JP2000515364A

JP2000515364A - 標識した活性化腫瘍特異的ｔ細胞の生産方法および腫瘍療法におけるそれらの使用

Info

Publication number: JP2000515364A
Application number: JP09534912A
Authority: JP
Inventors: カソラティ，ギウリア; デラボナ，パオロ
Original assignee: サイエンスパークラフソチエタペルアツィオニ
Priority date: 1996-03-30
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2000-11-21
Also published as: US6399054B1; DE69713336T2; ES2177964T3; WO1997037004A1; EP0914416B1; AU2160297A; CA2250394A1; EP0914416A1; DE69713336D1

Abstract

(57)【要約】ある患者からの腫瘍細胞とその患者からのＴ細胞とを生体外で共生培養することにより活性化腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する方法であって、ｉ）前記腫瘍細胞を、Ｂ７タンパク質と生物学的結合ペアの一方の相手とから得られた第一の融合タンパク質、および細胞表面抗原に対する抗体と前記生物学的結合ペアのもう一方の相手とから得られた第二の融合タンパク質と共にインキュベートし；ii）前記インキュベーションの前または後に前記腫瘍細胞の増殖を抑制し；iii）Ｔ細胞の活性化が得られるまで、前記腫瘍細胞を活性化すべきＴ細胞と一緒に共生培養し；そしてiv）活性化Ｔ細胞を腫瘍細胞から分離するという段階を含んでなる方法は、高い効率であり且つ単純なやり方で実施することができる。

Description

【発明の詳細な説明】標識した活性化腫瘍特異的Ｔ細胞の生産方法および腫瘍療法におけるそれらの使用本発明は、患者からの腫瘍細胞をその患者のＴ細胞と一緒に共生培養することによる標識した活性化腫瘍特異的Ｔ細胞の生産方法、そのような活性化Ｔ細胞を含有する治療用組成物、並びに腫瘍療法におけるそれの使用に関する。腫瘍特異的Ｔリンパ球は、腫瘍細胞により合成されＭＨＣ分子によりその細胞表面上に提示されるタンパク質由来のペプチドを認識する〔Lurquin他、Cell 58 （1989）293およびHellstrom，K.E．他、The Biologic Therapy of Cancer，J.B ．Lippincot Co.，Philade-lphla(1991)，35頁〕。しかし、Ｔ細胞は十分なエフェクター機能を発現するのに２つの活性化シグナルを必要とする〔Mueller，D.L ．他、Annu．Rev．Immunol．7（1989）445〕。シグナル１は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）がＭＨＣペプチド複合体と相互作用すると生成される。シグナル２は、専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現される共同刺激分子により提供される。多くの腫瘍、特に非造血系起源の腫瘍は、共同刺激分子を発現せず、故に腫瘍特異的Ｔリンパ球を活性化することができない〔Chen，L.他、Immunol．Today 14（1993）483〕。この知見により、共同刺激分子をコードする遺伝子を腫瘍細胞に導入してそれらの免疫原性と予防接種能力を高めるための理論的原理が得られた。種々の共同刺激分子のうち、Ｂ７タンパク質（例えばＢ７−１，Ｂ７−２およびＢ７−３）は、それらが専門的ＡＰＣ上に発現されるために特に着目されている〔Vandenberghe，P.他、Int．Immunol. 3（1993）229；Guinan，E.C．他、Blood 84（1994）3261-3282；WO 95/03408〕。それらの共同刺激分子は大部分のＴ細胞上に発現されるＣＤ28およびＣＴＬＡ４カウンターレセプターと相互作用して、ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞のＩＬ −２生産、増殖およびエフェクター機能の獲得の著しい増大をもたらす〔Azuma ，M．他、J．Immunol．115（1993）2091〕。Ｂ７と可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇキメラ分子との連結を阻止することは、試験管内では不応答性を引き起こし、生体内では体液性免疫反応や移植片拒絶に対する大きな抑制効果を有する。その上、種々のマウス腫瘍系へのＢ７−１遺伝子のトランスフェクションが、それらの一次拒絶と防御免疫の確立の両方を導き得る場合があることが示されている〔Chen， L.他、J．Exp．Med．179（1994）523およびRamarathinam，L.他、J．Exp．Med． 179（1994）1205〕。しかしながら、これらの研究は、Ｔ細胞依存性腫瘍免疫に対するＢ７−１活性が限定された効率を有することを明らかにした。抗腫瘍Ｔ細胞のＢ７共同刺激の効率はＢ７とＩＣＡＭ−１との協力により増強され、それによって効率的な腫瘍特異的免疫応答が刺激される。この効果は有力な炎症反応の漸増により左右される〔Cavallo，F．他、Eur．J．Immunol．25（1 995）1154-1162〕。Ｂ７分子群は、ＡＰＣ上に発現されるＣＤ28カウンターレセプターである。Ｂ７−１はFreeman，G.J．他、J．Immunol．143（1989）2714-2722により特徴づけられ且つ配列決定されている。Ｂ７−２とＢ７−３は、Freeman，G.J.，Science 262（1993）909-911およびWO 95/03408において特徴づけられ且つ配列決定されている。Ｂ７分子は２つのＩｇ様領域（ＩｇＶとＩｇＣ）と１つの膜貫通領域を有するＩｇスーパージーンファミリーの一員である。Ｂ７分子は細胞表面上にモノマーとしてまたはホモダイマーとして存在すると示唆されているが、あるとしても非常にわずかな証拠であるが、それがＣＤ28と共にヘテロダイマーを形成し得ることを示唆している〔Lindsten，T.他、J．Imm unol．151（1993）3489〕。Ｂ７分子はＣＤ28よりもＣＴＬＡ−４に対する方がより高い親和力を有する。Ｂ７−１分子とＢ７−２分子の両遺伝子は染色体領域 3q13.3−3q21に位置づけられている。それらの分子はＤＮＡレベルでは相同性があまり高くなかったが、上述した通り、それらは同じＩｇスーパージーンファミリー構造並びにＣＤ28およびＣＴＬＡ−４への結合能力を共有している。しかしながら、Ｂ７−１とＢ７−２はＢ細胞活性化後の出現が異なることがわかった。Ｂ７−２はＢ細胞活性化から24時間以内に細胞表面上に現れ、一方Ｂ７ −１はそれより後に現れる〔Boussiotis，V.A.他、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 19（1993）11059〕。更に、未刺激のヒト単核細胞ではＢ７−２が構成的に発現されるのに対して、Ｂ７−１は活性化後に誘導発現されることがわかった〔Azum a，M.他、Nature 366（1993）76〕。Ｂ７−３もBoussiotis他により記載されている。Ｂ７−３はまだ分子クローニングされていない。 WO 95/03408には、腫瘍細胞表面上へのＢ７の発現に適当な形のＢ７をコードする核酸を使って腫瘍細胞をトランスフェクションすることにより、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を発現するように腫瘍細胞を変更することが示唆されている。あるいは、腫瘍細胞表面上へのＢ７の発現を誘導または増強する物質との接触により腫瘍細胞が変更される。更に、腫瘍細胞の表面にＢ７−２および／またはＢ７−３をカップリングすることにより、変更された腫瘍細胞を生産することも示唆されている。WO 95/03408において使われている「カップリングする」という語は、共同刺激分子（Ｂ７）が腫瘍細胞の表面上に存在し且つそれがＴ細胞に対する共同刺激シグナルを触発することができるように、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細胞に結合せしめる化学的、酵素的または他の手段（例えば抗体）のことを言う。更に、市販の架橋試薬を使って化学的にＢ７を腫瘍細胞に架橋結合することが示唆されている。別のアプローチは、共同刺激分子Ｂ７と腫瘍細胞上の細胞表面分子の両方に結合するＢ７特異的抗体により、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細胞にカップリングすることである。活性化腫瘍特異的Ｔ細胞の生産は、腫瘍細胞がその表面上に上述のような共同刺激分子を担持している患者からの腫瘍細胞を、その患者からのＴ細胞と一緒に共生培養（co-cultivation）することにより達成することができる。しかしながら、既知の方法に従ってそのような腫瘍細胞をＢ７により改変することは多くの欠点を有し、日常療法にはむしろ不適当である。共同刺激分子をコードする核酸により腫瘍細胞をトランスフェクトする方法は、一般にあまり効果的ではない。これに加えて、活性化Ｔ細胞との共生培養の前に、トランスフェクトされた細胞とトランスフェクトされなかった細胞とを分離する面倒な作業が必要である。Mc Hugh，R.S.他、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92（1995）8059-8063は、同族リガンドＣＤ28に結合することができ且つＢ７−１自身を腫瘍細胞膜の中に取り込むことができる、精製したＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）固定Ｂ７−１分子を使って、腫瘍細胞の表面上にＢ７−１を導入することを提案している。しかしながら、放射線照射した腫瘍細胞の表面上のＧＰＩ−Ｂ７分子は安定性が限られており、該細胞はＣＤ28に効率的に結合することができるＢ７分子の最小限の提示しか保持しない。共同刺激分子と腫瘍細胞表面分子の両者と結合するＢ７特異的抗体を使うことによる腫瘍細胞へのＢ７のカップリングも、重大な欠点を有する。技術の現状で記載されているＢ７抗体は、残念なことに、ＣＤ28へのＢ７の結合が大幅に減少するかまたは完全に抑制されるような形でＢ７に結合する。この理由は、全ての既知の抗Ｂ７−１および抗Ｂ７−２モノクローナル抗体がＣＤ28と相互作用し、かくしてＴ細胞応答を阻害するためである〔Azuma，M ．他、J．Exp．Med．175（1992）353-360；Azuma，M.他、J．Immunol．149（199 2）1115;Azuma，M．他、J．Exp．Med．177（1993）845；Caux，C.他、J．Exp．M ed．180（1995）1841-1847〕。従って、本発明の目的は、単純なやり法で実施でき且つ高い効果を示すことのできる、活性化腫瘍特異的Ｔ細胞の生産方法を提供することである。本発明の主題は、患者からの腫瘍細胞とその患者からのＴ細胞とを生体外で共生培養することによる活性化腫瘍特異的Ｔ細胞の生産方法であって、次の段階：ｉ）前記腫瘍細胞を、Ｂ７タンパク質と生物学的結合ペアの一方の相手とから得られた第一の融合タンパク質、および細胞表面抗原に対する抗体と前記生物学的結合ペアのもう一方の相手とから得られた第二の融合タンパク質と共にインキュベートし； ii）前記インキュベーションの前または後に前記腫瘍細胞の増殖を抑制し； iii）Ｔ細胞の活性化が得られるまで、前記腫瘍細胞と活性化しようとするＴ細胞とを共生培養し； iv）活性化Ｔ細胞を前記腫瘍細胞から分離するを含んで成る方法である。患者のＴ細胞は、正常ヒト血液試料のバフィコートから調製した末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）から単離される〔Dellabona，P．他、J．Exp．Med．177（1993） 1763-1771〕。遠心後、単核細胞を収集しそして増殖させる〔Dellabona，P．他、J．Exp．Med．177（1993）1763-1771 〕。この調製物から、磁気標示式細胞選別法（ＭＡＣＳ）によりＣＤ４⁺および／またはＣＤ８⁺リンパ球を単離することができる。活性化に使用するＴ細胞は、既知の方法に従って、好ましくはＢ細胞と単核細胞を除去するナイロンウールカラムへのＰＢＭＣの単純通過により〔Julius，M. H.他、Eur．J．Immunol．3（1973）645〕患者から得ることができる。ＣＤ８⁺（ＣＤ４⁺有または無）Ｔ細胞を、患者の末梢血から、細胞選別法、好ましくは免疫磁気選別法により、試験管内で精製する。加えて、Anichini，A.他、J．Exp． Med．177（1993）989に従って外科的腫瘍試験片から得られる腫瘍浸潤性Ｔ細胞（ＴＩＬ）と精製ＣＤ８⁺Ｔ細胞の混成集団を使用することが好ましい。「活性化腫瘍特異的Ｔ細胞」という言い方は、好ましくは、活性化するのに最初に使用した腫瘍細胞を特異的で且つ制限された方法で撲滅することができる腫瘍特異的Ｔ細胞を意味する。活性化はTownsend，A.およびBodmer，H.，Ann．Rev ．Immunol．7（1989）601の意味でＭＨＣ拘束される。腫瘍特異的Ｔ細胞の作製：全ＰＢＭＣまたは精製ＣＤ８⁺Ｔ細胞のいずれかを、自己由来かまたは半一同種異系のいずれかである非複製性腫瘍細胞（放射線照射処理したものか、マイトマイシンＣ処理したものかまたは両処理をしたもの）と共に10：１〜５：１の比で、24ウエルプレート中で５％ヒト血清を含む標準ＲＰＭＩ培地２ml中で37℃にて培養する。２〜５百万個（２〜５×10⁶個）のRBMC または１〜２百万個（１〜２×10⁶個）のＣＤ８⁺Ｔ細胞を含有する多重培養物をセットすることができる。腫瘍細胞を飽和濃度（異なる種類の構成物によって決定される）の可溶性Ｂ７−１またはＢ７−２Ｉｇ×抗腫瘍ｍＡｂで予備パルスしておく。組換えヒトＩＬ−２を培養＋５日目に５Ｕ／mlの濃度で培養物に添加し、＋10日目まで維持し、その後その濃度を10Ｕ／mlに上げる。培養＋15日目に、生存Ｔ細胞をフィコール勾配上での遠心分離により培養物から回収し、そして組換えＢ７−１またはＢ７−２−Ｉｇ× 抗腫瘍ｍＡｂで予備パルスしておいた同じ非複製性腫瘍細胞を使ってＴ細胞／腫瘍細胞比２：１およびＴ細胞１×10⁶個／mlの濃度で再刺激する。この再刺激段階は、24ウエルプレート中で、２Ｕ／mlの組換えヒトＩＬ−２が補足されたヒト血清を含む標準ＲＰＭＩ培地中で行う。＋５日目に、rhＩＬ−２の濃度を10Ｕ／ mlに高め、その濃度を＋15日目まで維持する。上記と同様にＴ細胞に３回目の再刺激を行った後で、試験管内再刺激に使用したＴ細胞と対照としての無関連腫瘍細胞に対して従来の細胞毒性試験〔Lanzavec chia，A.，Nature 319（1986）765-767〕において試験することもできる。腫瘍に対するＴ細胞系の特異性は、該アッセイにおいて測定された細胞毒性レベルによって判断される。約30〜40％の比致死活性が療法上の利益により適当であると見なすことができる。この場合、照射済の同種異系フィーダー細胞（同種異系ＰＢＭＣ）の存在下で、ポリクローナル活性化因子：ＰＨＡおよび10Ｕ／mlのrhＩＬ−２；または抗ＣＤ３mAb＋Ｂ７−１ＩｇＭおよび10Ｕ／mlのrhＩＬ−２を使って、腫瘍特異的ポリクローナルＴ細胞系を更に増殖させることができる。再刺激から＋15日目に、rhＩＬ−２濃度を５日間20Ｕ／mlに上げ、次の５日間は50Ｕ／mlに上げる。異なる刺激サイクル毎に、患者に再注入するための所望の数の活性化Ｔ細胞を得ることが可能である。好ましい態様では、段階ｉ）のインキュベーションの前または後に腫瘍細胞の増殖が抑制される。この抑制は、例えば、放射線照射またはマイトマイシンＣの使用により成し遂げることができる。放射線照射の場合好ましくは3000〜5000ラドが使われ、マイトマイシンＣの場合は細胞百万個あたり50〜100μｇ/が使われる。マイトマイシンＣはＴ細胞の再刺激中腫瘍細胞の生存を延長するため、抑制にはマイトマイシンＣが好ましい。本発明の更に好ましい態様では、活性化Ｔ細胞が、好ましくは活性化後にマーカー標識される。そのようなマーカーは好ましくは標識細胞の表面上に提示される分子である。従って、Ｔ細胞の表面上に提示されるタンパク質をコードする核酸を用いてＴ細胞を形質転換せしめることが特に好ましい。そのような細胞表面タンパク質または抗原は、例えば、ＣＤ24（J．Cell Biochemistry Supplement 17E，203頁，アブストラクトS210）、ＬＤＬまたはＮＧＦレセプター（WO 95/06 723）である。そのような遺伝子産物で標識された前記活性化Ｔ細胞の自系移植後には、患者への移植後すぐにそれらの細胞を追跡することが可能である。この遺伝子標識は、活性化腫瘍特異的Ｔ細胞による治療効率を監視し比較できるようにするだろう。本発明の好ましい態様では、更にＴ細胞を自殺遺伝子により形質転換せしめることができる。そういった遺伝子は、好結果の治療処置後、それらの細胞の生体内特異的排除のため、直接的にまたはメディエーターを介して、感染細胞の致死を引き起こす（WO 92/08796およびPCT/EP94/01573）。この目的には、形質導入された活性化Ｔ細胞に生体内特異的細胞排除のための薬剤ガンシクロビルに対する生体内感受性を付与するチミジンキナーゼ遺伝子を使用するのが好ましい。例えば、肝機能酵素の増加と陽性皮膚生検によって、患者に活性化Ｔ細胞の急性不適合性〔例えば移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のような〕の徴候が現れたら、約10 mg／kgの用量の薬剤ガンシクロビルの２回のi.v．（静脈内）投与を行うのが好ましい。これは他のリンパ球の相当な減少を伴うことなく、標示した活性化Ｔ細胞の減少をもたらす。 WO 92/05262に記載されているジフテリア毒素遺伝子も自殺遺伝子として好ましい。活性化Ｔ細胞の生体内特異的排除のために、細胞アポプトシスを誘導することも好ましい。従って変形ＦＡＳレセプターおよび一定量の関連リガンドを使用することも好ましい。患者の腫瘍細胞は外科試験片から採取される。腫瘍細胞のアリコートを用いて、試験管内でまたは免疫不全マウスの生体内のいずれかにおいて、その後のＴ細胞刺激のために腫瘍細胞系を再生せしめる。新鮮な腫瘍細胞の残りをＴ細胞の直接刺激に用いる。そのような腫瘍細胞は、例えば、黒色腫、癌腫（例えば、乳、頸部、頭部および頸部、結腸、肺、腎臓、胃）、肉腫、リンパ腫または白血病細胞である。「生物学的結合ペア」という語は、互いに関して高い特異的結合能力を有する２つの分子の組合せを意味するものと解釈される。そのような結合ペアは、例えば、ビオチン／アビジン（またはストレプトアビジン／ニュートラアビジン）、または糖／コンカナバリンＡである。好ましくは、結合親和定数がｋｄ＜１ナノモル／ｌである。好ましくはより高い親和定数が用いられる。この理由により、ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン相互作用が高親和力のために好ましい。この相互作用は体内にある他のどのレセプターリガンドよりも強力である。従って、二価性試薬の２成分を接合するために生体内で使うことができる。ビオチン化の方法はHarlow，E.およびLane，D.，Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory（1988）341中に記載されている。ビオチン化またはアビジンもしくはストレプトアビジンもしくはニュートラアビジンとの架橋結合は当業者に周知の方法に従って行われる。２つのタンパク質分子を連結するための好ましい技法は、安定な共有結合を形成する化学架橋である。多数の二価性架橋剤が市販されている。特に好ましいのはＳＰＤＰ〔Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート〕架橋剤である。Ｂ７タンパク質として、Ｂ７の全部または一部、好ましくはＢ７−１，Ｂ７− ２もしくはＢ７−３の全部または一部を使うことができる。好ましくは、少なくともＮ末端可変領域を含むＢ７タンパク質の一部分が使われる。WO 95/03408に記載されているＢ７−１またはＢ７−２タンパク質および誘導体が特に好ましい（この内容について該刊行物は参考として本明細書に組み込まれる）。細胞表面へのＢ７融合タンパク質の結合は、生物学的結合ペア間の相互作用と抗−表面抗原抗体の結合によって行われるので、Ｂ７分子は今まで通りに膜貫通領域を含む必要はない。第二の融合タンパク質は、細胞表面抗原に対する抗体と生物学的結合ペアのもう一方の相手とを含有する。抗体として、多数の表面抗原に対して向けられた抗体を使うことができる。それらの細胞表面抗原は必ずしも腫瘍細胞特異的表面抗原である必要はない。この理由で、大部分が細胞表面上に存在する表面抗原、例えばERB B2またはトランスフェリンレセプター、に対する抗体を使うことが好ましい。しかしながら、以下のような適当な腫瘍関連抗原に対する抗体を使うことも可能である：結腸癌、肺癌、乳癌のＣＥＡ；骨髄系白血病のＣＤ33；Ｂ細胞白血病、リンパ腫、骨髄腫のＣＤ19／ＣＤ20 CALLAおよびＣＤ38；胃癌のＭｅｔ；卵巣癌のOVCA（MOV-18）；またはメラノーマ特異抗原。活性化腫瘍細胞とＴ細胞との共生培養は、その上更にＴ細胞を刺激することができる少量のリンホカイン（例えばＩＬ−２，ＩＬ− ６，ＩＬ−７）の存在下で実施される。多数の腫瘍特異的エフェクターＴ細胞に増殖させるために数回の再刺激が好ましい。最後の再刺激後３〜４日目に、腫瘍エフェクターＴ細胞を患者にi.v.再接種する。患者に投与しなければならないＴ細胞の数は多様であり、確立されたプロトコールに従って見つけだすことができる。好ましくは、10⁷〜10⁹細胞／体表面積ｍ²から成る、４週間に渡る１回のi.v .輸液が使われる。例えば、Greenberg，P.D.，Adv．Immunol．49（1991）281-35 5およびRiddel，R.R.他、Science 257（1992）238-241中に確立されたプロトコールが記載されている。養子移入の時点で、患者に免疫原性腫瘍細胞を予防接種すると共に可溶性組換え腫瘍特異的Ｂ細胞分子による処理を行って、生体内で更に再刺激することができる。これは、予め決められた量の可溶性Ｂ７接合体を患者にi.v.注射することにより達成でき、その結果、診断された腫瘍の細胞表面に該mAbが結合する。腫瘍が複数の適当なマーカーを発現する場合には、患者に複数のＢ７×抗腫瘍mAb分子を注射することができる。可溶性試薬の量および注射スケジュールは、例えば、放射性標識タンパク質を使ってそれのクリアランスおよび腫瘍塊へのターゲッティング効率をモニタリングすることによって、前臨床および臨床試験の間に決定される。この種の治療に必要な全パラメーターは薬理学および核医学の通常経験から引き出されるに違いなく、それらを見つけだすことは難しくない。患者が組換えタンパク質に対して生じ得る中和抗体応答をモニタリングすることも必要であろう。上述したように、適用後に生体内の活性化Ｔ細胞をモニタリングすることが好ましい。養子免疫療法は、この場合、好ましくはＬＮＧＦＲで標識されている腫瘍特異的Ｔ細胞を生体外で増殖させ、そして好ましくは腫瘍特異性可溶性Ｂ７接合体と一緒に、患者に再接種することをベースにしている。この場合、可溶性Ｂ７接合体は、残った腫瘍塊の部位において、移入された腫瘍特異的エフェクターＴ細胞を再剌激し、免疫応答の最適生体内増幅を引き起こすであろう。実際、可溶性Ｂ７接合体が無いと（または別の適当な共同刺激が無いと）、移入された抗腫瘍Ｔ細胞ブラストは数回しか細胞致死を行わずに、その後、機能的に不活性化されてしまうかまたは予定された細胞死により物理的に排除されてしまう。腫瘍特異的Ｔ細胞の標識付けの結果、投与されたＴ細胞の患者内存続性を測定することによってこのアプローチの効率をモニタリングすることができるようになる。下記の実施例および添付図面は、本発明の理解を助けるために与えられ、それの真の範囲は添付した請求の範囲により与えられる。本発明の精神から逸脱することなく記載の手順に対し変更を行いうると解釈される。図１は、組換え可溶性Ｂ７−Ｉｇ分子により共同刺激されたヒト一次ＣＤ４⁺ ＣＤ45Ｒ０⁺Ｔ細胞の増殖を表す（Ａ：抗ＣＤ３；Ｂ：抗ＣＤ３⁺Ｂ７−２ＩｇＧ３；Ｃ；抗ＣＤ３⁺Ｂ７−１ＩｇＧ１）。図２Ａは、腫瘍特異的Ｔ細胞系の生存度を表す。抗腫瘍自己由来ＣＴＬ系は、Ｂ７−２ＩｇＧ３標的ＲＭＡ−Thy1.1細胞によってのみ試験管内で誘導、維持および増殖することができ、対照標的ＣＤ４−ＩｇＧ１細胞によってはできない（ａ：再刺激；ｂ：養子移入）。図２Ｂは、特異的抗ＲＭＡＴ細胞系がＲＭＡリンパ腫細胞を接種したマウスを効率的に治療するのに対し、抗Ｊ558ＬＴ細胞系は治療しないことを表す。Ｂ７−２ＩｇＧ３分子でターゲティングしたＲＭＡ−Thy1.1細胞により試験管内で誘発・増殖させたＣＴＬ系は、確立したＲＭＡ腫瘍を有するマウスに養子移入した時、100％治療活性を有する。更に、治療したマウスの80％が、ＲＭＡ細胞でのその後のチャレンジに対して全身免疫を発生する。〔ａ：野性型（wt）ＲＭＡによるチャレンジ；マウスをＰＢＳ／ＩＬ−２のみ／ＣＤＢ抗Ｊ558 Ｌ＋ＩＬ− ２／ＣＤ８抗ＲＭＡ＋ＩＬ−２で処置する〕。図３Ａは、Ｂ７−２ＩｇＧ３で予備ターゲッティングしたＲＭＡ−Thy1.1生存細胞を接種したマウスの生存度を表す。Ｂ７−２ＩｇＧ３を使って３段階法により試験管内で予備ターゲッティングした生存ＲＭＡ Thy1.1細胞によりチャレンジしたマウスの40％が一次拒絶反応を示した。図３Ｂは、Ｂ７−２ＩｇＧ３でターゲティングした非複製性ＲＭＡ Thy1.1細胞の治療効率を表す。試験管内で３段階法によりＢ７−２ＩｇＧ３を予備パルスしたＲＭＡThy1.1細胞のみが、確立された腫瘍を有するマウスの60％を治癒した。実施例１可溶性Ｂ７−１ＩｇＧ１およびＢ７−２ＩｇＧ２は一次ＣＤ４⁺ＣＤ45Ｒ０⁺ヒトＴ細胞の増殖を共同刺激する精製した可溶性組換えＢ７−１ＩｇおよびＢ７−２Ｉｇ分子〔Traunecker，A. 他、Immunology Today 10（1989）29-31およびTraunecker，A.他、Nature 331（ 1988）84-86〕を、高純度のヒト一次ＣＤ４⁺ＣＤ45Ｒ０⁺Ｔリンパ球の増殖を共同刺激する能力にっいて試験した。プラスチックウエルに架橋結合せしめた増加する濃度の可溶性Ｂ７−１ＩｇまたはＢ７−２Ｉｇの存在下で、最適以下濃度の抗ＣＤ３特異的抗体を使って、Ｔ細胞を活性化した。図１に示されるように、両可溶性Ｂ７分子は用量応答形式でヒト一次Ｔ細胞の増殖を共同刺激する。実施例２可溶性Ｂ７−１ＩｇＧ１は同種異系腫瘍標的細胞に対するヒト一次ＣＤ８⁺Ｔ細胞の細胞溶解活性の獲得を共同刺激する抗ＣＤ４ｍＡｂと磁性ビーズを使って、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の陰性枯渇により一次ヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞を均質まで（純度90％）精製した。百万個の精製ＣＤ⁺Ｔ細胞を、不溶性Ｂ７−１ＩｇＧ１分子、Ｂ７−１ＩｇＧ１とＩＬ−２、ＩＬ−２のみ、または対照キメラ分子ＣＤ４−ＩｇＧ１の存在下で、５百万個の放射線照射済Jurkatリンパ腫細胞二より試験管内で再刺激した。５日後、応答したＴ細胞をフィコール勾配上で精製し、種々のエフェクター対標的比においてJurkat細胞に対する細胞毒性について試験した。図２は、Ｂ７−１ＩｇＧ１とＩＬ−２の両方の存在下でJurkat細胞により刺激したＣＤ８⁺Ｔ細胞が、ＩＬ−２のみよりも一層効率的に標的を致死せしめたことを示す。よって、可溶性Ｂ７−１Ｉｇ分子はＣＤ８⁺Ｔ細胞のエフェクター機能の獲得を誘導することができる。実施例３抗体のビオチン化ビオチン化は、ビオチンのスクシンイミドエステルを使って行う。抗体または他のタンパク質上の遊離アミノ基、通常はリジン残基上の遊離アミノ基を通してカップリングする。ジメチルスルホキシド中10mg／mlのビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液と、ホウ酸ナトリウム緩衝液（0.1Ｍ，pH8.8）中少なくとも１〜３mg／mlの抗体溶液を調製する。抗体をアジ化ナトリウム中で保存していたならば、カップリング前にホウ酸塩緩衝液に対して徹底的に透析することによりアジ化物を除去する必要がある。抗体１mgあたりエステル25〜250μ ｇの比率でビオチンエステルを抗体に加え、十分に混合し、そして室温で４時間インキュベートする。高濃度のビオチンエステルは、抗体に結合する多数のビオチン基を提供し、全ての抗体が標識される確率を高めるだろう。低比率はビオチン化を最小にとどめるだろう（25μｇエステル／mg抗体は約10：１の初期モル比を与える）。エステル250μｇあたり20μｌの１M NH₄Clを加え、混合物を室温で10分間インキュベートする。抗体溶液をＰＢＳまたは別の所望の緩衝液に対して透析して未結合のビオチンを取り除く。ビオチンはその大きさから予想されるよりもずっと遅く透析するので、十分な透析が必要である。実施例４Ｂ７−１ＩｇまたはＢ７−２Ｉｇ分子を分泌する形質細胞腫細胞は同系マウスにおいて効率的な抗腫瘍防御免疫を誘導するＢ７−１ＩｇＧ１、Ｂ７−１ＩｇＭ）Ｂ７−２ＩｇＧ３、ＣＤ４ＩｇＧ１、ＣＤ４ＩｇＭまたはＣＴＬＡ４ＩｇＧ１を分泌するJ558L形質細胞腫クローンを同系Balb/cマウスの右側腹部に注入し、そしてそれらの増殖を評価した。Ｂ７−１またはＢ７−２分子を分泌する形質細胞腫細胞でチャレンジしたマウスはいずれも腫瘍塊を発生しなかったが、一方対照のＣＤ４またはＣＴＬＡ４分子を分泌する細胞でチャレンジした全マウスにおいて腫瘍が発生した。これらの結果を表１に要約する。更に、Ｂ７Ｉｇ分子を分泌するJ558L細胞を注射した全てのマウスが、親の形質細胞腫細胞でのその後のチャレンジに対して二次的防御応答を示した（表１）。よって、可溶性キメラＢ７−１およびＢ７−２分子は効率的抗腫瘍免疫を開始する能力およびそれらが向けられる腫瘍に対して動物を防御する能力を生体内で維持している。表１：ヒトＢ７−１ＩｇまたはＢ７−２Ｉｇを分泌するJ558L形質細胞腫細胞は、未トランスフェクション親細胞による後続チャレンジに対して同系動物に予防接種するのに使うことができる。実施例５自己由来ＣＴＬの誘導 Thy1.1対立遺伝子をコードする遺伝子を、Thy1.2対立遺伝子を発現するマウス株（それぞれC57.B6およびBalb.c）と同系である２つのマウス腫瘍形成細胞系（Ｔリンパ腫ＲＭＡと乳腺癌ＴＳ／Ａ）にトランスフェクトした。こうして、腫瘍細胞が一端マウスに接種されれば、それらは特異的腫瘍マーカーを発現するマウスの唯一の組織を形成するだろう。腫瘍細胞表面上での性質の改善のために（すなわち容易なキャッピング、インターナリゼーションまたはシェーディング）腫瘍マーカーとして対立遺伝子Ly2.1（CD8）とLy5.1（CD45）を使うことも好ましい。所望の対立遺伝子腫瘍マーカーに特異的なmAbが使われ、これが腫瘍をターゲティングするアームとなるであろう。それらはそのままで使われるか、または −46ab’断片に縮小することができる。ＲＭＡ−Thy1.1＋による感作（三段階標識） Thy1.1を発現する非複製性（放射線照射済またはマイトマイシンＣ処理済）ＲＭＡまたはＴＳ／Ａ細胞を、飽和量のビオチン化Thy1.1特異的モノクローナル抗体（mab19E12）を使って＋４℃でパルスする。過剰のmAbを洗い流し、そして過剰量のニュートラアビジン（NAv;Pierceからの組換えアビジン）を添加する。NA vは４価であり、別のビオチン化分子のための少なくとも１つの遊離結合部位を残した状態でビオチン化19E12mabに結合する。過剰のNAvを洗い流し、ビオチン化組換えＢ７−１ＩｇＧ１またはＢ７−２ＩｇＧ３のいずれかを添加して３段ブリッジを完成する。対照として、Thy1.1でトランスフェクトしたＲＭＡ細胞による感作を使用する。６日後、親のＲＭＡ細胞に対するキラーアッセイにより、生き残っているＴ細胞をアッセイする。腫瘍細胞は今や何の遺伝子操作なしにそれらの表面上に有力な共同刺激分子を発現する。三段階標識腫瘍細胞を使って、試験管内で同種異系細胞溶解ＣＤ８⁺Ｔ細胞を再刺激する。実際に、細胞表面上に機能的Ｂ７−１またはＢ７−２を発現する細胞のみが、試験管内で自己由来エフェクター細胞を感作または再刺激することができる。結果を表２と図２に示す。表２：細胞致死は特異的であり、ＮＫ標的に対するＮＫ致死は見られない（ＹＡＫまたはＲＭＡ−Ｓ細胞）。Ｅ／Ｔ＝エフェクター／標的比実施例６三段階予備パルスした標的細胞による防御応答の誘導前記三段階法を使って可溶性Ｂ７−１またはＢ７−２（例えば、Ｂ７−２ＩｇＧ３）により試験管内で予備パルス（感作）した生存腫瘍細胞を同系マウス中に皮下（s.c.）接種し、拒絶応答を記録する。更に、三段階法を使って試験管内で予備パルスした非複製性腫瘍細胞を使って、２回目のチャレンジからのマウスに致死量の親細胞を接種する（結果は図３Ａを参照のこと）。実施例７微小腫瘍残病態に対する治癒免疫の誘導 Thy1.1対立遺伝子（または別の腫瘍特異的マーカー）を発現している種々の量の生存腫瘍細胞を使ってs.c.または静脈内（i.v.）のいずれかでマウスをチャレンジする。腫瘍を数日間成長させ、次いでＢ７−２−ＩｇＧ３を使って三段階法により生体内で予備ターゲティングした非複製性ＲＭＡ−Thy1.1細胞で処理する。非複製性治療用細胞ワクチンを１週間に２回、３週間に渡りs.c.接種する（結果は図３Ｂを参照のこと）。実施例８Ｂ７−Ｉｇ分子の直接生体内三段階投与による、微小腫瘍余病態に対する治癒免疫の誘導 Thy1.1対立遺伝子（または別の腫瘍特異的マーカー）を発現している種々の量の生存腫瘍細胞を使ってs.c.または静脈内（i.v.）のいずれかでマウスをチャレンジする。腫瘍を数日間成長させ、次いでそれらを生体内で三段階処置する。第一に、マウスにビオチン化抗Thy1.1mAbを投与し、12時間後にNAvを投与し、そして36時間後にビオチン化可溶性組換えＢ７−１またはＢ７−２を投与する。次いで腫瘍の成長を記録する。生体内三段階処置は一定期間に渡り繰り返すことができ、また、腫瘍部位においてＢ７−１もしくはＢ７−２と相乗作用し得る組換えビオチン化リンホカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−10，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−12）の使用と組み合わせることができる。可溶性Ｂ７−１またはＢ７−２共同刺激分子の生体内三段階ターゲティングと、操作された腫瘍細胞の能動的予防接種および／または試験管内で増殖させた腫瘍特異的Ｔ細胞系の受動的移入とを組合せることによる、微小腫瘍残病態に対する治癒応答の誘導は、生体内再刺激をもたらした。ワクチンとして使われる変更された腫瘍細胞は、Ｂ７−１もしくはＢ７−２をコードする遺伝子を用いたトランスフェクションにより、または三段階予備感作法により、作製することができる。同一系列上で、上述の三段階プロトコールに従って腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導しそして試験管内で増殖させることができる。

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Claims

【特許請求の範囲】 1. ある患者からの腫瘍細胞とその患者からのＴ細胞とを生体外で共生培養することにより活性化腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する方法であって、次の段階：ｉ）前記腫瘍細胞を、Ｂ７タンパク質と生物学的結合ペアの一方の相手とから得られた第一の融合タンパク質、および細胞表面抗原に対する抗体と前記生物学的結合ペアのもう一方の相手とから得られた第二の融合タンパク質と共にインキュベートし； ii）前記インキュベーションの前または後に前記腫瘍細胞の増殖を抑制し； iii）Ｔ細胞の活性化が得られるまで、前記腫瘍細胞を活性化すべきＴ細胞と一緒に共生培養し；そして iv）活性化Ｔ細胞を腫瘍細胞から分離するを含んでなる方法。 2. 前記腫瘍細胞の増殖が段階ｉ）によるインキュベーションの前または後に抑制されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 3. 前記活性化Ｔ細胞が段階iii）による活性化の前または後に標識されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。