno del mismo. Los polipéptidos adecuados para uso dentro de tales ensayos incluyen proteínas F de RSV de longitud completa y porciones de las mismas, incluyendo el dominio extracelular de una proteína F de RSV, para el cual un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo se enlaza, como se describe arriba.
El soporte sólido puede ser cualquier material conocido para aquellos de experiencia · ordinaria en la técnica para el cual la proteína puede unirse. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pozo de prueba en una placa de microtitulación o una nitrocelulosa u Otra membrana adecuada. El soporte también puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o un material plástico tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor óptico de fibra, tal como aquellos descritos, por ejemplo, eri la Patente de E.U.A. No. 5, 359, 681. El anticuerpo anti-RSV . o fragmento enlazado al antígeno del mismo puede inmovilizarse en el soporte sólido usando una variedad de técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica. El anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno ' del mismo puede inmovilizarse por adsorción a un pozo en una placa de microtitulación o a una membrana. En tales casos, la adsorción puede alcanzarse al poner en contacto el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo, en una solución amortiguadora adecuada, con el soporte sólido durante una cantidad adecuada de tiempo. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero está típicamente entre alrededor de 1 hora y . alrededor de 1 día. En general, poner en contacto un pozo de' una placa de microtitulación plástica (tal como poliestireno o polivinilcloruro) con una cantidad de anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo en el intervalo desde alrededor de 10 ng hasta alrededor de 10 g, y típicamente alrededor de 100 ng hasta alrededor de 1 pg, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno de la misma.
La unión covalent.e de anticuerpo anti-RSV o ¦ fragmento enlazado al antigeno del mismo a un soporte sólido puede generalmente alcanzarse al hacer reaccionar primero él soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará con el soporte y un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, en el anticuerpo anti-RSV. o fragmento enlazado al antigeno del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo' anti-RSV o fragmento enlazado ai antigeno del mismo puede unirse covalentemente a soportes que tienen un recubrimiento de polímero apropiado usando benzoquinona o por condensación de un grupo aldehido en el soporte con una amina y un hidrógeno activo en el patrón de enlace (ver, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en A12-A13).
En algunos ejemplos, el ensayo se realiza en un formato de prueba de cinta o de circulación, en donde el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo se inmoviliza en una membrana, tal como nitrocelulosa . En la prueba de flujo en circulación, los polipéptidos dentro de la muestra enlazan al anticuerpo anti-RSV inmovilizado o fragmento enlazado al antígeno del mismo ya que la muestra pasa a través de la membrana. Un agente segundo, enlazado etiquetado luego enlaza al anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo-complej o de polipéptido como una solución que contiene el segundo agente enlazado que fluye a través de la membrana.
Los protocolos de ensayo adicionales existen en la técnica que son adecuados para uso con las proteínas RSV o anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados. Las descripciones de arriba se pretenden para ser ejemplares solamente. Por ejemplo, serán aparentes para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica que los protocolos de- arriba pueden modificarse fácilmente para usar .polipéptidos RSV para detectar anticuerpos que enlazan a tales polipéptidos en una muestra biológica. La detección de tales anticuerpos específicos de proteína puede permitirse para la identificación de¦ infección por RSV.
Para mejorar la sensibilidad, múltiples marcadores de proteína RSV pueden colocarse en ensayo dentro de una muestra dada. Será aparente que los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos específicos para diferentes polipéptidos RSV pueden combinarse dentro de un ensayo sencillo. Además, múltiples cebadores o sondas pueden usarse concurrentemente. La selección .de marcadores de proteína RSV puede basarse en experimentos de rutina para determinar las combinaciones que resultan en sensibilidad óptima. Además, o alternativamente, los ensayos para proteínas RSV proporcionados en la presente pueden combinarse con ensayos para otros antígenos RSV conocidos. 2. Detección In vivo de infección patogénica Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden emplearse como un agente de diagnóstico in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos pueden proporcionar una imagen de tejidos infectados (por ejemplo, infección por RSV en los pulmones) usando métodos de detección tales como, .por ejemplo, formación de imágenes de resonancia magnética, formación de imágenes de rayos X, tomografía de emisión computarizada y otras tecnologías de formación de imágenes. Para la formación de imágenes de tejidos infectados por RSV, por ejemplo, la porción de anticuerpo del anticuerpo anti-RSV generalmente enlazará a RSV (por ejemplo, enlaza un epítopo de proteína F de RSV), y el agente de formación de imágenes será agente detectable en la formación de imágenes, tal como un agente paramagnético, radioactivo o fluorescente que se acopla al anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al-, antígeno del mismo. Generalmente, para uso como un agente de diagnóstico, el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo se acopla directamente o indirectamente al agente de formación de imágenes.
Se conocen en la técnica muchos agentes apropiados que forman imágenes, ya que son métodos para su' unión a los anticuerpos anti-RSV- o fragmentos enlazados al antigeno (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,021,236 y 4,472,509). Los métodos de unión ejemplares involucran el · uso de un complejo quelado de metal que emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico tal como un DTPA unido al anticuerpo, o fragmento enlazado al antigeno del mismo (Patente de E.U.A. No. 4,472,509). Los anticuerpos también pueden reaccionarse con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehido o peryodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceina se preparan en presencia de tales agentes de acoplamiento o por reacción con un isotiocianato .
Para formación de imágenes de diagnóstico in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible se considera cuando se selecciona un radioisótopo dado. El radioisótopo seleccionado tiene un tipo de descomposición que es detectable para un tipo dado de instrumento. Otro factor al seleccionar un radioisótopo para diagnóstico in vivo es que la vida media del radioisótopo sea suficientemente larga de manera que todavía sea detectable al momento de la absorción máxima por el objetivo, pero suficientemente corta de. manera que la radiación perjudicial con respecto al hospedero se minimiza. Típicamente, un radioisótopo usado para ¦ formación de imágenes in vivo carecerá de una emisión de partículas, pero produce un número, grande de fotones en el intervalo de 140-250 keV, que puede detectarse fácilmente por" cámaras gamma convencionales.
Para diagnóstico in vivo, los radioisótopos pueden enlazarse a los anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente ya sea directamente o indirectamente al usar un grupo funcional intermedio. Los grupos funcionales intermedios ejemplares que pueden usarse para enlazar radioisótopos, que existen como iones metálicos, para anticuerpos incluyen agentes quelantes bifuncionales, tales como ácido dietilen-triaminpentaacético (DTPA) y ácido etilendiamintetraacético (EDTA) y moléculas similares. Los ejemplos de iones metálicos que pueden enlazarse a los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados incluyen, pero no se limitan a, 72Arsenico, 21Astatina, 1 Carbono, 51Cromp, 36Cloro, "Cobalto, 58Cobalto, 67Cobre, 152Europio, 67Galio, 68Galio, 3Hidrógeno, 123Yodo, I25Yodo, 131Yodo, inIndio, 59Hierro, 32Fósforo, 186Renio, 188Renio, 97Rutenio, 75Selenio, 35Azufre, 9 mTecnecio, 201Talio, 90ltrio y 89Zirconio.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden etiquetarse con un isótopo paramagnético, para ;· propósitos de diagnóstico in vivo, como en la formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) o resonancia de giro de electrón (ESR) . En general, puede utilizarse cualquier " método convencional para, visualizar la formación de imágenes de diagnóstico. Generalmente, los- radioisótopos que emiten gamma y positrón se usan para formación de imágenes, de cámara e isótopos paramagnéticos para MRI.. Los elementos que son particularmente útiles en tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, 15Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, y 56Fe.
Los iones paramagnéticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cromo (III) , manganeso (II) , hierro · (III) , hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III}', samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II.), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III).. Los iones útiles, por ejemplo, en la formación de imágenes de rayos X, incluyen pero no se limitan a lantano (III), oro (III), plomo (II), y bismuto (III). ¦ La concentración de anticuerpo anti-RSV detectablemente etiquetado o fragmento enlazado al antígeno del mismo que se administra es suficiente de tal manera que el enlace a RSV es detectable comparado con el fondo. Además,, es deseable que el anticuerpo anti-RSV detectablemente etiquetado o ¦ fragmento enlazado al antígeno del mismo sea rápidamente depurado del sistema circulatorio con objeto de dar la mejor relación de señal objetivo a fondo.
La dosificación de anticuerpo anti-RSV detectablemente etiquetado o fragmento enlazado al antigeno del mismo para diagnóstico in vivo variará dependiendo de tales factores como edad, sexo, y extensión de la enfermedad del individuo. La dosificación de un anticuerpo monoclonal humano puede variar, por ejemplo, desde alrededor de 0.01 mg/m2 hasta alrededor de 500 mg/m2, 0.1 mg/m2 hasta alrededor de 200 mg/m2, o alrededor de 0.1 mg/m2 hasta alrededor de 10 mg/m2. Tales dosificaciones pueden variar, por ejemplo, dependiendo de si se dan las inyecciones múltiples, tejido, y otros factores conocidos . para aquellos de experiencia en la técnica. 3. Monitoreo de la Infección Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden usarse in vitro e in vivo para monitorear el curso de la terapia de la enfermedad patogénica. De esta manera, por ejemplo, el incremento o disminución en el número de células infectadas con RSV o cambios en la concentración de las partículas del virus RSV presentes en el cuerpo o en varios fluidos corporales puede medirse, Usando tales métodos, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden emplearse para determinar si un régimen terapéutico particular que apoya a mejorar la enfermedad patogénica es efectivo.
I. USOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOS Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente y composición farmacéuticas que contienen anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de ¦ los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse a un sujeto para profilaxis y terapia. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados pueden administrarse para tratamiento de una enfermedad o afección, tal como una infección por RSV. En algunos ejemplos, los anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados pueden administrarse a un sujeto para usos profilácticos, tales como la prevención y/o extensión de infección por RSV, incluyendo, pero no limitado a la inhibición de establecimiento de infección por RSV en un hospedero o inhibición de transmisión RSV entre los sujetos. En algunos ejemplos, los anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados pueden administrarse a un sujeto para la reducción de carga vírica RSV en el sujeto. Los anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos también' pueden administrarse a un sujeto para prevenir, tratar, y/o aliviar uno o más síntomas de una infección por RSV o reducir la duración de una infección por RSV.
En algunos ejemplos, la administración de un anticuerpo anti-RSV o fragmento. enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente inhibe la incidencia de Infección por RSV por al menos o alrededor de : 99% , al menos o alrededor de 95%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 55"6 f al menos o alrededor de 50%, al menos o alrededor de 45%, al menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%, al menos o alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, ¦ al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor de 15%, o al menos o alrededor de 10% con relación a la incidencia de infección por RSV en la ausencia del anticuerpo anti-RSV. o fragmento enlazado al antígeno. En algunos ejemplos, la administración de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno proporcionado en la presente disminuye la severidad de1 uno o más síntomas de infección por RSV por al menos o alrededor de 99%, al menos o alrededor de 95%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos ó alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 55%, al menos o alrededor de 50%, al menos o alrededor de 45%, al menos o alrededor de 40%, al menos ó alrededor de 35%, al menos o alrededor de 30%,' al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor de 15%, o al menos o alrededor de 10% con relación- a la severidad de uno o más síntomas de infección por RSV en la ausencia del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno. 1. Sujetos para terapia Un sujeto o candidato para terapia con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente incluye, pero no se limita a, un sujeto, tal como un paciente humano, que se ha expuesto a un virus de RSV, un sujeto, tal como un paciente humano, quien inhibe uno o más síntomas de una infección por RSV y un sujeto, tal como un paciente humano, quien está en riesgo de una infección por RSV. Las infecciones del virus de RSV ejemplares incluyen aquellas provocadas por los virus RSV, tales como, pero no limitadas a, enfermedad de RSV aguda, infección del tracto respiratorio superior RSV (URI) y/o infección del tracto respiratorio inferior RSV (LRI) , incluyendo, por ejemplo, bronquiolitis y neumonía.
En algunos ejemplos, el sujeto para terapia con un anticuerpo anti-RSV. o fragmento enlazado al . antígeno- del mismo proporcionado en la presente es un mamífero. En algunos ejemplos, el sujeto .para terapia con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente es un primate. En ejemplos particulares,- el sujeto para terapia con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente es un humano .
Los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos pueden administrarse a un sujeto, tal como un . aciente humano, para el tratamiento de cualquier enfermedad mediada por RSV. Por ejemplo, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse a un sujeto para aliviar uno o más síntomas o.' afecciones asociadas con una infección del virus RSV, incluyendo, pero no limitada a, asma, resuello, enfermedad de las vías respiratorias reactivas (RAD, por sus siglas en inglés) , y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) . Tales enfermedades y afección son bien conocidas y diagnosticadas fácilmente por médicos o experiencia ordinaria.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse a un sujeto, tal comb un paciente humano, que tiene una infección del virus RSV para el mantenimiento o terapia de supresión de recurrir a la enfermedad mediada por el virus RSV.
Los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden administrarse a un sujeto, tal como un paciente humano, en riesgo de una infección del virus RSV, incluyendo, pero no limitado a, un bebé nacido prematuramente (prematuro) (por ejemplo, un bebé nacido humano menor de 38 semanas de edad gestacional, tal como, por ejemplo, 29 semanas, 30' semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36. semanas, o 37 semanas de edad gestacional) ; un bebé (por ejemplo, un bebé nacido humano mayor de 37 semanas de edad gestacional), un sujeto que tiene fibrosis cistica, displasia broncopulmonar , enfermedad del corazón congénita, inmunodeficiencia congénita, o inmunodeficiencia adquirida (por ejemplo, un paciente con SIDA) , leucemia, linfoma no de Hodgkin, un paciente immunodeprimido, tal como, por ejemplo, un receptor de un transplante (por ejemplo un transplante de médula ósea o un transplante de riñon) , o sujetos ancianos, incluyendo individuos en residencias para mayores o centros de rehabilitación. En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de ' los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse a un sujeto, tal como un bebé prematuro o bebé expuesto a uno o más factores de riesgo ambientales, tal como> pero no limitado a asistir a la guardería, tener hermanos en edad escolar, exposición a contaminantes de aire ambientales, anormalidades de las vías respiradoras congénitas, y/o enfermedad neuromuscular severa. En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos pueden administrarse a un sujeto, tal como un bebé o niño quien es menor de dos años, que tiene enfermedad del pulmón crónica o enfermedad cardiaca congénita, incluyendo insuficiencia cardiaca congestiva, hipertensión pulmonar, y enfermedad del corazón cianótica.
Las pruebas para varios patógenos e infección patogénica se conocen en la técnica y pueden emplearse para evaluar si un sujeto es un candidato para terapia con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente. Por ejemplo, las pruebas para infección del virus RSV, se conocen e incluyen por ejemplo, ensayos de placa de cultivo vírico, prueba de detección de antígeno, pruebas de reacción en cadena de polimerasa (PCR), y varias prueba serológicas de anticuerpo. Las. pruebas para infección vírica pueden realizarse en muestras obtenidas de las muestras de fluido ó tejido, tal como fluido espinal, sangre, u orina. Las pruebas adicionales incluyen, pero no se limitan a rayos X de tórax, que pueden mostrar signos de neumonía, otras muestras de sangre, tal como una separación por exclusión química, un conteo sanguíneo completo, o análisis de gases sanguíneos . arteriales (ABGs) , y oximetría, para medir la cantidad de oxigeno en la sangre.
Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse a un sujeto, quien está en un riesgo incrementado de infección por RSV durante tiempos particulares del año. La época, de RSV típicamente se extiende desde Octubre hasta Mayo. Los sujetos, quienes muestran susceptibilidad incrementada a infección del virus durante este tiempo, tal como bebés de los pacientes ancianos o inmunocomprometidos , pueden administrarse un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente para la profilaxis y/o tratamiento de infección por RSV justo antes de y/o durante la época de RSV. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-RSV. o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente se administra una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces durante la época de RSV. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-RSV o f agmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente se administra una vez, dos veces, tres veces, cuatro- veces o cinco veces dentro de un mes, dos meses o tres meses, antes de una época de RSV. 2. Dosificaciones El anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente se administra en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en la ausencia de efectos colaterales indeseables en el paciente tratado. La concentración' terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al' antigeno del mismo puede determinarse empíricamente al ' probar los polipéptidos en sistemas in vitro e in vivo conocidos tal como al usar los ensayos proporcionados en la presente . o conocidos en la técnica.
Una cantidad efectiva de anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo a administrarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, .y la afección del paciente. Además, el médico que atiende toma en consideración varios factores conocidos para modificar la acción de fármacos, incluyendo severidad y tipo de enfermedad, salud del paciente, peso corporal, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. En consecuencia, será necesario que el terapeuta titule la dosificación del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo y modifique la vía de administración como . se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el médico administrará el anticuerpo o' fragmento enlazado al antígeno del mismo hasta que una dosificación es alcanzada que logre el efecto deseado.. El pro'greso de esta terapia se monitorea fácilmente por ensayos convencionales. Los ensayos ejemplares para tratamiento de monitoreo de una infección vírica se conocen en la técnica e, incluyen por ejemplo, ensayos de titulación vírica.
Generalmente, los intervalos de dosificación para la administración de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos se proporcionan en la presente aquellos suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el cual los síntomas de la enfermedad mediada por patógeno (por ejemplo enfermedad vírica) se mejoran o la probabilidad de infección de virus se disminuye. En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV. o fragmentos enlazados al antígeno. de los mismos sé proporcionan en la presente, administrados en una cantidad efectiva . para inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto. La dosificación no es tan grande como para provocar efectos colaterales adversos, tal como síndromes dé hiperviscosidad, edema pulmonar o insuficiencia cardiaca congestiva. Generalmente, la dosificación variará con la edad, afección, sexo y la extensión de la enfermedad en el paciente y puede determinarse por alguien de experiencia en la técnica. La dosificación puede ajustarse por el médico individual en el caso de la aparición de cualquier efecto colateral adverso. Las dosificaciones ejemplares para la prevención o tratamiento de una infección por¦ RSV y/o alivio de uno o más síntomas de una infección por RSV incluyen, pero no se limitan a, alrededor dé o 0.01 mg/kg hasta alrededor de o 300 mg/kg, tal como por ejemplo, alrededor de o 0.01 mg/kg, alrededor de o 0.1 mg/kg, alrededor de o 0.5 mg/kg, · alrededor de o 1 mg/kg, · alrededor de o 5 mg/kg, alrededor de o 10 mg/kg, alrededor de o 15 mg/kg, alrededor de o 20 mg/kg, alrededor de o 25 mg/kg, alrededor de o 30 mg/kg, alrededor de o 35 mg/kg, alrededor de o 40 mg/kg, alrededor de o 45 mg/kg, alrededor de o 50 mg/kg, alrededor de o 100 mg/kg, alrededor de o 150 mg/kg, alrededor de o 200 mg/kg., alrededor de o 250 mg/kg, o alrededor de o 300 mg/kg.
En algunos ejemplos, se proporcionan en la presente los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos administrados a un sujeto en una dosificación efectiva para alcanzar una titulación de suero- deseada. En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos se proporcionan en la presente administrados para la prevención o tratamiento de una infección por RSV y/o alivio de¦ uno o más síntomas de una infección por RSV en una cantidad efectiva para alcanzar una titulación de suero de al menos o alrededor de 1 g/ml, al menos o alrededor de 2 µ?/ml, al menos o alrededor de 3 yg/ml, al menos o alrededor de 4 pg/ml, al menos o alrededor de 5 µg/ml, al menos o alrededor de 6 µg/ml, al menos o alrededor de 7 g/ml, al menos ó alrededor de 8 g/ml, al menos o alrededor de 9 µq/ lr al menos o alrededor de 10 pg/ml, al menos o alrededor de 15 µg/ml, al menos o alrededor de 20 µg/ml, al menos o alrededor de 25 µg/ml, ' al menos o alrededor de 30 µg/ml, al menos o alrededor de 40 µg/ml, al menos o alrededor de 50 ]iq/ml, al menos o alrededor de 60 g/ml, al menos o alrededor de 70 µg/ml, al menos o' alrededor de 80 µg/ml, al menos o. alrededor de 90 g/ml, al menos o alrededor de 100 µg/ml, en o alrededor de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 15 días, 20 días, 25 días, 30 días, 35 días o 40 días después de la administración de una. primera dosis del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo y antes de una dosis posterior .del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo.
En algunos ejemplos, se proporcionan en la presente los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos administrados por suministro pulmonar a un sujeto en una dosificación efectiva para¦ alcanzar una .titulación deseada en una muestra de intubación, esputo o lavado de los pulmones. En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos se proporcionan en la presente administrados para la prevención o tratamiento de una infección por RSV y/o alivio de uno o más síntomas de una infección por RSV en una cantidad efectiva para alcanzar una titulación de 10 ng/mg (ng anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al ' antígeno del mismo por mg de proteína de pulmón) o alrededor de 10 ng/mg, 15 ng/mg o alrededor de 15 ng/mg, 20 ng/mg o alrededor de 20 ng/mg, 25 ng/mg o alrededor de 25 ng/mg, 30 ng/mg o alrededor de 30 ng/mg, 40 ng/mg o alrededor, de 40 ng/mg, 50 ng/mg o alrededor de 50 ng/mg, 60 ng/mg o alrededor de 60 ng/mg, 70 ng/mg o alrededor de 70 ng/mg, 80 ng/mg o alrededor de 80 ng/mg, 90 ng/mg o alrededor de 90 ng/mg, 100 ng/mg o alrededor de 100 ng/mg, 110 ng/mg o alrededor de 110 ng/mg, 120 ng/mg o alrededor de 120 ng/mg, 130 ng/mg o alrededor de 130 ng/mg, 140 ng/mg o alrededor de 140 ng/mg, o. 150 ng/mg o alrededor de 150 ng/mg en una muestra de intubación o lavado de los pulmones en o alrededor de 10 días, 15 días, 20 días, 25 días, 30 días, 35 días o 40 días después, de la administración de una primera dosis del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo y antes de una dosis posterior del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo .
Para tratamiento de una infección vírica, la dosificación de los. anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos puede variar dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno. de los mismos, pueden administrarse en dosis sencilla, en administraciones separadas múltiples, o por infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la afección, el tratamiento puede : repetirse hasta que una supresión deseada de síntomas de la enfermedad ocurra o la mejora deseada en la afección del paciente se alcance. Las administraciones repetidas pueden incluir cantidades incrementadas o disminuidas del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo dependiendo del progreso del tratamiento. Otros regímenes de dosificación también se contemplan.
En . algunos ejemplos, los anticuerpos. anti-RSV o fragmentos enlazados . al antigeno de los mismos se proporcionan en la presente administrados una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, . nueve veces, diez veces o más por día o durante varios días. En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos . enlazados al antigeno de los mismos se proporcionan en la presente administrados una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más para la prevención o tratamiento de una infección por RSV y/o alivio de uno o más síntomas de una infección por RSV en una cantidad efectiva para alcanzar una concentración en suero de al menos o alrededor de 1 µg/ml, al menos o alrededor de 2 yg/ml, al menos o alrededor de 3 yg/ml, al menos o alrededor de 4 yg/ml, al menos o alrededor de 5 yg/ml, al menos o alrededor de 6 yg/ml, al menos o. alrededor de 7 yg/ml, al menos o alrededor de 8 yg/ml, al menos o alrededor de 9 yg/ml, al menos o alrededor de 10 yg/ml, al menos o alrededor de 15 yg/ml, al menos o alrededor de 20 yg/ml, al menos o alrededor de 25 yg/ml, al menos o alrededor de 30 pg/ml, al menos o alrededor de 40 yg/ml, al menos o alrededor de 50 yg/ml, al menos o alrededor de 60 yg/ml, al menos o alrededor de 70 yg/ml, al menos o alrededor de 80 yg/ml, al menos o alrededor de 90 µ?/p??, al menos o alrededor de 100 µ?/ml, en o alrededor de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 15 días, 20 días, 25 días, 30 días, 35 días o 40 días después de la administración de una primera dosis, segunda dosis, tercera dosis, cuarta dosis, quinta dosis, sexta dosis, séptima dosis, octava dosis, novena dosis, décima dosis del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo y antes de una dosis posterior del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo. En un ejemplo particular, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos se proporcionan en la presente administrados- cuatro veces para la prevención o tratamiento de una infección por RSV y/o alivio de uno o más síntomas de una infección por RSV en una cantidad efectiva para alcanzar una titulación dé suero de al menos o alrededor de 72 µg/ml en o alrededor de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 15 días, 20 días, 25 días, 30 días, 35 días o 40 días después de la administración de la cuarta dosis del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo y .antes de una dosis posterior del anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo.
En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos se administran en una secuencia de dos o más administraciones, .donde las administraciones se separan por un periodo, de tiempo seleccionado. En algunos ejemplos, el periodo de tiempo seleccionado es al menos o alrededor de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas/ .3 semanas, 1 mes, 2 meses, o 3 meses.
En algunos ejemplos, una cantidad profilácticamente efectiva de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente . se · administra una o más veces justo ' antes de la época de RSV. En algunos ejemplos, una cantidad profilácticamente efectiva de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado ' en la presente se administra una o . más veces justo antes de la época de RSV y/o una o más veces durante la época de RSV.
La eficacia terapéutica de una . dosificación particular o régimen de dosificación también puede evaluarse, por ejemplo, por medición de titulación vírica en el sujeto antes de y después de la administración de una o más dosis · del anticuerpo anti-RSV o' fragmento enlazado al antígeno del mismo. Las cantidades de dosificación y/o frecuencia de administración pueden modificarse dependiendo de la velocidad deseada de compensación del virus en el sujeto.
Como se entenderá por alguien de experiencia, en la técnica, el régimen de tratamiento óptimo variará y está dentro del alcance de los métodos de tratamiento para evaluar el estado de la enfermedad bajo tratamiento y la salud general del paciente antes de, y después de uno o más ciclos de terapia con objeto de determinar la dosificación terapéutica óptima y frecuencia de administración. Es para entenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos pueden ajustarse con el paso del tiempo de acuerdo a la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de las formulaciones farmacéuticas, y que las dosificaciones establecidas en la presente son solamente ejemplares y no se pretenden para limitar el alcance de las mismas. La cantidad de un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al . antígeno del mismo a administrarse para el tratamiento de una enfermedad o afección, por ejemplo un infección vírica (por ejemplo una infección del virus RSV) , puede determinarse por. técnicas clínicas estándares (por ejemplo titulación vírica o ensayos de detección de antígeno) . Además, los ensayos in vitro y modelos de animal pueden emplearse para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. Tales ensayos pueden proporcionar intervalos de dosificaciones . que pueden extrapolarse para administración a los sujetos, tal como humanos. Los métodos para identificar intervalos de dosificación óptimos basados en modelos de animal son bien conocidos por aquellos de . experiencia en la técnica. 3. Vias de Administración Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse a un sujeto por cualquier método conocido en la técnica para la administración de polipéptidos , incluyendo por ejemplo administración sistémica o local. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden administrarse por vías, tal como parenteral (por ejemplo, intradérmica, . intramuscular, intrapéritoneal , intravenosa, subcutánea, o intracavidad) , tópica, epidural, o mucosal (por ejemplo, ' intranasal u oral) . Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos pueden administrarse externamente a un sujeto, en el sitio de la enfermedad para esfuerzo de acción transdérmica o local. Las composiciones que contienen anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección por bolo, por absorción a través de revestimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, .mucosa oral, mucosa rectal e intestinal) . Las composiciones que contienen anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. El modo de administración puede incluir tópica u otra administración de una composición sobre, en o alrededor de las áreas del cuerpo que pueden venir en contacto con el fluido, células, o tejidos que están infectados, contaminados o asociados con las mismas de virus, tal como un virus RSV. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse por rutas tópicas o aerosol para suministro directamente a órganos objetivo, tal como el pulmón (por ejemplo, por aerosol pulmonar).. En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden administrarse como una formulación de liberación controlada tal cerno por una bomba (ver, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buch ald et al. (1980) Surgery 88:507; y Saudek et al. (1989) N. Engl. J. ed. 321:574) o por medio del uso de varios polímeros conocidos en la técnica y descritos en cualquier lugar en la presente. En algunos ejemplos, un sistema de liberación sostenida o controlada puede colocarse en proximidad del objetivo terapéutico, por ejemplo, los pulmones, de esta manera requiere solamente una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo,; Goodson, in Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol . 2, pp. 115-138(1984)).
En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos se administran por suministro pulmonar (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A.. Nos. 6, 019,968, 5, 985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, y 4,880, 078; y Publicaciones PCT Nos. O 92/19244, WO. 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903). Los métodos ejemplares de suministro pulmonar se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, métodos en aerosol, tal como inhaladores (por ejemplo, inhaladores de dosis medidas presurizados (MDI, por . sus siglas en inglés), inhaladores de polvo seco (DPI, por sus siglas en inglés), nebulizadores (por ejemplo, nebulizadores de chorró o ultrasónicos) y otros sistemas líquidos de respiración sencillos), inhalación intratraqueal e insuflación. En algunos ejemplos, el suministro pulmonar puede potenciarse por . la coadministración de, o la administración de una co-formulación que contiene los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente y un potenciador de permeación, tal como, por ejemplo, tensoactivos , ácidos grasos, sacáridos, agentes quelantes e inhibidores de enzima, tal como inhibidores de proteasa.
Los métodos apropiados para suministro, tal como suministro pulmonar, . pueden seleccionarse por alguien de experiencia en la técnica basado en las propiedades de la cantidad de dosificación del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo o la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo. Tales propiedades incluyen, pero no · se limitan a, solubilidad, higroscopicidad, propiedades de cristalización, punto de fusión, densidad, viscosidad, flujo, estabilidad y perfil de degradación.
En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente incrementan la eficacia de inmunización mucosal contra un virus. De esta manera, en ejemplos particulares los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos se administran a una superficie mucosal. Por ejemplo, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos pueden suministrarse por medio de vías tal como oral (por ejemplo, bucal, sublingual), ocular (por ejemplo, inyección en la cornea, conjuntival, intravítreamente, intra-acuosa) , intranasal, genital (por ejemplo, vaginal), rectal, pulmonar, estomacal, ó intestinal. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse sistemáticamente, tal como parenteralmente, por ejemplo, por inyección o por infusión gradual con el paso del tiempo o entéricamente (esto es, tracto digestivo). Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente también pueden administrarse tópicamente, tal como por ejemplo, por instalación o aplicación tópica (por ejemplo, instilación e insuflación intratraqueal usando un broncoscopio u otras vías respiratorias artificiales) de soluciones liquidas, geles, ungüento, polvos o por inhalación (por ejemplo, rocíos nasales, inhaladores (por ejemplo., inhaladores ¦ de dosis contados presurizados ( DI), inhaladores de polvo seco (DPI), nebulizadores (por ejemplo,- nebulizadores por chorro o ultrasónicos) y otros sistemas líquidos de respiración sencillos)). La administración puede efectuarse antes de la exposición al virus o posterior a la exposición al virus. 4. Terapias de combinación Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos o terapias para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad o afección. Por ejemplo, los anticuerpos anti-RSV proporcionados o fragmentos enlazados al añtígenó de los mismos pueden administrarse en combinación con uno o. más agentes antiviricos para la profilaxis y/o tratamiento de una infección vírica, tal como una infección vírica respiratoria. En algunos ejemplos, la infección vírica respiratoria es una infección por RSV. Los agentes antivíricos pueden incluir agentes para disminuir y/o eliminar la infección patogénica o agentes para aliviar uno' o más síntomas de una infección patogénica. En algunos ejemplos, una pluralidad de anticuerpos o fragmentos enlazados al antígeno .de los mismos (por ejemplo, uno o más anticuerpos antivíricos) también pueden administrarse en combinación, donde al menos uno de los anticuerpos es un anticuerpo anti-RSV o . fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente. En algunos ejemplos, una pluralidad de anticuerpos puede administrarse en combinación para la profilaxis y/o tratamiento de una infección por RSV o infecciones víricas múltiples, donde al menos uno de los anticuerpos es un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente. En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV proporcionados pueden administrarse en combinación con uno ? más anticuerpos antiviricos, ¦ que enlazan a y neutralizan un virus, tal como RSV. En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados pueden administrarse en combinación con uno o más anticuerpos, que pueden inhibir o aliviar uno o más síntomas de una infección vírica, tal como una infección por RSV. En algunos ejemplos, se proporcionan en la presente dos o más de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos administrados en combinación.
El uno o más agentes adicionales pueden administrarse simultáneamente, secuencialmente o intermitentemente con el anticuerpo anti-RSV o. fragmento enlazado al antígeno del mismo. Los agentes pueden co-administrars.e con el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo, por ejemplo, como parte de la misma composición farmacéutica o mismo método de suministro. En algunos ejemplos, los agentes pueden coadministrarse con el anticuerpo' anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo al mismo tiempo como el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo, pero por un medio diferente de suministro. Los agentes también pueden administrarse en un tiempo diferente que la administración del anticuerpo anti-RSV o. fragmento enlazado al antígeno del mismo, pero suficientemente cerca en tiempo a la administración del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo para tener un efecto terapéutico o profiláctico combinado. En algunos¦ ejemplos, uno o más agentes adicionales se administran posteriores a o antes de la administración del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo separado por un periodo de tiempo seleccionado. En algunos ejemplos, el periodo de tiempo es 1.día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas,. 1 mes, 2 meses, o 3 meses. En algunos ejemplos, uno o más agentes adicionales se administran múltiples veces y/o el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente se administra múltiple veces.
En algunos ejemplos, la administración de la combinación inhibe la incidencia de infección por RSV por al menos o alrededor de 99%, al menos o alrededor de 95%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%,. al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 55%, al menos o alrededor de 50%, al menos o alrededor de 45%, al menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%, al menos o alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor de 15%, o al menos o alrededor de 10% con relación a la incidencia de infección por RSV en la ausencia de la combinación. En algunos ejemplos, la administración de la combinación disminuye la severidad de uno ó más' síntomas de infección por RSV por al menos o alrededor de 99%, al menos o alrededor de 95%, ál menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al. menos o alrededor de 55%, al menos o alrededor de 50%, al menos o . alrededor de 45%, al menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%, al menos o alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al. menos o alrededor de 15%, o al menos o alrededor de 10% con relación a la severidad de uno o más síntomas de infección por RSV en la ausencia de la combinación .
En algunos ejemplos, la combinación inhibe el enlace de RSV a su receptor de célula hospedera por al. menos o alrededor de 99%, al menos o. alrededor de 95%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 55%, al menos o alrededor de 50%, al menos o alrededor de 45%, al menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%, . al menos o alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor de 15%, o ál menos , o alrededor de 10% con relación al enlace de RSV . a . su receptor de célula hospedera en la ausencia de la combinación. En algunos ejemplos, la combinación inhibe la replicación de RSV por al menos o alrededor de 99%, al menos o alrededor de 95%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 55%, al menos o alrededor de 50%, al menos o alrededor de 45%, al menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%, al menos o alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor de .15%, o al menos o alrededor de 10% con relación a la replicación de RSV en la ausencia de la combinación.
Cualquier terapia la cual se conoce para ser útil, o que está o ha sido usada para la prevención, manejo, tratamiento, o alivio de una infección por RSV o uno o más síntomas de los mismos pueden usarse en combinación con anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente (ver, por ejemplo, Gilman et al., Goodman y Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics,' 10a ed. , McGraw-Hill, New York, 2001; The Merck Manual of Diagnosis y Therapy, Berkow, M. D. et al. (eds.), 17a Ed., Merck Sharp & Dohme Research. Laboratories, Rahway, NJ. , 1999; Cecil Textbook of Medicine, .20a Ed. , Bennett y Plum (eds.), W.B.
Saunders, Philadelphia, 1996, para información con respecto a terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) que han sido o se usan para prevenir, tratar, manejar, o aliviar una infección por RSV o uno o más síntomas de los mismos) . Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunomoduladores , agentes . antiinflamatorios (por ejemplo,. adrenocorticoides , corticosteroides (por ejemplo, beclometasona, budeson da, flunisolida, fluticasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, hidrocortisona ) , glucocorticoides, esferoides, fármacos anti-inflamatorios no esferoidales (por ejemplo aspirina, ibuprofeno, diclofenaco, e inhibidores COX-2)), aliviadores de dolor, antagonistas de leucotrieno (por ejemplo, montelukast , xantinas de metilo, zafirlukast , y zileuton) , broncodilatadores , tal- como p2-agonistas (por ejemplo, bambuterol, bitolterol, clenbuterol, fenoterol, formoterol, indacaterol, isoetarina, metaproterenol, pirbuterol, procaterol, . reproterol, rimiterol, salbutamol (Albuterol, Ventolín), levosalbutamol , salmeterol, tulobuterol y terbutalina) y agentes anticoliñérgicos (por ejemplo, bromuro de ipratropio y bromuro de oxitropio) , sulfasalazina, penicilamina, dapsona, antihistaminas , agentes antipalúdicos (por ejemplo, hidroxicloroquina) , y agentes antivíricos. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en' la presente también pueden administrarse en combinación con una o más terapias para el tratamiento de una infección por RSV, incluyendo pero no limitado a, la administración de infusión intravenosa de inmunoglobulina, la administración de oxigeno complementario y fluidos o respiradores asistidos. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente también pueden administrarse en combinación con uno o más agentes que regulan la maduración del pulmón y expresión de proteina de tensoactivo, tal como, pero no limitado a, glucocorticoides , ligandos PPARy, y factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF) .
Los agentes antiviricos ejemplares que pueden seleccionarse para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen, pero no se limitan a, compuestos antiviricos, proteínas antivíricas, . péptidos antivíricos, conjugados de proteína antivíricos y conjugados de péptido antivíricos, incluyendo, pero no- limitados a, análogos de nucleósido, análogos de nucleótido, inmunomoduladores (por ejemplo interferónes ) e inmunoestimulantes . La terapia de combinación usando anticuerpos y/o anticuerpos anti-RSV y fragmentos enlazados al antigeno proporcionados adjuntos se contemplan como es la combinación con los anticuerpos y/o anticuerpos anti-RSV y fragmentos enlazados al antigeno proporcionado en la presente con otros anticuerpos anti-RSV y anticuerpos, anti-RSV y fragmento enlazado al antigenos.
Los agentes antivíricos ejemplares para el tratamiento de infecciones víricas que pueden administrarse en combinación con los anticuerpos. anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, áciclovir, famciclovir, ganciclovir, penciclovir, valaciclovir, valganciclovir, idoxuridina, trifluridina, brivudina, cidofovir, docosanol, fomivirsen, foscarnet, tromantadina, imiquimod, podofilotoxina, entecavir, lamivudina, telbivudina, clevudina, adefovir, tenofovir, boceprevir, telaprevir, pleconaril, arbidol, amantadina, rimantadina, oseltamivir, zanamivir, peramivir, inosina, interferón (por ejemplo, Interferón alfa-2b, . Peginterferón alfa-2a) , ribavirina/taribavirina, abacavir, emtricitabina , lamivudina, didanosina, zidovudina, apricitabina , estampidina, elvucitabina, racivir, amdoxovir, estavudina, zalcitabina, tenofovir, efavirenz, nevirapina, etravirina, rilpivirina, lovirida, delavirdina, atazanavir, fosamprenavir , lopinavir, darunavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir, tipranavir, amprenavir, indinavir, enfuvirtida, maraviroc, vicriviroc, PRO 140, ibalizumab, raltegravir, elvitegravir, . bevirimat, vivecon, incluyendo formas tautoméricas , análogos, isómeros, polimorfos, solvatos, derivados, o sales de los mismos.
Los agentes antiviricos ejemplares para la profilaxis y/o tratamiento de infecciones por RSV que pueden administrarse en combinación' con los anticuerpos anti-RSV . o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, ribavirina, NIH-351 (Gemini Technologies) , vacuna de RSV recombinante (Aviron), RSVf-2 (Intracel), F-50042 (Pierre Fabre), T-786 (Trimeris) , VP-36676 (ViroPharma) , RFI-641 (American Home Products), VP-14637 (ViroPharma), PFP-1 y PFP-2 (American Home Products), vacuna de RSV (Avant Immunotherapeutics ) , F-50077 (Pierre Fabre), y otros anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos.
Los anticuerpos anti-RSV o . fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente también pueden administrarse en combinación con uno o más agentes capaces de estimular la inmunidad celular, tal como inmunidad mucosal celular. Cualquier agente capaz de inmunidad celular estimuladora puede usarse. Los agentes inmunoestimuladores ejemplares incluyen, citoquinas, tales como, pero no limitados a, interferones (por ejemplo, IFN-a, ß, ?, ?) , linfocinas y factores de crecimiento hematopoyético, tal como, por ejemplo, GM-CSF (factor que estimula la colonia del macrófago de granulocito) , Interleucina-2 .' (IL-2), Interleucina-3 (IL-3), Interleucina-4 (IL-4), Interleucina-7 (IL-7), Interleucina-10 (IL-10), Interleucina-12 (IL-12) , Interleucina-14 (IL-14), y Factor de Necrosis de Tumor (TNF) .¦ Para terapias de combinación con agentes antipatogénicos, las dosificaciones para la administración de tales compuestos se conocen en la técnica o pueden determinarse por alguien experimentado en la .técnica de acuerdo con factores clínicos conocidos (por ejemplo, especie del sujeto, tamaño,, área de superficie corporal, edad, sexo, inmunocompetencia, y saludo general, duración y vía de administración, el tipo y etapa de la enfermedad, y si otros tratamientos, ta como otros agentes anti-patogénicos , se administran concurrentemente) . a. Anticuerpos antiviricos para Terapia de combinación Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos énlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden administrarse en combinación con uno o más anticuerpos adicionales o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales son anticuerpos antivíricos. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales enlazan a un antigeno vírico. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales enlazan a un antígeno vírico que es una proteína de superficie, tal como una proteína capsida vírica o una proteína envuelta vírica. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales enlazan a un antigeno vírico que se expresa en la superficie de una célula infectada. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales enlazan a un antígeno vírico que se expresa intracelularmente (esto es, dentro, de una célula infectada). En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales enlaza a un virus que provoca enfermedad respiratoria, tal como, pero no limitada a, ¦ RSV, . virus parainfluenza (PIV, por sus siglas en inglés) o metaneumovirus humano (hMPV, por sus siglas en inglés) . Las composiciones que contienen las mezclas de anticuerpos también se proporcionan en la presente.
Los anticuerpos para uso en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente incluyen, pero no. se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos sintéticos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos ¦ quiméricos, intracuerpos , Fvs de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs ligados de disulfuro (sdFv), y anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id hasta anticuerpos proporcionados en la presente) , y fragmentos enlazados al epitopo de cualquiera de los de arriba. Los anticuerpos para uso en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina .
Los anticuerpos para uso en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo pájaros y mamíferos (por ejemplo, humano, murino, burro, oveja, conejo, cabra, conejillo de indias, camello, caballo, o gallina) . Típicamente, los anticuerpos para uso en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo se proporcionan en la presente anticuerpos humanos o humanizados. Los anticuerpos para uso en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente puede ser monoespecífico, biespecífico, triespecífico o de mayor multiespecificidad.
Los anticuerpos para uso en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente pueden incluir anticuerpos derivados que se modifican, por ejemplo, por la unión de cualquier tipo de molécula para el anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo tal como por unión covalente. El anticuerpo ejemplar o derivados de fragmento enlazado al antigeno del mismo incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, a.cetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolitica, ligadura a un ligando celular u otra proteina, o contener dominio Fe heterólogo con afinidades superiores para el receptor FcRN (ver, por ejemplo Patente de E.U.A. No. 7,083,784). Cualquiera de numerosas modificaciones químicas pueden llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas, escisión químico específico, acetilación, formilación, o síntesis en presencia de tunicamicina . Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
El uno o más anticuerpos adicionales para uso en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en el presente puede administrarse simultáneamente, secuencialmente o intermitentemente con el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo. Uno o más anticuerpos adicionales pueden co-administrarse con el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo, por ejemplo, como parte de la misma composición farmacéutica o mismo método de suministro: En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales pueden co-administrarse. con el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo al mismo tiempo como el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo, pero por un medio diferente de suministro. Uno o más anticuerpos adicionales también pueden administrarse en un tiempo diferente que la administración del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente, pero suficientemente cerca en tiempo a la administración . del anticuerpo anti-RSV o' fragmento enlazado al antigeno '· del mismo para tener un efecto terapéutico o ·. profiláctico combinado. En algunos ejemplos, uno o más . anticuerpos adicionales se administran subsecuentes a o antes de la administración del anticuerpo anti-RSV. o fragmento enlazado al antigeno del mismo separado por un periodo de tiempo seleccionado. En algunos ejemplos, el periodo de tiempo es .1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, o 3 meses. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales se administran múltiples veces y/o el anticuerpo anti-RSV. o ' fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente se administra múltiples veces. i. Anticuerpos anti-RSV En algunos ejemplos,, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos son anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos. En algunos ejemplos, un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno ' del mismo proporcionado en la presente se administra en combinación con uno o más anticuerpos adicionales anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos para la profilaxis y/o tratamiento de una infección por RSV. Los anticuerpos anti-RSV ejemplares o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluye anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos que enlazan inmunoespecificamente a y neutralizan RSV. ' En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que enlaza inmunoespecificamente a subtipo A de RSV y/o subtipo. B de RSV.
En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno proporcionado en la presente incluye un anticuerpo anti-RSV que enlaza a una proteina de unión de RSV (por ejemplo que tiene una. ' secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 276), una proteina estructural grande de subunidad beta de polimerasa de ARN de RSV) (proteina L) (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 276) , una proteina de nucleocapsida de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 277), una nucleoproteina (N) de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 278), una fosfoproteina P de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 279), una proteina de matriz de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 281), una proteina hidrofóbica pequeña (SH) de RSV (por ejemplo que ; tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:. 281), una polimerasa dependiente · de ARN de RSV, una proteina F de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de. aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 282), una proteina G de RSV (por ejemplo que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 283), o una variante alélica de cualquiera de los de arriba. En ejemplos particulares, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos incluyen un anticuerpo. anti-RSV que enlaza a una proteína F de RSV. En ejemplos particulares, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos que enlazan a un proteína F de RSV enlazan a los sitios antigénicos A, B, C, I, II, IV, V, o VI de una glicoproteína F de RSV (ver, por ejemplo, López et al. (1998) J. Virol. 72:6922-6928).
En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígenó del mismo proporcionado en la presente incluye, pero no se limita a, palivizumab (SYNAGIS®), motavizumab (NUMAX®) , AFFF, P12f2, P12f4, Plld4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF ( 1 ) , 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13all, Alh'5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, (ver Patentes de E.U.A. Nos. 5,824,307 y 6,818,216), rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9, rsv21, rsv22, rsv23 (ver Patente dé E.U.A. No. 6,685,942), RF-1, RF-2 (ver Patente-de E.U.A. No. 5,811,524), o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos para terapia de combinación incluye un anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo que contiene una cadena VH y/o cadena VL que tiene la secuencia de aminoácidos de una cadena VH y/o cadena VL de palivizumab (SYNAGIS®), ¦ motavizumab (NUMAX®) , AFFF, P12f2, P12f4, Plld4, Ale9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, YIOH'6, DG, AFFF(l), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13all, Alh5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, o RF-2. En algunos ejemplos, .-uno- o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene uno o más CDRs de palivizumab (Synagis®), motavizumab (Numax®) , AFFF, P12f2, P12f4, Plld4, Ale9, A12a6, A13c4, A1.7d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF ( 1 ) , 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13all, Alh5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9, rsv21, rsv22, rsv23,- RF-1, o RF-2. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación incluyen un anticuerpo o . fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una o más CDRs de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-RSV tal como, pero no limitado a, Abs 1153, 1142, 1200, 1214, 1237, 1129, 1121, 1107, 1112, 1269, 1269, 1243 (Beeler et al. (1989) J Virology 63 (7) :2841-2950) , MAbl.51 ( ufson et al. (1987) J. Clin. icrobiol. 25:1635-1539), MAbs 43-1 y 13-1 (Fernie et al. (1982) Proc. Soc . Exp. Biol. Med. 171 : 266-271) , . MAbs 1436C, 1302A, 1308F, y 1331H (Anderson et al. (1984) ¦ J. CHn . Microbiol. 19:934-936). Los anticuerpos ejemplares adicionales o fragmentos enlazados al antigeno, de los mismos que pueden usarse para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno proporcionado en la presente incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos descritos en, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,413,771, 5,840,298, 5,811,524, 6,656,467, 6,537,809, 7,364,742, 7,070,786, 5,955,364, 7,488,477, 6,818,216, 5,824,307, 7,364,737, 6,685,942, y 5,762,905 y Pub. de Patente de E.U.A. Nos. 2007-0082002, 2005-0175986, 2004-0234528, 2006-0198840, 2009-0110684, 2006-0159695, 2006-0013824, 2005-0288491, 2005-0019758, 2008-0226630, 2009-0137003, y 2009-0092609. . · En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigenp del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una cadena VH que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 103,.. 113, 122, 131, .137, 144, 149, 155, 161, 167, 172, 176, 179, 182, 186, 190, 194, 198, 201, 205, 210, 215, 222, 226, 233, 239, 246, 252, 257, 362 y 366. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del ¦ mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 104, 114, 123, 132, .138, 145, 150, 156, 162, 168, 173, 187, 206, 227, 232, 234,. 240, .247, 253 y 258. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento - enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo que contiene una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 105, 115, 124, 363, y 367. En ejemplos particulares, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos para terapia, de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno .del mismo proporcionado en la 'presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo que.. contiene' una CDR1 VH que tiene la secuencia de aminoácidos TSGMSVG (SEQ ID NO: 105), TAGMSVG (SEQ ID NO:115), AYAMS (SEQ ID NO: 363), o GYT H (SEQ ID NO: 367) . En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o. fragmento enlazado al antígeno del mismo . proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS.: 106, 125, 133, 157, 236, 259, 364 y 368. En un ejemplo particular, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácidos DIWWDDKKDYNPSL S (SEQ ID NO: 106) o DI DDKKHYNPSLKD (SEQ ID NO: 125), GISGSGDSTDYADSVKG (SEQ ID NO: 364)', o SITGGSNFINYSDSVKG (SEQ ID NO:.368). En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 107, 116, 126, 139, 188, 241, 365 y 369. En un ejemplo particular, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un . anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácidos SMITNWYFDV (SEQ ID NO: 107), DMIFNFYFDV (SEQ ID NO: 126), HLPDYWNLDYTRFFYYMDV (SEQ ID NO: 365), o APIAPPYFDH (SEQ ID NO: 369) .
En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la · presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una cadena VL que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 108, 117, 127, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 169, 174, 177, 180, 183, 189, 191, 195, 199, 202, 207, 211, 216, 220, 223, 228, 236, 242, 248, 254, 260, 263, 370, 374 y 378. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 109, 118, 128, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 170, 175, 178, 181, 184, 192, 196, 200, 203, 208, 212, 217, 221, 229, 237, 243, 249, 255, 261 y 264. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno- del . mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 110, 119, 129, 142, 154, 166, 244, 250, 265, 371, 375 y 379. En un ejemplo particular, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos . para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una CDR1 VL que' tiene la secuencia de aminoácidos KCQLSVGYMH (SEQ ID NO: 110),. SASSRVGYMH (SEQ ID. NO: 154), RATQSISSNYLA (SEQ ID NO: 371), KASQNINDNLA (SEQ ID NO: 375), o RATQSVSNFLN (SEQ ID NO: 379) . En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo que contiene una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 111, 120, 136, 143, 160, 171, 185, 218, 225, 230, 238, 245, 251, 256, 262, 266, 372, 376 y 380. En un ejemplo particular, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia ¦ de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del. mismo que contiene una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácidos DTSKLAS (SEQ ID NO:lll), DTLLLDS (SEQ ID NO:218), GASNRAT (SEQ ID NO: 372), GASSRAT (SEQ ID NO: 376), o DASTSQS (SEQ ID NO: 380) . En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo que contiene una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 112, 121, 193, 373, 377 y 381. En un ejemplo particular, uno o más anticuerpos adicionales antivíricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado .al antígeno del mismo que contiene una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácidos FQGSGYPFT (SEQ ID NO: 112), QQYDISPYT (SEQ ID NO-: 373), QQYGGSPYT (SEQ ID NO: 377), o QASINTPL (SEQ ID N0.381)..
En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la' presente pueden administrarse en combinación cori suero hiperinmunitario o globulina inmunitaria enriquecida para anticuerpos anti-RSV, tales como, por ejemplo, ¦ globulina hiperinmunitaria de RSV (RSV IVTG; · RespiGam®; Medlmmune Inc, Gaithersburg, MD; ver, por ejemplo, Groothius et al.. (1993) New Eng. J. Med 329: 1524- 1530). ii. Anticuerpos contra otros virus respiratorios En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales antiviricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al . antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo', a un virus respiratorio diferente de RSV, por' ejemplo, seleccionado de entre un anticuerpo de' metaneumovirus anti-humano (h PV) , un anticuerpo anti-virus de ' parainfluenza (PIV), un anticuerpo de pneumovirus anti-aviar (APV) u otro anticuerpo antivírico conocido en la técnica.
En algunos, ejemplos, donde uno. o más anticuerpos adicionales antivíricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento · enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la .presente es un anticuerpo anti-PFV, un anticuerpo que enlaza inmunoespecíficamente a un antígeno PIV, tal como, por ejemplo, ' una fosfoproteína de nucleocapsida de PIV, una proteína de fusión (F) de PIV, una fosfoproteína PIV, una 'proteína grande (L) ' de PIV, una proteína de matriz (M) de. PIV, una glicoproteína de hemaglutinina-neuraminidasa (HN) de PIV, . una polimerasa de ARN dependiente de ARN de PIV, una proteina Yl de PIV, una proteina D de PIV, una proteina C de PIV, o una variante alélica de cualquiera de los de arriba. En ejemplos particulares, el antigeno PIV es una proteina F de PIV. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-PIV es un anticuerpo que enlaza inmunoespecificamente a un antigeno de PIV humano tipo 1, PIV humano de tipo 2, PIV humano de tipo 3, y/o PIV humano de tipo 4.
En algunos ejemplos, donde uno o más . anticuerpos adicionales antivíricos para terapia de combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente es un anticuerpo anti-hMPV, un anticuerpo que enlaza inmunoespecificamente a un antígeno hMPV, tal como, por ejemplo, una nucleoproteína hMPV, una fosfoproteína hMPV, una proteína de matriz hMPV, una proteína hidrofóbica pequeña hMPV, una polimerasa de ARN dependiente de ARN de' hMPV, una proteína F de hMPV, una proteína G de hMPV, o una variante alélica de cualquiera de los de arriba. En ejemplos particulares, el antígeno hMPV es proteína F de PIV. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-hMPV es un anticuerpo que enlaza inmunoespecificamente a un antígeno de hMPV tipo A y/o hMPV tipo B. En algunos' ejemplos, el anticuerpo anti-hMPV es un¦ anticuerpo que enlaza inmunoespecíficamente a un antigeno, de hMPV sub-tipo Al y/o A2 y/o hMPV sub-tipo Bl y/o B2.
Los anticuerpos administrados en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente puede ser cualquier tipo de anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno conocido en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo administrado en combinación con un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente puede incluir, pero no se limita a, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano, un anticuerpo producido recombinantemente, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecifico) , un intracuerpo, y un. fragmento de anticuerpo, tal como, pero no limitado a, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab' )2, un fragmento Fv, un Fv ligado al disulfuro (dsFv) , un fragmento Fd, un; fragmento Fd', una Fv de cadena sencilla (scFv), un Fab de cadena sencilla (scFab), un diacuerpo, un anticuerpo anti-idiotipico (anti-Id) , o fragmentos enlazados al antigeno de cualquiera de los de arriba. Los anticuerpos administrados en combinación con un anticuerpo anti-RSV proporcionado en la presente pueden incluir miembros de' cualquier tipo de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) , cualquier clase (por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2) o subclase (por ejemplo, IgG2a y IgG2b) .
En algunos ejemplos, la administración de la combinación de anticuerpos antiviricos o fragmentos enlazados al antigeno inhibe la incidencia de infección por RSV por al menos o alrededor de 99%, al menos o alrededor de 95%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos 0 alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 55%, al menos o alrededor de 50%, al menos o alrededor de 45%., al menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%/ al menos o alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor de 15%, o al menos o alrededor de 10% con relación a la incidencia de . infección por RSV en la ausencia del anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno. En algunos ejemplos, la administración de la combinación de anticuerpos antiviricos o fragmentos enlazados al antigeno disminuye la severidad de uno o más síntomas de infección 'por RSV por al menos o alrededor de 99%, al menos o alrededor de 95%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de- 55%, al menos c alrededor de 50%, al menos o alrededor de 45%, al¦ menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%, al menos o. alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor de. 15%, o al menos o alrededor de 10% con relación a la severidad de uno o más síntomas de infección por RSV en la ausencia de la combinación de anticuerpos antivíricos o fragmento enlazado al antí.geno.
En algunos ejemplos, la combinación de anticuerpos antivíricos o fragmentos enlazados al antígeno inhibe el enlace de RSV a su receptor de célula hospedera por al menos o alrededor de 99%, al menos o alrededor de 95%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 55%, al menos o alrededor de 50%, al menos o alrededor de 45%, al menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%, al menos o alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor. de 15%,- o ai menos o alrededor de 10% con relación al enlace de RSV a su receptor de célula hospedera en la ausencia de la combinación de anticuerpos antivíricos o fragmento enlazado al. ant-ígenos . En algunos ejemplos, la combinación de anticuerpos antivíricos o fragmentos enlazados al antígeno inhibe la replicación de RSV por al menos o alrededor de 99%, al menos o alrededor de .95%, al menos o alrededor dé 90%, al menos o alrededor de- 85%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 75%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 65%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 55%, al menos o alrededor de 50%, al menos o . alrededor de 45%, al menos o alrededor de 40%, al menos o alrededor de 35%, al menos o alrededor de 30%, al menos o alrededor de 25%, al menos o alrededor de 20%, al menos o alrededor de .15%, o al menos o alrededor de 10% con relación a la replicación de RSV en la ausencia de la combinación de anticuerpos antivíricos o fragmento enlazado al ántígenos. 5. Terapia génica En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que ' codifican los anticuerpos anti-RSV, fragmentos enlazados al antígeno y/o derivados de los mismos, se administran para tratar, prevenir o aliviar uno o más síntomas asociados con infección por RSV, a manera de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En este ejemplo, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o fragmento enlazado al antigeno del mismo que media un efecto profiláctico o terapéutico.
Cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles en la técnica puede emplearse para la administración de ácido nucleico que codifica los anticuerpos anti-RSV, fragmentos enlazados al antigeno y/o derivados de los mismos. Los métodos ejemplares se describen a continuación.
Para revisiones generales .de los métodos de terapia génica, ver, por ejemplo, Goldspiel et al. (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; Morgan y Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. .62:191-217; y TIBTECH 11 ( 5) : 155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); ' y Kr.iegler, Gene Transfer y Expresión, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (.1990) .
En algunos ejemplos, una composición proporcionada en la presente contiene ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-RSV, un fragmento enlazado al ant.ígeno y/o derivado del mismo, donde los ácidos nucleicos son parte de un vector de expresión que expresa el anticuerpo anti-RSV, fragmento enlazado al antigeno y/o derivado del mismo en un hospedero adecuado.- En particular, tales ácidos nucleicos tienen promotores, tal como promotores heterólogos, operablemente ligados a la región que codifica el . anticuerpo, el promotor que es ' inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico de tejido. En otra modalidad particular, las moléculas de ácido, nucleico se usan en las cuales las secuencias que codifican el anticuerpo y cualquiera de otras secuencias deseadas se flanquean por regiones que promueven recombinación homologa . en: un sitió deseado en el genoma, de esta manera proporcionado para expresión intracromosomal de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Koller y Smithies (198.9) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 56:8932-8935; Zijlstra et al. (1989) Nature 342:435-438). En algunos ejemplos, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo de cadena sencilla. En algunos ejemplos, las secuencias de ácido nucleico, incluyen secuencias que codifican las cadenas ligeras y pesadas, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo. En un ejemplo particular, las secuencias de ácido nucleico ' incluyen secuencias que codifican un fragmento Fab anti-RSV. En un ejemplo particular, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que- codifican un anticuerpo anti-RSV de longitud completa. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-RSV codificado es un anticuerpo quimérico.
El suministro de los ácidos nucleicos en un sujeto puede ser ya sea directo, en cuyo caso el sujeto se expone directamente al ácido nucleico o vectores que portan el ácido nucleico, o indirecto, en cuyo caso, las células se transforman primero con los ácidos nucleicos in vibro, luego se transplantan en el sujeto. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.
En algunos ejemplos, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente ' in vivo, donde se expresan para producir el producto codificado. Esto puede realizarse por cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, al construirlos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarlos de manera que se vuelven intracelulares , por ejemplo, por infección usando vectores retroviricos defectuosos o atenuados u otros vectores víricos (ver Patente de E.U.A. No. 4,980,286), o por inyección directa de ADN desnudo, o por uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o recubrimiento con lípidos o receptores ' de superficie celular o agentes transfectados , encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas,, o al administrarlos en ligadura a un péptido que se conoce para ingresar al núcleo, al administrarlos en ligadura a; un sujeto de ligando para endocitosis mediada por el receptor (ver, por ejemplo, u y W.u (198.7) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). que pueden usarse, por ejemplo, para dirigir tipos celulares que expresan específicamente los receptores. En algunos ejemplos, los complejos de ácido nucleico-ligando pueden formarse en los cuales el ligando, contiene un péptido vírico fusogénico para interruptir las endosomas, permitiendo al ácido nucleico evitar la degradación lisosomal. En algunos ejemplos, el ácido nucleico puede dirigirse in vivo para absorción y expresión específica de la célula, al dirigir un receptor específico (ver, por ejemplo, Publicaciones PCT WO ' 92/06180; WO 92/22635; WO92/203 16; W093/14188, y WO 93/20221). Alternativamente, el ácido nucleico puede . introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedera para expresión, por recombinación homologa (Koller y Smithies (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) Nature 342:435-438).
En. algunos ejemplos', se usan vectores víricos que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo anti-RSV, fragmentos enlazados al . antígeno y/o derivados de los mismos. Por ejemplo, un vector retrovírico puede usarse (ver, por ejemplo, Miller et al.' (1993) Meth. Enzymol. 217:581-599). Los vectores retrovíricos contienen los componentes necesarios para el empacado' correcto del genoma vírico e integración dentro del ADN de la célula hospedera. Las secuencias, de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmento enlazado al antígeno del mismo para usarse en terapia génica se clonan en uno o más vectores, que facilitan el suministro del gen en un sujeto. Pueden encontrarse más detalles alrededor de vectores retrovíricos , por ejemplo, en Boesen et al. (1994) Biotherapy 6:291-302. Otras referencia que ilustra el uso de vectores retroviricos en terapia génica incluye, por ejemplo, Clowes et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et. al. (1994) Blood 83:1467-1473; Salmons y Gunzberg (1993) Human. Gene Therapy 4:129-141; y Grossman y Wilson (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.
Los adenovirus también son vectores víricos .que pueden usarse en la terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministro de . genes para epitelio respiratorio. El adenovirus infecta naturalmente el epitelio respiratorio donde provoca una enfermedad moderada. Otros objetivos para sistemas de suministro basados en adenovirus incluyen el hígado, sistema, nervioso central, células endoteliales , y músculo. El adenovirus tiene la ventaja de ser capaz de infectar células no divididas. Kozarsky y Wilson (1993) Current Opinión in Genetics . y Development 3:499-503 presentan una revisión de terapia génica basada en adenovirus. Bout ' et al. (1994) Human Gene Therapy 5:3-10 demuestra el usó de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos rhesus. Otros casos del uso de adenovirus en terapia génica pueden encontrarse, por ejemplos, en Rosenfeld et .al (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155; Mastrangeli et al. (1993) J. Clin. Invest . 91:225-234; Publicación PCT W094/12649; y Wang et al. (1995) Gene Therapy 2:775-783. En un ejemplo particular, los vectores de adenovirus se usan para suministrar ácido nucleico que codifica los anticuerpos anti-RSV, fragmentos enlazados al antigeno y/o derivados de los mismos proporcionados en la presente.
El virus adeno-asociado (AAV, por sus siglas en inglés) también puede usarse en terapia génica (Walsh et al. (1993) Proc. Soc. Exp. Biol . Med. 204:289-300; y Patente de E.U.A. No. 5,436,146). En un. ejemplo particular, los vectores de virus adeno-asociado (AAV) se usan para suministrar ácido nucleico que codifica los anticuerpos anti-RSV, fragmentos enlazados al antigeno y/o derivados de los mismos proporcionados en la presente.
Otro enfoque para terapia génica involucra transferir un gen a las células en cultivo de tejido por tales métodos como electroporación, lipofección, transíección mediada por fosfato de calcio, o infección vírica. Generalmente, el método de transferir incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células luego se colocan bajo selección para aislar aquellas células que se han tomado y están expresando el gen transferido. . Las células que expresan el gen luego se suministran a un sujeto.
En algunos ejemplos,' el ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-RSV, fragmentos enlazados al . antígeno ' y/o derivados de los mismos proporcionados en la presente se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero . no limitado a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector vírico o de bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia del gen mediada por cromosoma, transferencia del gen mediada por microcélula, y fusión de esferoplasto . Numerosas técnicas se conocen en la técnica para la introducción de genes extranjeros en células (ver, por ejemplo, Loeffler y Behr (1993) eth. Enzymol. 217:599-618; Cohén et al. (1993) Meth. Enzymol. '217:618-644; Cline (1985) Pharmacol. Ther. 29:69-92) y pueden usarse para la administración . de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-RSV, fragmento enlazado al . antígeno y/o derivado del mismo proporcionado en la presente, con tal de que el desarrollo necesario y funciones fisiológicas de las células receptoras no se interrumpan. La técnica contempla la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de manera que el ácido nucleico es- expresable por la célula y típicamente heredable y expresable por su progenie celular.
Las células recombinantes resultantes pueden suministrarse a un sujeto por varios métodos conocidos en la técnica. Las. células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células progenitoras o madre hematopoyéticas) pueden administrarse intravenosamente. La cantidad de células para administración depende de varios factores, incluyendo, por ejemplo, el efecto terapéutico y/o profiláctico deseado y el estado del paciente, y puede determinarse por alguien experimentado en la técnica.
Las células en las. cuales un ácido nucleico puede introducirse para propósitos de terapia génica abarcan cualquier tipo celular disponible, deseado, e -incluyen, pero- no se limitan a, células epiteliales, células endoteliales , queratinocitos , fibroblastos, células del músculo, hepatocitos; las células sanguíneas tal como linfocitos T, linfocitos B, ' monocitos ,¦ ' mácrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos ; varias células . progenitores o madre, en particular células progenitoras o madre hematopoyéticas , por ejemplo, como se obtienen de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, e hígado fetal. En ¦ ejemplos particulares, la célula usada para terapia, génica es autóloga al sujeto.
En algunos ejemplos en los cuales las células recombinantes se usan en terapia génica, las secuencias de ácido nucleico que codifican . un anticuerpo anti-RSV, fragmentos enlazados al antígeno y/o derivados de los mismos se proporcionan en la presente introducidos en las células de tal manera que son expresables por las células o su progenie, y las células recombinantes luego se administran in vivo para efecto terapéutico. En un ejemplo particular, se usan células progenitoras o madre. Cualquiera de las células progenitoras y/o madre que pueden aislarse y mantenerse in vitro pueden usarse (ver por ejemplo, Publicación PCT WO 94/08598; Stemple ¦ y Anderson (1992) Cell 71:973-985; Rheinwald (1980) Meth. Cell Bio. 21A:229; y Pittelkow y Scott (1986) Mayo Clinic Proc. 61 : 771) .
En un ejemplo particular, el ácido nucleico . a introducirse para propósitos de terapia génica contiene un promotor inducible operablemente ligado a la región de codificación, de tal manera que la expresión del ácido nucleico es controlable al controlar la presencia o ausencia del inductor apropiado de transcripción.
J. Composiciones farmacéuticas, combinaciones y artículos de fabricación/kits 1. Composiciones farmacéuticas Se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas que contienen ün anticuerpo anti-RSV ¦ .o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente. La composición farmacéutica puede usarse para aplicaciones terapéuticas, profilácticas, y/o de diagnóstico. Los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los. mismos proporcionados en la presente pueden formularse con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, Generalmente, tales composiciones farmacéuticas utilizan componentes que no perjudicarán significativamente las propiedades biológicas del anticuerpo o fragmento enlazado al antigeno del mismo, tal como' el enlace a su epitopo especifico (por ejemplo enlaza a un epitopo en una proteína F de RSV) . Cada componente es farmacéuticamente . y fisiológicamente aceptable en el sentido de ser Compatible con los otros ingredientes y no. perjudiciales' para el paciente. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por métodos bien conocidos en la técnica de farmacia, incluyendo pero no limitados a, comprimidos, pildoras, polvos, soluciones o suspensiones liquidas (por ejemplo, incluyendo formulaciones inyectables, ingeribles y tópicas (por ejemplo', gotas para los ojos, geles o ungüentos) , aerosoles (por ejemplo, roclos · nasales) , liposomas, supositorios, soluciones inyectable e infusible y formas de liberación sostenida. Ver, por ejemplo, Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman y Gilman' s: The Pharmacological Bases of Therapeutics , 8a Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa . ; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Medicat.ions, Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker,. NY; y Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. Cuando se administran sistemáticamente, la composición terapéutica es estéril, libre de pirógeno', generalmente libre de materia en partículas, y en una solución parenteralmente aceptable teniendo debidamente en cuenta el pH, isotonicidad, y estabilidad. Estas condiciones se conocen para aquellos experimentados en la. técnica. Los métodos para preparar composiciones parenteralmente administrables son bien conocidos o serán aparentes para aquellos experimentados en la técnica y se describen en más detalle en, por ejemplo, "Remington: The Science y Practice of Pharmacy (Anteriormente Remington's Pharmaceutical Sciences)", 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995) .
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente pueden estar en varias formas, por ejemplo, en forma sólida, semi-sólida, liquida, polvo, acuosa, o liofilizada. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se conocen en la técnica e incluyen pero no se limitan a agua, agentes de solución amortiguadora, soluciones salinas, solución amortiguadora salida de fosfato, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, alcoholes, goma arábica, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, gelatina, glicerina, carbohidratos tal como lactosa, sacarosa, amilosa o almidón, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácido graso, ésteres de ácido graso de pentaeritritol , hidroxi metilcelulosa, polvos, entre otros. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente pueden contener otros aditivos incluyendo, por ejemplo, antioxidantes, conservadores, agentes antimicrobianos, agentes analgésicos, aglutinantes, desintegrantes, colorantes, diluyentes, excipientes, agentes de dilución^ mejoradores de flujo, solubilizadores, estabilizadores, agentes de tonicidad, vehículos, agentes de viscosidad, agentes saborizantes , emulsiones, tal como emulsiones de aceite/agua, agentes emulsificantes y de suspensión, tal como acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, bentonita, carbómero, carragenina, carboximetilcelulosa, celulosa, colesterol, gelatina, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa , metilcelulosa, octoxinol 9, alcohol de oleilo, povidona, monoestearato de propilen glicol, sulfato lauril de sodio, ésteres de sorbitan, alcohol de estearilo, tragacanto, goma xantana, y derivados de los mismos, solventes, e ingredientes misceláneos tal como celulosa cristalina, celulosa microcristalina, ácido cítrico, dextrina, dextrosa, glucosa líquida, ácido láctico, lactosa, cloruro de magnesio, metafosfato de potasio, almidón, entre otros (ver, generalmente, Alfonso R. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins) . Tales portadores y/o aditivos pueden formularse por métodos convencionales y pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. Los agentes estabilizantes tal como' lípidos, inhibidores de nucleasa, polímeros, y agentes quelantes pueden conservar las composiciones . de degradación dentro del cuerpo.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para . uso incluyen las composiciones en donde uno o más anticuerpos anti-RSV están contenidos en una cantidad efectiva para alcanzar su propósito pretendido. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está bien dentro . de la capacidad de aquellos experimentados en la técnica. Las dosificaciones terapéuticamente efectivas pueden determinarse al usar métodos in vitro e in vivo como se describen en la presente. En consecuencia, un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente, cuando en una preparación farmacéutica, puede presentarse en formas de dosis unitaria para administración.
Un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente puede liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes del uso. Esta técnica se ha mostrado para ser efectiva con inmunoglobulinas convencionales y preparáciones de proteina y técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica pueden emplearse.
Un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente puede proporcionarse como una composición de liberación controlada o liberación sostenida. Los materiales poliméricos se conocen en la técnica para la formulación de pildoras y cápsulas que pueden alcanzar liberación controlada o sostenida de los anticuerpos o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados en la presente (ver, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (éds.) CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds . ) , Wiley, New York (1984); Ranger y. Peppas (1983) ¦ J, Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver también Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al.. (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. (1989) 7. Neurosurg. 7- 1:105; Patentes de E.U.A. Nos. 5,679, 377, 5, 916, 597, '5,912,015, 5,989,463, 5,120,326; Publicación PCT Nos. O .99/15154 y WO 99/20253) . Los ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) , poli (metacrilato de metilo), poli (ácido acrílico) , poli (acetato de etilen-co- vinilo) , poli (ácido metacrílico) , poliglicólidos . · (PLG) , polianhídridos, poli (N-vinil pirrolidona) , poli (alcohol de vinilo) , poliacrilamida, poli (etilen glicol) , polilactidos (PLA) , poli (lactido-co-glicólidos) (PLGA), y poliortoésteres . Generalmente, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estables en almacenamiento, estériles, y biodegradables . Cualquier técnica conocida en la técnica para la producción de formulación de liberación sostenida puede usarse para producir una formulación de liberación . sostenida que contiene uno o más anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno proporcionados en la presente.
En algunos ejemplos, la composición farmacéutica contiene un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente y uno o más anticuerpos adicionales. En algunos ejemplos, uno o más anticuerpos adicionales incluyen, pero no se limitan a, palivizumab (SYNAGIS®) , y. derivados de los mismos, tal como, pero no limitados a, motavizumab (NUMAX®) , AFFF, P12f2, Pl2f4, Plld4, Ale9, Al2a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, IX-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF ( 1 ) , 6H8 , L1-7E5, L2-15B10, A13all, Alh5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, y A4B4-F52S (ver Patentes de E.U.A. Nos. 5,824,307 y 6,818,216), rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9, rsv21, rsv22, rsv23 (ver, por ejemplo Patentes de E.U.A. Nos. 5,824,307, 6,685,942 y 6,818,216), un anticuerpo anti-RSV humano, tal como, pero no . limitado a, rsv6, rsvll, rsvl3, rsvl9 (esto- es Fab 19), rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 (ver, por ejemplo Patentes de E.U.A. Nos. 6,685,942 y 5,811,524), un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-RSV tal como, pero no limitado a, MAbs 1153, 1142, 1200, 1214, 1237, 1129, 1121, 1107, 1112, 1269, 12.69, 1243 (Beeler et al. (1989) J.
Virology 63 (7) : 2841-2950) , MAbl51 (Mufson et . al." . (1987) J. Clin. Microbiol. 25: 1635-1539), MAbs 43-1 y 13-1 (Fernie et al. (1982) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 171:266-271), MAbs 1436C, 1302A, 1308F, y 1331H (Anderson et al. (1984.) J. Clin. Microbiol. 19:934-936), o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos. Los anticuerpos ejemplares adicionales o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos que pueden usarse en una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-RSV- o fragmento enlazado al antigeno del mismo proporcionado en la presente incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos descritos en, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,413,771, 5,840,298, 5,811,524, 6,656,467, 6, 537, 809, 7, 364, 742, .7, 070, 786, 5, 955, 364·, 7, 488, 477, 6,818,216, 5,824, 307, 7, 364,737, 6, 685,942, y. 5, 762,905 y Pub. de Patentes de E:U.A. Nos. 2007-0082002, 2005-0175986, 2004-0234528, 2006-0198840, 2009-0110684, 2006-0159695, 2006-0013824, 2005-0288491, 2005-0019758, 2008-0226630, 2009-0137003, y 2009-0092609. 2. Artículos de fabricación/kits Las composiciones farmacéutica de anticuerpos anti-RSV o ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-RSV, o un derivado o una porción biológicamente activa de los mismos pueden empacarse como artículos de. fabricación que contienen material de empaque, una composición farmacéutica que es efectiva para profilaxis (esto es vacunación, inmunización pasiva) y/o tratar la enfermedad o trastorno mediado por RSV, y una etiqueta que indica que el anticuerpo o molécula de ácido nucleico es para usarse para vacunación y/o tratamiento de la enfermedad o trastorno. Las composiciones, farmacéuticas pueden empacarse en formas de dosificación unitarias que contienen una cantidad de la composición farmacéutica para una dosis sencilla o dosis múltiples. Las composiciones empacadas pueden contener un polvo liofilizado de las composiciones farmacéuticas que- contienen los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados, que pueden reconstituirse (por ejemplo con agua o solución salida) antes de la administración. .
Los artículos de fabricación proporcionados en la presente contienen materiales de empaque. Los materiales de empaque para uso en productos farmacéuticos empacados son bien conocidos para aquellos de experiencia en lá técnica. Los ejemplos de materiales de empaque farmacéuticos incluyen, pero no se limitan a, envases alveolados, botellas, tubos, inhaladores (por ejemplo, inhaladores de dosis contadores presurizados (MDI ) , inhaladores de polvo seco (DPI), nebulizadores (por ejemplo, nebulizadores por chorro o ultrasónicos) y otros sistemas líquidos de . respiración sencilla), bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, botellas, y cualquier material de empaque adecuado para una formulación seleccionada y modo pretendido de administración y tratamiento. La composición farmacéutica también puede incorporarse en, aplicarse a o recubrirse en una barrera u otro dispositivo protector que se usa para anticoncepción de la infección.
Los anticuerpos 'anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos, moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de los mismos, composiciones farmacéuticas o combinaciones proporcionadas en la presente también pueden proporcionarse como kits. Los kits pueden opcionalmente incluir uno o más componentes' tal como instrucciones para uso, dispositivos y reactivos adicionales (por ejemplo, agua esterilizada, o soluciones, salinas para dilución de las composiciones y/o reconstitución de proteína liofilizada) , y componentes, tal como tubos, recipientes y jeringas para practica de los métodos. Los kits ejemplares pueden incluir los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos proporcionados en la presente, y pueden opcionalmente incluir instrucciones para uso, un dispositivo para administrar los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos a un sujeto, un dispositivo para detectar los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos en un sujeto, un dispositivo para detectar los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos, en muestras obtenidas de un sujeto, y un dispositivo para administrar un agente terapéutico adicional a un sujeto.
El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones. Las inst ucciones típicamente incluyen una expresión tangible que describe los . anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos y, opcionalmente, otros componentes incluidos en el kit, y métodos para administración, incluyendo métodos para determinar el estado apropiado del sujeto, la cantidad de dosificación apropiada, regímenes de dosificación, y el método de administración apropiado para administrar los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos. Las instrucciones también .pueden incluir orientación para monitorear al sujeto sobre la duración del tiempo de tratamiento.
Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente y un artículo para diagnóstico. Por ejemplo, tales kits pueden incluir un artículo para medir la concentración, cantidad o' actividad del anticuerpo anti-RSV seleccionado o fragmento enlazado al antígeno del mismo, en un sujeto.
En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigéno del mismo se proporciona en un kit de diagnóstico para la detección de RSV en una muestra biológica aislada (por ejemplo, una muestra de fluido, tal como sangre, esputo, lavado, muestra de incubación de pulmón, saliva, orina o ganglio obtenido de un sujeto) . En algunos ejemplos, el kit de diagnóstico contiene un panel de .'uno o más anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos y/o uno o más anticuerpos de control (esto es anticuerpos enlazados no de RSV) , donde uno o más anticuerpos en el panel es un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antigeno proporcionado 'en la presente.
Los kits proporcionados en la presente también pueden incluir un dispositivo para administrar los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos a un sujeto. Cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar medicamentos a un sujeto. puede incluirse en los kits proporcionados en la presente. Los dispositivos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un inhalador (por ejemplo, inhalador de dosis ·' contador presurizado (MDI ) , inhalador de polvo seco (DPI), nebuliz.ador (por ejemplo, nebulizadores por chorro o ultrasónicos) y otro sistema liquido de respiración sencilla) , una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, y un dispensador liquido tal como un gotero. Típicamente el dispositivo para administrar los anticuerpos anti-RSV . o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos del kit será compatible con el método deseado de la administración de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del · mismo para suministrarse por administración pulmonar puede incluirse en un kit con o contenido en un inhalador o un nebulizador. 3. Combinaciones Se proporcionan combinaciones de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados · al antígeno de los mismos proporcionados en la presente y un segundo agente, tal como un segundo anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo u otro agente de diagnóstico o terapéutico. Una combinación puede incluir cualquier anticuerpo anti-RSV' o fragmento enlazado al antígeno del mismo o reactivo para efectuar terapia del mismo de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente. Por ejemplo, una combinación puede incluir cualquier anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del . mismo y un agente antivírico. Las combinaciones también pueden incluir un anticuerpo anti-RSV o fragmento enlazado al antígeno del mismo proporcionado en la presente con uno o más anticuerpos terapéuticos adicionales. Las combinaciones de los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos proporcionados también pueden contener composiciones farmacéuticas que . contienen los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos o células hospederas que contienen ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-RSV o fragmentos enlazados al antigeno de los mismos como se describe en la presente. Las combinaciones proporcionadas en la presente pueden formularse como una composición sencilla o en composiciones separadas. K. Ejemplos Los siguientes ejemplos se incluyen para propósitos ilustrativos solamente y . no se pretenden para limitar el alcance de la invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Expresión de proteina F de RSV En este ejemplo, la proteina de fusión de RSV (proteina F) de la cepa del Virus Sincitial Respiratorio A2 se expresó y purificó por captura en placas ELISA usando clon 2F7 de anticuerpo monoclonal anti-RSV, que reconoce . tanto las subunidades FO como Fl de- la glicoproteina de fusión. En el primer ejemplo, la proteina F de RSV recombinante se clonó y expresó en células 293F. En el segundo ejemplo, proteina F de RSV nativa se expresó por infección de células HEp-2 con cepa A2 de RSV.
A. Proteina F de RSV recombinante En este ejemplo, se clonó y expresó el gen que codifica la proteina F de RSV de la cepa A2 RSV. El gen F A2 de RSV (SEQ ID N0:21), que ¦ contiene solamente el dominio extracelular se sintetizó de acuerdo con protocolos de síntesis de ADN estándares por GeneArt (Burlingame, CA) . El gen F A2 de RSV se procesó por ingeniería para contener una secuencia Kozak (nucleótidos 7-16 de SEQ ID NO:21), una secuencia c-myc (nucleótidos 1600-1629 de SEQ¦ ID NO:21), y una etiqueta 6X-His (nucleótidos 1645-417 de SEQ ID NO:21). Adicionalmente, los sitios de restricción Nhel (SEQ ID NO:22) y HindIII (SEQ ID NO: 23) se procesaron por ingeniería- en los extremos 5' y 3', respectivamente, para permitir la. clonación en una vector de expresión. El ADN se digirió usando técnicas de biología molecular estándares y ligó en el vector de expresión mamífero similarmente digerido pcDNA™3.1/myc-His ( - ) C (SEQ ID NO:24, Invitrogen) . El vector que contiene el gen F A2 de RSV se transformó en células XLl-Blue electrocompetentes (Strategene) . Las colonias individuales se seleccionaron e hicieron crecer, y el ADN plásmido se purificó. La presencia del inserto de gen F A2 de RSV en el vector aislado se verificó por procesamiento de secuencias de ADN, y un clon que contiene el inserto se usó para producir preparaciones a gran escala de ADN (Megaprep kit, Qiagen) .
La proteina F A2 de RSV se. expresó en células, mamiferas usando el Sistema de Expresión FreeStyle™ 293 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 3 x 107 células se co-transfectaron con 30 yg de ADN plásmido de RSV A2 F/pcDNA3.1/myc-His (-) C y 5 de pAdVAntage. (Promega) e incubó a 37°C durante 72 hrs. Las células se peletizaron por centrifugación y 3 mL de solución amortiguadora de lisis fría (NaCl 300 mM, NaH2P04 50 mM, Tritón X-100 al 1%, coctel inhibidor de proteasa Complete™ (Cat. No. sc-29131, Santa Cruz), pH 8) se agregó durante cada 3 x 107 células 293-F transíectadas con RSV F. La mezcla se giró de forma- giratoria a 4°C durante 30 min seguido por centrifugación a 14,000 rpm durante 30 min a 4°C. El sobrenadante depurado se transfirió a un tubo fresco y se congeló a -80°C hasta que está listo para uso. Antes de la captura en una placa ELISA,, el sobrenadante se descongeló, brevemente se centrifugó y diluyó 1:1 v/v con PBS que contiene leche seca sin grasa al 0.8% (concentración final de leche seca sin grasa al- 0.4%) .
B. Proteina F de RSV nativa En este ejemplo, la proteina F de RSV nativa de la cepa A2 RSV (SEQ ID NO: 382) se purificó de Células HEp-2 infectadas por RSV como sigue. Brevemente, las células HEp-2 se siembran en un depósito receptor de cultivo celular de diez capas (Corning 3270) usando EMEM completo (ATCC 30-2003; que contiene FBS al .10%, L-glutamina 1%, y pen-Strep al 1%) y se incubó a 37°C y . C02 al 5%. Una vez que las células alcanzan 80% de confluencia, la monocapa HEp-2 se infectó con el virus A2 de RSV (ATCC VR-1540) en una multiplicidad de infección (MOI) de 0.01-0.1. Las células infectadas se cultivaron durante 3-5 días hasta que se observaron, sincitios celulares aparentes. Las células infectadas se lavaron una vez con PBS y las células se cosecharon al agregar 500 mL de PBS con EDTA 5 mM al depósito receptor de cultivo e incubaron a 37°C durante 1 hr. Las células se recolectaron en tubos cónicos de 50 mL (5.x 107 células por tubo) y peletizaron por centrifugación. Los peletizados celulares se lavaron 2X con PBS y centrifugaron en 1200 rpm durante 5 minutos. Los peletizados celulares se almacenaron a -20°C hasta que se prepararon además. Las células congeladas se descongelaron y se agregaron 3 mL de solución amortiguadora de lisis fría (NaCl 300 mM, NaH2P04 50 mM, Tritón X-100 al 1%, coctel de Inhibidor de Proteasa¦ Complete™ (Cat. No. sc-29131, Santa Cruz), pH 8) a cada peletizado celular. Las células se mezclaron de forma giratoria a 40 C durante 30 min seguido por sonicación (3 pulsos durante 10 segundos cada uno en polvo al 10%) y finalmente se centrifugaron a 14,000 rpm durante 30 min a 4°C. El sobrenadante depurado se transfirió a un tubo fresco y se congeló a -80°C hasta que está listo para uso. Antes de la captura en una placa ELISA, el sobrenadante se descongeló, brevemente se centrifugó y diluyó 1:2000.
C. Captura con mAb anti-RSV Las placas ELISA se recubrieron usando 50 uL/pozo de una dilución 1:400 de mAb anti-RSV (Cat. No. NB110-37246, clon 2F7, Novus Biologicals) en PBS. El anticuerpo no enlazado se removió y las placas se usaron inmediatamente para ELISA (ver Ejemplos 2 y 4). Alternativamente, las placas se congelaron durante hasta 2 semanas a -20°C. Inmediatamente antes del uso, las placas se bloquearon con leche seca sin grasa al 4% en lx PBS durante 2 horas a 37°C. Las placas se lavaron dos veces con PBS que contienen Tween-20 al 0.05% (solución amortiguadora de lavado) antes de la adición del lisado. La captura de la proteina F de RSV (ya sea recombinante o nativa) se efectúo al agregar 50 yL de cualquiera de los Usados preparados arriba para cada pozo de la placa ELISA mAb anti-RSV e incubó a 37 °C durante 2 horas.
Ejemplo 2 Aislamiento de Anticuerpos Fab Anti-RSV de Células B transformadas por EBV En este ejemplo, los anticuerpos anti-RSV se aislaron de células B de memoria del donador estimuladas, transformadas con virus Epstein Barr, que se seleccionaron para' enlazar a la proteina F de RSV seguido por generación de anticuerpo in vitro. Las secciones A y B describen dos procedimientos ligeramente diferentes para generar y clonar células B transformadas con EBV para enlazar a la proteina F de RSV. Las diferencias son como siguen: (1) la fuente de los PBMCs en la etapa 1; (2) aislamiento de células B IgG+ en la etapa 2 (eliminadas de células que expresan IgM, IgD e IgA en la sección A y eliminadas adicionalmente de células positivas CD3 en la sección B) ; y (3) preparación de células alimentadoras eliminadas de células B irradiadas en la etapa 3.a.
A. Generación y clonación de células B trans ormadas con EBV y cribado para enlace a la proteina F de RSV (Procedimiento A) Las células mononucleares de sangre periférica (PMBCs) se obtuvieron de un trabajador social de niños quien ' puede haberse expuesto a RSV a través de contacto con niños. Las PBMCs se aislaron por centrifugación de densidad sobre Ficoll Hypaque, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.. 1. Aislamiento de CD22+ y Activación de células B CD22+ Se aislaron 3.2 x 106 células -B CD22+ de PBMCs del donador usando perlas magnéticas CD22 (Miltenyi, cat . ¦# 130-046-401) y columnas LS (Miltenyi, cat.fr 130-042-401) . Las células B CD22+ aisladas se cultivaron en 1 x 106 células por pozo en una placa de 48 pozos en RPMI (Hyclone, cat.# SH30096.01) que contiene suero de bovino fetal de' IgG bajo inactivado con calor al 10% (FBS, Invitrogen, cat. # 16250-078), antibióticos al 1% (Hyclone, cat. # SV30010), piruvato de sodio al 1% (Hyclone, cat. # SH30239.01) y L-glutamina al 1% (Hyclone, cat. # SH30034.01) . Las células B aisladas se activaron con una selección de agentes que estimulan la célula B policlonal para inducir proliferación y producción de anticuerpo. .· . 2. Inmortalizacion mediada por EBV de células B IgG+ Se lavaron e incubaron 4.5 x 106 células- B CD22 + activadas con 40 pL de anti-IgM conjugado con . FITC (BD Biosciences, cat . # 555782), 40 yL de anticuerpos anti-IgD conjugado con FITC (BD Biosciences, cat.# 555778) y 4 i de anti-IgA conjugado con FITC (Jacksons Immunoresearch, cat. 309-096-043) durante 15 minutos a 4°C. Las células se lavaron IX en PBS (que contiene BSA al 0.5% y EDTA 2 .mM) y se volvieron a suspender en 90 uL de la misma, solución amortiguadora. Las células B IgG+ se enriquecieron por selección negativa de células que expresan IgM, ¦ IgD, IgA usando 10 L de perlas magnéticas anti-FITC (Miltenyi, cat.# 130-048-701) y columnas LS (Miltenyi, cat . # 130-042-401) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La inmortalización en volumen de células B se- realizó al incubar.1.87 x, 106 células' B enriquecidas con IgG+, CD22+ con 0.5 mi de sobrenadante EBV (50% v/v en RMPI-1640 con FCS al 10%, ATCC Cat. No. VR-1492 de células B95-8) durante 16 horas. Después de la infección las células se lavaron y cultivaron (106/mL en · cada uno de los dos pozos en RP I (Hyclone, cat. # SH30096.01) que contiene suero de bovino fetal de IgG bajo inactivado con calor al 10% (FBS, Invitrogen, cat. # 16250-078), antibióticos al 1% (Hyclone, cat. # SV30010), piruvato de sodio al 1% (Hyclone, cat. # SH30239.01) y L-glutamina al 1% (Hyclone, cat. # SH30034.01), 200 IU/ml rhIL-2. (R&D Systems Cat. # 202-IL-50 ) con 0.5.x 106 células alimentadoras irradiadas por pozo de una placa de 24 pozos durante unos 9 días adicionales. 3. Clonación de Células B a. Preparación de células alimentadoras reducidas en célula B irradiadas para clonación de células B Las células alimentadoras reducidas en células B irradiadas se usaron para ayudar a mantener el crecimiento de las células B transformadas por EBV. Las PBMCs de una mezcla de 3 donadores saludables se obtuvieron por separación Ficoll, irradiadas con 3250 rads (en el Centro de Cáncer de oore UCSD) , y reducción de células B usando perlas magnéticas anti-CDl9 ( iltenyi Biotec, Cat . No. 130-050-301) y columnas LD (Miltenyi Biotec, cat . # 130-091-509). Brevemente, PMBCs congeladas é irradiadas, obtenidas de separación Ficoll, se descongelaron, lavaron dos veces y contaron. Las células luego se centrifugaron a 300 g durante 10 minutos, y el sobrenadante se aspiró. El peletizado celular se volvió a suspender en 80 µ? de solución amortiguadora MACS- (PBS con BSA al 0.5% y EDTA 2 mM) por cada 107 células y se agregó 20 µ? de Microperlas CD19 (por cada 107 células) . Después de mezclar completamente, las células se incubaron a 4°C durante 15 minutos. Las células luego se lavaron al agregar 1-2 mL de solución amortiguadora (por cada 107 células) seguido por centrifugación en 300 g · durante 10 minutos y el sobrenadante - se aspiró. Hasta 108 células luego se volvieron a suspender en 500 µ? de solución amortiguadora.
La separación magnética se efectúo al colocar una columna LD (compuesta de esferas ferromagnéticas cubiertas con un recubrimiento plástico para permitir separación rápida y suave de las células) en el campo magnético de un separador MACS. La columna LD se lavó con 2 mL de solución amortiguadora y la suspensión celular se aplicó a la parte superior de la columna. Las células no B se recolectaron ya que pasaron a través de la columna después de la adición de 2 x 1 mL de solución amortiguadora. b. Clonación de células B Aproximadamente 20 células B transformadas por EBV se co-cultivaron con . agentes estimulantes de célula B policlonales y 50,000 células alimentadoras reducidas en célula B irradiadas por pozo en una placa de 96 pozos e hicieron crecer durante 13 días. Se generaron un total de 120 placas de 96 pozos. 4. Selección de sobrenadante de células B para enlazar a la proteina F de RSV Los sobrenadantes de cada pozo se transfirieron a una nueva placa de 96 pozos y las células se lavaron IX en PBS y se congeló a -80°C en 100 µ-L de solución amortiguadora RLT (Qiagen, cat. # 79216) que contiene 10 yL/mL de 2-mercaptoetanol . El sobrenadante se usó en una ELISA para determinar cuáles pozos son anticuerpos producidos que- son capaces de enlazar a la proteína F de RSV. Brevemente, la ELISA se realizó como sigue: (1) placas ELISA de proteína F de RSV se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 usando placas de área media de 96 pozos con las siguientes modificaciones: mAb anti-RSV (clon 2F7, fluido de ascitos de ratón, Cat . No. ab43812, Abeam) se usó como el anticuerpo de captura y la proteína F de RSV se incubó con el . anticuerpo de captura durante la noche a 4°C. (2) 10 ]i de sobrenadante de célula B de cada uno - de los 2 pozos (un total de 20 µL agrupado) se agregó a una placa ELISA de 96 pozos medios e incubó durante 2h a 37 °C. El plasma de un grupo de donadores del Banco de Sangre (recolectado y congelado después de la separación Ficoll Hypaque, diluido 1:1000) se usó como un control positivo. (3) Las placas se lavaron 4X' como arriba y 50 \iL de anticuerpo conjugado por HRP de IgG Fe anti-humano de cabra (diluido 1:1000 en PBS con Tween20 al 0.05%) se agregó a cada pozo y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora. (4) Las placas se lavaron 6X como . arriba y desarrollaron usando -50 yL de 1:1 v/v TMB: solución de peróxido (Pierce, Cat No. 34021) sustrato y se permitieron desarrollar durante 7 minutos.. La reacción se detuvo inmediatamente por la adición de 50 )i . de H2SO 2N y la absorbancia en 450 nm se midió usando un lector, de placa ELISA. El enlace positivo se indicó por un OD450 mayor que 0;5 (0.5-0.9 es enlace moderado, >1 es enlace fuerte) y una respuesta que es 3 veces arriba del fondo.
Para determinar cuál de los dos pozos agrupados contiene anticuerpos anti-RSV, 20 de sobrenadante de célula B (diluido 1:2 v/v con PBS/Tween 2.0 al 0.05%) de cada pozo se volvió a probar individualmente contra la proteína' F de RSV capturada.
Un total de 18 placas (o 1080 pozos), se' ' seleccionaron para enlazar al lisado F de RSV (como se purifica en el Ejemplo 1). Seis pozos se identificaron como enlazadores para el lisado F de RSV. Cinco de los seis pozos se reconfirmaron por un ELISA adicional y se usaron para generar anticuerpos anti-RSV por PCR (descritos a continuación) .
B. Generación y clonación de células B transformadas con EBV y cribado para enlace a la proteina F de RSV (Procedimiento B) Las células mononucleares de sangre periférica (PMBCs) se obtuvieron de un donador del banco de Sangre de San Diego. Las PBMCs se aislaron por centrifugación de densidad sobre Ficoll Hypaque, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1. Aislamiento de CD22+ y Activación de células B CD22+ Se aislaron .10.5 x 106 células B CD22+ de · PBMCs . del donador usando perlas magnéticas CD22 y las células B CD22+ aisladas se cultivaron y activaron en placas de 24 pozos como se describe en la sección A.l anterior 2. Inmortalizacion mediada por EBV de células B IgG+ a. Aislamiento de células B IgG+ Se lavaron e incubaron 11.3. x 106 células B. CD22+ activadas con 110 L de anti-IgM conjugado con biotina (BD Biosciences, cat . # 555781), 22 µ?, de anti-IgA conjugado con biotina (Invitrogen, cat # 62-7440) y 220 L de anti-CD3 conjugado con biotina '(BD Bioscience, cat. # 555331) durante 15 minutos a 4°C. Las células se lavaron IX en¦ PBS (que contiene BSA al 0.5% y EDTA 2 mM) y se volvieron a suspender en 1.045 mL de la misma solución amortiguadora. Las células B IgG+ se enriquecieron por selección negativa de células que ¦expresan IgM, IgD, IgA y CD3 usando 55 yL · de perlas magnéticas anti-biotina (Miltenyl, cat-. # 130-090-485) y columnas LD ( iltenyi, cat . # 130-042-901) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. a. Preparación de células alimentadoras irradiadas para cultivo de células transformadas por EBV Las células alimentadoras irradiadas se usaron para ayudar a mantener el crecimiento de las .células B transformadas por EBV. Las PBMCs de una mezcla de 2-3 donadores saludables sé obtuvieron ya aislaron por separación Ficoll, irradiadas con 3300 rads (en el Centro de Cáncer de Moore UCSD) , y se congelaron a 5 x 106 células por vial en FBS que contiene sulfóxido de dimetilo al 10% (Sigma cat . # D2650-100) . Antes ed usar, se descongeló un vial de células y se lavó 3x con RPMI (Hyclone, cat. # SH30096.01) que contiene suero de bovino fetal de bajo IgG inactivado por calor al 10% (Invitrogen, cat. # 16250-078), 1% de antibióticos (Hyclone, Cat# SV30010), 1% de piruvato de sodio (Hyclone, Cat# SH30239.1) y 1% de L-glutamina (Hyclone, Cat# SH30034.01). Las células se contaron, volvieron a suspender a 1 x 106 células/ml y se vaciaron en placas a 0.25 x 106 células por pozo de una placa de 48 pozos. c. Inmortalización mediada por EBV La inmortalización a granel de células B se efectuó al incubar 0.58 x 106 células B enriquecidas con CD22+, IgG+ con 0.5 mi de sobrenadante de EBV (50% v/v en R PI-1640 con FCS al 10%, ATCC Cat. No. VR-1492 a partir de células B95-8) durante 16 horas. Después de la . infección las células se lavaron y cultivaron (0.5-8 x 106/0.5 mi en un pozo en RPMI (Hyclone, Cat# SH30096.01) que contiene suero de bovino fetal bajo en IgG inactivado con calor al 10% (Invitrogen, cat# 16250-078), antibióticos al 1% (Hyclone, Cat# SV300.10), 1% de piruvato de sodio (Hyclone, Cat# SH30239.1) y 1% de L-glutamina (Hyclone, Cat# SH30034.01) con 0.5 x 106 células alimentadoras irradiadas por pozo de una placa de. 48 pozo. Después de 48 horas, 200 Ul/ml de rhIL-2 (R&D Systems, cat . #202-IL-50) se agregó y se cultivaron las células durante 7 días adicionales. 3. Clonación de células B a. Preparación de células alimentadoras reducidas en célula B irradiadas para clonación de células B Las células alimentadoras reducidas en células B irradiadas se prepararon para clonar células B. Las capas leucociticas de 5-6 donadores saludables se . obtuvieron y almacenaron de un día al otro a temperatura ambiente. Las PBMCs se aislaron por separación Ficoll, y se redujeron de células B al usar perlas magnéticas anti-CD19 (Miltenyi Biotec, Cat. No. 130-050-301) y columnas LD (Miltenyi Biotec, cat.# 130-042-901) .
Brevemente, PMBCs obtenidas de separación Ficoll, se descongelaron, lavaron dos veces y contaron. Las células luego se centrifugaron a 300 g durante 10 minutos, y el sobrenadante se aspiró. El peletizado celular se volvió a suspender en 80 µ? de solución amortiguadora MACS (PBS con BSA al 0.5% y EDTA 2 mM) por cada 107 células y se agregó 20 µ? de Microperlas CD19 (por cada 107 células) . Después de mezclar completamente, las células se incubaron a 4°C durante 15 minutos. Las células luego se lavaron al agregar 1-2 mL de solución amortiguadora (por cada 107 células) seguido por centrifugación a 300 g durante 10 minutos y el sobrenadante se aspiró. Hasta 108 células luego se volvieron a' suspender en 500 µ? de solución amortiguadora. La separación magnética se efectúo al colocar una columna LD (compuesta de esferas ferromagnéticas cubiertas- con un recubrimiento ' plástico para permitir separación rápida y suave de las células) en el campo magnético de un separador MACS. La columna LD se lavó con 2 mL de solución amortiguadora y la suspensión celular se aplicó a la parte superior de la columna. Las células no B se recolectaron ya que pasaron a través de la columna después de la adición de 2 x 1 mL de solución amortiguadora. Las células se contrifugaron a 300g durante 10 minutos y se volvieron a suspender a 5 x 106 células/ml en PBS que contiene suero de becerro fetal de bajo IgG al 2%. Las células se irradiaron con 4000 rads (en el centro de Cáncer Moore de la.UCSD) se centrifugaron a 300 g durante 6 minutos, se volvieron a suspender en FBS de bajo IgG al 90% y sulfóxido de dimetilo al 10% (DMSO, 25 x 106 células/ml) y se almacenaron congeladas en nitrógeno liquido.
Antes de usar, las células se descongelaron y lavaron tres veces con Medio de Dulbecco Modificado de ' iscove (IMDM, Hyclone .# SH30.228.1 ) que contiene suero de bovino fetal en IgG bajo inactivado por calor al 10% (Invitrogen, cat# 16250-078),. antibióticos al 1% (Hyclone, Cat# SV30010), 1% de aminoácidos no esenciales (Hyclone, Cat# SH30238.01) y 1% de L-glutamina (Hyclone, Cat#' SH30034.01 ) b . Clonación de células B Aproximadamente 100 células B transfromadas ' con EBV se co-cultivaron con. agentes estimuladores policlonales de células B y 50,000 células alimentadoras suprimidas de células B irradiadas por pozo en una placa de 96 pozos y se hicieron crecer durante 13 dias en IMD (Hyclone # SH30228.1) que contiene suero de bovino fetal en IgG bajo inactivado por calor al 10% (Invitrogen,. cat# 16250-078), antibióticos al 1% (Hyclone, Cat# SV30010), 1% de aminoácidos no esenciales (Hyclone, Cat# SH30238.01) y 1% de L-glutamina (Hyclone, Cat# SH30034..01') . Se generaron un total de 120 placas de 96' pozos.
. Cribado de sobrenadante de células B para enlace a Proteina F de RSV El sobrenadante de cada pozo se cribó por ELISA para determinar los pozos que estuvieran produciendo anticuerpos que pudieran enlazarse a la proteina F de RSV. Se efectuó el ELISA como se describe en la Sección A.5 anterior en placas ELISA de área media .de 96 pozos recubiertas con proteina F de RSV (como se describe en el Ejemplo 1). Como se describe anteriormente, para determinar cuales de los dos pozos acumulados contenían los anticuerpos anti-RSV, 20 µL de sobrenadanete de células B (diluido 1:2 v/v con. PBS/0.05% Tween 20) a partir de cada pozo se volvió a probar individualmente en contra de la proteína F de RSV capturada.
Un total de 120 placas (o 7200 pozos) se ; cribaron para enlazar al lisado F de RSV (cuando se purificói en el Ejemplo 1). Se identificaron veintinueve pozos como aglutinantes para el lisado F de RSV. Diez de los veinticinco "pozos se volvieron a confirmar por un ELISA adicional y se usaron para generar anticuerpos anti-RSV por PCR (abajo descritos)..
C. Generación de anticuerpos anti-RSV por PCR Siguiendo la selección inicial. de células B transformadas por EBV para producción de anticuerpos que enlazan a la proteína F de RSV, los anticuerpos individuales que codifican genes se amplificaron de ARN de célula B por PCR. Cinco pozos identificados como aciertos en la Sección A se seleccionaron para, clonación. Diez pozos identificados como aciertos en la Sección B anterior se seleccionaron para clonación. 1. Extracción de ARN El ARN se extrajo de las células B (para cada pozo correspondiente a un enlazador positivo para la proteína F de RSV) usando un Micro Kit . RNeasy (Qiagen, Cat . No. 1402-2408) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones: 1) las células B se congelaron en 100 L de solución amortiguadora RLT con ß-mercaptoetanol (10 por mL de solución amortiguadora); 2) las células no se homogenizaron; 3) el RNA se precipitó con 70% de etanol (en agua libre de RNasa) ; y 4)' tratamiento de DNasa se llevó a cabo "en columna" de acuerdo con el protocolo complementario del fabricante. El ARN se eluyó en un volumen final de 26 yi . 2. Síntesis de cADN de primera hebra Después de la extracción de ARN, el cADN se generó de acuerdo con el protocolo de Síntesis de Primera Hebra Superscript III (Invitrogen; Cat No. 19090-051) . Brevemente, 8 µ?, de ARN (aislado como . se describe arriba) , 1 \i de cebador oligo dT y 1 pL de dNTPs se combinaron en un tubo de 0.2 mL estéril y se incubó a 65°C durante 5 minutos seguido por incubación en hielo durante 1 minuto. Posteriormente, 2 L de DTT 0.1 mM, 4 pL de MgCl2 25 mM, 2 L de solución amortiguadora RT, 1 µ?. de RNasaOut, y 1 µ? de Superscript III RT se agregaron al tubo, y la mezcla de reacción se incubó a 50°C durante 50 minutos seguido por incubación a 85°C durante 15 minutos. El cADN se usó inmediatamente o congeló a -80°C para almacenamiento de larga duración. 3. Aislamiento de Genes de Cadena Ligera Kappa y Lambda e IgG de Cadena Pesada por Amplificación PCR Se generaron cadenas ligeras kappa y lambda y cadenas pesadas IgG por amplificación PCR de la reacción de síntesis de cADN de primera hebra de célula B (ver arriba) . Los genes de cadena ligera kappa se amplificaron por una PCR de etapa sencilla, mientras los genes de cadena ligera lambda y genes de cadena pesada se amplificaron usando un enfoque PCR anidado, de dos etapas. Los genes de cadena ligera y pesada amplificados se ligaron posteriormente en un caseté sencillo usando- "PCR de traslape".
Etapa 1. Amplificación de genes de cadena ligera lambda y genes de cadena pesada IgG En la Etapa 1, 2 i de cADN generado por la Síntesis de Primera Hebra (ver arriba) se usó como una plantilla para amplificar individualmente cadenas pesadas IgG por PCR. En esta etapa, los grupos de cebadores de la Etapa 1 se utilizaron (ver Tabla 3 a continuación). Las condiciones de reacción fueron como sigue: Etapa I de PCR: Cadena pesada A: Reactivo H20 . 16 lOx solución amortiguadora 2.5 lOx solución amortiguadora potenciadora 2.5 dNTP (10 mM cada uno) 0.75 cADN 2.0 líder de grupo VH (9 µ? cada uno) 0.5 grupo inverso VH (20 µ?) 0.25 Pfx50 0.5 25 Alternativamente en la Etapa lm Cadena Pesada B, 2.5 L de cADN generado por la Síntesis de la Primera Hebra (ver arriba) se usó como una plantilla para amplificar individualmente las cadenas pesadas IgG por PCR. En esta etapa, el mismo grupo de los cebadores de la Etapa 1 se utilizó para los cebadores delanteros y se usó · VH gamma-1 (a/b) reverso como el cebador inverso (ver ; tabla 3A a continuación).. Las condiciones de reacción fueron como siguen: Etapa I PCR: Cadena Pesada B Reactivo µ?_ H20 16 lOx solución amortiguadora 2.5 lOx solución' amortiguadora potenciadora 2.5' dNTP (10 mM cada uno) 0.75 cADN 2.5 líder de grupo VH (9 µ? cada uno). 0.5 VH-gl (a/b) -REV (20 µ?) 0.25 Pfx50 0.5 25 En la Etapa I, la. Cadena Ligera Lambda, 2:5 µ?, de cADN generado por Síntesis de Primera Hebra (ver arriba) se usó como una plantilla para amplificar individualmente cadenas pesadas IgG por PCR. En esta etapa, un grupo de cebadores de la Etapa I se utilizó para los cebadores delanteros y pCALCL(T)-R se usó como el cebador inverso (ver Tabla 3B a continuación). Las condiciones de reacción fueron como sigue: Etapa I de PCR: Cadena Ligera Lambda: Reactivo u_L H20 . 16 lOx solución amortiguadora 2.5 lOx solución amortiguadora potenciadora 2.5 dNTP (10 mM cada uno) 0.75 ' CADN 2.0 ; grupo VX (14.2 µ? cada uno) 0.5 . pCALCL(T)-R (20 µ?) · 0.25 Pfx50 0.5 25 Para la reacción PCR, un enfoque de .anotación se implemento con objeto de agregar especificidad a la amplificación de reacción. En cada etapa de anotación, la temperatura de combinación de los pares de bases se disminuye por 1°C cada ciclo. Las condiciones de termociclizador de PCR fueron como sigue. 1) 94°C durante 2 minutos 2) 10 ciclos de : 94°C durante 15 segundos; 62°C durante 20- segundos (Anotación); 68°C durante 1 minuto 3) 25 ciclos de: 94 °C durante 15 segundos; 52 °C durante 20 segundos; 68 °C durante 1 minuto 4) 68 °C durante 3 minutos 5) 4 °C mantenido Las mezclas de reacción resultantes se usaron como ADN de plantilla para la Etapa II (ver a continuación) sin ninguna purificación adicional.
Etapa II. Amplificación de genes de cadena ligera lambda y cadena pesada IgG En la Etapa II, las mezclas de reacción de cadena ligera lambda y cadena, pesada · de la Etapa I se usaron como plantillas para la segunda corrida de reacciones PCR con grupos de cebadores delanteros e inversos que se amplifican después la región de estructura 1 de cada cadena al extremo de la primera región constante (CHI para cadena pesada, CL para cadena ligera) .
Los cebadores delanteros de . cadena' pesada (ver Tabla 4) se diseñaron para introducir un sitio de restricción Sfil (SEQ ID NO: 1). Las condiciones de reacción fueron como siguen: PCR II : Cadena pesada Reactivo uJL H20 12.75 lOx solución amortiguadora 2.5 10X Potenciador '2.5 . dNTP (10 mM cada uno) · 0.75 reacción de Etapa I 2.5 grupo pCAL24VH-F (2 µ?)' 2.5 CH1-R Grupo-Sfi (20 µ?) 1 Pfx50 . 0_^5 25 Los cebadores delanteros de cadena ligera lambda (ver Tabla 6) se diseñaron para introducir un sitio de restricción Sfil (SEQ ID NO: 1). Las condiciones de reacción fueron como sigue: PCR II : Cadena ligera Lambda Reactivo jaL H20 15.5 lOx solución amortiguadora 2.5 10X Potenciador .2.5 dNTP (10 mM cada uno.) 0.75 Reacción de Etapa I 2.5 Grupo cebador ?? (2 µ?). 2.5 pCALCL(T)R (20 µ?) 1 Pfx50 0.50 25 Las condiciones del termociclizador de PCR para las reacciones de la Etapa II fueron como sigue: 1) 94 °C durante 2 minutos 2) 30 ciclos de: 94°C durante 15' segundos; 52°C durante 20 segundos; 68 C durante 1 minuto 3) 68 °C durante 3 minutos 4) 4°C mantenido Para amplificación de genes de cadena ligera, 2 \iL de cADN generado por Síntesis de Primera Hebra (ver arriba) se usó como una plantilla para amplificar individualmente cadena ligeras kappa y lambda de IgG por PCR. Los ' cebadores delanteros kappa de cadena ligera (ver Tabla 5) se usaron como grupos de cebador .y se diseñaron para introducir un sitio de restricción. Sfil (SEQ ID N0:41) .
Las condiciones de' reacción fueron como sigue: PCR II : Cadena ligera Kappa Reactivo xL H20 16 lOx solución amortiguadora 2.5 10X Potenciador 2.5 dNTP (lOmM cada uno) 0,75 cADN de primera hebra 2 Grupo Cebador VK (9.1 µ?) . 0.5 pCALCK(G)L (20 µ?) 0.25 Pfx50 ' 0.50 25 Las condiciones del termociclizador de PCR para las reacciones de la Etapa II fueron como sigue: 1) 94°C durante 2 minutos 2 ) 35 ciclos de : 94°C durante 15 segundos; 54°C. durante 20 segundos; 68°C durante 1 minuto 3) 68°C durante 3 minutos ) 4 °C mantenido Siguiendo ' la. amplificación, los productos de reacción PCR se separaron en un gel de agarósa al 1% y - la banda correspondiente a la cadena pesada (675 bp) y la cadena ligera (650 bp) se purificaron por extracción de gel (Kít de Extracción de Gel Qiagen; Cat. No. 28706) . Los productos PGR se eluyeron en 30 µ?.
Etapa III. PCR Traslapado En la Etapa III, los segmentos de ADN de cadena pesada y cadena ligera generados en la Etapa II fueron 1) ligados en una reacción de traslape con una ligadura Fab (ver Tabla 7, a continuación) que alinea al extremo 3' de la cadena ligera y el extremo 5' de la cadena pesada y 2) amplificados con los cebadores delanteros e inversos Sfl (ver Tabla 7, a continuación) , por ello permiten la amplificación de un fragmento de anticuerpo de 1200 pares base (bp) que contiene la cadena ligera-ligadura-cadena pesada.
La ligadura Fab Kappa se amplificó, del vector 2gl2/pCAL (SEQ ID NO: 81) al usar ya sea los cebadores FabLigadura-Inv o el Fab Ligadura-Rev-IT* (ver Tabla 7 a continuación) . Las condiciones de reacción PCR para la formación de la ligadura Fab Kappa fueron como sigue: Ligadura Fab Kappa Reactivo L H20 19.75 lOx solución amortiguadora 2.5 dNTP (10 mM cada una) 0.75 vector 2gl2/pCAL (10 ng) 1 ligadura FabCK-Del¦ (20 µ?) 0.25 Cebador Inverso (20 µ?) 0.25 Pfx50 0^5 25 La ligadura Fab Lambda se amplificó del vector 28dll/pCAL (SEQ ID NO: 1636) . Las condiciones de reacción PCR para la formación de ' la ligadura Kappa Fab fueron como sigue: Ligadura Fab Lambda Reactivo H20 lOx solución amortiguadora 5 lOx potenciador 5 dNTP (10 mM cada una) 1.5 vector 28dll/pCAL (10 ng) 1 Ligadura FabCA-Del (20 'µ?) 0.5 .Ligadura Fab-Inv IT* ' (20 µ?) 0.5 25 Las condiciones del termocicli zador de PCR para la formación de las Ligaduras Fab fueron como sigue: 1) 94°C durante 2 minutos 2) 30 ciclos de: 94°C durante 15 segundos; 54°C durante 20 segundos; 68°C ¦ durante 1 minuto 3) 68°C durante 3 minutos 4) 4°C mantenido La reacción PCR se corrió en un gel de agarosa al 1% . y la ligadura de 120 bp se extrajo con gel de acuerdo con el protocolo de Extracción de Gel Qiagen. 2 µ? de la ligadura purificada se usó para ^cada reacción de traslape.
Las condiciones de reacción PCR para Traslape fueron como sigue (los cebadores D/I Sfi se agregan a la reacción PCR después de los primeros 15 ciclos) : PCR III: Traslape Reactivo joL H20 24.5 lOx solución amortiguadora 10X Potenciador dNTP (10 mM cada uno) Producto de cadena ligera Producto de cadena pesada Ligadura 2 Cebadores D/I Sfi (20 µ?) Pfx50 1 50 Las condiciones del termociclizador de PCR fueron sigue: 1) 94°C durante 2 minutos 2) 15 ciclos de: 94°C durante 15 segundos; 68°C durante 1 minuto; Agregar cebadores D/I Sfi (1 pL) , entonces: 3) 9 °C durante 2 minutos 4) 30 ciclos de: 94°C durante 15 segundos; 60°C durante 20 segundos; 68°C durante 2 minutos 5) 68°C durante 3 minutos 6) 4°C mantenido Siguiendo la amplificación, 10 µ? de los 50 µ? totales de producto de reacción de traslape PCR cadena ligera-ligadura-cadena pesada se separó en un gel de agarosa al 1% para determinar el tamaño y el resto de 40 µ? del producto PCR se purificó por el Kit de Purificación PCR Qiagen (Qiage ; Cat . No. 28106) en 30 µ? de volumen total. Brevemente, 5 veces el volumen de reacción PCR de solución amortiguadora PBI se agrega al producto PCR. La mezcla se enlazó a la columna QIA Spin y lavó dos veces con solución amortiguadora PE. La muestra se eluyó en 30 µ? y giró durante 1.5 minutos en velocidad superior para eluir todos los 30 µ?. Alrededor de 1 µg de producto de- traslape fue el rendimiento típico por 50 µ? de reacción de traslape.
Etapa IV. Digestión con Sfi y Clonación ya sea en el vector de expresión CAL o el vector de expresión pCAL IT* Después de la reacción PCR de traslape y purificación del producto PCR, el producto de reacción se digirió con Sfil. Al eluido de 3.0 µ? (ver arriba), lo siguiente se agregó para la digestión: 4 µ? solución amortiguadora de reacción 2 (New England Biolabs) 0.4 µ? BSA 1.6 µ? enzima de Sfil (New England Biolabs) 4 µ? H2O 40µ1 Volumen Total La reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. Después de la digestión, el producto de traslape digerido se separó en un gel de agarosa al 1% y la banda correspondiente para el anticuerpo (-1.45 kB) se purificó por extracción de gel (Kit de Purificación de Extracción de Gel Qiagen Cat. No. 28706) .
Brevemente, la porción de gel se digirió con 500 µ? de solución amortiguadora QC (Qiagen) . 150 µ? de isopropanol se agregó para digerir y la muestra se aplicó a la columna QiaSpin. La columna se lavó dos veces con. solución amortiguadora PE (Qiagen) y la muestra se eluye en 30 µ? de solución amortiguadora EB (Qiagen) . Alrededor de 15 ng/µ? de muestra digerida se recupera desde aproximadamente 1 ^g de producto de traslape PCR.
Finalmente, el producto de traslape digerido se ligó en un vector de expresión bacteriano pCAL (SEQ ID. O: 86) o el vector de expresión bacteriano pCAL IT* (SEQ ID NO: 394). Las condiciones de reacción de ligación fueron como sigue: 25 ng de vector pCAL o pCAL IT* digerido Sfil 25 ng de producto de traslape digerido 2 µ? de solución amortiguadora de reacción de Ligasa T4 1 µ? de Ligasa T4 (NEB Cat . No. MC202L, 400,000 Unidades/ml) ajustado hasta 20 µ? de volumen total con H20 La muestra se ligó durante 1 hora a temperatura ambiente. 1 ul de la ligación se diluyó en 4 µ? de H20 antes de proceder a la transformación.
Etapa V. Transformación en E. coli Después de la ligación, el producto de ligación se transformó en células de Eficiencia Max DH5a ( Invitrogen; · Cat No. 18258; Genotipo: F-cp80lacZAMl5 ? ( IacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdRll (rk-, mk+)p oA supE44 ?-thi-l gyrA96 relAl) . En síntesis, 1 µ? del producto de ligación (1/5 dilución) se agregó a 50 µ? de DH5 e incubó en hielo durante 30 minutos. La transformación se efectúo por choque de calor a 42°C durante 45 segundos seguido por 2 minutos en hielo. 0.9 mL de medio SOC se agregó y las células se permitieron recuperar a 37°C durante 1 hora con agitación. Las células se colocaron en placa en placas LB complementadas con carbenicilina (100 yg/mL) y glucosa 20 mM. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C.
Etapa VI . Selección de colonias individuales .
Para cada amplificación ' de anticuerpos, un total de 88 colonias individuales se seleccio.naron y crecieron en 1 mL de Súper Caldo (SB, por sus siglas en inglés) complementado con 1 carbenicilina (100 pg/mL) en una placa de 96 pozos durante 2 horas a 37°C. Una placa hija se generó al transferir 500 µ? de cada cultivo en otra placa bacteriana de formato de 96 pozos con 500 µ? de SB complementado con glucosa 40 mM (final 20 mM) y 100 ug/ml de carbenicilina. La placa original o madre se alimentó con 500 µ? de SB complementado con 100ug/ml de carbenicilina. La placa original se hizo crecer a 30°C durante la noche y la placa' hija (que contiene glucosa) se hizo crecer a 37 °C durante la noche. El lisado celular de .la placa a 30 °C se usó paira ELISAs bacterianas (ver Ejemplo 4 a continuación) y los cultivos de placa a 37 °C se usaron para preparación de ADN mini-prep (Qiagen) .
Resumen Los cinco pozos identificados como aciertos se amplificaron usando cebadores de. cadena ligera kappa y clonaron en el vector de expresión pCAL. Los diez pozos identificados como aciertos en la Sección B anterior se amplificaron con cebadores kappa de cadena ligera y .se clonaron dentro del vector de expresión pCAL IT*. Se amplificó adicionalmente un pozo con cebadores de cadena ligera lambda y se clonaron dentro del vector de expresión pCAL IT*.
Ejemplo 3 Aislamiento de Anticuerpos Fab anti-RSV por Clasificación de Célula Sencilla En este ejemplo, los anticuerpos anti-RSV se aislaron de células positivas CD19/CD27/IgG. Las células positivas CD19/CD27/IgG se obtuvieron por 1) aislamiento de células B; y 2) clasificación de célula sencilla FACS. Las células clasificadas luego se usaron para aislar ARN que sirve como una plantilla para la producción in vi tro de anticuerpos Fab.
Aislamiento de células B Las células B se aislaron de PBMCs (cosechadas de un donador de banco de sangre anónimo) usando un Kit de Aislamiento de Células B (Miltenyi Biotec, Cat. No. 130-091-151). El kit se usa para aislar células B altamente puras por etiquetado y reducción magnética de células que expresan CD2, CD14, CD16, CD36, CD43,- y CD235a (células B activadas, células de plasma y. células CD5+ B-la) y células no B (por ejemplo, células T, células NK, células dendriticas, macrófagos, granulocitos, y células eritroides) . De acuerdo con el protocolo del fabricante, las células no B se etiquetaron indirectamente de forma magnética al usar un coctel de anticuerpos monoclonales conjugados con biotina como un reactivo etiquetado primario (Coctel de Biotina-Anticuerpo) y anticuerpo monoclonal anti-biotina conjugado a microperlas como un reactivo. etiquetado secundario (Microperlas Anti-Biotina) . Las células no- B' luego se removieron de las células B en reposo puras por separación magnética.
Brevemente, las PMBCs congeladas, obtenidas' a partir de separación Ficoll, .se descongelaron, lavaron dos veces y contaron. Las células luego se centrifugaron en 300 g durante 10 minutos, y el sobrenadante se aspiró. El peletizado celular se volvió a suspender en 40 µ? de solución amortiguadora MACS (por cada 107 células) y se agregó 10 µ? de coctel .de Biotina-Anticuerpo (por cada 107 células) . Después de la mezcla completa, las . células se incubaron a 4°C durante 10 minutos. Después del periodo de incubación, 30 µ? de solución amortiguadora .(por cada 107 células) y se agregó 20 µ? de Microperlas de Anti-Biotina (por cada 107 células) . Después de la mezcla completa, las células se incubaron a 4°C durante 15 minutos. Las células luego se lavaron al agregar 1-2 mL de solución amortiguadora (por cada 107 células) seguido por centrifugación a 300 g. durante 10 minutos y el sobrenadante se aspiro. Hasta 10 células luego se volvieron a suspender en 500 µ? de solución amortiguadora.
La separación magnética se efectuó al colocar una columna LS (compuesta de esferas ferromagnéticas cubiertas con un recubrimiento plástico para permitir separación rápida y suave de células) en el campo magnético de un separador MACS. La columna LS se lavó . con 3 mL de solución amortiguadora y la suspensión celular se. aplicó a la parte superior de la columna. Las células B no etiquetadas se recolectaron ya que pasaron a través de la columna después de la adición de 3 x 3 mL de solución amortiguadora.
Clasificación de células sencillas En este ejemplo, las células B aisladas se clasificaron por especificidad de antigeno usando un Citómetro de Flujo FACS Aria (BD Biosciences ) . Las células seleccionadas fueron CD19/CD27/IgG positivo. El. antigeno RSV-F se etiquetó con Flúor Alexa 647 siguiendo la instrucción de los fabricantes (Molecular Probes,- A-20186) .
En síntesis, las células B aisladas se colocaron en alícuotas en 16 tubos separados. Catorce tubos reciben IxlO5 células y se usaron para determinar los ajustes del fotomultiplicador y parámetros de clasificación en el FACS Aria. Las 1.8xl06 células restantes se etiquetaron con Flúor Alexa 647/RSV-F a una concentración final de 20 nM. La proteína etiquetada se agregó a la muestra 15 minutos antes de la adición de- los anticuerpos. Los anticuerpos CD19 y CD27 se usaron en la dilución de 1:20 mientras que el anticuerpo IgG se usó en una dilución de 1:50. Después de la adición de Flúor Alexa 647/proteína F de RSV y anticuerpos, los tubos se incubaron en hielo durante 30 minutos y se lavaron posteriormente dos veces. La clasificación de célula sencilla se efectúo usando el Citómetro de Flujo FACSAria (BD Biosciences).' Las etiquetas incluyen PE-Cy5 (CD19 anti-humano) , . PE-Cy7 (CD27 anti-humano) , PE (Fcg de IgG anti-humano de cabra), Pacific Blue (CD3 anti-humano de ratón), FITC (IgD antihumano de ratón, IgM anti-humano de ratón, IgA- anti-humano de ratón y CD14 anti-humano de ratón), yoduro de propidio y Flúor Alexa 647 (proteína F de RSV etiquetada) .
La clasificación' celular se realizó primero por células muertas excluidas seguido por exclusión de células positivas CD3. Las células CD19 y CD27 se identificaron además y dentro de esta población, las células se cerraron para expresión Fcy IgG. Las células que expresan IgD,. IgM e IgA se excluyeron de las células restantes. Finalmente, las células positivas Fcy CD19/CD27 / IgG se clasificaron para enlace RSV-F y cada célula B positiva se depositó en un pozo individual de una placa' de 96 pozos que contiene 2 µ? de solución amortiguadora de reacción de cADN (Superscript III 10X solución amortiguadora, Invitrogen; Cat No. 19090-051), 0.5 µ? de RNasaOUT y 7.5 µ? de agua estéril. Las placas se almacenaron a -80°C hasta procesado adicional.
Síntesis de cADN de Primera Hebra Después de la clasificación, cADN se generó individualmente en cada pozo de acuerdo con el . protocolo de Síntesis de Primera Hebra Invitrogen. En síntesis, 0.5 µ? de ??-40 al 10%, 1 µ? de cebador oligo dT y 1 µ? de dNTPs se agregaron a cada pozo y la placa se incubó a 65°C durante 5 minutos seguido por incubación en hielo durante 1 minuto. Posteriormente, 2 .µ? de DTT, 4 µ? de MgCl2 y 1 µ? de Superscript III RT se agregaron y la mezcla de reacción se incubó a 50°C durante 1 hora seguido por incubación a 85°C durante 5 minutos. El cADN se usó inmediatamente o congeló a -80°C durante almacenamiento de larga duración.
Amplificación de Cadena ligera Kappa y Cadena pesada de IgG Las cadenas pesadas de IgG y cadenas ligeras kappa se generaron posteriormente por cuatro etapas secuenciales de PCR.
Etapa 1. Amplificación En la Etapa 1, 2.5 µ]_, de cADN generado por Síntesis de Primera Hebra (ver arriba) se usó como una plantilla para amplificar individualmente cadenas ligeras kappa .y cadenas pesadas IgG por PCR. En esta etapa, los grupos de los cebadores de la Etapa 1 se utilizaron (ver Tablas 8 y 9 a continuación). Las condiciones de reacción fueron como sigue: PCR Etapa I: H20 16 lOx solución amortiguadora. 2.5 10x Solución amortiguadora potenciadora 2.5 dNTP (10 mM cada uno) 0.75 cADN 2.5 grupo de la Etapa .1 (20 µ? cada uno) 0.25 Cebador inverso (20 µ?) 0.25 Pfx50 0.25 25 L Las condiciones del termociclizador de PCR fueron como sigue: 1) 94 °C durante 2:00 2) 10 ciclos de: 9 °C durante 0:15; 62 °C durante 0:20 (ANOTACIÓN); 68 °C durante 1: 00 3) 40 ciclos de: 94°C durante 0:15; 52°C durante 0:20; 68°C durante 1:00 4) 68 °C durante 3:00 5) 4°C mantenido Las mezclas de reacción se usaron como ADN de plantilla para la Etapa II . (ver a 'continuación) sin- ninguna purificación adicional.
Etapa II . Amplificación En la Etapa II, las mezclas de reacción de la Etapa I se usaron como plantillas para las segundas reacciones PCR con grupos de cebadores delanteros e inversos para ya sea la cadena ligera o cadena pesada, respectivamente. ' Estas reacciones amplifican el ADN de la región de estructura 1. de cada cadena. Los cebadores delanteros de cadena ligera (ver Tabla 10 ) se diseñaron para introducir un sitio de restricción Sfil (SEQ ID NO: 41 ) . Las condiciones de reacción fueron como sigue: PCR II : Cadena ligera H20 . 15 . 75 lOx solución amortiguadora 2 . 5 10X Potenciador 2.5 dNTP (10 mM cada uno) 0.75 reacción de Etapa I 2.5 grupo cebador Vk (9.1 µ?) 0.5 pCALCK(G)L (20 µ?) 0.25.
Pfx50 0.25 : 25 ]i Los cebadores delanteros de cadena pesada (ver Tabla 11) se diseñaron para introducir un sitio de restricción' Salí (SEQ ID NO: 96) . Las condiciones de reacción fueron como sigue: PCR II: Cadena pesada H20 14.25 lOx solución amortiguadora 2-.5 10X Potenciador 2.5 dNTP (lOmM cada uno) 0.75 reacción de Etapa I 2.5 grupo pCAL24VH-F (2 µ?)' 2 grupo Sail JH-Inv (20 µ?) 0.25 Pfx50 0.25 25 pL Las condiciones del termociclizador de PCR fueron como sigue: 1) 9 °C durante 2 minutos 2) 50 ciclos de: 94 °C durante 15 segundos; 54°C durante 20 segundos; 68°C durante 1 minuto 3) 68 °C durante 3 minutos 4) 4°C mantenido Siguiendo la amplificación, los productos de reacción PCR se separaron en un gel de agarosa al 1% y - la banda correspondiente a la cadena pesada (400 bp) y la cadena ligera (650 bp) se . purificaron por extracción de gel (Qiagen) .
Etapa III. FCR de Traslape En la Etapa III, los segmentos de ADN de cadena pesada y cadena ligera generados en la etapa II fueron: 1) ligados en una reacción de traslape con una ligadura Fab (ver Tabla 12, a continuación) que alinea al extremo 3' de la cadena ligera y el extremo 5' de la cadena pesada y 2) amplificados con un cebador delantero Sfi (ver Tabla 12, a continuación) que alinea al extremo 5' de la cadena ligera y cebadores inversos JH (ver Tabla 11, de arriba)' que alinea al extremo 3' de la cadena pesada, por ello permite la amplificación de un fragmento de anticuerpo de 1200 pares base (bp) que contiene la cadena ligéra-ligadura-cadena pesada. Las condiciones de reacción fueron como sigue (la ligadura se generó como se describe en el Ejemplo 2 de arriba) : H20 24.5 lOx solución amortiguadora 10X Potenciador dNTP (10 mM cada uno) Cadena ligera Cadena pesada Ligadura 2 Cebadores Sfi F/JH-R' (.20 µ?) Pfx50 1 50 pL Las condiciones del termociclizador PCR fueron sigue: Traslape con Ligadura 1) 94 °C durante 2 minutos 2) 15 ciclos de: 94 °C durante 15 segundos; 68 °C durante 1 minuto Agregar cebadores 3) 94°C durante 2. minutos 4) 30 ciclos de: · 94°C durante 15 segundos; 60°C durante 20 segundos; 68°C durante 1 minuto 5) 68 °C durante 3 minutos 6) 4°C mantenido Siguiendo la amplificación, el producto de reacción PCR cadena ligera-ligadura-cadena pesada se separó en un gel de agarosa al 1% y se purificó por extracción de gel (Qiagen) .
Etapa IV. Introducción de la región CH1 Después del traslape, la cadena ligera-ligadura-cadena pesada amplificada se digirió con Sal I y ligó a una región 1 constante de cadena pesada digerida Sal I (región CHyl) que introduce un sitio de restricción Sfil en el extremo 3' de la región constante de cadena pesada. Las condiciones de reacción de ligación fueron como sigue: 2 µ? de solución amortiguadora de reacción de ligación 2 µ? de CH1 5 µ? de 1.2 kB de producto purificado con.- gel de la etapa III 10 µ? de agua 1 µ? de ligasa T4 La mezcla de reacción de ligación¦ se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de la ligación, el Fab de longitud completa se amplificó por PCR con Cebadores delanteros e inversos Sfil (ver Tabla 12, a continuación) resultando en un fragmento 1.45 kb. Las condiciones de reacción fueron como sigue: H20 . 31.5 lOx solución amortiguadora 5 10X Potenciador 5 dNTP (lOmM cada uno) 1.5 mezcla de reacción de ligación 5 cebadores Sfi D/I (20 µ?) ' 1 Pfx50 1¦ 50 \i Las condiciones del termociclizador de PCR fueron como sigue: 1) 94 °C durante 2 .minutos 2) 30 ciclos de: 94 °C durante 15 segundos; 60°C durante 20 segundos; 68°C durante 1 minuto 3) 68 °C durante 3. minutos 4 ) 4 °C mantenido El producto de reacción fue un fragmento de 1.45 kB de una cadena ligera y cadena pesada ligadas juntas en un cásete sencillo.
Etapa V. Digestión con Sfi y Clonación en vector de expresión pCAL Después de la reacción PCR de traslape y purificación del producto PCR, el producto de reacción se digirió con Sfil. A los 30 µ? de eluido (ver arriba), lo siguiente se agregó para la digestión: 4 µ? de solución amortiguadora 2 de reacción (New England Biolabs) 0.4 µ? de BSA 1.6 µ? de enzima Sfil (New England Biolabs) 4 µ? de H20 40 µ? de Volumen Total La reacción se incuba durante 1 hora a 37 °C. Después de la digestión, el producto de traslape digerido se separó en un gel de agarosa al 1% y la banda correspondiente al anticuerpo (-1.45 kB) se purificó por extracción de gel (Kit de Purificación de Extracción de Gel Qiagen Cat . No. 28706) . Brevemente, la porción de gel se digirió con 500 . µ? de solución amortiguadora QC (Qiagen). 150 µ? de isopropanol se agregaron para digerir y la muestra se aplicó' a la columna QiaSpin. La columna. se lavó dos veces con solución amortiguadora PE (Qiagen) y la muestra se eluye · en 30 µ? de solución amortiguadora EB (Qiagen) . Alrededor de 15 ng/µ? de muestra digerida se recupera desde aproximadamente 1 µ? de producto de traslape PCR.
Finalmente, el . producto de traslape digerido se ligó en un vector de expresión bacteriano pCAL (SEQ ID NO: 86). Las condiciones de reacción de ligación fueron como sigue: 25 ng de vector pCAL. digerido por Sfil 25 ng de producto de traslape digerido 1 ul de Ligasa T4 (NEB Cat. No. MC202L, 400,000 Unidades/ml) 20 µ? de volumen total La muestra se ligó durante 1 hora a temperatura ambiente. 1 µ? de la ligación se diluyó en 4 µ? de H20 antes de proceder a la transformación.
Etapa VI. Transformación en E. coli Después de la ligación, el producto de ligación se transformó en Células de Eficiencia Max DH5a (Ihvitrogen; Cat No. 18258; Genotipo: F- cp801acZAMl5 ? ( lacZYA-argF) U169 recAl endhl hsdRll (rk-, mk+) phoA supE44 ?- thi-1 gyrA96 relAl) . En síntesis, 1 µ? del producto de ligación (1/5 dilución) se agregó a 50 ul de DH5a e incubó en hielo durante 30 minutos. La transformación se efectúo por choque de calor a 42°C durante 45 segundos seguido por 2 minutos en hielo. 0.9 mL de medio SOC se agregó y las células se permitieron recuperar a 3 °C durante 1 hora con agitación. Las células se colocaron en placa en placas LB complementadas con carbenicilina (100 pg/mL) y glucosa 20' mM. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C .
Etapa VII . Selección de colonias individuales .
Un total de 88 colonias individuales se seleccionaron e hicieron crecer En 1 mL Súper Caldo (SB) complementado con 1 carbenicilina (100'pg/mL) en una. placa de 96 pozos durante 2 horas a 37°C. Una placa hija se generó al transferir 500 µ? de cada cultivo en otra placa bacteriana de formato de 96 pozos con 500 µ? de SB complementado con glucosa .40 mM (final 20 mM) y 100 g/ml de carbenicilina. La placa original o madre se alimentó 500 µ? de SB complementado con 100ug/ml de carbenicilina . La placa, original se hizo crecer a 30°C durante la noche y la placa hija (que contiene glucosa) se hizo crecer a 37°C durante la noche. El lisado celular de la placa a 30°C se usó para ELISAs bacterianas (ver Ejemplo 4 a continuación) y los cultivos de placa a 37 °C se usaron para preparación de ADN mini-prep (Qiagen) .
Ejemplo Anticuerpo Enlazado a la Proteina F de RSV En este ejemplo, los anticuerpos Fab generados en los Ejemplos 2 y 3 se probaron por su capacidad para enlazar a lisado Fl de RSV purificado por ELISA. Brevemente, 50 L de lisado celular bacteriano diluido 1 volumen en 3 volumes total con PBS/BSA al 3%/Tween20 al 0.01% se agregó a una pica ELISA de 96 pozos previamente recubierta con lisado Fl de · RSV (ver Ejemplo 1, de arriba) . La placa se incubó a 37 °C durante 2 horas, o alternativamente a 4°C durante la noche, seguido por lavado 4x con solución amortiguadora de lavado (PBS/Tween20 al 0.05%) . 50 \iL de anticuerpo F (ab) -HRP IgG anti-humano de cabra (Jackson Labs Cat. No. 109-036-097) diluido 1:1000 en PBS/BSA al 3%/Tween20 al 0.01% se. agregó y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora. Después del lavado 6x con solución amortiguadora de lavado, 50 L 1:1 v/v TMB: solución de peróxido (Pierce, Cat No. 34021) se agregó y se permitió para desarrollarse durante 7 minutos. La reacción se detuvo inmediatamente por la adición de 50 µL de H2SO4 2N y la absorbancia en 450 nm- se midió usando un lector de placa ELISA. El enlace positivo se indicó por un OD450 mayor que 0.5 (0.5-0.9 es enlace moderado, >1 es enlace fuerte) y una respuesta que fue 3 veces arriba del fondo.
Además de enlazar el lisado Fl de RSV, varios antigenos de control positivo y negativo también se utilizaron. El plasma de un grupo de donadores del Banco de Sangre (recolectado y congelado' después de la separación Ficoll Hypaque, diluido. 1:1000) se usó como un control positivo para enlace de lisado Fl de RSV. Como un control positivo para determinar que cada lisado celular bacteriano contiene un Fab intacto, una anticuerpo F(ab)2 anti-humanó de cabra Affinipure (1 µg/ml Jackson Immunoresearch Cat. No. 109-006-097) se- usó para recubrir una placa ELISA de 96 pozos para capturar el Fab intacto. Este enlace de anticuerpo sólo para la porción F(ab) de un anticuerpo IgG. La expresión Fab luego se detectó. al usar Peroxidasa anti-HA (Roche, Cat. # 12013819001; los Fabs expresados bacterianos tienen una etiqueta HA). La actina (1 µg/ml, Sigma Cat. No. A3653) se usó como un control negativo para enlace Fab a cualquief proteina y como un control positivo para la reacción ELISA usando anticuerpo anti-áctina de ratón (1.25 g/ml, Sigma Cat. . No. A3853) y anticuerpo F ( ab) -HRP de IgG anti-ratón de cabra (Santa Cruz Biotech Cat. No. SC3697). El mAb anti-RSV de ratón (clon 2F7, fluido de ascitos de ratón, Cat. No. ab43812, Abeam) también se incluyó como control negativo para especificidad de enlace a la proteína F de RSV ya que este anticuerpo se empleó para enlazar. la proteína F de RSV a la placa ELISA y de esta manera se presentó en las placas ELISA durante la selección de los anticuerpos anti-RSV humanos.
A. Enlace de Usados celulares para Fa s generados de Células B transformadas por EBV (ver Ejemplo 2, Secciones A y C, cadenas ligeras kappa, clonadas en el vector pCAL) Ochenta y ocho (88) lisados celulares generados en el Ejemplo 2 de arriba, se probaron por ELISA por su capacidad para 1) enlazar a un anticuerpo anti-Fab; y 2) enlazar el lisado Fl de RSV.. ELISA confirma que 76 de 88 lisados celulares fueron positivos para producción Fab aunque 59 de los 88 lisados celulares enlacen el- lisado F de RSV. El ELISA de confirmación revela que 72 de los 76 lisados celulares fueron es más producidos Fab y 46 de los 59 impactos positivos iniciales se reconfirmaron como enlazadores para el lisado F de RSV.
Tres de los enlazadores positivos se identificaron por procesamiento de secuencia de ADN de la p .ep de ADN correspondiente. El proceso por secuencia revela que todos tienen la misma secuencia, identificada como Fab 58c5, que tiene las siguientes cadenas ligeras y pesadas: Fab 58c5 Cadena ligera ElVMTQSPSSLSASIGDRV ITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSR FTGSGYGTDFSV ISSLQPEDIATYYCQQYQYLPY FAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5) Cadena pesada QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGAS INSD YY TWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNT YYTPSL SRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTÁADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDS GQG TQVTVSSAST GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT VDKKVEPKSC (SEQ ID NO: 1) B. Enlace de Usados celulares para Fabs generados de la clasificación de célula sencilla (ver Ejemplo 3) Los resultados indican que 64 de. 88 Usados celulares generados en el Ejemplo 3 enlazan la proteína Fl de RSV. Veinticuadro . enlazadores positivos se identificaron por porcesado por secuencia ADN de . la prep ¦ de ADN correspondiente.
Uno de los enlazadores positivos identificados fue Fab sc5 que tiene las siguientes cadenas ligeras y pesadas: Fab sc5 Cadena ligera DIQMTQSPSSLSASVGDRV l CRASQNIKNYLNWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYSCQQSYNNQLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13) Cadena pesada QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCTVSGDS I SGSNWWNWVRQPPGKGLEWIGEIY.YRGTTN YKSSLKGRVTMSVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGGRSTFGPDYYYYMDVWGRG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC ' (SEQ ID NO: 9) C . Enlace de Usados celulares para Fabs generados de células B transformadas por EBV (ver Ejemplo 2, Secciones B y C, cadenas ligeras kappa y lambda, clonada dentro del vector pCAL IT*) Para los¦ siguientes experimentos, se realizaron los ensayos ELISA como se describió anteriormente¦· con las siguientes modificaciones: sobrenadante bacteriano expresando 58c5 y sc5 Fab se usaron como controles positivos para enlazar al lisado Fl de RSV (fuente recombinante) y Usado HEp2 (fuente RSV F nativa), respectivamente, en .una dilución 1:3 en PBS gue contiene BSA al 3%· y Tween20 al 0.01%..
Fab 30D8 Para 30D8, 77 Usados celulares generados en el Ejemplo 2 de arriba se probaron por ELISA por su capacidad para 1) enlazar a un. anticuerpo anti-Fab; y 2) enlazar el lisado Fl de RSV. ELISA confirma gue 70 Usados celulares fueron positivos para producción Fab aunque 63 de los 77 lisados celulares enlacen el lisado F ' de RSV. El ' ELISA de confirmación en 8 clones revela que 8 de los 8 lisados celulares estuvieron de hecho produciendo Fab y 6 de los 8 aciertos positivos iniciales- se reconfirmaron como enlazadores para el lisado F de RSV. Tres de los enlazadores positivos se secuenciaron y todos contuvieron el mismo anticuerpo con las siguientes cadenas ligera y pesada (30D8) : Cadena ligera QSVII¾ASSVSVAPGQTAR1TCGAN ATLTlSPA'EA'SDEADYYCqvWDS&RDQAVIF^ ;5?G??d??t???3??053???????G?t·?'5?0d?{?????55?^^????·??5??5?8?d ???a$G??? TLAPTECS (SEO ID NO: 395) Cadena pesada &VQLLQ5GAEL KPGASVKISCKTSGF^ :m«iDT5TST YMELR5^ TSGGTA¾LGC VKDi PEPVTySWt5SGALTSGVHT?PAVLQSSGL SLSSVVTVFSSSLGTQ?YICMVlí a K s MT K DKP.V Ee KSC ; S EQ I D .. JO : 3 & 6 ) Fab 104E5 Para 104E5, 88 Usados celulares generados en el Ejemplo 2 de arriba se probaron por ELISA por su capacidad para 1) enlazar a un anticuerpo anti-Fab; y 2) enlazar el lisado Fl de RSV. ELISA confirma que 15 Usados celulares fueron positivos para producción Fab aunque 4 de los 88 lisados celulares enlacen el lisado F ' de RSV. El ELISA de confirmación en 24 clones revela que 10 de los 24 lisados celulares estuvieron de hecho produciendo Fab y 7 de los 24 aciertos positivos iniciales se reconf irmaron como enlazadores para el lisado F de RSV. Dos de los enlazadores positivos se secuenciaron y todos contuvieron el mismo anticuerpo con las siguientes cadenas ligera y pesada (104E5) : Cadena ligera MQHTQSPS SL PASVGDRVTITC fiASQNIKTY LHWYQCfK PGRAP L LT SAVSNLQSGV PS RFSGTGSGT DFTLT'ISSL'QPEDFATYYCQQSFSI PLT FGGGA VEIKRTVAAPSVFI FPPS0EQLK3G'TASVVCÍJLKH>T FY F AKVGWKyDNALQSGHSQES TEQDSKDOT SFNRGEC 'SEQ ID NO: ") Cadena pesada •QVQ L ClSGAEV K PGS SVKVSCK PSGGT F'DT Y T 13 WV'RQ A GQB LEWLG I PSLGETNYAHKLQGP.VT Fab 38F10 Para 38F10, 88 lisados celulares generados en el Ejemplo 2 de arriba se probaron .por ELISA por su capacidad para 1) enlazar a un anticuerpo anti-Fab; y 2) enlazar el lisado Fl de RSV. ELISA confirma que 65 lisados celulares fueron positivos para producción Fab aunque 40 de los 88 lisados celulares enlacen el lisado F de RSV. El ELISA de confirmación en 16 clones revela que 13 de los 16 lisados celulares estuvieron de hecho produciendo Fab y 13 de los 16 aciertos positivos iniciales se reconfirmaron como enlazadores para el lisado F de RSV. Cinco de los enlazadores positivos se secuenciaron y todos contuvieron .el mismo anticuerpo con las siguientes cadenas ligera y pesada (38F10) : Cadena ligera DIOLTQSP E'TLSASVG DRV£MTCRA¿'¾>S I StWLAWYQQKPGKAPKLLI QKASNLEDGV PSRF.TASG.~GT EFTLTIS3LOPD b".¾TYY OQYí\iSYSGL5FGGGTKVDI RTVAAPS7GI F?PS EQLKSGTA V CLLíl KZ JRC~EC i $t.Q T Cv : 309 ! Cadena pesada EVQLLESGGDVVQPG S L L5CTASGFG ITDFGIHWVRQAPGKGLEWVkLI SYfJEVNIHYGESVRGRFT I SRDl???? ?LQMNGLRPED'TGVYFCftRDVWEDSWLSLACPQEWGQGSLVVV3SASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGT^LGCLVKDYFPEPVrvSWNSGALTSGVHTF-PaVLQSSSLYSLSSVVrVPSSSLGTQTyiC MVWBKPSI-IT VD KVEPKSC [S Q JO NOH 0} Fab 1463 Para 14G3, 88 lisados celulares generados en el Ejemplo 2 de arriba se probaron por ELISA por su capacidad para 1) enlazar a un anticuerpo anti-Fab; y 2) enlazar el lisado Fl de RSV. ELISA confirma que 71 lisados celulares fueron positivos para producción. Fab aunque 13 de los · 88 lisados celulares enlacen el' lisado F de. RSV. El ELISA de confirmación en 16 clones revela que 14 de los 16 lisados celulares estuvieron de hecho produciendo Fab y 5 de los 16 aciertos positivos iniciales se reconfirmaron como enlazadores para el lisado F de RSV. Cuatro de , los enlazadores positivos se secuenciaron y todos contuvieron el mismo anticuerpo con las siguientes cadenas ligera, y pesada (14G3) : Cadena ligera Cadena pesada QVQLQFJ5GPGLV PSQTLSLTCTVSG SISSD.fflYWSNIRQPPG GLEWI¾$? YYTCGT ??? PSLKS L .^SIOTSGDQFSL LSSVTAADTAVYycyRGL FITAP^PYIftTFDLWGRGTLVAVSSSS'I.KGPSVFPLAP S£ KSTSGGTAALGCLVKOY G? EPVTVSWN SG ALfSGVflT FPAVLQSSGL YSL^SV TVPSSSLGTQT*I NVHKKPSHT v'DKRVEPKSC (SEO ID NO i 4 02 ) Fab 90D3 Para 90D3, 88 lisados celulares generados en el Ejemplo 2 de arriba se probaron por ELISA por su capacidad para 1) enlazar a un anticuerpo anti-Fab; y 2) enlazar el lisado Fl de RSV. ELISA confirma que 80 lisados celulares fueron positivos para producción Fab aunque 2 de los 88 lisados celulares enlacen .el' lisado F de RSV. El ELISA de confirmación en 8 clones revela que 7 de los ,8 lisados celulares estuvieron de hecho produciendo Fab y 3 de los 8 aciertos positivos iniciales se reconf'irmaron como enlazadores para el lisado F de RSV. Dos de los enlazadores positivos se secuenciaron y todos contuvieron el mismo anticuerpo con las siguientes cadenas ligera y pesada (90D3) : Cadena ligera AIFÁTQSPSSLSASVCDRVSITéR^QS^ D f G LT 15 £ LQ ?? DFAT ? YCQQ G ? I S L Y T FGQG T KL E I KRTVAAPS V F I FP PS DEQLKSGT A S WC L LN N FY PRSAKVQW V DNALQStí NSQSSV EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADi'EKHKVY ACEVTHQGÍJS SPVTK SFNRGEC {$EQ 10 RO:403) Cadena pesada Q VQ1M ES GG GLV PGGS LR LSC VG= G FTLKN YEMKWV QAPGQGLQY í SY I S S SG NW Y 7DS vrQ G F SrSGGTAALGCiV Y F"PSPVrVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL£5S TVPSSSLG QTY CN VH HKPStWCVDKKVBPKSC <SEQ ID MO:404) D . Anticuerpos anti-RSV adicionales Tres anticuerpos adicionales, Fabs 56E11, 17C9, y 69F6, se aislaron como se describe en el Ejemplo 2, Secciones B y C arriba, uso amplificado de cebadores tanto para las cadenas ligeras de kappa como de lambda. Las secuencias de las cadenas ligera y pesada se establecen a . continuación .
Fab 56E11 Cadena ligera Cadena pesada Pa 17C9 Cadena ligera El LTQSPSTLSASVCtD VTlTCBASQNINTO DFTLT-13NLQPE DFAT YFCQQANS FP T FGQGT VEWJíT V PS VFI FPPS DEQLKSGTAS WCLLNN FYPR-LWQ^mALQSGHSQESVTEQDSKDSTYSL^^ SFNRGEC (SEQ ID NO: 455) Cadena pesada QV LC¾WGAGLVR?SETI.SLTCAyYGr>SFWDYrrtTWIRQ PGKGLEWIGElSHSGSTKY.£PSL SRVTI S V OT S KMQFSL LSAV AAOTT VY FCARGVRSRPPPSYRGSGSPPY Y H GKDWSQGm'T VSSASTKG í^VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVW S LGT Y ÜCWVHH PSílTKVDKRVEPKSC ^SEQ I D >:Q : 45 ? ) Fab 69F6 Cadena ligera E I V LTQSPS SLS AS V DRVTI SCQASQOT SNYLNWYQQ PGKAPRLLI DA3 Y LDTGVPSSFSGSGSG DFTFTI S3LQPEDFA7 YYCQQYDOLRGGFTE^PGTKVDVKRl '.'AAPSVFI FPPS DBQLKSGTAS CLL RNFYPRSA ^QWXVDi^ALQSGKSQESVrEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV 7K3FNRGF.C '. SEQ ID NO: 457) Cadena pesada QMQLVQSGAEVR PGESLKIAC GSGYSFTSYWIA^JV¾QMPGKGL'EÍ?íiGIIFPRDSDATYSPSFOGQV-T MSVDKSISTAYLQWNSL ASDTAVYFCARQYYLGSFF.SWGQG?TV VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS.G GTAALGCLV DYFP£PVTVS«NSGALTSGVHTFPA\O.QSSGl.YSLSSWTV^SSSLG QTYICeiVtIH P SNTKVDK VEPKSC [SEQ T D NO : 4 S fij Los dominios de anticuerpo y regiones de Fabs aislados se proporcionan en la Tabla 13A-13C a continuación.
Tabla 13 A. Dominios de anticuerpo y regiones CDR de Fabs aislados [Tabla 13B. CDR1 de cadena pesada (numeración Kabat) ? Ejemplo 5 Expresión y Purificación de Fabs Aislados En este ejemplo, los anticuerpos Fab individuales que se determinaron para enlazar lisado F de RSV por ELISA usando lisado celular se expresaron y purificaron posteriormente de las. células bacterianas usando cromatografía de columna.
El ADN que codifica cada anticuerpo Fab individual se transformó en células Top 10 (Invitrogen) para- expresión. Cada anticuerpo Fab se' hizo crecer en 2 L de SB a 37 °C a un OÜ6oo de 0.8. La expresión de proteína se indujo por la adición de IPTG 1 mM y se permitió ocurrir durante la. noche a 30°C. Después de la expresión, los cultivos bacterianos se centrifugaron y el peletizado celular se volvió a suspender en 10 mL de Solución Amortiguadora Salina de Fosfato (PBS) con inhibidores de proteasa (Coctel de Inhibidor de Proteasa Completo, Santa Cruz Biotech, Cat . # sc-2913l . La lisozima (0.2 mg) se agregó a las células resuspendidas y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lisaron por dos ciclos de congelación/descongelación. En síntesis, las células bacterianas resuspendidas se congelaron en un baño de etanol/hielo seco seguido por descongelación en un baño de agua a 37°C. Una vez lisado, el lisado bacteriano se centrifugó a 18000 rpm y el sobrenadante se filtró y esterilizó al pasar a través de un filtro de Ó.4 raicrones.
Cada anticuerpo Fab individual luego se purificó por cromatografía de columna de afinidad. En síntesis, el sobrenadante filtrado se- pasó, lentamente sobre una columna anti-Fab/Proteína A permitiendo que la prot.eína . Fab se enlace. Después del lavado con 50 mL de PBS, el Fab enlazado se eluyó con 9 mL de glicina 0.2 M, pFI 2.2 y se recolectó en un tubo cónico que contiene 1. mL de Tris 2M, por ello neutraliza la proteína eluida. El Fab eluido luego se dializó usando un cásete de diálisis 10K MWCO (Pierce) contra 4 L de PBS. La proteína se almacenó a 4°C durante la noche y concentró posteriormente a un volumen de 1 mL usando un Filtro. Amicon Ultra 10 kDa (Millipore) . El enlace de cada anticuerpo Fab purificado al lisado F de RSV (fuente recombinante, Ejemplo 1A) y lisado HEp2 (fuente nativa, Ejemplo IB) luego se volvió a confirmarse por ELISA (ver Ejemplo 4 de arriba) . Adicionalmente, cada anticuerpo Fab purificado se probó por su capacidad para neutralizar RSV usando el ensayo descrito en el Ejemplo 6.
Enlace de Fabs 58c5 y sc5 para lisado F de RSV y proteina F de RSV purificada El enlace de anticuerpos 58C5 y sc5 para cualquier proteina F de RSV capturada de 293 células transfectadas (recombinante) o proteina F de RSV purificada de células Hep2 infectadas por RSV A2 (nativo) se midió por ELISA. Los resultados indican que Fab 58c5 y Fab sc5 se enlazan a la proteina F de RSV (recombinante) en una manera dependiente de dosis pero sólo sc5 fue. capaz de reconocer la proteina . F purificada (nativa) (ver Tablas 14-15 a continuación) .
Enlace de Fabs 30D8, 104E5, 38F10, 90D3 y 14G3 al lisado F de RSV y proteína F de RSV purificada El EC50s estimado para el enlace de Fabs 30D8, 104E5, 38F10, 90D3 y 14G3 se establece en la ' Tabla 16 a continuación. Los Fabs 30D8 y 14G3 ambos enlazan al lisado Fl RSV (recombinante) en un EC50 de aproximadamente 5 n (3.8 nM y 8.2 nM, respectivamente). Los Fabs 104E5 y 90D3 de proteina A2 F de cepa RSV nativa en un EC50 de aproximadamente 80 pM con Fab 38F10 enlazando a la proteina A2 F de cepa RSV nativa en un EC50 de 177 pM.
Enlace de Fabs 56E11, 17C9 y 69F6 a la proteina RSV F purificada Los EC50s estimados para el enlace de Fabs 56E11, ' 1759 y 69F6 se establecen, en la Tabla 16 a continuación. El Fab 56E11 enlaza al lisado Fl de RSV (recombinante.) con un EC50 de 545 pM. Los Fabs 17C9 y 69F6 enlazan al . lisado RSV Fl (recombinante) con un EC50 de 136 pM y 135 pM, respectivamente.
Ejemplo 6 Ensayo de Neutralización RSV En este ejemplo, los anticuerpos anti-RSV se analizaron por su capacidad para enlazar a. y neutralizar virus RSV en solución como se evalúa por un ensayo de reducción de placa. En este ejemplo, el virus RSV y los anticuerpos se pre-incubaron en la ausencia de células objetivo. La mezcla luego se agregó a las células y la infección de virus se midió por un ensayo de reducción de placa estándar descrito en la presente. Los anticuerpos anti-RSV se analizaron por su capacidad para neutralizar varias cepas de virus RSV, incluyendo RSV A2 (ATCC Cat . No. VR-1540), RSV B-lavado (ATCC Cat. No. VR-1580, cepa 18537), y RSV B-l (ATCC Cat. No. 1400) .
Las células Vero (ATCC, cat no: CCL-81; Manassas, VA) se emplearon para infección de célula hospedera. Las células Vero se hicieron crecer en DMEM (HyClone, cat no: SH 30285.01) con suero de bovino fetal al 10% (FBS) ' (HyClone, cat no: SH30070.03), complementado con L-Glutamina al 1% (HyClone, cat no: SH30034.01) y solución de Penicilina-Estreptomicina al' 1% (HyClone, cat no: SV30010) .¦ Las células Vero se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con C02 al 5% y se pasaron dos veces por semana.
En el día 1 del experimento, las células Vero se cultivaron en placas de cultivo celular de 24 pozos. Las células se colocaron en placa a una densidad (aproximadamente IxlO6 células por pozo) que permite la formación de las monocapas celulares (>90% de . confluencia) en el dia 2. En el día 2, cada anticuerpo se diluyó en serie en medio esencial mínimo de Eagle sencillo (EMEM, ATCC, cat no:' 30-2003) (concentraciones de anticuerpo finales probadas: 20 yg/ml, 4 µ?/ml, 0.8 yg/ml, 0.16 µ?/???, 0.032 yg/ml, y 0.006 yg/ml) . El virus RSV también se diluyó en EMEM sencillo a una concentración de 2 x 103 pfu/ml (100 pfu/50 ul) y 110 µ? del virus RSV diluido se agregó a 110 µ? de cada solución de anticuerpo diluido y mezclado por pipeteo. Para la muestra de control del virus, 110 µ? del virus RSV diluido se agregó a 110 µ? de EMEM sencillo. Las mezclas de control de virus o anticuerpo-virus se incubaron a 37°C durante 2 horas. Después de la incubación, el medio de cultivo se decantó de las placas de cultivo celular de 24 pozos que contienen las células hospederas Vero y 100 µ? de la mezcla de control de viruos o virus-anticuerpo pre-incubado luego se transfectó:a cada pozo. Cada prueba y muestra de control se preparó en 50*4 . triplicado. Las células luego se incubaron a 37 °C durante una hora con mezcla cada 15 min.
Después del periodo de incubación, el medio de cultivo que- contiene la mezcla de- control de virus o virus-anticuerpo se aspiró y 1 mi de medio de revestimiento se agregó a cada pozo (medio de revestimiento que contiene EMEM, FBS al 2%, L-glutamina al 1%, metilcelulosa al 0.75%). Las placas de cultivo celular de 24 pozos luego se incubaron · a 37 °C (con CO2 al 5%) durante aproximadamente 72' horas. Las placas celulares se fijaron con formalina al 10% durante' 1 hora a temperatura ambiente, lavaron 10 veces con ddH2Ü y bloquearon con leche seca sin grasa al 5% (NFDM). en PBS con Tween 20 al 0.05%) a 37 °C durante una hora.
Después de la incubación, la solución de bloqueo se decantó y 200 pL dé anticuerpo anti-RSV de ratón (abl0018, Abeam, 1:1000 dilución en NFDM al 5%) se agregó a cada pozo. Las placas se incubaron a 37 °C durante 2 hrs', lavaron 10 veces con ddH20 y 200 µL de IgG conjugado con HRP anti-ratón de cabra (Pierce, Cat. No. 31432 , 1 : 1000 dilución en NFDM al 5%) se agregó a cada pozo. Las placas se incubaron a 37°C durante 2 hrs. Las placas se lavaron 10 veces con ddH20 y 200 pL de sustrato de peroxidasa TrueBlue™ (KPL Cat. No. 50-78-02) se agregó a cada pozo. Las placas se desarrollaron durante 10 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces con ddH20 y secarón en una toalla de papel y el número de placas azules se contó. El ED50 (dilución efectiva para neutralización al 50%) se calculó usando Prism (GraphPad) . La velocidad de reducción de placa se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Velocidad de Reducción de Placa (percentil) = (1 - número de placa promedio en cada dilución de anticuerpo/número de placa promedio en pozos de control de virus) * 100 Los datos se muestran en las Tablas 17 a 19 a continuación. La Tabla 17 enlista el ED50 para cada Fab para las varias cepas RSV. La. Tabla 18 enlista los conteos de placa para las varias- cepas RSV y en las concentraciones variadas para Fab 58c5. La Tabla 19 enlista la velocidad de reducción de placa para Fab 58c5. La tabla 20 'enlista las velocidades de reducción de la placa para los Fabs 56E11, 17C9, 69F6 y 30D8 para RSV A2. Los resultados indican que Fab 58c5 es capaz de neutralizar todas las 3 cepas de RSV aunque Fab sc5 neutraliza sólo RSV A2 y RSV B-l, aunque en concentraciones de anticuerpo mucho superiores. Basados en los datos obtenidos en el ensayo- de neutralización y el peso molecular del fragmento Fab 58c5 (aproximadamente 50 kDa), el ED50 de Fab 58c5 para neutralización in vitro de RSV se estimó para ser aproximadamente 320 pM mientras que el ED50 para Fab 30D8 para' neutralización in vitro de RSV A2 es aproximadamente 3-veces más bajo (107 pM) . El Fab 30D8 es más efectivo contra RSV B-l y RSV B/lavado que Fab58c5.' Tabla 17. Datos de Neutralización ED50 para Fab ND No Determinado D8 se usó como control positivo Ejemplo 7 Clonación y Expresión de IgG En este ejemplo, los anticuerpos Fab que. muestran potencial para neutralizar RSV se convirtieron en IgGs por clonación en el vector de expresión mamífero pCAL (SEQ ID NO: 102). Los cebadores específicos para cada anticuerpo se generaron y las cadenas ligeras y pesadas de cada Fab como se clonaron originalmente ert el vector pCAL (ver Ejemplo 2) se amplificaron por PCR. La amplificación de cadena ligera resulta en un fragmento de 650 bp y la amplificación de cadena pesada resulta en un fragmento de 400 bp. Adicionalmente, una ligadura- se generó que permite traslape de la cadena pesada y la cadena ligera. La ligadura también incluye una región constante de cadena pesada estándar. El traslape de las cadenas ligera y pesada resulta en un cásete de 2.1 kB para cada anticuerpo que tiene sitios de restricción Sfil (SEQ ID NO: 41) en ambos extremos. Cada cásete se digirió con Sfil y clonó en el vector pCALM. Después de la confirmación de la secuencia correcta en las bacterias, el ADN para transfecciones mamiferas se aisló usando un Kit Maxi Prep (Qiagen) .
Para expresar cada IgG, cada vector pCALM se usó para infectar alrededor de 200 millones de células 293F resultando en alrededor de 200 mrcrogramos de IgG. Las células 293F se transfectaron con 293fectina (Invitrogen, Cat. N,o. 51-0031) y se permitieron para producir IgG durante 72 horas. Después de 72 horas después de la transfección, el medio celular se cosechó, centrigufó para remover las células, y se esterilizó por filtro a través de una unidad de filtro de 0.4 mieras. La purificación se efectúo por cromatografía de columna usando una columna de Proteína A. El medio filtrado, que contiene el IgG expresado, se pasó dos veces a través de una columna de Proteína A. Después del lavado con 50 mL de PBS,. IgG se eluyó con 9 mL de glicina 0.2 M en pH 2.2 y se recolectó en Tris 2 M para efectuar neutralización. El eluido se dializó contra 4 litros de PBS usando un cásete de diálisis , de 10 KDa (Pierce) . La muestra se concentró completamente hasta 1 mL con un Amicon Ultra 10 kDa (Millipore) .
Ejemplo 8 Ensayos de Enlace IgG En este ejemplo, las formas IgG de 58c5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 56E11, 17C9 y 69F6 generadas como se describe en el Ejemplo 7 de arriba, y anticuerpo anti-RSV Motavizumab (Wu et al. (2007) J. Mol. Biol. 368 (3) : 652-665) se probaron por su capacidad para enlazar a la proteina F de RSV ( recombinante ) o Usado de proteina F de RSV (nativa) por ELISA (ver Ejemplo 4 de arriba). Los EC50s estimados para enlace (determinado al titular cada IgG) se establecen en la Tabla 21 a continuación. La forma IgG de 30D8 tiene la afinidad más alta para proteina F de cepa A2 de- RSV alrededor de 10-tantos más grande que motavizumab.
Ejemplo 9 Forma IgG de Ensayos de Neutralización RSV 58c5 En este ejemplo las formas IgG de 58c5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 56E11, 17C9 y 69F6 generadas en el ''Ejemplo ' 7 de arriba, y motavizumab de anticuerpo anti-RSV ( u et al. (2007) J. Mol. Bio. 368 (3) : 652-665) se probaron por su capacidad para neutralizar varias cepas de RSV. Adicionalmente , la forma IgG de 58c5 se analizó por su capacidad para neutralizar varios mutantes de escape RSV resistentes al anticuerpo monoclonal (MARMs). Un MARM es una cepa mutante de RSV que ya no es capaz de neutralizarse por el anticuerpo que se generó en contra. Por lo tanto, la capacidad de la forma IgG de 58c5 para neutralizar un MARM especifico indica que el' enlace epitopo de 58c5 es diferente de la del anticuerpo en el cual el MARM se generó.
A. Neutralización de RSV Las formas IgG de 58c5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 56E11, 17C9 y 69F6 se probaron por su capacidad para neutralizar RSV (como se describe en el Ejemplo 6 de arriba) . Los datos se muestran en las Tablas 22-24 a continuación. La Tabla 22 enlista el ED50 (dilución efectiva para · neutralización al 501) para cada cepa RSV. la Tabla 23 enlista los conteos de placa para las varias cepas RSV y en las concentraciones de anticuerpo variadas de la forma IgG de 58c5. La Tabla 24 enlista la velocidad de reducción de placa para las varias cepas RSV y en concentraciones de anticuerpo variados. Los resultados indican que las .formas IgG de 58c5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 56E11, y 17C9 son capaces de neutralizar todas las 3. cepas de RSV, aunque a concentraciones variables. La forma IgG de 69F6 es selectiva para la cepa A2 de RSV. Basado en los datos obtenidos en el ensayo de neutralización y el peso molecular del fragmento IgG (aproximadamente 150 kDa) , el ED50 de la forma IgG para neutralización in vitro de RSV A2 es aproximadamente 133 pM. Los ED50s para las formas IgG de 30D8 y 14G3 para la neutralización in vitro de A2 RSV son 89 pM y 106 pM, respectivamente.
La comparación de la actividad de neutralización de la forma IgG de 30D8 y motavizumab de anticuerpo anti-RSV (Wu et al. (2007) J. Mol. Biol. 368 (3) :652-665) para las tres cepas de RSV ndican que IgG 30D8 es un anticuerpo neutralizador más potente.
Para la cepa A2 de RSV, la forma IgG de 30D8 es 4 tantos mejor en la neutralización (89 pM contra 360 pM) . La forma IgG de 30D8 muestra un incremento de 15 tantos mejor en la neutralización de la cepa B-l de RSV que el motavizumab. Para la cepa B/lavado de RSV, la forma IgG de 30D8 muestra un incremento de 25 tantos en la neutralización (115 pM contra 2.9 nM) . La forma . IgG de 30D8 se mostró de modo adicional para neutralizar tanto la cepa larga como la cepa B/9320 de RSV. abla 24. Velocidad de reducción en placa (%) para Neutralización con forma IgG de 58c5 B. Neutralización de Mutantes de Escape RSV Resistentes al Anticuerpo Monoclonal RSV La forma IgG de 58c5 también se probó por su capacidad para neutralizar varios mutantes de escape RSV resistentes a anticuerpo monoclonal (proporcionados por Dr. James Cro e, Vanderbilt University) , como se describe en el Ejemplo 6 de arriba. Los MARMS, enlistados en la Tabla 23 a continuación, se derivaron de cepa A2 de tipo natural de RSV. El MARM 19, generado contra Fab 19 humano (ver, por ejemplo, Crówe et al, Virology, 252:373-375 (1998))', contiene la isoleucina de mutación de aminoácido 266 hasta metionina. El MARM 151, generado contra mAb 151 murino, contiene la lisina de mutación de aminoácido 272 hasta asparagina. El MARM 1129, generado contra el mAb 1129 de murino que es el anticuerpo precursor para palivizumab (SYNAGIS) , contiene la serina de mutación de aminoácido 275 hasta fenilalanina .
La forma IgG de 58c5 también se probó por' su capacidad para neutralizar varios Mutantes Resistentes al Anticuerpo Monoclonal RSV (MARMs) . Los datos se muestran en las Tablas 25-26 a continuación. La Tabla 25 enlista los conteos de placa para neutralización contra los varios MARMs en concentraciones de anticuerpo variadas. La Tabla 26 enlista la velocidad de reducción de placa para neutralización entra los varios MARMs en concentraciones.de anticuerpo .variadas . Los resultados indican que la forma IgG de 58c5 es capaz de neutralizar todos los 3 MARMS de RSV. De esta manera, el 58c5 enlaza un epitopo diferente de cepa A2 de RSV que Fab 19, mAb 1129 de murino y mAb 151 de murino.
Ejemplo 10 Ensayos de Competencia En este ejemplo, los ensayos de competencia se realizaron en los cuales los Fabs 58c5, 30D8, 56E11, 17C9 y 69F6 se probaron para su capacidad para competir contra IgG de Motavizumab (Wu et al. (2007) J. MoL Biol. 368 (3) : 652-665) para enlazar a la proteína F de RSV. Los Fabs 58c5 y 30D8 se probaron adicionalmente para su capacidad para competir contra las formas IgG de 17C9 y 69F6 para enlazar a la proteína F RSV recombinante . Los Fabs 56E11, 17C9 y 69F6 se probaron adicionalmente para su capacidad para competir contra las formas IgG de 58c5 · y 30D8 para enlazar a la proteína F de RSV recombinante. Como controles positivos para competencia, las formas IgG de varios anticuerpos se probaron para su capacidad para competir contra las formas Fab respectivas de los mismos anticuerpos.
Brevemente, las placas ELISA se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 de arriba, con ya sea proteína F de cepa A2 de RSV recombinante o nativa. Las placas se bloquearon con leche seca sin grasa al 4% en lx PBS durante 2 horas a 37 °C seguido por lavado 4x con solución amortiguadora de lavado (PBS/Tween20 al 0.05%). Los Fabs se titularon en PBS/BSA al 3%/Tween20 al 0.01% ' de 9 pg/mL hasta 0.0001 g/mL (concentraciones actuales probadas: 9, 3, 1, 0.3, .0.1, 0.03, 0.01, 0.003, 0.001, 0.0003, 0.0001 pg/mL) . Las formas de IgG de los anticuerpos probados y Motavizumab se ¦ agregaron en concentraciones fijas de ya sea 0.5 g/mL, 0.1 g/mL, .0.05 g/mL y 0.01 pg/mL (como se indica en la Tabla 27 a continuación). 50 yL cada uno de IgG de concentración fija y Fab diluido se agregó simultáneamente a cada pozo de una placa, en duplicado, como se indica en la Tabla 27 a continuación, y las placas se incubaron a 37 °C durante 2 horas seguido por lavado 4x con solución amortiguadora de lavado. HRP Fc-gamma de IgG anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 109-035-098, diluido 1:1000, se agregó y las placas se incubaron a 37°C ' durante 1 hora. Después del lavado 6x con solución amortiguadora de lavado, 50 L 1:1 v/v TMB: solución de peróxido (Pierce, Cat No; 34021) se agregó y se dejó desarrollar durante 7 minutos. La reacción se detuvo inmediatamente por la adición de 50 L de H2SO4 2N y la absorbancia en 450 nm se midió usando un lector de placa ELISA.
Los resultados se resumen en la Tabla 28 a continuación. Los Fabs 58C5, 30D3, 56E11, 17C9 y 69F6 no compiten para enlazar a la proteina F A2 cepa RSV con Motavizumab. Fab 30D8 no compitió para enlazar con cualquiera de los anticuerpos probados. Fab 58C5 compitió con la forma IgG de 69F6 para enlazar a la proteina' F RSV. Los Fabs 56E11 y 69F6 ambos compiten con la forma IgG de 58c5 para enlazar a la proteina F RSV. Los anticuerpos 58C5, 69F6 y 56E11 comparten sitios de enlace de epitopo común en la proteina de fusión RSV.
ND: No Determinado Ejemplo 11 Ensayos de Neutralización y Generación de MARM de RSV En este ejemplo, los mutantes de escape RSV resistantes al anticuerpo monoclonal (MARMs) se generaron para Motavizumab y la forma IgG de 58C5. Para la' forma IgG de 30d8, se realizaron 12 rondas de selección y no se identificaron mutantes de escape. Motavizumab y las formas IgG de 58C5 y 30D8 y Fabs 56E11, 17C9 y 69F6 se analizaron además por su capacidad para neutralizar los MARMs nuevamente generados.
A. Generación MARM 1. Motavizumab La concentración de IgG de motavizumab que reduce titulaciones víricas de RSV por 3 registros (correspondientes a inhibición al 99.9% de virus A2 dé RSV por ensayo de neutralización) se determinó previamente para ser.3.2 pg/mL. Las partículas víricas A2 de RSV (2 x 106) se preincubaron con diluciones de IgG' de motavizumab y esta mezcla se usó para infectar monocapas de célula Vero (como se describe en el Ejemplo 6 de arriba) . Los pozos con las concentraciones de anticuerpo más altas que todavía demuestran efectos citotóxicos se seleccionaron para rondas adicionales de selección. Después de 10 rondas de selección, se obtuvieron las placas del crecimiento de virus en presencia de 8 yg/mL de motavizumab. Las partículas de virus de estas placas se probaron en ensayos de neutralización (como se describe en el Ejemplo 6 de arriba) y RNA de partículas positivas se preparó usando un kit de extracción RNeasy (Qiagen) . Seis mutantes de escape se seleccionaron y el gen F se amplificó por PCR. El ADN se procesó por secuencia y todos los seis clones codifican una sustitución de aminoácido sencilla de ácido glutámico para lisina en la posición 272 (K272E, SEQ ID NO: 486) comparado con la cepa A2 de RSV precursora (establecida en SEQ ID NO: 485) . .
La Tabla 29 a continuación establece la concentración de anticuerpos más alta que demuestra efectos citopáticos (CPE) para cada ronda de selección. Como se muestra en la Tabla 29 a continuación, los mutantes . de escape de motavizumab se identificaron después de 7 rondas de selección, como se identifica por una concentración de anticuerpo que. demuestra CPE mayor que la concentración de motavizumab que corresponde a inhibición al 99.9% de virus A2 de RSV como se determina por ensayo de neutralización (esto es, > 3.2 ug/mL) . 2 . 58C5 La concentración de la- forma IgG de 58C5 que reduce concentraciones víricas de RSV por 3 registros (corresponde a la inhibición al 99.9% de virus A2 de RSV por ensayo de neutralización) se determinó para ser 0.8 g/mL. Las partículas víricas A2 de RSV (2 x 105) se preincubaron con diluciones de IgG 58C5 y esta mezcla se usó para infectar monocapas de célula Vero (como se describe en el Ejemplo 6 de arriba). Los pozos con las concentraciones de anticuerpo, más altas todavía demuestran que los efectos citotóxicos se seleccionaron para rondas adicionales de selección. Después de 12 rondas de selección, las placas de crecimiento de virus en presencia de 2 µ?/p? de la forma IgG de; 58C5 se obtuvieron. Las partículas de virus de estas placas se probaron en ensayos de neutralización (como se describe en el Ejemplo 6 de arriba) y ARN de partículas positivas se preparó usando un kit de extracción de RNeasy (Qiagen) . Cinco mutantes de escape se seleccionaron y el gen F se amplificó por PCR. El ADN se procesó por secuencia y todos los cinco clones codifican tres sustituciones de aminoácidos (N63K, M115K y E295G; SEQ ID NO: 487) comparados con la cepa A2 de RSV precursora (establecida en SEQ ID NO: 485) .
La Tabla 30 a continuación establece la concentración de anticuerpo más alta que · demuestra los efectos citopáticos (CPE) para cada ronda de selección. Como se muestra en la Tabla 30 a continuación, los mutantes de escape 58C5 se identificaron después de 10 rondas de selección, como se identifica por una concentración de anticuerpo que demuestra CPE mayor que la concentración de la forma IgG de 58C5 que corresponde a la inhibición al 99.9% de virus A2 de RSV como se determina por ensayo de neutralización (esto es, > 0.8 µ?/mL) . 3 . 30D8 La concentración de la forma IgG de 30D8 que reduce concentraciones víricas de RSV por 3 registros se determinó para ser 1 g/mL. Las partículas víricas A2 de RSV (2 x 106) se preincubaron con diluciones de la forma IgG de 30D8 y esta mezcla se usó para infectar monocapás de célula Vero (como se describe en el Ejemplo 6 de arriba) . Los pozos con las concentraciones de anticuerpo más altas todavía demuestran que los efectos citotóxicos . se seleccionaron para rondas adicionales de selección. Después de 12 rondas de selección, no se identificaron mutantes de escape 30D8, como se muestra en la Tabla 31 a continuación.
B. Ensayos de Neutralización Motavizumab, las formas IgG de 58C5 y 30D8 y los Fabs 56E11, 17C9 y 69F6 se probaron por su capacidad para neutralizar la cepa de virus precursora A2 de RSV, el MARM de motavizumab y -la el MARM 58C5. El procedimiento de ensayo de neutralización se describe en el Ejemplo 6 de arriba. Los datos se muestran en las Tablas 32-35 a continuación. La Tabla 32 enlista la velocidad de.- reducción de placa para neutralización contra el virus precursor A2 de RSV. La Tabla 33 enlista la velocidad de reducción de placa para neutralización contra el MARM de Motavizumab. La. Tabla 34 enlista la velocidad de reducción de placa para neutralización contra el MARM 58c5. La Tabla 35 es un resumen de los datos de neutralización (valores ED50) .
Los resultados indican que todos anticuerpos son capaces de neutralizar la cepa A2 de RSV precursora, con las' formas IgG 58C5 y 30D8 mostrando la actividad más fuerte (ver Tablas 32 y 35) . Todos los anticuerpos probados neutralizan fuertemente el motavizumab MARM sin diferencia comparada con la cepa precursora (ver Tablas 33 y 35). Como se espera, motavizumab no puede neutralizar el motavizumab MARM en cualquiera de las concentraciones probadas. Motavizumab, la forma IgG de 30D8 y Fab 17c9 neutralizan fuertemente el MARM de 58C5 sin diferencia en potencia de neutralización (ver Tablas 34 y 35) . Como, se espera, la forma IgG de 58C5 no puede neutralizar el MARM 58c5 en cualquiera de las concentraciones probadas. Los resultados muestran que las formas IgG de 58C5 y 30D8 y Fabs .56Ell, 17C9 y 69F6 todas neutralizan el motavizumab MARM que no indica competencia. De este modo, los epitopos de 58c5, 30D8, 56E11, 17C9 y 69F6 no se superponen con ese de motavizumab, ya que no se observó competencia (ver Tabla 28 arriba) y todos los anticuerpos que neutralizan MARM motavizumab.
El Fab 69F6 compitió con la forma IgG de 58c5 para enlazar a la proteina F RSV (ver Tabla 28 arriba) pero aún neutralizó el MARM 58c5, aunque con un ED50 ligeramente más alto que ese para la neutralización de la cepa A2 precursora (353 pM contra .256 pM) . En contraste, Fab 56?1? compitió para enlazar a la proteina F RSV con la forma IgG de 58c5 (ver Tabla 28 arriba) pero no neutralizó el MARM 58c5 en cualquiera de las concentraciones probadas. De este modo, el epitopo 56E11 superpone con 58c5 ya que la competencia entre los dos anticuerpos se observa y el Fab 56E11 fue incapaz de neutralizar al MARM 58C5. Los anticuerpos 69F6 y 17C9 neutralizaron el MARM 58c5 indicando que sus epitopos. no están superpuestos con el del anticuerpo 58c5. Sin embargo, se observó competencia entre 58c5 y 69F6 (ver Tabla 28), pero debido a que 69F6 neutralizó el MARM 58c5, la' competencia observada es más probable debido al impedimento estérico.
! Tabla 32. Velocidad de reducción de placa para Neutralización de virus i recursor A2 de RSV Tabla 34. Velocidad de reducción de placa para Neutralización de IgG 58C5 MARM Ejemplo 12 Mapeo de los epitopos de enlace 58C5 y 30D8 En este ejemplo, los residuos de proteína F RSV inmplicados en el enlace de anticuerpos 58C5 y 30D8 se determinaron por medio de la selección de una colección de mutantes sencillos de la proteína F RSV para enlazar a los anticuerpos 58C5 o 30D8.
La biblioteca de mutantes de proteína F RSV se¦ generó usando Tecnología de Mapeo de Mutagénesis Shotgun de Integral Molecular (Filadelfia, PA) . En breve, la tecnología permite la expresión y el análisis de bibliotecas grandes de proteínas objetivo mutadas dentro de células eucarióticas . Cada residuo en una . proteína objetivo muta individualmente, usualmente para otros aminoácidos, múltiples, con el fin de ensayar para cambios en función o enlace de anticuepos monoclonales (Mab) . Las proteínas se expresan dentro de líneas celulares de mamíferos, así que incluso . proteínas complejas que requieren dé procesamiento post-traduccio.nal o traduccional eucariótico pueden mapear los epitopos ·.
La Cepa A2 F RSV humana (NCBI Ref# FJ614814) se usó como el plásmido precursor para la proteina F RSV. Una etiqueta V5 en el C terminal se incluyó para permitir la selección. Las proteínas F se expresaron, en células HEK 293 y se determinó el enlace usando inmunoluminiscencia . Usando una estrategia de mutación aleatoria, se generó una biblioteca de. proteínas F RSV que contiene 1029 clones mutantes. Todos los 549' aminoácidos de la proteína F mutaron, con un promedio de 1.34 mutaciones por clones y un promedio de 2.46 mutaciones por residuo de mainoácido. Cada aminoácido mutó al menos una vez (100%), y al menos 457 aminoácidos (83.2%) mutaron dos veces. Motivizumab y el suero policlonal que enlazan a la proteína F se usaron como controles positivos para determinar si la proteína F expresada estaba propiamente plegada. Motivizumab es conocido por enlazar tanto la conformación previa como posterior a la fusión de la proteína F RSV. Además, tanto 58C5 como 30D8 son sensibles a los cambios conformacionales , por lo tanto, 58C5 también se usó como un control para 30D8 y 30D8 se usó como un control para 58C5. Como se muestra en el Ejemplo 10 arriba, 58C5 y 30D8 enlazan a dos sitios independientes de la proteína F RSV y adicionalmente, ambos son sensibles a cambios conformacionales .
La selección se realizó muchas veces con . dos minipreps independientes de los transfectantes . Los criterios de selección para la evaluación de residuos que contribuyen al enlace del anticuerpo son como sigue: resultados del residuo mutante para enlazar a 58C5 que es 2x menos que la señal para enlace a 58C5; resultados del residuo mutante para ; enlazar a 30D8 que es 2x menos que la señal para enlace a 30D8; .
Control positivo (suero policlonal o Motivizumab) >20% luminiscencia; y Preferiblemente también otra sustitución en el mismo sitio.
Cada clon identificado también se verificó para expresión de superficie usando un anticuerpo policlonal. Las muestras se probaron al menos 3 veces. 1. Enlace al anticuerpo 58C5 Los resultados se muestran en las Tablas' 36-37 a continuación, que establecen inmunoluminiscencia por al menos 3 muestras (SI, S2 y S3) para el enlace de 58C5 y-30D8 para cada mutante de proteíná F, enlace de motavizumab y/o el suero policlonal, la media de los valores para. 58C5 y 30D8, la relación de enlace a 30D8/58C5 y la mutación de la proteína F. Como se muestra en las Tablas , 36-37 a continuación, la mutación de los residuos N63, E82, Y86, K168, V207, N371, S405 y/o E463 en la proteína F resultó en enlace reducido del anticuerpo 58C5. El residuo E82 fue identificado tanto en miniprep como en selección. El residuo N63 fue previamente identificado en el mutante de escape, o MARM, para 58C5. Esta mutación también fue confirmada por el análisis FACS. Cuando los residuos identificados combinados se exhibieron en un modelo 3D ' de prefusión RSV-F, se agruparon en un área restringida del pico, en la · misma área como los mutantes de escape en la parte superior de la punta e ilustran la huella del anticuerpo de Mab 58C5 (ver Figura 1). Asi, 58C5 enlaza a un epitopo conformacional .
Cuando estos residuos se exhiben en la estructura de rayos X del pico trimérico de proteína F-RSV posterior a la fusión, los residuos, se distribuyen sobre un área¦ grande de la superficie de proteína que sería imposible ser parte de una huella de anticuerpo (ver, Figura 2, y Morton' et . al., (2003) Virology 311:275-288; McLellan et al., (2010) J Virology 84 (23): 12236-12244; y McLellan et al.,. (2011) . J Mol Biol 409:853-866). El epitopo de 58C5 se ubica en un dominio que va a través del cambio conformacional más dramático de la proteína F cuando se mueve del .estado de prefusión al estado de postfusión. Sólo la región agrupada en el pico de pre-fusión acuerda con la huella de un anticuerpo. Por lo tanto, la ubicación del epitopo acuerda con1 los datos que 58C5 es específico para la conformación de prefusión y también confirma la ausencia de competencia con Motivizumab, F101 y 30D8. De este modo, 58C5 no enlaza el mismo epitopo como Motivizumab o 30D8. 2. Enlace al anticuerpo 30D8 Los resultados se muestran en las Tablas¦ 38-39 a continuación, que. establece la inmunoluminiscencia para al menos 3 muestras (SI, S2 y S3) para el enlace de 58C5 y 30D8 para cada mutante de proteina F, enlace de motavizumab y/o el suero policlonal, la media de los valores para 58C5 y 30D8, la relación de enlace de 58C5/30D8 y la mutación en la proteína F. Como se muestra en las Tablas 38-39 a continuación, la mutación de los residuos V278, R339, F351, P353, 370, N371, C382, D392, MM396 y/o S403 en la proteína F resultaron en enlace reducido del anticuerpo 30D8. El residuo R339 fue identificado tanto en miniprep como en selecciones. Dos mutaciones diferentes de ambos M370 y C382 resultaron en un enlace reducido del enlace 30D8 a la proteína F RSV. Como se muestra arriba para 58C5, los residuos identificados están restringidos a un dominio de la proteína RSV. Cuando todos los residuos identificados para el enlace se combinan, todos se agrupan en el dominio' DI, en la base de la paleta justo arriba de la región tallo/pedúnculo. Algunos residuos son internos de acuerdo al modelo 3D, mientras que otros residuos están expuestos en agrupación en la interfaz en la hendidura entre los dominios DI de diferentes promotores en el modelo trímero de prefusión, todos los residuos identificados son internos. Aunque el cambio conformacional de la región DI se espera que este muy limitado entre las conformaciones pre y post-fusión, las subunidades de promotor se ajustan entre la pre y la post fusión, resultando en una estructura de postfusión que está más condensada y menos abierta. El mapeo del Mab 30D8 para la región DI acuerda con nuestros resultados que es independiente sobre la conformación estructural de la proteina F rsv. Además, sólo en cuanto · a 58C5, el epitopo no compite con 58C5, Motiyizumab o anticuerpo 101F. Esto acuerda con la ubicación en el modelo 3d. De este modo, 30D8 no enlaza al mismo epitopo como Motivizumab o 58C5.
Ya que las modificaciones serán aparentes para aquellos de experiencia en esta técnica, se pretende que esta invención se limite sólo por el alcance. · de las reivindicaciones anexas'.

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace al antigeno del mismo, caracterizado porque: RSV no produce un virus que escapa a la neutralización por el anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno del mismo después de más de 10 o más rondas de replicación viral en presencia del anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno del mimso.
2. El anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: el anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno • ' comprende : una cadena pesada variable que contiene una CDR1 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 405 o 437 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%,- 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:405 o 437; una CDR2 VH. que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en 'SEQ ID NO: 406 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%,' 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,· 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 406; y una CDR3 VH que comprende la secuencia dé residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 07 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%,' 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%' o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 407; y una cadena ligera variable que contiene una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 408 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 408; una CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 409 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o 'al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 409; y una CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 410 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, '96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:410; y el anticuerpo' o fragmento de enlace al antigeno del mismo que une inmunoespecíficamente a la proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) y/o neutraliza el RSV.
3. El anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace al antigeno de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende: un dominio VH, en- donde la secuencia de aminoácido del dominio VH está establecida en los aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO:396 o es al menos o alrededor de 80%, 81%, .82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, ' 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácido establecida en los aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 396; y un dominio VL, en donde la secuencia de aminoácido del dominio VL está establecida en los aminoácidos 1-110 de SEQ ID NO:395 o es al menos o alrededor de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácido establecida en los aminoácidos 1-110 de SEQ ID NO: 395.
4. Un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace al antigeno del mismo, caracterizado porque: el. anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno comprende: una cadena pesada variable que contiene una CDR1 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 464 o 483 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:464 o . 83; una CDR2 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 465 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, .94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 465; y una CDR3 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 466 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 466; y una cadena ligera variable que contiene una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 467 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 467; una CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 468 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 468; y una CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%·, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 469; y el anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno que une inmunoespecificamente a la proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio .(RSV) y/o neutraliza el RSV.
5. El anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace al antigeno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende: un dominio VH, en donde la secuencia de aminoácido del dominio VH está establecida en los aminoácidos 1-133 de SEQ ID NO: 454 o es al menos o alrededor de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%', 90%,. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a. la secuencia de aminoácido establecida en los aminoácidos 1-133 de SEQ ID NO:454; y un dominio VL, en- donde la secuencia de aminoácido del dominio VL está establecida en los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO:455 o es al menos o alrededor de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácido establecida en los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO:455.
6. Un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace al antigeno del mismo, caracterizado porque: el anticuerpo o fragmento . de enlace al ·. antigeno comprende una cadena pesada variable que contiene una CDR1 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 458 o 482 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o . mas de identidad de secuencia con SEQ ID ' NO: 458 o 482; una CDR2 VH que comprende la secuencia de . residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 459 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al- menos alrededor de 80%, :90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad .de secuencia con SEQ. ID NO:459; y una CDR3. VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 460 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con . SEQ ID NO: 460; y una cadena ligera variable que contiene una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 461 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 461; una CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos' establecida en SEQ ID NO: 462 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ . ID NO: 462; y una CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 463 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o ' al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ .ID NO: 463; y el anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno que une inmunoespecificamente a la proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) y/o neutraliza el RSV.
7. El anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace al antigeno de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno comprende un dominio VH, en donde la secuencia de aminoácido del dominio VH está establecida en los aminoácidos 1-124 de SEQ ID NO: 52 o es al menos o alrededor de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%¦ idéntica a la secuencia de aminoácido establecida en- los aminoácidos 1-12 de .SEQ ID NO: 52; y un dominio VL, en donde la secuencia de aminoácido del dominio VL está establecida en los aminoácidos 1-111 de SEQ ID NO: 453 o es al menos o alrededor de 80%, 81%, 82%, .83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácido establecida en los aminoácidos 1-111 de SEQ ID NO: 453.
8. Un anticuerpo anti-RSV o fragmento de enlace al antigeno del mismo, caracterizado porque: el anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno se selecciona de entre un anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno que comprende: a) una cadena pesada variable que contiene una CDR1 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 411 o 438 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia¦ con SEQ ID NO: 411. o' 438 ; una CDR2 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 412 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 412; y una CDR3 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 413 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%,' 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 413; y una cadena ligera variable que contiene una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 414 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,' 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 414; una CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 415 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al. menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 415; y una CDR3 VL que' comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 416 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 416; b) una cadena pesada variable que contiene una CDR1 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 417 o 439 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 417 o 439; una CDR2 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 418 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 418; y una CDR3 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 419 o una secuencia de' aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%., 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad, de secuencia con SEQ ID NO:419; y una cadena ligera variable que contiene una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 420 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 420; una CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 421 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%·, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 421; y una CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 422 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o .' al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 422; c) una cadena pesada variable que contiene una CDR1 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 23 o 440 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, .97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 423 o 440; una CDR2 VH que comprende la . secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 424 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 424; y una CDR3 VH que comprende la secuencia de residuos · de aminoácido establecida ' en SEQ ID NO: 425 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, .95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:425; y una cadena ligera variable que contiene una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos, establecida en SEQ ID NO: 426 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, .95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 26; una CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 427 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, -90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 427; y una CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 428 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o . al menos alrededor de 80%, 90%, 91%,' 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO : 428 ; d) una cadena pesada, variable que contiene una CDR1 VH que comprende la secuencia de residuos dé aminoácido establecida en SEQ ID NO: 429 o 441 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o.- más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 429 o 441; una CDR2 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 430 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 430; y una CDR3 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 431 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%,. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 431; y una cadena ligera variable que contiene una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 432 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 432; una CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 433 o una secuencia dé aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, .96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 433; y una CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 434 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 434; y e) una cadena pesada variable que contiene una CDR1 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 70 o 484 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia¦ con SEQ ID NO:470 o 484 ; una CDR2 VH que comprende la secuencia de residuos de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 471 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 471; y una CDR3 VH que comprende la secuencia de residuos de' aminoácido establecida en SEQ ID NO: 72 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, · 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 72; y una cadena ligera variable que contiene una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 473 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, -95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 473; una CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 474; y una CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 75 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o al menos alrededor de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 475; y el anticuerpo, o fragmento de enlace al antigeno que une inmunoespecificamente a la proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV) y/o neutraliza el RSV.
9. El anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno tiene un EC50 de menos de 2 nM para neutralización de RSV en un ensayo de ' reducción . de placa in vi tro o una afinidad de al menos 108 M"1 para proteina RSV F aislada o para virus RSV.
10. Un anticuerpo multivalente, caracterizado porque comprende : una primera porción de enlace al antigeno que comprende un anticuerpo o fragmento de enlace al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o un fragmento de enlace al .antigeno del mismo conjugado a un dominio de multimerización; y una segunda porción de enlace al antigeno que comprende un fragmento de enlace al antigeno de un anticuerpo antiviral conjugado a un segundo dominio de multimerización, en donde: el primer dominio de multimerización y el segundo dominio de multimerización son complementarios o el mismo, por ello la primera porción de enlace ' al antigeno y la segunda porción de enlace al antigeno forman un anticuerpo multivalente.
11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende: un anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o el anticuerpo multivalente de conformidad con la reivindicación 10, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Un anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para tratar o inhibir uno o más síntomas de una infección por RSV, o para prevenir una infección por RSV.
13. El uso de un anticuerpo o fragmento.de enlace al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para ' formulación de un medicamento para tratar o inhibir uno o más síntomas de una infección por RSV, o para prevenir una infección por RSV.
14. Un método para detectar infección por RSV caracterizado porque comprende: (a) evaluar el nivel de antígeno RSV en un' fluido, célula, o muestra de tejido usando un anticuerpo o fragmento de enlace al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9; (b) comparar el nivel evaluado de antígeno' RSV con un nivel de control por ello un incremento en el nivel evaluado de antígeno RSV comparado con el nivel de control del antígeno RSV es indicativo de una infección por RSV.
15. Un ácido nucleico aislado, caracterizado ??^µß codifica el anticuerpo o fragmento de enlace al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
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