MX2012011323A

MX2012011323A - Agentes que se unen al receptor encrespado y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2012011323A
Application number: MX2012011323A
Authority: MX
Inventors: Austin L Gurney
Original assignee: Oncomed Pharm Inc
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2012-11-23
Also published as: EP2552953B1; WO2011123785A3; AU2011235904A1; JP2013530929A; US9499630B2; EP2552953A4; CN102971337B; NZ602700A; WO2011123785A2; AU2011235904B2; US20120027778A1; CA2794674A1; KR20130043102A; CN102971337A; US20140105917A1; EP2552953A2; US8551789B2; MX347515B

Abstract

La presente invención se refiere a agentes anticancerígenos novedosos que incluyen pero que no se limitan a anticuerpos y otros polipéptidos que se unen a receptores encrespados humanos. También se han identificado epítopos novedosos dentro de los receptores encrespados humanos los cuales son adecuados como objetivos para agentes anticancerígenos. Se proporcionan adicionalmente métodos de uso de los agentes o anticuerpos tales como métodos de uso de los agentes o anticuerpos para inhibir la señalización Wnt y/o inhibir el crecimiento de tumores. También se proporcionan métodos de cribado.

Description

AGENTES QUE SE UNEN AL RECEPTOR ENCRESPADO Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención El campo de esta invención se relaciona generalmente con polipéptidos y otros agentes que se unen a uno o varios receptores encrespados humanos, asi como con métodos de uso de los polipéptidos u otros agentes para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer.

Antecedentes de la Invención El cáncer es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado, con más de un millón de personas a las que se les diagnostica cáncer y 500,000 muertes al año únicamente en los Estados Unidos. En general se calcula que más de una de tres personas desarrollarán alguna forma de cáncer durante su vida. Existen más de 200 tipos diferentes de cáncer, cuatro de los cuales —mama, pulmón, colorrectal y próstata— constituyen más de la mitad de todos los casos nuevos (Jemal et al., 2003, Cáncer J. Clin. 53: 5-26) .

La vía de señalización Wnt se ha identificado como un objetivo potencial para el tratamiento contra el cáncer.

La vía de señalización Wnt es uno de los varios reguladores críticos de formación de patrón embriónico, mantenimiento de tejido postembriónico y biología de citoblastos . De manera Ref.: 235773 más específica, la señalización Wnt juega un papel importante en la generación de polaridad celular y especificación del destino celular que incluye autorregeneracion por poblaciones de citoblastos . La activación no regulada de la vía Wnt se asocia con numerosos cánceres humanos en donde puede alterar el destino de desarrollo de células tumorales para mantenerlas en un estado no diferenciado y proliferativo . De esta manera se puede producir carcinogénesis al usurpar mecanismos homeostáticos que controlan el desarrollo normal y la reparación de tejido por citoblastos (revisado en Reya & Clevers, 2005, Natuce 434:843; Beachy et al., 2004, Nature 432: 324) .

La vía de señalización Wnt fue dilucidada por primera vez en el mutante sin alas (wg, por sus siglas en inglés) en desarrollo de Drosophila y a partir del proto-oncogen murino int-1, ahora Wntl (Nusse & Varmus, 1982, Cell 31:99-109; Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell 39:233-40; Cabrera et al., 1987; Cell 50:659-63; Rijsewijk et al., 1987, Cell 50:649-57). Los genes Wnt codifican para glucoproteínas modificadas por lípidos, secretadas, de las cuales se han identificado 19 en mamíferos. Estos ligandos secretados activan un complejo de receptor que consiste de un miembro de la familia de receptor encrespado (Fzd) y proteína 5 ó 6 relacionada con receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) , (LPR5/6) . Los receptores Fzd son siete proteínas de dominio transmembranal de la superfamilia del receptor acoplado a proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) y contienen un dominio de unión de ligando N terminal extracelular grande con 10 cisteínas conservadas, conocido como dominio rico en cisteína (CRD, por sus siglas en inglés) o dominio Fri. Existen diez receptores FZD humanos: FZD1-10. Los diferentes CRD de Fzd tienen afinidad de unión diferentes por Wnt específicos (Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem. 277:41762-9) y los receptores Fzd se han agrupado en aquellos que activan la vía ß-catenina canónica y aquellos que activan vías no canónicas descritas más adelante (Miller et al., 1999, Oncogene 18:7860-72). Para formar el complejo receptor que une los ligandos FZD, los receptores FZD interactúan con LRP5/6, proteínas transmembranales de un solo paso con cuatro dominios ext acelulares similares a EGF separados por seis secuencias repetidas de aminoácidos YWTD (Johnson et al., 2004, J. Bone Mineral Res. 19:1749).

La vía de señalización Wnt canónica activada ante la unión a receptor es mediada por la proteína citoplásmica Dishevelled (Dsh) que interactúa directamente con el receptor Fzd y resulta en la estabilización citoplásmica y la acumulación de ß-catenina. En ausencia de una señal Wnt, la ß-catenina se localiza a un complejo de destrucción citoplásmico que incluye proteínas supresores de tumores adenoma tosas polipopsis coli (APC, por sus siglas en inglés) y axina. Estas proteínas funcionan como infraestructura critica para permitir que la glucógeno sintasa cinasa (GSK)-3ß se una a cualquier fosforilato de ß-catenina, marcándolo para degradación por medio de la vía ubiquitina/proteasoma . La activación de Dsh resulta en la fosforilación de GSK3 y la disociación del complejo de destrucción. La ß-catenina citoplásmica acumulada después se transporta al núcleo en donde interactúa con proteínas que se unen a ADN de la familia Tcf/Lef para activar la transcripción.

Además de la vía de señalización canónica, los ligandos nt también activan vías independientes de ß-catenina (Veeman et al., 2003, Dev. Cell. 5:367-77). La señalización no canónica Wnt se ha implicado en numerosos procesos pero el más convincente en los movimientos de gastrulación por medio de un mecanismo similar al de la vía de polaridad similar plana (PCP, por sus siglas en inglés) de Drosophila. Otros mecanismos potenciales de señalización Wnt no canónica incluyen flujo de calcio, JNK y proteínas G tanto pequeñas como heterotriméricas . Con frecuencia se observa antagonismo entre las vías canónica y no canónica y ciertas pruebas indican que la señalización no canónica puede suprimir la formación de cáncer (Olson & Gibo, 1998, Exp. Cell Res. 241:134; Topol et al., 2003, J. Cell Biol. 162:899-908). De este modo, en algunos contextos, los receptores Fzd actúan como reguladores negativos de la vía de señalización Wnt canónica. Por ejemplo, FZD6 reprime la señalización canónica inducida por Wnt-3a cuando coexpresa con FZD1 por medio de la vía T7AK1-NLK (Golan et al., 2004, JBC 279:14879-88). Similarmente, Fzd2 antagonista la señalización Wnt canónica en presencia de Wnt-5a vía la cascada TAKl-NLK MAPK (Ishitani et al., 2003, Mol. Cell. Biol. 23:131-9).

La vía de señalización Wnt canónica también juega un papel central en el mantenimiento de poblaciones de citoblastos en el intestino delgado y colon, y la activación inapropiada de esta vía juega un papel prominente en los cánceres colorrectales (Reya 6 Clevers, 2005, Nature 434:843). El epitelio absorbente del intestino se distribuye en vellos y criptas. Los citoblastos residen en las criptas y se dividen lentamente para producir células que proliferan rápidamente lo que da lugar a todas las poblaciones de células diferenciadas que se mueven hacia fuera de las criptas para ocupar los vellos intestinales. La cascada de señalización Wnt juega un papel dominante para el control de los destinos celulares a lo largo de los ejes cripta-vello y es esencial para el mantenimiento de la población de citoblastos. La ruptura de la señalización Wnt ya sea por pérdida genética de Tcf7/2 por recombinación homologa (Korinek et al., 1998, Nat. Genet. 19:379) o sobreexpresión de Dickkopf-1 (Dkkl), un potente antagonista de Wnt secretado (Pinto et al., 2003, Genes Dev. 17:1709-13; Kuhnert et al., 2004, Proc. Nat ? . Acad. Sci . 101:266-71), resulta en la supresión de poblaciones de citoblastos intestinales.

El cáncer colorrectal se inicia más comúnmente por mutaciones activantes en la cascada de señalización Wnt . Aproximadamente 5-10% de todos los cánceres colorrectales son hereditarios en donde una de las formas principales son los pólipos denamotosos familiares (FAP, por sus siglas en inglés), una enfermedad dominante autosómica en la cual aproximadamente 80% de las personas afectadas contienen una mutación de línea germinal en el gen para la poliposis adenomatosa coli (APC, por sus siglas en inglés) . También se han identificado mutaciones en otros componentes de vía Wnt que incluyen axina y ß-catenina. Los adenomas individuales son crecimientos excesivos clónales de células epiteliales que contienen un segundo alelo inactivado, y la gran cantidad de adenomas FAP inevitablemente resultan en desarrollo de adenocarcinomas mediante la adición de mutaciones en oncogenes y/o genes supresores de tumores. Además, la activación de la vía de señalización Wnt, que incluye mutaciones de ganancia de función en APC y ß-catenina pueden inducir el desarrollo hiperplásico y el crecimiento de tumores en modelos en ratón (Oshima et al., 1997, Cáncer Res 57:1644-9; Harada et al., 1999, EMBO J. 18:5931-42).

Un papel para la señalización con Wnt en cáncer se descubrió por primera vez con la identificación de Wntl (originalmente intl) como un oncogen en tumores mamarios transformados por la inserción cercana de un virus murino (Nusse & Varmus, 1982, Cell 31:99-109). Desde entonces se han acumulado pruebas adicionales del papel de la señalización de Wnt en cáncer de mama. Por ejemplo, la sobreexpresión transgénica de ß-catenina en glándulas mamarias resulta en hiperplasias y adenocarcinomas (Imbert et al., 2001, J. Cell Biol. 153:555-68; Michaelson & Leder, 2001, Oncogene 20:5093-9) mientras que la pérdida de señalización Wnt interrumpe el desarrollo normal de la glándula mamaria (Tepera et al., 2003, J. Cell Sci. 116:1137-49; Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 8:145-58). Más recientemente, se han demostrado que los citoblastos de células mamaria se activan por señalización Wnt (Liu et al., 2004, Proc. Nat'l Acad. Sci. 101:4158). En cáncer de mama humano, la acumulación de ß-catenina implica una señalización Wnt activada en más de 50% de los carcinomas y mediante mutaciones especificas que aún no han sido identificadas, se ha observado regulación por aumento de la expresión del receptor encrespado (Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Neoplasia 9:119-31; Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol. 25: 1337-42) .

FZD10, FZD8, FZD7, FZD4 y FZD5 son cinco de diez receptores Wnt humanos identificados. FzdlO se coexpresa con Wnt7b en los pulmones y los estudios de transfección celular han demostrado que el correceptor FzdlO/LRP5 activa la vía de señalización Wnt canónica en respuesta a Wnt7b (Wang et al., 2005, Mol. Cell Biol. 25:5022-30). El ARNm para FZD10 es regulado por aumento en numerosas líneas de células cancerosas, que incluyen líneas de células de cáncer cervical, gástrico y glioblastoma y los cánceres primarios incluyen aproximadamente 40% de los cánceres gástricos primarios, cáncer de colon y sarcomas sinoviales (Saitoh et al., 2002, Int. J. Oncol. 20:117-20; Terasaki et al., 2002, Int. J. Mol. Med 9:107-12; Nagayama et al., 2005, Oncogene 1-12) . FZD8 es regulado por aumento en varias líneas de células de cáncer humano, principalmente cánceres gástricos y carcinomas renales (Saitoh et al., 2001, Int. J. Oncol. 18:991-96; Kirikoshi et al., 2001, Int. J. Oncol. 19:111-5; Janssens et al., 2004, Tumor Biol. 25:161-71). FZD7 se expresa a través del tracto gastrointestinal y es regulado por aumento en uno de los seis casos de cáncer gástrico primario humano (Kirikoshi et al., 2001, Int. J. Oncol. 19:111-5). La expresión de ectodominio FZD7 por una línea de célula de cáncer de colon indujo cambios morfológicos y crecimiento de tumor disminuido en un modelo de xenoinjerto (Vincan et al., 2005, Differentiation 73:142-53). FZD5 juega un papel esencial en la angiogénesis del saco vitelino y placentario (Ishikawa et al., 2001, Dev. 128:25-33) y es regulado por aumento en carcinomas renales en asociación o la activación de señalización de Wnt/p-catenina (Janssens et al., 2004, Tumor Biology 25:161-71). FZD4 se expresa en gran medida en células epiteliales de la cripta intestinal y es uno de los varios factores que muestra expresión diferencial en tejido normal versus neoplásico (Gregorieff et al., 2005, Gastroenterology 129:626-38). La identificación de los receptores FZD como marcadores de citoblastos cancerígenos por lo tanto vuelve a estas proteínas objetivos ideales para tratamientos terapéuticos contra el cáncer.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona agentes novedosos que se unen a uno o más receptores encrespados humanos (los FZD) , que incluyen, pero que no se limitan a anticuerpos u otros agentes que se unen a dos o más receptores encrespados humanos, y métodos de uso de los agentes. La presente invención proporciona adicionalmente polipéptidos novedosos, tales como anticuerpos que se unen a uno o más receptores encrespados humanos, fragmentos de los anticuerpos y otros polipéptidos relacionados con los anticuerpos. En algunas modalidades, el agente, los anticuerpos, otros polipéptidos o agentes que se unen a un FZD, que se unen a una región de FZD a la que se hace referencia en la presente como el sitio de unión biológico (BBS, por sus siglas en inglés) que los inventores ahora han identificado por primera vez como un objetivo para inhibir la señalización de nt y/o el crecimiento de tumores. También se proporcionan anticuerpos y otros polipéptidos que comprenden un sitio de unión a antigeno que une más de un FZD. También se proporcionan polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos asi como vectores que comprenden los polinucleótidos. Las células que comprenden a los polipéptidos y/o los polinucleótidos de la invención se proporcionan adicionalmente . Las composiciones (por ejemplo composiciones farmacéuticas) que comprenden agentes que unen FZD novedosos o anticuerpos también se proporcionan. Adicionalmente, también se proporcionan métodos de elaboración y uso de agentes de unión FZD novedosos, o anticuerpos tales como métodos de uso de los agentes o anticuerpos que unen FZD novedosos para inhibir el crecimiento de tumores y/o para tratar cáncer.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un agente que se une específicamente a un receptor encrespado humano. En algunas modalidades, el agente inhibe la unión de un ligando (por ejemplo, un Wnt) al sitio de unión biológico (BBS, por sus siglas en inglés) del receptor encrespado humano. En algunas modalidades, el agente se une a por lo menos parte del sitio de unión biológico (BBS) dentro del receptor encrespado humano. En algunas modalidades, la unión del agente al BBS resulta en la inhibición de la señalización de Wnt y/o crecimiento del tumor. En algunas modalidades, el receptor encrespado humano es FZD8 y el agente se une a por lo menos una parte de: (a) un epítopo conformacional de FZD8 conformado por los aminoácidos 72(F), 74-75 (PL), 78(1), 92 (Y) , 121-122 (LM) y 129-132 (WPDR (SEC ID NO: 70)); (b) una región de FZD8 que consiste de la secuencia QDEAGLEVHQFWPL (SEC ID NO: 67); y/o (c) una región de FZD8 que consiste de la secuencia QYGFA (SEC ID NO: 66) .

En algunas modalidades, el receptor encrespado humano unido por el agente se selecciona del grupo que consiste de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 ó FZD8 y el agente se une a por lo menos parte de la secuencia Q/DE/ED) AGLEVHQF (Y/W) PL (SEC ID NO: 24) dentro del receptor encrespado humano. Por ejemplo, en algunas modalidades, el receptor encrespado humano es FZD8 y el agente se une a por lo menos parte de la secuencia QDEAGLEVHQFWPL (SEC ID NO: 67) dentro de FZD8. En algunas modalidades, el agente se une a por lo menos parte de la secuencia GLEVHQ (SEC ID NO: 25) . En algunas modalidades, el receptor encrespado humano es FZDl, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD9 ó FZD10 y el agente se une a por lo menos parte de una región del receptor encrespado humano que corresponde a la región FZD8 que consiste de QDEAGLEVHQFWPL (SEC ID NO: 67). En algunas modalidades, el agente se une a por lo menos parte de una secuencia (K/Q) ( F/Y) GF (Q/A) (SEC ID NO: 69) dentro de FZDl , FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8. Por ejemplo, en algunas modalidades, el receptor encrespado humano es FZD8 y el agente se une a por lo menos parte de una secuencia QYGFA (SEC ID NO: 66) dentro de FZD8. En algunas modalidades alternativas, el receptor encrespado humano es FZD1, FZD2, FZD3, FZD4 , FZD5, FZD6, FZD7, FZD9 ó FZD10, y el agente se une a por lo menos parte de una región del receptor encrespado humano que corresponde a la región de FZD8 que consiste de QYGFA (SEC ID NO: 66) . En algunas modalidades, el agente se une específicamente a dos o más, tres o más o cuatro o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, el agente se une específicamente a receptores encrespados humanos que comprenden FZD5 y FZD8.

En algunas modalidades alternativas, el agente de unión a FZD es un agente que se une a un receptor FDZ humano (por ejemplo, FDZ8) en la hendidura de su BS. Por medio de ejemplo no limitante, el agente puede unirse a uno o más residuos de hendidura listados en la Tabla 16. En algunas modalidades, el agente une L75 de FDZ8. En algunas modalidades, el agente comprende un polipéptido que comprende una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-11 y SEC ID N0s:113-116. En algunas modalidades, el agente comprende la SEC ID NO: 112. En algunos casos, el agente puede comprender la SEC ID NO: 118.

En otro aspecto, la invención proporciona un agente que compite por la unión especifica a un receptor encrespado humano con un anticuerpo (por ejemplo en un análisis de unión competitivo in vitro) en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 12 ó SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, el agente compite por la unión especifica a dos o más, tres o más o cuatro o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, el agente compite por la unión especifica a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 ó FZD8.

En otro aspecto, la invención proporciona un agente que compite por la unión especifica a un FZD5 y/o FZD8 humano con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 85 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 86.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un agente de unión a FDZ que (a) compite para unión al BBS de FDZ8 con un polipéptido y/o (b) es capaz de desplazar de un FDZ8 un polipéptido que se une al BBS de FDZ8. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 98-111 y SEC ID NOs: 113-116. En algunas modalidades alternativas, el polipéptido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 112.

En otro aspecto, la invención proporciona un agente que se une específicamente a dos o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, dos o más receptores encrespados comprenden: (a) FZD1 y un segundo receptor encrespado que se selecciona del grupo que consiste de FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8; (b) FZD2 y un segundo receptor encrespado se seleccionan del grupo que consiste de FZD5, FZD7 y FZD8; (c) FZD5 y FZD7; o (d) FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, el agente se une específicamente a tres o más (es decir, 3, 4 ó 5) receptores encrespados humanos, en donde los tres o más receptores encrespados humanos comprenden FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8. En algunas modalidades, los tres o más receptores humanos comprenden FZD5 y FZD8. En algunas modalidades, tres o más receptores encrespados humanos comprenden además FZD3, FZD4, FZD6, FZD9 y/o FZD10.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido que se une específicamente a un receptor encrespado humano, en donde el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y/o (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido une específicamente FZD1, FZD2, FZD5 , FZD7 y/o FZD8. En algunas modalidades, el polipéptido une específicamente dos o más receptores encrespados humanos que incluyen FZD5 y FZD8. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido son sustituciones conservadoras.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido que se une específicamente a un receptor encrespado humano en donde el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7) o una variante de la SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 7 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), o una variante de la SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) o una variante de la SEC ID NO: 6 o SEC ID NO: 9 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido une específicamente FZD1, FZD2 , FZD5, FZD7 y/o FZD8. En algunas modalidades, el polipéptido une específicamente dos o más receptores encrespados humanos que incluyen FZD5 y FZD8. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido son sustituciones conservadoras.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2), y una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3) ; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), y una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) . En algunas modalidades, el polipéptido une específicamente un receptor encrespado humano. En algunas modalidades el polipéptido une específicamente dos o más (por ejemplo, por lo menos FZD5 y FZD8), tres o más, o cuatro o más receptores encrespados humanos.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que une específicamente un receptor encrespado humano que se selecciona del grupo que consiste de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4), SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), o una variante ya sea de SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 7 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; una cadena ligera CDR2 que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5), DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), o una variante de ya sea SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; y una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6), QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) o una variante de ya sea SEC ID NO: 6 o SEC ID NO: 9 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una CDRl de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2) y una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o D SNRPSG (SEC ID NO: 8), y una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) . En algunas modalidades el anticuerpo comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2) y una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3) y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), una CDR2 de cadena ligera que comprende DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) .

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende (a) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 10; y/o (b) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 12 o la SEC ID NO: 14. En algunas modalidades la invención proporciona un polipéptido que comprende (a) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 10; y/o (b) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, el polipéptido se une específicamente a receptor encrespado humano. En algunas modalidades, el polipéptido se une específicamente a dos o más, tres o más, o cuatro o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, uno o varios receptores encrespados humanos se seleccionan del grupo que consiste de FZDl, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un agente tal como un anticuerpo que se une específicamente a FZD5 y/o FZD8 humano, en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSSYYIT (SEC ID NO: 77), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; una CDR2 de cadena pesada que comprende TISYSSSNTYYADSVKG (SEC ID NO: 78), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; y una CDR3 de cadena pesada que comprende SIVFDY (SEC ID NO: 79), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 6 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDALGNRYVY (SEC ID NO: 80), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; una CDR2 de cadena ligera que comprende SG (SEC ID NO: 81) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; y una CDR3 de cadena ligera que comprende GS DTRPYPKY (SEC ID NO: 82), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSSYYIT (SEC ID NO: 77), una CDR2 de cadena pesada que comprende TISYSSSNTYYADSVKG (SEC ID NO: 78) y una CDR3 de cadena pesada que comprende SIVFDY (SEC ID NO: 79); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDALGNRYVY (SEC ID NO: 80), una CDR2 de cadena ligera que comprende SG (SEC ID NO: 81) y una CDR3 de cadena ligera que comprende GSWDTRPYPKY (SEC ID NO: 82) .

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido que une específicamente FZD5 y/o FZD8, en donde el polipéptido comprende: (a) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad con la SEC ID NO: 85; y/o (b) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad con la SEC ID NO: 86.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un agente que compite por unión específica a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8 humanos con cualquiera de los siguientes anticuerpos IgG: 18R8, 18R5, 18R4605 y 18R4805.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un agente que compite por unión específica a FZD5 y/o FZD8 humano con el anticuerpo IgG antiFZD 44R24.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados antes así como en otros aspectos descritos en la presente, el agente o polipéptido es un anticuerpo.

En algunas modalidades alternativas, el agente no es un anticuerpo .

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados antes, asi como en otros aspectos descritos en la presente, el agente o polipéptido o anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular (ECD) del receptor encrespado humano o receptores en los cuales se une. En algunas modalidades, de cada uno de los aspectos mencionados antes así como en otros aspectos descritos en la presente, el agente polipéptido o anticuerpo se une específicamente al dominio Fri (Fri) del receptor o receptores encrespados humano a los cuales se une.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados antes así como otros aspectos descritos en otra parte en este documento, un sitio individual que une antígeno del anticuerpo u otro polipéptido se une específicamente (o es capaz de unir) a más de un receptor encrespado humano.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados antes, así como otros aspectos descritos en la presente, el agente o polipéptido o anticuerpo inhibe la unión de un ligando a uno o varios receptores encrespados humanos. En algunas modalidades el ligando es un Wnt, que incluye, pero no se limita a Wnt3a.

En algunas modalidades, cada uno de los aspectos mencionados antes así como otros aspectos descritos en la presente, el agente o polipéptido o anticuerpo que se une a uno o varios FZD es un antagonista de uno o varios FZD.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados antes asi como otros aspectos descritos en la presente, el agente o polipéptido o anticuerpo inhibe la señalización de Wnt . En algunas modalidades, la señalización de Wnt que se inhibe es señalización Wnt canónica. En algunas modalidades, la señalización Wnt que sirve es por el agente de unión de FZD es señalización Wnt no canónica. El algunas modalidades, la señalización Wnt es señalización Wnt no canónica .

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados antes, asi como otros aspectos descritos en la presente, el agente de unión FZD o polipéptido o anticuerpo inhibe el crecimiento de tumores.

La invención proporciona adicionalmente los anticuerpos 18R8, 18R5, 184R4605, 44R24 y 18R4805 asi como fragmentos de los mismos.

La invención proporciona además composiciones, tales como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente, polipéptido o anticuerpo que une FZD.

Se proporcionan métodos para inhibir la señalización de Wnt (por ejemplo señalización Wnt canónica) y/o inhibición de crecimiento de tumor en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente que une FZD o polipéptido o anticuerpo.

También se proporcionan métodos para reducir la tumorigenicidad de un tumor que comprende citoblastos cancerígenos. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente que une FZD o polipéptido o anticuerpo a un sujeto que comprende el tumor. En algunas modalidades, la frecuencia de citoblastos cancerígenos en el tumor se reduce por administración del anticuerpo. En algunas modalidades, la administración del agente que une FZD resulta en la diferenciación de células tumorigénicas en el tumor a un estado no tumorigénico .

También se proporcionan métodos para inducir células en un tumor en un sujeto para diferenciar, los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente que une al FZD, polipéptido o anticuerpo al suj eto .

Los métodos para tratar cáncer en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, polipéptido o anticuerpo que une FZD al sujeto se proporcionan adicionalmente .

Además, también se proporcionan métodos para reducir la activación de miofibroblastos en el estroma de un tumor sólido que comprende poner en contacto el estroma con una cantidad eficaz de un agente, polipéptido o anticuerpo que une FZD.

En otros aspectos, se proporcionan métodos de tratamiento de una enfermedad asociada con la activación de la señalización Wnt . En algunas modalidades, loe métodos comprenden administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un agente, polipéptido o anticuerpo de unión a FDZ . En algunas modalidades, la enfermedad es cáncer. En algunas modalidades alternativas, la enfermedad es enfermedad renal poliquistica . En algunas modalidades, el agente de unión a FDZ es un polipéptido que une al BBS de uno o más receptores FDZ humanos. En algunas modalidades, el polipéptido de unión a FDZ comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-111 y SEC ID NOS: 113-116. En algunas modalidades, el polipéptido de unión a FDZ comprende la secuencia de la SEC ID NO: 112. En algunas modalidades alternativas, el polipéptido de unión a FDZ es 18R5.

En algunas modalidades, los métodos comprenden la administración del agente, polipéptido o anticuerpo que une FZD comprende además administrar un segundo agente anticancerigeno (por ejemplo, un agente quimioterapéutico ) al sujeto. En algunas modalidades, el segundo agente es gemcitabina, irinotecano o paclitaxel. En algunas modalidades, el segundo agente es un inhibidor de angiogénesis y/o un inhibidor de la señalización de Notch.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 10-15. De igual manera se proporcionan polipéptidos que comprenden una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 85-86. También se proporcionan polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos .

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NOS: 17-22. Se proporcionan adicionalmente polinucleótidos que comprenden una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 87-90, 92 y 94-95.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que hibridiza con un polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 17, 19, 21, 87-90, 92 y 94-95 o un polinucleótido que codifica para un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 10, 12, 14 y 85-86 bajo condiciones de alta rigurosidad. En algunas modalidades, la invención comprende un polinucleótido que hibridiza con un polinucleótido que consiste de una secuencia de las SEC ID NOS: 17, 19 ó 21 o un polinucleótido que codifica para las SEC ID NOS: 10, 12 ó 14 bajo condiciones de alta rigurosidad.

En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados antes, asi como otros aspectos descritos en la presente, se aisla el agente, polipéptido, anticuerpo o polinucleótido . En algunas modalidades, el agente, polipéptido, anticuerpo o polinucleótido está sustancialmente puro .

La presente invención proporciona además una firma de gen Wnt útil para la identificación de tumores y/o pacientes susceptibles a responder al tratamiento con un agente que une FZD (por ejemplo, un antagonista de un receptor encrespado humano y/o un inhibidor de señalización Wnt) u otros inhibidores de señalización Wnt. También se proporcionan métodos de uso de la firma del gen Wnt para seleccionar pacientes para tratamiento con un agente que une FZD u otro inhibidor de la señalización de Wnt. En algunas modalidades, los métodos involucran la determinación del nivel de uno o más genes en la firma del gen Wnt. Los métodos de cribado de los candidatos de medicamento contra tumores identificados utilizando la firma del gen Wnt también se proporcionan. También se proporcionan arreglos, kits y otras composiciones útiles en los métodos.

La presente invención también proporciona métodos de cribado para inhibidores de la señalización Wnt, candidatos de medicamentos potenciales u otros agentes. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a métodos que comprenden comparar los niveles de uno o más marcadores de diferenciación en un primer tumor sólido que se ha expuesto al agente en relación a los niveles de uno o más marcadores de diferenciación en un segundo tumor sólido que no se ha expuesto al agente. En algunas modalidades, estos métodos incluyen comprender (a) exponer un primer tumor sólido, pero no un segundo tumor sólido al agente; (b) determinar los niveles de uno o más marcadores de diferenciación en el primero y segundo tumores sólidos; y (c) comparar los niveles de uno o más marcadores de diferenciación en el primero y segundo tumores sólidos. En algunas modalidades alternativas, los métodos involucran el uso de receptores de FZD o derivados de los receptores de FZD los cuales comprenden una o más sustituciones en el BBS o polipéptidos u otros agentes los cuales han sido ya identificados como unión a porciones del BBS. Agentes identificados que usan los métodos de cribado, o que tienen las características de agentes identificados usando los métodos de cribado, son del mismo modo proporcionados, ya que son métodos que usan tales agentes para inhibir la señalización Wnt y/o en terapia.

En un aspecto, la invención proporciona un método de cribado de un compuesto de prueba para determinar actividad o posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt . En algunas modalidades, el método comprende comparar (a) la afinidad de unión del compuesto de prueba para un primer polipéptido que comprende el dominio Fri de un receptor de FZD humano (por ejemplo, FZD8) que tiene una o más sustituciones en su BBS con (b) la afinidad de unión del compuesto para un segundo polipéptido que comprende el dominio Fri de tipo nativo. Si el compuesto de prueba tiene mayor afinidad para el segundo polipéptido que el primer polipéptido, el compuesto es identificado como un inhibidor de la señalización Wnt o un posible inhibidor de la señalización Wnt. En algunas modalidades, el método comprende además las etapas adicionales de determinar primero la afinidad de unión del compuesto de prueba para el primero y segundo polipéptidos . También se proporcionan reactivos útiles en tales métodos que incluyen el dominio Fri mutante. Agentes identificados como inhibidores de la señalización Wnt (o por lo menos inhibidores Wnt potenciales) por tales métodos son del mismo modo proporcionados.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de cribado de un compuesto de prueba para determinar actividad o posible actividad como un inhibidor de la señalización Wnt que comprende determinar si el compuesto de prueba puede competir con un agente de unión a FZD (que se une al BBS) para unión a un receptor FZD humano. En algunas modalidades, la capacidad del compuesto para competir por enlace con el polipéptido indica que el compuesto tiene actividad o posible actividad como un inhibidor de la señalización Wnt .

En otro aspecto, la invención proporciona métodos alternativos de cribado de un compuesto de prueba para determinar actividad o posible actividad como un inhibidor de la señalización Wnt. En algunas modalidades el método comprende determinar si el compuesto de prueba puede desplazar un agente de unión a FZD (que se une al BBS) del receptor FZD humano al cual se une. Si el compuesto de prueba puede desplazar el agente de unión a FZD, el compuesto tiene actividad o posible actividad como un inhibidor de la señalización Wnt. Se proporcionan reactivos útiles en los ensayos de desplazamiento y unión competitiva indicados anteriormente, incluyen, sin limitación, polipéptidos que comprenden una secuencia que es por lo menos aproximadamente 80% idéntica con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs:98-lll y SEC ID NOs:113-116. Agentes identificados como inhibidores de la señalización Wnt (o por menos inhibidores Wnt potenciales) por tales ensayos de desplazamiento y unión competitiva son del mismo modo proporcionados .

En donde los aspectos o modalidades de la invención se describen en términos de un grupo arkush u otro agrupamiento de alternativas, la presente invención abarca no sólo el grupo completo incluido en su totalidad sino también cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal pero también el grupo principal ausente de uno o más miembros del grupo. La presente invención también abarca la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo en la invención reivindicada .

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. 18R8 une receptores encrespados humano múltiples. El análisis por FACS demuestra que 18R8 se une a secuencias de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8 en células HEK293 transfectadas de manera transitoria. Se muestran gráficas FACS para la unión de 18R8 a células HEK 293 transfectadas con vectores de expresión que codifican para el FZD indicado y un vector de expresión para GFP. La unión de 18R8 se indica por tinción elevada dentro de la población de células cotransfectadas (positivas a GFP) . Las gráficas FACS para FZD1, FZD2, FZD5 , FZD7 y FZD8 se encierran en un rectángulo con una línea gruesa para resaltar que los FZD muestran unión a 18R8.

Figura 2. El anticuerpo antiFZD 18R5 une múltiples receptores encrespados humanos en células. El análisis por FACS demuestra que 18R5, al igual gue 18R8 se une a secuencias FZD1, FZD2, FZD5 , FZD7 y FZD8 .en células. Los anticuerpos 18R8 y 18R5 se incubaron en una gama de concentraciones con células HEK293 que sobreexpresan FZD indicado y se determinó la unión de anticuerpo por citometria de flujo. Aunque ambos, 18R8 y 18R5 se unen a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8 , 18R5 se une con mayor afinidad.

Figura 3. Se llevaron a cabo análisis de indicador de luciferasa en células STF293 que expresan de manera estable el elemento promotor 8xTCF unido a luciferasa. Se tratan células con medio acondicionado que contiene Wnt3A asi como una gama de concentraciones de 18R8 y 18R5 y después se analizan 18 horas después utilizando el sistema indicador de análisis de luciferasa Dual-Glo (Promega) . Los resultados demuestran que ambos, 18R8 y 18R5 inhiben la señalización de Wnt y que 18R5 se une con mayor afinidad que 18R8.

Figura 4. 18R8 bloquea la señalización de TCF por Wnt múltiples. Se llevaron a cabo análisis de indicador de luciferasa en células STF293 que expresan de manera estable el elemento promotor 8xTCF unido a luciferasa. Se generaron diversas células que sobreexpresan Wnt al transfectar células HEK293 (ATCC) con vectores de expresión que codifican para las proteínas Wnt indicadas utilizando Fugene 6 (Roche) . Las células STF293 se trataron con 18R8 y se agregaron a células HEK293 que sobreexpresan Wnt y se analizaron durante 18 horas después utilizando el sistema indicador de análisis de luciferasa Dual-Glo.

Figura 5. 18R8 inhibe directamente la unión de Wnt a FZD. Los análisis indicadores de luciferasa se llevaron a cabo en células STF293 que expresan de manera estable el elemento promotor 8xTCF. Se coincubó una mezcla que contiene medio acondicionado con Wnt3A, purificado con FZD8-Fc y/o 18R8, como se indica, durante 2 h a 4°C con/sin esferas de proteina A Sepharose. Después de incubación, las esferas de proteina A Sepharose se separan y se agregan a células STF293. Las células STF293 tratadas se analizan 18 horas después utilizando el sistema indicador de análisis de luciferasa Dual-Glo. Este experimento muestra que en ausencia de 18R8, Fzd8-Fc es capaz de inhibir la habilidad de Wnt3A para estimular la señalización, pero que 18R8 es capaz de bloquear la habilidad de FZD8 para unirse a Wnt3A, como se vuelve evidente por el restablecimiento de la señalización cuando se utilizan las esferas Sepharose A para eliminar FZD8-Fc (y 18R8) a partir de la co-incubación .

Figura 6. Análisis de FACS de unión de 18R8 a FZD8 mutante en comparación con FZD8 natural. Para determinar el epitopo de 18R8 en FZD, se realizaron estudios de mapeo de epitopo. Se utilizó una construcción de expresión que habilita la expresión del dominio Fri de FZD8 humano con una etiqueta FLAG en la parte N terminal y un dominio transmembranal CD4 en la parte C terminal y se utilizó una dominio intracelular en estudios de transfección transitorios junto con un vector de expresión que codifica para GFP. Las variantes de este vector de expresión también se prepararon como las cuales contienen las sustituciones seleccionadas de aminoácidos dentro de la secuencia FZD8 para codificar para los aminoácidos en la posición correspondiente dentro del dominio Fri de otras FZD particulares no unidas por 18R8. Después se determinó por citometria de flujo la capacidad de 18R8 para unirse a estas secuencias FZD8 variantes. Algunas posiciones que incluyen los aminoácidos 66-71 y 126-127 de los FZD8 se encuentra que se requieren para unión 18R8, como se indica por la tinción reducida con la población de células co-transfectadas (positivas a GFP) . La región de la gráfica FACS muestra la unión de 18R8 a la población de células cotransfectada se resalta por un rectángulo y el rectángulo se muestra con lineas más gruesas para aquellas sustituciones de aminoácidos que muestran unión a 18R8 reducida notablemente .

Figura 7. Se muestra que 18R5 y 18R8 tienen un epitopo de unión similar sobre FZD8 humano. Se determinó por citometria de flujo en la capacidad de 18R5 para unir a un epitopo similar como 18R8 utilizando una serie de variantes de aminoácidos mostrado previamente que interrumpe la unión de 18R8. Las posiciones incluyen los aminoácidos 66-71 y 126-127 de FZD8 se encontró que son necesarios para la unión tanto de 18R8 como 18R5, como se indica por una tinción reducida dentro de la población de células cotransfectadas (positivas a GFP) . La región de la gráfica FACS que muestra la unión de 18R8 a la población de células cotransfectadas está resaltada por un rectángulo y el rectángulo se muestra con lineas gruesas para aquellas sustituciones de aminoácidos que muestran una unión de 18R8 y 18R5 notablemente reducida.

Figura 8. Comparación de las secuencias de aminoácidos de porciones de las secuencias de dominio Fri de los receptores encrespados humanos. Los sitios de los residuos conservados están sombreados en negro; los sitios con residuos aminoácidos similares están sombreados en gris. El epitopo FZD de 18R8 y 18R5 contienen las regiones indicadas por subrayado y marcadas como "borde superior" y "borde inferior". Los términos "borde superior" y "borde inferior" reflejan el reconocimiento, basado en el examen de la estructura cristalina de dominio Fri, de que estas regiones flanquean una hendidura sobre la superficie de la proteina FZD. Esta hendidura contiene residuos altamente conservados múltiples. Los aminoácidos que comprenden esta hendidura se resaltan por símbolos de zanahoria por encima de cada uno de las posiciones correspondientes dentro de la alineación. Esta región no ha sido adscrita previamente con una función específica. El descubrimiento de anticuerpos que se unen a esta región y el descubrimiento de que estos anticuerpos inhiben la unión de Wnt y la señalización de Wnt así como nuestro reconocimiento de la naturaleza conservada de esta hendidura nos ha permitido identificar esta región como un aspecto funcional clave de las proteínas FZD.

Figura 9. Sitio de unión biológico (BBS, por sus siglas en inglés) de FZD. Se muestran imágenes de la estructura de un dominio fri de Fzd. Las imágenes se basan en el análisis de la estructura cristalina reportada previamente de FZD8 de ratón (Dann CE et al., Nature 412 (6842) 86-90, 2001) y el análisis dializado utilizando el programa de software Pymol. Se muestra en la imagen izquierda superiores una vista de superficie del dominio Fri de FZD con región de la proteína Fzd que comprende el sitio de unión biológica (BBS) que los inventores han descubierto (circundada por un óvalo blanco) . Esta es la región unida por los anticuerpos 18R8 y 18R5. Esta región contiene elementos estructurales que denominamos el "borde superior", el "borde inferior" y la "hendidura". Cada uno de estos se resalta en una coloración de superficie más oscura en imágenes separadas en el fondo del panel. La imagen derecha superior resalta en la superficie más oscura los residuos que están conservados en nueve o diez de los diez miembros de la familia Fzd humano y resalta el reconocimiento de que un agrupamiento distinto de estos residuos se produce dentro del centro de la región de "hendidura" flanqueado por el epítopo que une anticuerpos para inhibir la función Fzd.

Figura 10. Prevención del crecimiento de tumor dependiente de Wnt por mAb antiFZD. Ratones NOD/SCID inyectados con 50,000 células derivadas de tumor WNTl de MMTV y crecimiento de tumor se monitoreó cada semana hasta que se detecta el crecimiento y después se midió el crecimiento del tumor dos veces a la semana. Diez ratones con tumores establecidos se trataron ya sea con 18R8 o un anticuerpo control como un control. El crecimiento de tumor en animales tratados con 18R8 se eliminó virtualmente en comparación con el observado en animales tratados con el anticuerpo control.

Figura 11. Reducción de crecimiento de tumor de xenoinjerto O P-C28 por tratamiento combinado de 18R5 e irinotecano. Se inyectó a ratones NOD/SCID con 10,000 células de tumor de colon OMP-C28 y, en el día 24, los ratones con tumores con un volumen promedio de 129 mm3 se distribuyeron aleatoriamente y se iniciaron los tratamientos indicados. El crecimiento del tumor se monitoreó semanalmente . El crecimiento de tumor en los animales tratados 18R5 se reduce significativamente. Además, la combinación de 18R5 e irinotecano se reduce de manera significativa sobre el tratamiento con cualquiera de los agentes solos.

Figura 12. Reducción del crecimiento de tumor de xenoinjerto OMP-PN4 por tratamiento combinado de 18R5 y gemcitabina. Se inyectó a ratones NOD/SCID con 50,000 células tumorales pancreáticas OMP-PN4 y, en el día 38, los ratones con tumores de volumen promedio de aproximadamente 120 mm3 fueron distribuidos aleatoriamente y los tratamientos indicados se iniciaron dos días después. El crecimiento de tumor en los animales tratados con la combinación de 18R5 y gemcitabina se redujo significativamente en comparación con el tratamiento únicamente con gemcitabina.

Figura 13. Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera para 18R8 y 18R5, que incluyen las secuencias VH y VL.

Figura 14. Secuencias nucleotídicas que codifican para la cadena pesada y secuencias VH de 18R8 y 18R5.

Figura 15. Secuencias nucleotídicas que codifican para la cadena ligera y secuencias VL de 18R8 y 18R5.

Figura 16. Secuencias de aminoácidos de la proteína Fe de ECD FZD7 y secuencia nucleotídica que codifica para la misma.

Figura 17. Secuencias de aminoácidos de FZDl humano (SEC ID NO: 26), el dominio extracelular (ECD) de FZDl (SEC ID NO: 27, que se muestra como aminoácidos subrayados 1-321 de la SEC ID NO: 26), y el dominio Fri de FZDl (SEC ID NO: 28).

Figura 18. Secuencias de aminoácidos de FZD2 humano (SEC ID NO: 30) , el dominio extracelular (ECD) de FZD2 (SEC ID NO: 31, que se muestra como aminoácidos subrayados 1-250 de la SEC ID NO: 30) y el dominio Fri de FZD2 (SEC ID NO: 32) .

Figura 19. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD1 humano.

Figura 20. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD2 humano.

Figura 21. Secuencias de aminoácidos de FZD3 humano (SEC ID NO: 34), el dominio extracelular (ECD) de FZD3 (SEC ID NO: 35, mostrado como aminoácidos subrayados 1-204 de la SEC ID NO: 34) y el dominio Fri de FZD3 (SEC ID NO: 36) .

Figura 22. Secuencias de aminoácidos de FZD4 humano (SEC ID NO: 38), el dominio extracelular (ECD) de FZD4 (SEC ID NO: 39, mostrado como aminoácidos subrayados 1-224 de la SEC ID NO: 38) y el dominio Fri de FZD4 (SEC ID NO: 40) .

Figura 23. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD3 humano.

Figura 24. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD4 humano.

Figura 25. Secuencias de aminoácidos de FZD5 humano (SEC ID NO: 42), el dominio extracelular (ECD) de FZD5 (SEC ID NO: 43, que se muestra como aminoácidos subrayados 1-233 de la SEC ID NO: 42) y el dominio Fri de FZD5 (SEC ID NO: 44) .

Figura 26. Secuencias de aminoácidos de FZD6 humano (SEC ID NO: 46), el dominio extracelular (ECD) de FZD6 (SEC ID NO: 47, mostrado como aminoácidos subrayados 1-207 de la SEC ID NO: 46) y el dominio Fri de FZD6 (SEC ID NO: 48) .

Figura 27. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD5 humano.

Figura 28. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD6 humano.

Figura 29. Secuencias de aminoácidos de FZD7 humano (SEC ID NO: 50), el dominio extracelular (ECD) de FZD7 (SEC ID NO: 51, que se muestra como aminoácidos subrayados 1-255 de la SEC ID NO: 50) y el dominio Fri de FZD7 (SEC ID NO: 52) .

Figura 30. Secuencias de aminoácidos de FZD8 humano (SEC ID NO: 54), el dominio extracelular (ECD) de FZD8 (SEC ID NO: 55, que se muestra como aminoácidos subrayados 1-277 de la SEC ID NO: 54) y el dominio Fri de FZD8 (SEC ID NO: 56) .

Figura 31. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD7 humano.

Figura 32. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD8 humano.

Figura 33. Secuencias de aminoácidos de FZD9 humano (SEC ID NO: 58), el dominio extracelular (ECD) de FZD9 (SEC ID NO: 59, que se muestra como aminoácidos subrayados 1-230 de la SEC ID NO: 58) y el dominio Fri de FZD9 (SEC ID NO: 60) .

Figura 34. Secuencias de aminoácidos de FZD10 humano (SEC ID NO: 62), el dominio extracelular (ECD) de FZD10 (SEC ID NO: 63, que se muestra como aminoácidos subrayados 1-227 de la SEC ID NO: 62) y el dominio Fri de FZD10 (SEC ID NO: 64) .

Figura 35. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD9 humano.

Figura 36. Secuencia nucleotidica que codifica para FZD10 humano.

Figura 37. Reducción del crecimiento de tumor de mama PE-13 con tratamiento combinado de anticuerpo 18R5 y paclitaxel. Se inyectó a ratones NOD/SCID con 10,000 células tumorales de mama PE-13 y, en el día 22, los ratones con tumores del volumen promedio de aproximadamente 120 mm3 se distribuyeron aleatoriamente. Los ratones después se trataron ya sea con un anticuerpo control ("Ab control"), anticuerpo 18R5 ("antiFZD"), paclitaxel ("taxol"), o una combinación del anticuerpo 18R5 más paclitaxel ( "antiFZD+Taxol" ) .

El tratamiento con el anticuerpo 18R5 en combinación con paclitaxel resulta en actividad antitumoral.

Figura 38. Crecimiento de tumor de mama en animales individuales tratados con la combinación de anticuerpo 18R5 más paclitaxel. El tratamiento con anticuerpo 18R5 en combinación con paclitaxel resultó en una regresión de tumores de mama establecidos.

Figura 39. Muestra análisis de citometria de flujo de células tumorales colorrectales después del tratamiento con anticuerpo control, anticuerpo 18R5, irinotecano o ambos, anticuerpo 18R5 e irinotecano.

Figura 40. Crecimiento de tumor en ratones después de la administración del 30, 90, 270 u 810 células tumorales obtenidas de ratones que han sido tratados durante 41 días ya sea con anticuerpo control ("control"), anticuerpo 18R5 ("antiFZD"), gemcitabina ( "Gemcitabina" ) , o la combinación de 18R5 más gemcitabina ("combinación").

Figura 41. Frecuencia de citoblastos cancerosos (CSC, por sus siglas en inglés) en tumores pancreáticos PN-4 después de tratamiento con anticuerpo control ( "Ab control"), anticuerpo 18R5 solo ("antiFZD"), gemcitabina sola ("gemcitabina") o la combinación de anticuerpo 18R5 y gemcitabina ("combinación"), determinado por análisis de dilución limitante.

Figura 42. Cromatograma de expresión de gen en células tumorales pancreáticas que han sido tratadas con anticuerpo control ("LZ-1"), anticuerpo 18R5 solo ("18R5"), gemcitabina sola ("Gem") o una combinación de gemcitabina y 18R5 ("Combo") .

Figura 43. Tratamiento con el anticuerpo antiFZD, 18R5 promueve la diferenciación de células tumorales en células mucinosas no proliferativas . Se inyectó a ratones NOD/SCID con 50,000 células tumorales pancreáticas OMP-PN13 y, en el día 23, los ratones con tumores con un volumen promedio de aproximadamente 107 rara3 fueron distribuidos aleatoriamente y en tratamiento con el anticuerpo control o 18R5 se inició 4 días después. Después de 20 días los tumores se recolectaron y se rebanaron en secciones. Las secciones de tumor de ratones tratados con 18R5 o ratones tratados con anticuerpo control se tiñeron con tinción azul alcian para mostrar células mucinosas y por inmunohistoquimica con anticuerpo para ki67 para mostrar células proliferativas . Las células mucinosas ejemplares y las células proliferativas están resaltadas por flechas.

Figura 44. Anticuerpo antiFZD, 18R5, sólo y en combinación con taxolMR (paclitaxel) inhibe el crecimiento de tumor de xenoinjerto OMP-LU24. Ratones que presentan tumores de pulmón humano OMP-LU24 se trataron ya sea con anticuerpo control ("Control Ab"), antiFZD 18R5 ("18R5"), TaxolMR ("Taxol") o la combinación de 18R5 más TaxolMR ( "18R5+Taxol" ) .

Figura 45. Anticuerpo antiFZD, 18R5, sólo y en combinación con AvastinMR (bevacizumab) , inhibe el crecimiento de tumor de xenoinjerto O P-LU33. Los ratones que presentan tumores de pulmón humano OMP-LU33 se tratan ya sea con anticuerpo control (cuadros), AvastinMR (triángulos con la punta hacia arriba) y antiFZD 18R5 (triángulos con la punta hacia abajo), o la combinación de 18R5 más AvastinMR (círculos) .

Figura 46. La combinación de anticuerpo antiFZD 18R5 con Herceptin (trastozumab) inhibe el crecimiento de crecimiento de tumor de xenoinjerto T3. Los ratones que presentan tumores de mama humano T3 se tratan ya sea con anticuerpo control (cuadros) , antiFZD 18R5 (triángulos) , HerceptinMR (circuios negros) , o una combinación de 18R5 más HerceptinMR (circuios blancos) .

Figura 47. Perfiles de unión a Fzd de 18R5 y 44R24. Curva dosis-respuesta que representa la unión de cada mAb a Fzdl,2, 5, 7 y 8.

Figura 48. Inhibición de la actividad indicadora inducida por Wnt3a en células STF por 18R5 y 44R24 (curvas dosis-respuesta) .

Figura 49. Inhibición de nivel basal de la expresión del gen axin2 por 18R5 y 44R24.

Figura 50. Detección por IHC por Mucl6 en tumores OMP-PN13 tratados con 18R5 o 44R24.

Fiquras 51A-51B. Inhibición de actina de músculo liso en tumor pancreático tratado con 18R5. Fig. 51A. Niveles de expresión del gen ACTA2, detectados por microarreglo. Fig. 51B. Detección por SMA en tumores OMP-PN4 tratados con mAb control (panel superior) y 18R5 (panel inferior) .

Figura 52A-52C. Prueba de la tumorigenicidad de células OMP-PN13 Mucl6+ inducido por 18R5. 52A. Gráfica FACS de células tumorales OMP-PN13 suprimidas en lin teñidas para Mucl6. Las dos poblaciones clasificadas se encuentran en circuios. 52B. Imágenes representativas de tumores que resultan de la inyección de células Mucl6- (panel superior) y Mucl6+ (panel inferior). 52C. Curvas de crecimiento de tumor.

Figura 53. Inhibición de recurrencia de tumor por mAb antiFZD, 18R5 en xenoinjerto de tumor de mama PE13.

Figura 54. Reducción de frecuencia de citoblastos cancerosos de mama por mAb 18R5 antiFZD.

Figura 55. Inhibición de recurrencia de tumor por mAb antiFZD 18R5 en xenoinjerto de tumor pancreático PN4.

Figura 56. Inhibición del crecimiento de tumor por mAb antiFZD 44R24 y en combinación con gemcitabina en xenoinjerto de tumor pancreático PN4.

Figura 57. Análisis por FACS de la unión de mAb antiFZD 44R24 para FZD8 mutante en relación a FZD8 natural. La región de la gráfica FACS muestra la unión de 44R24 a la población de células cotransfectadas y se resalta por un rectángulo. El rectángulo para las sustituciones de aminoácidos muestra unión 44R24 reducida notablemente y se marca con una flecha.

Figura 58. Actividad antitumoral de anticuerpos antiFZD 44R24 y 18R5 en xenoinjertos de tumor de colon C28.

Figura 59. Inducción de expresión de citoqueratina 7 en xenoinjertos de tumor de colon C28 tratados con anticuerpos antiFZD 44R24 o 18R5.

Figuras 60A-60C. Residuos dentro del sitio de unión OMP-18R5 impactan la unión Wnt . Fig. 60A. Se muestran imágenes de la estructura de un dominio fri Fzd. Las imágenes se basan en el análisis de la estructura cristalina reportada previamente de FZD8 de ratón (Dann CE et al., Nature 412 (6842) 86-90, 2001) y análisis hecho usando el software del programa Pymol. Esta región contiene elementos estructurales que llamamos el "borde superior" el "borde inferior" y la "hendidura". Mostrada en la imagen superior izquierda está una vista de superficie del dominio fri FZD con la región de la proteina Fzd que resalta residuos conservados en nueve o diez de los receptores encrespados humanos. El lado derecho superior resalta algunos de los residuos unidos por 18R5. Fig. 60B. Se muestran imágenes que representan la posición de cuatro sustituciones de aminoácido dentro de la región de hendidura por un resaltado en gris. Se lista la posición y sustitución de aminoácido (código de aminoácido de una letra) dentro del FZD8 humano. Fig. 60C. Se examinó la capacidad de las proteínas de fusión FZD8-Fc que incluyen las variantes que contienen sustituciones de aminoácido dentro de la región de hendidura para actuar como moléculas señuelo solubles para unión a Wnt3A. Se llevaron a cabo ensayos del reportero luciferasa en células STF293 que expresan establemente el elemento promotor 8xTCF. Las células se expusieron a medio que contiene Wnt3A y un intervalo de diluciones de medio que contiene variantes de FZD8-Fc por 18 horas y después se midió la actividad de luciferasa con el sistema reportero de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega) . Los resultados demuestran que variantes FZD8-Fc que contienen sustituciones de aminoácido con la región de hendidura son menos capaces de unirse a Wnt3A e inhibir su capacidad para provocar señalización Wnt con las células STF293.

Figura 61. Identificación de péptidos que unen a FZD. Se muestran datos de ELIS que prueban la capacidad de clones de fago individuales que expresan péptidos para unión a FZD8-Fc o una proteina de control negativo, DLL4-Fc. Las flechas resaltan varios clones positivos por medio de ej emplo .

Figura 62. Análisis de secuencias peptidicas de unión FZD. Se muestran secuencias peptidicas encontradas para unión específicamente a FZD. Se identificaron secuencias peptidicas tanto cíclicas como lineales. Los péptidos cíclicos muestran una clara similitud de secuencia que permite la definición de una secuencia consenso. Debido a que la biblioteca peptídica es probable contenga todas las variaciones de aminoácido posible relacionadas a este consenso, es probable que variantes adicionales fuera de este consenso podrían también ser capaz de unión a FZD. Los péptidos lineales no presentan fuerte similitud consenso. Sin embargo, varias de estas secuencias (por ejemplo clon#2 DTLSALIERGLM (SEC ID NO: 112)) fueron ligantes FZD potentes a la región de unión 18R5 de FZD y unidos dentro de la región de hendidura encontrada por ser importante para interacción Wnt-FZD.

Figura 63. Péptidos de unión FZD se unen dentro de la "hendidura" en la región de unión 18R5/unión Wnt . Para examinar la capacidad de los péptidos de unión FZD para interactuar con la "hendidura" dentro de la región de unión 18R5, se condujo ELISA que prueba la capacidad de los clones de fago individual que expresan péptidos para unión a FZD8-FC o una variante FZD8-Fc (Mut2) que contiene una sustitución de aminoácido dentro de la hendidura, o una proteina de control negativa, DLL4-Fc. Muchos de los péptidos unen la proteina FZD8-Mut2 mucho menos bien que el FZD8 de tipo nativo. Varios péptidos, ya resaltados por las flechas, presentan poca si la hay, unión a la proteina FZD8-Mut2 indicando que se unen específicamente dentro de la "hendidura". Un ejemplo de tal péptido, clon#2, tiene la secuencia DTLSALIERGLM (SEC ID NO: 112) .

Figura 64. Inhibición de señalización Wnt por péptidos que se unen a FZD. Se muestran los resultados de estudios de reportero luciferasa dependiente de Wnt que examinan la capacidad de dos péptidos (clones #2 y #24) para inhibir la señalización Wnt. Los dos péptidos fueron generados por síntesis química. Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) y después diluyeron en el ensayo reportado a las concentraciones indicadas. El ensayo reportero utiliza células HEK293 transíectadas con un plásmido que contiene el reportero de luciferasa 8XTCF sensible a Wnt. Las células se expusieron a Wnt3 A y el péptido indicado y después incubaron por 16 horas. Se determinó la actividad Wnt usando el ensayo de luciferasa Dual-glo (Promega) .

Figura 65. Dominios Fri mínimos de FZD1-5 humanos.

Figura 66. Dominios Fri mínimos de FZD6-10 humanos.

Figura 67. Anticuerpo 18R5 antiFZD inhibe la capacidad de varios Wnt para inducir señalización canónica.

Figura 68. Unión de 18R5 a FZD inhibe la interacción de WNT con FZD.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona agentes novedosos que incluyen, pero que no se limitan a polipéptidos tales como anticuerpos que se unen a uno o más receptores encrespados humanos (FZD). Los polipéptidos y polinucleótidos relacionados, las composiciones que comprenden las patentes de unión de FZD y los métodos de elaboración de los agentes de unión a FZD también se proporcionan. Se proporcionan adicionalmente métodos de uso de los agentes de unión FZD novedosos, tales como métodos para inhibir el crecimiento de tumores y/o para tratar cáncer.

En parte, la invención se basa en la identificación de una región dentro de los receptores encrespados humanos que es un objetivo adecuado para agentes anticancerigenos que unen FZD. Se encontraron dos anticuerpos antiFZD, 18R8 y 18R5 que se unen específicamente FZD7, pero que también dan reacción cruzada con FZDl, FZD2, FZD5 y FZD8 (Ejemplos 1 y 2, más adelante) . Los experimentos in vitro con el anticuerpo 18R8 indican que el anticuerpo es capaz de inhibir la señalización de NT (Ejemplo 3, más adelante) e inhibe la unión de los ligandos de Wnt a FZD8 (Ejemplo 4 más adelante) . El anticuerpo 18R5 también ha demostrado que de igual manera es capaz de inhibir la señalización de Wnt en análisis basados en células (Ejemplos 3 y 20, más adelante) . Los experimentos in vivo con el anticuerpo 18R5 demuestran que el anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento o la recurrencia de tumor (Ejemplos 7, 17 y 23, más adelante) . Los inventores también han demostrado que el anticuerpo antiFZD, 18R5, es capaz de reducir la frecuencia de linfoblastos cancerosos en tumores (Ejemplos 8 y 23, más adelante) e induce la diferenciación y/o reduce la tumorigenicidad de células tumorales (Ejemplos 16, 21, 22 y 25, más adelante) . Los experimentos de mapeo de epítopos con estos anticuerpos activos 18R8 y 18R5 indican que ambos anticuerpos se unen a por lo menos parte de la secuencia GLEVHQ (SEC ID NO: 25) y por lo menos parte de la secuencia YGFA (SEC ID NO: 74) dentro de FZD8 (Ejemplo 5, más adelante) . En base en la actividad biológica demostrada de estos dos anticuerpos, se analizó la estructura cristalina de encrespado 8 de ratón (Dann et al., Nature, 412: 86-90 (2001) ) y una región extracelular de proteínas encrespadas que comprenden estas secuencias que previamente no habían sido adscritas a función específica alguna se identificaron por primera vez que juegan un papel funcional importante en la biología de FZD y en la señalización de Wnt (Ejemplo 6) . Esta región de receptores encrespados humanos, designa el sitio de unión biológico (BBS, por sus siglas en inglés), es un objetivo adecuado para tratamientos contra el cáncer.

Además, se encontró que un tercer anticuerpo, 44R24, se une específicamente a FZD5 y FZD8 humanos (véase Ejemplo 19, más adelante) . Este anticuerpo también se ha demostrado que es capaz de inhibir la señalización de Wnt en análisis basados en célula (Ejemplo 20, más adelante) y de eficacia antitumoral in vivo (Ejemplos 23 y 25, más adelante) . Al igual que el tratamiento con anticuerpos antiFZD 18R8 y 18R5, el tratamiento del tumor con 44R24 resulta en niveles aumentado de un marcador de diferenciación en el tumor (Ejemplo 25, a continuación) . El mapeo de epítopos también ha demostrado que el epítopo del anticuerpo antiFZD 44R24 se superpone con el de los anticuerpos antiFZD 18R8 y 18R5. De manera más específica, se ha demostrado que 44R24 se une a por lo menos parte de la región YGFA (SEC ID NO: 74) en el BBS (Ejemplo 24, más adelante).

I. Definiciones Para facilitar la comprensión de la presente invención se definen a continuación un número de términos y frases .

El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y que se une específicamente a un objetivo, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores a través de por lo menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos Fab, Fab 1 , F(ab')2 y Fv) , mutantes Fv de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés), anticuerpos multiespecífieos tales como anticuerpos biespecífieos generados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno en la medida en que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas : IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2), en base en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada a los que se les denomina como , d, e , ? y µ respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen diferentes estructuras de subunidad bien conocidas y configuraciones tridimensionales. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados a otras moléculas tales como toxinas, radioisótopos, etc.

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinadoras antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a los fragmentos Fab, Fab ' , F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecificos que se forman a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea involucrada en el reconocimiento altamente especifico y la unión de un determinante antigénico único o epitopo. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. El término "anticuerpo monoclonal" abarca anticuerpos monoclonales intactos y de longitud completa asi como fragmentos de anticuerpo (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , mutantes de cadena sencilla (scFv) , proteínas de fusión que comprende una porción de anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, el "anticuerpo monoclonal" se refiere a los anticuerpos elaborados de cualquier número de manera que incluyen pero que no se limitan a hibridoma, selección de fago, expresión recombinante y animales transgénicos .

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a las formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) que son cadenas de inmunoglobulina específicas, inmunoglobulinas quiméricas o fragmentos de las mismas que contienen secuencias no humanas (por ejemplo murinas) mínimas. Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las cuales los residuos de la región determinadora de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) son sustituidas por residuos de la CDR de una especie no humana (por ejemplo ratón, rata, conejo, hámster) que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, los residuos de la región de infraestructura (FR, por sus siglas en inglés) Fv de una inmunoglobulina humana se sustituyen con los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado se puede modificar adicionalmente por la sustitución de residuos adicionales ya sea en la región de infraestructura Fv y/o dentro de los residuos no humanos sustituidos para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad o por lo menos uno y típicamente dos o tres dominios variables que contienen la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender por lo menos una porción de una región constante o dominio de inmunoglobulina (Fe), típicamente el de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de métodos utilizados para generar anticuerpos humanizados se describen en la patente de E.U.A. 5, 225, 539.

El término "anticuerpo humano" significa un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a un anticuerpo producido por un humano elaborado utilizando cualquier técnica conocida en el ámbito. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos y/o anticuerpos que comprenden por lo menos un polipéptido de cadena pesada y/o ligera humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende cadena ligera murina y polipéptidos de cadena pesada humana.

El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. Típicamente, la región variable de las cadenas tanto ligera como pesada corresponde a la región variable de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos (por ejemplo ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas mientras que las regiones constantes son homologas a las secuencias en anticuerpos derivados de otro (habitualmente humano) para evitar inducir una respuesta inmunitaria en ésa especie.

El término "epítopo" o "determinante antigénico" se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refieren a la porción de un antígeno capaz de ser reconocida y ser unida específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido se pueden formar epítopos a partir de aminoácidos contiguos y aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos típicamente se retienen en la desnaturalización de la proteína mientras que los epítopos formados por plegamientos terciarios típicamente se pierden al desnaturalizar la proteína. Un epítopo típicamente incluyen por lo menos tres y de manera más habitual por lo menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

Que un anticuerpo "se una específicamente" a un epítopo proteína significa que el anticuerpo reacciona o se asocia más frecuentemente, con mayor rapidez y con una duración mayor, con una afinidad mayor o con alguna combinación de lo anterior, a un epítopo o proteína que con sustancias alternativas, incluyendo proteínas no relacionadas. En algunas modalidades, "que se une específicamente" significa, por ejemplo, que un anticuerpo se une a una proteína con una KD de aproximadamente 0.1 mM o menor, pero de manera más habitual menor de aproximadamente 1 µ . En algunas modalidades, que "se une específicamente" significa que un anticuerpo se une a una proteína a veces con una KD de por lo menos aproximadamente 0.1 µ? o menos y otras veces a por lo menos aproximadamente 0.01 µ? o menos. Debido a la identidad de secuencia entre proteínas homologas en especies diferentes, la unión específica puede incluir un anticuerpo que reconoce una proteína particular tal como un receptor encrespado en más de una especie. De igual manera, debido a que la homología entre receptores FZD diferentes (por ejemplo FZD5 y FZD8) en ciertas regiones de las secuencias polipeptídicas de los receptores, la unión específica puede incluir un anticuerpo (u otro polipéptido o agente) que reconozca más de un receptor encrespado. Se entiende que un anticuerpo o una porción de unión que une específicamente a un primer objetivo puede o no unirse específicamente a un segundo objetivo. De esta manera, el término "unión específica" no necesariamente requiere (aunque puede incluir) unión excluyente, es decir, unión a un objetivo único. De esta manera, en algunas modalidades un anticuerpo se puede unir específicamente a más de un objetivo (por ejemplo FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8 humano) . En algunas modalidades, los objetivos múltiples se pueden unir al mismo sitio de unión a antígeno en el anticuerpo. Por ejemplo, en ciertas circunstancias un anticuerpo puede estar constituido de dos sitios idénticos que unen antígeno, cada uno de los cuales se une específicamente a dos o más receptores de encrespado humanos (por ejemplo, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8 humanos) . En algunas modalidades alternativas, un anticuerpo puede ser biespecífico y comprender por lo menos dos sitios que unen antígeno con especificidades diferentes. A modo de ejemplo no limitante, un anticuerpo biespecífico puede comprender un sitio que une antígeno el cual reconoce un epítopo en un receptor encrespado, tal como FZD5 humano y comprende además un segundo sitio que une antigeno, diferente, que reconoce un epítopo diferente en un segundo receptor encrespado, tal como FZD8 humano. De manera general, aunque no necesariamente, se hace referencia a un medio que se une como unión específica.

Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición el cual es "aislado" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición la cual está en forma no encontrada en la naturaleza. Los polipéptidos , anticuerpos, polinucleótidos , vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos los cuales han sido purificados en un grado en el que ya no se encuentran más en una forma en la cual se les encuentra en la naturaleza. En algunas modalidades, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición el cual está aislado, es sustancialmente puro.

Como se utiliza en la presente, "sustancialmente puro" se refiere a un material el cual es por lo menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes) , de manera más preferible por lo menos 90% puro, de manera mucho más preferible por lo menos 95% puro, de manera mucho más preferible por lo menos 98% puro, de manera más preferible por lo menos 99% puro.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica de mamíferos en la cual una población de células se caracteriza por crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cánceres de células escamosas, cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar amicrocitico, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cánceres de las vías respiratorias y digestivas altas.

Los términos "tumor" y "neoplasma" se refiere a cualquier base de tejido que resulta de crecimiento o proliferación celulares excesivos, ya sea benigno (no canceroso) o maligno "canceroso" que incluye lesiones precancerosas .

Los términos "citoblasto canceroso", "citoblasto tumoral" o "citoblasto de tumor sólido" se utiliza de manera intercambiable en la presente y se refieren a una población de células de un tumor sólido que: (1) tienen capacidad proliferativa extensa; (2) son capaces de división celular asimétrica para generar una o más clases de descendencia diferenciada con potencial proliferativo o de desarrollo reducido; y (3) son capaces de divisiones celulares simétricas para autorrenovacion o automantenimiento . Estas propiedades de los "citoblastos cancerosos", "citoblastos tumorales" o "citoblastos de tumor sólido" confieren a los citoblastos cancerosos la capacidad de formar tumores palpables al realizar transplante en serie en ratones inmunodeteriorados , en comparación con la mayor parte de las células tumorales que no forman tumores. Los citoblastos cancerosos experimentan autorrenovacion versus diferenciación de una manera caótica para formar tumores con tipos de células anormales que pueden cambiar con el tiempo conforme se producen mutaciones.

Los términos "célula cancerosa", "célula tumoral" y equivalentes gramaticales se refieren a la población total de células derivadas de un tumor o una lesión precancerosa que incluyen células no tumorigénicas , las cuales comprenden el volumen de la población de células tumorales asi como citoblastos tumorigénicos (citoblastos cancerosos) . Como se utiliza en la presente, el término "célula tumoral" se modificará por el término "no tumorigénico" cuando se refiera únicamente a aquellas células tumorales que carecen de la capacidad de renovarse y diferenciarse para distinguir a estas células tumorales de los citoblastos cancerosos.

El término "tumorigénico" se refiere a características funcionales de un citoblasto tumoral sólido que incluye las propiedades de autorrenovación (lo que da lugar a citoblastos cancerosos tumorigénicos adicionales) y proliferación para generar la totalidad de otras células tumorales (lo que genera células tumorales indiferenciadas y por lo tanto no tumorigénicas ) que permiten que los citoblastos tumorales sólidos formen un tumor. Estas propiedades de autorrenovación y proliferación para generar todas las demás células tumorales le confieren a los citoblastos cancerosos la capacidad de formar tumores palpables ante transplante en serie en un ratón inmunodeteriorado en comparación con células tumorales no tumorigénicas las cuales son incapaces de formar tumores cuando se produce transplante en serie. Se ha observado que las células tumorales no tumorigénicas pueden formar un tumor por transplante primario en un ratón inmunodeteriorado después de obtener las células tumorales de un tumor sólido, pero las células tumorales no tumorigénicas no producen un tumor por transplante en serie.

El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo un mamífero) que incluye, pero que no se limita a humanos, primates no humanos, roedores y similares los cuales van a ser los receptores de un tratamiento particular. Habitualmente, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan de manera intercambiable en la presente con referencia a un sujeto humano.

Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de un compuesto que es farmacéuticamente aceptable y que posee la actividad farmacológica deseada del compuesto original .

Un "excipiente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente, portador o adyuvante que se puede administrar a un sujeto, junto con por lo menos un anticuerpo de la presente descripción y el cual no destruye la actividad farmacológica del mismo y es no tóxico cuando se administra en dosis suficientes para suministrar la cantidad terapéutica del compuesto .

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el cual se administra por lo menos un anticuerpo de la presente descripción.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido o polinucleótido, molécula orgánica pequeña u otro medicamento eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento pueda reducir el número de células cancerosas, reducir el tamaño del tumor, inhibir o detener la infiltración de células cancerosas a órganos periféricos que incluye, por ejemplo, la diseminación del cáncer a tejido suave y grueso; inhibir y tener la metástasis tumoral; inhibir y detener el crecimiento del tumor; aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer; reducir la morbilidad y mortalidad; mejorar la calidad de vida, disminuir la tumorigenicidad, la frecuencia tumorigénica o la capacidad tumorigénica de un tumor; reducir el número o frecuencia de citoblastos cancerosos en el tumor; diferenciar células tumorigénicas a un estado no tumorigénico; o una combinación de estos efectos. En la medida en que el medicamento evite el crecimiento y/o destruya células cancerosas existentes se puede denominar que es citostático y/o citotóxico.

Los términos tales como "tratar" o "tratamiento" o "trato" o "alivio" o "aliviar" se refieren tanto a: 1) medidas terapéuticas que curan, frenan, disminuyen los síntomas y/o detienen el progreso de una condición patológico o trastorno diagnosticado y 2) medidas profilácticas o preventivas que evitan y/o frenan el desarrollo de una condición patológica o trastorno objetivo. De esta manera, aquellos en necesidad del tratamiento incluyen a lo ya mencionado con el trastorno; aquellos susceptibles a presentar el trastorno y aquellos en quienes se debe evitar el trastorno. En algunas modalidades, un sujeto es "tratado" con éxito contra el cáncer, de acuerdo con los métodos de la presente invención si el paciente muestra uno o más de lo siguiente: una reducción en el número o la ausencia completa de células cancerosas; una reducción en el tamaño del tumor; inhibición o ausencia de infiltración de células cancerosas a órganos periféricos que incluyen, por ejemplo, la diseminación del cáncer a tejido suave y hueso; inhibición o ausencia de metástasis tumoral; inhibición o ausencia de crecimiento de tumor; alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico; morbilidad y mortalidad reducidos; mejoramiento en la calidad de vida; reducción de la tumorigenicidad, frecuencia tumorigénica o capacidad de un tumor; reducción en el número o frecuencia de citoblastos cancerosos en un tumor; diferenciación de células tumorigénicas a un estado no tumorigénico o alguna combinación de efectos.

Los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se utilizan de manera intercambiable en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos modificados o bases y/o sus análogos o cualquier sustrato que se puede incorporar en un polímero por una polimerasa de ADN o de ARN. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados y sus análogos.

Si están presentes, la modificación de la estructura nucleotídica se puede impartir antes o después del ensamblado del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componentes no nucleotídicos . Un polinucleótido puede ser modificado adicionalmente después de polimerización, por ejemplo por conjugación con un componente de marcado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "remates", sustitución de uno o más nucleótidos como se encuentran de manera natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo fosfonatos de metilo, fosfotriésteres , fosforoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen porciones pendientes tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo metales, metales radioactivos, boro o metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos anoméricos a, etc.) así como formas no modificadas de uno o varios polinucleótidos . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo habitualmente presentes en los azúcares se pueden sustituir, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o se pueden conjugar a soportes sólidos. Un OH terminal 5' y 3' se puede fosforilar o sustituir con aminas o porciones de grupo de remate orgánico o de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en el ámbito y que incluyen, por ejemplo, 2 ' -0-metilo-, 2'-0-alilo, 2'-fluoro- o 21 -azido-ribosa , análogos de azúcar carboxíclico, azúcares a-anoméricos , azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas , análogos aciclicos y análogos nucleosidicos abásicos tales como metilribósido . Uno o más enlaces fosfodiéster pueden ser sustituidos por grupos enlazantes alternativos. Estos grupos enlazantes alternativos incluyen pero no se limitan a modalidades en donde el fosfato es sustituido por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato") , "(0)NR2 ("amidato"), P(0)0R\ CO o CH2 ( "formacetal" ) , en la cual cada R o R1 es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (de 1 a 20 átomos de carbono) que opcionalmente contiene un enlace éter (—O--) arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en la presente que incluyen ARN y ADN.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera de anticuerpo o la región variable de la cadena pesada de anticuerpo, ya sea sola o combinada. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera consisten, cada una, de cuatro regiones de infraestructura (FR, por sus siglas en inglés) conectadas por tres regiones determinadoras de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) conocidas también como regiones hipervariables . Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por las FR y con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de los anticuerpos que une antigeno. Existen por lo menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en variabilidad de secuencia de especies cruzadas (por ejemplo Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md. ) ) ; y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antigeno-anticuerpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Además, las combinaciones de estos dos enfoques algunas veces se utilizan en la técnica para determinar las CDR.

El término "vector" significa una construcción la cual es capaz de suministrar y preferiblemente expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula hospedadora. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, plásmidos, cósmidos o vectores de fago, vectores de expresión de ADN o de ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucarióticas tales como células productoras.

Los términos "polipéptidos " , "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, puede ser interrumpido por sustancias diferentes de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero aminoácido que ha sido identificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.) así como otras modificaciones conocidas en el ámbito. Se entiende que debido a que los polipéptidos de la presente invención se basan en anticuerpos, en algunas modalidades, los polipéptidos se pueden presentar como cadenas solas o cadenas asociadas .

Los términos "idénticos" o por ciento de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos aminoácidos que son los mismos cuando se comparan y alinean (introduciendo separaciones, si son necesarias) para correspondencia máxima sin considerar sustitución conservadora alguna de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El por ciento de identidad se puede medir utilizando un programa de comparación y secuencia o algoritmos o por inspección visual. Se conocen en el ámbito varios algoritmos y programas que se pueden utilizar para obtener alineaciones de secuencias de aminoácidos o nucleotidicas . Un ejemplo no limitante de un algoritmo de alineación de secuencia es el algoritmo descrito en Karlin et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci., 87:2264-2268, modificado en Karlin et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci.r 90:5873-5877 e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). En algunas modalidades, se puede utilizar BLAST con separaciones (Gapped) como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Están disponibles públicamente de manera adicional programas de software BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) que se pueden utilizar para alinear secuencias. En algunas modalidades, el por ciento de identidad entre dos secuencias nucleotidicas se determina utilizando el programa GAP en el programa o software GCG (por ejemplo utilizando la matriz NWSgapdna . CMP y una ponderación de separación de 40, 50, 60, 70 ó 90 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6) . En algunas modalidades alternativas, el programa GAP en el paquete de programa GCG, el cual incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) se puede utilizar para determinar el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo utilizando la matriz Blossum 62 o la matriz PAM250 y una ponderación de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4 ó 5). De manera alternativa, en algunas modalidades, el por ciento de identidad entre secuencias nucleotidicas y de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el por ciento de identidad se puede determinar utilizando el programa ALIGN (versión 2.0) y utilizando un PAM120 con una tabla de residuos, un castigo de longitud de separación de 12 y un castigo de separación de 4. Los parámetros apropiados para alineación máxima por el programa de alineación particular se pueden determinar por un experto en el ámbito. En algunas modalidades, los parámetros implícitos del programa de alineación son los que se utilizan. En algunas modalidades, el porcentaje de identidad "X" de la primera secuencia de aminoácidos respecto a una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z), en donde Y es el número de residuos de aminoácidos calificados como coincidencias idénticas en la alineación de la primera y segunda secuencias (como se alinean por inspección visual o un programa de alineación de secuencia particular) y Z es el número total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la de la segunda secuencia, el por ciento de identidad de la primera secuencia respecto a la segunda secuencia será más grande que el por ciento de identidad de la segunda secuencia con respecto a la primera secuencia .

Como un ejemplo no limitante, si cualquier polinucleótido particular tiene cierto porcentaje de identidad de secuencia (por ejemplo, es por lo menos 80% idéntico, por lo menos 85% idéntico, por lo menos 90% idéntico y en algunas modalidades, por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntico) con una secuencia de referencia, en algunas modalidades se puede determinar utilizando el programa Bestfit ( isconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se establecen de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia nucleotídica de referencia y las separaciones en la homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia se permiten.

En algunas modalidades, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, lo que significa que tienen por lo menos 70%, por lo menos 75%, preferiblemente por lo menos 80%, de manera más preferible por lo menos 85%, de manera más preferible por lo menos 90% y en algunas modalidades, por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de residuos nucleotídicos o de aminoácidos cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima, medida utilizando el algoritmo de comparación de secuencia o por inspección visual. Preferiblemente, existe identidad sobre una región de las secuencias que es por lo menos aproximadamente 10, de manera preferible aproximadamente 20, de manera más preferible aproximadamente 40-60 residuos en longitud o cualquier valor integral entre los mismos, preferiblemente sobre una región más grande de 60-80 residuos, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 90-100 residuos y de manera más preferible las secuencias son sustancialmente idénticas sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan, tal como una región codificante de una secuencia nucleotidica, por ejemplo.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la cual un residuo aminoácido es sustituido con otro residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han identificado en el ámbito que incluyen, cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales ß-ramificadas (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una sustitución conservadora. Preferiblemente, las sustituciones conservadoras en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la invención no abrogan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos con uno o varios de los antigenos, es decir, uno o más receptores encrespados (frizzled) humanos a los cuales se une el polipéptido o anticuerpo. Los métodos de identificación de sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos los cuales no eliminan la unión del antigeno son bien conocidos en el ámbito (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12 (10) : 879-884 (1999); y Burks et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94 : 12- 17 (1997)).

Como se utiliza en la presente descripción y reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" "la" incluye las formas plurales a menos que el contexto claramente lo indique en otro sentido.

Se entiende que siempre que se describen modalidades en la presente con la frase "que comprende", y modalidades de otra manera análogas descritas en términos de "que consiste de" y/o "que consiste esencialmente de" también se incluyen.

El término "y/o", como se utiliza en las frases tales como "A y/o B" en la presente se pretende que incluya "A y B", "A o B", "A", y "B". De igual manera, el término "y/o", como se utiliza en una frase tal como "A, B y/o C" se pretende que abarque cada una de las siguientes modalidades: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (únicamente) ; B (únicamente) y C (únicamente) .

El término "condiciones de alta rigurosidad" se puede identificar por aquellos que: (1) utilizan una baja fuerza iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecilsulfato de sodio 0.1% a 50°C; (2) quienes utilizan durante hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo formamida 50% (v/v) con albúmina sérica bovina 0.1%/Ficoll 0.1%/polivinilpirrolidona 0.1%/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) quienes utilizan formamida 50%, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.75 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 yg/ml) , SDS 0.1% y sulfato de dextrano 10% a 42°C con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida 50% a 55°C seguido por lavado de alta rigurosidad que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA, a 55°C.

II. Agen-bes que unen FZD La presente invención proporciona agentes que unen específicamente uno o más de los receptores encrespados humanos (FZD). Estos agentes se denominan en la presente como "agentes que unen FZD". En algunas modalidades, los agentes se unen específicamente a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez receptores encrespados. El receptor o los receptores encrespados (frizzled) humanos unidos por el agente se pueden seleccionar del grupo que consiste de FZDl, FZD2, FZD3, FZD4 , FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 y FZD10. En algunas modalidades, uno o más de los receptores encrespados humanos comprenden FZDl, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8. En algunas modalidades, uno o más receptores encrespados humanos comprenden FZD7. En algunas modalidades, uno o más de los receptores encrespados humanos comprenden FZD5 y/o FZD8. En algunas modalidades, el agente une específicamente FZDl, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. Las secuencias de longitud completa de aminoácidos (aa) y nucleotídicas (nt) para FZD1-10 se conocen en el ámbito y también se proporciona en la presente como la SEC ID NO: 26 (FZDl aa) , SEC ID NO: 30 (FZD2 aa), SEC ID NO: 34 (FZD3 aa) , SEC ID NO: 38 (FZD4 aa), SEC ID NO: 42 (FZD5 aa) , SEC ID NO: 46 (FZD6 aa) , SEC ID NO: 50 ( FZD7 aa), SEC ID NO: 54 (FZD8 aa) , SEC ID NO: 58 (FZD9 aa), SEC ID NO: 62 (FZD10 aa) , SEC ID NO: 29 (FZDl nt) , SEC ID NO: 33 (FZD2 nt ) , SEC ID NO: 37 (FZD3 nt), SEC ID NO: 41 (FZD4 nt), SEC ID NO: 45 (FZD5 nt) , SEC ID NO: 49 (FZD6 nt), SEC ID NO: 53 (FZD7 nt), SEC ID NO: 57 (FZD8 nt) , SEC ID NO: 61 (FZD9 nt) y SEC ID NO: 65 (FZD10 nt) .

En algunas modalidades, el anticuerpo u otro polipéptido o agente descrito en la presente une específicamente FZD7. En algunas modalidades, el anticuerpo, polipéptido o agente puede unirse específicamente de manera adicional o proporcionar reacción cruzada con uno o más receptores encrespados humanos adicionales.

En algunas modalidades, el anticuerpo u otro polipéptido o agente descrito en la presente une específicamente FZD5. En algunas modalidades, el anticuerpo, polipéptido o agente puede unirse específicamente de manera adicional o proporcionar reacción cruzada con uno o más receptores encrespados humanos adicionales.

En algunas modalidades, el agente se une específicamente a dos o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, dos o más receptores encrespados humanos se seleccionan del grupo que consiste de FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, dos o más receptores encrespados comprenden FZD1 y un segundo receptor encrespado que se selecciona del grupo que consiste de FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, dos o más receptores encrespados comprenden FZD2 y un segundo receptor encrespado se selecciona del grupo que consiste de FZD1, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, dos o más receptores encrespados comprenden FZD5 y un segundo receptor encrespado se selecciona del grupo que consiste de FZDl, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, dos o más receptores encrespados comprenden tanto FZD5 como FZD8. En algunas modalidades, dos o más receptores encrespados comprenden FZD7 y un segundo receptor encrespado se selecciona del grupo que consiste de FZDl, FZD5 , FZD7 y FZD8.

En algunas modalidades, el agente se une específicamente a tres o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, tres o más receptores encrespados humanos tres o más receptores encrespados que se seleccionan del grupo que consiste de FZDl, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, el agente adicional se une específicamente a uno o más receptores encrespados humanos adicionales .

En algunas modalidades, el agente o anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) dentro de uno o más receptores encrespados humanos a los cuales se une. Las secuencias del dominio extracelular de cada uno de los receptores encrespados humanos se conocen en el ámbito y también se proporcionan como SEC ID NO: 27 (FZDl ECD), SEC ID NO: 31 (FZD2 ECD), SEC ID NO: 35 (FZD3 ECD), SEC ID NO: 39 (FZD4 ECD), SEC ID NO: 43 (FZD5 ECD), SEC ID NO: 47 (FZD6 ECD), SEC ID NO: 51 (FZD7 ECD), SEC ID NO: 55 (FZD8 ECD), SEC ID NO: 59 (FZD9 ECD) y SEC ID NO: 63 (FZD10 ECD) .

En algunas modalidades, el agente o anticuerpo se une específicamente al dominio Fri (FRI) (también conocido como el dominio rico en cisteína (CRD, por sus siglas en inglés)), dentro de uno o varios receptores encrespados humanos a los cuales se une. Las secuencias del dominio Fri de cada uno de los receptores encrespados humanos se conocen en el ámbito y también se proporcionan como SEC ID NO: 28 (FZD1 FRI), SEC ID NO: 32 (FZD2 FRI), SEC ID NO: 36 (FZD3 FRI), SEC ID NO: 40 (FZD4 FRI), SEC ID NO: 44 (FZD5 FRI), SEC ID NO: 48 (FZD6 FRI), SEC ID NO: 52 (FZD7 FRI), SEC ID NO: 56 (FZD8 FRI), SEC ID NO: 60 (FZD9 FRI) y SEC ID NO: 64 (FZD10 FRI) .

En algunas modalidades, un sitio individual que une antígeno de un anticuerpo que une FZD o polipéptido descrito en la presente es capaz de unir (o se une) a uno, dos, tres, cuatro o cinco (o más) receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, un sitio individual que une antígeno del anticuerpo o polipéptido que une FZD es capaz de unir específicamente uno, dos, tres, cuatro o cinco receptores encrespados humanos que se seleccionan del grupo que consiste de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, un sitio de unión individual del anticuerpo o polipéptido se une específicamente a por lo menos FZD5 y FZD8.

En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que se une a FZD, se une a uno o más receptores encrespados humanos (por ejemplo dos o más, tres o más o cuatro o más) con una constante de disociación (KD) de aproximadamente 1 µ? o menos, aproximadamente 100 mM o menos, aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, o aproximadamente 10 nM o menos. Por ejemplo, en algunas modalidades, un agente o anticuerpo que se une a FZD descrito en la presente que se une a más de un FZD, se une a aquellos FZD con una KD de aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, o aproximadamente 10 nM o menos. En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que se une a FZD se une a cada uno de uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4 ó 5) de los siguientes FZD con una constante de disociación de aproximadamente 40 nM o menos: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que une FZD se une a cada uno de uno o más de los siguientes FZD con una constante de disociación de aproximadamente 10 nM o menos: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que une FZD se une a cada una de las siguientes FZD con una constante de disociación de aproximadamente 10 nM o menos: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, la constante de disociación del agente o anticuerpo a un FZD particular es la constante de disociación determinada utilizando una proteina de fusión FZD-FC que comprende el dominio extracelular de FZD o el dominio Fri inmovilizado en un chip Biacore.

En algunas modalidades, el agente o anticuerpo de unión FZD une a cada uno de uno o más de los siguientes FZD con una constante de disociación entre aproximadamente InM y aproximadamente ????: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, y FZD8. Alternativamente, el agente o anticuerpo de unión FZD se une a dos o más (o tres o más) de los siguientes FZD con una constante de disociación entre aproximadamente InM y aproximadamente 10 nM: FZDl, FZD2, FZD5, FZD7 , y FZD8. En algunas modalidades adicionales, el agente o anticuerpo de unión FZD se une a cada uno de tanto FZD5 como FZD8 con una constante de disociación entre aproximadamente InM y aproximadamente ????.

En algunas modalidades, el agente o anticuerpo de unión FZD se une a FZD8 con una constante de disociación de por lo menos aproximadamente 3nM. En algunas modalidades, el agente o anticuerpo de unión FZD se une a FZD8 con una constante de disociación entre aproximadamente 3nM y 30nM. En algunas modalidades alternativas, la constante de disociación para unión de FZD8 puede ser entre aproximadamente 3nM y 10 nM.

En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que une FZD se une a uno o más (por ejemplo dos o más, tres o más o cuatro o más) receptores encrespados humanos con una CE50 de aproximadamente 1 µ? o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos o aproximadamente 1 nM o menos. Por ejemplo, en algunas modalidades, un agente o anticuerpo que une FZD descrito en la presente que se une a más de un FZD tiene una CE50 de aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, o aproximadamente 10 nM o menos con respecto a las FZD. En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que une FZD tiene una CE50 de aproximadamente 20 nM o menos con respecto a uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4 ó 5) de los siguientes FZD: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que se une a FZD tiene una CE5o de aproximadamente 10 nM o menos con respecto a uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4 ó 5) de los siguientes FZD: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8. En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que une FZD tiene una CE50 de aproximadamente 40 nM o menos o 20 nM o menos con respecto a la unión de FZD5 y/o FZD8.

En algunas modalidades, el agente que se une a FZD (por ejemplo un anticuerpo) se une al mismo epitopo, o se une a un epitopo que se superpone con el epitopo de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 14 (por ejemplo el anticuerpo IgG 18R5 o 18R8) . En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que se une a FZD se une al mismo epitopo, o se une a un epitopo que se superpone con un epítopo de un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 11 y una cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 13 o la SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, el agente que se une a FZD se une al mismo epitopo o se une a un epitopo que se superpone con el epitopo de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 85 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 86 (por ejemplo el anticuerpo IgG 44R24).

En algunas modalidades, el agente que se une a FZD compite por unión especifica a un receptor encrespado humano con un anticuerpo en un análisis de unión competitivo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 12 o la SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, el agente que se une a FZD compite por unión especifica a un receptor encrespado humano con un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 11 y una cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 13 o SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, el anticuerpo con el cual compite el agente por unión especifica al receptor encrespado humano es un anticuerpo IgG 18R5. En algunas modalidades alternativas, el anticuerpo es un anticuerpo IgG 18R8.

En algunas modalidades, el agente que se une a FZD compite por unión especifica a un receptor encrespado humano con un anticuerpo en un análisis de unión competitivo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 85 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 86.

En algunas modalidades, el agente que se une a FZD compite directamente para unión o inhibe directamente la unión de Wnt en los FZD.

En algunas modalidades, el agente o anticuerpo que se une a FZD se une a por lo menos parte de una región de un receptor encrespado humano denominado por los inventores como el sitio de unión biológica (BBS) (Figura 9, Ejemplo 6) . En FZD8 humano (SEC ID NO: 54), el BBS consiste de lo siguiente: (a) un epitopo conformacional que consiste de los aminoácidos 72(F), 74-75 (PL), 78(1), 92 (Y) , 121-122 (LM) y 129-132 (WPDR (SEC ID NO: 70)) (la "hendidura" de BBS que se muestran en la figura 8 y en la figura 9) ; (b) una región de FZD8 que consiste de la secuencia GLEVHQ (SEC ID NO: 25) (el "borde superior" de BBS que se muestra en la figura 8 y en la figura 9) ; y (c) una región de FZD8 que consiste de la secuencia YGFA (SEC ID NO: 74) (el "borde inferior" del BBS que se muestra en la figura 8 y en la figura 9) . Los residuos correspondientes de BBS en FZD1-7, FZD9 y FZD10 se identifican en la Tabla 1, a continuación, y en la figura 8. En algunas modalidades, un agente que bloquea la unión de un ligando (por ejemplo un Wnt) del FZD inhibe la unión del ligando al BBS. Se entiende que en algunas modalidades, los agentes los cuales se unen a por lo menos parte del BBS también se pueden unir a una o más regiones en otra parte (es decir, fuera del BBS) en el receptor encrespado humano. En otras palabras, en algunas modalidades, el epitopo al cual el agente o anticuerpo que se une a FZD se une, es una región dentro del dominio extracelular del receptor FZD que se superpone con el BBS, pero no está contenido completamente dentro del BBS. En algunas modalidades alternativas, el epitopo al cual el agente o anticuerpo que se une a FZD se une, está contenido completamente dentro del BBS (es decir, el BBS comprende el epitopo completo al cual se une el anticuerpo de otro agente que se une a FZD) .

Tabla 1. Sitios de Unión Biológica (BBS) de los receptores FZD Sin desear unirse a teoría alguna, se considera que el BBS comprende un sitio de unión de ligando posible, tal como un sitio de unión para Wnt. En FZD8, este posible sitio de unión de ligando comprende el epítopo conformacional constituido por los aminoácidos 72(F), 74-75(PL), 78(1), 92 (Y), 121-122 (LM) y 129-132(WPDR (SEC ID NO: 70)) (la "hendidura" del BBS que se muestra en la figura 8 y en la figura 9) . Los residuos correspondientes del posible sitio de unión de ligando en FZD1-7, FZD9 y FZD10 se muestran en la alineación de secuencias en la figura 8. En algunas modalidades, un agente que bloquea la unión de un ligando (por ejemplo un Wnt) al BBS inhibe la unión de ligando a este epítopo conformacional . Se entiende que en algunas modalidades, los agentes los cuales se unen a por lo menos parte de este sitio de unión de ligando también se pueden unir a una región en otra parte (por ejemplo fuera del BBS) en el receptor encrespado humano. En algunas modalidades alternativas, el agente no se une a porción alguna del FZD fuera del epitopo conformacional .

En algunas modalidades, el agente se une a por lo menos parte de la secuencia QDEAGLEVHQFWPL (SEC ID NO: 67) dentro del receptor encrespado humano si el receptor encrespado humano es FZD8, o la secuencia correspondiente si el receptor encrespado humano es FZD1-7, FZD9 o FZD10. Esta región en los FZD comprende el "borde superior" del BBS identificado en la figura 8 y en la figura 9. Las secuencias que corresponden al epitopo QDEAGLEVHQFWPL (SEC ID NO: 67) de FZD8 en los diversos receptores encrespados se identifican en la Tabla 2, más adelante y también son evidentes a partir de la alineación en la figura 8. En algunas modalidades, el agente se une específicamente a un receptor encrespado humano que se selecciona del grupo que consiste de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y FZD8 y el agente se une a por lo menos parte de la secuencia Q (DE/ED) AGLEVHQF (Y/W) PL (SEC ID NO: 24) dentro del receptor encrespado humano. En algunas modalidades, el agente se une específicamente por lo menos parte de la secuencia AGLEVHQF (SEC ID NO: 68) dentro de uno o varios receptores encrespados humanos FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8. En algunas modalidades, el agente se une a por lo menos parte de una secuencia en FZD3, FZD4, FRZD6, FZD9 y/o FZD10 que corresponde a la secuencia AGLEVHQF (SEC ID NO: 68) en FZD8. En algunas modalidades, el agente se une específicamente a por lo menos parte de la secuencia GLEVHQ (SEC ID NO: 25) dentro de uno o varios receptores encrespados humanos FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8. Esta secuencia es el "borde superior" del BBS que se muestra en la figura 9. En algunas modalidades, el agente se une a por lo menos parte de la secuencia en FZD3, FZD4, FZD6, FZD9 y/o FZD10 que corresponden a la secuencia GLEVHQ (SEC ID NO: 25) en FZD8. Las secuencias las cuales corresponden a la secuencia GLEVHQ (SEC ID NO: 25) de FZD8 están subrayadas en la segunda y tercera columnas de la Tabla 2 a continuación y son evidentes a partir de la alineación de secuencia en la figura 8. En algunas modalidades, un agente que se une a por lo menos parte de la SEC ID NO: 67 ó 68 en FZD8 o a un epítopo correspondiente en otro FZD inhibe la unión de un ligando (por ejemplo un Wnt) al FZD (por ejemplo al BBS del FZD) . En algunas modalidades, los agentes se unen a las regiones indicadas en lo anterior también se pueden unir a regiones adicionales en otra parte (es decir, fuera de las regiones especificadas en lo anterior) sobre el receptor encrespado humano.

Tabla 2. Regiones correspondientes sobre receptores encrespados humanos (a) : Las secuencias corresponden a los aa 66-71 GLEVHQ (SEC ID NO: 25) de FZD8 (SEC ID NO: 54) están subrayadas. (b) : Las secuencias que corresponden a los aa 125-128 YGFA (SEC ID NO: 74) de FZD8 (SEC ID NO: 54) están subrayadas.

En algunas modalidades, el agente que se une a FZD se une a por lo menos parte de una región que consiste de la secuencia QYGFA (SEC ID NO: 66) si el receptor encrespado humano es FZD8, el cual corresponde al "borde inferior" de la BBS o la secuencia correspondiente si el receptor encrespado humano es FZDl-7, FZD9 o FZD10. Las secuencias que corresponden a la región QYGFA (SEC ID NO: 66) en los diversos receptores encrespados se identifican en la figura 8 y en la Tabla 2 anterior. En algunas modalidades, el agente de unión a FZD que se une a por lo menos parte de una región que consiste de las secuencias YGFA (SEC ID NO: 74), el "borde inferior" de la BBS, si el receptor encrespado humano es FZD8, o la secuencia correspondiente si el receptor encrespado humano es FZDl-7, FZD9 o FZD10. Las secuencias que corresponden a la región YGFA (SEC ID NO: 74) en los diversos receptores encrespados se identifican en la figura 8 y se subrayan en la cuarta columna de la Tabla 2 anterior. En algunas modalidades, un agente que se une a por lo menos una parte de la SEC ID NO: 66 o la SEC ID NO: 74 en FZD8 o su secuencia correspondiente en otro FZD, inhibe la unión de un ligando (por ejemplo un Wnt) al FZD (por ejemplo la BBS del FZD) . En algunas modalidades, los agentes los cuales se unen a esta región también se pueden unir a uno o más residuos aminoácidos en otra parte (es decir, fuera de esta región) del receptor encrespado humano.

En algunas modalidades, el agente que se une a FZD se une a por lo menos parte de la región que forma el "borde superior" de la BBS, asi como por lo menos una parte de la región que forme el "borde inferior" de la BBS. En algunas modalidades, el agente que se une a FZD, que se une a por lo menos parte de Q ( DE/ED) AGLEVHQF (Y/W) PL (SEC ID NO: 24) dentro de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8, QDEAGLEVHQFWPL (SEC ID NO: 67) dentro de FZD8, AGLEVHQF (SEC ID NO: 68) dentro de FZD8 y/o GLEVHQ (SEC ID NO: 25) dentro de FZD8 y/o una secuencia que corresponde a cualquiera de estas secuencias en un receptor encrespado humano diferente (como se define en la Tabla 2 anterior) se une adicionalmente a por lo menos parte de QYGFA (SEC ID NO: 66) dentro de FZD8 o YGFA (SEC ID NO: 74) dentro de FZD8 y/o una secuencia que corresponde a una de estas secuencias dentro de FZD1-7, FZD9 o FZD10 (como se define en la Tabla 2 anterior) . En algunas modalidades, el agente que se une a FZD se une a por lo menos parte de la secuencia GLEVHQ (SEC ID NO: 25) dentro de FZD8, asi como a por lo menos parte de la secuencia YGFA (SEC ID NO: 74) dentro de FZD8. En algunas modalidades, el agente que se une a FZD se une a por lo menos parte de una región de FZDl-7, FZD9 ó FZD10 que corresponde a la secuencia GLEVHQ (SEC ID NO: 25) en FZD8 , así como a por lo menos parte de una región de FZDl-7, FZD9 ó FZD10 que corresponde a la secuencia YGFA (SEC ID NO: 74) en FZD8. En algunas modalidades, el agente que se une a FZD que se une a las secuencias indicadas también se une a una o más secuencias en otra parte dentro de uno o varios de los receptores encrespados a (frizzled) humanos a los cuales se une. En otras palabras, en algunas modalidades, el epitopo al cual el agente o anticuerpo que se une a FZD se une es una región dentro del dominio extracelular FZD que se superpone solo parcialmente con las secuencias indicadas antes. En algunas modalidades alternativas el epitopo completo al cual se une el agente que se une a FZD está contenido enteramente dentro de las secuencias indicadas en lo anterior.

En algunas modalidades, el agente de unión FZD se une a un receptor FZD humano (por ejemplo, FZD8) en la hendidura de su BBS. Véase, por ejemplo, los residuos de hendidura listados en la Tabla 16 en los Ejemplos siguientes. En algunas modalidades L76 de FZD8 es necesario para unión del agente. En algunas modalidades, el agente de unión FZD el cual se une en la hendidura del BBS, puede tener un peso molecular de menos de aproximadamente 2000 Daltones o menos de aproximadamente 1000 Daltones. El agente de unión FZD puede ser un polipéptido, un lipido, un aptámero, una molécula pequeña u otro compuesto. En algunas modalidades, el agente de unión FZD comprende un polipéptido que comprende aproximadamente 100 aminoácidos o menos. En algunas modalidades, el polipéptido comprende menos de aproximadamente 20 aminoácidos. El polipéptido puede ser modificado o no modificado. En algunas modalidades, el agente comprende un polipéptido que comprende una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 98-111 y 113-116. En algunas modalidades, el agente comprende la SEC ID NO: 112. En algunas modalidades, el agente puede comprender la SEC ID NO: 108.

En algunas modalidades, el agente es un polipéptido. En algunas modalidades, el agente o polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgGl o un anticuerpo IgG2. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos u otros agentes de la presente invención se pueden analizar para unión especifica por cualquier método conocido en el ámbito. Los inmunoanálisis los cuales se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a sistemas de análisis competitivos y no competitivos que utilizan técnicas como análisis BIAcore, análisis FACS, inmunofluorescencia , inmunocitoquimica , transferencias Westerns, radioinmunoanálisis, ELISA, inmunoanálisis tipo "emparedado", análisis de inmunoprecipitación, reacciones de precipitación, reacciones de precipitación por dilución en gel, análisis de inmunodifusión, análisis de aglutinación, análisis de fijación de complemento, análisis inmunorradiométricos, inmunoanálisis fluorescentes e inmunoanálisis de proteina A. Tales análisis son habituales y bien conocidos en el ámbito (véase, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, la cual se incorpora como referencia en la presente en su totalidad) .

Por ejemplo, la unión especifica de un anticuerpo a un receptor encrespado humano se puede determinar utilizando ELISA. Un análisis de ELISA comprende preparar antigeno, recubrir los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos con antigeno, agregar el anticuerpo que se une a FZD u otro agente que se une a FZD conjugado a un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) al pozo, incubar durante un periodo de tiempo y detectar la presencia del antigeno. En algunas modalidades, el anticuerpo o agente que se une a FZD no se conjuga a un compuesto detectable, pero en vez de esto, se agrega al pozo un segundo anticuerpo conjugado que reconoce el anticuerpo o agente que se une á FZD. En algunas modalidades, en vez de recubrir el pozo con el antigeno, el anticuerpo o agente que se une a FZD se puede recubrir en el pozo y el segundo anticuerpo conjugado a un compuesto detectable se puede agregar después de la adición del antigeno al pozo recubierto. Una persona experta en el ámbito podrá ser reconocible respecto a los parámetros gue se pueden modificar para incrementar la señal detectada asi como otras variaciones de las pruebas de ELISA conocidas en el ámbito (véase, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 1, John iley & Sons, Inc., Nueva York el 11.2.1).

La afinidad de unión de un anticuerpo sobre otro agente a un receptor encrespado humano y la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antigeno se puede determinar por análisis de unión competitiva. Un ejemplo de un análisis de unión competitiva es un radioinmunoanálisis que comprende la incubación de antigeno marcado (por ejemplo 3H o 12 I) o un fragmento o variante del mismo, con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades cada vez mayores de antigeno sin marcar seguido por la detección del anticuerpo unido al antigeno marcado. La afinidad del anticuerpo contra un receptor encrespado y las velocidades de disociación de la unión se pueden determinar a partir de los datos por análisis de gráfica scatchard. En algunas modalidades, se utiliza el análisis cinético BIAcore para determinar las velocidades de formación y eliminación de unión de los anticuerpos o agentes que se unen a uno o más receptores encrespados humanos. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y disociación de los anticuerpos a partir de chips con antigenos FZD inmovilizados sobre su superficie .

En algunas modalidades, el agente (por ejemplo, anticuerpo) es un antagonista de por lo menos un receptor encrespado humano (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 FZD) unidos por el agente. En algunas modalidades, el agente inhibe por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 90% o aproximadamente 100% de uno o más de la actividad del receptor encrespado humano unido .

En algunas modalidades, el agente que se une a FZD inhibe la unión de un ligando a por lo menos un receptor encrespado humano. En algunas modalidades, el agente de unión a FZD, inhibe la unión de un ligando al sitio de unión biológico (BBS) el receptor encrespado humano. En algunas modalidades, el ligando es una proteina Wnt humana. Se han identificado diecinueve proteínas Wnt humanas: WNTl, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A (previamente WNT14), WNT9B (previamente WNT15 ) , WNT10A, WNT10B, WNT11 y WNTl 6. En algunas modalidades, el agente inhibe la unión de WNT3A a FZD8. En algunas modalidades, la inhibición de unión de un ligando particular a una proteina encrespada humana particular proporcionada por el agente que une FZD es de por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95%. En algunas modalidades, un agente que inhibe la unión de un ligando tal como un Wnt a un FZD inhibe además la señalización de Wnt (por ejemplo inhibe la señalización de Wnt canónico) .

En algunas modalidades, el agente que une FZD inhibe la señalización Wnt. Se entiende que un agente que une FZD que inhibe la señalización Wnt, en algunas modalidades puede inhibir la señalización por uno o más Wnt, pero no necesariamente por todos los Wnt. En algunas modalidades alternativas, se puede inhibir la señalización por todos los Wnt humanos. En algunas modalidades se inhibe la señalización por uno o más Wnt que se seleccionan del grupo que consiste del grupo que consiste de WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A (previamente WNT14), WNT9B (previamente WNT15 ) , WNT10A, WNT10B, WNT11 y WNT16. En algunas modalidades, la señalización Wnt que se inhibe es señalización por WNT1, WNT2, WNT3, WNT3A, WNT7a, WNT7b y/o WNT10B. En algunas modalidades, el agente inhibe señalización por (al menos) WNT1, WNT3A, WNT7b y WNT10B. En modalidades particulares, el agente inhibe la señalización por (al menos) WNT3A. En algunas modalidades, la inhibición de señalización por un Wnt proporcionado por el agente que se une a FZD es una reducción en el nivel de señalización por el Wnt de por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95%. En algunas modalidades, la señalización Wnt que se inhibe es señalización Wnt canónica.

Los análisis in vivo e in vitro para determinar si un agente que se une a FZD (o un candidato de agente que se une FZD) inhibe la señalización Wnt se conocen en el ámbito. Por ejemplo, los análisis de indicador de luciferasa basados en célula que utilizan un vector indicador TCF/Luc que contiene copias múltiples del dominio que se une a TCF hacia el dirección 5' de un gen indicador de luciferasa de luciérnaga se puede utilizar para medir los niveles de señalización Wnt canónicos in vitro (Gazit et al., 1999, Oncogene 18; 5959-66). El nivel de señalización Wnt en presencia de uno o más Wnt (por ejemplo, uno o más Wnt que se expresa en porciones transfectadas o que se proporcionan por medio acondicionado para Wnt) con el agente que se une a FZD presente se compara con el nivel de señalización sin el agente que se une a FZD presente. Los ejemplos específicos no limitantes del uso del análisis indicador de luciferasa para determinar la inhibición de señalización Wnt canónica se proporcionan en los Ejemplos 3 y 11 a continuación. Además, del análisis indicador TCF/luc, el efecto de un agente que une FZD (o agente candidato) sobre señalización Wnt canónica se puede medir in vitro o in vivo al medir el efecto del agente sobre el nivel de expresión de genes regulados por ß-catenina tales como c-myc (He et al., Science, 281:1509-12 (1998)), ciclina DI (Tetsu et al., Nature, 398:422-6 (1999)) y/o fibronectina (Gradl et al. Mol. Cell Biol., 19:5576-87 (1999)). En algunas modalidades, el efecto de un agente sobre la señalización Wnt también se puede determinar al medir el efecto del agente sobre el estado de fosforilación de Dishevelled-1, Dishevelled-2 , Dishevelled-3 , LRP5, LRP6 y/o ß-catenina. En modalidades adicionales el efecto de un agente que se une a FZD sobre la señalización Wnt se determina al calcular el impacto del agente que se une a FZD sobre el nivel de expresión de uno o más genes en una firma Wnt.

En algunas modalidades, los agentes que se unen a FZD tienen uno o más de los siguientes efectos: inhibir proliferación de células tumorales, reducir la tumorigenicidad de un tumor al reducir la frecuencia de citoblastos cancerosos en el tumor, inhibir el crecimiento de tumor, incrementar la supervivencia, activar la muerte celular de células tumorales, diferenciar células tumorigénicas a un estado no tumorigénico o evitar metástasis de células tumorales.

En algunas modalidades, los anticuerpos u otros agentes que une específicamente uno o más receptores encrespados humanos activan la muerte celular vía una toxina conjugada, un agente quimioterapéutico, un radioisótopo u otro agente similar. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo para un anticuerpo encrespado humano se conjuga con una toxina que es activada en células tumorales que expresan el FZD por internalización de proteína. En algunas modalidades alternativas, el agente o anticuerpo no se conjuga a una toxina, agente quimioterapéutico o radioisótopo .

En algunas modalidades, los agentes que se unen a FZD son capaces de inhibir el crecimiento de tumores. En algunas modalidades, los agentes que se unen a FZD son capaces de inhibir el crecimiento de tumor in vivo (por ejemplo en un modelo de ratón de xenoinjerto y/o en un humano que tiene cáncer) .

En algunas modalidades, los agentes que se unen a FZD son capaces de reducir la tumorigenicidad de un tumor. En algunas modalidades, el agente o anticuerpo es capaz de reducir la tumorigenicidad de un tumor que comprende citoblastos cancerosos en un modelo animal, tal como un modelo de xenoinjerto de ratón. En algunas modalidades, el número o frecuencia de citoblastos cancerosos en un tumor se reduce en por lo menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o aproximadamente 1000 veces. En algunas modalidades, la reducción en el número o frecuencia de citoblastos cancerosos se determina por análisis de dilución limitante utilizando un modelo animal. Un ejemplo de un análisis de dilución limitante utilizada para probar la eficacia de un anticuerpo antiFZD se proporciona en el Ejemplo 8 más adelante. Los ejemplos adicionales y una guia respecto al uso de los análisis de dilución limitante para determinar una reducción en el número de frecuencia de citoblastos cancerosos en un tumor se puede encontrar, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 2008/042236, la Publicación de Solicitud de Patente E.U.A. No. 2008/0064049 y la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2008/0178305, cada uno de los cuales se incorpora como referencia en la presente en su totalidad.

En algunas modalidades, los anticuerpos para receptores encrespados humanos mediante la muerte celular de una célula que exprese la proteina FZD via citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) . La ADCC involucra lisis celular por células efectoras que reconocen la porción Fe de un anticuerpo. Muchos linfocitos, monocitos, macrófagos tisulares, granulocitos y eosinófilos, por ejemplo, tienen receptores Fe que median citólisis (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497) .

En algunas modalidades, los anticuerpos para uno o más FZD activan la muerte celular de una célula que expresa una o varias proteínas de FZD al activar citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . CDC involucra la unión de complemento en suero a la porción Fe de un anticuerpo y activación subsecuente de la cascada de proteínas de complemento lo que resulta en daño a la membrana celular y, a la postre, muerte celular. La actividad biológica de anticuerpo se sabe que está determinada, en gran medida, por los dominios constantes o la región Fe de la molécula de anticuerpo (Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2a. Edición, Williams & Wilkins, p. 218 (1984)). Los anticuerpos de clases y subclases diferentes difieren a este respecto como los anticuerpos de la misma subclase pero de especies diferentes. De los anticuerpos humanos, la IgM es la clase más eficaz de anticuerpos para unir complemento, seguida por IgGl, IgG3 e IgG2 mientras que Ig4 parece ser muy deficiente para activar la cascada de complemento (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). De acuerdo con la presente invención se preparan anticuerpos de estas clases que tienen la actividad biológica deseada.

Se puede analizar la capacidad de un anticuerpo particular contra uno o más FZD para mediar la lisis de la célula objetivo por activación de complemento y/o ADCC. Las células de interés se hacen crecer y se marcan in vitro; el anticuerpo se agrega al cultivo celular en combinación ya sea con complemento de suero o células inmunes las cuales pueden ser activadas por complejos antigeno-anticuerpo. La citólisis de las células objetivo se detectan, por ejemplo, por liberación de la marca de las células lisadas. De hecho, se pueden cribar anticuerpos utilizando el suero propio del paciente como una fuente de complemento y/o células inmunitarias . El anticuerpo que es capaz de activar complemento o mediar ADCC en la prueba in vitro después se puede utilizar terapéuticamente en ese paciente particular.

La invención proporciona polipéptidos que incluyen, pero que no se limitan a anticuerpos que se unen específicamente a uno o más receptores encrespados humanos que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis de las CDR de 18R5 y/o 18R8 (véase Tabla 4 del Ejemplo 1 a continuación) con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 ó 4) sustituciones conservadoras de aminoácidos por CDR. De esta manera, la invención proporciona polipéptidos que incluyen pero que no se limitan a anticuerpos que unen específicamente a uno o más receptores encrespados humanos que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis de las CDR de 18R5 y/o 18R8. En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden la CDR3 de cadena pesada de 18R8 y/o la CDR3 de cadena ligera de 18R5 ó 18R8. En algunas modalidades, una o varias de las CDR de cadena pesada están contenidas dentro de la región variable de cadena pesada y/o las CDR de cadena ligera están contenidas dentro de una región variable de cadena ligera.

Por ejemplo, la invención proporciona un polipéptido (por ejemplo un anticuerpo) que se une específicamente a un receptor encrespado humano, en donde el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácido; (b) una CDR2 de cadena pesada VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y/o (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), o una variante de la SEC ID NO: 4 o la SEC ID NO: 7 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), o una variante de SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) o una variante de SEC ID NO: 6 o SEC ID NO: 9 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras.

De esta manera, la invención proporciona polipéptidos o anticuerpos que comprenden una CDRl de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1) , una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2) y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3) . En algunas modalidades, una o varias de las CDR de cadena ligera están contenidas dentro de una región variable de una cadena pesada de anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido o anticuerpo que comprende una o más de las CDR de cadena pesada unen específicamente uno o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, una o varias de las CDR se han modificado con 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, cada una de las CDR de cadena pesada se han modificado por un máximo de 1-2 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

La invención también proporciona un anticuerpo que une específicamente un receptor encrespado humano, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende además una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), o una variante de la SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 7 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), o una variante de SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) , o una variante de SEC ID NO: 6 o SEC ID NO: 9 que comprende 1, 2, 3 6 4 sustituciones de aminoácido. En algunas modalidades alternativas, el anticuerpo en vez de esto comprende además una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7); (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o DKSNRPSG (SEC ID NO: 8); y (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) . En algunas modalidades, el anticuerpo se une específicamente a FZD1, FZD2 , FZD5 , FZD7 y/o FZD8. En algunas modalidades, el anticuerpo se une específicamente a dos o más receptores encrespados humanos que incluyen FZD5 y FZD8. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras.

La invención proporciona adicionalmente un polipéptido (por ejemplo un anticuerpo) que une específicamente un receptor encrespado humano, en donde el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), o una variante de la SEC ID NO: 4 o la SEC ID NO: 7 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), o una variante de la SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 8 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos; y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) o una variante de la SEC ID NO: 6 o la SEC ID NO: 9 que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras.

También se proporcionan polipéptidos o anticuerpos que comprenden (a) una CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia SGD (K/N) (L/I)G(K/S) (K/F)Y(A/V) (S/H) (SEC ID NO: 71) o una secuencia de la SEC ID NO: 71 hasta con cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 ó 4) sustituciones conservadoras de aminoácidos, (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia (E/D) K (D/S) NRPSG (SEC ID NO: 72) o la secuencia de la SEC ID NO: 72 hasta con cuatro sustituciones conservadoras de aminoácidos y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia (S/Q) S (F/Y) A (G/N) (N/T) (sin aa/L) SL (E/sin aa) (en donde "sin aa/L" indica que es L o sin aminoácido y "E/sin aa" indica que es E o sin aminoácido; SEC ID NO: 73) o la SEC ID NO: 73 hasta con cuatro sustituciones conservadoras de aminoácidos.

La invención también proporciona polipéptidos o anticuerpos que comprenden una CDRl de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) . En algunas modalidades, el polipéptido o anticuerpo comprende una CDRl de cadena ligera que comprende SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), una CDR2 de cadena ligera que comprende DKSNRPSG (SEC ID NO: 8), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) . En algunas modalidades alternativas, el polipéptido o anticuerpo comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4), una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5), y una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) . En algunas modalidades, una o varias de las CDR de cadena ligera están contenidas dentro de una región variable de una cadena ligera de anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido o anticuerpo se une específicamente a uno o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, el polipéptido o anticuerpo que comprende una o más de las CDR de cadena ligera une específicamente uno o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, una o varias de las CDR se han modificado con 1, 2, 3 ó 4 modificaciones conservadoras. En algunas modalidades, cada una de las CDR de cadena ligera ha sido modificada en un máximo de 1-2 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1) , una CDR2 de cadena de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2) y una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4) o SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) o DKSNRPSG (SEC ID NO: 8) y una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) o QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) . En algunas modalidades el anticuerpo comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2), y una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3) ; y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDKLGKKYAS (SEC ID NO: 4), una CDR2 de cadena ligera que comprende EKDNRPSG (SEC ID NO: 5) y una CDR3 de cadena ligera que comprende SSFAGNSLE (SEC ID NO: 6) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSHYTLS (SEC ID NO: 1), una CDR2 de cadena pesada que comprende VISGDGSYTYYADSVKG (SEC ID NO: 2) y una CDR3 de cadena pesada que comprende NFIKYVFAN (SEC ID NO: 3) y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDNIGSFYVH (SEC ID NO: 7), una CDR2 de cadena ligera que comprende DKSNRPSG (SEC ID NO: 8) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QSYANTLSL (SEC ID NO: 9) . En algunas modalidades, una o varias de las CDR se han modificado con 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, cada una de una o varias de las CDR se han modificado por un máximo de 1-2 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

La invención proporciona adicionalmente polipéptidos que incluyen, pero que no se limitan a anticuerpos que se unen específicamente a uno o más receptores encrespados humanos que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis de las CDR del anticuerpo antiFZD 44R24 (véase tabla 7 del ejemplo 18 más adelante) con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 ó 4) sustituciones conservadoras de aminoácidos por CDR. De esta manera, la invención proporciona polipéptidos que incluyen pero que no se limitan a anticuerpos que se unen específicamente a uno o más receptores encrespados humanos que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis de las CDR de 44R24. En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden la CDR3 de la cadena pesada de 44R24 y/o la CDR3 de la cadena ligera de 44R24. En algunas modalidades, una o varias de las CDR de la cadena pesada están contenidas dentro de la región variable de cadena pesada y/o una o varias CDR de cadena ligera están contenidas dentro de la región variable de cadena ligera.

La invención también proporciona un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que se une específicamente a FZD5 humano y/o FZD8, en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSSYYIT (SEC ID NO: 77) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; una CDR2 de cadena pesada que comprende TISYSSSNTYYADSV G (SEC ID NO: 78) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos y una CDR3 de cadena pesada que comprende SIVFDY (SEC ID NO: 79) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDALGNRYVY (SEC ID NO: 80) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos, una CDR2 de cadena ligera que comprende SG (SEC ID NO: 81) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos; y una CDR3 de cadena ligera que comprende GSWDTRPYPKY (SEC ID NO: 82) o una variante de la misma que comprende 1, 2 , 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el anticuerpo (u otro polipéptido que une FZD) comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFTFSSYYIT (SEC ID NO: 77), una CDR2 de cadena pesada que comprende TISYSSSNTYYADSVKG (SEC ID NO: 78), y una CDR3 de cadena pesada que comprende SIVFDY (SEC ID NO: 79); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende SGDALGNRYVY (SEC ID NO: 80), una CDR2 de cadena ligera que comprende SG (SEC ID NO: 81), y una CDR3 de cadena ligera que comprende GSWDTRPYPKY (SEC ID NO: 82) .

También se proporcionan polipéptidos que comprenden una de las cadenas ligeras individuales o cadenas pesadas descritas en la presente asi como polipéptidos (por ejemplo anticuerpos) que comprenden tanto una cadena ligera como una cadena pesada.

También se proporcionan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 10; y/o (b) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 12 o la SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%; por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97% o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con las SEC ID NOS: 10, 12 ó 14. Así, en algunas modalidades, el polipéptido comprende: (a) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 10 y/o (b) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 12 o 14. En algunas modalidades, el polipéptido comprende: (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 10; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, el polipéptido comprende: (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 11; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 13 o SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo y/o un polipéptido que se une específicamente a uno o más receptores encrespados humanos (por ejemplo, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8) . Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un receptor encrespado humano que comprende: (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 10; y (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, el polipéptido que comprende la SEC ID NO: 10 es una región variable de cadena pesada. En algunas modalidades, el polipéptido que comprende la SEC ID NO: 12 ó 14 es una región variable de cadena ligera. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene cierto porcentaje de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 12 o 14 difiere de la SEC ID NO: 10, 12 ó 14 por sustituciones conservadoras de aminoácidos únicamente.

En algunas modalidades, el polipéptido o anticuerpo comprende: (a) la SEC ID NO: 10 y la SEC ID NO: 12; (b) la SEC ID NO: 10 y la SEC ID NO: 14; (c) la SEC ID NO: 11 y la SEC ID NO: 13; o (d) la SEC ID NO: 11 y la SEC ID NO: 15.

La invención proporciona adicionalmente un anticuerpo u otro polipéptido que se une específicamente a FZD5 y/o FZD8 y que comprende: (a) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97% o por lo menos aproximadamente 99% de identidad con la SEC ID NO: 85 y/o (b) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97% o por lo menos aproximadamente 99% de identidad con la SEC ID NO: 86. En algunas modalidades alternativas, el polipéptido o anticuerpo comprende la SEC ID NO: 85 y/o la SEC ID NO: 86.

En algunas modalidades, el agente que une FZD comprende, consiste esencialmente o consiste de un anticuerpo antiFZD que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos IgG 18R8, 18R5, 18R4605, 18R4805 y 44R24.

En algunas modalidades, el agente de unión FZD no es el anticuerpo 44M1, 44M2, 44M13, 44M15, 44M17, 44M18, 18M4, 18M6, 18M17, 18M18, 54 1, 54M2, 54M3, 54M4, 54M5, 54M6, o 54M7 reportado en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 2007/01 16701, la cual se incorpora por referencia aquí en su totalidad. En algunas modalidades, el agente de unión FZD es un anticuerpo que une FZD5, pero no es 44M13.

En algunas modalidades, el agente que une FZD comprende las cadenas pesadas y cadenas ligeras del anticuerpo IgG2 18R8 (con o sin la secuencia líder) . En algunas modalidades, el agente que une FZD es el anticuerpo IgG2 18R8. El ADN que codifica para las cadenas pesadas y cadenas ligeras del anticuerpo IgG2 18R8 se ha depositado ante la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA, Estados Unidos bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 29 de septiembre del 2008 y se le asignó el número de designación de depósito ATCC PTA-9540. En algunas modalidades, el agente que une FZD comprende las cadenas pesadas y las cadenas ligeras del anticuerpo IgG2 18R5 (con o sin la secuencia líder) . En algunas modalidades, el agente que une FZD es el anticuerpo IgG2 18R5. El ADN que codifica para las cadenas pesadas y cadenas ligeras del anticuerpo IgG2 18R5 se depositó ante la ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 29 de septiembre del 2008 y se le asignó el número de designación de depósito ATCC PTA-9541.

En algunas modalidades, el agente que une FZD es un anticuerpo IgG codificado por el plásmido depositado ante la ATCC el 26 de agosto del 2009 y al que se le asignó el número de designación de depósito PTA-10307, PTA-10309 o PTA-10311.

En algunas modalidades, el agente que une FZD es un agente que compite por unión específica a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 y/o FZD8 con un anticuerpo codificado por el plásmido que tiene el número de designación de depósito ATCC PTA-9540, PTA-9541, PTA-10307 o PTA-10309 (por ejemplo en un análisis de unión competitivo) . En algunas modalidades alternativas, el agente que une FZD es un agente que compite por la unión específica a FZD5 y/o FZD8 con un anticuerpo codificado por el plásmido que tiene el número de designación de depósito ATCC PTA-10311.

En algunas modalidades, el agente que une FZD tiene una semivida circulante en ratones, macacos o humanos de por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas por lo menos aproximadamente 3 días, por lo menos aproximadamente 1 semana o por lo menos aproximadamente 2 semanas. En algunas modalidades, el agente que une FZD es un anticuerpo IgG (por ejemplo IgGl o IgG2) que tiene una semivida circulante en ratones, macacos o humanos de por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 3 días, por lo menos aproximadamente 1 semana o por lo menos aproximadamente 2 semanas. Se conocen en el ámbito métodos para incrementar la semivida de agentes tales como polipéptidos de anticuerpos. Por ejemplo, los métodos conocidos para incrementar la semivida circulante de anticuerpos IgG incluyen la introducción de mutaciones en la región Fe lo que incrementa la unión dependiente de pH del anticuerpo al receptor Fe neonatal (FcRn, por sus siglas en inglés) a pH 6.0 (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patentes de E.U.A. números 2005/0276799, 2007/0148164 y 2007/0122403) . Los métodos conocidos para incrementar la semivida circulante de fragmentos de anticuerpo que carecen de la región Fe incluyen técnicas tales como pegilación.

Los anticuerpos policlonales se pueden preparar por cualquier método conocido. Los anticuerpos policlonales se generan al inmunizar a un animal (por ejemplo un conejo, rata, ratón, burro, etc.), mediante inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales del antígeno relevante (un fragmento peptidico purificado, una proteina recombinante de longitud completa, una proteína de fusión, etc.), opcionalmente conjugado a hemocianina de lapa de bocallave (KLH, por sus siglas en inglés), albúmina sérica, etc., diluido o en solución salina estéril y combinado con un adyuvante (por ejemplo adyuvante de Freund, completo o incompleto) para formar una emulsión estable. El anticuerpo policlonal después se recupera de la sangre, ascitis y similares de un animal inmunizado de esta manera. La sangre recolectada se coagula y el suero se decanta, se aclara por centrifugación y se realiza en un análisis para determinar el título de anticuerpo. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar de suero o ascitis de acuerdo con métodos estándar en el ámbito que incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, diálisis, etc.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando métodos de hibridoma tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495). Utilizando el método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado se inmuniza como se describe en lo anterior para inducir la producción de anticuerpos por linfocitos que se unirán específicamente a un antígeno inmunizante. Los linfocitos también pueden ser inmunizados in vitro. Después de la inmunización, se aislan los linfocitos y se fusionan con una línea de células de mieloma adecuada utilizando, por ejemplo, polietilenglicol , para formar células de hibridoma que después se pueden separar por selección de linfocitos no fusionados y células de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno seleccionado, determinado por inmunoprecipitación, inmunotransferencia o por un análisis de unión in vitro (por ejemplo radioinmunoanálisis (RIA) , análisis inmunosorbente unido a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) ) se puede propagar ya sea mediante cultivo in vitro utilizando métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, 1986) o in vivo, en tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales después se pueden purificar del medio de cultivo o el fluido ascítico como se describe para anticuerpos policlonales antes.

De manera alternativa, los anticuerpos monoclonales también se pueden elaborar utilizando métodos de ADN recombinante como se describe en la patente de E.U.A. 4,816,567. Los polinucleótidos que codifican para un anticuerpo monoclonal se aislan de linfocitos B maduros o células de hibridoma por ejemplo mediante RT-PCR utilizando cebadores oligonucleotidicos que amplifican específicamente los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y sus secuencias se determinan utilizando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican para las cadenas pesada y ligera después se clonan en vectores de expresión adecuados los cuales, cuando se transfectan en células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) o células de mieloma que de otra manera no producen la proteína inmunoglobulina, se generan anticuerpos monoclonales por las células hospedadoras. Además, también se pueden aislar anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de los mismos de las especies deseadas a partir de bibliotecas de presentación de fago que expresan las CDR de las especies deseadas como se ha descrito (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).

Uno o varios de los polinucleótidos que codifican para un anticuerpo monoclonal se puede modificar adicionalmente de numerosas maneras diferentes utilizando tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas modalidades, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón se pueden sustituir 1) por aquellas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) para un polipéptido diferente de inmunoglobulina, para generar un anticuerpo de fusión. En algunas modalidades, las regiones constantes se cortan o se separan para generar el fragmento de anticuerpo deseado a partir de un anticuerpo monoclonal. Se puede utilizar la mutagénesis dirigida a sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc., de un anticuerpo monoclonal.

En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal contra uno o varios de los receptores encrespados humanos es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, los anticuerpos se utilizan terapéuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas HA A (siglas en inglés para anticuerpo humano antiratón) cuando se administra a un sujeto humano. Los anticuerpos humanizados se pueden elaborar utilizando diversas técnicas conocidas en el ámbito. En algunas modalidades alternativas, el anticuerpo para uno o varios de los receptores encrespados humanos es un anticuerpo humano. En algunas modalidades, el agente es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, este no es un anticuerpo murino .

Los anticuerpos humanos se pueden preparar directamente utilizando diversas técnicas conocidas en el ámbito. Los linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vítro o aislados de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antigeno objetivo se pueden generar (véase, por ejemplo, Colé et al., onoclonal Antibodies and Cáncer Theraphy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1) : 86-95; y la patente de E.U.A. 5,750,373). Además, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una biblioteca de fagos, en donde la biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos como se describe, por ejemplo, en Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581) . Las técnicas para la generación y uso de las bibliotecas de fago de anticuerpo también se describen en las patentes de E.U.A. números 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484 y 7,264,963; y Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi : 10.1016/j . jmb .200 .12.018 (cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad) . Las estrategias de maduración de afinidad y las estrategias de barajado de cadena (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, incorporada como referencia en su totalidad) se conocen en el ámbito y se pueden utilizar para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.

Los anticuerpos humanizados también se pueden elaborar en ratones transgénicos que contengan loci de inmunoglobulina humana que sean capaces, por inmunización de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Este enfoque se describe en las patentes de E.U.A. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 y 5,661,016.

Esta invención también abarca anticuerpos biespecífieos que reconocen específicamente un receptor encrespado humano. Los anticuerpos biespecífieos son anticuerpos que son capaces de reconocer específicamente y unir por lo menos dos epítopos diferentes. Los epítopos diferentes pueden estar dentro de la misma molécula (por ejemplo el mismo receptor encrespado humano) o en moléculas diferentes de manera que ambos anticuerpos, por ejemplo, pueden reconocer específicamente y unir un receptor encrespado humano así como, por ejemplo, 1) una molécula efectora sobre un leucocito tal como un receptor de linfocitos T (por ejemplo, CD3) o un receptor Fe (por ejemplo CD64, CD32 o CD16) , o 2) un agente citotóxico como se describe con detalle en lo siguiente. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico une específicamente por lo menos un receptor encrespado humano así como ya sea VEGF, un ligando Notch tal como un ligando similar a delta (por ejemplo, DLL ) o jagged, o por lo menos un receptor Notch que se selecciona del grupo que consiste de Notch 1, Notch 2, Notch 3 y Notch 4. Los anticuerpos biespecificos pueden ser anticuerpos intactos o fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos biespecificos ejemplares se pueden unir a dos epitopos diferentes, por lo menos uno de los cuales se origina en un polipéptido de la invención. De manera alternativa, en un brazo antiantigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo el cual se une a una molécula activadora sobre un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo CD2, CD3, CD28 o B7) o receptores Fe para IgG de manera que enfocan los mecanismos de defensa celulares a la célula que expresa el antigeno particular. Los anticuerpos biespecificos también se pueden utilizar para dirigir agentes citotóxicos a células las cuales expresan un antigeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo que une antigeno y un brazo el cual une un agente citotóxico o un quelante radionúclido tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Las técnicas para elaborar anticuerpos biespecificos son comunes en el ámbito (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kolstelny et al., 1992, J. Immunol . 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J.

Immunol. 152:5368; y patente de E.U.A. 5,731,168). También se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecificos (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). Asi, en algunas modalidades los anticuerpos para uno o varios receptores encrespados humano son multiespecificos .

De manera alternativa, en algunas modalidades alternativas, los agentes que unen FZD de la invención son anticuerpos no biespecificos . En algunas modalidades, cada uno de los sitios de unión al antigeno del anticuerpo es idéntico a los otros.

En algunas modalidades, un sitio de unión al antigeno individual se une a una región que es homologa entre dos o más receptores encrespados (por ejemplo, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, y/o FZD8) . En algunas modalidades, un sitio -de unión al antigeno se une a una región en el BBS que es homologa entre dos o más receptores encrespados.

En algunas modalidades, los anticuerpos (u otros polipéptidos ) descritos en la presente pueden ser monoespecificos . Por ejemplo, en algunas modalidades, cada uno de uno o más sitios de unión a antigeno que contiene el anticuerpo es capaz de unión (o se une) al mismo uno o más receptores FZD humanos (por ejemplo FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 o FZD8 o un epitopo homólogo sobre alguna combinación de los FZD) . En algunas modalidades, el sitio que une antigeno de un anticuerpo monoespecifico descrito en la presente es capaz de unión (o se une) a uno, dos, tres, cuatro o cinco (o más) receptores encrespados humanos.

En algunas modalidades se proporciona un fragmento de anticuerpo para, por ejemplo, incrementar la penetración de tumor. Se conocen diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan vía digestión proteolitica de anticuerpos intactos (por ejemplo Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81) . En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo se producen de manera recombinante . Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv se pueden expresar todos y se pueden secretar a partir de E. coli u otras células hospedadoras y de esta manera permitir la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo también se pueden aislar de bibliotecas de fago de anticuerpo descritas antes. El fragmento de anticuerpo también pueden ser anticuerpos lineales como se describe en la patente de E..U.A. 5, 641, 870, por ejemplo y pueden ser monoespecificos o biespecificos . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo se harán evidentes para los expertos en el ámbito.

De acuerdo con la presente invención, se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla específicos para uno o más receptores encrespados humanos (véase la patente de E.U.A. número 4,946,778). Además, se pueden adaptar métodos para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por un receptor FZD, o derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos. Se pueden producir fragmentos de anticuerpo por técnicas en el ámbito que incluyen pero que no se limitan a: (a) un fragmento F(ab')2 producido por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (b) un fragmento Fab generado al reducir los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2, (c) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor, y (d) fragmentos Fv.

Puede ser deseable de manera adicional, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpo, modificar un anticuerpo con el fin de incrementar su semivida en suero. Esto se puede obtener, por ejemplo, mediante incorporación de un epítopo de unión de receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o por incorporación del epítopo en una etiqueta peptídica que después se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en la parte media (por ejemplo mediante síntesis de ADN o síntesis peptidica) .

Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están constituidos de dos anticuerpos unidos covalentemente . Estos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para dirigir células inmunitarias a células no deseadas (patente de E.U.A. número 4, 676, 980) . Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro utilizando métodos conocidos en química de síntesis proteínica que incluyen aquellos que involucran agentes reticulantes . Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio disulfuro o por formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato .

Para propósitos de la presente invención, deberá apreciarse que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que proporcione para la asociación del anticuerpo con los polipéptidos de un receptor FZD humano. A este respecto, la región variable puede comprender o ser derivada de cualquier tipo de mamífero que pueda ser inducido para montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno asociado al tumor deseado. De esta manera, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de humano, murino, primate no humano (por ejemplo macaco, etc.) o de origen lupino. En algunas modalidades, las regiones tanto variable como constante de las inmunoglobulinas modificadas con humanas. En otras modalidades las regiones variables de los anticuerpos compatibles (habitualmente derivados de una fuente no humana) se pueden manipular o se pueden adecuar específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. A este respecto las regiones variables útiles en la presente invención pueden ser inmunizadas o alteradas de alguna otra manera mediante la inclusión de secuencias de aminoácidos importadas.

En algunas modalidades, los dominios variables de ambas cadenas, pesada y ligera se alteran por sustitución por lo menos parcial de una o más CDR y, si es necesario por sustitución de región libera infraestructura parcial y cambio de secuencia. Aunque las CDR se pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del cual se derivan las regiones de infraestructura, se considera que las CDR se derivarán de un anticuerpo de clase diferente y preferiblemente de un anticuerpo de una especie diferente. Puede no ser necesario sustituir la totalidad de las CDR con la CDR completa de una región variable donadora para transferir la capacidad de unión a antigeno de un dominio variable a otro. En vez de esto, puede únicamente ser necesario transferir aquellos residuos que sean necesarios para mantener la actividad del sitio de unión a antigeno. Dadas las explicaciones que se establecen en las patentes de E.U.A. números 5,585,089; 5,693,761 y 5,693,762, está dentro de la competencia de aquellos expertos en el ámbito, ya sea mediante la realización de experimentación sistemática o por ensayo y error probar para obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.

Las alteraciones a la región variable, no obstante, aquellos expertos en la técnica apreciarán que los anticuerpos modificados de esta invención comprenderán anticuerpos (por ejemplo anticuerpos de longitud completa o fragmentos inmunorreactivos de los mismos) en los cuales por lo menos una fracción de uno o más dominios de región constante han sido suprimidos o alterados de alguna otra manera de modo que proporcionan características bioquímicas deseadas tales como localización aumentada de tumor o semivida sérica reducida cuando se comparan con un anticuerpo de inmunogenicidad aproximadamente igual que comprende una región constante nativa o no alterada. En algunas modalidades, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones a la región constante compatibles con esta invención comprenden adiciones, supresiones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios, esto es, los anticuerpos modificados descritos en la presente pueden comprender alteraciones o modificaciones a uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o al dominio constante de cadena ligera (CL) . En algunas modalidades se contemplan regiones constantes modificadas en donde uno o más dominios se han suprimido parcial o completamente. En algunas modalidades, los anticuerpos modificados comprenderán construcciones suprimidas de dominio o variantes en donde la totalidad del dominio CH2 ha sido eliminada (construcciones Ach2 ) . En algunas modalidades, el dominio de la región constante omitida se sustituirá por un separador aminoácido corto (por ejemplo 10 residuos) que proporcione parte de la flexibilidad molecular impartida típicamente por la región constante ausente.

Además de su configuración, se conoce en el ámbito que la región constante media varias funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente Cl del complemento a anticuerpos activa el sistema de complemento. La activación de complemento es importante en la opsonisación y lisis de patógenos celulares. La activación de complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar involucrada en hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a células vía la región Fe con un sitio receptor Fe en la región Fe de anticuerpo que se une a un receptor Fe (FcR, por sus siglas en inglés) en una célula.

Existen números receptores Fe los cuales son específicos para clases diferentes de anticuerpo que incluyen IgG (receptores ?), IgE (receptores ?), IgA (receptores a) e IgM (receptores µ) . La unión de anticuerpo a receptores Fe sobre superficies celulares activa varias respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen englobamiento y destrucción de partículas recubiertas con anticuerpo, depuración de complejos inmunitarios, lisis de células objetivo recubiertas con anticuerpo por células citolíticas (denominada citotoxicidad mediada por célula, dependiente de anticuerpo o ADCC) , liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de producción de inmunoglobulina .

En algunas modalidades, los anticuerpos que unen FZD proporcionan funciones efectoras alteradas que, a su vez, alteran el perfil biológico del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la supresión o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otro medio) de un dominio de región constante pueden reducir la unión de receptor Fe del anticuerpo modificado circulante con lo que se incrementa la localización del tumor. En otros casos pueden ser modificaciones de la región constante, que concuerdan con esta invención, unión de acoplamiento moderada y por lo tanto reducen la semivida de suero y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Otras modificaciones adicionales de la región constante se pueden utilizar para eliminar enlaces disulfuro o porciones oligosacáridas que permiten la localización aumentada debido a una especificidad de antigeno incrementada o flexibilidad de anticuerpo. Similarmente, las modificaciones a la región constante de acuerdo con la invención se pueden realizar fácilmente utilizando técnicas de manipulación bioquímica o molecular bien conocidas que se encuentran dentro de lo considerado por una persona experta en el ámbito.

En algunas modalidades, un agente que una FZD que es un anticuerpo no tiene una o más funciones efectoras. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo no tiene actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . En algunas modalidades, el anticuerpo no se une a un receptor Fe y/o factores de complemento. En algunas modalidades, el anticuerpo no tiene función efectora.

Se notará que en algunas modalidades, los anticuerpos modificados se pueden manipular para fusionar el dominio CH3 directamente a la región de hendidura de los anticuerpos modificados respectivos. En otras construcciones puede ser deseable proporcionar un separador peptídico entre la región de hendidura y los dominios modificados CH2 y/o CH3. Por ejemplo, las construcciones compatibles se pueden expresar en donde se ha suprimido el dominio CH2 y el dominio CH3 remanente (modificado o no modificado) se une a la región de hendidura con un separador de 5-20 aminoácidos. Este separador se puede agregar, por ejemplo, para asegurar que los elementos reguladores del dominio constante permanecen libres y accesibles o que la región de hendidura permanece flexible. No obstante, debe hacerse notar que los separadores de aminoácidos, en algunos casos, pueden demostrar ser inmunogénicos e inducir una respuesta inmune no deseada contra la construcción. En consecuencia, en algunas modalidades cualquier separador agregado a la construcción será relativamente no inmunogénico o incluso se omitirá por completo de manera que se mantengan las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados.

Además de la supresión de los dominios de región constante completos se apreciará que los anticuerpos de la presente invención se pueden proporcionar por la supresión o sustitución parcial de algunos o incluso de un solo aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un aminoácido único en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión de Fe y de esta manera incrementar la localización del tumor. Similarmente, puede ser deseable simplemente suprimir la parte de uno o más dominios de la región constante que controlan la función efectora (por ejemplo la unión CLQ de complemento) que se va a modular. Las supresiones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (semivida en suero) mientras deja intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante sujeto. Además, como se describe en lo anterior, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden estar modificadas por mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que incrementan el perfil de la construcción resultante. A este respecto, puede ser posible que se interrumpa la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo unión Fe) mientras que mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Algunas modalidades pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para incrementar las características deseables tales como disminución o aumento de la función efectora o para proporcionar más citotoxina o unión de carbohidrato. En estas modalidades puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados .

La presente invención abarca adicionalmente variantes y equivalentes los cuales son sustancialmente homólogos a los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos o fragmentos de anticuerpo de los mismos, que se establecen en la presente. Estos pueden contener, por ejemplo mutaciones de sustitución conservadora, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro dentro de la misma clase 1 genera tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro con otro aminoácido neutro. Lo que se pretende por una sustitución conservadora de aminoácidos es bien conocido en el ámbito.

La invención también se relaciona con inmunoconj ugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos incluyen agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores de crecimiento, toxinas (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, micótico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) , isótopos radioactivos (es decir, un radioconjugado) , etc. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de los inmunoconj ugados incluyen, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos que no se unen de toxina de difteria, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecciona, oc-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Están disponibles una diversidad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados que incluyen 212Bi, 1311, 1311?, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se elaboran utilizando una diversidad de agentes acopladores de proteína bifuncionales tales como 3-(2-piridilditiol ) -propionato de N-succinimidil (SPDP, por sus siglas en inglés), iminotiolano (IT, por sus siglas en inglés) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como clorhidrato de adipimidato de dimetilo) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina ) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilendiamina ) , diisocianatos (tales como 2 , ß-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor-bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como una caliqueamicina, maitansinoides , un tricoteno y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se pueden utilizar.

Los anticuerpos de conjugados están constituidos de dos anticuerpos unidos covalentemente . Se han propuesto a los anticuerpos de tener, por ejemplo, como objetivo células inmunitarias a células no deseadas (patente de E.U.A. número 4,676,980). Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteína sintética, que incluyen aquellos que involucran agentes reticulantes . Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio disulfuro o por formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato .

Sin importar de qué manera se obtienen cantidades útiles, los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en cualquiera de numerosas formas conjugadas (es decir, un inmunoconjugado) o no conjugadas. De manera alternativa, los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar en una forma no conjugada o "desnuda". En algunas modalidades, los anticuerpos utilizan en forma no conjugada para ensamblar los mecanismos de defensa naturales del sujeto que incluyen citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) para eliminar las células malignas. En algunas modalidades, los anticuerpos se pueden conjugar a radioisótopos tales como 90Y, 125I, 131I, 123I, mIn, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re y 188Re utilizando cualquiera de numerosos quelantes bien conocidos o por marcado directo. En otras modalidades, las composiciones descritas pueden comprender anticuerpos acoplados a medicamentos, fármacos precursores o modificadores de respuesta biológica tales como metotrexato, adriamicina y limfocinas tales como interferón. Otras modalidades adicionales de la presente invención comprenden el uso de anticuerpos conjugados a biotoxinas especificas tales como toxina de ricina o de difteria. En otras modalidades adicionales los anticuerpos modificados pueden formar complejos con otros ligandos inmunológicamente activos (por ejemplo anticuerpos o fragmentos de los mismos) en donde la molécula resultante se une tanto a células neoplásicas como a células efectoras tales como los linfocitos T. La selección de cual anticuerpo modificado conjugado o no conjugado utilizar dependerá del tipo y etapa de cáncer, el uso de tratamiento adyuvante (por ejemplo quimioterapia o radiación externa) y condición del paciente. Se apreciará que una persona experta en el ámbito puede realizar fácilmente esta selección tomando en consideración las enseñanzas de la presente.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes , polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o un fragmento del mismo, contra un receptor FZD humano. Se reconocerá en el ámbito que algunas secuencias de aminoácidos de la invención pueden variar sin efecto significativo de la estructura o función de la proteina. De esta manera, la invención incluye adicionalmente variaciones de los polipéptidos los cuales muestran actividad sustancial o los cuales incluyen regiones de un anticuerpo o fragmentos de las mismas contra proteina receptora FZD humana. Los mutantes incluyen supresiones, inserciones, inversiones, secuencias repetidas y sustituciones de tipo.

Los polipéptidos y análogos se pueden modificar adicionalmente para que contengan porciones químicas adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Estas porciones derivatizadas pueden mejorar la solubilidad, la semivida biológica o la absorción de la proteína. Las porciones también pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario deseable (sic) de las proteínas y similares. Una revisión de estas porciones se pueden encontrar en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed . , ack Publisnhing Co., Easton, PA (2000).

Los polipéptidos aislados descritos en la presente se pueden producir por cualquier método adecuado conocido en el ámbito. Los métodos varían desde métodos de síntesis directa de proteínas hasta construcción de una secuencia de ADN que codifica para secuencias polipeptídicas aisladas y que expresan estas secuencias en un hospedador transformado adecuado. En algunas modalidades, se construye una secuencia de ADN utilizando tecnología recombinante al aislar o sintetizar una secuencia de ADN que codifica para una proteína natural de interés. Opcionalmente, la secuencia puede ser mutagenizada por mutagénesis específica de sitio para proporcionar análogos funcionales de la misma. Véase, por ejemplo, Zoeller et al., Proc. Nat 11. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) y la patente de E.U.A. número 4,588,585.

En algunas modalidades una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido de interés se puede construir por síntesis química utilizando un sintetizador oligonucleotídico . Los oligonucleótidos se pueden diseñar en base en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y al seleccionar aquellos codones que se favorecen en la célula hospedadora en la cual se producirá el polipéptido recombinante de interés. Se pueden aplicar métodos estándar para sintetizar una secuencia polinucleotídica aislada que codifica para un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, se puede utilizar una secuencia completa de aminoácidos para construir un gen retrotraducido . Además, se puede sintetizar un ADN oligomérico que contenga una secuencia nucleotídica que codifique para el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, se pueden sintetizar varios oligonucleótidos pequeños que codifican para porciones del polipéptido deseado y después se pueden unir. Los oligonucleótidos individuales típicamente contienen partes sobresalientes 5' o 3' para ensamblado complementario.

Una vez ensambladas (por síntesis, mutagénesis dirigida a sitio u otro método) , las secuencias polinucleotídicas que codifican para un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se unirán operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la proteina en un hospedador deseado. Se puede confirmar el ensamblado adecuado por secuenciado nucleotídico, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un hospedador adecuado. Como es bien conocido en el ámbito, con el fin de obtener niveles de expresión elevados de un gen transfectado en un hospedador, el gen debe ser enlazado operativamente a secuencias de control de expresión transcripcionales y traduccionales que son funcionales en el hospedador de expresión seleccionado.

En algunas modalidades, los vectores de expresión recombinantes se utilizan para amplificar y expresar anticuerpos que codifican para ADN o fragmentos de los mismos contra receptores encrespados humanos. Los vectores de expresión recombinantes son construcciones de ADN replicables las cuales tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican para una cadena polipeptídica de un anticuerpo antiFZD, o un fragmento de la misma, unido operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados derivados de genes de mamífero, microbianos, virales o de insecto. Una unidad transcripcional generalmente comprende un ensamblado de (1) un elemento genético o elementos que tienen un papel regulador en la expresión de genes, por ejemplo, promotores transcripcionales o mejoradores, (2) una secuencia estructural o codificante la cual es transcrita en ARNm y traducida en una proteína, y (3) secuencias de inicio y de terminación de transcripción y traducción apropiadas, como se describe con detalle más adelante. Los elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. La capacidad para replicar en un hospedador, habitualmente denominado por un origen de replicación y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes se pueden incorporar adicionalmente . Las regiones de ADN están unidas operativamente cuando se relacionan funcionalmente entre sí. Por ejemplo, un ADN para un péptido señal (líder secretor) se enlaza operativamente a ADN para un polipéptido si es expresado como un precursor el cual participa en la secreción del polipéptido; un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribozoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado de manera que permite la traducción. Los elementos estructurales destinados para uso en sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que habilita la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora. De manera alternativa, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo metionina en la parte N terminal. Este residuo opcionalmente puede ser separado subsecuentemente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

La elección de la secuencia de control de expresión y el vector de expresión dependerán de la elección del hospedador. Se pueden utilizar una amplia variedad de combinaciones de hospedador de expresión/vector. Los vectores de expresión útiles para hospedadores eucarióticos incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, de virus de papiloma bovino, de adenovirus y de citomegalovirus . Los vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos tales como plásmidos de Escherichia coli que incluyen pCRl, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de alcance de hospedador más amplios tales como M13 y fagos de ADN de cadena sencilla filamentosos.

Las células hospedadoras adecuadas para expresión de un polipéptido o anticuerpo que une FZD (o una proteína FZD para uso como un antígeno) incluye células procarióticas , de levadura, de insecto o eucarióticas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos por ejemplo E. coli o bacilos. Las células eucarióticas superiores incluyen lineas de células establecidas de origen de mamífero como se describe más adelante. También se pueden utilizar sistemas de traducción sin células. Los vectores de clonación y expresión apropiados para uso con hospedadores bacterianos, micóticos, de levadura y de mamífero celulares se describen por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), la descripción relevante de la cual se incorpora en la presente como referencia. La información adicional respecto a métodos de producción de proteína, gue incluyen producción de anticuerpo se puede encontrar, por ejemplo, en la publicación de patente de E.U.A. número 2008/0187954, las patentes de E.U.A. números 6,413,746 y 6,660,501 y la publicación de patente internacional número WO 04009823, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad .

Diversos sistemas de cultivo de células de mamífero o de insecto también se pueden utilizar ventajosamente para expresar proteína recombinante . La expresión de proteína recombinante en células de mamíferos se puede llevar a cabo debido a que tales proteínas generalmente se pliegan o naturalizan correctamente, se modifican apropiadamente o son completamente funcionales. Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñon de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981) y otras líneas de células capaces de expresar un vector apropiado que incluyen, por ejemplo, células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), HeLa y líneas de células BHK. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y un mej orador unido al gen que se va a expresar y otras secuencias no transcritas flanqueantes 5' o 3' y secuencias no traducidas 5' ó 3', tales como los sitios de unión a ribozoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de empalme y secuencias de terminación transcripcional. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterologas en células de insectos se revisan por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

Las proteínas producidas por un hospedador transformado se pueden purificar de acuerdo con cualquier método adecuado. Los métodos estándar incluyen cromatografía (por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y de columna de determinación de tamaño) , centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para purificación de proteínas. Se pueden unir a la proteína etiquetas de afinidad tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de recubrimiento de influenza y glutation-S-transferasa para permitir la fácil purificación por paso sobre una columna de afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también se pueden caracterizar físicamente utilizando técnicas tales como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.

Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas los cuales secretan proteína recombinante en medio de cultivo se pueden concentrar primero utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente , por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. De manera alternativa se puede utilizar una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos utilizados comúnmente en la purificación de proteínas. De manera alternativa se puede utilizar una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo y carboximetilo . Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-CLAP) utilizando medios RP-CLAP hidrofóbicos , por ejemplo gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes, se pueden utilizar para purificar adicionalmente un agente que se une a FZD. Parte o la totalidad de las etapas de purificación precedentes, en diversas combinaciones, también se pueden utilizar para proporcionar una proteina recombinante homogénea.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se puede aislar, por ejemplo, por extracción inicial de sedimentos celulares, seguido por uno o más de concentración, eliminación de sal, intercambio iónico acuoso o etapas de cromatografía de exclusión de tamaño. Se puede utilizar la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) para etapas de purificación final. Las células microbianas utilizadas en la expresión de una proteína recombinante se pueden romper por cualquier método conveniente que incluyen ciclos de congelamiento-recalentamiento, sonicado, ruptura mecánica o el uso de agentes para lisis celular.

Los métodos conocidos en el ámbito para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo los descritos en las publicaciones de patentes de E.U.A. número 2008/0312425, 2008/0177048 y 2009/0187005, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad .

En algunas modalidades, el agente que une FZD es un polipéptido que no es un anticuerpo. Se conocen en el ámbito una diversidad de métodos para identificar y producir polipéptidos que no son anticuerpos que se unen con alta afinidad a una proteina objetivo. Véase, por ejemplo, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gilí et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2996), Nygren, FEBS J. , 275:2668-76 (2008) y Skerra, FEBS J. , 275:2677-83 (2008), cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente en su totalidad .

En algunas modalidades se ha utilizado la tecnología de presentación de fago para identificar/producir el polipéptido que se une a FZD. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una infraestructura de proteína de un tipo que se selecciona del grupo que consiste de proteína A, una lipocalina, un dominio de fibronectina, un dominio repetido de consenso de ankirina y tiorredoxina .

En algunas modalidades el polipéptido ha sido modificado naturalmente o no naturalmente. Por medio del ejemplo no limitante, el polipéptido puede ser etiquetado. En algunas modalidades, el polipéptido es glicosilado, pegilado, fosforilado o acetilado, amidado. En algunas modalidades, las modificaciones incrementan la estabilidad y/o la vida media in vivo del polipéptido. En algunas modalidades, los polipéptidos son cíclicos. En algunas modalidades adicionales, los polipéptidos comprenden uno o más N-metil aminoácidos.

En algunas modalidades, al agente de unión FZD es (o comprende) un polipéptido que comprende (a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-112 o (b) una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-111. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 88, o por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-111. En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de un péptido cíclico seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-112. En algunas modalidades, la secuencia es la SEC ID NO: 108. En algunas modalidades alternativas, la secuencia es la SEC ID NO:112.

En algunas modalidades alternativas, el agente de unión FZD es (o comprende) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 88%, o por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 113-116. En algunas modalidades alternativas, el agente de unión FZD es (o comprende) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente de, o que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 113-116.

En algunas modalidades, el polipéptido de unión FZD puede ser menos de aproximadamente 500 aminoácidos de longitud, menos de aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, menos de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, menos de aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, o menos de aproximadamente 15 aminoácidos de longitud . Tales polipéptidos pueden ser por lo menos aproximadamente 3, por lo menos aproximadamente 5, o por lo menos aproximadamente 7 aminoácidos de longitud. Por consiguiente, en algunas modalidades el polipéptido puede ser entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el polipéptido es entre aproximadamente 7 y aproximadamente 15 aminoácidos de longitud .

En algunas modalidades el agente es una molécula que no es una proteina. En algunas modalidades el agente es una molécula pequeña. Se conocen por aquellos expertos en el ámbito bibliotecas de química combinatorias y técnicas útiles en la identificación de agentes de unión de FZD diferentes de proteínas. Véase, por ejemplo, Kennedy et al., J. Comb. Chem, 10:345-354 (2008), Dolle et al, J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007) y Bhattacharyya, Curr. Med. Chem. , 8:1383-404 (2001), cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente en su totalidad. En algunas modalidades adicionales, el agente es un carbohidrato, un glucosaminoglucano, una glucoproteina o un proteoglucano .

En algunas modalidades, el agente comprende un lipido. Por ejemplo, en algunos casos, el agente puede comprender un ácido graso o un derivado del mismo. En algunas modalidades, el ácido graso es ácido miristoleico, ácido palmitoleico , ácido sapiénico, ácido oléico, ácido linoleico, ácido oí-linoleico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido erúcico, o ácido docosahexaenoico . Debido a que la hendidura del BBS es hidrofóbica, agentes que comprenden uno o más lipidos son particularmente adecuados para dirigir la hendidura.

En algunas modalidades el agente es un aptámero de ácido nucleico. Los aptámeros son moléculas polinucleotidicas que han sido seleccionadas (por ejemplo a partir de acumulados aleatorios o mutagenizados ) en base en su capacidad para unirse a otra molécula. En algunas modalidades, el aptámero comprende un polinucleótido de ADN. En algunas modalidades alternativas, el aptámero comprende un polinucleótido de ARN. En algunas modalidades, al aptámero comprende uno o más residuos de ácido nucleico modificados. Los métodos de generación y cribado de aptámeros de ácido nucleico para unión a proteínas son bien conocidos en el ámbito. Véanse la patente de E.U.A. número 5,270,163; la patente de E.U.A. número 5,683,867; la patente de E.U.A. número 5,763,595; la patente de E.U.A. número 6,344,321; la patente de E.U.A. número 7,368,263; la patente de E.U.A. número 5,582,981; la patente de E.U.A. número 5,756,291; la patente de E.U.A. número 5,840,867; la patente de E.U.A. número 7.312,325; la patente de E.U.A. número 7,329,742; la publicación de patente internacional número WO 02/077262, la publicación de patente internacional número WO 03/070984, la publicación de solicitud de patente de E.U.A. número 2005/0239134, la publicación de solicitud de patente de E.U.A. número 2005/0124565 y la publicación de solicitud de patente de E.U.A. número 2008/0227735, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.

En algunas modalidades, el agente tiene un peso molecular de por lo menos aproximadamente 100 Daltones. En algunas modalidades, el agente tiene un peso molecular de por lo menos aproximadamente 1000 Daltones. En algunas modalidades, el agente tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 200 Daltones o menos de aproximadamente 1000 Daltones .

La presente invención proporciona adicionalmente métodos para el cribado de agentes para eficacia en la inhibición de la señalización Wnt, para eficacia antitumoral y/o eficacia contra citoblastos cancerosos. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a métodos que comprenden comparar los niveles de uno o más marcadores de diferenciación en un primer tumor sólido que se ha expuesto al agente, en relación a los niveles de uno o más marcadores de diferenciación en un segundo tumor sólido que no ha sido expuesto al agente. En algunas modalidades estos métodos incluyen: (a) exponer un primer tumor sólido, pero no un segundo tumor sólido al agente; (b) determinar los niveles de uno o más marcadores de diferenciación en el primero y segundo tumores sólidos; y (c) comparar los niveles de uno o más marcadores de diferenciación en el primero y segundo tumores sólidos. En algunas modalidades, el agente es un inhibidor de la via de señalización Wnt canónica y/o nivel a unión de una o más proteínas Wnt humanas a uno o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a uno o más receptores encrespados humanos. En algunas modalidades, los niveles aumentados de uno o más marcadores de diferenciación en el primer tumor sólido en relación al segundo tumor sólido indica eficacia contra citoblastos de tumor sólido. En algunas modalidades alternativas, los niveles disminuidos de uno o más marcadores de diferenciación (es decir, marcadores negativos para diferenciación) en el primer tumor sólido en relación al segundo tumor sólido indica eficacia contra citoblastos del tumor sólido. En algunas modalidades, el tumor sólido es un tumor pancreático. En algunas modalidades el tumor sólido es un tumor pancreático y uno o más de los marcadores de diferenciación pueden comprender una o más mucinas (por ejemplo Mucl6) y/o cromogranina A (CHGA, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades alternativas el tumor sólido es tumor de colon. En algunas modalidades el tumor sólido es un tumor de colon y uno o más marcadores de diferenciación comprenden citoqueratina 7. Otros marcadores de diferenciación potenciales para páncreas y colon asi como otros tipos de tumores son conocidos por aquellos expertos en el ámbito. La utilidad de los marcadores de diferenciación potencial en un método de cribado se puede determinar fácilmente por una persona experta en el ámbito al tratar el tipo de tumor deseado con uno o más de los anticuerpos antiFZD descritos en la presente tales como 18R5 y/o 44R24 y después determinar en búsqueda de cambios en la expresión del marcador por el tumor tratado en relación al control. Los ejemplos no limitantes de estos métodos se pueden encontrar, por ejemplo, en los ejemplos específicos que se proporcionan más adelante.

Reactivos útiles para análisis de selección adicional incluyen derivados FZD mutantes. Por ejemplo, polipéptidos que comprenden el dominio Fri de un receptor encrespado en el cual uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más) sustituciones de aminoácido se han hecho en el Sitio de Unión Biológica (BBS). En algunas modalidades, los polipéptidos mutantes presentan una afinidad de unión reducida con un Wnt (por ejemplo, Wnt3a) , con relación a la afinidad de unión que un polipéptido comprende el dominio Fri de tipo nativo del receptor encrespado tiene para el Wnt. En algunas modalidades, el dominio Fri de tipo nativo comprende una secuencia de dominio Fri mínima tal como una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 117-126. Alternativamente, el dominio Fri de tipo nativo comprende un polipéptido que tiene una secuencia de dominio Fri FZD seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, y 64. En algunas modalidades, una o más de las sustituciones se pueden hacer en el sitio de un residuo de hendidura seleccionado de la Tabla 16 y/o Tabla 17. En algunas modalidades, el dominio Fri es un dominio Fri FZD4, FZD5, o FZD8. En algunas modalidades, el dominio Fri es un dominio Fri FZD8 que comprende una o más sustituciones en F72, L75, 178, o L121. En algunas modalidades, el dominio Fri FZD8 comprende una mutación en L75. Una o varias sustituciones de aminoácidos en la hendidura del BBS pueden, por ejemplo, ser uno o varios residuos de aminoácido que son menos hidrofóbicos que el residuo de aminoácido en tal mismo sitio en la secuencia FZD de tipo nativa. Alternativamente, una o más sustituciones se pueden hacer en el sobresaliente superior y/o el sobresaliente inferior del BBS. En algunas modalidades, el polipéptido FZD mutante es soluble. En algunas modalidades, el polipéptido FZD mutante es un receptor FZD soluble y puede comprender una región Fe, tal como una región Fe humana.

En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido gue comprende el dominio Fri de FZD8 en el cual una o más sustituciones se han hecho en el BBS el cual perjudica la unión de FZD8 a Wnt . Por ejemplo, una o más sustituciones se pueden haber hecho en la hendidura del BBS. En algunas modalidades, una o más sustituciones se han hecho en F72, L75, 178, y/o L121. Ejemplos no limitantes de sustituciones posibles incluyen F72Y, L75S, I78S, o L121S. En algunas modalidades, una sustitución se ha hecho en L75 (por ejemplo, L75S) . Ensayos de cribado para agentes los cuales se unen al BBS de un receptor FZD (por ejemplo, un receptor FZD humano) , inhiben la señalización Wnt y/o pueden ser usados como agentes terapéuticos, tales como agentes anticancerigenos , incluyen ensayos en los cuales un compuesto es cribado para unión preferencial a una secuencia de dominio Fri FZD de tipo nativo con relación a un polipéptido FZD mutante en el cual se han hecho una o más sustituciones de aminoácido en el BBS. Por ejemplo, la invención proporciona un método de cribado de un compuesto para posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt. En una modalidad, el método comprende determinar la afinidad de enlace (cualitativamente o cuantitativamente) de un compuesto para un primer polipéptido que comprende el dominio Fri de un receptor encrespado, en donde el dominio Fri comprende una o más sustituciones en el Sitio de Unión Biológica (BBS) . El método comprende además determinar la afinidad de unión del compuesto por un segundo polipéptido que comprende la secuencia de tipo nativa del dominio Fri del receptor Encrespado humano del primer polipéptido, y después comparar la afinidad de unión del compuesto para el primer polipéptido con la afinidad de unión del compuesto para el segundo polipéptido. Si el compuesto tiene mayor afinidad para el segundo polipéptido (dominio Fri FZD de tipo nativo) que el primer polipéptido (BBS mutante) , el compuesto es identificado como un posible inhibidor de señalización nt (y agente anticancerigeno candidato) .

En algunas modalidades, los receptores FZD en los análisis descritos anteriores u otros análisis descritos aquí son receptores FZD humanos. Un receptor FZD humano puede ser FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, o FZD10. Del mismo modo, en algunas modalidades de los análisis mencionados antes, u otros análisis descritos en otra parte aquí, la proteina Wnt es una proteina Wnt humana. Por ejemplo, en algunas modalidades, la proteina Wnt es Wnt3a humana, u otra proteina Wnt humana descrita en otra parte aquí .

La invención proporciona además polipéptidos adicionales (por ejemplo, polipéptidos de unión FZD) útiles en análisis de cribado. Por ejemplo, la invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-112. En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de un péptido cíclico seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-112. La invención también proporciona polipéptidos aislados que comprenden, consisten esencialmente de, o que consisten de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs:113-116. En algunas modalidades, la secuencia es la SEC ID NO: 108. En algunas modalidades, la secuencia es la SEC ID NO: 112. En algunas modalidades alternativas, la secuencia es la SEC ID NO: 113. Los polipéptidos usados en los análisis de unión competitivos y/o análisis de desplazamiento son, en algunos casos, etiquetados o modificados. En general, cualquiera de los agentes de unión FZD descritos aquí puede ser usado en tales análisis. En algunas modalidades alternas, el polipéptido de unión FZD usado en un análisis de unión competitiva es el anticuerpo 18R5.

También se proporcionan métodos de cribado que involucran el uso de los polipéptidos de unión FZD descritos en el párrafo precedente o en otra parte aquí (por ejemplo, agentes de unión FZD que se unen a uno o más residuos en la hendidura del BBS) . En una modalidad, un método de cribado de un compuesto para determinar posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt comprende determinar si el compuesto puede competir con un polipéptido de unión FZD para unión a un receptor FZD humano (y/o desplazar el polipéptido del receptor FZD al cual está unido) . En tal método, la capacidad del compuesto para competir por unión con el polipéptido (y/o desplazar el polipéptido del receptor FZD al cual está unido) indica que el compuesto tiene posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt. En algunas modalidades, el receptor FZD es FZD8. En algunas modalidades, la molécula del receptor FZD humano actualmente usada en el análisis de cribado está en una forma soluble (por ejemplo, una molécula FZD-Fc tal como FZD8Fc, la cual comprende el dominio extracelular o por lo menos el dominio Fri de la proteina FZD fusionada a una región Fe) .

En algunas modalidades, los análisis de cribado y/o otros análisis descritos en la presente han sido usados para identificar los agentes de unión FZD. Por ejemplo, el agente puede haber sido identificado por un análisis de desplazamiento o unión competitiva usando un polipéptido que comprende una de las SEC ID NOs: 98-116. Alternativamente, el agente puede por ejemplo, haber sido identificado por unión reducida a un FZD que contiene una o más sustituciones en la BBS con relación al FZD de tipo nativo.

III. Polinucleótidos En algunas modalidades, la invención abarca polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican para un polipéptido que se une específicamente a receptor FZD humano o un fragmento de ese polipéptido. Por ejemplo, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo para un receptor encrespado humano o que codifica para un fragmento de ese anticuerpo. Los polinucleótidos de la invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN. ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético; y puede ser de cadena doble o de cadena sencilla y, si es de cadena sencilla puede ser la cadena codificante o la no codificante (antisentido) .

En algunas modalidades, los polinucleótidos están aislados. En algunas modalidades, los polinucleótidos son sustancialmente puros.

La invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 10, 12 y 14. La invención proporciona adicionalmente un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 85-86. También se proporciona un polinucleótido que comprende polinucleótidos que codifican para un polipéptido que comprende las SEC ID NOS: 11, 13 ó 15.

También se proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs:98-lll y SEC ID NOs:113-116. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica la SEC ID NO: 108.

La invención proporciona adicionalmente un polinucleótido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 17, 19 y 21. De manera alternativa, en algunas modalidades, el polinucleótido puede comprender una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 87-90, 92 y 94-95. También se proporcionan secuencias polinucleotidicas que comprenden la SEC ID NO: 18, 20 o 22.

También se proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que hibridiza para un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 17, 19 o 21 y/o con un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 10, 12 ó 14. También se proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que hibridiza para un polinucleótido que tiene una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 87-90, 92 y 94-95 y/o con un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de las SEC ID NOS: 85 u 86. En algunas modalidades, la hibridación es bajo condiciones de alta rigurosidad.

En algunas modalidades los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura con un polinucleótido el cual ayuda, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido de una célula hospedadora (por ejemplo, una secuencia líder la cual funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula) . El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder separada por la célula hospedadora para conformar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar para una proproteína la cual es la proteína madura más residuos aminoácidos en la parte 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia se separa, lo que queda es una proteína madura activa.

En algunas modalidades los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedador bacteriano, o la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de una proteina de hemaglutinina de influenza cuando se utiliza hospedador de mamífero (por ejemplo células COS-7).

La presente invención se relaciona adicionalmente con variantes de los polinucleótidos descritos en lo anterior que codifican, por ejemplo, para fragmentos, análogos y derivados .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona polinucleótido aislados que comprenden polinucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica por lo menos 80% idéntica, por lo menos 85% idéntica, por lo menos 90% idéntica, por lo menos 95% idéntica y en algunas modalidades por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo a un receptor FZD humano descrito en la presente.

Por un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia nucleotídica de referencia se quiere indicar que la secuencia nucleotídica del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polinucleot idica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia nucleotidica de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia nucleotidica por lo menos 95% idéntica a una secuencia nucleotidica de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden suprimir o sustituir con otro nucleótído, o un número de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar en una secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia se pueden presentar en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia nucleotidica de referencia o en cualquier parte entre estas posiciones terminales, interpuestas individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Las variantes polinucleotidicas pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. En algunas modalidades, las variantes polinucleotidicas contienen alteraciones las cuales producen sustituciones, adiciones o supresiones que no se expresan (silenciosas) pero que no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas modalidades, las variantes nucleotidicas se producen por sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Las variantes polinucleotidicas se pueden producir por una diversidad de razones, por ejemplo para optimizar la expresión de codón por un hospedador particular (cambio de codones en el ARNm humano por aquellos preferidos por un hospedador bacteriano tal como E. coli) .

También se proporcionan vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en la presente.

IV. Métodos de uso y composiciones farmacéuticas Los agentes que unen FZD (que incluyen polipéptidos y anticuerpos) de la invención son útiles en una diversidad de aplicaciones que incluyen pero que no se limitan a métodos de tratamiento terapéutico tal como el tratamiento de cáncer. En algunas modalidades, los agentes son útiles para inhibir la señalización nt (por ejemplo, señalización Wnt canónica) , inhibir el crecimiento de tumores, inducir diferenciación, reducir el volumen de tumor y/o reducir la tumorigenicidad de un tumor. Los métodos de uso pueden ser in vitro, ex vivo o métodos in vivo. En algunas modalidades, el agente, polipéptido o anticuerpo que une FZD es un antagonista de uno o más receptores encrespados humanos a los cuales se une.

En algunas modalidades, los agentes o antagonistas que unen FZD se utilizan en el tratamiento de una enfermedad asociada con activación de señalización de Wnt. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar una cantidad efectiva del agente de unión FZD a un sujeto. En algunas modalidades, la enfermedad es cáncer o una enfermedad renal poliquistica . En modalidades particulares, la enfermedad es una enfermedad dependiente de la señalización Wnt. En modalidades particulares, la señalización de Wnt es señalización de Wnt canónica. En algunas modalidades, los agentes o antagonistas que unen FZD se utilizan en el tratamiento de trastornos caracterizados por niveles aumentados de citoblastos y/o células progenitoras.

En algunas modalidades, la enfermedad tratada con el agente o antagonista que una FZD (por ejemplo, un anticuerpo antiFZD) es un cáncer. En algunas modalidades, el cáncer está caracterizado por tumores que dependen de Wnt. En algunas modalidades, el cáncer está caracterizado por tumores que expresan uno de los receptores encrespados a los cuales se une el agente de unión FZD (por ejemplo un anticuerpo) . En algunas modalidades, el cáncer está caracterizado por tumores que expresan uno o más genes en una firma de gen Wnt.

En algunas modalidades, la enfermedad tratada con el agente o antagonista de unión FZD no es un cáncer. Por ejemplo, la enfermedad puede ser un trastorno metabólico tal como obesidad o diabetes (por ejemplo diabetes tipo II) (Jin T., Diabetologia, 2008 Oct; 51 ( 10) : 1771-80) . De manera alternativa, la enfermedad puede ser un trastorno óseo tal como osteoporosis , osteoartritis o artritis reumatoide (Corr M . , Nat Clin Pract Rheumatol, 2008 oct; 4 ( 10) : 550-6; Day et al., Bone Joint Surg Am, 2008, Feb;90 Suppl 1:19-24) . La enfermedad también puede ser un trastorno renal tal como renopatia poliquistica (Harris et al., Annu Rev Med, 2008 Oct. 23; Schmidt-Ott et al., Kidney Int, 2008 Oct; 74 (8) : 1004-8; Benzing et al., J Am Soc Nephrol, 2007. May; 18 ( 5 ) : 1389-98 ) . De manera alternativa, los trastornos oculares incluyen pero no se limitan a degeneración macular y vitreorretinopatia exudativa familiar pueden ser tratadas (Lad et al., Stem Cells Dev, 2008 Aug. 8). También se pueden tratar trastornos cardiovasculares que incluyen infarto al miocardio, aterosclerosis , trastornos de la válvula e hipertrofia cardiaca (Al-Aly Z., Transí Res, 2008 May; 151 (5) : 233-9; Kobayashi et al., Nat Cell Biol, 2009 Jan; 11 (1) : 46-55; van Gijn et al., Cardiovasc Res, 2002 Jul; 55 (1) : 16-24; Christman et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008 Jun; 2 4 ( 6 ) : H2864 -70 ; Malekar et al, Hypertension, 2010 Apr; 55 (4): 939-45 (Epub 2010 Feb 22)). En algunas modalidades, la enfermedad es un trastorno pulmonar tal como hipertensión arterial pulmonar idiopática o fibrosis pulmonar (Laumanns et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2008, Nov 21; Kónigshoff et al., PLoS ONE, 2008 May 14;3 (5) :e2142) . En algunas modalidades, la enfermedad tratada con el agente que une FZD es una hepatopatia tal como cirrosis o fibrosis hepática (Cheng et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Phisiol, 2008 Jan; 29 ( 1 ) : G39-49 ) .

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para tratar enfermedad renal poliquistica que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un agente, polipéptido o anticuerpo de unión FZD. En algunas modalidades, el agente, polipéptido o anticuerpo de unión FZD se une al BBS de un receptor FZD humano (por ejemplo, FZD8). En algunas modalidades, el polipéptido de unión FZD comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-111 y SEC ID NOs: 113-116. En algunas modalidades alternativas, el polipéptido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 112. En aún modalidades adicionales, el agente de unión FZD es 18R5.

La presente invención proporciona métodos para tratar cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que una FZD a un sujeto (por ejemplo un sujeto en necesidad de tratamiento) . En algunas modalidades, el cáncer es un cáncer que se selecciona del grupo que consiste de cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer cervical, cáncer de vejiga, glioblastoma y cáncer de las vias respiratorias y digestivas altas. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer colorrectal. En algunas modalidades, el sujeto es un humano.

La presente invención proporciona adicionalmente métodos para inhibir el crecimiento de tumores utilizando los anticuerpos u otros agentes descritos en la presente. En algunas modalidades, el método para inhibir el crecimiento de tumores comprende poner en contacto un tumor o células tumorales con una cantidad efectiva de un agente que una FZD (por ejemplo un anticuerpo u otro polipéptido) in vitro. Por ejemplo, una linea de células inmortalizada o una linea de células cancerosas que expresan uno o varios FZD objetivo se cultiva en medio al cual se le agrega el anticuerpo u otro agente para inhibir el crecimiento de tumores. En algunas modalidades, las células tumorales se aislan de una muestra de un paciente tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión pleural o muestra de sangre y se cultivan en el medio al cual se agrega un agente que une FZD para inhibir el crecimiento de tumores.

En algunas modalidades, el método de inhibición de crecimiento de tumores comprende poner en contacto el tumor o las células tumorales con una cantidad efectiva del agente que una FZD (por ejemplo anticuerpo) in vivo. En algunas modalidades, el contacto de un tumor o célula tumoral con un agente que una FZD se lleva a cabo en un modelo animal. Por ejemplo, los agentes de unión FZD se pueden administrar a xenoinjertos que expresan uno o más FZD que han crecido en ratones inmunodeteriorados (por ejemplo ratones NOD/SCID) para inhibir el crecimiento de tumor. En algunas modalidades, se aislan citoblastos cancerosos de una muestra de un paciente tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión pleural o muestra de sangre y se inyecta en ratones inmunodeteriorados a los que después se les administra un agente que una FZD para inhibir el crecimiento de células tumorales. En algunas modalidades, el agente que una FZD se administra al mismo tiempo o poco después de la introducción de células tumorigénicas en el animal para evitar el crecimiento de tumores. En algunas modalidades, el agente que une FZD se administra como una sustancia terapéutica después de que las células tumorigénicas han crecido a un tamaño especificado .

En algunas modalidades, el método de inhibición de crecimiento de tumor comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que una FZD. En algunas modalidades, el sujeto es un humano. En algunas modalidades, el sujeto tiene un tumor o se le ha extirpado un tumor.

En algunas modalidades, el tumor es un tumor en el cual la señalización Wnt es activa. En algunas modalidades, la señalización Wnt que es activa es señalización Wnt canónica. En algunas modalidades, el tumor es un tumor que depende de Wnt . Por ejemplo, en algunas modalidades, el tumor es sensible a sobreexpresión de axina. En algunas modalidades, el tumor no comprende una mutación inactivante (por ejemplo una mutación por corte) en poliposis adenomatosa coli (APC, por sus siglas en inglés) , el gen supresor de tumor o una mutación activante en el gen ß-catenina. En algunas modalidades, el tumor expresa uno o más genes en una firma de gen Wnt. En algunas modalidades, el cáncer para el cual el sujeto tratado involucra al tumor.

En algunas modalidades, el tumor expresa uno o más receptores encrespados humanos a los cuales se une el agente de unión FZD o el anticuerpo. En algunas modalidades, el tumor sobreexpresa uno o varios de los receptores encrespados humanos .

En algunas modalidades, el tumor es un tumor seleccionado del grupo que consiste de un tumor colorrectal, tumor pancreático, tumor pulmonar, tumor de ovario, tumor hepático, tumor de mama, tumor renal, tumor de próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de vejiga, glioblastoma y tumor de las vías respiratorias y digestivas altas. En algunas modalidades, el tumor es un tumor colorrectal. En algunas modalidades, el tumor es un tumor pancreático.

La invención también proporciona un método para inhibir señalización de Wnt en una célula que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un agente que une FZD . En algunas modalidades, la célula es una célula tumoral. En algunas modalidades, el método es un método in vivo en donde la etapa de poner en contacto a la célula con el agente comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente al sujeto. En algunas modalidades alternativas el método es un método in vi tro o ex vivo. En algunas modalidades, la señalización Wnt que se inhibe es señalización Wnt canónica. En algunas modalidades, la señalización Wnt es señalización por WNT1, WNT2, WNT3, WNT3A, ENT7a, WNT7b y/o WNT10B. En algunas modalidades, la señalización Wnt es señalización por WNT1, WNT3A, WNT7b y/o WNT10B.

Además, la invención proporciona un método para reducir la tumorigenicidad de un tumor en un sujeto que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva de un agente de unión FZD o administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que une FZD al sujeto. En algunas modalidades el tumor comprende citoblastos cancerosos. En algunas modalidades, la frecuencia de citoblastos cancerosos en el tumor se reduce por administración del agente.

De esta manera, la invención proporciona un método para reducir la frecuencia de citoblastos cancerosos en un tumor que comprende poner en contacto al tumor con una cantidad eficaz de un agente que une FZD (por ejemplo anticuerpo antiFZD u otro polipéptido que une FZD) .

La invención proporciona además métodos de diferenciación de células tumorigénicas en células no tumorigénicas que comprende poner en contacto las células tumorigénicas con un agente que une FZD (por ejemplo al administrar el agente que una FZD a un sujeto que tiene un tumor que comprende las células tumorigénicas o quien se ha extraído el tumor. En algunas modalidades, las células tumorigénicas son células tumorales pancreáticas. En algunas modalidades alternativas, las células tumorigénicas son células de tumor de colon.

También se proporciona el uso de agentes de unión FZD, polipéptidos o anticuerpos descritos en la presente para inducir la diferenciación de células que incluyen, pero que no se limitan a células tumorales. Por ejemplo se consideran métodos para inducir células para diferenciar, que comprende poner en contacto las células con una cantidad eficaz de un agente que une FZD (por ejemplo un anticuerpo antiFZD u otro polipéptido de unión FZD) descrito en la presente. También se proporcionan métodos para inducir células en un tumor en un sujeto para diferenciar, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, polipéptido o anticuerpo que une FZD al sujeto. En algunas modalidades, el tumor es un tumor pancreático. En algunas otras modalidades el tumor es un tumor de colon.

Se proporcionan adicionalmente métodos de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto, en donde la enfermedad o trastorno se asocia con activación de señalización Wnt y/o está caracterizado por un nivel aumentado de citoblastos y/o células progenitoras. En algunas modalidades, los métodos de tratamiento comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, polipéptido o anticuerpo que une FZD al sujeto. En algunas modalidades, la señalización Wnt es señalización Wnt canónica.

La presente invención proporciona adicionalmente métodos para reducir activación de miofibroblastos en el estroma de un tumor sólido que comprende poner en contacto el estoma con una cantidad eficaz de un agente, polipéptido o anticuerpo que una FZD.

La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más agentes que unen FZD descritos en la presente. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas encuentran uso para inhibir el crecimiento de tumor y tratar cáncer en pacientes humanos.

En algunas modalidades, se preparan formulaciones 17 para almacenamiento y uso para combinar un anticuerpo o agente purificado de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo un portador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000) . Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a amortiguadores no tóxicos tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (por ejemplo cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol, resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (por ejemplo menos de aproximadamente 10 residuos aminoácidos) ; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tales como monosacáridos , disacáridos, glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína) y tensioactivos no iónicos tales como TWEEN o polietilenglicol (PEG) .

En algunas modalidades, la composición farmacéutica es congelada. En algunas modalidades alternativas, la composición farmacéutica es liofilizada.

La invención proporciona formulaciones para los anticuerpos descritos aguí, tales como 18R5, los cuales comprenden uno o más (o todos) de los siguientes componentes: 30-50 de mM Histidina, 70-110 mM de Cloruro de Sodio, 60-100 mM de Sacarosa, y/o 0.01%-0.04% de Polisorbato-20 , con un pH de 5.5 a 5.9. En algunas modalidades, la formulación comprende 40 mM de Histidina, 86 mM de Cloruro de Sodio, 82 mM de Sacarosa, y 0.02% Polisorbato-20, pH 5.7. De este modo, en una modalidad, una formulación 18R5 comprende 5-20 mg/mL de 18R5, 40 mM de Histidina, 86 mM de Cloruro de Sodio, 82 mM de Sacarosa, y 0.02% de Polisorbato-20, pH 5.7. En otra modalidad, una formulación 18R5 comprende 5-20 mg/mL de 18R5, 56 mM de Histidina, 86 mM de Cloruro de Sodio, 82 mM de Sacarosa, y 0.02% de Polisorbato-20, pH 5.7. En algunas modalidades, la concentración de 18R5 en la formulación es 10 mg/mL. En algunas modalidades, la composición farmacéutica es congelada .

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de numerosas maneras para tratamiento local o sistémico. La administración puede ser tópica (tal como membranas mucosas que incluyen administración vaginal y rectal) tal como parches transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aspersiones, líquidos y polvos; pulmonar (por ejemplo mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles que incluyen por nebulizador, intratraqueal , intranasal, epidérmico y transdérmico) ; oral; o parenteral que incluye intravenoso, intraarterial , subcutáneo, intraperitoneal o inyección o infusión intramuscular; o intracraneal (por ejemplo intratecal o intraventricular ) .

La formulación terapéutica puede estar en una forma de dosificación unitaria. Las formulaciones incluyen comprimidos, pildoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones en medios acuosos o no acuosos, o supositorios para administración oral, parenteral o rectal o para administración por inhalación. Las composiciones sólidas tales como comprimidos el ingrediente activo principal se mezcla con un portador farmacéutico. Los ingredientes de compresión o tableteado convencionales incluyen almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas y otros diluyentes (por ejemplo agua) para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable no tóxica de la misma. La composición de preformulación sólida después se subdivide en formas de dosificación unitaria del tipo descrito en lo anterior. Los comprimidos, pildoras, etc., de la composición novedosa se pueden recubrir o se pueden formar compuestos de alguna otra manera para proporcionara una forma de dosificación que proporcione la ventaja de acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o pildora puede comprender una composición interna cubierta por un componente externo. Además, los dos componentes se pueden separar por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración y que permite que el componente interno pase intacto a través del estómago o que se retrase su liberación. Se pueden utilizar una diversidad de materiales para las capas entéricas o recubrimientos, y los materiales incluyen numerosos ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos tales como materiales como laca, alcohol cetilico y acetato de celulosa.

Los anticuerpos o agentes también pueden ser atrapados en microcápsulas . Las microcápsulas se preparan, por ejemplo, por técnicas ce coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa de gelatina y microcápsulas de poli (metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de medicamento coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones como se describe en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000) .

En algunas modalidades, las formulaciones farmacéuticas incluyen anticuerpos u otros agentes de la presente invención que forman complejos con liposomas (Epstein, et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang, et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4030; y la patente de E.U.A. 4,485,045 y 4,544,545). Los liposomas con un tiempo de circulación aumentado se describen en la patente de E.U.A. 5,013,556. Algunos liposomas pueden ser generados por evaporación en fase inversa con una composición lipidica que comprende fosfatidilcolina , colesterol y fosfatidiletanolamina que forma derivado con PEG (PEG-PE, por sus siglas en inglés). Los liposomsa se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado.

Además se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparación de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices las cuales están en forma de artículos conformados, (por ejemplo películas o microcápsulas ) . Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles tal como poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli (alcohol vinílico) ) , poliláctidas (patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de 7-etilo, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOTMR (microes feras inyectables constituidas de copolimero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) , acetato e isobutirato de sacarosa y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico .

En algunas modalidades, además de administrar el agente de unión FZD, el método o tratamiento comprende además administrar un segundo agente anticancerigeno (antes, de maneras concurrente con y/o subsecuente a la administración del agente que une FZD) . También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un agente que una FZD y el segundo agente anticancerígeno. En algunas modalidades, la administración de la combinación del agente que una FZD y un segundo agente anticancerígeno tiene un efecto sinergístico, tal como un efecto sinergístico en la frecuencia de los citoblastos cancerosos.

Se apreciará que la combinación de un agente que une FZD y un segundo agente anticancerígeno se pueden administrar en cualquier orden o de manera concurrente. En modalidades seleccionadas, los agentes que unen FZD se administrarán a pacientes que previamente hayan experimentado tratamiento con el segundo agente anticancerígeno. En algunas otras modalidades, el agente que une FZD y el segundo agente anticancerígeno se administrarán de manera sustancialmente simultánea o concurrente. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar agente que una FZD mientras experimenta un curso de tratamiento con un segundo agente anticancerigeno (por ejemplo quimioterapia) . En algunas modalidades, el agente que une FZD se administrará dentro de 1 año del tratamiento con el segundo agente anticancerigeno. En algunas modalidades, el agente que une FZD se administrará dentro de 10, 8, 6, 4 ó 2 meses de cualquier tratamiento con el segundo agente anticancerigeno. En algunas modalidades, el agente que une FZD se administrará dentro de 4 , 3, 2 ó 1 semanas de cualquier tratamiento con el segundo agente anticancerigeno. En algunas modalidades, el agente que une FZD se administrará dentro de 5, 4, 3, 2 ó 1 días de cualquier tratamiento con el segundo agente anticancerigeno. Se apreciará adicionalmente que se pueden administrar al sujeto dos agentes o tratamiento al sujeto en cuestión de horas o minutos (es decir de manera sustancial simultánea) .

Las clases útiles de agentes anticancerigenos incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas , aglutinantes de surco menor de ADN, inhibidores de replicación de ADN, agentes alquilantes (por ejemplo complejos de platino tal como cis-platino, mono (platino) , bis (platino) y complejos de platino trinucleares y carboplatino) , antraciclinas , antibióticos antifolatos, antimetabolitos, sensibilizantes a quimioterapia, duocarmicinas , etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas , nitrosoureas , platinóles, compuestos de desempeño, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizantes de radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides de vinca o similares. En algunas modalidades, el segundo agente anticancerigeno es un antimetabolito, un antimitótico, un inhibidor de topoisomerasa o un inhibidor de angiogénesis .

Los agentes anticancerigenos anticancerosos que se pueden administrar en combinación con agentes que unen FZD incluyen agentes quimioterapéuticos . Asi, en algunas modalidades, el método o tratamiento involucra la administración combinada de un anticuerpo o agente de la presente invención y un agente quimioterapéutico o combinación de agentes quimioterapéuticos diferentes múltiples. El tratamiento con un anticuerpo se puede producir antes, de manera concurrente o subsecuente a la administración de quimioterapias. Las quimioterapias contempladas por la invención incluyen sustancias químicas o medicamentos los cuales se conocen en el ámbito y están disponibles comercialmente tales como gemcitabina, ironotecano, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citocina ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; busulfano, citoxina, TAXOL, metotrexato, cisplatino, melfalano, vinblastina y carboplatino . La administración combinada puede incluir la coadministración, ya sea en una formulación farmacéutica única o utilizando formulaciones separadas, o administración consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un periodo de tiempo de manera tal que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biológicas simultáneamente. Los procedimientos de preparación y dosificación para los agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o se pueden determinar empíricamente por un experto en el ámbito. Los procedimientos de preparación y dosificación para la quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la presente invención también incluyen pero no se limitan a agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN) sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altetramina, trietilenmelamina , trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y mostazas nitrogenadas de trimetilomelamima tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida , estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de raecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina , trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina , carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina , daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina , mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina , estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedores de ácido fólico tales como ácido frolinico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxano; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina ; mitobronitol ; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE, Rhone- Poulenc .Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina ; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina, navelvina; novantrona, tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidores de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO, por sus siglas en inglés); ácido retinoico; esperamicinas ; capecitabina y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Los agentes quimioterapéuticos también incluyen agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre los tumores tales como antiestrógenos que incluyen, por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4 ( 5 ) -imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida; leuprolida y goserelína; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores .

En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de topoisomerasa . Los inhibidores de topoisomerasa son agentes quimioterapéuticos que interfieren con la acción de una enzima topoisomerasa (por ejemplo topoisomerasa I o II). Los inhibidores de topoisomerasa incluyen, pero no se limitan a clorhidrato de doxorrubicina, citrato de daunorrubicina , clorhidrato de mitoxantrona, actinomicina D, etopósido, clorhidrato de topotecano, tenipósido (VM-26) e irinotecano. En algunas modalidades, el segundo agente anticancerigeno es irinotecano. En algunas modalidades, el tumor que va a ser tratado es un tumor colorrectal y el segundo agente anticancerigeno es un inhibidor de topoisomerasa tal como irinotecano.

En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un antimetabolito . Un antimetabolito es una sustancia química con una estructura que es similar a un metabolito necesario para reacciones bioquímicas normales, aunque suficientemente diferente para interferir con una o más funciones normales de las células tal como división celular. Los antimetabolitos incluyen pero no se limitan a gemcitabina, fluorouracilo, capecitabina, metotrexato de sodio, ralitrexed, pemetrexed, tegafur, arabinósido de citosina, TIOGUANINA (GlaxoSmithKline ) , 5-azacitidina, 6-mercaptopurina , azatioprina, 6-tioguanina, pentostatina, fosfato de fludarabina y cladribina así como sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de estos. En algunas modalidades, el segundo agente anticancerígeno es gemcitabina. En algunas modalidades, el tumor que va a ser tratado es un tumor pancreático y el segundo agente anticancerígeno es un antimetabolito (por ejemplo gemcitabina) .

En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un agente antimitótico que incluye pero que no se limita a agentes que unen tubulina. A modo de ejemplo no limitante, el agente comprende un taxano. En algunas modalidades, el agente comprende paclitaxel o docetaxel o una sal, ácido o derivado farmacéuticamente aceptable de paclitaxel o docetaxel. En algunas modalidades, el agente es paclitaxel (TAXOL) , docetaxen (TAXOTERE) , paclitaxel unido a albúmina (por ejemplo ABRAXANE) , DHA-paclitaxel o PG-paclitaxel . En algunas modalidades alternativas el agente antimitótico comprende un alcaloide de vinca tal como vincrístina, vinblastina, vinorelbina o vindesina o sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. En algunas modalidades, el agente antimitótico es un inhibidor de cinesina Eg5 o un inhibidor de una cinasa mitótica tal como Aurora A o Plkl. En algunas modalidades, en donde el agente quimioterapéutico administrado en combinación con un agente que une FZD o un polipéptido o anticuerpo comprende un agente antimitótico, el cáncer o tumor que es tratado es cáncer de mama o un tumor de mama .

En algunas modalidades, el tratamiento involucra la administración combinada de un anticuerpo (u otro agente) de la presente invención y radioterapia. El tratamiento con el anticuerpo (o agente) puede producirse antes, de manera concurrente o subsecuente a la administración de radioterapia. Se puede utilizar cualquier protocolo de dosificación para radioterapia, según lo determine el experto en el ámbito.

En algunas modalidades, el segundo agente anticancerigeno comprende un anticuerpo. De esta manera, el tratamiento puede involucrar la administración combinada de anticuerpos (u otros agentes) de la presente invención con otros anticuerpos contra antigenos adicionales asociados a tumor que incluyen pero que no se limitan a anticuerpos que se unen a EGFR, ErbB2, HER2, DLL4, Notch y/o VEGF. De manera ejemplar, los anticuerpos antiDLL4 se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de E.U.A. número US 2008/0187532, incorporado como referencia en la presente en su totalidad. En algunas modalidades, el segundo agente anticancerígeno es un anticuerpo que es un inhibidor de angiogénesis (por ejemplo un anticuerpo antiVEGF) . Los anticuerpos antiDLL4 adicionales se describen, por ejemplo, en las publicaciones de patentes internacionales números WO 2008/091222 y WO 2008/0793326 así como en la publicación de solicitud de patente de E.Ü.A. números US 2008/0014196; US 2008/0175847; US 2008/0181899 y US 2008/0107648, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Los ejemplos de anticuerpos antiNotch (muesca) se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de E.U.A. número US 2008/0131434, incorporado como referencia en la presente en su totalidad. En algunas modalidades, el segundo agente anticancerígeno es un anticuerpo que es un inhibidor de angiogénesis (por ejemplo un anticuerpo antiVEGF) . En algunas modalidades, el segundo agente anticancerígeno es un inhibidor de señalización Notch. En algunas modalidades, el segundo agente anticancerígeno es AVASTINA (Bevacizumab) , herceptina (Trastuzumab) , VECTIBIX ( Panitumumab) o Erbitux (Cetuximab) . La administración combinada puede incluir la co-administración, ya sea en una formulación farmacéutica única o utilizando formulaciones separadas, o la administración consecutiva en cualquier orden, pero generalmente dentro de un período de tiempo de manera que todos los agentes activos pueden ejercer sus actividades biológicas simultáneamente.

Además, el tratamiento puede incluir la administración de una o más citocinas (por ejemplo linfocinas, interleucinas, factores de necrosis tumoral y/o factores de crecimiento) o puede ser acompañado por extirpación quirúrgica de células cancerosas o cualquier otro tratamiento que se considere necesario por el médico que trata .

Para el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo o agente de la presente invención depende del tipo de enfermedad que va a ser tratada, la gravedad y curso de la enfermedad, la capacidad de respuesta de la enfermedad, si el anticuerpo o agente se administra para propósitos terapéuticos o preventivos, tratamiento previo, antecedentes clínicos del paciente, etc., todo a criterio del médico que trate. El anticuerpo o agente se puede administrar una vez o durante una serie de tratamientos que duren desde varios días hasta varios meses, o hasta que se produzca una cura o se obtenga una disminución del estado de enfermedad (por ejemplo reducción en el tamaño del tumor) . Los protocolos de dosificación óptimos se pueden calcular a partir de mediciones de acumulación de medicamento en el cuerpo de un paciente y variarán en base en la potencia relativa del anticuerpo o agente individual. El médico que administre puede determinar . fácilmente las dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. En algunas modalidades, la dosificación es de 0.01 µ? a 100 mg por kg de peso corporal y se puede proporcionar una vez o más de manera diaria, semanal, mensual o anual. En algunas modalidades, el anticuerpo u otro agente que una FZD se suministra una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. En algunas modalidades, la dosificación del anticuerpo u otro agente que una FZD es desde aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal. El médico que trata puede calcular las tasas de repetición para dosificación en base en tiempos de residencia medidos y concentraciones del medicamento en fluidos corporales o en tej idos .

V. Firma del gen Wnt y usos del mismo La presente invención proporciona adicionalmente una firma de gen Wnt, una firma de gen indicativo de actividad de señalización Wnt en tumores, lo cual se puede utilizar en la selección de tumores, pacientes y/o terapia.

La firma del gen Wnt comprende la expresión diferencial de un conjunto de genes en tumores en los cuales se activa la señalización Wnt (y/o la cual depende de la señalización Wnt) en relación a los tumores en los cuales no se activa la señalización Wnt. En algunas modalidades, la señalización Wnt es señalización Wnt canónica. La firma del gen Wnt es útil para la identificación de tumores y/o pacientes que probablemente respondan al tratamiento con un inhibidor de señalización Wnt (por ejemplo, un agente que una FZD que es un antagonista de por lo menos un receptor encrespado humano y/o un inhibidor de señalización Wnt) .

En algunas modalidades, la firma del gen Wnt comprende uno o más genes (es decir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19 genes), incluidos en la tabla 3 a continuación. Los números "ID de conjunto de sonda" son los números de ID de conjunto de sonda para el arreglo GeneChipMR Human Genome U133 Plus 2.0 ("HG_U133_Plus_2"; Affymetrix, Santa Clara, CA) . En tumores en los cuales la señalización Wnt está activa (es decir, tumores los cuales son positivos para una firma de gen Wnt) , uno o varios de los niveles de expresión de uno o varios de los genes en la tabla 3 que comprenden la firma del gen Wnt están elevadas en relación a los tumores en los cuales no está activa la señalización Wnt. En algunas modalidades, la firma del gen Wnt comprende dos o más genes que se incluyen en la tabla 3 siguiente. En algunas modalidades, la firma del gen Wnt comprende tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más, quince o más, dieciséis o más, diecisiete o más, dieciocho o más o diecinueve de los genes incluidos en la tabla 3 siguiente. En algunas modalidades, el tumor se determina para niveles de expresión de uno o más genes en la tabla 3 es un tumor colorrectal. En algunas modalidades, la firma del gen Wnt comprende AXIN2 y/o F0XQ1. En algunas modalidades, el tumor es un tumor colorrectal y la firma del gen WNT comprende AXIN2, LGR5 y/o F0XQ1.

Tabla 3. Genes de firma de gen Wnt ejemplares Los métodos de uso de la firma del gen Wnt para seleccionar pacientes (o para identificar un paciente) adecuado para tratamiento con un inhibidor de la via Wnt o para determinar la eficacia de un tratamiento particular también se proporcionan. En algunas modalidades, el inhibidor de señalización Wnt es un agente que una FZD, tal como un anticuerpo FZD antagonista. Por ejemplo, se puede identificar a un paciente como adecuado para tratamiento con un agente que une FZD (o agentes que unen FZD) al determinar si un tumor en el paciente o que ha sido extraído del paciente presenta una firma de gen Wnt. En algunas modalidades, la detección de la firma del gen Wnt comprende determinar el nivel de expresión de uno o más genes en la tabla 3 en el tumor. Si los niveles de expresión de uno o más genes en la tabla 3 que comprenden la firma del gen Wnt está elevada en el tumor (y por lo tanto indicando que la señalización Wnt es activa en el tumor) , el paciente se identifica como adecuado para tratamiento con un agente que une FZD, tal como anticuerpo antiFZD que inhibe la señalización Wnt. Los métodos de uso de la firma del gen Wnt para seleccionar un tratamiento adecuado para un paciente particular de igual manera se proporciona.

La invención proporciona un método para tratar cáncer en un paciente que tiene un tumor o de quien se ha extraído un tumor, que comprende: (a) proporcionar el nivel de expresión de uno o más genes en la tabla 3 en el tumor; (b) seleccionar al paciente para que comience o continúe el tratamiento con un agente que una FZD en base en el nivel de expresión de uno o más genes, y (c) administrar al agente que se une a FZD al paciente. En algunas modalidades, el método comprende medir el nivel de expresión de uno o más genes en el tumor. En algunas modalidades, el nivel de expresión de uno o más genes se compara con un nivel control o de referencia .

También se proporcionan métodos para identificar un tumor el cual puede responder al tratamiento con un inhibidor de señalización de Wnt. En algunas modalidades, el inhibidor de señalización de Wnt es un agente que se une a FZD. En algunas modalidades, el método comprende probar el tumor para una firma de gen Wnt. En algunas modalidades, los métodos comprenden determinar el nivel de expresión de uno o más genes en la tabla 3 en el tumor.

También se proporcionan métodos de cribado de medicamentos candidatos contra tumores identificados que presentan la firma del gen Wnt. En algunas modalidades, los candidatos de medicamentos son inhibidores de señalización de Wnt. Tales candidatos de medicamentos preferiblemente se prueban para determinar su eficacia sobre aquellos tumores en los cuales la señalización Wnt es activa y/o los cuales dependen de la señalización de Wnt. La presente invención también proporciona un método de cribado de un candidato de medicamento que comprende determinar el nivel de expresión de uno o más genes en la tabla 3 en un tumor; (b) seleccionar el tumor para probar con el medicamento candidato en base (por lo menos en parte) sobre el nivel de expresión de uno o más genes, y (c) probar el efecto del medicamento candidato en el tumor .

Además, en algunas modalidades, se puede determinar el efecto de un medicamento sobre la firma del gen Wnt y se puede utilizar para determinar la eficacia de un tratamiento de un tumor en el cual este activa la señalización Wnt. En algunas modalidades, esto proporciona un método de monitoreo de tratamiento de un paciente. En algunas modalidades alternativas esto proporciona un método para determinar la eficacia de un candidato de medicamento. En algunas modalidades, una disminución en los niveles de expresión de uno o más genes en la tabla 3 (es decir, una reducción o una eliminación de la firma del gen Wnt) indica eficacia del tratamiento.

En algunas modalidades, la determinación del nivel de uno o más genes en una firma de gen Wnt comprende determinar los niveles de expresión de polinucleótidos de uno o más genes. En algunas modalidades, la detección de una firma de gen Wnt comprende detectar la expresión de ARNm de polinucleótidos de uno o más ganes que comprenden la firma.

En algunas modalidades, la detección de expresión de ARNm es por medio de transferencia Northern. En algunas modalidades, la detección de expresión de ARNm es por medio de RT-PCR, PCR en tiempo real o PCR cuantitativa utilizando conjuntos de cebadores que amplifican específicamente los polinucleótidos que comprenden la firma de citoblastos cancerosos. En algunas modalidades, la detección de ARNm comprende exponer una muestra a sondas de ácido nucleico complementarias a polinucleótidos que comprenden una firma de gen de citoblasto canceroso. En algunas modalidades, el ARNm de la muestra se convierte a ADNc antes de la detección. En algunas modalidades, la detección de ARNm es vía microarreglos que comprenden polinucleótidos que hibridizan a uno o más genes en la firma del gen Wnt.

En algunas modalidades, la determinación del nivel de uno o más genes en una firma de gen Wnt comprende detectar polipéptidos codificados por uno o más genes. En algunas modalidades, la determinación de los niveles de los productos de expresión polipeptídicos de uno o más genes comprende exponer una muestra de anticuerpos específicos a los polipéptidos y detectar la unión de los anticuerpos a los polipéptidos, por ejemplo, mediante inmunofluorescencia cuantitativa o ELISA. Otros métodos de detección se conocen por aquellos habitualmente expertos en el ámbito, véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 6,057,105.

También se proporciona un arreglo que comprende polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones rigurosas con uno o más genes en la tabla 3. También se proporciona un kit que comprende al arreglo.

También se proporcionan kits que comprenden anticuerpos que unen el producto de expresión de uno o más genes en la tabla 3.

VI . Kits que comprenden agentes que se unen a FZD .

La presente invención proporciona kits que comprenden los anticuerpos u otros agentes descritos en la presente y que se pueden utilizar para realizar los métodos descritos en la presente. En algunas modalidades, un kit comprende por lo menos un anticuerpo purificado contra uno o más receptores encrespados humanos en uno o más recipientes. En algunas modalidades, los kits contienen la totalidad de los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un análisis de detección que incluye todos los controles, instrucciones para realizar análisis y cualquier programa para análisis necesario y presentación de resultados. Una persona experta en el ámbito reconocerá fácilmente que los anticuerpos o agentes descritos de la presente invención se pueden incorporar fácilmente en uno de los formatos de kit establecido los cuales son bien conocidos en el ámbito.

Se proporcionan adicionalmente kits que comprenden un agente que una FZD (por ejemplo un anticuerpo que se une a FZD) así como un segundo agente anticanceroso. En algunas modalidades, el segundo agente anticanceroso es un agente quimioterapéutico (por ejemplo, gemcitabina o irinotecano) . En algunas modalidades, el segundo agente anticanceroso es un inhibidor de angiogénesis . En algunas modalidades el segundo agente anticanceroso es un inhibidor de la señalización Notch (por ejemplo, un anticuerpo antiDLL4 o antiNotch) .

También se proporcionan kits que comprenden un agente que se une a FZD y un reactivo o reactivos para determinar la expresión de uno o más genes en la tabla 3 anterior ("genes de firma de gen Wnt ejemplares").

Las modalidades de la presente descripción se pueden definir adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes los cuales describen con detalle la preparación de ciertos anticuerpos de la presente descripción y métodos para usar los anticuerpos de la presente descripción. Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que muchas modificaciones tanto en los materiales como en los métodos se pueden realizar sin por esto apartarse del alcance de la presente descripción.

EJEMPLOS Se entiende que los ejemplos y modalidades que se describen en la presente son únicamente con propósitos ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios tomando en consideración los anteriores se sugerirán para las personas expertas en el ámbito y se incluyen dentro del espíritu y alcance de esta solicitud.

Ejemplo 1 Identificación/generación de anticuerpos anti-FZD Los anticuerpos humanos que reconocen específicamente uno o más receptores encrespados (frizzled) humanos se pueden aislar utilizando presentación de fago. Por ejemplo, una biblioteca de anticuerpos sintéticos que contiene dominios variables de anticuerpo humano se pueden analizar sistemáticamente (panear) para reconocimiento de afinidad específica y alta afinidad de un dominio extracelular del receptor FZD7 humano. Una vez que se haya identificado un Fab específico con las características deseadas, las regiones variables humanas del Fzb se clonan después en un vector de expresión Ig que contiene la cadena pesada y la cadena ligera de IgG2 humana ( o ?) para expresión de anticuerpos humanos en células CHO.

Se utiliza la presentación de fago para identificar un Fab específico, 18R8, que se une al dominio extracelular de FZD7. Se incuban 2 x 1013 partículas de fago presentadoras de Fab a partir de una biblioteca de fago Fab humana con proteína Fe ECD FZD7 recombinante inmovilizada de manera pasiva. El fago que no es específico se elimina por lavado y después el fago específico se eluye con DTT. La salida que se ha eluido se utiliza para infectar bacterias F+ TG1, rescatadas con fago auxiliar. Después se induce la presentación de Fab con IPTG (0.25 mM) . La salida de esta ronda rescatada sirve como el punto de inicio para rondas de selección adicionales. Las selecciones continúan a la ronda 3 y después el resultado se criba en ELISA para los Fab específicos para la proteína Fe ECD FZD7 recombinante . Se identifica un Fab que se une específicamente a FZD7 humano.

Se obtienen las secuencias de las regiones variables de los Fab identificados. Se retira un sitio de glucosilación unido a N de una secuencia original a través de mutagénesis dirigida a sitio. El sitio de glucosilación unido a N, Asn, en la CDR1 de cadena pesada se cambia a His. Esta mutación se realiza para evitar la glucosilación durante la expresión en sistemas de mamífero. El Fab resultante se denomina 18R8. Las secuencias de CDR de cadena pesada y de cadena ligera de 18R8 se muestran a continuación en la tabla 4 siguiente. Las secuencias VH y VL de 18R8 se proporcionan en la SEC ID NO: 10 y la SEC ID NO: 12, respectivamente.

Tabla 4. CDR de anticuerpos humanos 18R8 y 18R5 *Cambio dirigido a sitio para eliminar sitio de glucosilación unido A está subrayado.

Se genera Fab antiFZD 18R5 por asociación de las cadenas VH-CH1 de FAb 18R8 con una diversidad de cadenas VL-CL a partir de la biblioteca de fago Fab original a partir de la cual se identifica 18R8. Se aisla 18R5 de la biblioteca después de tres rondas de análisis sistemático (paneo) con proteína Fe de ECD de FZD7 recombinante inmovilizada. Las secuencias de las CDR de 18R5 se muestran en la tabla 4 anterior. La VL del anticuerpo 18R5 tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID NO: 14. Las CDR de cadena pesada y la VH del anticuerpo 18R5 son idénticas a las del anticuerpo 18R8.

Las regiones variables humanas de las Fab 18R8 y 18R5 se clonan en el vector de expresión Ig que contiene la cadena pesada y la cadena ligera IgG2 humana (?) para expresión en células CHO. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo IgG 18R8 (que incluye secuencias de señal) se proporcionan en la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 13, respectivamente. La secuencia de señal en la parte N terminal de la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas se separa por secreción. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo IgG 18R8 se proporcionan en la SEC ID NO: 18 y la SEC ID NO: 20, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo IgG 18R5 se proporcionan en la SEC ID NO: 11 y la SEC ID NO: 15, respectivamente (nuevamente, la secuencia de señal en la parte N terminal de la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas se separa por secreción) . Las secuencias de ácido nucleico que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo IgG 18R5 se proporcionan en la SEC ID NO: 18 y la SEC ID NO: 22, respectivamente. Se utiliza la purificación en proteina A para purificar los anticuerpos.

Se determinan las KD de los anticuerpos 18R8 y 18R5 utilizando el sistema Biacore 2000 de Biacore Lifescience (GE Healthcare) . Específicamente, los anticuerpos antiFZD7 purificados se diluyen de manera seriada en incrementos dobles de 100 a 0.78 nM en HBS-P (HEPES 0.01 M, pH 7.4, NaCl 0.15M, tensioactivo P20 0.005% v/v) . Cada dilución se prueba contra proteínas Fe de FZD recombinantes inmovilizadas en un chip CM5 Biacore. Se miden las velocidades de asociación y de disociación y se determinan los valores KD utilizando el programa de software de bioevaluación (tabla 5, a continuación) .

Tabla 5. Afinidad de los anticuerpos IgG 18R8 y 18R5 18R8 18R5 FZD KD (nM) KD (nM) 1 15.6 4.6 2 6.2 3.3 5 4.2 1.9 7 5.2 1.8 8 29.3 5.8 También se preparó otro anticuerpo antiFZD 18R0512 Ejemplo 2 Análisis FACS de anticuerpos anti-FZD que demuestran la unión de los FZD humanos a superficie celular múltiple Se utiliza análisis de citometria de flujo para determinar la capacidad de los anticuerpos para unirse a proteínas FZD que se expresan en la superficie celular.

Para fomentar una expresión de superficie celular robusta de las proteínas FZD seleccionadas, se generan plásmidos de expresión de mamífero que comprenden un promotor C V corriente arriba de polinucleótidos que codifican para FZD utilizando tecnología de ADN recombinante estándar (estas construcciones de denominan "FL sin FLAG"). Se generan plásmidos de expresión similares para cada uno de las diez proteínas encrespadas humanas. También se preparan versiones alternativas de los vectores de expresión FZD en los cuales los polinucleótidos que codifican para el epítopo de la secuencia FLAG de señal N terminal fusionada a la parte N terminal de la proteína FZD madura también se generan por tecnología recombinante estándar (tales construcciones se denominan "indicador FL"). Adicionalmente, los plásmidos de expresión se designan los cuales codifican para proteínas quiméricas comprendidas ya sea de el dominio CRD (también denominado como el dominio "fri") o el FZD o el dominio extracelular N terminal completo de la proteína FZD fusionado a un epítopo de secuencia FLAG de señal N terminal (denominado "indicador fri" y "indicador ECD", respectivamente) , asi como una sección en la parte C terminal que codifica para el dominio transmembranal y citoplásmico de una proteina CD4 humana.

Para medir la unión de anticuerpo a FZD por citometria de flujo se cotransfectaron células HEK 293 con vectores de expresión FZD y el marcador de transfección GFP. A las 24 a 48 horas posteriores a la transfección se recolectaron las células en suspensión y se incubaron en hielo con anticuerpos antiFZD (10 µg/ml, a menos que se indique en otro sentido) o IgG control para detectar unión de anticuerpo de fondo. Las células se lavaron y los anticuerpos primarios detectados con anticuerpos secundarios específicos de dominio Fe conjugados a un cromóforo fluorescente (por ejemplo antilgG humana conjugada a ficoeritrina) . Las células marcadas después se analizan por citometria de flujo para identificar anticuerpos antiFZD que reconocen específicamente la expresión de superficie celular de proteína FZD. Los anticuerpos monoclonales 18R5 y 18R8 reconocen FZD en células transíectadas . Como se muestra en la figura 1 y en la figura 2, tanto 18R8 como 18R5 se unen a FZD múltiple que incluye FZD1, FZD2 , FZD5 , FZD6, y FZD8. Para examinar la capacidad relativa de 18R8 y 18R5 para unirse cada proteína FZD, se llevaron a cabo análisis de titulación en donde se varió la cantidad de anticuerpo en la reacción de unión (figura 2) .

Este análisis demostró que 18R5 muestra una mayor potencia de unión a cada uno de los receptores FZD (FZD1, FZD2, FZD5 , FZD7 y FZD8) en comparación con 18R8.

Ejemplo 3 Inhibición de señalización Wnt por 18R8 y 18R5 La capacidad de los anticuerpos IgG antiFZD de 18R8 y 18R5 para bloquear la activación de la vía de señalización Wnt se determinó in vitro utilizando análisis indicadores de luciferasa .

Se cultivaron células STF293 en DMEM suplementado con antibióticos y FCS 10%. Las células STF293 son células 293 en las cuales se ha integrado de manera estable lo siguiente: (1) un vector indicador Luc 8xTCF que contiene siete copias del sitio de unión TCF unidas a un promotor hacia el dirección 5' de un gen indicador de luciferasa de luciérnaga para medir niveles de señalización Wnt canónica (Gazit er al., 1999, Oncogene 18:5959-66) y (2) un indicador de luciferasa Renilla (Promega; Madison, WI) como un control interno para eficiencia de transíección . Las células se agregaron a placas de cultivo. Se agregaron los anticuerpos FZD que se van a probar (o sin anticuerpos) . Las células después se incubaron en presencia o ausencia de medio acondicionado Wnt3A que se ha preparado a partir de células L que expresan de manera estable Wnt3a (ATCC CRL-2647) o medio acondicionado control a partir de células L que no sobreexpresan nt3A (linea de células ATCC, CRL-2648) . Después de incubación durante la noche se midieron los niveles de luciferasa utilizando un kit de análisis de luciferasa doble (Promega; Madison, WI) con actividad de luciferasa de luciérnaga normalizada a actividad de luciferasa Renilla.

De esta manera se determinó la capacidad de los anticuerpos 18R8 y 18R5 para inhibir la activación de la vía inducida por Wnt . Se trataron células STF 293 con concentraciones diferentes de anticuerpos IgG 18R8 o 18R5 y se agregó medio acondicionado con Wnt3A. Las células se analizaron 18 horas después utilizando el kit de análisis de luciferasa doble. En la figura 3 se muestran los resultados. Se observó una mayor inhibición de la señalización TCF de la vía nt3a con el anticuerpo antiFZD 18R5.

En experimentos adicionales se determinó la capacidad del anticuerpo 18R8 para antagonizar la señalización por diferentes ligandos Wnt. Se transíectaron células HEK 293 con Wntl, Wnt2, Wnt2b2, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt9b y WntlOb durante 48 horas mediante Fugene 6 (Roche). Se utilizó medio acondicionado Wnt3A ("WNT3ACM") como un control de activación positivo. Las células STF293 se cultivaron en DMEM suplementado con antibióticos y FCS 10% y se trataron con 20 pg/ml de anticuerpo 18R8 o sin anticuerpo. Después se agregaron las células HEK293 que sobreexpresan Wnt. Dieciocho horas después del tratamiento de midieron los niveles de luciferasa utilizando el kit de análisis de luciferasa doble. En la figura 4 se muestran los resultados. Se demostró que el anticuerpo antiFZD 18R8 inhibe la señalización de una diversidad de Wnt que incluyen la inhibición de Wntl, Wnt2, Wnt3r Wnt7A, Wnt7B y WntlOB, además de Wnt3A.

En experimentos similares, se determinó la capacidad del anticuerpo 18R5 para inhibir la señalización por diferentes ligandos Wnt. Los resultados se muestran en la Figura 67. El 18R5 se encontró por inhibir la señalización beta-catenina en respuesta a cada uno de los miembros de la familia Wnt que fue activo en el análisis reportero a base de célula .

Ejemplo 4 18R8 bloquea la unión de FZD a Wnt Para determinar la capacidad de 18R8 para bloquear la unión de FZD a Wnt, se agregaron al medio de cultivo 2 µ? de 1.32 µg/ml de FZD8-Fc soluble que contiene el dominio Fri (aminoácidos 1-157 de FZD8 enlazado en marco a Fe de IgGl humana) al medio de cultivo para unir Wnt3A (agregado como 20 µ? de medio acondicionado Wnt3A) ya sea solo o en presencia del anticuerpo IgG 18R8 (agregado como 4 µ? de 3.71 µg/ml). Las mezclas se incuban solas o en presencia de esferas de proteina A sepharose (GE Healthcare produets; 20 µ? de solución 50% en PBS) durante 2 h a 4°C. Después de la incubación las esferas de proteina A (y cualquier proteina que forme complejo con las esferas de proteina A) en cada muestra se separan por centrifugación y el sobrenadante se analiza para determinar la capacidad para inducir actividad de luciferasa 8xTCF. El sobrenadante se agrega a células STF293, el cual expresa de manera estable 8xTCF (ocho copias del dominio de unión a TCF hacia el dirección 5' de un gen indicador de luciferasa de luciérnaga) para medir los niveles de señalización Wnt canónicos y los cuales se cultivan en DMEM suplementado con antibióticos y FCS 10%. A las 18 horas después del tratamiento de las células CTF293 se midieron los niveles de luciferasa utilizando el kit de análisis de luciferasa doble (promega; Madison, I) .

Como se observa en la figura 5, Wnt3A más la proteina A inducen una fuerte activación del gen indicador como se mide por unidades de luciferasa (RLU) (figura 5, columna 1) . La adición de Fzd8-fc induce un complejo entre Wnt3A-Fzd8 y la proteina de fusión Fe con las esferas de proteina A sepharose y una vez que se separa por centrifugación el complejo proteina A-Wnt3A-Fzd8 , el sobrenadante resultante ya no es capaz de activar el gen indicador (figura 5, columna 2). Ante la adición de 18R8, este complejo probablemente se rompe por el bloqueo del anticuerpo sobre el dominio que interactúa con nt3A de Fzd8, debido a que, aunque el complejo de proteina-A-Fzd8-fc se separa junto con 18R8, el cual puede interactuar fácilmente con proteina A por medio de su propia porción Fe, la actividad indicadora se puede observar fácilmente, lo que sugiere niveles suficientes de Wnt3A que no forma complejos (figura 5, columna 3) . 18R8 también funciona sobre los Fzd endógenos presentes en las células STF293 debido a que la incapacidad para separar 18R8 por proteina A no muestra el retorno de la activación de Wnt3A (figura 5, columna 6) .

Los datos de la figura 5 muestran que la presencia del anticuerpo IgG 18R8 en la reacción de incubación resulta en retención de actividad Wnt3A dentro del sobrenadante en relación a la actividad observada con FZD8-Fc solo. Estos resultados indican que 18R8 bloquea la capacidad de FZD8 para unirse a nt3A e indican que la unión de anticuerpo al epítopo reconocido por 18R8 es capaz de bloquear las interacciones Wnt-FZD.

De manera similar, para determinar si 18R5 bloquea directamente la capacidad de Wnt para interactuar con Fzd, se condujeron estudios de unión adicionales. Los resultados se muestran en la Figura 68. Wnt3A, FZD5-Fc y 18R5 fueron coincubados como se indica, y después 18R5 y FZD5-Fc se eliminaron por la proteina A IP. El sobrenadante entonces se analizó para determinar actividad WNT en un análisis reportero de luciferasa 8XTCF. El 18R5 bloquea Wnt3A que se une a Fzd5-Fc, sugiriendo que un mecanismo por el cual 18R5 inhibe la señalización Wnt involucra la inhibición directa de la unión Wnt.

Ejemplo 5 Mapeo de epi opo de 18R8 y 18R5 Para identificar el epitopo FZD reconocido por el anticuerpo IgG 18R8 se realiza el mapeo de epitopo. El análisis de citometria de flujo de FZD expresado en la superficie celular se utiliza para medir la unión de anticuerpo. Los vectores plasmidicos de expresión de mamífero que comprenden un promotor C V corriente arriba de los polinucleótidos que codifican para una secuencia de señal N-terminal de la etiqueta de epitopo FLAG fusionada a la parte N terminal del dominio Fri de FZD8 a su vez se fusionan al dominio transmembranal y al dominio intracelular de la proteína CD4 se genera por tecnología recombinante estándar. Esta construcción de expresión permite la expresión del dominio Fri de FZD8 sobre la superficie de la célula, así como la expresión de una etiqueta de epitopo FLAG para la expresión de monitor. Después se utiliza la mutagénesis directa de sitio para modificar los aminoácidos seleccionados dentro del dominio extracelular de FZD. Las células HEK293 se cotransfectan con vectores de expresión que codifican para FZD y el marcador de transfección GFP. Cuarenta y ocho horas después de la transfección se recolectan células en suspensión y se incuban en hielo con anticuerpo antiFZD o IgG para detectar unión de anticuerpo de fondo. Las células se lavan y los anticuerpos primarios detectados con anticuerpos secundarios para antianticuerpo conjugado a un cromóforo fluorescente. Las células marcadas después se analizan por citometria de flujo para medir la unión de anticuerpo-FZD a FZD de superficie celular.

De esta manera, los aminoácidos específicos dentro del dominio extracelular FZD que son importantes para la unión de anticuerpos antiFZD se identifican. Cuando los residuos aminoácidos 82-83 de FZD8 se mutan de PD a SQ, la unión de FZD8 por 18R8 permanece principalmente sin alteración (figura 6) . De manera similar, cuando el aminoácido 109S se cambia a 109Q, no se observa un efecto apreciable en la unión. Por otra parte, cuando los residuos 70-71 de FZD8 se cambian de HQ a AE, la unión de FZD8 sobre células por 18R8 disminuye claramente (figura 6 y figura 7) . Cuando los aminoácidos 66-67 se mutan de GL a o cuando los aminoácidos 68-69 se mutan de EV a QL o cuando los aminoácidos 126-127 se mutan de FG a NV, la unión del anticuerpo 18R8 a FZD8 en las células de manera similar también se pierde. La pérdida de unión a FZD cuando ciertos aminoácidos han sido sustituidos con el dominio extracelular de FZD muestran sitios de reconocimiento específicos del anticuerpo. De esta manera, se determina que el anticuerpo 18R8 se une a un epitopo que comprende los aminoácidos 66-71 GLEVHQ (SEC ID NO: 25) de FZD8 y aminoácidos 124-128 GF a FZD8 humano. Esta región de epitopo está bien conservada a través de los receptores encrespados humanos a los cuales se une FZD8 (es decir FZD1, DZD2 , FZD5 , FZD7 y FZD8) y no están altamente conservados en aquellos receptores encrespados humanos a los cuales no se une FZD8 (es decir, FZD3, FZD4, FZD6, FZD9 o FZD10) .

Los experimentos FACS que comparan la unión de IgG 18R5 e IgG 18R8 con FZD8 natural y mutante sobre las células también se realizó. Estos experimentos demuestran que el anticuerpo 18R8 y el anticuerpo 18R5 se unen a un epitopo similar en FZD8 (figura 7).

Ejemplo 6 Identificación del Sitio de Unión Biológico (BBS de los receptores FZD) El descubrimiento de anticuerpos que inhiben la señalización Wnt y el descubrimiento del epitopo dentro de la proteina FZD unida por estos anticuerpos ahora ha permitido el análisis del cual las regiones de la estructura de proteina FZD son importantes para señalización Wnt. Para examinar esto, se examinó la estructura cristalina del dominio Fri de Fzd 8 de ratón. Identificamos el epitopo de unión de 18R8 y 18R5 que se encuentra dentro de una región de la estructura FZD para la cual un papel funcional específico no ha sido apreciado previamente. Además, el epítopo contenido a dos elementos de superficie separados de Fzd (el cual se denomina "borde superior" y "borde inferior") separados por una hendidura. También se ha descubierto que ante la comparación de diez receptores encrespados humanos, que existe una conservación sorprendente de la identidad de aminoácidos que revisten el fondo de esta hendidura. La región que comprende esta hendidura, asi como el "borde superior" y "borde inferior" a los cuales se une 18R8 y 18R5 se han designado como el sitio de unión biológica (BBS, por sus siglas en inglés) de FZD. En la figura 9 se muestran imágenes de la estructura de un dominio Fri de Fzd en base en análisis de la estructura cristalina reportada previamente de FZD8 de ratón (Dann CE et al., Nature 412 (6842) 86-90, 2001) y el análisis realizado utilizando el programa Pymol. En la imagen izquierda superior se muestra la vista de superficie del dominio Fri de FZD con la región de la proteina Fzd que comprende el sitio de unión biológica (BBS) indicado por un circulo blanco. Las regiones designadas como el "borde superior", "borde inferior" y la "hendidura" de BBS se resaltan cada uno en una coloración de superficie más oscura en imágenes separadas en el fondo del panel. La imagen derecha superior de la figura 9 resalta en una superficie más oscura los residuos que se conservan en 9 ó 10 de diez miembros de familia Fzd de humanos.

Ejemplo 7 Inhibición de crecimiento de tumor In vivo por 18R5 Prevención de crecimiento de tumor dependiente de Wnt por 18R5 Se inyectó a ratones NOD/SCID hembra a edad de 5-7 semanas con 50,000 células derivadas de virus de tumor mamario de ratón (MMTV, por sus siglas en inglés) -WNT1 en la almohadilla grasa mamaria derecha superior. Los ratones transgénicos (MMTV) -Wnt-1 muestran etapas definidas de tumorigénesis mamario que incluyen hiperplasia, carcinoma invasivo de los ductos y metástasis distante y por lo tanto este modelo de ratón de cáncer de mama proporciona una herramienta útil para analizar el papel de Wnt en la formación y crecimiento de tumores (Nusse y Varmus (1982) Cell 31:99-109). Los tumores de estos ratones se disociaron y estas células tumorales disociadas se utilizaron para propósitos de propagación de tumor. Los ratones con células tumorales implantadas en la almohadilla grasa mamaria se monitorearon dos veces a la semana. Una vez que los tumores eran palpables, se midieron los tumores dos veces cada semana y se determinó el volumen de tumor utilizando la fórmula ½(a x b2) ; en donde a = longitud y b = anchura. Los datos se expresan como media y media +_ S.E.M. (media de error estándar) . Las medias de los grupos se comparan utilizando la prueba t no pareada de dos colas de Student. Los valores de probabilidad (p) de <0.05 se interpretaron como significativamente diferentes. En el dia 19 los ratones con un volumen de tumor promedio de 44 mm3 se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos de 10 animales cada uno. A los animales se les inyectó ya sea con el anticuerpo control o con anticuerpo IgG 18R5 (10 mg/kg) . La administración de los anticuerpos se realizó vía inyección en la cavidad intraperitoneal, dos veces a la semana. El tratamiento con el anticuerpo 18R5 suprime completamente el crecimiento de tumor en comparación con tumores tratados con anticuerpo control (figura 10; p = 0.002) .

Reducción de tumor de xenoinjeto OMP-C28 por tratamiento combinado de 18R5 e irinotecano En otra modalidad se analizaron anticuerpos antiFZD para determinar su capacidad para reducir el crecimiento de xenoinjertos de tumor de colon O P-C28. Células O P-C28 humanas disociadas (10,000 por animal) se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID macho de 6-8 semanas de edad. Se monitoreó semanalmente el crecimiento de tumor y se iniciaron mediciones de tumor una vez que los tumores eran palpables. En el dia 24, los ratones con un volumen de tumor promedio de 129 mm3 se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos de 10 animales cada uno. A los animales se les inyectó ya sea con anticuerpo control o con anticuerpo IgG 18R5 (10 mg/kg) o irinotecano (7.5 mg/kg) o combinación tanto de 18R5 como de irinotecano. La administración de los anticuerpos e irinotecano se realizó por medio de inyección en la cavidad intraperitoneal, dos veces a la semana. Los tumores se midieron dos veces a la semana y se determinó el volumen de tumor utilizando la fórmula ½(a x b2) en donde a = longitud y b = anchura. Los datos se expresan como media y media + S.E. . (media de error estándar) . Las medias de los grupos se compararon con la prueba t no pareada de dos colas de Student. Los valores de probabilidad (p) de <0.05 se interpretaron como significativamente diferentes. El tratamiento con 18R5 resulta en una reducción en 40% en el crecimiento de tumor, como se muestra en la figura 11 (p = 0.02). Además, el tratamiento con 18R5 e irinotecano resulta en una reducción de 53% del crecimiento de tumor en relación al tratamiento con irinotecano solo (p = 0.0002 versus irinotecano solo) (figura 11). De esta manera, 18R5 demuestra actividad de crecimiento antitumoral en el modelo de tumor de colon OMP-C28 como un agente único asi como en combinación con irinotecano.

Reducción del crecimiento de tumor de xenoinj erto OMP-Pn4 por tratamiento combinado de 18R5 y gemcitabina En otra modalidad se analizaron anticuerpos antiFZD para determinar su capacidad para reducir el crecimiento de xenoinjertos de tumor pancreático OMP-Pn4. Se adquirieron ratones NOD/SCID de Harían ( Indianápolis , Indiana) y se permitió que se aclimaten durante varios días antes de los estudios. El establecimiento y caracterización de modelos de xenoinjerto de páncreas generado por citoblastos cancerosos in vivo se describe previamente (Li et al., Cáncer res., 67:1030-7, 2007). Para estudios de eficacia, las células tumorales pancreáticas humanas 0MP-Pn4 se disocian en suspensiones de células solas, lo que resulta en una mezcla 1:1 (v/v) de amortiguador FACS (solución salina balanceada de Hank [HBSS, por sus siglas en inglés] suplementada con suero bovino fetal inactivado por calor 2% y Hepes 20 m ) y Matrigel (BD Bioscience, San José, CA) e implementada subcutáneamente en la región del flanco derecho de ratones NOD/SCID de 6-7 semanas de edad con una aguja de calibre 25 que contiene 50,000 células/100 µ?. El crecimiento del tumor se monitorea semanalmente y las mediciones de tumor se inician una vez que los tumores son palpables. En el día 36, los volúmenes medios de tumor alcanzan aproximadamente 120 mm3 y los animales que presentan tumor se distribuyen aleatoriamente (4 grupos de 9 por grupo) . El tratamiento se inicia dos días después. A los animales se les inyecta con anticuerpo control con anticuerpo IgG 18R5 (10 mg/kg) con gemcitabina (40 mg/kg) o con una combinación de anticuerpo IgG 18R5 y gemcitabina. La administración de los anticuerpos y/o gemcitabina se realiza por medio de inyección en la cavidad intraperitoneal , una vez a la semana. Se mide el crecimiento de tumor con un calibrador electrónico (Coast Tools Company, San Leandro, CA) . Se miden los tumores una vez a la semana y se determina el volumen de tumor utilizando la fórmula ½(a x b2) ; en donde a = longitud (eje más largo del tumor) y b = anchura (eje más corto del tumor) . Los animales se pesan cada dia si muestran más de 15% de pérdida de peso corporal y se les mata si muestran 20% de peso corporal. Los datos se expresan como media + S.E.M. Las diferencia en la media de valores entre los grupos se analizan por prueba t no paramétrica. Las comparaciones múltiples utilizan la prueba ANOVA de una vía con comparación de prueba t posthoc. Las diferencias de p <0.05 se consideran significativamente diferentes. El programa para análisis estadístico es de GradhPad Prism4 (GradhPad Software Inc., San Diego, CA) . Al final del estudio se mata a los ratones utilizando una cámara de C02 seguido por dislocación cervical. Se recolectan los tumores para análisis de ARN e histológico. Los tumores remanentes se transfectan en medio 199 frío para procesamiento en suspensiones de células solas para análisis de frecuencia de citoblastos cancerosos.

Los resultados del estudio de xenoinjerto OMP-Pn4 se muestran en la figura 12. El tratamiento con el anticuerpo 18R5 como tratamiento único no resultan en una reducción significativa en el crecimiento de tumor en este experimento. No obstante, el tratamiento con 18R5 y gemcitabina resulta en una reducción en el crecimiento de tumor en 42% con respecto al tratamiento con gemcitabina (figura 12; p = <0.001 versus gemcitabina sola) . De esta manera, 18R5 demuestra una actividad de crecimiento antutumoral sinergistica en el modelo de tumor pancreático 0MP-Pn4 en combinación con gemcitabina y un agente quimioterapéutico aprobado para estándar de cuidado.

Reducción de crecimiento de tumor de mama PE-13 por tratamiento combinado con 18R5 y paclitaxel Se implantan 10,000 células de tumor de mama humano PE-13 (HER2-negativo) en ratones NOD-SCID y se permite que crezcan durante 22 días hasta que alcanzan un volumen promedio de aproximadamente 120 mm3. Los animales después se distribuyen aleatoriamente en 4 grupos de 10 animales cada uno y se les dosifica ya sea con un anticuerpo control, antiFZD 18R5, paclitaxel (TAXOLMR) o 18R5 más paclitaxel. La figura 37 muestra el promedio de los volúmenes de tumor de ratones dosificados con anticuerpo control, antiFZD 18R5, paclitaxel o 18R5 más paclitaxel. Los anticuerpos se dosifican a 10 mg/kg, IP, dos veces a la semana. Se dosifica paclitaxel a 10 mg/kg, IP, una vez a la semana. Los tumores se miden los días indicados en la figura 37. La figura 28 muestra el crecimiento de tumor de los animales individuales en el grupo 18R5 más paclitaxel. El tratamiento de 18R5 más paclitaxel se muestra que resulta en una actividad antitumoral y regresión de los tumores de mama establecidos.

Ejemplo 8 Análisis para determinar el efecto sobre la frecuencia de citoblastos cancerígenos Se puede utilizar los análisis de dilución limitante (LDA, por sus siglas en inglés) para determinar el efecto de un agente o anticuerpo que une FZD sobre citoblastos cancerígenos de tumor sólido sobre la tumorigencidad de un tumor que comprende los citoblastos cancerosos. Los análisis se pueden utilizar para determinar la frecuencia de citoblastos cancerosos en tumores de animales tratados con anticuerpo que une FZD u otro agente y comparar esa frecuencia con la frecuencia de citoblastos cancerosos en tumores de animales control.

Efecto del tratamiento combinado de 18R5 e irinotecano sobre citoblastos cancerosos en tumores 0MP-C28 Tumores control y tratados a partir de un estudio de xenoinjerto O P-C28 descrito en lo anterior (ejemplo 7) se cosecharon al final del estudio (día 48) . Los tumores se procesaron y se disociaron en células solas. Las células tumorales después se incubaron con anticuerpos de ratón biotinados (a-CD45 de ratón-biotina 1:200 de dilución y rata a-ratón H2Kd-biotina 1:100 de dilución, BioLegend, San Diego, CA) en hielo durante 30 min seguido por la adición de esferas magnéticas marcadas con estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para eliminar células de ratón con la ayuda de un imán.

Para la LDA, se cosecharon células humanas en la suspensión, se contaron y las dosis de células apropiadas (5, 25 y 125 células) en amortiguador FACS se mezclaron en una mezcla 1:1 con Matrigel y se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID (10 ratones por dosis de célula por grupo de tratamiento) . Se permitió que los tumores crecieran hasta por 4 meses. En el punto de tiempo deseado, se determinó el porcentaje de ratones con tumores detectables en todos los grupos inyectados con células tumorales tratadas con el anticuerpo antiFZD y se compararon con el porcentaje de ratones con tumores detectables en los controles. Por ejemplo, el número de ratones inyectados con células tumorales tratadas con control 125 que presentaron tumores detectables se determinaron y compararon con el número de ratones inyectados con células tumorales tratadas con anticuerpo FZD 125 que presentan tumores detectables. Después se calcula la frecuencia de citoblastos cancerosos utilizando el programa L-CalcTM (StemCell Technologies Inc.). Brevemente, en base en la estadística de Poisson, exactamente un citoblasto canceroso existe entre un número conocido de células inyectadas si 37% de los animales no desarrollan tumores .

Para análisis de marcadores de superficie celular, la suspensión celular de un solo tumor se tiñe con anticuerpos antiESA (Biomeda) y antiCD44 (BD Biosciences) los cuales se conjugan directamente a fluorocromos . Se excluyen las células muertas mediante la utilización del colorante de viabilidad DAPI . Se realiza citometria de flujo utilizando kit FACS Aria (Becton Dickinson) . La dispersión lateral y los perfiles de dispersión delantera se utilizan para eliminar grumos de células. El análisis de los tumores tratados con anticuerpo control mostraron que 64% de la población de tumor a granel expresa ESA y CD44 en niveles altos (figura 39) . La duplicación de población positiva no es afectada significativa por el tratamiento con irinotecano solo (55%), como se muestra en la figura 39, pero el tratamiento con 18R5 o la combinación de 18R5 con irinotecano reduce la duplicación de población positiva (40% y 32%, respectivamente) .

Efecto del tratamiento combinado de 18R5 y gemcitabina en citoblastos cancerosos en tumores OMP-Pn4 Se cosecharon tumores control y tratados de un estudio de xenoinjerto OMP-Pn4 descrito antes (ejemplo 7) al final de 41 días de tratamiento. Los tumores fueron procesados y disociados en células solas. Las células tumorales se incubaron después con anticuerpos de ratón biotinados (a-CD45 de ratón-biotina, dilución 1:200 y rata ot-ratón H2 d-biotina, dilución 1:100, BioLegend, San Diego, CA) en hielo durante 30 min seguido por la adición de esferas magnéticas marcadas con estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para eliminar células de ratón. Las células humanas remanentes en la suspensión se recolectaron, contaron y diluyeron a las dosis de célula apropiadas (30, 90, 270 y 810 células) se mezclaron en un mezcla de amortiguador FACS 1:1 (v/v) y Matrigel y se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID (10 ratones por dosis de células por grupo de tratamiento) . Se permitió que los tumores crecieran durante 75 días como se muestra en la figura 40. Cada punto en la figura 40 representa el volumen de tumor de un ratón individual. Se determinó el porcentaje de ratones con tumores detectables en todos los grupos inyectados con células tumorales tratadas con anticuerpo antiFZD y se compararon con el porcentaje de ratones con tumores detectables en los controles. Por ejemplo, el número de ratones inyectados con células tumorales tratadas con el control 810 que tienen tumores detectables se determinó y comparó con respecto al número de ratones inyectados con células tumorales tratadas con anticuerpo FZD 810 que tienen tumores detectables. Se utilizó la frecuencia de crecimiento de tumor para calcular la frecuencia de citoblastos cancerosos utilizando el programa L-CalcTM. Las frecuencias de citoblastos cancerosos calculadas para cada uno de los grupos de tratamiento se muestran en la figura 41. El tratamiento con 18R5 solo y el tratamiento con 18R5 combinado con gemcitabina reduce la frecuencia de citoblastos cancerosos, mientras que el tratamiento con gemcitabina sola no tiene efecto.

Ejemplo 9 Producción de anticuerpos FZD Producción de Antígeno Los fragmentos de polipéptido recombinantes del dominio extracelular (EDC, por sus siglas en inglés) o el dominio Fri (Fri) de receptores FZD humanos (FZD) se generan como antigenos para producción de anticuerpo. Se utiliza la tecnología de ADN recombinante estándar para aislar polinucleótidos que codifican para los aminoácidos de estos dominios del receptor o receptores encrespados humanos deseados. Estos polinucleótidos se ligan en marco en la parte N terminal ya sea a la etiqueta Fe humana o a la etiqueta histidina y se clonan en un vector de plásmido de transferencia para expresión mediada por baculovirus en células de insecto. La transfección estándar, la infección y los procedimientos de cultivo celular se utilizan para producir células de insecto recombinantes que expresan los polipéptidos FZD correspondientes (O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)).

La proteína antigénica se purifica de medio acondicionado de células de insectos utilizando proteína A y cromatografía de afinidad Ni++-quelato . La proteína de antígeno purificada se dializa contra PBS (pH = 7) , se concentra a aproximadamente 1 mg/ml y se esteriliza por filtración en preparación para inmunización.

Inmunización Se inmuniza a ratones con proteina de antigeno FZD purificada utilizando técnicas estándar. La sangre de ratones individuales se criba aproximadamente 70 dias después de la inmunización inicial para reconocimiento de antigeno utilizando análisis de ELISA y FACS (descrito detalladamente más adelante) . Los dos animales con los títulos de anticuerpo más alto se seleccionan para el refuerzo de antigeno final después de lo cual se aislan las células del bazo para producción de hibridoma. Las células de hibridoma se siembran en placa a 1 célula por pozo en placas de 96 pozos y el sobrenadante de cada pozo se criba para ELISA y análisis FACS contra proteina antigénica. Se seleccionan varios hibridomas con un titulo de anticuerpo alto y se aumentan en un cultivo de matraz estático. Se purifican los anticuerpos del sobrenadante de hibridoma utilizando cromatografía en agarosa con proteína A o con proteína G. Los anticuerpos monoclonales purificados se prueban nuevamente por FACS y se determina el isotipo para seleccionar los anticuerpos IgG e IgM.

Mapeo de Epítopo Para identificar anticuerpos que reconocen regiones específicas del dominio extracelular FZD que incluyen un dominio rico en cisteina se realiza el mapeo de epítopo. Los vectores plasmídicos de expresión de mamífero que comprenden un promotor CMV hacia el dirección 3' de los polinucleótidos que codifican para fragmentos del dominio FZD extracelular se generan utilizando tecnología de ADN recombinante estándar. Las proteínas recombinantes después se expresan en células de mamífero cultivadas por transfección transitoria. Veinticuatro a 48 horas después de la transfección se cosechan las células y la proteína de lisado celular se separa en geles de acrilamida de SDS-PAGE para transferencia Western utilizando anticuerpos de ratones inmunizados con antígeno FZD. Los anticuerpos que reconocen el dominio de unión de ligando de FZD se pueden analizar adicionalmente para unión competitiva con proteínas Wnt por ELISA.

Para identificar epítopos específicos dentro de los dominios extracelulares reconocidos por un anticuerpo contra FZD, se utiliza el sistema SPOT (sigma Genosys, The Woodlands, TX) . Una serie de 10 péptidos lineales de 10 residuos que se superponen por un aminoácido y que abarcan la totalidad del dominio extracelular FZD se sintetizan y se unen covalentemente a una membrana de celulosa por la técnica de síntesis SPOT. La membrana se preincuba durante 8 horas a temperatura ambiente con amortiguador de bloqueo y se hibridiza con anticuerpo durante la noche a 4°C. La membrana después se lava, se incuba con un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) , se vuelve a lavar y se visualiza con solución de revelado de señal que contiene 3-amino-9-etilcarbazol . Los epitopos específicos reconocidos por un anticuerpo de esta manera se determinan.

Análisis FACS Para seleccionar los anticuerpos monoclonales producidos por clones hibridoma que reconocen la proteína FZD en la superficie celular nativa se utiliza el análisis FACs. Se transfectan células HEK293 con un vector se expresión que codifica para un clon de ADNc de longitud completa del FZD correspondiente ya sea solo o cotransfectado con un vector que expresa GFP. Se puede introducir una etiqueta de epítopo Flag en la parte amino terminal, lo que permite la verificación de la expresión de los receptores FZD etiquetados sobre la superficie celular. Veinticuatro a 48 horas después de la transfeccion se recolectan las células en suspensión y se incuban en hielo con anticuerpos antiFZD, anticuerpos FLAG, suero inmune (para células que expresan FZD5) o IgG control para detectar unión de anticuerpo de fondo. Las células se lavan y los anticuerpos primarios detectados con anticuerpos secundarios antiratón conjugados a un cromóforo fluorescente. Las células marcadas después se clasifican por FACS para identificar anticuerpos antiFZD que reconocen específicamente la expresión en superficie celular del receptor FZD correspondiente. Se identifican anticuerpos que reconocen uno o varios de los receptores encrespados humanos deseados.

Anticuerpos Quiméricos Después de que se identifican los anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente un receptor FZD, se modifican estos anticuerpos para superar la respuesta inmunitaria de anticuerpo antiratón humano (HAMA, por sus siglas en inglés) cuando los anticuerpos de roedor se utilizan como agentes terapéuticos. Las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo monoclonal seleccionado se aisla por RT-PCR de células de hibridoma y se liga en marco a la cadena pesada de IgGl humana y las regiones constantes de cadena ligera ?, respectivamente, en vectores de expresión de mamífero. De manera alternativa, un vector de expresión Ig humano tal como TCAE 5.3 se utiliza, que contiene los genes para la región constante de cadena pesada de IgGl humana y cadena ligera ? en el mismo plásmido (Preston et al., 1998, Infection & Immunity 66: 4137-42). Los vectores de expresión que codifican para las cadenas pesada y ligera quiméricas después se cotransfectan en células de ovario de hámster chino (CHO) para la producción de anticuerpo quimérico. Se compara la inmunorreactividad y afinidad de anticuerpos quiméricos con los anticuerpos murinos originales mediante ELISA y FACS.

Anticuerpos Humanizados Dado que las sustancias terapéuticas de anticuerpos quiméricos con frecuencia aún son antigénicas, la producción de una respuesta inmunitaria de anticuerpo antiquimérico humano (HACA) , los anticuerpos quiméricos contra un receptor FZD pueden experimentar humanización adicional. Para generar anticuerpos humanizados, los aspectos clave de los motivos determinadores de especificidad del anticuerpo, que incluyen potencialmente elementos tanto de las tres secuencias hipervariables cortas, o las regiones determinadoras de complementariedad (las CDR) y/o las regiones de infraestructura requeridas para la colocación correcta de las regiones CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos descritos en lo anterior se manipulan utilizando tecnología de ADN recombinante en secuencias de ADN de línea germinal de los genes para anticuerpo de cadena pesada y ligera humanas, respectivamente, y después se clonan en un vector de expresión de mamífero para expresión en células CHO. La inmunorreactividad y afinidad de los anticuerpos humanizados se compara con anticuerpos quiméricos originales por prueba de ELISA y FACS. Adicionalmente , se pueden utilizar la mutagénesis dirigida a sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar especificidad, afinidad, etc. del anticuerpo humanizado.

Anticuerpos Humanos En algunas modalidades, los anticuerpo humanos que reconocen específicamente el dominio extracelular de un receptor FZD se aislan utilizando tecnología de presentación de fago. Se criba una biblioteca de anticuerpo de presentación de fago que contiene dominios variables de anticuerpo humano presentados como dominios Fv de cadena única o como dominios fab, para reconocimiento específico y de alta afinidad de un antígeno de receptores FZD descrito antes. Las secuencias de anticuerpo de dominio variable identificadas después se reformatean en un vector de expresión Ig que contiene la cadena pesada IgGl humana y la cadena ligera ? para expresión de anticuerpos humanos en células CHO.

Ejemplo 10 Producción de anticuerpos que reconocen epitopos específicos Anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas En algunas modalidades, los anticuerpos reconocen epítopos funcionales de receptores FZD se generan al inmunizar ratones con uno o más antígenos receptores de FZD. Los ratones se inmunizan con proteína antigénica de FZD purificada utilizando técnicas estándar. En algunas modalidades los ratones se inmunizan secuencialmente con distintos antígenos de receptor FZD. La sangre de ratones individuales se criba aproximadamente 70 días después de la inmunización inicial. Los animales con un titulo de anticuerpo elevado para el antigeno FZD se seleccionan para refuerzo de antigeno final después de lo cual se aislan del bazo para producción de hibridoma. Las células de hibridoma se siembran en placas a 1 célula por pozo en placas de 96 pozos y los sobrenadantes de cada pozo se criban por ELISA y análisis de citometria de flujo. Para identificar anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos específicos, que incluyen epítopos dentro o que se superponen con el sitio de unión biológico (BBS), el sobrenadante de hibridoma se criba tanto para unión de anticuerpo a los FZD deseados como por falla a unión a FZD que tienen sustituciones específicas de aminoácido dentro del epítopo específico deseado (por ejemplo, el BBS) .

Anticuerpos Humanos Se puede utilizar una biblioteca de presentación de fago para identificar anticuerpos que reconocen los epítopos deseados de los receptores FZD (por ejemplo epítopos comunes a FZD múltiples y/o epítopos dentro o que se superponen con el BBS o una porción del mismo) . Por ejemplo, el dominio Fri de un FZD de seleccionado se expresa como proteína recombinante y se recubre sobre una superficie apropiada a 10 µg/ml. Después una biblioteca de fago humana se analiza sistemáticamente (paneo) a través de dos o más rondas de enriquecimiento (véase, por ejemplo Griffiths et al., EMBO J. 12: 715-34) . De manera opcional, las sondas subsecuentes de análisis sistemático se pueden realizar utilizando proteínas FZD distintas.

Opcionalmente , cada ronda de análisis sistemático se puede realizar en presencia de proteína FZD soluble de señuelo que contiene sustituciones de aminoácidos específicas dentro de la región de epítopo objetivo deseada (por ejemplo que incluyen los epítopos dentro del sitio de unión biológico (BBS) ) . Los clones individuales del resultado de las selecciones de análisis sistemático después se criban para determinar la capacidad para unir una o varias de las proteínas FZD deseadas por ELISA o análisis de citometría de flujo y unión a un epítopo deseado se determina por carencia de unión a proteína FZD que contiene sustituciones específicas de aminoácidos dentro del epítopo objetivo deseado. Los genes que codifican para el dominio de unión a antígeno después se recuperan del fago y se utilizan para construir una molécula de anticuerpo humana completa por unión del dominio de unión a antígeno con regiones constantes para expresión en una línea de célula hospedadora adecuada. Los anticuerpos se identifican y se prueban para determinar la capacidad para evitar el crecimiento de células tumorales, como se describe en otra parte en este documento.

Ejemplo 11 Análisis in vitro adicionales para evaluar anticuerpos contra un receptor FZD Este ejemplo describe análisis representativos in vitro para probar la actividad de anticuerpos generados contra un receptor FZD sobre proliferación celular, activación de la vía y citotoxicidad .

Análisis de Proliferación La expresión de un receptor FZD por líneas celulares cancerosas diferentes se cuantifica utilizando análisis Taqman. Las líneas de células identificadas que expresan un receptor FZD se siembran en placa a una densidad de 104 células por pozo en microplacas de cultivo de tejido de 96 pozos y se permite que se diseminen durante 24 horas. Subsecuentemente las células se cultivan durante 12 horas adicionales en DMEM fresco con FCS 2%, punto en el cual se agregan al medio de cultivo anticuerpos antiFZD versus anticuerpos control en presencia de 10 µt???/? de BrdU. Después del marcado con BrdU, el medio de cultivo se retira y las células se fijan a temperatura ambiente durante 30 minutos en etanol y se hacen reaccionar durante 90 minutos con anticuerpo monoclonal antiBrdU conjugado con peroxidasa (fragmentos de Fab clon B G 6H8) . El sustrato se revela en una solución que contiene tetrametilbencidina y se detiene después de 15 minutos con 25 µ? de 1 mol/1 de H2S04. La reacción de color se mide con un lector de placa ELISA automático utilizando un filtro de 450 nm (lector de microplaca UV Microplate Reader; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) . Todos los experimentos se realizan por triplicado. Se determina la capacidad de los anticuerpos antiFZD para inhibir la proliferación celular en comparación con anticuerpos control.

Análisis de activación de vía En algunas modalidades se determina in vitro la capacidad de los anticuerpos contra un receptor de FZD para bloquear la activación de la vía de señalización Wnt. Por ejemplo, células HEK293 cultivadas en DMEM suplementado con antibióticos y FCS 10% se cotransfectan con 1) Wnt7B y vectores de expresión FZD10 para activar la vía de señalización Wnt; 2) TCF/Luc natural o vector indicador mutante que contiene tres a ocho copias del dominio de unión TCF hacia el extremo cinco prima de un gen indicador de luciferasa de luciérnaga para medir los niveles de señalización Wnt canónicos (Gazit et al., 1999, Oncogene 18: 5959-66); y 3) un indicador de luciferasa Renilla (Promega; Madison, WI) como un control interno para eficiencia de transacción. Los anticuerpos antiFZDlO y control después se agregan al medio de cultivo celular. Cuarenta y ocho después de la transfección los niveles de luciferasa se miden utilizando un kit de. análisis de luciferasa doble (Promega; Madison, WI) con actividad de luciferasa de luciérnaga normalizado a actividad de luciferasa Renilla. Se realizan por triplicado tres experimentos independientes. De esta manera se determina la capacidad de los anticuerpos FZD para inhibir la activación de la via Wnt .

Análisis de citotoxicidad dependiente de complemento En algunas modalidades las lineas de células cancerosas que expresan un receptor FZD citoblastos cancerosos aislados de una muestra de paciente se someten a pasaje como un xenoinjerto en ratones inmunodeteriorados y se utilizan para medir la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) mediada por un anticuerpo contra un receptor FZD. Las células se suspenden en 200 µ? de medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con antibióticos y FBS 5% a 106 células/ml. Las células suspendidas después se mezclan con 200 µ? de suero o suero inactivado por calor con anticuerpos contra un receptor FZD o anticuerpos control, por triplicado. Las mezclas celulares se incuban durante 1 a 4 horas a 37 °C en C02 5%. Las células tratadas después se recolectan, se resuspenden en 100 µ? de anexina V marcada con FITC diluida en medio de cultivo y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se agregan 100 µ? de una solución de yoduro de propidio (25 µg/ml) diluida en HBSS y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se recolectan, se resuspenden en medio de cultivo y se analizan por citometria de flujo. La citometria de flujo de células teñidas con FITC proporciona cuentas de células totales y la captación de yoduro de propidio por células muertas como un porcentaje de los números de células totales se utiliza para medir la muerte celular en presencia de suero y anticuerpos contra un FZD en comparación con suero inactivado con calor y anticuerpos control. De esta manera se determina la capacidad de los anticuerpos antiFZD para mediar citotoxicidad dependiente de complemento .

Análisis de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo Líneas de células cancerosas que expresan un receptor FZD o citoblastos cancerosos aislados de una muestra de un paciente que se somete a pasaje como un xenoinjerto en ratones inmunodeteriorados se pueden utilizar para medir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) mediada por un anticuerpo contra un receptor FZD. Las células se suspenden en 200 µ? de medio de cultivo RPMI 1640 libre de rojo de fenol, suplementado con antibióticos y FBS 5% a 106 células/ml. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) se aislan de sangre periférica heparinizada por centrifugación en un gradiente de densidad de Ficoll-Paque para uso como células efectoras. Las células objetivo (T) después se mezclan con células efectoras PB C (E) en relaciones E/T de 25:1, 10:1 y 5:1 en placas de 96 pozos en presencia de por lo menos un anticuerpo receptor FZD o un anticuerpo control. Los controles incluyen incubación de células objetivo solas y células efectoras solas en presencia de anticuerpo. Las mezclas de células se incuban durante 1 a 6 horas a 37°C en C02 5%. La lactato deshidrogenasa (LDH, por sus siglas en inglés) liberada, una enzima citosólica estable liberada por lisis celular se mide después por un análisis colorimétrico (análisis de citotoxicidad no radioactiva CytoTox96 Non-radiact ive Cytototoxicity Assay; Promega; Madison, I). Los datos de absorbancia a 490 nm se recolectan con un lector de placa de 96 pozos estándar y se corrige el fondo. Se calcula el porcentaje de citotoxicidad especifica de acuerdo con la fórmula: % de citotoxicidad = 100 x (liberación experimental de LDH -liberación espontánea de LDH efectora - liberación objetivo de LDH espontánea )/( liberación máxima objetivo de LDH - liberación espontánea objetivo de LDH) . De esta manera se determina la capacidad de los anticuerpos contra un receptor FZD para mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo.

Ejemplo 12 Prevención In vivo de crecimiento tumoral utilizando anticuerpos receptores anti-FZD Este ejemplo describe el uso de anticuerpos receptores antiFZD para evitar el crecimiento de tumores en un modelo de xenoinjerto. En algunas modalidades, las células tumorales de una muestra de paciente (biopsia de tumor sólido de efusión plural) que se han sometido a pasaje como un xenoinjerto en ratones se preparan para repasar los animales experimentales. Se retira el tejido tumoral bajo condiciones estériles, se cortan piezas pequeñas, se tritura completamente utilizando cuchillas estériles y se obtienen suspensiones de células solas por digestión enzimática y ruptura mecánica. Específicamente, células de efusión pleural de las piezas de tumor resultante se mezclan con colagenasa III ultrapura en medio de cultivo (200-250 unidades de colagenasa por mi) y se incuban a 37 °C durante 3-4 horas con pipeteo hacia arriba y hacia abajo a través de una pipeta de 10 mi cada 15-20 minutos. Las células digeridas se filtran a través de una malla de nylon de 45 µ?, se lavan con RPMI/FBS 20% y se lavan dos veces con HBSS. Las células tumorales disociadas después se inyectan subcutáneamente en almohadillas grasas mamarias de ratones NOD/SCID para inducir crecimiento de tumor.

En algunas modalidades, las células tumorales disociadas se clasifican primero en células tumorigénica o no tumorigénicas en base en los marcadores de superficie celular antes de su inyección en animales experimentales. Específicamente, las células tumorales disociadas como se describe en lo anterior se lavan dos veces con solución salina amortiguada Hepes (HBSS, por sus siglas en inglés) que contiene suero bovino inactivado por calor (HICS, por sus siglas en inglés) 2% y se resuspenden a 106 células por 100 µ? . Los anticuerpos se agregan y las células se incuban durante 20 minutos en hielo seguido por dos lavados con HBSS/HICS 2%. Los anticuerpos incluyen antiESA (Biomeda, Foster City, CA) , antiCD44, antiCD24, y marcadores de línea antiCD2, -CD3, -CD10, -CD16, -CD18, -CD31, y -CD140b (denominados colectivamente como Lin; PharMingen, San José, CA) . Los anticuerpos se conjugan directamente a fluorocromos para seleccionar de manera positiva o negativa células que expresan estos marcadores. Las células de ratón se eliminan al seleccionar contra células H2Kd+ y las células muertas se eliminan mediante la utilización del colorante de viabilidad 1AAD. Se realiza citometría de flujo en un kit FACSvantage (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . La dispersión lateral y los perfiles de dispersión delantera se utilizan para eliminar los grumos de células. Las células tumorigénicas aisladas ESA+, CD44+, CD24-/bajas, Lin- después se inyectan subcutáneamente en ratones NOD/SCID para inducir crecimiento tumoral .

A modo de ejemplo, se analizan anticuerpos antiFZD para determinar su capacidad para reducir el crecimiento de células tumorales. Se inyectan subcutáneamente células tumorales disociadas (10,000 por animal) en la región de flanco de ratones NOD/SCID de 6-8 semanas de edad. Dos días después de la inyección de células tumorales se inyecta a los animales por vía intraperitoneal (i.p.) con 10 mg/kg de ya sea anticuerpos antiFZD, dos veces a la semana. El crecimiento tumoral se monitorea semanalmente hasta que se detecta el crecimiento, punto después del cual el crecimiento de tumor se mide dos veces semanalmente por un total de 8 semanas. Los anticuerpos que unen FZD, los cuales reducen de manera significativa el crecimiento de tumor en comparación con controles inyectados con PBS se identifican de esta manera .

Ejemplo 13 Tratamiento in vivo de tumores utilizando anticuerpos receptor anti-FZD Este ejemplo describe el uso de anticuerpos receptores antiFZD para tratar cáncer en un modelo de xenoinjerto. En algunas modalidades, las células tumorales de una muestra de paciente (biopsia de tumor sólido o efusión pleural) que se ha sometido a pasaje como un xenoinjerto en ratones se preparan para volverlos a pasar a animales experimentales. El tejido tumoral se extrae, se corta en piezas pequeñas, se tritura completamente utilizando cuchillas estériles y se obtiene una suspensión de células solas por digestión enzimática y ruptura mecánica. Las células tumorales disociadas después se inyectan subcutáneamente ya sea en almohadillas grasas mamarias, para tumores de mama o en el flanco, para tumores que no son de mama, de ratones NOD/SCID para inducir crecimiento tumoral. De manera alternativa, se aislan células tumorales tumorigénicas ESA+ . CD44+, CD24-/bajo, Lin- como se describe en lo anterior y se inyectan.

Después de la inyección de células tumorales se monitorea a los animales para determinar crecimiento de tumor. Una vez que los tumores alcanzan el tamaño promedio de aproximadamente 150 a 200 mm, comienza el tratamiento de anticuerpo. Cada animal recibe 100 µg de anticuerpo receptores FZD o anticuerpos control i.p. dos a cinco veces a la semana por un total de 6 semanas. Se determina el tamaño del tumor dos veces a la semana durante estas 6 semanas. De este modo se determina la capacidad de los anticuerpos de receptor FZD para evitar crecimiento de tumor adicional o para reducir el tamaño de tumor en comparación con anticuerpos control.

En el punto final de tratamiento de anticuerpo, los tumores se cosechan para análisis adicional. En algunas modalidades una porción del tumor se analiza por inmunofluorescencia para determinar la penetración de anticuerpo en el tumor y la respuesta del tumor. Una porción de cada tumor cosechado de receptor antiFZD tratado y ratones tratados con anticuerpo control se congela fresco en nitrógeno liquido, se incrusta en O.C.T. y se corta en un criostato en secciones de 10 µ?? sobre portaobjetos de vidrio. En algunas modalidades, una porción de cada tumor se fija en formalina, se incrusta en parafina y se corta en un microtomo como una sección de 10 µp\ sobre portaobjetos de vidrio. Las secciones se fijan posteriormente y se incuban con anticuerpos marcados con cromóforo que reconocen específicamente anticuerpos inyectados para detectar receptor antiFZD o anticuerpos control presentes en la biopsia de tumor. Además, los anticuerpos que detectan tumor diferente y tipos de células reclutadas por el tumor tales como, por ejemplo, anticuerpos anticaderina VE (CD144) o antiPECA -1 (CD31) para detectar células endoteliales vasculares, anticuerpos antiactina a de músculo liso para detectar células de músculo liso vasculares, anticuerpos antiKi67 para detectar células proliferantes, análisis TUNEL para detectar células que mueren, anticuerpos antip-catenina para detectar señalización nt y dominio antiintracelular (ICD), anticuerpos de fragmento Notch para detectar señalización Notch se pueden utilizar para determinar los efectos de tratamiento de anticuerpo sobre, por ejemplo, angiogénesis, crecimiento de tumor y morfología de tumor.

En algunas modalidades, también se determinó el efecto del tratamiento con el anticuerpo antireceptor FZD de sobre la expresión de gen de célula tumoral. Se extrae ARN total de una porción de cada tumor cosechado a partir de ratones tratados con anticuerpo FZD o tratados con anticuerpo control y se utilizó para RT-PCR cuantitativa. Los niveles de expresión de los receptores FZD, componentes de la vía de señalización Wnt incluyen, por ejemplo, Wntl y ß-catenina, así como marcadores de citoblastos cancerosos identificados previamente (por ejemplo CD44) se analizan en relación a un gen constitutivo GAPDH como un control interno. De esta manera se determina los cambios en la expresión de un gen de célula tumoral ante el tratamiento con anticuerpo para receptor FZD.

Además se determinó el efecto del tratamiento con anticuerpo antireceptor FZD en la frecuencia de citoblastos cancerosos. Las muestras de tumor de ratones tratados con FZD versus anticuerpo control se cortan en piezas pequeñas, se trituran completamente utilizando cuchillas estériles y se obtienen suspensiones de células solas por digestión enzimática y ruptura mecánica. Las células tumorales disociadas después se analizan por análisis FACS para determinar la presencia de linfoblastos cancerosos tumorigénicos en base en la expresión de marcador de célula de superficie ESA+, CD44+, CD24-/bajo, Lin-, como se describe con detalle en lo anterior.

La tumorigenicidad de células aisladas basadas en la expresión de ESA+, CD44+, CD24-/bajo, Lin- posterior al tratamiento con anticuerpo antiFZD se puede determinar de esta manera. Los linfoblastos cancerosos ESA+, CD44+, CD24-/bajo, Lin-aislados de ratones tratados con anticuerpo FZD versus anticuerpo control se reinyectan subcutáneamente en almohadillas grasas mamarias de ratones NOD/SCID. Después se determinó la tumorigenicidad de citoblastos cancerosos en base en el número de células inyectadas que se requieren para una formación de tumor consistente .

Ejemplo 14 Identificación de una firma de gen Wnt Se llevaron a cabo experimentos para identificar un grupo de genes cuya expresión es específica para activación de la vía de señalización Wnt en tumores de colon humano.

Supresión del crecimiento de tumor por sobreexpresión de axina Axina es un importante regulador de la vía Wnt canónica. Es parte del complejo multiproteínico que activa la degradación de ß-catenina, y de esta manera mantiene la vía en silencio (sin expresión) en ausencia de Wnt. Este efecto se invierte por Wnt, el cual separa la axina del complejo de destrucción lo que permite la traslocación de ß-catenina y la activación mediada por TCF de genes objetivos específicos. Tanto la sobreexpresión exógena de axina como la expresión de una forma truncada negativa dominante de TCF (DNTCF4) representa medios bien caracterizados para bloquear la vía de señalización Wnt.

Se demuestra que la sobre expresión de axina mediada por lentivirus suprime por completo el crecimiento de tumores de mama UM-PE13 y UM-T3 asi como el crecimiento de tumores de colon 0MP-C11 y OMP-C17 en ratones NOD/SCID. La expresión estable de DNTCF4 en células tumorales UM-T3 tiene el mismo efecto. Tomados juntos, estos datos demuestran que el bloqueo de Wnt intracelular puede afectar de manera negativa el desarrollo de diferentes tipos de tumor, fundamentando que la vía Wnt es un objetivo relevante para el tratamiento de canceres de mama y colon.

La via de señalización Wnt se activa de manera constitutiva en muchos tipos de tumor. En mayor parte de los tumores de colon esta activación se debe a una mutación de truncado de APC o mutaciones de activación de ß-catenina. Estas mutaciones no se han reportado para otros tejidos, en los cuales la via de señalización Wnt se puede activar a través de otro conjunto de mutaciones o un mecanismo autócrino. En aquellos tumores en donde la via de señalización Wnt permanece sensible a estímulos autócrinos, el bloqueo de la vía utilizando medios extracelulares tales como anticuerpos u otros inhibidores de proteína solubles debe ser factible e incidir sobre el desarrollo del tumor. La identificación de los tumores que dependen de Wnt puede ser útil para desarrollar agentes antiWnt y definir tipos de tumores que se tengan como objetivo en la clínica.

Los datos inmunohistoquímicos muestran que la mayor parte de las células tumorales OMP-Cll expresan niveles altos de ß-catenina citoplásmica/nuclear, lo que sugiere que la vía de señalización Wnt está activada de manera constitutiva en este tipo de tumor. Esto se confirmó por la detección de altos niveles de ß-catenina en OMP-Cll por transferencia Western. La combinación de la activación de la vía Wnt y la sensibilidad a sobreexpresión de axina vuelve a OMP-Cll un buen tumor en el cual estudiar la regulación de la expresión del gen en respuesta a Wnt y el bloqueo de Wnt, y a partir del cual derivar una firma del gen Wnt.

Análisis de microarreglo de expresión de gen diferencial en respuesta a sobreexpresión de axina La expresión de gen diferencial por tratamiento de células tumorales de colon de OMP-Cll con axina se determinó por análisis de microarreglo.

Se utilizaron ratones NOD/SCID en quienes recién se extrajeron tumores OMP-Cll de colon humano (modelo de tumor de xenoinjerto) como fuente de células tumorales de colon. Se generaron dos vectores lentivirales para el suministro del cásete de expresión axina-IRES-GFP constitutivo y un cásete de expresión IRES-GFP control que se denominaron, respectivamente, LOM91 y LOM92.

Los tumores OMP-Cll se procesaron a una suspensión de células solas y se suprimieron de las células de linea de ratón. Las células en las que se suprimió lin se infectaron con L0M91 (axina) o vectores lentivirales 92 (control) utilizando una multiplicidad de infección de 2.5 mantenida en cultivo durante 3-4 días y clasificada para expresión de GFP. El ARN total se extrajo de cada muestra de células clasificadas. Los ARN se analizaron en el microarreglo GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, California). Los experimentos se repitieron dos veces.

Se generó una firma del gen que contiene un conjunto de núcleo de genes regulados por la vía Wnt mediante el análisis de los genes que se expresaron de manera diferencial posterior al tratamiento con axina y que también mostraron correlación con la expresión de axina2 a través de un conjunto de muestras de tumor de colon normales y malignos. Se identificaron genes del experimento de microarreglo de axina (antes) que mostraron regulación por disminución en respuesta a la sobreexpresión de axina. El limite para esta selección fue la regulación por disminución en 50% o más de muestras que sobreexpresan axinal, en comparación con muestras control (relación de logaritmo 2 de muestras que sobreexpresan axinal con respecto a muestras control la cual es de -1 o menor) con un valor P de prueba T menor de 0.1. Dado que axinal se sabe que es un inhibidor de la vía Wnt, los genes regulados por disminución por sobreexpresión de axinal serán objetivos de la vía Wnt directos o indirectos. Esta selección después se ajustó adicionalmente por identificación de aquellos genes que mostraron una correlación alta (valor de correlación > 0.3) con axina2 entre un conjunto de muestras de tumor de colon/intestino/otras muestras de tumor maligno de tejido (232 muestras) . Puesto que axina2 es un objetivo Wnt conocido, los genes que muestran patrón de expresión similar de que axina2 probablemente también sean objetivos de Wnt. Este análisis produce una firma de gen para la actividad de la vía Wnt (tabla 6) . Los niveles de expresión de los genes en esta firma se pueden utilizar para determinar si las muestras de tumor individuales o tipos diferentes de tumores muestran pruebas de señalización de vía Wnt alterada.

Tabla 6. Lista de firma de gen Wnt derivada de tumores de colon Ejemplo 15 Tratamiento de cáncer humano utilizando anticuerpos receptores anti-FZD Este ejemplo describe métodos para tratar cáncer utilizando anticuerpos contra un receptor FZD para obtener como objetivo tumores que comprenden citoblastos cancerosos y/o células tumorales en las cuales se ha detectado la expresión del receptor FZD y/o células tumorales que tienen una firma del gen Wnt que indique que responden a la inhibición de señalización de Wnt (por ejemplo, la firma de gen Wnt del ejemplo 14).

La presencia de un marcador de citoblasto canceroso o el receptor FZD o la expresión de uno o más genes en una firma de gen Wnt se puede determinar por primera vez a partir de una biopsia de tumor. Las células tumorales de una biopsia de un paciente a quien se le ha diagnosticado con cáncer se extrae bajo condiciones estériles. En algunas modalidades, la biopsia de tejido se congela fresca en nitrógeno liquido, se incrusta en O.C.T., y se corta en un criostato como secciones de 10 um sobre portaobjetos de vidrio. En algunas modalidades, la biopsia de tejido se fija en formalina, se incrusta en parafina y se corta en un microtomo como sección de 10 µp? sobre portaobjetos de vidrio.

Las secciones se incuban con anticuerpos contra un receptor FZD para detectar expresión de proteina FZD. De manera alternativa, las secciones se pueden analizar para determinar la presencia de uno o más genes en la firma de gen Wnt como se describe en el ejemplo 14.

También se puede determinar la presencia de citoblastos cancerosos. Las muestras de biopsia de tejido se cortan hasta piezas pequeñas, se trituran completamente utilizando cuchillas estériles y las células se someten a digestión enzimática y ruptura mecánica para obtener una suspensión de células solas. Las células tumorales disociadas después se incuban con anticuerpos antiESA, -CD44, -CD24, -Lin y -FZD para detectar citoblastos cancerosos y la presencia de linfoblastos tumorales ESA+ . CD44+, CD24-/bajo, Lin-, FZD+ se determina por citometria de flujo como se describe con detalle en lo anterior.

Los pacientes con cáncer cuyos tumores se diagnostican que expresan un receptor FZD y/o uno o más genes en la firma de gen nt se tratan con anticuerpos receptores antiFZD. En algunas modalidades, los anticuerpos receptores antiFZD monoclonales humanizados o humanos generados como se describe en lo anterior se purifican y formulan con un vehículo farmacéutico adecuado para inyección. En algunas modalidades los pacientes se tratan con anticuerpos FZD por lo menos una vez al mes durante por lo menos 10 semanas. En algunas modalidades, los pacientes se tratan con los anticuerpos FZD por lo menos una vez a la semana durante por lo menos aproximadamente 14 semanas. Cada administración del anticuerpo debe ser una dosis farmacéuticamente eficaz. En algunas modalidades, se administran entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo antiFZD. En algunas modalidades se administran entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mg/ml de anticuerpo antiFZD. El anticuerpo se puede administrar antes, de manera concurrente o después de regímenes de radioterapia estándar o regímenes de quimioterapia utilizando uno o más agentes quimioterapéuticos tales como oxaliplatino, fluorouracilo, leucovorina o estreptozocina . Se monitorea a los pacientes para determinar si el tratamiento resultado en una respuesta antitumoral, por ejemplo en base en regresión de tumor, reducción de las incidencias de tumores nuevos, expresión menor de antígeno tumoral, miembros disminuidos de citoblastos cancerosos u otro medio para evaluar pronóstico de enfermedad.

Ejemplo 16 Diferenciación de células tumorales pancreáticas posterior a tratamiento con 18 5 y gemcitabina Análisis de expresión de gen de células tumorales pancreáticas tratadas por PCR cuantitativa (Q-PCR) Tumores de xenoinjerto PN4 se tratan ya sea con Ab control, anticuerpo IgG 18R5, gemcitabina o la combinación de gemcitabina y anticuerpo IgG 18R5, como se describe en lo anterior (ejemplo 7) y se analizan para la expresión de cromogranina A (CHGA, por sus siglas en inglés) por análisis PCR cuantitativo. CHGA es bien conocido como marcador para diferenciación neuroendocrina de diversos tumores que incluyen tumores de mama, colon, pulmón y pancreático y la expresión elevada de CHGA en tumores pancreáticos se ha encontrado que se relaciona con supervivencia mejorada (Tezel et al. 2000. Cáncer 89, 2230-6) .

Se prepara ARN total de 5 tumores de cada grupo en el estudio de xenoinjerto PN4 y se evalúa por transcripción inversa de una etapa (RT) -PCR utilizando sondas registradas de Applied Biosystems Taqman^ de acuerdo con procedimiento estándar. El conjunto sonda-cebados (Hs00154441_ml) utilizado para análisis de CHGA incluye una sonda marcada con colorante FAM y el Siguiente cebador: 5' -CGCTCTCCAAGGCGCCAAGGAGAGG-3 ' (SEC ID NO: 75) . Se utiliza Gus B como un control interno. Brevemente, se realiza RT a 48°C durante 30 min, desnaturalización inicial a 95°C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 segundos y extensión a 60°C durante 1 minuto y amplificación/incorporación de las sondas fluorescentes se observa en tiempo real.

Este marcador de células ß de islote CHGA se eleva significativamente únicamente en muestras de ratones tratados con gemcitabina y 18R5. Los tumores del Ab control, 18R5 y los grupos de gemcitabina solo expresaron niveles similares de ARN para CHGA mientras que los tumores del grupo de combinación mostraron un claro incremento en la expresión de CHGA. Los niveles de CHGA se elevaron 10 veces y 7 veces en dos experimentos en tumores tratados tanto con 18R5 como con gemcitabina. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la figura 42.

Análisis de expresión de gen de células tumorales pancreáticas tratadas por inmunohistoquímica La expresión aumentada de CHGA también se observó a nivel de proteína por inmunohistoquímica en secciones de tejido preparadas a partir de tumores tratados (datos no mostrados) . Los tumores tratados con Ab control muestran una tinción intensa de un subconjunto pequeño de células dispersadas a través de los tumores. Los tumores tratados con 18R5 solos o gemcitabina sola expresaron CHGA a niveles similares que los controles. En contraste, los tumores tratados con una combinación de 18R5 y gemcitabina mostraron un incremento en el número de células positivas a CHGA, lo que concuerda con la expresión aumentada de ARN detectada por Q-PCR.

Tinción con azul alcian y anticuerpo para ki67 Otra característica de las células endocrinas, secretoras o de ducto es la producción de mucina y estas células se detectan por la tinción azul alcian (van Es et al. 2005. Nature 435 959-63). Se observa durante la cosecha y procesamiento de tumores que los tumores tratados con 18R5 son mucho más mucinosos que tumores tratados control. Por lo tanto, secciones de tumores PN4 de ratones tratados con anticuerpo control, únicamente con gemcitabina, únicamente con 18R5 o con 18R5 más gemcitabina se tiñeron con azul alcian. Los tumores tratados con 18R5 mostraron un incremento claro en la tinción de azul alcian tanto en los grupos 18R5 solo como 18R5 más gemcitabina en relación a los controles y el grupo tratado únicamente con gemcitabina (datos no mostrados ) .

Las células mucinosas aumentadas también se observaron en una segunda linea de tumor pancreático, PN13, seguido por tratamiento con 18R5 o anticuerpo control (figura 43) . En este experimento, los ratones que presentan tumores PN13 se trataron como se describe en lo anterior (ejemplo 7) . Las secciones de tumores se tiñeron con azul alcian para mostrar células mucinosas y también se tiñeron por inmunohistoquimica con un anticuerpo para ki67 para mostrar células que experimentan proliferación. Los resultados muestran que el tratamiento con 18R5 resulta en números aumentados en gran medida de células mucinosas positivas para azul alcian. Adicionalmente, se redujo la frecuencia de células ki67 positivas por tratamiento con 18R5. De manera interesante, no hay una superposición entre células mucinosas y células que son positivas a ki67, lo que sugiere que las células mucinosas no sean proliferativas . Esto proporciona pruebas de que el tratamiento con 18R5 promueve la diferenciación de células tumorales en descendencia no proliferativa .

En resumen, la expresión aumentada de CHGA, la producción aumentada de mucinas como se vuelve evidente por la tinción azul alcian y la producción de descendencia no proliferativa, como se vuelve evidente por tinción con el anticuerpo para ki67 concuerdan con un modelo que inhibe la señalización Wnt-FZD con tratamiento 18R5 que promueve la diferenciación de células tumorales pancreáticas hacia tipos de células distintos múltiples con características definitorias de células diferenciadas no proliferativas .

Ejemplo 17 Estudios de eficacia in vivo adicionales con 18R5 solo y/o en combinación con otros agentes anticancerigenos Efecto sobre el crecimiento de tumor de xenoinj erto 0MP-LU24 Se determinó la eficacia de anticuerpo antiFZD 18R5, solo y en combinación con TaxolMR (paclitaxel) para inhibir el crecimiento de tumores de pulmón humanos OMP-LU24 in vivo.

Se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID 50,000 células de tumor de pulmón humano OMP-LU24. Se permitió que los tumores crecieran durante 27 días hasta que alcanzaron un volumen promedio de 143 mm3. Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en 4 grupos (n = 9 por grupo) y se trataron ya sea con anticuerpo control ("Ab control"), antiFZD 18R5 ("18R5"), TaxolMR ("Taxol") o la combinación de 18R5 más TaxolMR ("18R5+Taxol" ) . Se hicieron mediciones de tumor los días indicados en la figura 44. Se dosificaron los anticuerpos a 10 mg/kg intraperitonealmente (IP), una vez a la semana y se dosificó TaxolMR a 15 mg/kg, IP, una vez por semana.

Los resultados se muestran en la figura 44. El tratamiento antiFZD se observa que reduce el crecimiento de tumor y el tratamiento combinado muestra actividad antitumoral aumentada en relación con TaxolMR solo.

Efecto en el crecimiento de tumor de xenoinj erto 0MP-LU33 También se probó la eficacia de anticuerpo antiFZD de 18R5 solo y en combinación con AvastinMR (bevacizumab) para inhibir el crecimiento de tumores de pulmón humanos OMP-LU33 in vivo.

Se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD-SCID 10,000 células de tumor de pulmón humano OMP-LU33. Se permitió que los tumores crecieran durante 30 días hasta que alcanzaron un volumen promedio de 124 mm . Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en 4 grupos (n = 10 por grupo) y se trataron con anticuerpo control (cuadro) , AvastinMR (triángulos que apuntan hacia abajo) , antiFZD 18R5 (triángulos que apuntan hacia arriba) o la combinación de 18R5 más AvastinMR (circuios). Se hicieron mediciones del tumor en los días indicados en la figura 45. Los anticuerpos se dosificaron a 10 mg/kg IP, dos veces a la semana.

Los resultados se muestran en la figura 45. El tratamiento antiFZD parece reducir el crecimiento de tumor y el tratamiento combinado muestra actividad antitumoral aumentada en relación a únicamente Avastin .

Efecto sobre el crecimiento de tumor de xenoinjerto T3 También se determinó la eficacia del anticuerpo antiFZD 18R5 tanto solo como combinado con HerceptinMR ( trastuzumab) para inhibir el crecimiento de tumores de mama HER2-positivo humano T3 in vivo.

Se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD-SCID 50,000 células de tumor de mama humano T3. Se permitió que los tumores crecieran durante 32 días hasta que alcanzaron un volumen promedio de 125 mm3. Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en 4 grupos (n = 10 por grupo) y se trataron con anticuerpo control (cuadros), antiFZD 18R5 (triángulos), HerceptinMR (circuios pequeños negros) o una combinación de 185 más HerceptinMR (circuios blancos) . Se realizaron mediciones de tumor los días indicados en la figura 46. Los anticuerpos se dosificaron a 10 mg/kg IP, dos veces a la semana .

Los resultados se muestran en la figura 46. El tratamiento de combinación con 18R5 y HerceptinMR mostró actividad antitumoral aumentada en relación a HerceptinMr solo .

Ejemplo 18 Secuencias de anticuerpo anti-FZD Las CDR de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpos antiFZD se proporcionan en las tablas 7 y 8 a continuación, respectivamente. Las regiones variables de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) y las regiones variables de cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés) de los anticuerpos antiFZD y sus secuencias codificantes se identifican en la tabla 9 a continuación. Las secuencias de aminoácidos y polinucleotidicas de VH y VL que se incluyen en la tabla 9 se proporcionan en las figura 13-15 o en las tablas 10 y 11 a continuación. Las secuencias que codifican para la cadena pesada o la cadena ligera de los anticuerpos antiFZD se proporcionan en las figuras 14-15 o en la tabla 12 abaj o .

Tabla 7. CDR de cadena pesada de anticuerpos anti-FZD humano Tabla 8. CDR de cadena ligera de anticuerpos anti-FZD humano Tabla 9. VH y VL de anticuerpos anti-FZD humanos Tabla 10. Secuencias de aminoácidos VH y VL adicionales anti- FZD Tabla 11. Secuencias nucleotidicas adicionales que codifican para VH y VL de anticuerpos anti-FZD SECUENCIA (SEC ID NO:) secuencia codificante VH 18R5/18R8 (optimizada en codones)(SEC ID NO: 87): GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTG TCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCT CTCCCACACACCCTGTCCTGGGTGCGCCAGGCA CCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCTCCGTGATCTCCGGCGACGGCTCCTACACCTACTAC GCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCrCCGACAACTCCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACTOTCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGAAC- TC ATCAAGTACGTGTTCGCCAACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCXjTGTCCTCC secuencia codificante VL 18R8 (optimizada en codonesKSEC ID NO: 88): GACATCGAGCTGACCCAGCCTCCCTCCGTGTCTGTGGCTCCTGGCCAGACCGCCCGGATC TCC GCTCCGGCGACAAGCTGGGCAAGAAGTACGCCTCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGA CIAGGCCCCTGTGC GGTCATCTACGAGAAGGACAACCGGCCTAGCGGCATCCCTGAGCGG T CTCCGGCTCCAACTCCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCTCCGGCACCCAGGCCGAG GACGAGGCCGACTACTACTGCTCCTCCTTCGCCGGCAACTCCCTGGAAGTGTTCGGCGGA GGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGC secuencia codificante VL 18R5 (optimizada en codones)(SEC ID NO: 89): GACATCGAGCTGACCCAGCCTCCCTCCGTGTCCGTGGCCCCTGGCCAGACCGCCCGGATC TCCTGCTCCGGCGACAACATCGGCAGCT^ <^GGCCCC GTGCTX¾H?GATCTACGACAAGTC^ TTC CCGGCTCCAACTCCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCTCCGGCACCCAGGCCGAG GACGAGGCCGACTACTACTGCCAGTCCTACGCCAACACCC GTCCCTGGTGTTTGGCGGC GGAACAAAGCTGACCGTGC GGGC secuencia codificante VL 18R4605 (SEC ID NO: 90): GACATAGAACTAACTCAGCCACCCTCTGTTAGCGTTGCACCGGGACAGACGGCACGTATA TCGTGC CGGGAGACAATATAGGAAGTTTCTATGTACATTGGTATCAACAGAAACCTGGT CAAGCACCTGTATTAGTAATCTATGACAAAAGTAACCGACCTTCCGGAATACCTGAGCGT TTCAGTGGTTCGAACTCCGGCAAC1AC GCAACTTTAACTATATCTGGAACTCAGGCGGAG GATGAGGCTGACTACTACTGCCAGAGTTACGCAAACACTCTGTCCC GGTGTTTGGCGGC GGAACAAAGTTAACCGTGCTGGGC secuencia codificante VL 18R4805 (SEC ID NO: 92): GACATAGAACTAACTCAGCCGCCGTCTGTTAGCGTTGCACCGGGACAGACGGCACGTATA XCGTGCTCGGGAGACAATATTGGTTCTTTCTATGTACATTGGTATCAACAGAAACCTGGT CAAGC1ACCGTATTAGTAATATATGACAAAA TTCAGTGGTTCGAACTCGGGCAACACTGCAACTTTAAC ATATCTGGAACGCAGGCGGAG GATGAGGCGGACTACTATTGCCAAAGTTACGCAAACACTCTATCCTTAGTGTTTGGTGGA GGAACAAAGTTAACCGTGCTAGGC secuencia codificante VH 44R24 (SEC ID NO: 94): GAGGTGCAGCTGGTGGAGTC GGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTG TCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTC CCTCTTACTACATCACC GGGTGCXK;CAGGCT CCTGGCAAGGGACTGG^TGGGTGTCCACCATCTCCTACTCCTCCAG-AACACCTACTAC GCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCAXCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTCCATC GTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCXGGTGACCGTGTCCTCT secuencia codificante VL 44R24 (SEC ID NO: 95): GACATCGAGCTGACCCAaCCTCCC CTGTGTCTGTGGCCCCTGGCCAGACCGCCAGGATC TCT GCTCTGGCGACGCCCTGGGCAACAGATACGTGTAC GGTATCAGCAGAAGCCAGGC CAGGCCCCIX3TGCTGGTGATCCCTTCCGGCATCCCTGAGC8TTCTCCGQCTCCAACTCC GGCAACACCGCCACCCTGACCATCTCTGGCACCCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTAC TGCGGCTCCTGGGAC^CCCGGCCTTACCCTAAGTACGTGTTCGGCGGAGGCACCAAGCTG ACCGTGCTGGGC Tabla 12. Secuencias nucleotidlcas adicionales que codifican para las cadenas pesadas (HC) o cadenas ligeras (LC) de anticuerpos IgG anti-FZD (que incluyen secuencias de señal SECUENCIA (SEC ID NO:) secuencia codificante HC lgG2 18R5H8R8/18R4605/18R4805 (optimizada en codones) (SEC ID NO: 96): ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGC GCTGGTCGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCCGAG GTGCAGC GGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGC CCCTGAGACTGTCC TGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACACCCTGTCCTGGGTGCGCCAGGCACCA GGGAAGGGACTGQAGTGGC?rCTCCGTGATC CCGGCGACGGCTCCTACACCTACTACGCC GACTCCGTGAAGGGCCGGTXCACCATC CCTCCGACAACrCCAAGAACACCCTGTACCTG CAGATGAACTCTCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGAACTTCATC AAGTACGTGTTCGCCAACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACC AAGGGCCCTTCCGTGT CCCTC GGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCCACCGCC GCTCTGGGC GCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCrrGTGACAGTGTCCTGGAACTCT GGCGCCC GACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTAC TCCCTGTCC CCG-TGGTGACAGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGC AACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGC GTGGAGTGCCC CCT GCCC GCCCCTCCTGTGGCTGGTCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCT CCTAAGCCTAAGGJACACCCTGATGATC CCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTG GACGTGTCCCACGAGGATCCrGAAGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCC GTGC GACCGTGGTGCACCAGGACTGX3CTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCC AACAAGGGCC GCC GCCCC ATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCC CGC GAG^CTCAGGTGrACACCCTGCCTCCC CTCGCGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCC CTGACCTGTCTGGTCAAGGGC TCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAAC GGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCTTTC TTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCC TGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCT CCTGGCAAG secuencia codificante LC ? 18R8 (optimizada en codones) (SEC ID NO: 97): ATGGCCTGGGCCCTGCTGCTGCTGACCCTGCTGACACAGGGCACCGGCTCTXGGGCCGAC ATCGAGCTGACCCAGCCTCCCTCCGTGTCTGTGGCTCCTGGCCAGACCGCCCGGATCTCC TGCTC X3GCGACAAGCTGGGCAAGAAGTACGCCTCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACAG GCCCCTGTGCTGGTCATCTACGAGAAGGACAACCGGCCTAGCGGCATCCCTGAGCGGTTC TCCGGCTCCAA rCCGGCAAC-ACCGCCACCCTGACCATCTCCGGCACCCAGGCCGAGGAC GAGGCCGACTACTACTGCTCCTCCTTCGCCGGCAACTCCCTGGAAGTGTTCGGCGGAGGC ACCAAGCTGACCGTGCTGGGCCAGCCTAAGGCCGCTCCTTCCGTGACCCTGTTCCCTCCT TCCTCCGAGGAACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTCTGCCTGATCTCCGACTTCTAC CCTGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCCGACTCC CCCCTG GAAGGCCGGCGTGGAG AC^CC^CCCCTTCCAAGCAGTCC^CAACAAGTACGCCGCCTCCTCCTACCTGTCCCTG ACCCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACCGGTCCTACTCTTGCCAGGTCACCCACGAGGGCTCC ACCGTGGAAA¾GACAGTGGCX:CCCACCGAGTGCTCC secuencia codificante LC 18RS (optimizada en codones) (SEC ID NO: 76): ATGGCCTGGGCCCTGCTGCTGCTGACCCTGCTGACACAGGGCACCGGCTCTTGGGCCGAC ATCGAGCTGACCCAGCCTCCCTCCGTGTCCGTGGCCCCTGGCCAGACCGCCCGGATCTCC TGCTCCGGCGACAACATCGGCAGCTTCTACGTGCACTGGTATCAGCAGAAACCTGGACAG GCCCCTGTGCTGGTGATCTACGACAAGTCCAACCGGCCTTCCGGCATCCCTGAGCGGTTC TCCGGCTCCAACTCCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCTCCGGCACCCAGGCCGAGGAC GAGGCCGACTACTACTGCCAGTCC ACGCCAACACCCTGTCCCTGGTGTTTGGCGGCGGA AC AAAGCTGACCGTGCTGGGCCAGCCTAAGGCCGCTCCTTCCGTGACCCTGT CCCTCCT TCCTCCGAGGAGCTGC-AGGCCAACAAGGCCACCC GGTGTGCCTGATCTCCGACTTCTAC CCTGGCGCTGTGACTGTGGCTTGGAAGGCCGACTCCTCCCCTGTGAAGSCCGGCGTGGAG AC^ACCACCCCTTCCAAGCAGTCCAACAAC!AAGTACGCCGCCTCC CCTACCTGTCCCTG ACCCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACCGGTCCTAC CTTGCCAGGTGACCCACGAGGGCTCC ACCGTGGAAAAGACAGTGGCACCCACCGAGTGCTCC secuencia codificante LC 18R4605 (SEC ID NO: 83): ATGGCATGGGCATTATTGCTACTTACTCTATnGACGCAAGGAACGGGTTCATGGGCAGAC ATAGAACTAACTCAGCCACCCTCTGTTAGCGTTGCACCGGGACAGACGGCACGTATATCG TGCTCGGGAGAGAATATAGGAAGTTTC ATGTACATTGGTATCAACAGAAACCTGGTCAA GCACCTGTATTAGTAATCTATGACAAAAGTAACCGACC CCGGAATACCTGAGCGTTTC AGTGGTTCGAACT C CGG CAAC ACTGCAACTTTAAC T ATAT C TGGAACT AGGCGG AGGAT GAGGCTGACTACTACTGCCAGAGT ACGCAAACACTCTGTCCCTGGTGTTTGGCGGCGGA ACAAAGTTAACCGTGCTGGGCCAGCCTAAGGCCGCACCTTCGGTGACCCTATTCCCTCCT TC¾TCCGAGGAGCTACAGGCCAACAAGGCC_ACCTTAGTGTGCC AATCTCCGACTTCTAT CCTGGTGCTGTAACGGTAGCGTGGAAGGCCGACTCATCGCCGGTGAAGGCCGGTGTGGAG ACAACGACTCCTTCCAAGCAGTCCAACAACAAATACGCCGCGTCCTCCTACCTGTCCCTA ACCCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACCGTTCATACTCGTGCCAGGTGACGCACGAGGGTTCA ACGGTCGAAAAGACAGTAGCACCTACTGAATGCTCA secuencia codificante LC 18R4805 (SEC ID NO: 84): ATGGCATGGGCATTATTACTAC ACTCTACT ACGCAAGGAACGGGTTCATGGGCAGAC ATAGAACTAACTCAGCCGCCGTCTGT AGCGT GCACCGGGACAGACGGCACGTATATCG TGCTCGGGAGACAATATTGGTTCTTTCTATGTACATTGGTATCAACAGAAACCTGGTCAA GCACCTGTATTAGTAATATATGACAAAAGTAACCGTCCTTCGGGAATACCTGAGCGTTTC AGTGGTT CG AACT CGGGCAACACTGCAACTT T AACTA ATCTGG AACGCAGG CGGAGGAT GAGGCGGACTACTATTGCCAAAGTTACGCAAACACTCTATCCTTAG GTTTGGTGGAGGA ACAAAGTTAACCGTGCTAGGCCAGCCTAAGGCCGCACCTTCGGTGACCCTATTCCCTCCT TCATCCGAGGAGCTACAGGCGAACAAAGCCACCTTAGTGTGCCTAATCTCAGACTTTTAT CCTGGTGCTGTAACGGTAGCGTGGAAGGCGGACTCATCGCCGGTGAAGGCCGG GTGGAG ACAACGACTCCTTCCAAGCAGTCCAACAACAAATACGCAGCGAGTAGTTACCTGTCCCTA ACCCC GAGCAGTGGAAGTCGCACCG TCATACTCGTGCCAGGTTACGCACGAGGGTTCA ACGGTCGAAAAGACAGTAGCACCTACGGAATGCTCA secuencia codificante HC 44R24 (SEC ID NO: 91 ): ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTC GCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCC GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGC CCCTGAGACTG TCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCrrCrCCTCTTACTACATCACCTGGGTGCGCCAGGCT CCTGGC-?^GGGACTGGAATGGGTGTCCACCATCTCCTACTCCTCCAGCAACACCTACTAC GCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTCCATC GTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCI¾i¾^GACCGTQTCCTCTTCCGTGTTCCCTCTG GCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCrGAGTCrACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGAC TAC TCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTG CC TCCTCCLAACTTCGGCACCCAGACCTACIACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAAC ACCAAGGTGGACAAGACCX5TGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCT CCTCCTGTGGCTGGCCCrTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATG ATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAG GTGCAG TCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGG GAGGAACAGTTC1AACTCCACCT CCGGGTGGTGTOTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGAC TGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATC GAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCT CCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTC TACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCC-AGCCTGAGAACAACTACAAG ACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT CCTGTACTCCAAGCTGACAGTG GACAAGTCCCGGTGGC1AGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAGTGA secuencia codificante LC 44 Z4 (SEC ID NO: 93): ATGGCTTGGGCTCTGCTGCTGCTGACCOTGCTGACACAGGGCÁCCGGCTCTTGGGCC GACATCGAGCTGACCCAGCCTCCCTCTGTGTCTGTGGCCCCTGGCCLAGACCGCCAGGATC TCTTGCXCTGGCGACGCCCTGGGCAACAGATACGTGTACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGC CAGGCCCCTGTGCTGGTGATCCCTTCCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCCGGCTCCAACTCC GGCAACACCGCCACCCTGACCATCTCTGGCACCCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTAC TGCGGCTCCTGGGACACCCGGCCTTACCCTAAGTACGTGTTCGGCGGAGGCACCAAGCTG ACCGTGCTGGGCCCTTCCGTGACCCTGTTCCCTCCATCCTCCGAGGAACTGCAGGCCAAC AAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCTCCGACTTCTACCCTGGCGCCGTGACCGTGGCTTGG AAGGCCGACTCTAGCCCTGTGAAGGCCGGCGTGGAGACAACCACCCCTTCCAAGCAGTCC AACAACAAGTACGCCGCCTCCTCCTACCTGTCCCTGACCCCTGAGCAGTGGAAGTCCCAC CGGTCCTACTCrTGCCAGGTGACCCACGAGGGCTCCACCGTGGAAAAGACCGTGGCCCCT ACCGAGTGCTCCTÁG Los plásmidos aislados de E. coli que codifican para anticuerpos IgG antiFZD 18R4605 (ATCC, depósito no. PTA-10307), 18R4805 (ATCC, depósito no. PTA-10309) y 44R24 (ATCC, depósito no. PTA-10311) se depositan con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, Estados Unidos bajo las condiciones del tratado de Budapest el 26 de agosto del 2009.

Ejemplo 19 Perfiles de unión de anticuerpos anti-FZD Se utiliza el análisis FACS para caracterizar los perfiles de unión de FZDl, 2, 5, 7 y 8 de anticuerpos monoclonales (mAb) antiFZD.

Se cotransfectan células HEK293 con un ADN plasmidico que expresa longitud completa de FZDl, 2, 5, 7 ú 8 junto con otro plásmido que expresa el gen indicador GFP utilizado como un marcador de transfección . Se utiliza Fugene 6 (Roche) como reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se incuban veinticuatro a cuarenta y ocho horas a 37 °C y C02 5%. Los mAb antiFZD después se diluyen en un volumen final de 50 µ? comenzando con una concentración de 20 µg/ml y diluidos de manera seriada en diluciones cuádruples por un total de 8 diluciones. Cada acumulado de transfectante transitorio 293 de FZD/GFP se recolecta en suspensión y se incuban 100,000 células transfectadas en hielo 30-60 minutos con el mAb antiFZD diluido que se va a probar. Las células se lavan y se unen anticuerpos antiFzd se detectan con un anticuerpo antihumano secundario conjugado a un cromóforo fluorescente. Las células marcadas después se detectan y cuentan por FACS. Los datos de FACS generados se expresan en unidades de media de intensidad de fluorescencia (MFI , por sus siglas en inglés) . Se utiliza el programa GraphPad Prism para graficar y analizar los datos. Las MFI se grafican como una función de la concentración de Ab para establecer curvas dosis-respuesta. Se aplica una regresión no lineal a los números para ajustar la curva y calcular las CE50.

Los perfiles de unión para los mAb 18R5 y 44R24 se determinan y comparan. La curva dosis-respuesta que representa la unión de cada uno de 18R5 y 44R24 a Fzdl, 2, 5, 7 y 8 se muestran en la figura 47. La CE50 (nM) calculada para los dos mAb se muestra en la tabla 13. 44R24 se une a Fzd5 y Fzd8 con buena afinidad. No se puede establecer una curva dosis-respuesta sigmoidea para los otros 3 receptores Fzd, lo que sugiere que 44R24 no se une a Fzdl, 2 y 7. La unión de alta afinidad de Fzdl, 2, 5 y 7 se confirma para 18R5.

Tabla 13. CE50 (nm) para los mAb 18R5 y 44R24 Ejemplo 20 Evaluación de actividad anti-Wnt de los mAb anti-FZD en análisis basados en célula Se determinó y comparó la capacidad de 18R5 y 44R24 para inhibir la señalización Wnt en células STF-293. Las células STF son células de riñon embriónico humano (HEK)-293 transíectadas de manera estable con el cásete indicador Super Top Fias (STF) en el cual la expresión del gen indicador de luciferasa (Luc) es regulado por copias múltiples del sitio de unión TCF hacia el extremo cinco prima de un promotor mínimo. Se puede inducir la expresión Luc basal baja 30-60 veces en respuesta a Wnt3a, lo que proporciona un intervalo grande para determinar la actividad inhibidora de Abs antiFzd .

Para determinar los mAb, se hacen crecer células STF-293 en DMEM-FBS 10%. En el día 1 se siembran en placas 10,000 células por pozo en placas de fondo blanco óptico de 96 pozos (Nunc #165306). Las células se incuban O. N. a 37°C y C02 5%. En el día 2, los Abs que se van a probar se diluyen a una concentración final de 40 µg/ml utilizando medio de cultivo. Se realizan siete diluciones seriadas quíntuples . El medio de cultivo de células STF-293 se sustituye con una mezcla que contiene 50 µ? de dilución de Ab, 25 µ? de medio acondicionado Wnt3a a partir de células L estables nt3a y 25 µ? de DMEM-FBS 10%. Para cada Ab las concentraciones finales probadas son 20, 4, 0.8, 0.16, 0.03, 0.006, 0.0013 y 0.0003 g/ml. Cada concentración de Ab se prueba por triplicado. Un Ab antihapteno humano, LZ1, se utiliza como Ab control negativo. Se utiliza un medio acondicionado diferente de Wnt3a para células L originales, como inductor de control negativo. Las placas se regresan a la incubadora. La actividad de luciferasa se mide en el día 3 utilizando el kit Promega Steady Glo (VWR # PAE2550-A) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los resultados se expresan en fotones por seg. Se utiliza el programa GraphPad Prism para graficar y analizar los datos. Las actividades de luciferasa se grafican como una función de la concentración de Ab para establecer curvas dosis-respuesta. Se aplica una regresión no lineal a los números para ajustar la curva y calcular las CI50.

De igual manera se determina y compara como se describe en lo anterior la capacidad de 44R24 y 18R5 para inhibir señalización Wnt en células STF. Los resultados se muestran en la figura 48 y en la tabla 14. La actividad, de 44R24 se detecta únicamente a concentraciones de Ab superiores, los que refleja la baja actividad del anticuerpo en el análisis. Se calcula la CI50 de 44R24 la cual es 13 veces menor que la de 18R5.

Tabla 14. CI50 para inhibición de señalización de Wnt en células ST-293 por 18R5 y 44R24 También se determinó la capacidad de 18R5 y 44R24 para inhibir la señalización Wnt en células A549. Las células A549 son células de carcinoma de pulmón humano en el cual se expresa en un alto nivel el gen Axin2, traduciendo actividad endógena de señalización Wnt. Axin2 es un gen objetivo Wnt bien conocido que responde a la activación de la via por regulación por aumento de su transcripción y finalmente regulación por disminución de señalización Wnt a través de un mecanismo de bucle de retroalimentación . Este sistema se utiliza para probar el impacto de los Abs antiFzd en los niveles de ARNm de Axin2 por qPCR.

Se siembran placas de 12 pozos con 30,000 células A549 por pozo y se hace crecer durante 3 días en DMEM + FBS 10%. Se agregan anticuerpos en concentraciones variadas (5, 1, 0.2, 0.04, 0.008 µq/ l) durante 24 horas y se extrae el ARN total de las células. Se utiliza como control negativo LZ1, un anticuerpo que no se une, únicamente en la concentración más alta.

Se siembran 30,000 A549 en placas de 12 pozos y se hacen crecer durante 3 días en DMEM + FBS 10%. El anticuerpo antiFZD, 18R5 o 44R24 se agrega a concentraciones variables (5, 1, 0.2, 0.04, 0.008 µg/ml) y LZ1, un anticuerpo que no se une, se utiliza como control negativo únicamente a la concentración más alta. Se elabora ARN 24 horas después del tratamiento y después se trata con Dnasa.

Se sabe que Axn2 es un gen objetivo robusto en la señalización Wnt y su nivel de expresión se examinó al realizar el análisis de expresión relativa Taqman (????) utilizando una máquina Applied Biosystems 7900 HT . Se utilizan 50 ng de ARN por punto, por triplicado y se utiliza la sonda GUSB para control endógeno. Todos los resultados se normalizan a niveles de Axin2 en la muestra control LZ1.

La curva dosis-respuesta muestra la inhibición del nivel basal de la expresión del gen axin2 por 18R5 y 44R24 y los valores CE50 calculados para los anticuerpos se muestran en la figura 49. 18R5 y 44R24 inhiben los niveles básales de Axin2 en relación al control LZ1 con eficiencias comparables.

Ejemplo 21 Evaluación de actividad antitumoral de los mAb anti-FZD en modelos de xenoinjerto pancreático Tumores pancreáticos 0MP-PN13 : Se obtienen células tumorales 0MP-PN13 congeladas que se han sometido a pasaje dos veces en ratones de un banco de tumores de Oncomed. Se recalientan e inyectan subcutáneamente en el flanco izquierdo de ratones NOD/SCID inmediatamente después del recalentamiento. Se inyectan por animal ~ 25,000 células viables. Se monitorea a los ratones semanalmente para determinar el crecimiento de tumor. Después del inicio, se mide el tamaño de los tumores una vez a la semana con un calibrador. Los ratones que presentan tumores de 200-300 mm3 se colocan en los grupos de tratamiento en donde cada uno contiene 5 animales. El tamaño de tumor promedio es comparable en cada grupo. Se inicia el tratamiento con Ab el dia después de la distribución aleatoria. Se utiliza LZ1 como Ab de control negativo. Se administran 3 dosis de 10 mg/kg de Ab via inyección intraperitoneal durante un período de 12 días. Se mata a los ratones 24 horas después de la última inyección. Se cosechan el tumor, duodeno e hígado.

Los tejidos de tumor se fijan en formalina para incrustación en parafina y se cortan. Se realiza la detección de ucl6 por inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) para monitorear la aparición de células productoras de mucina. Las mucinas son específicas para un subtipo de células diferenciadas en el páncreas y de esta manera se utilizan como marcadores de diferenciación en el modelo de tumor.

Los cortes incrustrados en parafina y fijados con formalina (FFPE, por sus siglas en inglés) se les quita la parafina. Los portaobjetos primero se les quita la parafina por tratamiento secuencial con xileno dos veces durante 5 minutos cada vez. El tejido después se rehidrata por inmersión en una serie de etanol de 100% dos veces durante 3 minutos cada una, 90% una vez durante 1 minuto, 80% una vez durante 1 minuto y 70% una vez 1 minuto en agua. El tejido se lava con agua destilada que fluye, durante 1 minuto.

Se utiliza el anticuerpo mucina 16 (clon X325 de AbCAM, catálogo ab 10033) para detección de IHC de células que expresan mucina 16 en secciones de tejido FFPE. La recuperación de antígeno inducida por calor se lleva a cabo con amortiguador citrato 10 mM, pH 6.0 en una autoclave. Los portaobjetos después se mantienen a temperatura ambiente y se permite que las proteínas recuperen antigenicidad lentamente (aproximadamente 2 horas).

Las secciones de tejido se bloquean con solución de peróxido de hidrógeno 3% en agua, se lavan y después se bloquean nuevamente utilizando solución bloqueadora de suero de caballo normal (para 50 mi; PBS (38.5 mi), NHS 10% (5 mi), BSA 1% (5 mi), gelatina 0.1% (500 µ? ) , Tx-100 0.1% (500 µ?) , NaN3 0.05% (500 µ?)) durante 1 horas a temperatura ambiente. Las secciones después se tiñen con dilución 1:200 de anticuerpo primario Maucl6 en un diluyente verde Da Vinci, pH 7.3 (PD 900, Biocare Medical) durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por tres lavados utilizando solución salina amortiguada con fosfato que contiene tritón X-100 0.1%. Las secciones se tiñen con 3 gotas de anticuerpo antilgG de ratón conjugado con HRP ImmPress (Catálogo 101098-260, VWR) durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido por tres lavados utilizando solución salina amortiguada con fosfato que contiene tritón X-100 0.1%. Los portaobjetos se colocan en cajas de petri y se revelan utilizando el kit Vector NovaRed (SK4800, Vector labs) durante 1-2 minutos. La reacción se detiene al agregar agua destilada. Los portaobjetos se enjuagan perfectamente bajo agua destilada que fluye. Las secciones de tejido después se someten a tinción contrastante utilizando hematoxilina (fórmula de Vector Labs Gill's, catálogo H3401) durante 1 minuto, se lavan y después se neutralizan utilizando una solución de tinción azul durante 30 segundos. Los portaobjetos se dejan secar durante la noche y se montan utilizando kit VectaMount (Vector Labs) .

Los campos representativos de tumores tratados con Ab control (LZ1) , 18R5 o 44R24 se muestran en la figura 50. Aunque LZ1 se asocia con tinción de baja intensidad, se detectaron niveles superiores de tinción con anticuerpo Mucl6 en los tumores tratados con 18R5. Esto sugiere que las células tumorales inducen para diferenciarse hacia la linea de células productoras de mucina por 18R5. Los niveles de Mucl6 que se tiñen en los tumores tratados con 44R24 son más moderados que en los tumores tratados con 18R5 pero aún parecen ser ligeramente mayores que los tumores tratados con LZ1 en este experimento.

Los ARN totales también se extraen de tumor, duodeno e hígado para análisis de expresión de gen objetivo Wnt utilizando qPCR.

Los tejidos se transfieren de inmediato a RNAlater (QIAGEN) en el momento de la recolección. El ARN se extrae utilizando el mini kit QIAGEN RNeasy for Fibrous Tissue (para tejido fibroso) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se envían 50 ng de ARN total a análisis de expresión de gen utilizando el procedimiento y los nativos de RT-PCR de una etapa ABI. Se utiliza la expresión del gen GusB como control endógeno. Se establecen los triplicados para cada muestra. La totalidad de los cinco tumores de cada grupo de tratamiento se analizan. Se utiliza una máquina ABI 7900 TaqMan para llevar a cabo los experimentos. Se utiliza el programa ABI SDS 2.2.1 para analizar los datos y calcular los valores ACt que se convierten en cantidades relativas. Los valores por triplicado de la totalidad de los 5 tumores se promedian para cada grupo de tratamiento. Después se calcularon los múltiplos de factores de inhibición en relación al anticuerpo control (LZ1) .

Los resultados se muestran en la tabla 15. Los genes objetivo Wnt se afectan de manera variable por los Abs antiFZD. 18R5 induce 2.3x y 8x de inhibición en tumor e hígado, mientras que permanece sin afectar en el duodeno. Los cambios inducidos por 44R24 son más moderados.

Tabla 15. Análisis de expresión de gen qPCR de los genes objetivo Wnt en tejidos tratados con 18R5 y 44R24 ND: no realizado Los experimentos separados se muestran en cursivas Tumores pancreáticos OMP-PN4 También se investigó el impacto de 18R5 en estroma de tumor en un modelo de xenoinjerto de tumor pancreático 0MP-PN4. Se identificaron varios genes por microarreglo cuyos niveles de expresión se alteraron por el tratamiento. Entre estos, ACTA2, el cual codifica para la proteina de actina de músculo liso (SMA, por sus siglas en inglés) es de interés particular. Se ha demostrado que SMA se asocia con estroma de tumor activado. Su regulación por disminución de esta manera se puede observar como un signo de disminución de fenotipo tumorigénico .

Como se describe en el ejemplo 7 anterior, se tratan ratones NOD/SCID que presentan el tumor 0MP-PN4 con Ab control (LZ-1) , 18R5, gemcitabina o la combinación de 18R5 y gemcitabina, una vez a la semana, durante 6 semanas. Los anticuerpos se administraron en una concentración de 10 mg/kg. Después de que se cosecharon, los tumores de ese experimento se analizaron para la expresión de genes objetivo Wnt a niveles tanto de ARN como de proteina, utilizando microarreglo IHC, respectivamente.

El ARN total se extrae de los tumores, se amplifica y se somete a análisis de microarreglo. Los ARN totales se amplifican utilizando el kit Ovation RNA Amplification System V2 (NuGEN, San Carlos, CA) . Los ADNc de cadena sencilla antisentido amplificado resultantes se fragmentan y se biotinan utilizando FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 (NuGEN) para uso en chips Affymetrix. Se utilizan microarreglos oligonucleotídicos Affymetrix HG-U133 plus 2 o MG 430 2.0 en estos experimentos (realizados en Almac Diagnostics, Durham, NC) . Después de hibridación, los chips de genes se lavan, se tiñen y se exploran de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA) . La calidad del ADNc y el ADNc fragmentado se analizan por espectrofotómetro y por el kit Bioanalyzer antes de hibridación del arreglo. Los datos de chip sin tratar explorados se cuantifican y se incrementan utilizando el paquete de programa GCOS (Affymetrix) y se someten a una determinación exhaustiva de control de calidad Gene Chip Quality Control recomendada por Affymetrix para detectar cualquier defecto en el chip y valores atipicos, los cuales se excluyen de los análisis de datos subsecuentes.

El ajuste del fondo de arreglo y la normalización de intensidad de señal se realizan con el algoritmo GCRMA en el programa Bioconductor de fuente abierta (www.bioconductor.org). Los genes se expresan de manera diferencial entre los dos grupos o puntos de tiempo se identificaron por la prueba t de Bayes (Cyber-T) , el cual combina la prueba t de Student con un cálculo de Bayes de la varianza intragrupo obtenida a partir de la varianza observada de los conjuntos de sonda a niveles de expresión similares (Baldi P, Long AD. A Bayesian framework for the analysis of microarray expression data: regularized t -test and statistical inferences of gene changes. Bioinformatics . 2001; 1786) : 509-19) .

Para el análisis de chip de gen de tumor humano, se analizan muestras en chips tanto de humano como de ratón para determinar los efectos de tratamiento en tumor humano a granel y en estroma de ratón, independientemente. Aquellos conjuntos de sonda Affymetrix que no son específicos de especie se omiten del análisis.

En la preparación para inmunofluorescencia de a actina de músculo liso (SMAa), el tejido de tumor se congela utilizando OCT. con secciones de 4 micrómetros que se obtienen y almacenan congeladas a -80°C. Para tinción con SMAa el tejido se fija utilizando acetona enfriada a -20°C durante 15 minutos y después se permite que se seque y se lleva a la temperatura ambiente y después se marca utilizando una pluma PAP hidrofóbica. Los cortes después se lavan utilizando solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) . El tejido se bloquea utilizando suero del caballo normal R.T.U. (Vector Labs) durante 2 horas a temperatura ambiente. La tinción del anticuerpo primario se realiza con una dilución 1:10,000 de anticuerpo a actina de músculo liso conjugado con FITC (cline 1A4 , #F3777, SIGMA) durante 1 hora. Las secciones se lavan 3 veces utilizando PBS que contiene tritón X-100 0.1%. Los portaobjetos después se secan al aire y se montan utilizando medio de montaje utilizando medio de montaje de fraguado Hard que contiene DAPI (vectashied H-500).

La figura 51A muestra los niveles de expresión del gen ACTA2 detectados por microarreglo . Los tumores tratados con anticuerpo antiFZD, 18R5, muestran niveles disminuidos de expresión de ACTA-2. La figura 51B muestra los resultados de la inmunofluorescencia de a actina de músculo liso (SMAa) en tumores OMP-PN4 tratados con mAb control (panel superior) o con 18R5 (panel inferior) . Las cantidades reducidas de SMAa se detectan en los tumores tratados con 18R5. La expresión de ACTA2 y la cantidad de SMA se reduce perceptiblemente en el estroma de tumor en respuesta a 18R5, lo que sugiere que el bloqueo de nt: (i) incide en este compartimiento del tumor, y (ii) lo hace asi al reducir un marcador de tumorigenicidad bien establecido. Estos resultados sugieren que la reducción de la activación de miofibroblastos puede ser uno de los mecanismos de acción antitumorales de 18R5.

Ejemplo 22 Evaluación del potencial tumorigénico de células OMP-PN13 positivas para Mucl6 Como se describe en lo anterior, el tratamiento con 18R5 induce la expresión de genes y cambios de fenotipo celular en tumores pancreáticos, que incluye expresión aumentada de mucina. En particular, IHC funciona sobre tumores PN-13 tratados muestra un número aumentado de células positivas a Mucl6. Los niveles de expresión del gen para Mucl6 también son mayores en tumores tratados que en tumores control. La tumorigenicidad de células positivas a ucl6 inducidas por 18R5 se determinó para probar la hipótesis de que las células positivas a Mucl6 inducidas por 18R5 son representativas de una subpoblación de células tumorales diferenciadas .

Ratones que presentan 0MP-PN13 se trataron con 18R5 de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 21. Se mató a los ratones a los 12 días después de inicio del tratamiento con Ab. Los tumores se cosecharon y procesaron para obtener una suspensión de células solas utilizando colagenasa III para digerir los tejidos. Las células estromales de ratón se tiñeron con un anticuerpo antiH-2Kd biotinado y un anticuerpo antiCD45 biotinado. Estos después se incubaron con esferas magnéticas conjugadas a estreptavidina (Thermo MagnaBind) y se suprimieron utilizando un imán Dynal. Las células tumorales suprimidas en lin resultantes se tiñeron con mAb antiMucl6 detectado con un Ab secundario conjugado a PE. Las células positivas a Mucl6 y negativas a Mucl6 se almacenaron utilizando una máquina ARIA FACS que funciona con el programa DIVA. Véase figura 52A. Las células se reinyectaron subcutáneamente en el flanco izquierdo de ratones NOD/SCID para comparación de sus potenciales tumorigénicos . Cada tipo de célula se inyectó en 10 ratones. Cada ratón recibió 75 células. Las imágenes representativas de los tumores que resultan de la inyección de células Mucl6- (panel superior) y Mucl6+ (panel inferior) se muestra en la figura 52B. Las curvas de crecimiento de tumores Mucl6- y Mucl6+ después de la inyección en los ratones se muestran en la figura 52C. No creció tumor después de la inyección de células Mucl6+ mientras que 7 de los 10 ratones a los que se les inyectó células Mucl6- desarrollaron tumores. Los datos sugieren que las células Mucl6+ inducidas por 18R5 son no tumorigénicas , lo que fundamenta la inducción de diferenciación como un mecanismo subyacente de actividad antitumoral de 18R5.

Ejemplo 23 Estudios in vivo adicionales con anticuerpos anti-FZD Estudio de recurrencia de tumor de mama PE13 con mAb 18R5: Se inyectaron células de tumor de mama PE13 en ratones NOD-SCID para crecer hasta que los tumores han alcanzado aproximadamente 100 mm3. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (n = 10) y se les suministró taxol (15 mg/kg, dos veces a la semana) + anticuerpo control (cuadros negros) o la misma dosis de taxol + antiFZD 18R5 (circuios gris claros) los anticuerpos se dosificaron a 20 mg/kg una vez a la semana. Los tratamientos con taxol se detuvieron en el día 70 y los tratamientos con anticuerpo continuaron. Los resultados se muestran en la figura 53. Se observó que 18R5 incrementa la tasa de regresión tumoral y retrasa la recurrencia de tumor después de detener el tratamiento con taxol.

Estudio de análisis de dilución limitante (LDA) de tumor de mama PE13 con mAb 18R5: animales que presentan tumores de mama PE13 se trataron ya sea con anticuerpo control (circuios grises), 18R5 (triángulos blancos), taxol (circuios negros) o la combinación de taxol y 18R5 (cuadros blancos). Se dosificó taxol a 15 mg/kg dos veces a la semana y los anticuerpos se dosificaron a 20 mg/kg, una vez a la semana. Se cosecharon los tumores y las células tumorales humanas se purificaron por supresión lin. Se inyectaron 50, 150 ó 500 células tumorales en un grupo nuevo de ratones (n = 10 por dosis de célula) . Los resultados se muestran en la figura 54. La frecuencia de crecimiento de tumor se monitoreó después de 59 días y se utilizó para calcular la frecuencia CSC (L-calc) .

Estudio de recurrencia de tumor pancreático PN4 con mAb 18R5: se inyectaron células tumorales pancreáticas PN4 en ratones NOD-SCID y se permitió que crecieran hasta que los tumores alcanzaron aproximadamente 250 mm3. A los animales se les suministró gemcitabina (75 mg/kg, una vez a la semana) durante 5 semanas hasta que los tumores remitieron. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos y se les proporcionó anticuerpo control (cuadros negros) o antiFZD 18R5 (círculos gris claro) . Los anticuerpos se dosificaron a 10 mg/kg, una vez a la semana. Los resultados se muestran en la figura 55. Se observó que 18R5 retrasa la recurrencia de tumor después de tratamiento con gemcitabina.

Estudios de crecimiento de tumor pancreático PN4 con mAb 44R24: Se inyectaron tumores pancreáticos PN4 en ratones NOD-SCID. Se permitió que los tumores crecieran hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 150 mm3. Los animales se distribuyeron de manera aleatoria en 4 grupos (n = 10 por grupo) y un anticuerpo control dado (cuadros negros) , antiFZD5/8 44R24 (triángulos gris claro) , gemcitabina (triángulos negros) o una combinación de 44R24 más gemcitabina (círculos gris claro) . Se dosificó gemcitabina a 15 mg/kg una vez a la semana y los anticuerpos se dosificaron a 20 mg/kg, dos veces a la semana. Los resultados se muestran en la figura 56. Se observó que 44R24 reduce el crecimiento de tumor en combinación con gemcitabina en relación a gemcitabina sola.

Ejemplo 24 Mapeo de epitopo de anticuerpo anti-FZD 44R24 El mapeo de epitopo para el anticuerpo antiFZD 44R24 se realizó de una manera similar a la descrita en lo anterior en el ejemplo 5 para los anticuerpos 18R8 y 18R5. Se determinó por citometría de flujo la capacidad de 44R24 para unir un epitopo similar a que 18R8, utilizando una serie de variantes de aminoácidos de FZD8 que previamente se ha demostrado que interrumpe la unión de 18R8 (véase ejemplo 5 y figura 6 y figura 7). Se encontró que los aminoácidos 126-127 de FZD8 se requieren para unión de 44R24, como se indica por tinción reducida dentro de una población de células cotransfectada (positivas a GFP).,Los resultados de los experimentos de FACS se muestran en la figura 57. Estos resultados muestran que 44R24 se une a un epitopo que se superpone con el epitopo de 18R8 y que comprende los aminoácidos 126-127 compartidos.

Ejemplo 25 Estudio de crecimiento de tumor de colon C28 con anticuerpos anti-FZD 18R5, 18R8 y 44R24 Se inyectaron subcutáneamente células tumorales C28 en ratones NOD-SCID. Se permitió que los tumores crecieran hasta que alcanzaron un volumen promedio de 126 mm3. Los animales que presentan el tumor fueron grupos que se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 10 ratones por grupo) y se trataron ya sea con Ab control (cuadros negros), 18R8 (triángulos grises), 44R24 (circuios negros) o 18R5 (circuios grises) (figura 58) . Los anticuerpos se dosificaron intraperitonealmente a 15 mg/kg, dos veces a la semana. Se indican los volúmenes de tumor. El tratamiento con los anticuerpos 44R24 y 18R5 reduce el crecimiento en relación al grupo control mientras que 18R8 no tiene efecto (figura 58 ) .

Después del tratamiento de los animales en el experimento que se muestra en la figura 58, los tumores se cosecharon, se fijaron en formalina, se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones de 5 micrómetros. Las secciones de tumor se analizaron para expresión de citoqueratina 7, un marcador de diferenciación de células de colon por inmunohistoquimica (kit Vectastain, Vector Labs). La expresión de citoqueratina 7 se observa que está elevada después del tratamiento con 44R24 o 18R5 (figura 59) .

Ejemplo 26 Producción y Purificación de 18R5 Una linea de células recombinantes derivadas de CHO que expresa el anticuerpo 18R5 se produjo usando métodos estándares conocidos para uno de habilidad en el ámbito. Para producción y purificación de anticuerpo, la linea de célula se cultivó usando un proceso de cultivo de célula de biorreactor de alimentación por lotes y se hizo crecer en medio libre de suero y químicamente definido. El proceso de cultivo celular se corrió por aproximadamente 10-15 días e incluye un cambio de temperatura de 37 °C a 34 °C a aproximadamente 5 días posteriores a la inoculación.

El anticuerpo 18R5 se purificó en un esquema de purificación de etapas múltiples. Primero, se purificó el fluido de cultivo celular recolectado (HCCF, por sus siglas en inglés) de los biorreactores por cromatografía de afinidad usando MabSelect SuRe™ (GE Healthcare Life Sciences) . El HCCF se aplicó a la columna MabSelect SuRe™ a 25-30 gramos de proteína por litro de resina y la columna se lavó subsecuentemente tres veces. El anticuerpo 18R5 unido se eluyó de la columna con lOOmM de glicina-HCl (pH 3.2). El eluato que contiene 18R5 se mantuvo a un pH bajo por 1 hora a temperatura ambiente por inactivación viral, seguido por un ajuste del pH a aproximadamente 6.5 usando 1M de amortiguador Bis-Tris (pH 8.5) . El eluato entonces se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y almacenó a 2-8°C hasta la siguiente etapa de purificación.

Segundo, el eluato que contiene 18R5 se sometió a cromatografía de intercambio catiónico usando resina Capto Q (GE Healthcare Life Sciences). El anticuerpo 18R5 fluyó a través de la columna Capto Q y se recolectó, mientras las impurezas se unieron a la columna y se eliminaron de la combinación 18R5. El flujo por combinación que contiene el anticuerpo 18R5 se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y almacenó hasta la siguiente etapa de purificación.

Tercero, el flujo por combinación que contiene 18R5 se sometió a cromatografía de hidroxiapatito cerámico (CHT, por sus siglas en inglés) en una columna tipo I CHT envasada (BioRad Laboratories) . El anticuerpo 18R5 e impurezas restantes se unieron a la columna CHT. La columna se lavó dos veces con amortiguadores bajos en sales (0-100 mM de NaCl) que contienen 5-10% de polietilenglicol (PEG) . El anticuerpo 18R5 se eluyó de la columna con un amortiguador alto en sal (400-1000 mM de NaCl) que contiene 5-10% PEG y recolectó. Se usó ultrafiltración y diafiltración de flujo tangencial para intercambiar el amortiguador de elución alto en sal con un amortiguador que comprende histidina, NaCl y sacarosa. El anticuerpo 18R5 purificado se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y almacenó a 2-8°C para uso futuro.

Ejemplo 27 Residuos dentro del sitio de unión OMP-18R5 impactan la unión Wnt Como se señaló anteriormente, el anticuerpo 18R5 se une a los receptores Encrespados por interacción via un epitopo discontinuo. La superficie del receptor FZD dentro del área de unión 18R5 contiene una hendidura, aparente en la estructura cristalina de FZD (Figura 9 y Figura 60A) . Los residuos de aminoácido dentro de la hendidura del BBS de cada uno de los receptores FZD humanos se proporcionan en la Tabla 16. Los residuos de tal linea base de esta hendidura presentan particularmente alta conservación entre miembros de la familia FZD sugiriendo importancia funcional. 18R5 que une FZD bloquea la interacción de Wnt a FZD demostrando que la región es funcionalmente relevante para señalización Wnt. Para analizar además la importancia de residuos dentro de esta región de unión en FZD8, los residuos seleccionados que alinean la hendidura, se mutaron a residuos alternativos (Figura 60B) . (En algunas modalidades alternativas, los residuos análogos dentro de otro FZD humano, ya identificado en la Tabla 17 abajo, pueden preferentemente ser usados en un método de cribado, como pueden otros residuos dentro del BBS) . La capacidad de los receptores FZD que contienen estas sustituciones para unirse a nt3A fue entonces analizada (Figura 60C) . Cada una de las sustituciones reduce mayormente la capacidad de Wnt para unirse a los receptores FZD confirmando la importancia de esta región del receptor FZD en la mediación de interacción Wnt.

Tabla 16. Residuos de aminoácido en "hendidura" de los Sitios de Unión Biológica (BBS) de receptores FZD.

Tabla 17. Posición de aminoácido de residuos análogos mutantes en los receptores FZD humanos Ejemplo 28 Identificación de péptidos de molécula pequeña que unen la región de unión Wnt de FZD Para identificar péptidos de molécula pequeña se unen a FZD se cribaron bibliotecas peptidicas (Ph.D. sistema de biblioteca de péptido de despliegue de fago, New England Biolabs) . Las bibliotecas se cribaron usando el método URSA (Selección Ultra Rápida de Anticuerpos) usando FZD8-Fc recombinante unido a perlillas de proteina A. Después de tres rondas de enriquecimiento, se probaron clones individuales para unión a FZD. Como se muestra en la Figura 61, se identificaron péptidos que se unen a FZD pero no a una proteina de control irrelevante (DLL4-Fc) , demostrando que interactúan específicamente con FZD. Los clones positivos representativos son resaltados por flechas. Se determinaron secuencias de los péptidos de unión FZD. Se aislaron ambos péptidos lineales de una biblioteca de péptidos 12-mer y péptidos cíclicos de una biblioteca comprendida de siete aminoácidos aleatorios flanqueados por residuos de cisteína. Como se muestra en la Figura 62, los péptidos cíclicos despliegan secuencias similares pero distintas que sugieren que adoptan estructuras similares y demuestran una clara secuencia consenso.

Para examinar si cualquiera estos péptidos unión FZD interactúan con FZD a través del BBS, se examinó capacidad de los péptidos para interactuar con FZD con sustituciones de aminoácido que se muestran en los experimentos descritos arriba en el Ejemplo 27 (Fiqura 60°C) para impactar la unión Wnt. Como se muestra en la Figura 63, se identificaron péptidos de unión FZD que específicamente interactúan con FZD dentro de la región de unión Wnt. Diversos péptidos presentan unión mayormente reducida o eliminada al FZD cuando se introduce una sustitución de aminoácido dentro de la región de hendidura, demostrando la capacidad para identificar moléculas pequeñas que interactúan con esta región.

Ejemplo 29 Inhibición de señalización Wnt por moléculas pequeñas que unen la región de unión Wnt de Encrespado Para examinar si los péptidos que unen el dominio extracelular FZD e interactúan con la región BBS son capaces de impactar la señalización Wnt, se condujeron análisis del reportero Wnt. Dos péptidos se sintetizaron químicamente que contienen la secuencia de los clones #2 y #24. El análisis de reportero Wnt utiliza un reportero de luciferasa 8xTCF que es inducible por proteínas Wnt endógenas que activan la señalización Wnt canónica. Como se muestra en la Figura 64, péptidos pequeños que se unen a la proteína FZD fueron capaces de inhibir la capacidad de las células HEK293 para responder a Wnt3A.

Ejemplo 30 Identificación de moléculas pequeñas no peptidicas que unen a la región de unión Wnt del BBS FZD Existen muchas formas en las cuales uno puede identificar moléculas pequeñas que se unen a la reqión de unión Wnt de los receptores FZD. En un procedimiento, se puede hacer uso de péptidos que se unen dentro del BBS, o más específicamente, la región de hendidura de FZD para permitir los cribados rápidos y de alto rendimiento de bibliotecas químicas de molécula pequeña. Como un ejemplo no limitante, el péptido puede ser etiquetado con un reportero conveniente (por ejemplo, radioetiqueta, etiqueta fluorescente, o etiqueta FRET) . El péptido etiquetado puede entonces ser dejado para unirse a la proteína FZD. El complejo de péptido-FZD puede entonces dejarse interactuar con un compuesto de prueba de una biblioteca de molécula pequeña y se puede medir la capacidad de la molécula pequeña para desplazar el péptido del receptor FZD o competir con el péptido para unión a la proteína FZD. En tal manera, uno es capaz de identificar moléculas pequeñas que se unen específicamente a la proteína FZD dentro de la región de unión deseada.

Ejemplo 31 Tratamiento de enfermedad renal poliquistica con 18R5 La capacidad de 18R5 para tratar enfermedad renal poliquistica (PKD) puede ser demostrada en modelos murina de PKD. Existen varios modelos murina de PKD los cuales reflejan las mutaciones subrayadas observadas en PKD humano y demuestran la patología muy comparable a la enfermedad humana (referencias abajo) . Diversos de estos modelos involucran alteración en los niveles de expresión de ya sea el gen PKD1 el cual codifica policistinal (PCI) o el gen PKD2 el cual codifica policistina2 (PC2). Estos genes son mutados en casi todos los casos humanos de enfermedad renal poliquística . Utilizando tal modelo, se tratan ratones que poseen expresión alterada de PKD1 o PKD2 (y son subsecuentemente propensos para desarrollar PKD) por administración de 18R5 vía inyección IP a una dosis de 15 mg/kg dos veces por semana. Después de un mes de tratamiento se puede observar mejoramiento en la función renal con relación a ratones de control no tratados con 18R5. Esta función mejorada se manifiesta por tamaño reducido y abundancia de quistes renales, proliferación reducida de células epiteliales renales ya medibles por tinción 1HC ki-67 de secciones de tejido, y función renal mejorada ya medida por concentraciones de urea en sangre reducida. Referencias relevantes incluyen Happé et al., Hum Mol Genet. 2009 Jul 15; 18 (14) : 2532-42, Kim et al., J Am Soc Nephrol . 2009 Dec; 20 (12) :2556-69, y Kurbegovic et al., Hum Mol Genet. 2010 Abril 1; 19 (7 ): 1174-89, cada una de las cuales es de este modo incorporada por referencia aquí en su totalidad.

Ejemplo 32 Esquema de Purificación Adicional por Anticuerpo Monoclonal 18R5 Se produjo una linea de célula recombinante derivada de CHO que expresa el anticuerpo 18R5 usando los métodos estándares conocidos por uno de experiencia en el ámbito. Para producción y purificación de anticuerpo, la linea celular se cultivó usando un proceso de cultivo celular de biorreactor de alimentación por lotes y se hizo crecer en medio libre de suero y químicamente definido. Los procesos de cultivo celular se corrieron por aproximadamente 10-15 días e incluyen un cambio de temperatura de 37 °C a 34 °C a aproximadamente 5 días posteriores a la inoculación.

El anticuerpo 18R5 se purificó en un esquema de purificación de etapas múltiples. Primero, el fluido de cultivo celular recolectado (HCCF) de los biorreactores se purificó por cromatografía de afinidad usando MabSelect SuRe™ (GE Healthcare Life Sciences) . El HCCF se aplicó a la columna MabSelect SuRe a 25-30 gramos de proteína por litro de resina y la columna se lavó subsecuentemente tres veces. El anticuerpo 18R5 unido se eluyó de la columna con lOOmM de glicina-HCl (pH 3.2). El eluato que contiene 18R5 se mantuvo a pH bajo por 1 hora a temperatura ambiente para inactivación viral, seguido por un ajuste del pH a aproximadamente 6.75-6.85 usando 0.5-1M de amortiguador Bis-Tris (pH 8.5). El eluato entonces se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y almacenó a 2-8°C hasta la siguiente etapa de purificación.

Segundo, el eluato que contiene 18R5 se sometió a cromatografía de intercambio aniónico usando resina Capto Q (GE Healthcare Life Sciences) . El anticuerpo 18R5 que fluyó a través de la columna Capto Q y se recolectó, mientras las impurezas, tales como agregados, se unieron a la columna y se removieron de la combinación 18R5. El flujo por combinación que contiene el anticuerpo 18R5 se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y almacenó hasta la siguiente etapa de purificación .

Tercero, el flujo por combinación que contiene 18R5 se sometió a cromatografía de hidroxiapatito cerámico (CHT) en una columna tipo I CHT envasada (BioRad Laboratories) . El anticuerpo 18R5 e impurezas restantes, tales como agregados, se unieron a la columna CHT. La columna se lavó dos veces con amortiguadores bajos en sal (0-100mM de NaCl) que contienen 0-10% de polietilenglicol (PEG) . El anticuerpo 18R5 se eluyó de la columna con un amortiguador alto en sal (400-1000mM de NaCl, tal como, por ejemplo, 546mM) que contienen 10-13% de PEG (tal como, por ejemplo, 12.5% de PEG) y recolectó. Se usaron ultrafiltración y diafiltración de flujo tangencial para intercambiar el amortiguador de elusión alto en sal con un amortiguador que comprende histidina y NaCl. Después de la diafiltración, la solución que contiene 18R5 se diluyó con un amortiguador excipiente que comprende histidina, NaCl, sacarosa y polisorbato-20. El anticuerpo 18R5 purificado se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y almacenó a 2-8°C, o congeló a -65°C o por debajo, para uso futuro.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes, sitios de Internet y números de acceso/secuencias de base de datos (que incluyen secuencias polinucleotidicas y polipeptidicas ) mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos en la misma medida asi cada publicación, patente, solicitud de patente, sitio de Internet o número de acceso/secuencia de base de datos individual fuera indicada de manera especifica e individual para ser incorporada de esta manera como referencia. Además, la Solicitud de Patente Estadounidense No. 12/568,534, presentada el 28 de Septiembre de 2009, la cual se publicó como la Solicitud de Patente Estadounidense No. 2010/0104574, está de este modo incorporada por referencia en la presente en su totalidad.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las reivindicaciones:

1. Un polipéptido aislado que comprende el dominio Fri de un receptor encrespado humano, caracterizado porque el dominio Fri comprende una o más sustituciones en el Sitio de Unión Biológica (BBS) , con relación a un dominio Fri de tipo nativo .

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una afinidad de unión reducida a un Wnt, con relación a un polipéptido que comprende el dominio Fri de tipo nativo del receptor encrespado .

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el Wnt es Wnt3A.

. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el dominio Fri de tipo nativo comprende un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 117-126.

5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el dominio Fri de tipo nativo comprende un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs. 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, y 64.

6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una sustitución en el sitio de un residuo de hendidura seleccionado de la Tabla 16.

7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una o más sustituciones comprenden una o más sustituciones en un sitio seleccionado de la Tabla 17.

8. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una o más sustituciones comprenden un residuo de aminoácido que es menos hidrofóbico que el aminoácido en el sitio correspondiente de la secuencia de dominio Fri FZD de tipo nativo .

9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende además una región Fe.

10. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el receptor FZD humano es FZD4, FZD5, o FZD8.

11. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el receptor FZD humano es FZD8.

12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque una o más sustituciones comprenden una sustitución en F72, L75, 178, o L121.

13. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque una o más sustituciones comprenden una sustitución en L75.

14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque una o más sustituciones comprenden F72Y, L75S, I78S, o L121S.

15. Un método de cribado de un compuesto para posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt, caracterizado porque comprende: determinar la afinidad de unión de un compuesto para un primer polipéptido el cual es el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes ; determinar la afinidad de unión del compuesto para un segundo polipéptido que comprende el dominio Fri de tipo nativo; y comparar la afinidad de unión del compuesto para el primer polipéptido con la afinidad de unión del compuesto para el segundo polipéptido, en donde si el compuesto tiene mayor afinidad para el segundo polipéptido que el primer polipéptido, el compuesto se identifica como un posible inhibidor de señalización Wnt.

16. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que es por lo menos aproximadamente 80% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs:98-lll y SEC ID NOs:113-116.

17. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-112.

18. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende la SEC ID NO: 112.

19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende la SEC ID NO: 108.

20. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque consiste esencialmente de un péptido cíclico seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 98-112.

21. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque consiste esencialmente del péptido cíclico de la SEC ID NO: 108.

22. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs:113-116.

23. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque consiste esencialmente de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 113-116.

24. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-19 y 22, caracterizado porque es menos de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud.

25. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque es desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 aminoácidos de longitud.

26. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-25, caracterizado porque es un polipéptido modificado.

27. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque es etiquetado.

28. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-27, caracterizado porque es un inhibidor de señalización Wnt .

29. Un agente caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-28.

30. Un método de cribado de un compuesto para posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt, caracterizado porque comprende: determinar si el compuesto puede competir con el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-28, para unión a un receptor FZD humano, en donde la capacidad del compuesto para competir por unión con el polipéptido indica que el compuesto tiene posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt.

31. Un método de cribado de un compuesto para posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt, caracterizado porque comprende: determinar si el compuesto puede desplazar el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-28, del BBS del receptor FZD humano, en donde la capacidad del compuesto para desplazar el polipéptido indica que el compuesto tiene posible actividad como un inhibidor de señalización Wnt.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30 ó 31, caracterizado porque el receptor FZD humano es FZD8.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-32, caracterizado porque el receptor FZD humano está en forma insoluble.

34. Un agente caracterizado porque es identificado por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 y 30-33.

35. Un agente aislado que se une a un receptor FZD humano, caracterizado porque el agente tiene afinidad de unión reducida para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, con relación a su afinidad de unión para un polipéptido que comprende el dominio Fri de tipo nativo de un receptor FZD humano.

36. Un agente aislado caracterizado porque compite para unión a un receptor FZD humano con un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-28.

37. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-36, caracterizado porque el receptor FZD humano es FZD8.

38. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-37, caracterizado porque comprende un polipéptido .

39. El agente de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende un anticuerpo.

40. El agente de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque no es un anticuerpo.

41. El agente de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el polipéptido es de menos de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud.

42. El agente de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el polipéptido es desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 aminoácidos de longitud .

43. El agente de conformidad con cualquiera de las rei indicaciones 38-42, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido modificado.

44. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-37, caracterizado porque comprende un lipido .

45. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-44, caracterizado porque tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2000 Daltones.

46. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-45, caracterizado porque inhibe la unión de un Wnt a un receptor FZD humano.

47. El agente de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el Wnt es Wnt3a.

48. El agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-47, caracterizado porque inhibe la señalización Wnt canónica.

49. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el polipéptido o agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-29 y 34-48.

50. Un método para inhibir la señalización Wnt en una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva del polipéptido o agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-29 y 34-48.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la señalización Wnt es señalización Wnt canónica.

52. Un método para inducir diferenciación de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva del polipéptido o agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-29 y 34-48.

53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50-52, caracterizado porque la célula es una célula tumoral.

54. Un método para inhibir el crecimiento de un tumor, caracterizado porque comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva del polipéptido o agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-29 y 34-48.

55. Un método para tratar una enfermedad asociada con la activación de señalización Wnt caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva del polipéptido o agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-29 y 34-48.

56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la enfermedad es cáncer

57. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la enfermedad es enfermedad renal poliquistica .

58. Un método para tratar enfermedad renal poliquistica caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un agente que se une al BBS de un receptor FZD humano.

59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el agente es 18R5.

60. Un método para reducir la tumorigenicidad de un tumor, caracterizado porque comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva del polipéptido o agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-29 y 34-48.