MX2008015108A - Planta y semilla de maiz que corresponden al evento transgenico mon89034, y metodos para la deteccion y el uso del mismo. - Google Patents
Planta y semilla de maiz que corresponden al evento transgenico mon89034, y metodos para la deteccion y el uso del mismo.Info
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Abstract
La presente invención proporciona un evento de maíz transgénico M0N89034 y células, semillas y plantas que comprenden el diagnóstico de ADN para el evento de maíz; la invención también proporciona composiciones que comprenden secuencias nucleótidas que son diagnósticas para dicho evento de maíz en una muestra, métodos para detectar la presencia de dicha secuencia nucleótida de eventos de maíz en una muestra, sondas e iniciadores para el uso en la detección de secuencias nucleótidas que son diagnóstica para la presencia de dicho evento de maíz en una muestra, cultivar las semillas de tal evento de maíz en plantas de maíz y fertilizar para producir las plantas de maíz que comprenden el diagnóstico de ADN.
Description
PLANTA Y SEMILLA DE MAIZ QUE CORRESPONDEN AL EVENTO TRANSGENICO MON89034, Y METODOS PARA LA DETECCION Y EL USO DEL MISMO
REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA
Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad a la solicitud provisional de E.U.A. número de serie 60/808,834, presentada en mayo 26 de 2006.
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se refiere al evento de maíz transgénico MON89034, y partes de la planta y semilla del mismo. El evento exhibe resistencia a la infestación por insectos de insectos del orden Lepidoptera. La invención se refiere también a métodos para el uso de plantas y semillas que comprenden ADN que sirve de diagnóstico para la presencia del evento transgénico cuando se sondea para la presencia de secuencias de nucleótidos que son únicas para el evento transgénico, y a métodos para detectar la presencia de dicho evento del maíz en una muestra biológica, detectando secuencias de nucleótidos específicas que son únicas para el evento transgénico. La invención provee secuencias de nucleótidos que son únicas para el evento.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Esta invención se refiere a la variedad transgénica de la planta de maíz (Zea mays) resistente a lepidópteros, referida en la presente como evento MON89034, y a secuencias de ADN únicas presentes que, cuando se detectan en alguna muestra o variedad de maíz, sirven de diagnóstico para la presencia del evento de planta de maíz transgénica MON89034 en esa muestra o variedad, y se refiere también a la detección de la región de inserción genómica/transgen en el evento MON89034 del maíz, y plantas de la progenie y semillas derivadas del mismo. El evento de la planta de maíz MON89034 es particularmente resistente a insectos de la familia Lepidoptera, tales como la gardama (Spodoptera frugiperda), el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), el gusano del maíz {Helicoverpa zea), el barrenador del sudoeste del maíz (Diatraea grandiosella) y la gardama negra (Agrotis ípsilon), y similares, todos los cuales son plagas de insectos agronómicamente importantes. El maíz es un cultivo importante, y es una fuente de alimento primaria en muchas áreas del mundo. Se han aplicado métodos de biotecnología a! maíz con el propósito de mejorar rasgos agronómicos y ¡a calidad del producto. Uno de dichos rasgos agronómicos es la resistencia a insectos, por ejemplo, resistencia genéticamente diseñada a especies de lepidópteros y coleópteros que surgen en plantas de maíz genéticamente diseñadas que contienen uno o más genes que codifican para agentes
insecticidas (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 6,489,542 y la patente de E.U.A. 6,620,988). Es ventajoso detectar la presencia de un evento transgénico particular en una muestra biológica para determinar si una o más progenie de una cruza sexual contiene al material transgénico. Por ejemplo, la detección del evento en una muestra es importante para propósitos de licénciamiento, para establecer y mantener estándares de pureza, importante para cumplir con agencias reguladoras, para cumplir con estándares para ingredientes alimenticios, para su uso en procedimientos legales para establecer que uno o más individuos o entidades particulares han estado usando el evento particular sin una licencia del propietario o licencia de alguna patente dirigida hacia el evento transgénico, y para garantizar el acatamiento con varias regulaciones y/o leyes gubernamentales. Además, métodos que permitan la detección de una planta particular serían útiles cuando se cumple con regulaciones que requieren la aprobación previa por el mercado y el etiquetado de alimentos derivados de las plantas de cultivo recombinantes. Individuos o entidades que sean resistentes a la presencia de un evento transgénico en una muestra, desean también métodos confiables para detectar la presencia del transgen en una muestra para que ellos sean capaces de capitalizar su negocio, lo cual saca ventaja de una ausencia de transgenes en sus productos. A pesar de estas ventajas, es posible que los insectos puedan desarrollar resistencia a plantas que expresan sólo una d-endotoxina de B. thuringiensis. Dicha resistencia, si llegara a ser extendida, limitaría claramente
el valor comercial de germoplasma que contenga genes de B. thuringiensis individuales. Una forma posible de incrementar la eficacia de agentes insecticidas provistos por medio de plantas transgénicas y dirigidos al control de plagas de insectos objetivo y reducir contemporáneamente la probabilidad de emergencia de plagas de insectos resistentes a dichos agentes insecticidas, sería garantizar que los cultivos transgénicos expresen altos niveles de estos agentes insecticidas, tales como delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (McGaughey y Whalon (1992), Science 258: 1451 -55; Roush (1994) Biocontrol. Sci. Technol., 4: 501 -516). Además, el tener un depósito de genes insecticidas que sean efectivos contra grupos de plagas de insectos y que manifiesten sus efectos a través de diferentes modos de acción, puede salvaguardar contra el desarrollo de resistencia. El inicio de resistencia podría retardarse sustancialmente como resultado de que se provea un cultivo que exprese dos o más actividades insecticidas que exhiban toxicidad traslapante con las mismas plagas de insectos. Un medio para lograr dichos modos de acción dobles, podría ser proveer una planta que exprese un gen de Bacillus thuringiensis tóxico para una especie de insecto particular junto con un ARNds que se provea con el propósito de determinar como blanco la supresión de un gen esencial de la misma especie de insecto elegida como objetivo por la toxina de Bacillus thuringiensis, el ARNds induciendo una respuesta de ARNi tras la ingestión por la plaga objetivo, proveyendo un medio para redundancia en caso de que el insecto desarrolle
resistencia al ARNds o al gen de Bacillus thuringiensis. En forma alternativa, la co-expresión en una planta de dos o más toxinas insecticidas que son tóxicas para la misma especie de insecto, pero cada una exhibiendo un diferente modo para efectuar su actividad de destrucción, en particular cuando ambas se expresan a altos niveles, provee un medio para el manejo efectivo de resistencia. Ejemplos de dichos insecticidas útiles en dichas combinaciones incluyen, pero no están limitados a, toxinas de Bacillus thuringiensis, proteínas insecticidas de Xenorhabdus sp. o Photorhabdus sp., proteínas patatina desalergenizadas y desglucosiladas y/o permuteínas, lectinas de plantas, y similares. Se sabe que la expresión de genes extraños en plantas es influenciada por su posición cromosómica, debido quizá a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o a la proximidad de elementos de regulación de la transcripción (por ejemplo, intensificadores) cerca del sitio de integración (Weising et al. (19880 Ann. Rev. Genet 22: 421 -477). Por esta razón, con frecuencia es necesario identificar un gran número de eventos para identificar un evento caracterizado por expresión óptima de un gen de interés introducido. Incluso entonces, con docenas e incluso cientos de diferentes eventos transgénicos a la mano, no existe certeza de éxito en la identificación de un evento transgénico individual que provea los niveles de expresión óptimos de las diferentes toxinas o agentes insecticidas (por lo menos dos) y carezca de alguna deficiencia agronómica o efectos fitotóxicos indeseables, ya sea como resultado de la inserción en alguna región esencial o
parcialmente esencial del genoma de la planta, o como resultado de efectos tóxicos producidos por los niveles de expresión de los transgenes. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre los eventos. Puede haber también diferencias en los patrones de expresión espacial o temporal, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgen en varios tejidos de la planta, que pueden no corresponder con los patrones esperados de elementos reguladores de la transcripción presentes en la construcción del gen introducido. Por esta razón, es común producir varios cientos a varios miles de eventos diferentes, e identificar los eventos de un sólo evento que tengan los niveles y patrones de expresión deseados del transgen para propósitos comerciales. Un evento que tenga los niveles o patrones de expresión deseados del transgen, es útil para introgresar el transgen en otros ambientes genéticos por cruzamiento sexual usando métodos de mejoramiento genético convencionales. La progenie de dichas cruzas mantiene las características de expresión del transgen del transformante original. Esta estrategia se usa para garantizar la expresión confiable de los genes en un número de variedades que están convenientemente adaptadas a condiciones de crecimiento locales específicas. Es posible detectar la presencia de un transgen por cualquier método de detección de ácidos nucleicos conocido, tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o hibridación de ADN, usando sondas de ácido
nucleico. Estos métodos de detección se enfocan en general en elementos genéticos usados con frecuencia, tales como promotores, terminadores, genes marcadores, o incluso la secuencia codificante que codifica para la proteína o ARNds de interés expresado de los transgenes, etc. Como resultado, dichos métodos pueden no ser útiles para discriminar entre diferentes eventos, en particular aquellos producidos usando la misma construcción de ADN, a menos que se conozca la secuencia de ADN cromosómico adyacente al ADN insertado ("ADN flanqueante"). Dependiendo del método usado para introducir los transgenes en el genoma de una planta, pueden observarse efectos aberrantes o inusuales, los cuales complican con frecuencia severamente la identificación de las secuencias del genoma de la planta que flanquean al ADN transgénico que se destinó para ser introducido en la planta. Con frecuencia, son frecuentes reordenamientos del ADN insertado, reordenamientos del ADN flanqueante genómico o reordenamientos del ADN insertado y el ADN flanqueante genómico, y complican el análisis del evento de inserción que está siendo evaluado. Por lo tanto, es ventajoso tener un medio para seleccionar, para identificar y para garantizar la pureza y las características de un evento transgénico particular en una muestra, y la única forma de lograr esto es identificar una o más secuencias únicas asociadas sólo con el evento transgénico deseado, y la presencia de dichas secuencias en una muestra biológica que contiene ADN de la especie vegetal en la cual el ADN transgénico fue insertado para dar lugar al evento, sirve de esta manera de diagnóstico para el evento en dicha muestra.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a la planta de maíz transgénica designada como MON89034 y a la progenie que son indistinguibles del evento de maíz MON89034 (al grado de que contienen también por lo menos un alelo que corresponde al ADN transgénico insertado) del mismo que tienen semilla depositada en marzo 28 de 2006 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-7455. Otro aspecto de la invención, son las plantas de la progenie, o semillas, o partes regenerables de las plantas y semillas del evento de maíz MON89034 que contienen un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. La invención incluye también partes de la planta del evento de maíz MON89034 que incluyen, pero no están limitadas a, polen, óvulo, flores, vástagos, raíces, tallos, estigmas, espiguillas, mazorcas y hojas, en tanto estas partes contengan por lo menos los polinucleótidos como se expuso anteriormente. Composiciones genéticas novedosas contenidas en el genoma de MON89034, y productos de MON89034, como harina integral, harina, aceite, pulpa y biomasa que quede en un campo de plantas de maíz que corresponda a! evento MON89034, son un aspecto de esta invención. La invención provee una planta de maíz resistente a insectos que tiene todas las características fisiológicas y morfológicas del evento de maíz MON89034.
De conformidad con un aspecto de la invención, se proveen composiciones y métodos para detectar la presencia de la región de inserción genómica/transgen de una planta de maíz novedosa designada como MON89034. Se proveen secuencias de ADN que comprenden por lo menos una secuencia de unión de MON89034 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 (localizada en las posiciones 2051 a 2071 en SEQ ID NO: 5) y SEQ ID NO: 2 (localizada en las posiciones 1 1295 a 11314) y complementos de las mismas; en donde una secuencia de unión abarca la unión entre ADN heterólogo insertado en el genoma y el ADN de la célula de maíz que flanquea el sitio de inserción y sirve de diagnóstico para el evento (figura 1 ). Un evento de maíz MON89034 y semilla que comprende estas moléculas de ADN, es un aspecto de esta invención. Secuencias de ADN que comprenden la región de inserción genómica/transgen novedosa, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (figura 1 ) del evento de maíz MON89034, son aspectos de esta invención. La planta y semilla de maíz que comprenden estas moléculas, son también aspectos de esta invención. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proveen dos moléculas de ADN para su uso en un método de detección de ADN, en donde la primera molécula de ADN comprende por lo menos 1 1 o más polinucleótidos contiguos de cualquier porción de la región del transgen de la molécula de ADN de SEQ ID NO: 3, y una molécula de ADN de longitud similar de cualquier porción de una región de ADN genómico flanqueante 5' de
SEQ ID NO: 3 del maíz, en donde estas moléculas de ADN cuando se usan en conjunto, son útiles como iniciadores de ADN en un método de amplificación de ADN que produce un amplicón. El amplicón producido usando estos iniciadores de ADN en el método de amplificación de ADN, sirve de diagnóstico para el evento de maíz MON89034 cuando el amplicón contiene SEQ ID NO: 1. Cualquier amplicón producido por iniciadores de ADN homólogos o complementarios a cualquier porción de SEQ ID NO: 3, y cualquier amplicón que comprenda SEQ ID NO: 1 , es un aspecto de la invención. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proveen dos moléculas de ADN para su uso en un método de detección de ADN, en donde la primera molécula de ADN comprende por lo menos 11 o más polinucleótidos contiguos de cualquier porción de la región del transgen de la molécula de ADN de SEQ ID NO: 4, y una molécula de ADN de longitud similar de cualquier porción de un ADN genómico flanqueante 3' de SEQ ID NO: 4, en donde estas moléculas de ADN son útiles como iniciadores de ADN en un método de amplificación de ADN. El amplicón producido usando estos iniciadores de ADN en el método de amplificación de ADN, sirve de diagnóstico para el evento de maíz MON89034 cuando el amplicón contiene SEQ ID NO: 2. Cualquier amplicón producido por iniciadores de ADN homólogos o complementarios a cualquier porción de SEQ ID NO: 4, y cualquier amplicón que comprenda SEQ ID NO: 2, es un aspecto de la invención.
De conformidad con otro aspecto de la invención, se proveen métodos para detectar la presencia de ADN que corresponde al evento de maíz MON89034 en una muestra. Dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una serie de iniciadores que, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de maíz MON89034, produce un amplicón que sirve de diagnóstico para el evento de maíz MON89034; (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esta manera el amplicón; y (c) detectar el amplicón, en donde dicho amplicón comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Una planta de maíz, o semilla o producto derivado de la planta o semilla de MON89034, en donde el ADN genómico comprende una molécula de ADN, consiste esencialmente de SEQ ID NO: 5 y complementos de la misma. Una planta de maíz, o semilla o producto derivado de la planta o semilla de MON89034, en donde el ADN genómico cuando se aisla de la planta de maíz, o semilla o producto de la misma, comprende una molécula de ADN que incorpora los nucleótidos 2061 a 11305 de SEQ ID NO: 5, y complementos de la misma. Una planta de maíz, o semilla o producto derivado de la planta o semilla de MON89034, en donde el ADN genómico cuando se aisla de la planta de maíz, o semilla o producto de la misma produce un amplicón en un método de amplificación de ADN, en donde las moléculas del iniciador de ADN son SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, se usa en el método de amplificación
de ADN. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proveen métodos para detectar la presencia de un ADN que corresponde al evento MON89034 en una muestra, dichos métodos comprendiendo: (a) poner en contacto la muestra que contiene ADN, con una sonda que híbrida bajo condiciones de hibridación severa con ADN genómico del evento de maíz MON89034 y no híbrida bajo las condiciones de hibridación severa con una planta de maíz control; (b) someter la muestra y sonda a condiciones de hibridación severa; y (c) detectar la hibridación de la sonda con el ADN del evento de maíz MON89034, en donde dicha sonda comprende SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Otro aspecto de la invención es un método para determinar la cigosidad de la progenie del evento de maíz MON89034, que comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN de maíz, con una serie de iniciadores que comprende SQ2842 (SEQ ID NO: 6), SQ2843 (SEQ ID NO: 7), SQ6523 (SEQ ID NO: 10), SQ6524 (SEQ ID NO: 1 1 ), PB880 (SEQ ID NO: 14) y PB2931 (SEQ ID NO: 15), que cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de maíz ON89034, produce un primer amplicón que sirve de diagnóstico para e! evento de maíz MON89034, y (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esta manera el primer amplicón; y (c) detectar el primer amplicón; y (d) poner en contacto la muestra que comprende ADN de maíz con dicha serie de iniciadores, que cuando se usa en una reacción de
amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de plantas de maíz, produce un segundo amplicón que comprende el ADN genómico de maíz nativo homólogo a la región genómica de una inserción del transgen del maíz identificada como evento de maíz MON89034; y (e) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esta manera el segundo amplicón, y (f) detectar el segundo amplicón; y (g) comparar el primer y segundo amplicones en una muestra, en donde la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigótica para la inserción del transgen. Un aspecto de la invención es proveer en la dieta de una plaga de lepidópteros, una cantidad ¡nsecticidamente efectiva del evento de maíz MON89034. Otro aspecto de la presente invención es proveer una composición o muestra biológica en la forma de un producto o producto alimenticio que se derive del evento de maíz MON89034, el producto o producto alimenticio comprendiendo mazorcas de maíz, maíz descascarado, estigmas de maíz, polen de maíz, maíz quebrado, harina integral de maíz, maíz triturado, harina de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, solución de infusión de maíz, malta de maíz, azúcar de maízj jarabe de maíz, margarina producida de aceite de maíz, aceite de maíz insaturado, aceite de maíz saturado, hojuelas de maíz, palomitas de maíz, etanol y/o solución producida de maíz o productos de maíz que comprendan ADN que sirve de diagnóstico para el evento de maíz ON89034, sólidos de géneros secos de destilador
(DDGS) producidos de la fermentación de dicho evento de maíz, y piensos que comprendan dichos DDGS y/o maíz, productos alimenticios procesados ya sea o no enteros, quebrados o triturados, un cosmético y un agente de abultamiento en el cual se encuentre una cantidad detectable de un polinucleótido que sirva de diagnóstico para la presencia del evento de maíz transgénico MON89034 en la muestra biológica. Un medio alternativo para proveer maíz como un producto alimenticio, es proveer maíz en varias formas de grano para alimentación, tales como maíz entero, maíz quebrado, maíz triturado y varias formas de los anteriores en una mezcla con milo, sebo, mijo, girasol, avena, trigo, arroz, frijol, y similares. Cantidades detectables de una secuencia de nucleótidos en dicho producto o producto alimenticio, tal como se expone en SEQ ID NO: 1 o SEO ID NO: 2, o los complementos de las mismas, sirven de diagnóstico para la presencia de ADN de dicho evento transgénico MON89034 en la muestra y, por lo tanto, la presencia de las células del evento transgénico que han originado el ADN en la muestra. Lo anterior y otros aspectos de la invención, llegarán a ser más evidentes a partir de la descripción detallada más adelante.
BREVE DESCRIPCION DEL DIBUJO
La figura 1 muestra la organización de la inserción del transgen presente dentro del genoma del evento de maíz transgénico MON89034. La barra clara central representa el ADN insertado. Abajo de la barra clara está
un diagrama que representa los varios elementos dentro del ADN insertado. Los extremos del ADN insertado han sido designados arbitrariamente como 5' (hacia el lado izquierdo de la figura) y 3' (hacia el lado derecho de la figura). Las secuencias o segmentos del borde izquierdo y borde derecho están marcados debajo de cada extremo del diagrama, ilustrando los varios elementos dentro del ADN insertado. Los elementos marcados en los cassettes de expresión dentro del ADN insertado están partiendo, en orden consecutivo, del borde derecho: promotor e35S, secuencia guía no traducida CAB del trigo, intrón de actina del arroz, secuencia codificante para Cry1A.105, secuencia de poliadenilación y terminación 3' de HSP17 del trigo, promotor del FMV, intrón de hsp70, secuencia codificante del péptido de determinación del blanco de cloroplastos de la subunidad pequeña de rubisco, secuencia codificante de Cry2Ab, terminación 3' de nos y secuencia de señal de poliadenilación, y entonces el borde izquierdo. Las barras verticalmente sombreadas en cualquier extremo de la barra clara central, corresponden a las secuencias flanqueantes del genoma del maíz marcadas arbitrariamente como 5' y 3'. La línea negra más larga arriba de la barra clara y sombreada representa SEQ ID NO: 5 (la secuencia de longitud completa representada por la figura que describe la secuencia flanqueante 5', la secuencia de ADN insertada y la secuencia flanqueante 3'). Las líneas oscuras más cortas arriba y abajo de la línea negra marcada como SEQ ID NO: 5 representan las posiciones aproximadas dentro de SEQ ID NO: 5, en la cual pueden encontrarse cada una de las secuencias específicamente marcadas (es decir,
SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEO ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4). SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y cualquier secuencia derivada del evento de maíz MON89034 que contiene a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, sirven de diagnóstico para ADN del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Las siguientes definiciones y métodos se proveen para definir mejor la presente invención, y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se denote de otra manera, los términos deberán entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica relevante. Definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse también en Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a. edición, Springer-Verlag: New York, 1991 ; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Como se usa en la presente, el término "maíz" significa Zea mays o maíz, e incluye todas las variedades de plantas que pueden ser cruzadas con el maíz, incluyendo especies de maíz silvestres. Como se usa en la presente, el término "que comprende" significa "incluyendo, pero no limitado a". Un "evento" transgénico se produce por la transformación de células vegetales con ADN heterólogo, es decir, una construcción de ácido
nucleico que incluye un transgen de interés, regeneración de una población de plantas que resulta de la inserción del transgen en el genoma de la planta, y selección de una planta particular caracterizada por la inserción en un sitio del genoma particular. El término "evento" se refiere al transformante original y progenie del transformante que incluye al ADN heterólogo. El término "evento" se refiere también a la progenie producida por una cruza sexual entre el transformante y otra variedad que incluye al ADN heterólogo. Incluso después de retrocruzamiento repetido con un progenitor recurrente, el ADN insertado y ADN flanqueante del progenitor transformado está presente en la progenie de la cruza en el mismo sitio cromosómico. El término "evento" se refiere también a ADN del transformante original que comprende el ADN insertado y secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado que se esperaría es transferido a una progenie que recibe ADN insertado, incluyendo el transgen de interés como resultado de una cruza sexual de una línea progenitora que incluye al ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y progenie que resulta de autofecundación), y una línea progenitora que no contiene al ADN insertado. La presente invención se refiere a ADN del evento MON89034, células vegetales, tejidos, semillas y productos procesados derivados de MON89034, Se entenderá también que dos diferentes plantas transgénicas pueden ser cruzadas también para producir progenie que contenga dos genes exógenos segregantes añadidos independientemente. La autofecundación de la progenie adecuada puede producir plantas que son homocigóticas para
ambos genes exógenos añadidos. Se contemplan también retrocruzamiento con una planta progenitora y cruzamiento con una planta no transgénica, como es la propagación vegetativa. Descripciones de otros métodos de mejoramiento genético que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos pueden encontrarse en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wl (1987). Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al cual es unido una molécula reportera o marca detectable convencional, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Dicha sonda es complementaria a una cadena de un ácido nucleico objetivo, en el caso de la presente invención, a una cadena de ADN genómico del evento de maíz MON89034, ya sea de una planta de maíz o de una muestra que incluya ADN del evento. Las sondas de conformidad con la presente invención incluyen no sólo ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico, sino también poliamidas y otros materiales de la sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y pueden usarse para detectar la presencia de esa secuencia de ADN objetivo. Los "iniciadores" son ácidos nucleicos aislados que son unidos a una cadena de ADN objetivo complementaria por hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el iniciador y la cadena de ADN objetivo, extendido entonces a lo largo de la cadena de ADN objetivo por una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Los pares de iniciadores de la
presente invención se refieren a su uso para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo, por ejemplo, por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) u otros métodos convencionales de amplificación de ácidos nucleicos. Las sondas y los iniciadores tienen generalmente 1 1 nucleótidos o más de longitud, de preferencia 18 nucleótidos o más, más preferiblemente 24 nucleótidos o más, y muy preferiblemente 30 nucleótidos o más. Dichas sondas e iniciadores hibridan específicamente con una secuencia objetivo bajo condiciones de hibridación de alta severidad. De preferencia, las sondas y los iniciadores de conformidad con la presente invención tienen similitud de secuencia completa con la secuencia objetivo, aunque sondas que difieren de la secuencia objetivo y que retienen la capacidad para hibridar con secuencias objetivo, pueden diseñarse mediante métodos convencionales. Métodos para preparar y usar sondas e iniciadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., vol. 1 -3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en lo sucesivo, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en lo sucesivo, "Ausubel et al., 1992"); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pueden derivarse pares de iniciadores de PCR de una secuencia conocida, por ejemplo, usando programas de cómputo destinados para ese propósito, tal como Primer
(versión 0.5, © 1991 , Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Los iniciadores y sondas basados en el ADN flanqueante y secuencias de inserción descritas en la presente, pueden usarse para confirmar (y, si es necesario, para corregir) las secuencias descritas mediante métodos convencionales, por ejemplo, por re-clonación y secuenciación de dichas secuencias. Las sondas e iniciadores de ácido nucleico de la presente invención hibridan bajo condiciones severas con una secuencia de ADN objetivo. Cualquier método de amplificación o hibridación de ácidos nucleicos convencional puede usarse para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas o fragmentos de ácido nucleico del mismo son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico bajo ciertas circunstancias. Como se usa en la presente, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente con alguna otra, si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico antiparalela de doble cadena. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico, si exhibe complementariedad completa. Como se usa en la presente, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias", si pueden hibridar con alguna otra con estabilidad
suficiente para permitirles que se vuelvan a unir a alguna otra bajo por lo menos condiciones de "baja severidad" convencionales. Asimismo, se dice que las moléculas son "complementarias", si pueden hibridar con alguna otra con estabilidad suficiente para permitirles que se mantengan unidas con alguna otra bajo condiciones de "alta severidad" convencionales. Condiciones de severidad convencionales son descritas por Sambrook et al., 1989, y por Haymes et al., en: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Desviaciones de la complementariedad completa son por lo tanto permisibles, en tanto dichas desviaciones no excluyan por completo la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble cadena. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como iniciador o sonda, sólo necesita ser suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura estable de doble cadena bajo el solvente particular y la concentración de sales usados. Como se usa en la presente, una secuencia sustancialmente homologa es una secuencia de ácido nucleico que hibridará específicamente con el complemento de la secuencia de ácido nucleico con la cual está siendo comparada bajo condiciones de alta severidad. Condiciones de severidad adecuadas que promueven la hibridación de ADN. por ejemplo, 6.0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida de un lavado de 2.0 x SSC a 50°C, son conocidas por los expertos en la técnica, o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sales en el
paso de lavado puede seleccionarse de una baja severidad de aproximadamente 2.0 x SSC a 50°C a una alta severidad de aproximadamente 0.2 x SSC a 50°C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede incrementarse de condiciones de baja severidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de alta severidad a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la concentración de sales pueden hacerse variar, o la temperatura o la concentración de sales pueden mantenerse constantes, mientras que la otra variable es cambiada. En una modalidad preferida, un ácido nucleico de la presente invención hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico expuestas en SEQ ID NO: 1 y 2, o complementos de las mismas o fragmentos de cualquiera de las mismas bajo condiciones moderadamente severas, por ejemplo, a aproximadamente 2.0 x SSC y aproximadamente 65°C. En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico expuestas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o complementos o fragmentos de cualquiera de las mismas bajo condiciones de alta severidad. En un aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora preferida de la presente invención tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o complementos de las mismas o fragmentos de cualquiera de las mismas. En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora preferida de la presente invención comparte entre 80% y 100% o 90% y 100% de identidad
de secuencia con la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o complementos de las mismas o fragmentos de cualquiera de las mismas. En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora preferida de la presente invención comparte entre 95% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o complementos de las mismas o fragmentos de cualquiera de las mismas. SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 pueden usarse como marcadores en métodos de fitomejoramiento para identificar la progenie de cruzas genéticas, similares a los métodos descritos para el análisis de marcadores de ADN de repetición de secuencia simple, en "DNA markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 173-185, Cregan, et al., eds., Wiley-Liss NY; cita que se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. La hibridación de la sonda con la molécula de ADN objetivo puede detectarse por cualquier número de métodos conocidos por los expertos en la técnica, y éstos pueden incluir, pero no están limitados a, marcadores fluorescentes, marcadores radiactivos, marcadores basados en anticuerpos y marcadores quimioluminiscentes. Respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, por PCR) usando un par de iniciadores de amplificación particular, el término "condiciones severas" se refiere a condiciones que permiten que el par de iniciadores hibride sólo con la secuencia de ácido nucleico objetivo con la cual un iniciador que tenga la secuencia de tipo silvestre correspondiente (o su complemento) se uniría, y de preferencia
produciría un producto de amplificación único, el amplicón, en una reacción de amplificación térmica de ADN. El término "específico de (una secuencia objetivo)" indica que una sonda o iniciador híbrida bajo condiciones de hibridación severa, sólo con la secuencia objetivo en una muestra que comprenda la secuencia objetivo. Como se usa en la presente, el término "ADN amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico objetivo que es parte de un molde de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de maíz que resulta de una cruza sexual contiene ADN genómico del evento transgénico de la planta de maíz de la presente invención, ADN extraído de una muestra de tejido de la planta de maíz puede someterse al método de amplificación de ácido nucleico usando un par de iniciadores que incluya un iniciador derivado de la secuencia flanqueante en el genoma de la planta, adyacente al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado, y un segundo iniciador derivado del ADN heterólogo insertado, para producir un amplicón que sirva de diagnóstico para la presencia del ADN del evento. El amplicón es de una longitud y tiene una secuencia que sirve también de diagnóstico para el evento. El amplicón puede variar en longitud de la longitud combinada de los pares de iniciadores más un par de bases de nucleótido, de preferencia más de aproximadamente 50 pares de bases de nucleótido, más preferiblemente más de aproximadamente 250 pares de bases de nucleótido, y aún más preferiblemente más de aproximadamente 450 pares de bases de nucleótido. En forma alternativa, un
par de iniciadores puede derivarse de la secuencia flanqueante en ambos lados del ADN insertado para producir un amplicón que incluya la secuencia de nucleótidos de la inserción entera. Un miembro de un par de iniciadores derivado de la secuencia genómica de la planta puede localizarse a una distancia de la molécula de ADN insertada, y esta distancia puede variar de un par de bases de nucleótido hasta aproximadamente 20,000 pares de bases de nucleótido. El uso del término "amplicón" excluye específicamente dímeros de iniciadores que pueden formarse en la reacción de amplificación térmica de ADN. Puede lograrse la amplificación de ácidos nucleicos por cualquiera de los varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Una variedad de métodos de amplificación se conoce en la técnica y se describe, entre otras, en las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Se han desarrollado métodos de amplificación por PCR que amplifican hasta 22 kb de ADN genómico y hasta 42 kb de ADN de bacteriófagos (Cheng et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 5695-5699, 1994). Estos métodos, así como otros métodos conocidos en la técnica de amplificación de ADN, pueden usarse en la práctica de la presente invención. La secuencia de la inserción de ADN heterólogo o secuencia flanqueante del evento de maíz MON89034 con muestras de semilla depositadas como números de la ATCC, puede
verificarse (y corregirse, si es necesario) amplificando dichas secuencias del evento usando iniciadores derivados de las secuencias provistas en la presente, seguida de la secuenciación de ADN estándar del amplicón de PCR o del ADN clonado. El amplicón producido mediante estos métodos puede detectarse mediante una pluralidad de técnicas. Uno de dichos métodos es el análisis de bits genéticos (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22: 4167-4175, 1994), en donde se diseña un oligonucleotido de ADN que traslapa la secuencia de ADN genómico flanqueante adyacente y la secuencia de ADN insertada. El oligonucleotido es inmovilizado en cavidades de una placa de microcavidades. Después de la PCR de la región de interés (usando un iniciador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), un producto de PCR de cadena sencilla puede ser hibridado con el oligonucleotido inmovilizado y sirve como molde para una reacción de extensión de bases individuales usando una ADN polimerasa y ddNTPS marcados específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede basarse en fluorescencia o puede basarse en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia flanqueante/inserción debido a amplificación, hibridación y extensión de bases individuales exitosas. Otro método es la técnica de pirosecuenciación descrita por
Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleotido que traslapa la unión del ADN de la inserción y el ADN genómico adyacente. El oligonucleotido es hibridado con el producto de PCR
de cadena sencilla de la región de interés (un iniciador en la secuencia insertada, y uno en la secuencia genómica flanqueante), e incubado en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosin 5' fosfosulfato y luciferina. Se añaden dNTP's individualmente, y la incorporación resulta en una señal luminosa que es medida. Una señal luminosa indica la presencia de la secuencia flanqueante/inserción del transgen debido a amplificación, hibridación y extensión de bases individuales o múltiples exitosas. La polarización con fluorescencia como es descrita por Chen, et al. (Genome Res. 9: 492-498, 1999), es un método que puede usarse para detectar el amplicón de la presente invención. Mediante el uso de este método, se diseña un oiigonucleotido que traslapa la unión del ADN insertado y el ADN flanqueante genómico. El oiigonucleotido es hibridado con el producto de PCR de cadena sencilla de la región de interés (un iniciador en el ADN insertado y uno en la secuencia de ADN genómico flanqueante), e incubado en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado con fluorescencia. La extensión de bases individuales resulta en la incorporación del ddNTP. La incorporación puede medirse como un cambio en polarización usando un fluorímetro. Un cambio en polarización indica la presencia de la secuencia flanqueante/inserción del transgen debido a amplificación, hibridación y extensión de bases individuales exitosas. La prueba TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) se describe como un método de detección y cuantificación de la presencia de
una secuencia de ADN, y es entendida completamente en las instrucciones provistas por el fabricante. En resumen, se diseña una sonda de oligonucleotidos de FRET que traslapa la unión del ADN de la inserción y el ADN flanqueante genómico. La sonda de FRET y los iniciadores de PCR (un iniciador en la secuencia de ADN de la inserción y uno en la secuencia genómica flanqueante) se hacen pasar por un ciclo en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. La hibridación de la sonda de FRET resulta en corte y liberación de la porción fluorescente lejos de la porción de extinción en la sonda de FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de la inserción del transgen/secuencia flanqueante debido a amplificación e hibridación exitosas. Se han descrito guías moleculares para su uso en la detección de secuencias, como se describe en Tyangi, et al. (Nature Biotech. 14: 303-308, 1996). En resumen, se diseña una sonda de oligonucleótidos de FRET que traslapa la unión del ADN de la inserción y el ADN genómico flanqueante. Se obtiene la estructura única de la sonda de FRET, conteniendo en ella la estructura secundaria que mantiene a las porciones fluorescente y de extinción en estrecha proximidad. La sonda de FRET y los iniciadores de PCR (un iniciador en la secuencia de ADN de la inserción y uno en la secuencia genómica flanqueante) se hacen pasar por un ciclo en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. Después de la amplificación por PCR exitosa, la hibridación de la sonda de FRET con la secuencia objetivo resulta en la remoción de la estructura secundaria de la sonda y la separación
espacial de las porciones fluorescente y de extinción, que resulta en la producción de una señal fluorescente. La señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de la inserción del transgen/secuencia flanqueante debido a amplificación e hibridación exitosas. Otros métodos descritos, tales como microfluídica (publicación de patente de E.U.A. 2006068398, patente de E.U.A. No. 6,544,734), proveen métodos y dispositivos que separan y amplifican muestras de ADN. Se usan colorantes ópticos para detectar y cuantificar moléculas de ADN específicas (véase documento WO/05017181 ). Se usan también dispositivos de nanotubos (véase documento WO/06024023) que comprenden un sensor electrónico para la detección de moléculas de ADN o nanoperlas que se unen a moléculas de ADN específicas y que pueden detectarse entonces. Se proveen equipos de detección de ADN usando las composiciones descritas en la presente. Los equipos son útiles para la identificación de ADN del evento de maíz MON89034 en la muestra, y pueden aplicarse por lo menos a métodos para mejorar genéticamente plantas de maíz que contienen al ADN del evento adecuado. Los equipos contienen iniciadores y/o sondas de ADN que son homólogos o complementarios a segmentos seleccionados de las secuencias como se exponen en SEQ !D NOs: 1 a 7, o iniciadores o sondas de ADN homólogos o complementarios a ADN contenido en los elementos genéticos del transgen de ADN como se expone en el listado de secuencias. Estas secuencias de ADN pueden usarse en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un método de
hibridación de ADN, para detectar la presencia de polinucleótidos que sirven de diagnóstico para la presencia del ADN objetivo en una muestra. La producción de un amplicón predefinido en una reacción de amplificación térmica, sirve de diagnóstico para la presencia de ADN que corresponde a ADN del genoma de PTA-7455 en la muestra. Si se selecciona hibridación, la detección de hibridación de la sonda con la muestra biológica sirve de diagnóstico para la presencia de ADN del evento transgénico MON89034 en la muestra. Típicamente, la muestra es maíz, o productos de maíz o subproductos del uso de maíz. La presente invención provee una planta de maíz transgénica designada como evento de maíz MON89034, progenie de la planta, y células de la planta, así como semilla producida de la planta. Semilla representativa para el crecimiento de la planta, para la producción de progenie, para la obtención de células, o para la producción de un cultivo de dicha semilla que comprende el evento de maíz transgénico, ha sido depositada en marzo 28 de 2006 con la American Type Culture Collection (ATCC), y tiene el número de acceso PTA-7455. La planta y células y productos obtenidos de estas modalidades y similares, contienen ADN que sirve de diagnóstico para la presencia de ADN derivado de cualquier célula derivada del evento de maíz transgénico MON89034 en cualquier muestra biológica. Esto es porque estas dos secuencias novedosas están contenidas dentro de las células del evento de maíz transgénico MON89034. El ADN que sirve de diagnóstico comprende
una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. La relación de estas secuencias se describe más particularmente en la presente, y en la leyenda de la figura 1 y con relación a la figura 1. Plantas de maíz obtenidas de semilla que son homocigóticas para el ADN que sirve de diagnóstico para el evento de maíz transgenico MON89034, están también dentro del alcance de la presente invención. Plantas de maíz obtenidas de semilla que son heterocigóticas para el ADN que sirve de diagnóstico para el evento de maíz transgénico MON89034, están también dentro del alcance de la presente invención, en tanto estas semillas comprendan también las secuencias de ADN que sirven de diagnóstico. Células, semillas y tejido producido de dichas plantas que comprenden el ADN que sirve de diagnóstico, están también dentro del alcance de la presente invención. Plantas de maíz y células de plantas de maíz y similares que comprendan ADN que sirve de diagnóstico para el evento de maíz transgénico MON89034, exhiben resistencia a la infestación por insectos lepidópteros. Estas células y plantas contienen ADN que codifica para la proteína insecticida (insecticida, agente tóxico) Cry2Ab, y ADN que tiene secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 que forman parte del genoma de las células de la planta. Estas plantas y células vegetales contienen también un ADN que codifica para la proteína insecticida (insecticida, agente tóxico) Cry1A.105. Estas proteínas pueden ser referidas como una primera y
una segunda proteínas insecticidas, respectivamente, o a la inversa. La expresión de estas proteínas se logra de los elementos genéticos/componentes reguladores que están incluidos dentro de los cassettes de expresión que proveen la expresión de cada una de las secuencias de ADN que codifican para estas toxinas, y se describen enteramente en la presente y en la leyenda de la figura 1 y con relación a la figura 1 y la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5. Las plantas de maíz y células de plantas de maíz que comprendan estas secuencias, son efectivas para proteger a las plantas de la infestación por plagas de lepidópteros, ya sea heterocigóticas u homocigóticas para los alelos en los cuales estas secuencias codificantes están presentes. La presente invención provee también amplicones que pueden producirse de las secuencias descritas en la presente que sirven de diagnóstico para la presencia, en una muestra biológica, de ADN derivado de ADN del evento de maíz transgénico MON89034. Un amplicón que sirve de diagnóstico para la presencia de ADN del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica, contiene por lo menos un segmento de polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Estos amplicones pueden producirse usando secuencias de iniciadores como se describe en la presente más adelante, de cualquier muestra biológica que contenga por lo menos aproximadamente 0.5 femtomoles o aproximadamente 0.5 picogramos de ADN derivado del evento de maíz transgénico MON89034. Dichas fuentes de
ADN de muestras biológicas que corresponden al evento de maíz transgénico MON89034, pueden ser harina integral de maíz, aceite de maíz, torta de maíz, semilla de maíz, germen de maíz, almidón de maíz y harina de maíz, y similares, derivados de ese evento transgénico. La invención provee también moléculas de polinucleótidos aisladas que exhiben secuencias de nucleotidos contiguas tales como las expuestas en SEQ ID NO: 5. Estas secuencias de nucleotidos contiguas comprenden: (1 ) de aproximadamente 1 1 a aproximadamente 12000 nucleotidos de cualquier longitud intermedia, y comprenden además los nucleotidos contiguos como se expone en la posición de nucleótido 1 a 11 ó 9 a 20 en SEQ ID NO: 1 , y 1 a 11 ó 9 a 20 como se expone en SEQ ID NO: 2; (2) cualquier secuencia de nucleotidos contigua como se expone en SEQ ID NO: 3 de aproximadamente 1 1 a aproximadamente 2000 nucleotidos y cualquier longitud intermedia, y comprenden además los nucleotidos contiguos como se expone en la posición de nucleótido 1 a 11 y 9 a 20 como se expone en SEQ ID NO: 1 ; cualquier secuencia de nucleotidos contigua como se expone en SEQ ID NO: 4 de aproximadamente 11 a aproximadamente 914 nucleotidos, y cualquier longitud intermedia, y comprenden además los nucleotidos contiguos como se expone en. !a posición. de nucleótido 1 a 1 1 y 9 a 20 como se expone en SEQ ID NO: 2. Estas moléculas de polinucleótidos aisladas son útiles en métodos de amplificación de ADN que producen uno o más amplicones de una muestra biológica que contiene ADN de maíz. La detección de dicho amplicón sirve de diagnóstico
para la presencia de ADN del evento de maíz transgénico MON89034 en la muestra. Las moléculas de polinucleótidos aisladas son también útiles en varios métodos de detección de nucleótidos para detectar la presencia de ADN derivado del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica. En particular, sondas de polinucleótidos que comprendan por lo menos aproximadamente 11 nucleótidos contiguos como se expone en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, son útiles como sondas en dichos métodos para detectar ADN del evento transgénico MON89034 en una muestra. Las secuencias complementarias de estas moléculas de polinucleótidos aisladas son también útiles en los mismos métodos de amplificación y/o detección. Equipos para su uso en la detección de la presencia de ADN derivado del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica, son provistos también por la presente invención. Un equipo que use una molécula de polinucleótido sonda, la molécula sonda conteniendo por lo menos de aproximadamente 11 a aproximadamente 12000 nucleótidos contiguos que exhiben homología sustancial, o que exhiben complementariedad sustancial con un segmento de nucleótidos que comprende una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5, sería útil para detectar la presencia de ADN de MON89034 en una muestra. La molécula sonda debe contener por lo menos una de las secuencias como se expone en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 pueden ser referidas también como secuencias de unión, es decir, las secuencias en cualquier extremo del ADN transgénico insertado en
la planta de maíz, que da lugar al evento de maíz transgénico MON89034. Estas secuencias, referidas arbitrariamente como extremos 5' y 3', respectivamente, contienen parte de la secuencia de ADN insertada y parte de la secuencia flanqueante del genoma del maíz. Por ejemplo, SEQ ID NO: 1 representa en su mitad 5' el extremo 3' de la secuencia del genoma del maíz que flanquea el extremo 5' del ADN insertado, el extremo 5' del ADN insertado siendo representado por la mitad del extremo 3' de la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 representa en su mitad 5' el extremo 3' del ADN insertado, y en su mitad del extremo 3' el extremo 5' de la secuencia del genoma del maíz que flanquea el extremo 3' del ADN insertado. En el genoma del maíz de ocurrencia natural en la posición de la secuencia insertada expuesta en SEQ ID NO: 5, la secuencia flanqueante en el extremo 5' del ADN insertado y la secuencia flanqueante en el extremo 3' del ADN insertado son unidas, y una primera molécula iniciadora que híbrida con la secuencia complementaria a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 (diferente de los 21 nucleotidos del extremo 3' de SEQ ID NO: 3) y una segunda molécula iniciadora que híbrida con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4 (diferente de los 20 nucleotidos del extremo 5' de SEQ ID NO: 4), producirán un amplicón en una reacción de amplificación térmica con un molde que es ADN diferente del ADN de MON89034 que sirve de diagnóstico para la ausencia del ADN insertado en MON89034, y los mismos iniciadores producirán un amplicón que ligeramente tiene más de 12000 nucleotidos (dependiendo de la posición de los iniciadores en las secuencias flanqueantes
expuestas en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4), cuando se usa ADN de MON89034 como molde. Se proveen también otras modalidades. Se provee un equipo para detectar la secuencia de unión SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica. El equipo contiene una sonda de polinucleótidos que es complementaria o es completamente complementaria a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o complementos de las mismas, y contiene también un par de iniciadores para su uso en una reacción de amplificación de ácido nucleico. El par de iniciadores puede ser referido como un primer iniciador que consiste de por lo menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos de la porción del genoma del maíz de SEQ ID NO: 3, y un segundo iniciador que consiste de por lo menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos complementarios a la porción de ADN heterólogo de la inserción de SEQ ID NO: 5. El primer iniciador del par de iniciadores de polinucleótidos híbrida específicamente con la secuencia complementaria inversa que corresponde a la que se expone en SEQ ID NO: 3, de aproximadamente la posición de nucleotido 1 a aproximadamente la posición 2050, y el segundo iniciador de dicho par de iniciadores de polinucleótidos híbrida específicamente con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5, de aproximadamente la posición de nucleotido 2060 a aproximadamente la posición de nucleotido 12,208, y se extienden entre sí para formar un amplicón que comprende SEQ ID NO: 1 , dicho amplicón sirviendo de
diagnóstico para la presencia de ADN del evento MON89034 en la muestra. Un diferente par de iniciadores puede ser referido como un primer iniciador que consiste de por lo menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos complementarios a la porción del genoma de maíz de SEQ ID NO: 4, y un segundo iniciador que consiste de por lo menos aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos de la porción de ADN heterólogo de la inserción de SEQ ID NO: 5. El segundo iniciador del par de iniciadores de polinucleótidos híbrida específicamente con la secuencia complementaria inversa que corresponde a la expuesta en SEQ ID NO: 5, de aproximadamente la posición de nucleótido 1 a aproximadamente la posición 11305, y el primer iniciador del par de iniciadores de polinucleótidos híbrida específicamente con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4, de aproximadamente la posición de nucleótido 21 a aproximadamente la posición de nucleótido 914, y se extienden uno hacia el otro para formar un amplicón que comprende SEQ ID NO: 2, dicho amplicón sirviendo de diagnóstico para la presencia de ADN del evento MON89034 en dicha muestra. Estos pares de iniciadores son útiles para producir amplicones que comprenden SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, según pueda ser el caso, y sirven de esta manera de diagnóstico para la presencia de ADN de MON89034 en una muestra biológica. Estos amplicones permiten la detección de la presencia de una secuencia de unión que sirve de diagnóstico para el evento de maíz MON89034 en una muestra biológica.
Se provee también un método para producir y detectar un amplicon que sirve de diagnóstico para el ADN del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica que comprende ADN de maíz. El método comprende poner en contacto la muestra biológica junto con dos o más iniciadores en una reacción de amplificación de ácido nucleico, realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, y detectar entonces el amplicon. La presencia del amplicon sirve de diagnóstico para el ADN de dicho evento en la muestra, en tanto el amplicon contenga por lo menos una de las secuencia contiguas como se expone en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, de aproximadamente la posición de nucleótido 1 a 1 1 ó 9 a 20, o las secuencias complementarias que correspondan a estas posiciones. Las secuencias de nucleótidos que sirven de diagnóstico para la presencia del evento de maíz transgénico MON89034 en una muestra biológica, pueden detectarse también usando otros métodos, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra biológica que se sospecha contiene ADN de MON89034 con una sonda que hibride bajo condiciones de hibridación severa con una o más de las secuencias de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, sometiendo la muestra y la sonda a condiciones de hibridación severa; y entonces detectando !a hibridación de !a sonda con la secuencia de nucleótidos. La detección de hibridación sirve de diagnóstico para la presencia de ADN de MON89034 en la muestra. Iniciadores de polinucleótidos para su uso en la producción, en una reacción de amplificación térmica, de un amplicon que sirva de
diagnóstico para la presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica, son provistos también por la presente invención. Típicamente, los iniciadores se proveen en pares, los miembros del par de iniciadores siendo referidos por conveniencia como un primer iniciador y un segundo iniciador. Un primer iniciador puede consistir de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de la porción del genoma del maíz como se expone en SEQ ID NO: 3, y un segundo iniciador puede consistir de por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos contiguos complementarios a la porción de ADN heterólogo de la inserción como se expone en SEQ ID NO: 5. Estos dos iniciadores producirían un amplicón en una reacción de amplificación térmica con ADN molde obtenido de ADN del evento de maíz ON89034 que contiene una secuencia de polinucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 1. En forma alternativa, un primer iniciador puede consistir de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de la porción del genoma del maíz de SEQ ID NO: 4, y un segundo iniciador puede consistir de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos complementarios a la porción de ADN heterólogo de la inserción de SEQ ID NO: 5. Estos dos iniciadores producirían un amplicón en una reacción de amplificación térmica con ADN molde obtenido de ADN de! evento de maíz ON89034 que contiene una secuencia de polinucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 2. Un método alternativo para detectar una secuencia de unión del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica que comprende ADN de maíz, tal como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, consiste en poner en contacto
la muestra con una sonda de polinucleótidos que hibride bajo condiciones de hibridación severa con una de las secuencias de unión, someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación severa; y detectar la hibridación de la sonda con la secuencia de unión. La detección de la unión/hibridación de la sonda con la secuencia de unión, es indicativa de la presencia de ADN de MON89034 en la muestra biológica. Una planta de maíz establemente transformada, cuyo ADN produzca un amplicón de ADN que comprenda SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 cuando se somete al método expuesto en la presente, está dentro del alcance de la presente invención. Ejemplos de secuencias de iniciadores, en particular, un par de secuencias de iniciadores, se exponen en la presente en los ejemplos y en SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. Un método alternativo para detectar la presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en una muestra biológica, puede consistir de los pasos de poner en contacto la muestra con una sonda que hibride bajo condiciones de hibridación severa con ADN de MON89034, y no hibride bajo condiciones de hibridación severa con ADN genómico de la planta de maíz que no sea ADN de MON89034, someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación severa, y detectar entonces la hibridación de la sonda con ADN de MON89034. Una sonda consistente con esta modalidad, es complementaria a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. La detección de hibridación de la sonda con la muestra sirve de diagnóstico para la presencia del polinucleótido del evento
de maíz MON89034 en la muestra. La muestra biológica puede ser cualquier muestra que contenga ADN de MON89034 incluyendo, pero no limitada a, aceite de maíz, harina integral de maíz, harina de maíz, gluten de maíz, torta de maíz, almidón de maíz, solución de infusión de maíz, tejido de maíz, células de maíz, grano de maíz, polen de maíz, tejido de la raíz de maíz, DDGS, e incluso etanol producido como un subproducto de la fermentación de dicho maíz transgénico, en tanto la muestra contenga por lo menos una cantidad detectable de un polinucleótido que sirva de diagnóstico para la presencia del evento MON89034 en la muestra. Una sonda de polinucleótidos puede ser cualquier nucleótido seleccionado del grupo que consiste de un ácido desoxirribonucleico, un ácido ribonucleico, y un análogo de nucleótido, y puede ser marcada con por lo menos un fluoróforo, molécula que contenga un isótopo radioemisor, o una molécula tipo hapteno que pueda detectarse específicamente con un anticuerpo u otra reacción de tipo unión. Una variedad de maíz que comprende un ADN que sirve de diagnóstico para la presencia de ADN del evento transgénico MON89034, puede obtenerse mejorando genéticamente una planta de maíz que comprende ADN del evento de maíz transgénico MON89034 junto con una planta de maíz diferente del evento MON89034 que produce una planta de maíz híbrida que comprende ADN que sirve de diagnóstico para dicho evento. Dicha planta de maíz híbrida que comprende ADN que sirve de diagnóstico para el evento de maíz transgénico MON89034 está dentro del alcance de la presente invención, como lo están las semillas producidas del híbrido (en
tanto comprenda ADN que sirva de diagnóstico para el evento de maíz transgénico MON89034), y polen, óvulo, semilla, raíces u hojas de la planta de maíz híbrida MON89034, también al grado de que éstos contengan las secuencias de ADN que sirven de diagnóstico, y progenie producida de dichas modalidades. La presente invención provee un método para proteger a una planta de maíz de la infestación por insectos lepidópteros, que comprende proveer en la dieta de una plaga de insectos lepidópteros objetivo, una o más células de la planta de maíz transgénica, cada célula de la planta de maíz comprendiendo en su genoma un polinucleotido que corresponda a la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y la secuencia de nucleótidos contigua como se expone en SEQ ID NO: 5 entre SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. El insecto lepidóptero objetivo que se alimente de dichas células de la planta de maíz transgénica, se ve impedido para que siga alimentándose de la planta de maíz de la cual las células de la planta de maíz se derivan. La presente invención provee también composiciones que son tóxicas a plagas de lepidópteros objetivo de plantas de maíz. Una composición de células de la planta transgénica provistas en la dieta de una plaga de insectos lepidópteros objetivo, en la cual cada célula de la planta de maíz transgénica comprende en su genoma un polinucleotido que corresponde a la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, junto con la secuencia de nucleótidos contigua como se expone en SEQ ID
NO: 5 entre SEQ ID NO: 1 y 2 SEQ ID NO: 2, es efectiva para brindar protección contra la infestación por insectos lepidópteros a una planta de maíz o células de la planta de maíz, en tanto la planta de maíz o células de la planta de maíz estén expresando Cry1A.105 y/o Cry2Ab2 de los cassettes de expresión contenidos dentro de la secuencia de nucleótidos contigua. Dichas composiciones, en la forma de semilla de maíz transgénica, han sido depositadas con la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PTA-7455. Dichas plantas de maíz resistentes a insectos, o partes de las mismas, contendrán ADN en el genoma de las células de dicha planta que tiene por lo menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. La progenie y las semillas de la planta de maíz resistente a insectos, en la cual la progenie y las semillas tienen las secuencias que sirven de diagnóstico referidas en la presente, se incluyen también dentro del alcance de la presente invención. Dichas plantas de maíz resistentes a insectos pueden producirse en un método que comprende cruzar un evento de planta de maíz transgénica MON89034 con una planta de maíz diferente, y seleccionar la progenie resistente a insectos analizando por lo menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. El evento de la planta de maíz transgénica MON89034 resistente a insectos puede combinarse con otras variedades transgénicas de maíz, tales como maíz resistente a herbicidas tales como glifosato, glufosinato y
dicamba, y similares, o maíz resistente a insectos que devoran la raíz como resultado de la inserción de secuencias que codifican para proteínas tales como PS149B1 y Cry3Bb modificada, u otras variedades de maíz transgénico resistentes a la infestación por insectos lepidópteros como resultado de la inserción de secuencias que codifican para otras proteínas tóxicas tales como VIP3A, CryIAb y CryI Fa, y similares. Varias combinaciones de todos estos eventos transgénicos diferentes se reproducen junto con las plantas de maíz de la presente invención, es decir, el evento MON89034, para proveer variedades mejoradas de maíz transgénico híbrido resistente a la infestación por coleópteros y lepidópteros, y resistentes a herbicidas selectivos. Dichas variedades exhiben características mejoradas de rendimiento y tolerancia a la sequía en comparación con las variedades transgénicas de rasgos individuales y no transgénicas. Se provee un método para producir una planta de maíz resistente a la infestación por insectos, en donde la planta de maíz comprende una cantidad insecticidamente efectiva de las secuencias codificantes de toxina como se expone en SEQ ID NO: 5. El método comprende extraer las secuencias codificantes de toxina del evento de maíz transgénico ON89034, e introducir estas secuencias codificantes, solas o en conjunto, en una o más células de maíz, para producir células de maíz transgénicas que comprenden estas una o más secuencias codificantes de toxina. Las células de maíz transgénicas se hacen crecer entonces (se regeneran) en plantas de maíz transgénicas que comprenden las una o más secuencias codificantes, y las
plantas transgénicas exhiben entonces resistencia a la infestación por insectos. La presente invención provee un método para determinar la cigosidad del ADN de una planta de maíz transgénica que comprende ADN del evento de maíz MON89034, con respecto al ADN que sirve de diagnóstico para la presencia de dicho ADN de MON89034 en una muestra biológica. El método consiste, como primer paso, en poner en contacto la muestra con tres diferentes iniciadores que comprendan SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 10, que cuando se usan en conjunto en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN del evento de maíz MON89034, producen un primer amplicón que sirve de diagnóstico para el evento de maíz MON89034, y cuando se usan en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN genómico de maíz diferente del ADN de ON89034, producen un segundo amplicón que sirve de diagnóstico para ADN genómico de maíz diferente del ADN de MON89034. Los siguientes pasos consisten en realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, y comparar los amplicones producidos durante la reacción de amplificación térmica. La detección de la presencia de ambos amplicones, sirve de diagnóstico de la cigosidad de la muestra. La detección de sólo el primer amplicón es indicativa de que la muestra contiene sólo ADN de MON89034, es decir, una muestra homocigótica. La detección de sólo el segundo amplicón es indicativa de la muestra que no contiene ADN de MON89034. La detección del primer y segundo amplicones juntos en una muestra, es
indicativa de una muestra que contiene (1 ) ADN heterocigótico con relación a una muestra pura que contiene sólo material de partida heterocigótico, o (2) una muestra que contiene moléculas de ADN de la muestra de partida homocigótica y heterocigótica, o (3) una muestra que contiene alguna combinación de muestras homocigóticas, heterocigóticas y de otro tipo diferentes del ADN de MON89034. La invención provee también el crecimiento de plantas de maíz que comprenden ADN que sirve de diagnóstico para un segmento de ADN transgénico insertado en el genoma de las células de las plantas de maíz. El ADN en el genoma de las células de maíz comprende cualquier secuencia o la totalidad de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO:
5; (b) las secuencias de nucleótidos como se exponen en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; (c) la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO:
3; y (d) la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO:
4. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de ciertas modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan procedimientos que los inventores han encontrado funcionan bien
en la práctica de la invención, y de esta manera puede considerarse que constituyen ejemplos de modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y que obtienen aún un resultado igual o similar sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención.
EJEMPLOS
EJEMPL0 1
Este ejemplo ilustra la construcción y caracterización molecular del evento de maíz transgénico MON89034. La planta de maíz MON89034 se produjo mediante un procedimiento de transformación mediada por Agrobacterium de una línea de maíz endógama con la construcción de plásmido pMON38850 (el cassette de expresión se muestra en la figura 1 ). El método de transformación usado es similar al descrito en la patente de E.U.A. No. 6,603,061 . La construcción de plásmido pMON38850 contiene los cassettes de expresión ligados de la planta con los elementos genéticos reguladores necesarios para la expresión de la proteína insecticida Cry1 A.105 en las células de la plantas de maíz. Se regeneraron células de maíz en plantas de maíz intactas que consisten de por lo menos aproximadamente 23,000 eventos transgénicos diferentes. Se
seleccionaron eventos transgénicos individuales (plantas) de la población de eventos que mostró integridad de los cassettes de expresión de las plantas y resistencia al daño por la alimentación de las larvas de insectos lepidópteros. Una planta de maíz que contenga en su genoma los cassettes de expresión ligados de la planta de pMON38850, es un aspecto de la presente invención. Después del análisis substancial de estos eventos transgénicos, se seleccionó el evento transgénico MON89034 sobre la base de su caracterización molecular y la ausencia de algún efecto de deficiencia agronómico o fenotípico indeseable. Las secuencias de los elementos genéticos del transgen contenidos en el genoma del maíz MON89034 como se ilustran en la figura 1 consisten de los siguientes elementos, cada uno en ligamiento operable mutuo. Primero en el extremo 5' definido arbitrariamente de la secuencia (es decir, cerca de la porción central izquierda del segmento descrito en la figura 1 ), está marcada una porción de la región de borde derecho (RB) de Agrobacterium tumefaciens. Esta va seguida en secuencia por un cassette de expresión que consiste de un elemento promotor 35S mejorado del CaMV (referido en la presente como P-CaMV35Sen, localizado en las posiciones 2350 a 2651 en SEQ ID NO: 5); una secuencia guía no traducida de proteína de unión a clorofila A/B de trigo (referida en la presente como L-Ta.lhcb1 , localizada en las posiciones 2678 a 2738 en SEQ ID NO: 5); una secuencia de intrón de actina de arroz (referida en la presente como l-Os.Act1 , localizada en las posiciones 2755 a 3234 en SEQ ID NO: 5); una secuencia de
ocurrencia no natural que codifica para el gen quimérico Cry1 A.105 (localizado en las posiciones 3244 a 6777 en SEQ ID NO: 5 ); y una región de terminación 3' de trigo (referida en la presente como T-Ta.Hsp17-1 :1 :1 , localizada en las posiciones 6809 a 7018 en SEQ ID NO: 5). La combinación de los elementos referidos anteriormente, diferentes de la secuencia de borde, funciona en conjunto cuando en una planta de maíz causa la expresión de la proteína insecticida Cry1 A.105. Estos elementos son enlazados entonces en secuencia con otro cassette de expresión que consiste de los siguientes elementos: un promotor del virus del mosaico de la escrofularia (localizado en las posiciones 7086 a 7649 en SEQ ID NO: 5), una secuencia guía de Hsp70 de Zea mays (referida en la presente como HSP70 o I-Hsp70, localizada en las posiciones 7672 a 8475 en SEQ ID NO: 5), y una secuencia codificante de péptidos de tránsito de cloroplastos de Zea mays (referida en la presente como CTP2 o TS-SSU-CTP, localizada en las posiciones 8492 a 8892 en SEQ ID NO: 5). Estos segmentos enlazados operablemente son enlazados entonces a una secuencia de nucleotidos que codifica para la proteína insecticida Cry2Ab (localizada en las posiciones 8893 a 10800 en SEQ ID NO: 5), que está enlazada en su extremo 3' a una región no traducida 3' del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (referida en la presente como T-AGRtu.nos-1 :1 :13, localizada en las posiciones 10827 a 1 1377 en SEQ ID NO: 5). Estos elementos que flanquean la secuencia codificante de Cry2Ab funcionan en conjunto para dirigir la expresión de Cry2Ab cuando están presentes en una planta de maíz. El cassette de expresión de Cry2Ab va
seguido entonces en secuencia por una secuencia de nucleótidos que consiste de una porción suficiente de la región de borde izquierdo (LB) de Agrobacterium tumefaciens. Las moléculas de ADN útiles como iniciadores en métodos de amplificación de ADN, pueden derivarse de las secuencias de los elementos genéticos de la inserción del transgen contenidos en el evento MON89034. Estas moléculas útiles como iniciadores pueden usarse como parte de una serie de iniciadores que incluye también una molécula de iniciador de ADN derivada del genoma del evento que flanquea la inserción del transgen. La porción de ADN del plásmido pMON38850 insertada en el genoma del maíz, que da lugar al evento de la planta de maíz transgénica MON89034, que consiste de los segmentos de borde izquierdo y derecho y los dos cassettes de expresión ligados de la planta (un primer cassette de expresión codificando para Cry1 A.105, y un segundo cassette de expresión codificando para Cry2Ab, en donde cada cassette puede ser intercambiable en cuanto a si uno es designado como un primer cassette o un segundo cassette) entre los segmentos de borde, se caracterizó mediante análisis moleculares detallados. Estos análisis se realizaron para identificar eventos que contenían sólo un segmento insertado intacto e individual que consiste de los bordes y los dos cassettes de expresión deseados entre los bordes (número de sitios de integración dentro del genoma del maíz), el número de copias (el número de copias del ADN de transformación (T) dentro de un locus) y la integridad de los cassettes del gen insertado (es decir, ausencia de
cualquier reordenamiento o variación de secuencia de la secuencia que se sabe está presente en el plásmido pMON38850). Se usaron sondas moleculares de ADN que incluían la región codificante de Cry1A.105 intacta y sus elementos reguladores respectivos, los promotores, intrones y secuencias de poliadenilación de los cassettes de expresión de la planta, y la región de ADN de la estructura de base del plásmido pMON38850. Los datos obtenidos de los análisis de todos los eventos, demostraron que MON89034 contiene una inserción de ADN de transformación (T) individual con una copia del cassette de expresión de Cry1A.105. Ningún elemento adicional del vector de transformación pMON38850, enlazado o no enlazado a cassettes de genes intactos, se detectó en el genoma de MON89034. Por último, se realizaron PCR y análisis de secuencias de ADN, para determinar las uniones de la inserción 5' y 3' al genoma de la planta, confirmar la organización de los elementos dentro de la inserción (véase, por ejemplo, la figura 1 ), y determinar la secuencia completa del ADN insertado en el genoma de la planta de maíz que dio lugar al evento de maíz transgénico MON89034. La secuencia insertada completa, junto con una porción del genoma del maíz que flanquea secuencias en cualquier extremo del ADN insertado, se describe en la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5. Se extrajo ADN genómico de MON89034 y ADN no transgénico de maíz diferente de MON89034 (ADN control) de semillas de maíz, procesando primero la semilla (hasta 200 semillas) hasta un polvo fino en un batidor de pintura Harbil 5G-HD (Harbil Inc., Cincinnati, Ohio). En resumen, la
semilla pulverizada se extrajo en regulador de pH de extracción (EM Science, No. de catálogo 3700, EM Science, Gibbstown, New Jersey, USA), y se precipitó ADN de la solución con isopropanol (Sigma, No. de catálogo 1-0398, Sigma, St. Louis, MO, USA). El ADN precipitado se encanilló en un tubo de microcentrífuga que contenía etanol a 70%. El ADN fue convertido a pellas en una microcentrífuga a velocidad máxima (-14,000 rpm) por ~5 minutos, se secó en vacío y se redisolvió en regulador de pH de TE (pH 8.0). El ADN se almacenó entonces en un refrigerador a 4°C. Este método puede ser modificado por el experto en la técnica para extraer ADN de una semilla de maíz individual. Ejemplos de métodos usados para identificar el evento MON89034 en una muestra, se describen en una PCR TAQMAN® de punto terminal específica del evento para la cual ejemplos de condiciones se describen en el cuadro 1 y el cuadro 2. Los iniciadores de ADN usados en la prueba son los iniciadores SQ2842 (SEQ ID NO: 6), SQ2843 (SEQ ID NO: 7), iniciador marcado 6FAM™ PB880 (SEQ ID NO: 14) e iniciador marcado VIC™ PB2931 (SEQ ID NO: 15). 6FAM y VIC son productos colorantes fluorescentes de Applied Biosystems (Foster City, CA) unidos a los iniciadores de ADN. Para sondas TAQMAN® MGB; la actividad de 5'-exonucleasa de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus rompe la sonda del extremo 5', entre el fluoróforo y el atenuador. Cuando hibridan con la cadena de ADN objetivo, el atenuador y el fluoróforo se separan suficientemente en espacio tridimensional para producir una señal fluorescente (longitud de onda de
excitación del fluoróforo). SQ2842 (SEQ ID NO: 6) y SQ2843 (SEO ID NO: 7), cuando se usan en estos métodos de reacción con PB880 (SEQ ID NO: 14), producen un amplicón de ADN que sirve de diagnóstico para ADN del evento MON89034. Los controles para este análisis deben incluir un control positivo de maíz que contiene ADN del evento MON89034, un control negativo de maíz no transgénico o de maíz transgénico diferente del evento MON89034, y un control negativo que no contenga ADN molde. SQ1564 (SEQ ID NO: 17) y SQ1565 (SEQ ID NO: 18), cuando se usan en estos métodos de reacción con PB351 (SEQ ID NO: 21 ), producen un amplicón que sirve de diagnóstico para Cry1 A.105 en MON89034. Estas pruebas se optimizan para su uso con un sistema de PCR 9700 GeneAmp de Applied Biosystems o Robocycler (ciclador robótico) de Stratagene, MJ Engine, sistema de PCR 9700 de Perkin-Elmer, o thermocycler (ciclador térmico) de gradiente Mastercycler Eppendorf. Otros métodos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica, que producen amplicones y que identifican ADN del evento MON89034, están dentro de la aptitud de la técnica. Cualquier sonda que se una específicamente a SEQ ID NO: 1 o a su secuencia complementaria perfecta en una muestra biológica, y contenga por lo menos 1 1 nucleótidos contiguos como se expone en SEQ ID NO: 1 , o según pueda ser el caso, el complemento inverso de la secuencia en SEQ ID NO: 1 , en tanto la unión pueda detectarse, sirve de diagnóstico para la
presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en esa muestra. Cualquier sonda que se una específicamente a SEQ ID NO: 2 o a su secuencia complementaria perfecta en una muestra biológica, y contenga por lo menos 1 1 nucleótidos contiguos como se expone en SEQ ID NO: 2, o según pueda ser el caso, el complemento inverso de la secuencia en SEQ ID NO: 2, en tanto la unión pueda detectarse, sirve de diagnóstico para la presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en esa muestra. Se considera que cualquier par de iniciadores que se use o sea diseñado para su uso en la producción de un amplicón de una muestra biológica que comprende ADN de maíz, y el amplicón comprenda cualquiera de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o según pueda ser el caso, comprenda ambas secuencias, está dentro del alcance de la presente invención. Para los propósitos de la invención descritos en la presente, se considera que cualquiera de dichos amplicones que comprendan cualquiera de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o ambas, sirve de diagnóstico para la presencia de ADN del evento de maíz MON89034 en dicha muestra biológica. El siguiente ejemplo se provee como referencia para los expertos en la técnica.
CUADRO 1 PCR TAQMAN de punto terminal específica del evento de maíz MON89034
La amplificación del ADN puede planearse y llevarse a cabo usando cualquier medio para termociclado, incluyendo manipulaciones
manuales o manipulaciones electrónicamente controladas de pasos y ciclos de temperatura. Se ha usado exitosamente el Robocycler de Stratagene, MJ Engine, sistema de PCR 9700 de Perkin-Elmer, o el thermocycler de gradiente Mastercycler Eppendorf, o el sistema de PCR 9700 GeneAmp de Applied Biosystems, o el thermocycler PTC-225 para ADN de MJ Research, para llevar a cabo los siguientes parámetros de ciclado. Cuando se emprende la PCR en el thermocycler de gradiente Mastercycler Eppendorf o MJ Engine, el thermocycler se hace pasar por un ciclo en el modo calculado. Cuando se usa el sistema de PCR 9700 de Perkin-Elmer, las condiciones de ciclado se llevan a cabo con el ajuste de velocidad ascendente al máximo.
CUADRO 2 Condiciones del thermocycler para la prueba de ciqosidad
EJEMPLO 2
Este ejemplo ilustra la identificación de una planta de maíz que comprende ADN que sirve de diagnóstico para el evento de maíz transgénico
MON89034 en su genoma, y la determinación de la cigosidad de dicha planta de maíz. Los métodos usados para identificar la progenie heterocigótica de la homocigótica que contiene ADN del evento MON89034 en su genoma, se describen en una prueba de cigosidad para la cual las condiciones se ejemplifican en el cuadro 3 y el cuadro 4. Los ejemplos de iniciadores de ADN usados en la prueba de cigosidad son los iniciadores SQ2842 (SEQ ID NO: 6), SQ2843 (SEQ ID NO: 7), SQ6523 (SEQ ID NO: 10), SQ6524 (SEQ ID NO: 1 1 ), iniciador marcado 6FAM™ PB880 (SEQ ID NO: 14) e iniciador marcado VIC™ PB2931 (SEQ ID NO: 15). Como se indicó anteriormente, 6FAM y VIC son productos colorantes fluorescentes de Applied Biosystems (Foster City, CA) unidos al iniciador de ADN. SQ2842 (SEQ ID NO: 6), SQ2843 (SEQ ID NO: 7), SQ6523 (SEQ ID NO: 10) y SQ6524 (SEQ ID NO: 11 ), cuando se usan en conjunto en una reacción de amplificación térmica en la cual una muestra biológica que contiene ADN molde contiene ADN que sirve de diagnóstico para la presencia del evento de maíz MON89034 en la muestra, producen un amplicón de ADN que sirve de diagnóstico para ADN de maíz diferente del ADN del evento de maíz MON89034 (independiente de si el ADN de maíz se deriva de la muestra no transgénica o de alguna otra fuente transgénica). En forma alternativa, la reacción producirá dos diferentes amplicones de ADN de una muestra biológica que contiene ADN derivado de un genoma de maíz que es heterocigótico para el alelo que corresponde al ADN insertado presente en el
evento de maíz transgénico MON89034. Estos dos diferentes amplicones corresponderán a un primer amplicón que se deriva del locus del genoma de maíz de tipo silvestre, y un segundo amplicón que sirve de diagnóstico para la presencia de ADN del evento de maíz MON89034. Una muestra de ADN de maíz que dé lugar sólo a un amplicón individual que corresponda al segundo amplicón descrito para el genoma heterocigótico, sirve de diagnóstico para la presencia del evento de maíz MON89034 en la muestra, y sirve de diagnóstico para determinar que el ADN de maíz usado como molde surge de una semilla de maíz que es homocigótica para el alelo que corresponde al ADN insertado del evento de maíz transgénico MON89034. Los controles para este análisis deben incluir un control positivo de maíz homocigótico y heterocigótico que contenga ADN del evento MON89034, un control negativo de maíz no transgénico o cualquier otra variedad de maíz transgénico, y un control negativo que no contenga ADN molde. Esta prueba es optimizada para su uso con un Robocycler de Stratagene, MJ Engine, sistema de PCR 9700 de Perkin-Elmer, o thermocycler de gradiente Mastercycler Eppendorf. Otros métodos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica que producen amplicones que identifican la cigosidad de la progenie de cruzas obtenidas con plantas MON89034, están dentro de la aptitud de la técnica.
CUADRO 3 Soluciones de reacción de la prueba de cigosidad
Se ha usado exitosamente el Robocycler de Stratagene, MJ
Engine, sistema de PCR 9700 de Perkin-Elmer, o el thermocycler de gradiente
Mastercycler Eppendorf, o el sistema de PCR 9700 GeneAmp de Applied
Biosystems, o el thermocycler PTC-225 para ADN de MJ Research, para
llevar a cabo los siguientes parámetros de ciclado. Cuando se usa el
thermocycler de gradiente Mastercycler Eppendorf o MJ Engine, los ciclos se
llevan a cabo en el modo calculado. Cuando se usa el sistema de PCR 9700 de Perkin-Elmer, los ciclos se llevan a cabo con el ajuste de velocidad
ascendente al máximo.
CUADRO 4 Condiciones del thermocycler para la prueba de ciqosidad3
a: Usando el sistema de PCR 9700 GeneAmp de Applied Biosystems.
Semilla que corresponde al evento transgénico MON89034, ha sido depositada en marzo 28 de 2006 bajo el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard,
Manassas, Va. 201 10. El número de acceso de la ATCC o designación del
depósito de patente es PTA-7455. El depósito se mantendrá en el depositario por un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o por la vida efectiva de la patente, cualquiera que dure más tiempo, y será reemplazado según sea necesario durante ese período. Habiendo ilustrado y descrito los principios de la presente invención, debe ser evidente para los expertos en la técnica que la invención puede modificarse en disposición y detalles sin que se aparte de dichos principios. Se reclaman todas las modificaciones que estén dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y documentos de patente publicados citados en esta especificación, se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora en la presente como referencia.
Claims (10)
1. - Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, o complemento de las mismas.
2. - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o complemento de las mismas.
3. - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque consiste esencialmente de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o complemento de la misma.
4. - Una célula de planta de maíz transgénica que comprende la molécula de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. - Una planta de maíz transgénica, o partes de la misma, que comprenden la molécula de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. - Semilla de la planta de maíz transgénica de la reivindicación 5, en donde dicha semilla comprende dicha molécula de ADN.
7. - Una planta de maíz transgénica, o partes de la misma, la semilla de dicha planta de maíz habiendo sido depositada con la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PTA-7455.
8. - Una planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma, en donde ADN que codifica para Cry2Ab y ADN que tiene las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, forman una parte del genoma en las células de dicha planta de maíz o partes de la misma.
9. - La planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende ADN que codifica para Cry 1 A.105.
10. - Semilla de la planta de maíz resistente a insectos de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizada además porque dicha semilla comprende dicho ADN que codifica para Cry2Ab, y dicho ADN tiene las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. 1 1.- Una composición derivada de la planta de maíz transgénica, o partes de la misma, de la reivindicación 5, en donde dicha composición comprende una cantidad detectable de dicha molécula de ADN, y en donde dicha composición es un producto seleccionado del grupo que consiste de harina integral de maíz, aceite de maíz, torta de maíz, semilla de maíz, germen de maíz, almidón de maíz, harina de maíz, polen de maíz, estigmas de maíz, solución de infusión de maíz, malta de maíz, azúcar de maíz, jarabe de maíz, margarina producida de aceite de maíz, sólidos de géneros secos de destilador (DDGS), cosmético y agente de abultamiento. 12.- Un método para producir una planta de maíz resistente a insectos, que comprende: (a) cruzar la planta de maíz transgénica de conformidad con la reivindicación 5 con otra planta de maíz; (b) obtener por lo menos una planta de la progenie derivada de la cruza de (a); y (c) seleccionar la progenie que comprenda secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, en donde dicha progenie seleccionada sea una planta de maíz resistente a insectos. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho paso de selección (c) incluye someter dicha planta de la progenie (por lo menos una) obtenida del inciso (b), a una reacción de amplificación de ácido nucleico, en donde se selecciona la progenie que produce un amplicón que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o someter dicha planta de la progenie (por lo menos una) obtenida del inciso (b), a una reacción de hibridación de ácido nucleico, en donde se selecciona la progenie que híbrida con una sonda que híbrida bajo condiciones severas con una o más secuencias de ADN seleccionadas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. 14. - Un método para producir una planta de maíz resistente a insectos, que comprende: (a) transformar una célula de la planta de maíz con la molécula de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y (b) regenerar una planta de maíz de dicha célula transformada, en donde dicha planta de maíz comprende dicha molécula de ADN y es resistente a insectos. 15. - Un método para proteger a una planta de maíz de la infestación por insectos, que comprende proveer en la dieta de una plaga de lepidópteros del maíz, una cantidad insecticidamente efectiva de células o tejidos de la planta de maíz transgénica, o partes de la misma, de cualquiera de las reivindicaciones 5, 7, 8 y 9. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicha plaga de lepidópteros se selecciona del grupo que consiste de la gardama (Spodoptera frugiperda), el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), el gusano del maíz (Helicoverpa zea), el barrenador del sudoeste del maíz (Diatraea grandiosella) y la gardama negra {Agrotis ípsilon). 17. - Un par de moléculas de ADN que comprenden: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde las moléculas de ADN son de longitud suficiente de nucleotidos contiguos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, o su complemento, que funcionan como iniciadores o sondas de ADN que sirven de diagnóstico para ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma. 18. - El par de moléculas de ADN de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha primera molécula de ADN comprende 1 1 o más nucleotidos contiguos de cualquier porción de la región del transgen de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, o complemento de las mismas, y dicha segunda molécula de ADN comprende una longitud similar de una región de ADN genómico flanqueante 5' del maíz de SEQ ID NO: 3, o complemento de la misma. 19. - El par de moléculas de ADN de conformidad con !a reivindicación 18, caracterizado además porque dicha primera molécula de ADN comprende por lo menos 15 nucleotidos contiguos complementarios a la porción de ADN heterólogo de la inserción de SEQ ID NO: 5, y en donde dicha segunda molécula de ADN comprende por lo menos 15 nucleotidos contiguos de la porción del genoma del maíz de SEQ ID NO: 3. 20.- El par de moléculas de ADN de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha primera molécula de ADN híbrida específicamente con SEQ ID NO: 5 de aproximadamente la posición de nucleótido 2060 a aproximadamente la posición de nucleótido 12,208, y en donde dicha segunda molécula de ADN híbrida específicamente con la secuencia complementaria inversa que corresponde a SEQ ID NO: 3, de aproximadamente la posición de nucleótido 1 a aproximadamente la posición 2050. 21.- Un par de moléculas de ADN que comprenden: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde las moléculas de ADN son de longitud suficiente de nucleotidos contiguos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o su complemento, que funcionan como iniciadores o sondas de ADN que sirven de diagnóstico para ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma. 22. - El par de moléculas de ADN de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicha primera molécula de ADN comprende 11 o más nucleotidos contiguos de cualquier porción de la región del transgen de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o complemento de las mismas, y dicha segunda molécula de ADN comprende una longitud similar de una región de ADN genómico flanqueante 3' del maíz de SEQ ID NO: 4, o complemento de la misma. 23. - El par de moléculas de ADN de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha primera molécula de ADN comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la porción de ADN heterólogo de la inserción de SEQ ID NO: 5, y en donde dicha segunda molécula de ADN comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a la porción del genoma del maíz de SEQ ID NO: 4. 24. - El par de moléculas de ADN de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha primera molécula de ADN híbrida específicamente con la secuencia complementaria inversa que corresponde a SEQ ID NO: 5 de aproximadamente la posición de nucleótido 1 a aproximadamente la posición 1 1 ,305, y en donde dicha segunda molécula de ADN híbrida específicamente con SEQ ID NO: 4 de aproximadamente la posición de nucleótido 21 a aproximadamente la posición de nucleótido 914. 25. - El par de moléculas de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, caracterizado además porque dicha primera molécula de ADN comprende SEQ ID NO: 6, y dicha segunda molécula de ADN comprende SEQ ID NO: 7. 26. - Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 en una muestra biológica, el método comprendiendo: (a) poner en contacto dicha muestra biológica con un par de iniciadores de ADN que comprendan moléculas de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3 o su complemento, SEQ ID NO: 4 o su complemento y SEQ ID NO: 5 o su complemento, para funcionar como iniciadores o sondas de ADN que sirvan de diagnóstico para ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma; (b) proveer una condición de reacción de amplificación de ácido nucleico; (c) realizar dicha reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esta manera una molécula de amplicón de ADN; y (d) detectar dicha molécula de amplicón de ADN, en donde la detección de un amplicón que comprenda por lo menos una de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 y complemento de las mismas, es indicativa de la presencia de dicha molécula de ADN en dicha muestra biológica. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicha muestra biológica es una muestra de ADN extraída de una planta de maíz. 28. - Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 en una muestra biológica, el método comprendiendo: (a) poner en contacto dicha muestra biológica con una sonda de ADN que híbrida bajo condiciones de hibridación severa con dicha molécula de ADN, y no híbrida bajo las condiciones severas con una muestra biológica que no contiene dicha molécula de ADN; (b) someter dicha muestra biológica y sonda de ADN a condiciones de hibridación severa; y (c) detectar !a hibridación de dicha sonda de ADN con dicha muestra biológica, en donde la detección de hibridación es indicativa de la presencia de dicha molécula de ADN en dicha muestra biológica. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicha muestra biológica es una muestra de ADN extraída de una planta de maíz. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizado además porque dicha sonda de ADN comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o complemento de las mismas. 31. - El método de conformidad con las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado además porque dicha sonda de ADN es marcada con por lo menos un fluoróforo. 32. - El método de conformidad con la reivindicación 26 ó 28, caracterizado además porque dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de harina integral de maíz, aceite de maíz, torta de maíz, semilla de maíz, germen de maíz, almidón de maíz, harina de maíz, polen de maíz, estigmas de maíz, solución de infusión de maíz, malta de maíz, azúcar de maíz, jarabe de maíz, margarina producida de aceite de maíz, sólidos de géneros secos de destilador (DDGS), cosmético y agente de abultamiento. 33. - Un equipo de detección de ADN, que comprende: por lo menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 para funcionar como una sonda o iniciador de ADN específico de! evento de maíz MON89034 y/o su progenie. 34. - El equipo de detección de ADN de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha molécula de ADN (por lo menos una) comprende SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, o complemento de las mismas. 35. - El equipo de detección de ADN de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque dicha molécula de ADN (por lo menos una) es SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, o complemento de las mismas. 36. - El equipo de detección de ADN de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho equipo comprende un par de moléculas de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25. 37. - Un método para determinar la cigosidad de ADN de una planta de maíz que comprende el evento de maíz MON89034 en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto dicha muestra con una serie de iniciadores que comprende SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 10, que (1 ) cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN del evento de maíz MON89034, produce un primer amplicón que sirve de diagnóstico para el evento de maíz MON89034, y (2) cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN genómico de maíz diferente del ADN de MON89034, produce un segundo amplicón que sirve de diagnóstico para ADN genómico de maíz diferente del ADN de MON89034; (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico; y (c) detectar los amplicones producidos de esta manera, en donde la detección de la presencia de ambos amplicones indica que dicha muestra es heterocigótica para ADN del evento de maíz MON89034, en donde la detección de sólo el primer amplicón indica que dicha muestra es homocigotica para ADN del evento de maíz MON89034. 38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicha serie de iniciadores se usa además junto con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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