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KR101366363B1 - 형질전환 계통 ｍｏｎ８９０３４에 해당하는 옥수수 식물 및 종자와 이의 검출 방법 및 사용 - Google Patents

형질전환 계통 ｍｏｎ８９０３４에 해당하는 옥수수 식물 및 종자와 이의 검출 방법 및 사용 Download PDF

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KR101366363B1
KR101366363B1 KR1020137008503A KR20137008503A KR101366363B1 KR 101366363 B1 KR101366363 B1 KR 101366363B1 KR 1020137008503 A KR1020137008503 A KR 1020137008503A KR 20137008503 A KR20137008503 A KR 20137008503A KR 101366363 B1 KR101366363 B1 KR 101366363B1
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제니퍼 더글라스
지나 그로트
스콧 존슨
레베카 켈리
존 코르테
제임스 라이스
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몬산토 테크놀로지 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 형질전환 옥수수 계통 MON89034, 및 상기 옥수수 계통에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 세포, 종자, 및 식물을 제공한다. 또한, 본 발명은 샘플에서 옥수수 계통에 대하여 진단성인 뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 샘플에서 옥수수 계통 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 방법, 샘플에서 옥수수 계통의 존재에 대하여 진단성인 뉴클레오티드 서열을 검출하는데 사용되는 프로브 및 프라이머, 이러한 옥수수 계통의 종자를 옥수수 식물로 성장, 및 옥수수 계통에 진단성인 DNA를 포함하는 옥수수 식물을 생산하기 위한 생육법을 제공한다.

Description

형질전환 계통 ＭＯＮ８９０３４에 해당하는 옥수수 식물 및 종자와 이의 검출 방법 및 사용{CORN PLANT AND SEED CORRESPONDING TO TRANSGENIC EVENT MON89034 AND METHODS FOR DETECTION AND USE THEREOF}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2006년 5월 26일자 미국 가출원번호 60/808,834에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 형질전환 옥수수 계통 MON89034 및 이들 식물의 일부분 및 종자에 관련된다. 상기 계통은 나비목(order Lepidoptera)의 곤충으로부터 곤충 침입(insect infestation)에 저항성을 나타낸다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환 계통에 유일한 뉴클레오티드 서열의 존재를 통해 확인되는 상기 형질전환 계통의 존재를 나타내는 DNA를 포함하는 식물 및 종자를 사용하는 방법, 및 상기 형질전환 계통에 유일한 특이적 뉴클레오티드 서열을 검출하므로써 생물학적 샘플에서 상기 옥수수 계통의 존재를 검출하는 방법에 관련된다. 본 발명은 상기 계통에 유일한 핵산 서열을 제공한다.
본 발명은 본 명세서에서 계통 MON89034로 명명되는 나비목 곤충 저항성 형질전환 변종 옥수수(제아 마이스 : Zea mays) 식물, 및 옥수수의 어떤 샘플 또는 변종에서 검출될 때, 상기 샘플 또는 변종에서 상기 형질전환 옥수수 식물 계통 MON89034의 존재를 나타내는 것으로 존재하는 유일한 DNA 서열에 관련되고, 또한 옥수수 MON89034, 및 이들로부터 유래된 자손 식물 및 종자에서 형질전환유전자(transgene)/게놈 삽입 지역의 검출에 관련된다.
상기 옥수수 식물 계통 MON89034는 농업적으로 중요한 해충인 밤나방(Spodoptera frugiperda), 유럽조명나방(Ostrinia nubilalis), 왕담배나방(Helicoverpa zea), 사우스웨스턴조명나방(Diatraea grandiosella) 및 검거세미나방(Agrotis ipsilon) 등과 같은 나비목의 곤충에 특히 저항성이 있다.
옥수수는 중요한 작물이고, 전세계적으로 기본적인 식품원이다. 작물학적 특성과 생산물의 품질을 향상시킬 목적으로 생명공학적 방법이 옥수수에 적용되었다. 그러한 작물학적 특성 중 하나는 곤충 저항성, 예를 들어, 살충 성분을 코딩하는 하나 이상의 유전자(예를 들어, 미국 특허 6,489,542 및 미국 특허 6,620,988)가 함유되게 유전적으로 조작된 옥수수 식물에서 발현되는 나비목 곤충 및 딱정벌레 종에 대한 유전적으로 조작된 저항성이다.
하나 이상의 교잡종 자손이 형질전환 물질을 함유하고 있는지를 결정하기 위하여, 생물학적 샘플에서 특정 형질전환 계통의 존재를 검출하는 것은 유익하다. 예를 들어, 샘플에서 특정 계통의 검출은 허가 목적, 순도 표준의 확립 및 유지에 중요하고, 관리 당국의 허가, 식물 첨가 표준에의 적합성, 일인 이상의 개인 또는 단체가 형질전환 계통에 관한 어떤 특허의 소유자 또는 권리자로부터 허가 없이 특정 계통을 사용하는 것을 가능하게 하는 법적 절차에서 사용, 및 여러 정부 규정 및/또는 법률에 충족됨을 보증하는데 중요하다.
또한, 재조합 작물로부터 유래된 식품의 판매 전 승인 및 표시를 요구하는 규정을 만족시켜야 하는 경우, 특정 식물을 검출할 수 있는 방법은 도움을 줄 수 있을 것이다. 또한, 샘플에서 형질전환 계통의 존재를 반대하는 개인 또는 단체는, 그들의 생산물에 형질전환유전자가 부재한 것이 이점이 되는 그들의 사업을 번창시킬 수 있게 하기 위하여 샘플에서 형질전환유전자의 존재를 검출하는 믿을 수 있는 방법을 원한다.
이러한 이점에도 불구하고, 곤충은 단지 하나의 바실러스 투린기엔시스(B. thuringiensis) δ-엔도톡신을 발현하는 식물에 대해 저항성을 갖도록 진화할 수 있다. 확산되어지는 이러한 저항성은 단일의 Bt 유전자를 함유하는 생식질의 상업적 가치를 명백히 제한시킬 수 있다.
형질전환 식물을 통하여 제공되어, 표적 해충을 구제하는데 적용되는 살충 성분의 효과를 향상시키고, 이러한 살충 성분에 저항성인 해충의 출현 가능성을 감소시키기 위한 하나의 가능한 방법은, 형질전환 작물이 바실러스 투린기엔시스 δ-엔도톡신과 같은 살충 성분을 고 농도로 발현하는 것을 보장하는 것일 수 있다(McGaughey and Whalon (1992), Science 258:1451-55; Roush (1994) Biocontrol. Sci. Technol.. 4:501-516).
추가적으로, 해충군에 대해 효과적이고, 여러 작용 방식을 통하여 이들 효과를 나타내는 살충 유전자군의 확보는 저항성의 발생에 대한 안전 장치일 수 있다. 저항성의 출현은 동일한 곤충 종들에 2 이상의 살충 활성을 나타내는 중첩되는 독성을 발현하는 작물을 제공하므로써 실질적으로 지연시킬 수 있다. 이러한 이중 작용 방식을 달성하기 위한 하나의 수단은, 표적 해충에 의하여 섭취될 때, RNAi 반응을 유도하여 Bt 독소에 의하여 표적화되는 곤충 종의 필수 유전자 발현을 억제하기 위한 목적으로 제공되는 dsRNA와 함께 특정 곤충 종에 독성인 Bt 유전자를 발현하는 식물을 제공하므로써, 상기 해충이 dsRNA 또는 Bt 유전자에 저항성을 나타내는 경우에 중복 작용을 위한 수단을 제공하는 것일 수 있다. 또는, 식물에서 동일한 곤충 종에 모두 독성을 갖지만, 각각은 살충 활성이 다른 양식으로 작용하는, 2 이상의 살충 독소의 동시발현은, 특히 양자가 고 농도로 발현될 때, 효과적인 저항 조절 수단을 제공한다. 이러한 조합에 유용한 살충 성분들의 예는, 제한되지는 않지만, Bt 독소, 제노랍두스 종(Xenorhabdus sp.) 또는 포토랍두스 종(Photorhabdus sp.) 살충 단백질, 탈-알러지화된(deallergenized) 및 탈-당화된(de-glycosylated) 페타틴 단백질(patatin proteins) 및/또는 페르뮤테인(permuteins), 식물 렉틴 등을 포함한다.
식물에서의 외래 유전자의 발현은 이들의 염색체 위치, 아마도 크로마틴 구조(예를 들어, 헤테로크로마틴) 또는 통합 지역에 근접한 전사 조절 인자(예를 들어, 인핸서)의 근접성에 의해 영향받는 것으로 알려져 있다(Weising et al.(1988) Ann. Rev. Genet 22:421-477). 이러한 이유로, 도입된 목적 유전자의 최적의 발현에 의하여 특징되는 계통을 확인하기 위하여 다수의 계통들을 검색하는 것이 종종 필수적이다. 수십 또는 수백 종의 다른 형질전환 계통을 확보한 경우라도, 식물 게놈의 어떤 필수적인 또는 부분적으로 필수적인 부위로의 형질전환유전자들의 삽입의 결과로서, 또는 형질전환유전자들의 발현 수준에 의하여 야기되는 독성 효과의 결과로서, 적어도 두 가지의 다른 독소 또는 살충 성분의 최적 농도의 발현을 제공하면서, 어떠한 원하지 않는 경작적 결함 또는 식물독성 효과를 결한 단일 형질전환 계통을 확인함에 있어서 성공이 보장되지는 않는다. 예를 들어, 식물과 다른 유기체에서, 계통에 도입된 유전자의 발현 농도의 변화가 다양할 수 있다는 것이 관찰되었다. 또한, 도입되는 유전자 구조물에 존재하는 전사 조절 인자로부터 기대되는 양상에 상응하지 않는, 공간적인 또는 시간적인 발현 양상의 차이, 예를 들어 다양한 식물 조직에서 형질전환유전자의 상대적인 발현의 차이가 있을 수 있다. 이러한 이유 때문에, 수백 내지 수천종의 다른 계통을 생산하고, 상업적인 목적에 적합한 형질전환유전자 발현 수준 및 양상을 갖는 단일 계통을 검색하는 것이 일반적인 것이 되었다. 원하는 수준 또는 양상의 형질전환유전자 발현을 갖는 계통은 종래의 육종 방법을 사용한 교배법에 의하여 상기 형질전환유전자를 다른 유전적 기반내로 도입하는데 유용하다. 이러한 교배의 자손은 원 형질전환체의 형질전환유전자 발현 특성을 유지한다. 이러한 전략은 특정 지역적 생장 조건에 적합하게 적응된 다양한 변종들에서 확실한 유전자 발현을 보장하기 위하여 사용된다.
중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 핵산 프로브를 사용한 DNA 혼성화와 같은 공지된 핵산 검출 방법에 의하여 형질전환유전자의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 일반적으로 이러한 검출 방법들은 프로모터, 터미네이터, 마커 유전자, 또는 심지어 형질전환유전자(들)로부터 발현된 목적 단백질 또는 dsRNA를 코딩하는 코딩 서열 등과 같은 자주 사용되는 유전 요소들에 초점이 맞추어져 있다. 결과적으로, 이러한 방법들은 삽입된 DNA에 인접한 염색체 DNA의 서열("인접 DNA(flanking DNA)")이 알려지 있지 않다면, 다른 계통들, 특히 동일한 DNA 구조물을 사용하여 생산된 계통들을 분리하는데 사용될 수 없을 것이다. 형질전환유전자(들)을 식물 게놈 내로 도입하는데 사용되는 방법에 따라서는, 식물 내로 도입하려는 식물 게놈 서열 인접 형질전환 DNA를 확인하는 것을 매우 복잡하게 하는 착오 또는 비정상적인 결과를 낳을 수 있다. 때때로, 삽입 DNA의 재배열(rearrangement), 인접 게놈 DNA의 재배열, 또는 삽입 DNA 및 인접 게놈 DNA의 재배열이 빈번하게 발생하여, 평가되는 삽입 계통의 분석을 복잡하게 한다. 그러므로, 샘플에서 특정 형질전환 계통을 선별, 확인하고, 순도 및 특성을 보장하는 수단을 갖는 것은 유용하고, 이것을 달성하기 위한 유일한 방법은 원하는 형질전환 계통과만 관련된 하나 이상의 유일한 서열을 확인하는 것이므로, 형질전환 DNA가 삽입되어 상기 계통을 발생시키는 식물 종의 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서 이러한 서열의 존재는 그러한 샘플에서 상기 계통을 판별하게 하는 표지가 된다.
발명의 개요
본 발명은 MON89034로 명명된 형질전환 옥수수 식물, 및 American Type Culture Collection(ATCC)에 2006년 3월 28일자로 기탁번호 PTA-7455로 기탁된 종자를 갖는, 옥수수 계통 MON89034와 구별 불가능한 (삽입된 형질전환 DNA에 상응하는 적어도 하나의 대립유전자를 포함하는 정도에 있어서도 구별 불가능한) 그들의 자손과 관련된다. 또한, 본 발명은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4 및 서열번호:5로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 옥수수 계통 MON89034의 자손 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 및 종자의 재생 가능한 부분에 관련된다. 또한, 본 발명은, 제한되지는 않지만, 적어도 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 화분(pollen), 밑씨(onule), 꽃(flowers), 싹(shoots), 뿌리(roots), 줄기(stalks), 실크(silks), 수염(tassels), 이삭(ears) 및 잎(leaves)을 포함하는, 옥수수 계통 MON89034의 식물 부분을 포함한다. MON89034에 상응하는 옥수수 식물 분야에서 MON89034의 게놈에 포함된 신규한 유전적 성분, 및 MON89034로부터의 가루(meal), 분말, 오일, 펄프 및 잔여 바이오매스(biomass)와 같은 산물은 본 발명에 포함된다.
본 발명은 옥수수 계통 MON89034의 생리적 및 형태적 특징의 모든 것을 구비한 곤충 저항성 옥수수 식물을 제공한다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, 본 발명은 MON89034로 명명된 신규한 옥수수 식물로부터 형질전환유전자/게놈 삽입 지역의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. (서열번호:5의 2051 내지 2071에 위치된) 서열번호:1 및 (11295 내지 11314에 위치된) 서열번호:2 및 이들의 상보체로 구성되는 군으로부터 선택된 MON89034의 적어도 하나의 접합부 서열(junction sequence)을 포함하는 DNA 서열이 제공되며, 상기 접합부 서열은 게놈 내로 삽입된 이종 DNA와 상기 삽입 위치에 인접한 옥수수 세포의 DNA 사이의 접합부에 걸쳐 있으며, 상기 계통에 대해 진단 표지가 된다(진단성이다)(도 1). 이러한 DNA 분자를 포함하는 옥수수 계통 MON89034 및 종자는 본 발명에 포함된다.
본 발명은 옥수수 계통 MON89034로부터의 신규 형질전환유전자/게놈 삽입 지역, 서열번호:3 및 서열번호:4(도 1)를 포함하는 DNA 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 이러한 분자를 포함하는 옥수수 식물 및 종자를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 DNA 검출 방법에 사용하기 위한 두 DNA 분자를 제공하며, 제1의 DNA 분자는 서열번호:3의 DNA 분자의 형질전환유전자 지역의 적어도 11개 또는 그 이상의 연속적인 어떠한 부분의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호:3의 5' 인접 옥수수 게놈 DNA 지역의 유사한 길이의 어떠한 부분의 DNA 분자를 포함하고, 상기 DNA 분자들은, 함께 사용될 때, 증폭산물(amplicon)을 얻는 DNA 증폭 방법(DNA amplication method)에서의 DNA 프라이머로서 유용하다. 상기 DNA 증폭 방법에서 이러한 DNA 프라이머를 사용하여 얻어진 증폭산물은, 상기 증폭산물이 서열번호:1을 포함하는 경우, 옥수수 계통 MON89034에 진단성이다. 본 발명은 서열번호:3의 어떠한 부분에 상동성 또는 상보적인 DNA 프라이머에 의하여 얻어진 어떠한 증폭산물 및 서열번호:1을 포함하는 어떠한 증폭산물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 DNA 검출 방법에 사용하기 위한 두 DNA 분자를 제공하며, 제1의 DNA 분자는 서열번호:4의 DNA 분자의 형질전환유전자 지역의 적어도 11개 또는 그 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드의 어떠한 부분 및 서열번호:4의 3' 인접 옥수수 게놈 DNA의 유사한 길이의 어떠한 부분의 DNA 분자를 포함하고, 상기 DNA 분자들은 DNA 증폭 방법에서의 DNA 프라이머로서 유용하다. 상기 DNA 증폭 방법에서 이러한 DNA 프라이머를 사용하여 얻어진 증폭산물은, 상기 증폭산물이 서열번호:2를 포함하는 경우, 옥수수 계통 MON89034에 대해 진단성이다. 본 발명은 서열번호:4의 어떠한 부분에 상동성 또는 상보적인 DNA 프라이머에 의하여 얻어진 어떠한 증폭산물 및 서열번호:2를 포함하는 어떠한 증폭산물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 샘플에서 옥수수 계통 MON89034에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 옥수수 계통 MON89034로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 옥수수 계통 MON89034에 진단성인 증폭산물을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 상기 증폭산물을 생산하기 위한 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 (c) 서열번호:1 또는 서열번호:2를 포함하는 상기 증폭산물을 검출하는 단계들을 포함한다.
상기 식물 또는 종자 MON89034로부터 유래된 옥수수 식물, 또는 종자, 또는 산물의 게놈 DNA는 서열번호:5 및 이들의 상보체로 필수적으로 구성되는 DNA 분자를 포함한다. 상기 식물 또는 종자 MON89034로부터 유래된 옥수수 식물, 또는 종자, 또는 산물의 게놈 DNA는, 상기 옥수수 식물, 또는 종자, 또는 산물로부터 분리될 때, 서열번호:5의 뉴클레오티드 2061 내지 11305 및 이들의 상보체를 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
상기 식물 또는 종자 MON89034로부터 유래된 옥수수 식물, 또는 종자, 또는 산물의 게놈 DNA는, 상기 옥수수 식물, 또는 종자, 또는 산물로부터 분리될 때, DNA 프라이머 분자인 서열번호:6 및 서열번호:7을 사용하는 DNA 증폭 방법에 의해 증폭산물을 생산한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 샘플에서 MON89034에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 엄격한 혼성화 조건하에서 옥수수 계통 MON89034로부터의 게놈 DNA와는 혼성화되지만, 엄격한 혼성화 조건하에서 대조군 옥수수 식물과는 혼성화되지 않는 프로브(probe)와 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플과 상기 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용시키는 단계; 및 (c) 서열번호:1 또는 서열번호:2를 포함하는 상기 프로브와 옥수수 계통 MON89034 DNA와의 혼성화를 검출하는 단계들을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 (a) 옥수수 DNA를 포함하는 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 옥수수 계통 MON89034로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 옥수수 계통 MON89034에 대해 진단성인 제1의 증폭산물을 생산하는 SQ2842(서열번호:6), SQ2843(서열번호:7), SQ6523(서열번호:10), SQ6524(서열번호:11), PB880(서열번호:14) 및 PB2931(서열번호:15)을 포함하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 상기 제1의 증폭산물을 생산하기 위한 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; (c) 제1의 증폭산물을 검출하는 단계; (d) 옥수수 DNA를 포함하는 상기 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 옥수수 식물로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 옥수수 계통 MON89034로 확인된 형질전환유전자가 삽입된 옥수수 게놈 지역에 상동성인 원(native) 옥수수 게놈 DNA를 포함하는 제2의 증폭산물을 생산하는 상기 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (e) 상기 제2의 증폭산물을 생산하기 위한 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; (f) 상기 제2의 증폭산물을 검출하는 단계; 및 (g) 샘플에서 제1의 증폭산물 및 제2의 증폭산물을 비교하여, 양 증폭산물이 존재하면 상기 샘플은 형질전환유전자 삽입에 대하여 이형접합성(heterozygous)임을 확인하는 단계들을 포함하는, 옥수수 계통 MON89034의 자손의 접합성(zygosity)을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 나비목 해충의 먹이로 효과적인 살충 유효량의 옥수수 계통 MON89034를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 옥수수 계통 MON89034로부터 유래된 일용품(commodity) 또는 식료품(foodstuff)의 형태로 된 조성물 또는 생물학적 샘플을 제공하며, 상기 일용품 또는 식료품은 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 옥수수 또는 옥수수 산물로부터 얻어진 옥수수 이삭, 껍질 옥수수, 옥수수 실크, 옥수수 화분, 깨진 옥수수, 옥수수 가루, 파쇄 옥수수, 옥수수 분말, 옥수수 오일, 옥수수 전분, 옥수수 담금 액, 옥수수 맥아, 옥수수 당, 옥수수 시럽, 옥수수 오일로부터 생산된 마아가린, 불포화 옥수수 오일, 포화 옥수수 오일, 옥수수 플레이크, 팝콘, 에탄올 및/또는 음료, 상기 옥수수 계통의 발효로부터 얻어진 주정박(DDGS), 상기 DDGS 및/또는 옥수수를 포함하는 동물사료, 전체 또는 부분이 깨지거나, 또는 파쇄되거나, 가공된 식료품, 화장품, 및 생물학적 샘플에서 형질전환 옥수수 계통 MON89034의 존재에 대하여 진단성인 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드가 발견되는 증량제(bulking agent)를 포함한다. 식료품으로서 옥수수를 제공하는 또 다른 수단은 전체 옥수수, 깨진 옥수수, 파쇄 옥수수와 같은 섭취를 위한 낱알의 다양한 형태, 및 상기 다양한 형태와 마일로우(milo), 쇠기름(suet), 기장(millet), 해바라기, 오트, 귀리, 쌀, 콩 등과의 블렌드의 다양한 형태로 옥수수를 제공하는 것이다. 상기 일용품 또는 식료품 내의, 서열번호:1 또는 서열번호:2로 나타낸 바와 같은 검출가능한 양의 뉴클레오티드 서열은 샘플에서 상기 형질전환 계통 MON89034의 존재에 대해 진단성이고, 그 결과, 상기 샘플에서 상기 DNA가 존재하는 형질전환 계통 세포의 존재에 대하여 진단성이다.
본 발명의 상술한 여러 측면들은 다음의 상세한 설명에 의하여 더욱 명확하게 될 것이다.
발명의 상세한 설명
다음의 정의들과 방법들은 본 발명을 더욱 명확하게 하고, 본 발명의 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자를 이해시키기 위하여 제공된다. 달리 언급이 없다면, 용어들은 관련 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에 의한 일반적인 용법에 따라 이해될 것이다. 또한, 분자생물학의 일반적 용어의 정의는 Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; 및 Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994에서 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 것으로서, 용어 "옥수수"는 제아 마이스 또는 메이즈(maize)를 의미하고, 옥수수와 교배될 수 있는 야생 메이즈 종을 포함하는 모든 식물 변종을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 것으로서, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 제한되지는 않는"을 의미한다.
형질전환 "계통"은 식물 세포를 이종 DNA, 즉, 목적하는 형질전환유전자를 포함하는 핵산 구조물로 형질전환, 식물의 게놈 내로 형질전환유전자의 삽입으로부터 얻어지는 식물의 군집의 재생, 및 특정 게놈 위치 내로의 삽입에 의해 특징되는 특정 식물의 선별에 의하여 얻어진다. 용어 "계통"은 이종 DNA를 포함하는 원 형질전환체 및 상기 형질전환체의 자손을 나타낸다. 또한, 용어 "계통"은 이종 DNA를 포함하는 형질전환체 및 다른 변종간의 교배로 얻어지는 자손을 나타낸다. 반복친(recurrent parent)에 대한 반복된 역-교배(back-crossing) 후에도, 형질전환된 부(parent)로부터의 삽입 DNA 및 인접 DNA는 교배 자손에서도 동일한 염색체 위치에 존재한다. 또한, 용어 "계통"은, 삽입된 DNA를 포함하는 하나의 부계(예를 들어, 원 형질전환체 및 자가수분에 의한 자손)와 삽입 DNA를 포함하지 않는 하나의 부계의 교배의 결과로서 목적 형질전환유전자를 포함하는 삽입된 DNA를 받는 자손에게 전달될 것으로 기대되는 상기 삽입 DNA 및 삽입 DNA에 바로 인접한 인접 게놈 서열을 포함하는 원 형질전환체로부터의 DNA를 나타낸다. 본 발명은 MON89034로부터 유래된 계통 MON89034 DNA, 식물 세포, 조직, 종자 및 가공물에 관련된다.
또한, 각각 분리되는 두 개의 첨가된 외래성 유전자를 포함하는 자손을 얻기 위하여 두 다른 형질전환 식물이 교배될 수 있다. 적절한 자손의 자가수분은 첨가된 두 외래성 유전자가 동형접합성(homozygous)인 식물을 생산할 수 있다. 또한, 영양번식(vegetative propagation)과 같이, 부계 식물과의 역-교배 및 비-형질전환 식물과의 이종교배(out-crossing)가 고려된다. 다른 특질 및 작물들에 일반적으로 사용되는 다른 육종 방법의 설명은 여러 참고 자료 중 하나인, 예를 들어 Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)에서 찾을 수 있다.
"프로브"는 통상의 검출가능한 표지 또는 리포터 분자, 예를 들어, 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소가 부착된 분리된 핵산이다. 이러한 프로브는 표적 핵산의 하나의 가닥, 본 발명의 경우, 옥수수 식물이든, 계통 MON89034로부터의 DNA를 포함하는 샘플이든지를 불문하고, 옥수수 계통 MON89034로부터의 게놈 DNA의 하나의 가닥에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브는 디옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하여, 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 폴리아미드 및 다른 프로브 물질들을 포함한다.
"프라이머"는 핵산 혼성화에 의하여 상보적 표적 DNA 가닥에 어닐링(annealing)되어 프라이머와 표적 DNA 가닥 간에 혼성체(hybrid)를 형성하고, 다음으로 중합효소, 예를 들어 DNA 중합효소에 의하여 표적 DAN 가닥을 따라 연장되는 분리된 핵산이다. 본 발명의 프라이머 쌍은, 예를 들어 중합체 연쇄 반응(PCR) 또는 다른 종래의 핵산 증폭 방법에 의한 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 이들의 사용을 나타낸다.
프로브와 프라이머는 일반적으로 11개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 18개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 24개 이상의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 프로브와 프라이머는 매우 엄격한 혼성화 조건하에서 표적 서열과 특이적으로 혼성화된다. 표적 서열과는 다르지만, 표적 서열과 혼성화할 수 있는 능력을 보유하는 프로브가 종래의 방법으로 설계될 수 있을지라도, 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브와 프라이머는 표적 서열과 완전한 서열 유사성을 갖는다.
프로브와 프라이머를 제조하고 사용하는 방법들은, 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989(이하, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (주기적으로 개정됨) (이하, "Ausubel et al., 1992"); 및 Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990에 설명되어 있다. PCR-프라이머 쌍들은, 예를 들어 이러한 목적을 위하여 개발된 Primer(Version 0.5, ⓒ 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 공지된 서열로부터 도출될 수 있다.
본 발명에서 설명된 인접 DNA와 삽입 서열을 기초로 한 프라이머와 프로브는 종래의 방법들, 예를 들어, 재-클로닝(re-cloning) 및 그 서열들의 시퀀싱(sequencing)에 의하여 개시된 서열을 확인 (및, 만약 필요하다면, 수정)하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 프로브와 프라이머는 엄격한 조건하에서 표적 DNA 서열과 혼성화된다. 어떤 종래의 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플에서 형질전환 계통의 DNA의 존재를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 이들의 단편은 특정 환경하에서 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, 만약 두 핵산 분자가 안티-평행의 이중가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면, 두 핵산 분자는 서로 특이적으로 혼성화될 수 있다는 것을 나타낸다. 만약, 핵산 분자가 완전한 상보성을 나타내면, 핵산 분자는 다른 핵산 분자의 "상보체"인 것을 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, 분자의 각 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드와 상보성이면, 분자는 "완전한 상보성"을 나타낸다는 것을 말한다. 만약, 두 분자가 적어도 통상의 "낮은-엄격성" 조건하에서 서로 어닐링되어 유지되는 것이 가능하도록 충분히 안정성을 가지고 서로 혼성화될 수 있다면, 두 분자는 "최소 상보성"이라고 말한다. 유사하게, 만약, 두 분자가 통상의 "높은-엄격성" 조건하에서 서로 어닐링되어 유지되는 것이 가능하도록 충분히 안정성을 가지고 서로 혼성화될 수 있다면, 두 분자는 "상보성"이라고 말한다. 통상의 엄격성 조건은 Sambrook et al., 1989, 및 Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)에 설명되어 있으며, 완전한 상보성으로부터 이탈이 이중-가닥 구조를 형성하는 분자의 능력을 완전히 상실시키지 않는 한, 완전한 상보성으로부터의 이탈은 허용가능하다. 핵산 분자를 프라이머나 프로브로 사용하기 위하여, 특정 용매와 염 농도가 적용되는 조건하에서 안정한 이중-가닥 구조를 형성할 수 있게 하기 위한 서열의 충분한 상보성만이 필요하다.
본 발명에서 사용되는 것으로서, 실질적인 상동성 서열은 매우 엄격한 조건하에서 핵산 서열과 비교되는 상보체에 특이적으로 혼성화될 핵산 서열이다. 예를 들어, 약 45℃에서 6.0 x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)로 처리 후, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하는, DNA 혼성화를 촉진시키는데 적합한 엄격성 조건은 당업자에게 공지되어 있거나, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에 개시되어 있다. 예를 들어, 세척 단계에서의 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격성으로부터 50℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격성까지 선택될 수 있다. 추가적으로, 상기 세척 단계에서의 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄격성 조건까지 증가될 수 있다. 온도와 염 모두가 변화될 수 있거나, 또는 온도 또는 염 농도가 하나를 일정하게 유지하면서, 다른 것을 변화시킬 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산은 중간의 엄격성 조건, 예를 들어 약 2.0 x SSC 및 약 65℃에서, 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 하나 이상의 핵산 분자들 또는 이들의 상보체 또는 이들의 단편과 특이적으로 혼성화될 것이다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산은 높은 엄격성 조건하에서 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 하나 이상의 핵산 분자들 또는 이들의 상보체 또는 단편과 특이적으로 혼성화될 것이다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 바람직한 마커 핵산 분자는 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 핵산 서열 또는 이들의 상보체 또는 이들의 단편을 갖는다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명의 바람직한 마커 핵산 분자는 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 핵산 서열 또는 이들의 상보체 또는 이들의 단편과 80% 내지 100% 또는 90% 내지 100% 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명의 바람직한 마커 핵산 분자는 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 핵산 서열 또는 이들의 상보체 또는 이들의 단편과 95% 내지 100% 서열 동일성을 갖는다. 서열번호:1 및 서열번호:2는, 전체로서 본 명세서에 통합된 "DNA markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 173-185, Cregan, et al., eds., Wiley-Liss NY에 설명된 simple sequence repeat DNA marker analysis를 위한 방법들과 유사한 유전적 교배의 자손을 확인하기 위한 식물 육종 방법들에서 마커로서 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자와 프로브의 혼성화는, 제한되지는 않지만, 형광 태그, 방사성 태그, 항체 기초 태그, 및 화학발광 태그를 포함할 수 있는, 당업자에 공지된 다양한 방법들에 의하여 검출될 수 있다.
특정 증폭 프라이머 쌍을 사용한 표적 핵산 서열의 증폭(예를 들어, PCR에 의함)에 있어서, "엄격한 조건"이란, DNA 열 증폭 반응에서, 상응하는 야생형 서열 (또는 그것의 상보체)을 갖는 프라이머가 표적 핵산 서열에 결합하여, 바람직하게는 단일의 증폭 생성물인 증폭산물을 생산하도록, 프라이머 쌍이 표적 핵산 서열에만 혼성화되게 하는 조건이다.
용어 "(표적 서열)에 특이적"은 엄격한 혼성화 조건하에서 프로브 또는 프라이머가 표적 서열을 포함하는 샘플에서 표적 서열과만 혼성화하는 것을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 것으로서, "증폭된 DNA" 또는 "증폭산물"은 핵산 기질의 부분인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 산물을 나타낸다. 예를 들어, 교배로부터 얻어진 옥수수 식물이 본 발명의 옥수수 식물의 형질전환 계통 게놈 DNA를 포함하는지 여부를 결정하기 위하여, 옥수수 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA는 계통 DNA의 존재에 대하여 진단성인 증폭산물을 생산하기 위해, 삽입된 이종 DNA의 삽입 위치에 인접한 식물의 게놈 내의 인접 서열로부터 유래된 하나의 프라이머, 및 상기 삽입된 이종 DNA로부터 유래된 두번째 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 증폭 방법에 적용될 수 있다. 증폭산물은 계통에 대하여 진단성인 어떤 길이의 서열을 갖는다. 상기 증폭산물의 길이는 프라이머 쌍과 하나의 뉴클레오티드 염기 쌍, 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드 염기 쌍, 보다 바람직하게는 약 250 뉴클레오티드 염기 쌍, 및 가장 바람직하게는 약 450 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합된 길이의 범위일 수 있다. 또는, 전장 삽입 뉴클레오티드 서열을 포함하는 증폭산물을 얻기 위하여, 프라이머 쌍은 삽입된 DNA의 양 측면의 인접 서열로부터 유래될 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 멤버는 삽입 DNA 분자로부터 떨어져 위치될 수 있는데, 이러한 거리는 하나의 뉴클레오티드 염기 쌍으로부터 최대 약 2만 뉴클레오티드 염기 쌍까지의 범위일 수 있다. 용어 "증폭산물"의 사용은 특히 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이합체를 배제한다.
핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는 당업계에서 공지된 다양한 핵산 증폭 방법의 어떠한 것이라도 사용될 수 있다. 다양한 증폭 방법이 당업자에 공지되어 있으며, 특히, 미국특허번호 제4,683,195호와 제4,683,202호 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990에 설명되어 있다. PCR 증폭 방법은 최대 22kb의 게놈 DNA 및 최대 42kb의 박테리오파아지 DNA를 증폭하는 정도로 발전되어 있다(Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). DNA 증폭의 기술분야에서 공지된 이러한 방법들뿐만 아니라 다른 방법들도 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. ATCC 기탁번호로 기탁된 종자 샘플인 옥수수 계통 MON89034로부터의 이종 DNA 삽입물의 서열 또는 인접 서열은 본 발명에서 제공된 서열들로부터 유래된 프라이머를 사용하여 상기 계통으로부터 이들 서열을 증폭하고, PCR 증폭산물 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 시퀀싱에 의하여 확인 (및 만약 필요하다면 수정)될 수 있다.
이러한 방법으로 얻어진 증폭산물은 여러 기술에 의하여 검출될 수 있다. 이러한 하나의 방법은, DNA 올리고뉴클레오티드가 인접 게놈 DNA 서열과 삽입된 DNA 서열 모두에 중첩되도록 설계되는, Genetic Bit 분석법(Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994)이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트의 웰 내에 고정화된다. (삽입된 서열에서 하나의 프라이머와 인접 게놈 서열에서 하나의 프라이머를 사용하여) 목적 부위의 PCR을 수행한 후, 단일-가닥 PCR 산물은 고정화된 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있으며, DNA 중합효소와 기대되는 다음 염기에 특이적인 표지된 ddNTP를 사용한 단일 염기 확장 반응을 위한 기질로 사용한다. 판독은 형광 또는 ELIZA에 기초하여 수행될 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 확장에 의한 삽입/인접 서열의 존재를 나타낸다.
다른 방법은 Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)에 의하여 설명된 것과 같은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 기술이다. 이 기술에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 인접 게놈 DNA 및 삽입 DNA 접합부에 중첩되는 것으로 설계된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 목적 지역으로부터의 단일-가닥 PCR 산물(삽입된 서열에서 하나의 프라이머 및 인접 게놈 서열에서 하나의 프라이머)에 혼성화되고, DNA 중합효소, ATP, 설퍼릴라아제(sulfurylase), 루시페라아제(luciferase), 아피라아제(apyrase), 아데노신 5' 포스페이트 및 루시페린의 존재하에서 인큐베이션된다. dNTP들이 각각 첨가되고, 광신호(light signal)로 통합 결과가 측정된다. 광신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중-염기 확장에 의한 형질전환유전자 삽입/인접 서열의 존재를 나타낸다.
Chen, et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999)에 의하여 설명된 형광 편광법(fluorescence polarization)은 본 발명의 증폭산물을 검출하는데 사용될 수 있는 방법이다. 이 방법을 사용하여, 게놈 인접 및 삽입 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 설계될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 목적 지역으로부터의 단일-가닥 PCR 산물(삽입된 DNA에서 하나의 프라이머 및 인접 게놈 DNA 서열에서 하나의 프라이머)에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 형광-표지 ddNTP의 존재하에서 인큐베이션된다. 단일 염기 확장에 의해 ddNTP의 통합이 이루어진다. 통합은 형광계(fluorimeter)를 사용하여 편광의 변화로 측정된다. 편광의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 확장에 의한 형질전환유전자 삽입/인접 서열의 존재를 나타낸다.
Taqman®(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량하는 방법으로서 설명되며, 제조사로부터 제공되는 안내서를 통하여 완전히 이해된다. 요약하면, 게놈 인접 및 삽입 DNA 접합부에 중첩되도록 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머(삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 인접 게놈 서열에서 하나의 프라이머)는 열안정성 중합효소 및 dNTPs의 존재하에서 사이클링된다. FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브의 퀀칭 부분(quenching moiety)으로부터 형광 부분의 절단 및 방출을 야기한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 인접/형질전환유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
분자 비콘(molecular beacons) 방법은 Tyangi, et al.(Nature Biotech.14:303-308, 1996)에서 설명된 바와 같이, 서열 검출 용도를 위하여 설명되어 있다. 요약하면, 인접 게놈 및 삽입 DNA 접합부에 중첩되도록 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브의 고유의 구조로 인해, 상기 FRET 프로브는 형광 및 퀀칭 부분이 매우 근접하게 유지되는 2차 구조를 갖게된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머들(삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 인접 게놈 서열에서 하나의 프라이머)은 열안정성 중합효소 및 dNTPs의 존재하에서 사이클링된다. 성공적인 PCR 증폭 후, FRET 프로브의 표적 서열로의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 및 퀀칭 부분의 공간적인 분리를 이끌고, 그 결과 형광 신호가 생성된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 인접/형질전환유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
마이크로유체기술(Microfluidics)(미국특허공개 2006068398, 미국특허번호 6,544,734)과 같은, 다른 공지된 방법들은 DNA 샘플을 분리 및 증폭하는 방법 및 장치들을 제공한다. 특정 DNA 분자를 검출 및 정량하기 위하여 광학적 염료가 사용된다(WO/05017181). 나노튜브 장치(WO/06024023)는 DNA 분자, 또는 특정 DNA 분자에 결합되어 검출될 수 있는 나노비드(nanobead)의 검출을 위한 전자 센서를 포함한다.
DNA 검출 키트가 본 발명에서 설명된 조성물을 사용하여 제공된다. 상기 키트는 샘플에서 옥수수 계통 MON89034 DNA의 확인에 유용하고, 적어도 적절한 계통의 DNA를 포함하는 옥수수 식물을 육종하기 위한 방법에 적용될 수 있다. 상기 키트는 서열번호:1-7에 나타난 서열로부터 선택된 단편들에 대해 상동성 또는 상보성인 DNA 프라이머 및/또는 프로브, 또는 서열 목록에 나타낸 바와 같은 DNA의 형질전환유전자 유전 성분에 포함된 DNA에 대해 상동성 또는 상보성인 DNA 프라이머 또는 프로브를 포함한다. 이러한 DNA 서열들은 샘플에서 표적 DNA의 존재에 대하여 진단성인 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 DNA 증폭 반응 또는 DNA 혼성화 방법에서의 프로브로 사용될 수 있다. 열 증폭 반응에서 미리 정의된 증폭산물의 생산은 샘플에서 PTA-7455 게놈 DNA에 상응하는 DNA의 존재에 대하여 진단성이다. 만약, 혼성화가 선택된다면, 프로브와 생물학적 샘플과의 혼성화의 검출은 샘플에서 MON89034 형질전환 계통 DNA의 존재에 대하여 진단성이다. 전형적으로, 샘플은 옥수수, 또는 옥수수 산물 또는 옥수수 이용에 따른 부산물이다.
본 발명은 옥수수 계통 MON89034로 명명된 형질전환 옥수수 식물, 상기 식물의 자손, 및 상기 식물의 세포뿐만 아니라 상기 식물로부터 얻어진 종자를 제공한다. 형질전환 옥수수 계통을 포함하는 상기 식물의 성장, 자손의 산출, 세포의 획득, 또는 상기 종자의 작물을 생산하기 위한 대표적인 종자는 2006년 3월 28일자로 American Type Culture Collection(ATCC)에 수탁번호 PTA-7455로 기탁되었다.
이러한 구체예들로부터 얻어진 식물 및 세포 및 생산물 등은, 어떤 생물학적 샘플에서 형질전환 옥수수 계통 MON89034로부터 유래된 어떤 세포로부터 유래된 DNA의 존재에 대하여 진단성인 DNA를 포함한다. 이것은 이러한 두 신규 서열들이 형질전환 옥수수 계통 MON89034의 세포에 포함되어 있기 때문이다. 진단성 DNA는 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 및 서열번호:5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 서열들의 관련성은 도 1의 설명 및 도 1을 참고하여 본 명세서에서 보다 구체적으로 설명된다.
형질전환 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성인 DNA에 동형접합성인 종자로부터 성장된 옥수수 식물은 본 발명의 범위 내이다. 또한, 형질전환 옥수수 계통 MON890334에 대하여 진단성인 DNA에 이형접합성인 종자로부터 성장된 옥수수 식물은, 상기 종자가 상기 진단성 DNA 서열들을 포함하는 한, 본 발명의 범위 내이다. 또한, 상기 진단성 DNA를 포함하는 그러한 식물로부터 얻어진 세포, 종자, 및 조직은 본 발명의 범위 내이다.
형질전환 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 옥수수 식물 및 옥수수 식물 세포 등은 나비목 곤충 침입에 저항성을 나타낸다. 이러한 세포 및 식물은 상기 식물의 세포의 게놈의 일부분을 형성하는 살충 단백질(살충제, 독성제) Cry2Ab를 코딩하는 DNA, 및 서열번호:1 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함한다. 또한, 이러한 식물 및 식물 세포는 살충 단백질(살충제, 독성제) Cry1A.105를 코딩하는 DNA를 포함한다. 이러한 단백질들은 각각 또는 역으로 제1의 살충 단백질 및 제2의 살충 단백질로 나타낼 수 있다. 이러한 단백질들의 발현은, 이러한 독소를 코딩하는 각각의 DNA 서열의 발현을 위하여 제공되는 발현 카세트 내에 삽입되며, 본 발명의 명세서 및 도 1의 설명 및 도 1 및 서열번호:5에서 나타낸 바와 같은 서열에 의해 상세히 설명되어 있는 조절 성분들/유전 인자들로부터 달성된다. 이러한 서열들을 포함하는 옥수수 식물 및 옥수수 식물 세포는 이러한 코딩 서열들이 존재하는 대립유전자가 이형접합성이든 동형접합성이든 간에, 나비목 해충 침입으로부터 식물을 보호하는데 효과적이다.
또한, 본 발명은, 생물학적 샘플 내에서, 형질전환 옥수수 계통 MON89034의 DNA로부터 유래된 DNA의 존재에 대하여 진단성인, 본 발명에서 설명된 서열들로부터 생산될 수 있는 증폭산물을 제공한다. 생물학적 샘플 내의 형질전환 옥수수 계통 MON89034의 존재에 대하여 진단성인 증폭산물은 서열번호:1 또는 서열번호:2에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 이러한 증폭산물들은 형질전환 옥수수 계통 MON89034로부터 유래된 적어도 약 0.5펨토몰 또는 약 0.5피코그램의 DNA를 포함하는 어떤 생물학적 샘플로부터 아래에 설명된 바와 같은 프라이머 서열들을 사용하여 얻을 수 있다. 형질전환 옥수수 계통 MON89034에 상응하는 DNA의 이러한 생물학적 샘플 소스는 상기 형질전환 계통으로부터 유래된 옥수수 가루, 옥수수 오일, 옥수수 케이크, 옥수수 종자, 옥수수 배아, 옥수수 전분, 및 옥수수 분말 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호:5에 나타낸 바와 같은 연속적인 뉴클레오티드 서열들을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자들을 제공한다. 이러한 연속적인 뉴클레오티드 서열은 (1) 약 11 내지 약 12000 뉴클레오티드 및 이들 중 어떠한 길이의 뉴클레오티드, 및 서열번호:1의 뉴클레오티드 위치 1~11 또는 9~20 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 위치 1~11 또는 9~20으로 나타낸 연속적인 뉴클레오티드를 더 포함하는 뉴클레오티드, (2) 서열번호:3에 나타낸 약 11 내지 약 2000 뉴클레오티드의 연속적인 뉴클레오티드 서열 및 이들 중 어떠한 길이의 뉴클레오티드, 및 서열번호:1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 위치 1~11 및 9~20에 나타낸 바와 같은 연속적인 뉴클레오티드를 더 포함하는 뉴클레오티드; 서열번호:4의 약 11 내지 약 914 뉴클레오티드에 나타낸 바와 같은 어떤 연속적인 뉴클레오티드 및 이들 중 어떠한 길이의 뉴클레오티드, 및 서열번호:2에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 위치 1~11 및 9~20에 나타낸 바와 같은 연속적인 뉴클레오티드를 더 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 분리된 폴리뉴클레오티드 분자들은 옥수수 DNA를 함유하는 생물학적 샘플로부터 하나 이상의 증폭산물을 얻기 위한 DNA 증폭 방법에 유용하다. 이러한 증폭산물의 검출은 상기 샘플에서 형질전환 옥수수 계통 MON89034의 존재에 대하여 진단성이다. 또한, 분리된 폴리뉴클레오티드 분자는 생물학적 샘플에서 형질전환 옥수수 계통 MON89034로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하기 위한 다양한 뉴클레오티드 검출 방법에 유용하다. 특히, 서열번호:1 또는 서열번호:2에 나타낸 바와 같은 적어도 약 11개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브는 샘플에서 형질전환 계통 MON89034를 검출하는 방법에서 프로브로서 유용하다. 또한, 이러한 분리된 폴리뉴클레오티드 분자들의 상보성 서열들도 상기 검출 및/또는 증폭 방법들에 유용하다.
또한, 본 발명에 의하여, 생물학적 샘플에서 형질전환 옥수수 계통 MON89034로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하는데 사용되는 키트가 제공된다. 키트는 프로브 폴리뉴클레오티드 분자를 사용하고, 서열번호:5에 나타낸 서열을 포함하는 뉴클레오티드 단편과 실질적으로 상동성을 나타내거나, 또는 실질적으로 상보성을 나타내는 적어도 약 11 내지 약 12000의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 상기 프로브 분자는 샘플에서 MON89034 DNA의 존재를 검출하는데 유용하다. 상기 프로브 분자는 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 적어도 하나의 서열을 포함하여야 한다. 또한, 서열 번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 서열은 접합 서열, 즉, 형질전환 옥수수 계통 MON89034를 얻기 위해 옥수수 식물 내로 삽입된 형질전환 DNA의 양 끝 서열로서 언급될 수 있다. 임의적으로 5' 및 3' 말단으로 각각 언급되는 이러한 서열들은 삽입된 DNA 서열의 부분 및 인접하는 옥수수 게놈 서열의 부분을 포함한다. 예를 들어, 서열번호:1의 5' 절반은 삽입된 DNA의 5' 말단에 인접한 옥수수 게놈 서열의 3' 말단을 나타내고, 서열번호:1의 3' 절반은 삽입된 DNA의 5' 말단을 나타낸다. 서열번호:2의 5' 절반은 삽입된 DNA의 3' 말단을 나타내고, 3' 절반은 삽입된 DNA의 3' 말단에 인접한 옥수수 게놈 서열의 5' 말단을 나타낸다. 자연적으로 발생하는 옥수수 게놈의, 서열번호:5에 나타낸 삽입된 서열의 위치에 있어서, 상기 삽입된 DNA의 5' 말단에 인접하는 서열 및 상기 삽입된 DNA의 3' 말단에 인접하는 서열은 연결되고, 서열번호:3에 나타낸 서열에 상보적인 서열(서열번호:3의 3' 말단의 21 뉴클레오티드외의 서열)과 혼성화하는 제1의 프라이머 분자 및 서열번호:4에 나타낸 서열(서열번호:4의 5' 말단의 20 뉴클레오티드외의 서열)과 혼성화하는 제2의 프라이머 분자는 MON89034에 삽입된 DNA의 부재에 대해 진단성인 MON89034 DNA 이외의 DNA를 기질로 하는 열 증폭 반응에서 증폭산물을 생산할 것이고, 상기 프라이머들은 기질로서 MON89034 DNA를 사용하는 경우 (서열번호:3 및 서열번호:4로 나타낸 인접 서열들 내의 상기 프라이머들의 위치에 따라) 12000 뉴클레오티드보다 약간 큰 증폭산물을 생산할 것이다. 또한, 다른 구체예들이 제공된다.
생물학적 샘플 내의 옥수수 계통 MON89034의 접합 서열인 서열번호:1 또는 서열번호:2를 검출하기 위한 키트가 제공된다. 상기 키트는 서열번호:1 또는 서열번호:2 또는 이들의 상보체들로 구성되는 군으로부터 선택된 서열이거나, 상기 서열에 완전히 상보성인 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하고, 또한 핵산 증폭 반응에서 사용되는 한 쌍의 프라이머를 포함한다. 상기 한 쌍의 프라이머는 서열번호:3의 옥수수 게놈 부분으로부터의 적어도 약 15 내지 약 50개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 제1의 프라이머 및 서열번호:5의 이종 삽입 DNA 부분에 상보적인 적어도 약 15 내지 약 50개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 제2의 프라이머로 나타낼 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 제1의 프라이머는 뉴클레오티드 위치 약 1 내지 약 2050의 서열번호:3으로 나타낸 서열에 상응하는 역 상보체 서열과 특이적으로 혼성화하고, 상기 폴리뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 제2의 프라이머는 뉴클레오티드 위치 약 2060 내지 약 12208의 서열번호:5로 나타낸 서열과 특이적으로 혼성화되며, 이들 프라이머는 샘플에서 MON89034 계통 DNA의 존재에 대하여 진단성인, 서열번호:1을 포함하는 증폭산물을 형성하기 위하여 각각에 대하여 연장된다. 또 다른 한 쌍의 프라이머는 서열번호:4의 옥수수 게놈 부분에 상보적인 적어도 약 15 내지 약 50개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 제1의 프라이머 및 서열번호:5의 이종 삽입 DNA 부분으로부터 적어도 약 15 내지 약 50개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 제2의 프라이머로 나타낼 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 제2의 프라이머는 뉴클레오티드 위치 약 1 내지 약 11305의 서열번호:5로 나타낸 서열에 상응하는 역 상보체 서열과 특이적으로 혼성화하고, 상기 폴리뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 제1의 프라이머는 뉴클레오티드 위치 약 21 내지 약 914의 서열번호:4로 나타낸 서열과 특이적으로 혼성화되며, 이들 프라이머는 샘플에서 MON89034 계통 DNA의 존재에 대하여 진단성인, 서열번호:2를 포함하는 증폭산물을 형성하기 위하여 각각에 대하여 연장된다.
이러한 프라이머 쌍들은 서열번호:1 또는 서열번호:2를 포함하는 증폭산물을 생산하는데 유용하며, 경우에 따라서, 생물학적 샘플에서 MON89034 DNA의 존재에 대하여 진단성이다. 이러한 증폭산물들은 생물학적 샘플에서 옥수수 계통 MON89034에 대해 진단성인 접합 서열의 존재의 검출을 가능하게 한다.
또한, 옥수수 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서 형질전환 옥수수 계통 MON89034 DNA에 대해 진단성인 증폭산물을 생산 및 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 핵산 증폭 반응에서 생물학적 샘플을 2 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계, 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계, 및 증폭산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭산물의 존재는 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 뉴클레오티드 위치 약 1~11 또는 9~20의 적어도 하나의 연속적인 서열, 또는 이러한 위치들에 상응하는 상보적인 서열들을 포함한다.
또한, 생물학적 샘플에서 형질전환 옥수수 계통 MON89034의 존재에 대하여 진단성인 뉴클레오티드 서열들은 다른 방법들을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, MON89034 DNA를 포함하는 것으로 기대되는 생물학적 샘플을 서열번호:1 또는 서열번호:2로 나타낸 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 엄격한 혼성화 조건에서 혼성화되는 프로브와 접촉시키는 단계, 상기 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용시키는 단계, 및 상기 뉴클레오티드 서열과 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화의 검출은 샘플에서 MON89034 DNA의 존재에 대하여 진단성을 나타낸다.
또한, 열 증폭 반응에서, 생물학적 샘플 내의 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재에 대하여 진단성인 증폭산물을 생산하는데 사용하기 위한 프라이머 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 제공된다. 전형적으로, 상기 프라이머는 쌍으로 제공되며, 프라이머 쌍의 구성은 편의적으로 제1의 프라이머 및 제2의 프라이머로 나타낼 수 있다. 제1의 프라이머는 서열번호:3으로 나타낸 옥수수 게놈 부분으로부터의 적어도 약 15개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 제2의 프라이머는 서열번호:5로 나타낸 이종 삽입 DNA 부분에 상보적인 적어도 약 15개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 이러한 두 프라이머는, 서열번호:1에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 옥수수 계통 MON89034 DNA로부터 얻어진 기질 DNA를 사용한 열 증폭 반응에서 증폭산물을 생성시킬 수 있다. 또는, 제1의 프라이머는 서열번호:4의 옥수수 게놈 부분으로부터의 적어도 약 15개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 제2의 프라이머는 서열번호:5의 이종 삽입 DNA 부분에 상보적인 적어도 약 15개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 이러한 두 프라이머는, 서열번호:2에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 옥수수 계통 MON89034 DNA로부터 얻어진 기질 DNA를 사용한 열 증폭 반응에서 증폭산물을 생성시킬 수 있다.
서열번호:1 또는 서열번호:2와 같은, 옥수수 DNA를 포함하는 생물학적 샘플 내의 옥수수 계통 MON89034의 접합 서열을 검색하기 위한 또 다른 방법은, 샘플을 엄격한 혼성화 조건하에서 접합 서열 중 하나와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계, 상기 샘플과 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용시키는 단계, 및 상기 프로브와 상기 접합 서열의 혼성화를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 프로브와 상기 접합 서열의 결합/혼성화의 검출은 생물학적 샘플에서 MON89034 DNA의 존재를 시사한다. 안정적으로 형질전환된 메이즈 식물, 및 본 명세서에서 설명된 방법이 적용되었을 때, 서열번호:1 또는 서열번호:2를 포함하는 DNA 증폭산물을 생산하는 상기 식물의 DNA는 본 발명의 범위 내이다. 예시적인 프라이머 서열들, 특히 한 쌍의 프라이머 서열들은 본 명세서의 실시예 및 서열번호:6 및 서열번호:7에 나타내었다.
생물학적 샘플에서 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재를 검출하는 또 다른 방법은, 샘플을 엄격한 혼성화 조건 하에서 MON89034 DNA와는 혼성화되지만, 엄격한 혼성화 조건 하에서 MON89034 DNA가 아닌 옥수수 식물 게놈 DNA와는 혼성화되지 않는 프로브와 접촉시키는 단계, 상기 샘플과 상기 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용시키는 단계, 및 상기 프로브와 MON89034 DNA의 혼성화를 검출하는 단계로 이루어질 수 있다. 본 구체예를 구성하는 프로브는 서열번호:1 및 서열번호:2로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열이거나 상기 서열에 상보적인 서열이다. 샘플과 프로브의 혼성화의 검출은 샘플에서 옥수수 계통 MON89034 폴리뉴클레오티드의 존재에 대하여 진단성이다. 생물학적 샘플은 MON89034 DNA를 포함하는 어떤 샘플로서, 제한되지는 않지만, 옥수수 오일, 옥수수 가루, 옥수수 분말, 옥수수 글루텐, 옥수수 케이크, 옥수수 전분, 옥수수 침지수, 옥수수 조직, 옥수수 세포, 옥수수 낱알, 옥수수 화분, 옥수수 근조직, DDGS, 및 샘플에서 MON89034 계통의 존재에 대하여 진단성인 폴리뉴클레오티드의 적어도 검출량을 샘플이 포함하는 한 이러한 형질전환 옥수수의 발효 부산물로서 얻어진 에탄올을 포함하는 어떠한 샘플일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브는 디옥시리보핵산, 리보핵산, 및 뉴클레오티드 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택된 어떠한 뉴클레오티드일 수 있고, 이는 항체 또는 다른 결합 형태 반응으로 특이적으로 검출될 수 있는 적어도 하나의 형광단(fluorophore), 방사성-방출 방사성 동위원소를 포함하는 분자, 또는 헵텐(hapten) 형태 분자로 표지될 수 있다.
MON89034 형질전환 계통 DNA의 존재에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 다양한 옥수수는, 상기 계통에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 혼성 옥수수 식물을 얻기 위하여, 형질전환 옥수수 계통 MON89034 DNA를 포함하는 옥수수 식물과 계통 MON89034와는 다른 옥수수 식물을 교배하므로써 얻어질 수 있다. 형질전환 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 이러한 혼성 옥수수 식물은 본 발명의 범위 내이고, (형질전환 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 한) 상기 혼성 식물로부터 얻어진 종자, 및 상기 진단성 DNA 서열들을 포함하는 한, 상기 혼성 옥수수 식물 MON89034의 화분, 밑씨, 종자, 뿌리, 또는 잎, 및 이러한 구체예로부터 얻어진 자손은 본 발명의 범위 내이다.
본 발명은 게놈 내에 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호:1 및 서열번호:2사이에 서열번호:5로 나타낸 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 하나 이상의 형질전환 옥수수 식물 세포를 표적 나비목 해충의 먹이로 제공하는 것을 포함하는, 나비목 곤충 침입으로부터 옥수수 식물을 보호하는 방법을 제공한다. 이러한 형질전환 옥수수 식물 세포를 섭취하는 표적 나비목 곤충은 상기 옥수수 식물 세포가 유래된 옥수수 식물의 추가적인 섭취가 차단된다.
또한, 본 발명에 의하여, 옥수수 식물의 표적 나비목 해충에 독성인 조성물이 제공된다. 표적 나비목 해충의 먹이로 제공되는 형질전환 옥수수 세포 조성물은, 그것의 각각의 형질전환 옥수수 식물 세포의 게놈에 서열번호:1 및 서열번호:2 사이에 서열번호:5로 나타낸 연속적인 뉴클레오티드 서열과 함께 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 옥수수 식물 또는 옥수수 식물 세포가 연속적인 뉴클레오티드 서열 내에 포함된 발현 카세트로부터 Cry1A.105 및/또는 Cry2Ab2를 발현하는 한, 상기 옥수수 식물 또는 옥수수 식물 세포로의 나비목 곤충 침입을 방어하는 것을 제공하는데 효과적이다. 형질전환 옥수수 종자의 형태로서의 이러한 조성물은 American Type Culture Collection에 기탁번호 PTA-7455로 기탁되었다. 이러한 곤충 저항성 옥수수 식물, 또는 이들의 부분은 식물 세포의 게놈 내에 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 및 서열번호:5로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함할 것이다. 본 발명에서 언급된 진단성 서열들을 가지는 곤충 저항성 옥수수 식물의 자손 및 종자는, 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 곤충 저항성 옥수수 식물은, 형질전환 옥수수 식물 계통 MON89034를 다른 옥수수 식물과 교배시키고, 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 및 서열번호:5로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 분석하므로써 곤충 저항성 자손을 선별하는 것을 포함하는 방법으로 얻어질 수 있다.
곤충 저항성 형질전환 옥수수 계통 MON89034는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 및 디아캄바(diacamba) 등과 같은 제초제에 저항성인 옥수수와 같은 다른 형질전환 옥수수 변종, 또는 PS149B1 및 변형된 Cry3Bb와 같은 단백질을 코딩하는 서열 삽입의 결과로서 뿌리 섭취 곤충(root devouring insects)에 저항성인 옥수수, 또는 VIP3A, Cry1Ab, 및 Cry1Fa 등과 같은 다른 독소 단백질을 코딩하는 서열 삽입의 결과로서 나비목 곤충 침입에 저항성인 다른 형질전환 옥수수 변종과 조합될 수 있다. 딱정벌레 목 곤충 및 나비목 곤충 침입에 대해 저항성이고, 그리고 선별적인 제초제에 대해 저항성인 혼성 형질전환 옥수수의 개선된 변종들을 제공하기 위하여, 이러한 다른 형질전환 계통의 모든 다양한 조합이 본 발명의 옥수수 식물, 즉 MON89034 계통과 함께 육종될 수 있다. 이러한 변종들은 비-형질전환 종 및 개별적 특질의 형질전환 변종과 비교하여 개선된 생산율 및 가뭄 내성을 나타낸다.
곤충 침입에 저항성인 옥수수 식물을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 옥수수 식물은 서열번호:5에 나타낸 살충 유효량의 독소 코딩 서열을 포함한다. 상기 방법은, 이러한 하나 이상의 독소 코딩 서열을 포함하는 형질전환 옥수수 세포를 얻기 위하여, 형질전환 옥수수 계통 MON89034로부터 상기 독소 코딩 서열들을 추출하고, 이들 코딩 서열을, 단독으로 또는 함께, 하나 이상의 옥수수 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 형질전환 옥수수 세포는 하나 이상의 상기 코딩 서열을 포함하는 형질전환 옥수수 식물로 성장(재생)되어, 상기 형질전환 식물은 곤충 침입에 저항성을 나타내게 된다.
생물학적 샘플에서 MON89034 DNA의 존재에 대하여 진단성인 DNA에 있어서, 옥수수 계통 MON89034 DNA를 포함하는 형질전환 옥수수 식물 DNA의 접합성을 결정하는 방법이 본 발명에 의하여 제공된다. 상기 방법은, 제1의 단계로서, 샘플을, 옥수수 계통 MON89034 DNA를 포함하는 핵산 증폭 반응에서 함께 사용될 때, 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성인 제1의 증폭산물을 생성하고, MON89034와 다른 옥수수 게놈 DNA를 포함하는 핵산 증폭 반응에서 사용될 때, MON89034 DNA와는 다른 옥수수 게놈 DNA에 대하여 진단성인 제2의 증폭산물을 생성하는, 샘플을 서열번호:6, 서열번호:7, 및 서열번호:8을 포함하는 3개의 다른 프라이머와 접촉시키는 것으로 이루어진다. 다음의 단계는, 핵산 증폭 반응을 수행하고, 열 증폭 반응 동안 얻어진 증폭산물을 비교하는 것으로 이루어진다. 양 증폭산물의 존재의 검출은 샘플의 접합성에 대하여 진단성이다. 제1의 증폭산물만의 검출은 MON89034 DNA만을 포함하는 샘플, 즉 동형접합성 샘플을 나타낸다. 제2의 증폭산물만의 검출은 MON89034 DNA를 포함하지 않는 샘플을 나타낸다. 샘플에서 제1의 증폭산물과 제2의 증폭산물의 동시 검출은 (1) 이형접합성 출발물질만을 포함하는 순수 샘플에 관한 이형접합성 DNA를 포함하는 샘플, 또는 (2) 동형접합성 및 이형접합성 출발 샘플 DNA들을 모두 포함하는 샘플, 또는 (3) 동형접합성, 이형접합성, 및/또는 MON89034와는 다른 샘플의 어떤 조합을 포함하는 샘플을 나타낸다.
또한, 본 발명은 옥수수 식물 세포의 게놈 내로 삽입된 형질전환 DNA 단편에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 옥수수 식물을 성장시키는 것을 제공한다. 상기 옥수수 세포의 게놈 내의 DNA는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어떤 하나의 서열 또는 모든 서열들을 포함한다:
(a) 서열번호:5로 나타낸 뉴클레오티드 서열;
(b) 서열번호:1 및 서열번호:2로 나타낸 뉴클레오티드 서열들;
(c) 서열번호:3으로 나타낸 뉴클레오티드 서열; 및
(d) 서열번호:4로 나타낸 뉴클레오티드 서열.
다음의 실시예들은 본 발명의 특정 바람직한 구체예들을 나타내기 위하여 제공된다. 다음의 실시예에 개시된 기술들은 본 발명자들이 본 발명의 수행에 있어서 가장 잘 작용하는 것으로 발견한 접근법들이므로, 본 발명의 실시를 위한 바람직한 형태의 실시예를 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 당업자는 이해하여야 한다. 그러나, 본 명세서의 견지에서, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이, 다양한 변화가 특정 구체예들에서 이루어질 수 있으며, 동등 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 당업자는 이해하여야 한다.
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도 1. 형질전환 옥수수 계통 MON89034의 게놈 내에 존재하는 형질전환유전자 삽입물의 구성. 중앙의 열린 백색 막대는 삽입된 DNA를 나타낸다. 상기 백색 막대 아래는 삽입된 DNA 내의 여러 구성요소를 나타내는 모식도이다. 삽입된 DNA의 말단은 5'(도면의 왼쪽) 및 3'(도면의 오른쪽)과 같이 임의적으로 명명되었다. 우측 경계 및 좌측 경계 서열들 또는 단편들은 삽입된 DNA 내의 여러 구성요소를 설명하는 것으로서, 모식도의 각 말단 아래에 표시되었다. 삽입된 DNA 내의 발현 카세트에 표시된 구성요소는 우측 경계로부터 출발하는 연속적인 순서로 e35S 프로모터, 밀 CAB 비변역 리더(wheat CAB untranslated leader), 쌀 액틴 인트론(rice actin intron), Cry1A.105에 대한 코딩 서열, 밀 HSP17 3' 종결 서열 및 폴리아데닐화 서열, FMV 프로모터, hsp70 인트론, 루비스코 스몰 서브유닛 클로로플라스트 타겟팅 펩티드 코딩 서열(rubisco small subunit chloroplast targeting peptide coding sequence), Cry2Ab 코딩 서열, nos 3' 종결 및 폴리아데닐화 신호 서열, 및 좌측 경계이다. 중앙의 열린 백색 막대의 양 말단에 수직으로 빗금친 막대들은 임의적으로 표지된 5' 및 3' 옥수수 게놈 인접 서열들에 상응한다. 빗금친 막대 및 열린 백색 막대 위의 가장 긴 검은 선은 서열번호:5(5' 인접 서열, 삽입된 DNA 서열, 및 3' 인접 서열을 나타내는 전장 서열)를 나타낸다. 서열번호:5로서 표시된 검은 선 위와 아래의 짧은 검은 선들은 각각의 특이적으로 표지된 서열들(즉, 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 및 서열번호:4)이 발견될 수 있는 서열번호:5 내의 근사적인 위치들을 나타낸다. 서열번호:1 및 서열번호:2, 및 서열번호:1 및/또는 서열번호:2를 포함하는 옥수수 계통 MON89034로부터 유래된 어떤 서열은 생물학적 샘플에서 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성이다.
실시예 1
본 실시예에서는 형질전환 옥수수 계통 MON89034의 구조 및 분자적 특성을 설명한다.
옥수수 식물 MON89034를, 플라스미드 구조물 pMON38850(발현 카세트는 도 1에 나타내었다)를 사용하여, 근친교배 옥수수 계열의 아그로박테리움 매개 형질전환 방법으로 얻었다. 사용된 형질전환 방법은 미국특허번호 제6,603,061호에 설명된 방법과 유사하다. 플라스미드 구조물 pMON38850은 옥수수 식물 세포에서 Cry1A.105 살충 단백질의 발현에 필수적인 조절 유전 성분을 갖는 연결된 식물 발현 카세트를 포함한다. 옥수수 세포들을 적어도 약 23000종의 다른 형질전환 계통들로 이루어진 완전한(intact) 옥수수 식물들로 재생시켰다. 개별적인 형질전환 계통들(식물들)을 식물 발현 카세트의 보존성(integrity) 및 나비목 곤충의 유충 먹이 손상에 저항성을 나타내는 계통들의 군으로부터 선별하였다. 옥수수 게놈 내에 pMON38850의 연결된 식물 발현 카세트를 포함하는 옥수수 식물은 본 발명의 하나의 측면이다. 이러한 형질전환 계통의 실질적인 분석 후, MON89034 형질전환 계통을 그것의 분자적 특징 및 어떠한 원하지 않는 표현형 또는 작물학적 결함 효과의 부재에 기초하여 선별하였다.
도 1에서 설명된 바와 같은 MON89034 옥수수 게놈에 포함된 형질전환유전자 유전 성분들의 서열들은 서로 작동가능하게 연결된 다음의 각 성분들로 구성된다. 서열의 임의적으로 정의된 5' 말단의 시작 부분(즉, 도 1에서 설명된 단편의 좌측 중앙 부분 근처)은 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 우측 경계 지역의 부분으로 표시된다(B-우측 경계). 상기 시작 부분 다음에는, 강화된 CaMV 35S 프로모터 성분(P-e35S로 명명, 서열번호:5의 위치 2350 내지 2651에 위치); 밀 클로로필 A/B 결합 단백질 비번역 리더 서열(L-Cab으로 명명, 서열번호:5의 위치 2678 내지 2738에 위치); 쌀 액틴 인트론 서열(I-Ract1으로 명명, 서열번호:5의 위치 2755 내지 3234에 위치); 키메릭 유전자 CS-cry1A.105를 코딩하는 비-자연적으로 발생하는 서열(서열번호:5의 위치 3244 내지 6777에 위치); 및 밀로부터의 3' 말단 지역(T-Hsp17로 명명, 서열번호:5의 위치 6809 내지 7018에 위치)으로 이루어지는 발현카세트가 이어진다. 경계 서열 이외의 상기 언급된 성분들의 조합은 옥수수 식물에서 Cry1A.105 살충 단백질의 발현이 발생할 때 함께 작용한다. 다음으로 이러한 성분들은 다음의 성분으로 이루어지는 다른 발현 카세트에 차례로 연결된다: 피그워트 모자이크 프로모터(Figwort mosaic promoter)(P-FMV로 명명, 서열번호:5의 위치 7086 내지 7649에 위치), 제아 마이스 Hsp70 리더(HSP70 또는 I-Hsp70으로 명명, 서열번호:5의 위치 7672 내지 8475에 위치), 및 제아 마이스 클로로플라스트 트랜짓 펩티드 코딩 서열(CTP2 또는 TS-SSU-CTP로 명명, 서열번호:5의 위치 8492 내지 8892에 위치). 다음으로 이러한 작동가능하게 연결된 단편들은, 3' 말단이 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 합성효소 유전자(nopaline synthase gene)의 3' 비번역 지역(T-nos로 명명, 서열번호:5의 위치 10827 내지 11377에 위치)에 연결된 살충 단백질 Cry2Ab을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(CS-cry2Ab2로 명명, 서열번호:5의 위치 8893 내지 10800에 위치)에 연결된다. Cry2Ab 코딩 서열에 인접한 이러한 성분들은 옥수수 식물에 존재할 때, Cry2Ab의 발현을 유도하기 위하여 함께 작용한다. 다음으로, Cry2Ab 발현 카세트 다음에 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 좌측 경계(LB, B-좌측 경계로 명명) 지역의 충분한 부분으로 이루어지는 뉴클레오티드 서열이 차례로 이어진다.
DNA 증폭 방법에서 프라이머로서 유용한 DNA 분자는 MON89034 계통에 포함된 형질전환유전자 삽입물의 유전 성분들의 서열로부터 유래될 수 있다. 이러한 프라이머 분자들은 형질전환유전자 삽입물에 인접한 계통의 게놈으로부터 유래된 DNA 프라이머 분자를 포함하는 프라이머 세트의 부분으로서 사용될 수 있다.
형질전환 옥수수 식물 계통 MON89034를 창출하는, 좌측 및 우측 경계 단편들 및 상기 경계 단편들 사이의 두 개의 연결된 식물 발현 카세트(제1의 발현 카세트는 Cry1A.105를 코딩하고, 제2의 발현 카세트는 Cry2Ab를 코딩하며, 상기 각 카세트는 하나가 제1로 명명되거나 제2로 명명되는 것과 같이 상호교환될 수 있다)로 이루어지는, 옥수수 게놈 내로 삽입된 pMON38850 플라스미드 DNA의 부분은 상세한 분자 분석들에 의하여 특성화된다. 이러한 분석들은 경계들 및 상기 경계들 사이의 원하는 두개의 발현 카세트로 이루어지는 단일의 완전한 삽입 단편을 포함하는 계통(옥수수 게놈 내의 통합 부위의 수), 사본수(하나의 유전자좌 내의 형질전환(T)-DNA 사본수), 및 삽입된 유전자 카세트의 보존성(즉, 플라스미드 pMON38850에 존재하는 것으로 알려진 서열로부터 어떠한 재배열 또는 서열 변화의 부재)을 확인하기 위하여 수행된다. 완전한 Cry1A.105 코딩 지역 및 그것의 각각의 조절 성분들, 프로모터들, 인트론들, 및 식물 발현 카세트의 폴리아데닐화 서열들, 및 플라스미드 pMON38850 골격 DNA 지역을 포함하는 DNA 분자 프로브들이 사용된다. 모든 계통으로부터 얻어진 데이터로부터 MON89034는 단일 사본의 Cry1A.105 발현 카세트를 가진 단일 T-DNA 삽입을 포함한다는 것을 보여주었다. 완전한 유전자 카세트에 연결 또는 비연결된 형질전환 벡터 pMON38850으로부터의 추가적인 성분은 MON89034의 게놈에서 검출되지 않았다. 마지막으로, 5' 및 3'의 삽입물-식물 게놈 접합부를 결정하기 위하여, 삽입물 내의 성분들의 조직화를 확인하기 위하여(예를 들어, 도 1 참고), 그리고 형질전환 옥수수 계통 MON89034를 창출하는 옥수수 식물 게놈 내로 삽입된 DNA의 완전한 서열을 결정하기 위하여 PCR과 DNA 서열 분석을 수행하였다. 삽입된 DNA의 양 말단의 옥수수 게놈 인접 서열들의 부분과 함께 완전한 삽입 서열을 서열번호:5에 나타낸 서열로 나타내었다.
MON89034로부터의 게놈 DNA, 및 MON89034와는 다른 옥수수로부터의 비형질전환 DNA(대조군 DNA)를, 먼저 종자(최대 200 종자)를 Harbil 5G-HD paint shaker(Harbil Inc, Cincinnati, Ohio)를 이용하여 미세 분말로 가공하는 것에 의하여 옥수수로부터 추출하였다. 요약하면, 분말 종자를 추출 완충액(EM Science Cat. No. 3700, EM Science, Gibbstown, New Jersey, USA)으로 추출하고, 이소프로판올(Sigma Cat. No. I-0398, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 용액으로부터 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 70% 에탄올을 포함하는 마이크로 원심분리 튜브 내로 투입하였다. DNA를 최고속도(~14000rpm)로 ~5분 동안의 마이크로 원심분리기에 의해 펠렛화하고, 진공건조 후, TE 완충액(pH 8.0)에 재용해시켰다. 다음으로, DNA를 4℃의 냉장고에 저장하였다. 이 방법은 단일 옥수수 종자로부터 DNA를 추출하기 위하여 당업자에 의하여 변경될 수 있다.
샘플에서 계통 MON89034를 확인하기 위하여 사용된 예시적인 방법들은 예시적인 조건이 표 1 및 표 2에 설명된 계통 특이적 종점(event specific endpoint) TAQMAN® PCR에 설명되어 있다. 상기 분석에 사용된 DNA 프라이머들은 프라이머 SQ2842(서열번호:6), SQ2843(서열번호:7), 6FAMTM 표지 프라이머 PB880(서열번호:14) 및 VICTM 표지 프라이머 PB2931(서열번호:15)이며, 상기 6FAM 및 VIC는 DNA 프라이머에 부착된 Applied Biosystems(Foster City, CA)의 형광 염료 산물이다. TAQMAN® MGB 프로브에 대하여, Taq DAN 중합효소의 5'-엑소뉴클레아제 활성은 5' 말단으로부터 형광단 및 퀀처(quencher) 사이의 프로브를 절단한다. 표적 DNA 가닥에 혼성화될 때, 퀀처와 형광단은 형광(형광단 여기 파장) 신호를 얻기 위한 3차원 공간으로 충분히 분리된다.
SQ2842(서열번호:6) 및 SQ2843(서열번호:7)은, PB880(서열번호:14)와 함께 이러한 반응 방법들에 사용될 때, 계통 MON89034 DNA에 대하여 진단성인 DNA 증폭산물을 생산한다. 이러한 분석을 위한 대조군들은 계통 MON89034 DNA를 포함하는 옥수수로부터의 양성 대조군, 및 비-형질전환 옥수수 또는 계통 MON89034와는 다른 형질전환 옥수수로부터의 음성 대조군, 및 기질 DNA를 포함하지 않는 음성 대조군을 포함한다.
SQ1564(서열번호:17) 및 SQ1565(서열번호:18)은, PB351(서열번호:21)과 함께 이러한 반응 방법들에 사용될 때, MON89034에서 Cry1A.105에 대한 진단성인 증폭산물을 생산한다.
이러한 분석은 Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 또는 Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, 또는 Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler를 사용하기 위하여 최적화된다. 증폭산물을 생산하여 계통 MON89034 DNA를 확인하기 위한 다른 방법들 및 장치들은 당업자에게 알려져 있고, 이는 당분야의 기술범위 내이다.
생물학적 샘플에서 서열번호:1 또는 그것의 완전한 상보성 서열에 특이적으로 결합하고, 서열번호:1로 나타낸 적어도 11개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 경우에 따라서, 결합이 검출될 수 있는 한, 서열번호:1의 서열의 역상보체를 포함하는 어떤 프로브는 샘플에서 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재에 대하여 진단성이다. 생물학적 샘플에서 서열번호:2 또는 그것의 완전한 상보성 서열에 특이적으로 결합하고, 서열번호:2로 나타낸 적어도 11개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 경우에 따라서, 결합이 검출될 수 있는 한, 서열번호:2의 서열의 역상보체를 포함하는 어떤 프로브는 샘플에서 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재에 대하여 진단성이다.
옥수수 DNA를 포함하는 생물학적 샘플로부터 증폭산물을 생산하는데 사용되는, 또는 사용하기 위하여 설계된 어떤 프라이머 쌍, 및 서열번호:1 또는 서열번호:2, 또는 경우에 따라서, 양 서열을 포함하는 증폭산물은 본 발명의 범위 내로 간주된다. 본 발명의 목적을 위하여, 서열번호:1 또는 서열번호:2 또는 양 서열을 포함하는 이러한 증폭산물은 생물학적 샘플에서 옥수수 계통 MON89034의 존재에 대하여 진단성인 것으로 고려된다. 다음의 실시예는 당업자를 위한 참고내용으로서 제공된다.
옥수수 MON89034 계통 특이적 종점 TAQMAN ® PCR
단계 시약 양 코멘트
1 뉴클레아제-미함유 물 최종 부피가 10μl가 되도록 첨가 -
2 2X Universal Master Mix (Applied Biosystems cat. # 4304437) 5μl 1 X 최종농도
3 프라이머 SQ2842(서열번호:6), 및 SQ2843(서열번호:7)(뉴클레아제-미함유 물에 각각 20μM의 농도로 재현탁) 0.5μl 1.0μM 최종농도
4 프라이머 6FAMTM PB880(서열번호:14)
(뉴클레아제-미함유 물에 10μM의 농도로 재현탁)		 0.2μl 0.2μM 최종농도
5 내부 대조군 프라이머-SQ2842 및 내부 대조군 프라이머 SQ2843 0.2 ml 0.2μM 최종농도
6 추출된 DNA(기질):
분석될 샘플(각각의 잎)


음성 대조군



음성 대조군



양성 대조군




양성 대조군		 3,0μl
게놈 DNA 4~80ng


비-형질전환 옥수수 게놈 DNA 4ng


무 DNA 기질
(DNA가 재현탁된 용액)


알려진 계통MON89034
이형접합성 옥수수로부터의 게놈 DNA 4ng


알려진 계통 MON89034
동형접합성 옥수수로부터의 게놈 DNA 4ng		 물에 희석
7 약하게 혼합, 각 반응 상층부에 1~2 방울의 미네랄 오일 첨가.
DNA 증폭은 매뉴얼 조작 또는 온도 단계 및 싸이클의 전자적 조절 조작을 포함하는 써모싸이클링(thermocycling)을 위한 어떤 수단을 사용하여 준비되고 수행될 수 있다. Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, 또는 Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler 또는 Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 또는 MJ Research DNA Engine PTC-225 thermal cyclers는 다음의 싸이클링 변수들을 수행시키는데 성공적으로 사용되었다. Eppendorf Mastercycler Gradient 또는 MJ Engine에서 PCR을 수행할 때, 써모싸이클러는 계산된 모드로 싸이클링된다. Perkin-Elmer 9700을 사용할 때, 싸이클링 조건들은 최대 속도로 설정된 램프 스피드(ramp speed)로 수행된다.
접합성 분석 써모싸이클러 조건
싸이클 수 세팅: Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
1 50℃ 2분
1 95℃ 10분
10 95℃ 15초
4℃ 1분(-1℃/싸이클)
30 95℃ 15초
54℃ 1분
1 10℃ 지속
실시예 2
본 실시예는 게놈 내에 형질전환 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 옥수수 식물의 동정 및 그러한 옥수수 식물의 접합성의 결정을 설명한다.
게놈 내에 계통 MON89034 DNA를 포함하는 동형접합성 자손으로부터 이형접합성을 확인하는데 사용된 방법은 표 3 및 표 4에 예시된 조건들의 접합성 분석으로 설명된다. 상기 접합성 분석에서 사용된 DNA 프라이머는 프라이머 SQ2842(서열번호:6), SQ2843(서열번호:7), SQ6523(서열번호:10), SQ6524(서열번호:11), 6FAMTM 표지 프라이머 PB880(서열번호:14) 및 VICTM 표지 프라이머 PB2931(서열번호:15)이다. 상기 설명된 바와 같이, 6FAM 및 VIC는 DNA 프라이머에 부착된 Applied Biosystems(Foster City, CA)의 형광 염료 생성물이다.
열 증폭 반응에서 샘플 내의 옥수수 계통 MON89034의 존재에 대하여 진단성인 DNA를 포함하는 기질 DNA를 포함하는 생물학적 샘플과 함께 사용될 때, SQ2842(서열번호:6), SQ2843(서열번호:7), SQ6523(서열번호:10), SQ6524(서열번호:11)은 (옥수수 DNA가 비형질전환 샘플로부터 유래되든, 어떤 다른 형질전환 샘플로부터 유래되든 상관없이) 옥수수 계통 MON89034 DNA와는 다른 옥수수 DNA에 대하여 진단성인 DNA 증폭산물을 생산한다. 또는, 상기 반응은 형질전환 옥수수 계통 MON89034에 존재하는 삽입 DNA에 상응하는 대립유전자에 대하여 이형접합성인 옥수수 게놈으로부터 유래된 DNA를 포함하는 생물학적 샘플로부터 두 개의 다른 DNA 증폭산물을 생산할 것이다. 이러한 두 개의 다른 증폭산물은 야생형 옥수수 게놈 유전자좌로부터 유래된 제1의 증폭산물, 및 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재에 대하여 진단성인 제2의 증폭산물에 상응할 것이다. 이형접합성 게놈에 대하여 설명된 제2의 증폭산물에 상응하는 단일의 증폭산물을 창출하는 옥수수 DNA의 샘플은 상기 샘플에서 옥수수 계통 MON89034의 존재에 대하여 진단성이고, 형질전환 옥수수 계통 MON89034 삽입 DNA에 상응하는 대립유전자에 대하여 동형접합성인 옥수수 종자로부터 얻은 기질로서 사용된 옥수수 DNA의 결정에 대하여 진단성이다. 이 분석을 위한 대조군은 계통 MON89034 DNA를 포함하는 동형접합성 옥수수 및 이형접합성 옥수수로부터의 양성 대조군, 비-형질전환 옥수수 또는 어떤 다른 형질전환 옥수수 변종으로부터의 음성 대조군, 및 기질 DNA를 포함하지 않은 음성 대조군을 포함하여야 한다. 이 분석은 Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, 또는 Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler를 사용하는데 최적화된다. MON89034 식물로 만들어진 교배의 자손의 접합성을 확인하기 위한 증폭산물을 얻는 다른 방법들 및 장치들은 당업계에서 통상적인 기술이라는 것은 당업자에게 알려져 있다.
접합성 분석 반응 용액
단계 시약 양 코멘트
1 뉴클레아제-미함유 물 최종 부피가 5μl가 되도록 첨가 -
2 2X Universal Master Mix (Applied Biosystems cat. # 4304437) 2.5μl 1 X 최종농도
3 프라이머 서열번호:6, 및 서열번호:7(뉴클레아제-미함유 물에 20μM의 농도로 재현탁됨) 0.05μl 0.25μM 최종농도
4 PB880 서열번호:14 프라이머 6FAMTM(뉴클레아제-미함유 물에 10μM의 농도로 재현탁됨) 0.01μl 0.4μM 최종농도
5 PB2931 서열번호:15 프라이머 VICTM(뉴클레아제-미함유 물에 10μM의 농도로 재현탁됨) 0.01μl 0.15μM 최종농도
6 REDTaq DNA 중합효소
(1유니트/μl)		 1.0μl(다음 단계 이전에 피펫의 교환이 추천됨) 1유니트/반응
7 추출 DNA(기질):
분석될 샘플(각각의 잎)


음성 대조군



음성 대조군



양성 대조군




양성 대조군		 2.0μl
게놈 DNA 4~80ng


비-형질전환 옥수수 게놈 DNA 4ng


DNA 기질 없음(DNA가 재현탁된 용액)


알려진 계통 MON89034
이형접합성 옥수수로부터의 게놈 DNA 4ng


알려진 계통 MON89034
동형접합성 옥수수로부터의 게놈 DNA 4ng		 물에 희석
8 약하게 혼합, 각 반응 상층부에 1~2 방울의 미네랄 오일 첨가.
다음의 싸이클링 변수들을 수행하기 위하여, DNA 증폭에 Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, 또는 Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler 또는 Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 또는 MJ Research DNA Engine PTC-225 thermal cycler가 성공적으로 사용되었다. Eppendorf Mastercycler Gradient 또는 MJ Engine을 사용할 때, 싸이클은 계산된 모드로 수행되었다. Perkin-Elmer 9700을 사용할 때, 싸이클은 최대 속도로 설정된 램프 스피드로 수행되었다.
접합성 분석 써모싸이클러 조건 a
연속적인 순서로서 싸이클의 수 온도 및 시간
1 50℃ 2분
1 95℃ 10분
10 95℃ 15초
64℃ 1분(-1℃/싸이클)
30 95℃ 15초
54℃ 1분
1 10℃ 유지
a: Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 사용
형질전환 계통 MON89034에 상응하는 종자를 부다페스트 조약하에서 American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110에 2006년 3월 28일자로 기탁하였다. ATCC 기탁번호 또는 특허기탁번호는 PTA-7455이다. 기탁은 30년의 기간, 또는 최종 요청으로부터 5년, 또는 더 장기간이더라도 특허존속기간 동안 기탁소에 유지될 것이며, 상기 기간 동안 필요한 경우 대체될 것이다.
본 발명의 개념을 도해하고 설명하는데 있어서, 본 발명의 이러한 개념으로부터 벗어남이 없이 배열 및 세부사항이 변형될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 우리는 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범위 내의 모든 변형을 권리범위로 한다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌 및 반포된 특허문서는 각 개별적인 문헌 또는 특허출원이 참고문헌으로서 통합되는 것으로 특정적 및 개별적으로 지시된 것과 동일하게 참고문헌으로서 본 명세서에 통합된다.
ATCC PTA-7455 20060328
서열목록 전자파일 첨부

Claims (54)

  1. Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 삽입물, 서열번호:1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는, 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 옥수수 식물의 세포들의 게놈 중에 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 삽입물, 서열번호:1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는, 옥수수 식물.
  3. 제 2항에 있어서, 서열번호:5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 옥수수 식물.
  4. 제 1항에 있어서, MON89034 옥수수 계통으로부터 수득된 옥수수 식물로서, 상기 MON89034 옥수수 계통을 포함하는 대표 종자 샘플이 미국미생물보존센터(ATCC)에 PTA-7455로 기탁된 것을 특징으로 하는, 옥수수 식물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 옥수수 식물은 자손(progeny) 옥수수 식물인 것을 특징으로 하는, 옥수수 식물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 옥수수 식물은 화분(pollen), 밑씨(onule), 꽃(flowers), 싹(shoots), 뿌리(roots), 줄기(stalks), 실크(silks), 수염(tassels), 이삭(ears) 및 잎(leaves)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 옥수수 식물의 부분인 것을 특징으로 하는, 옥수수 식물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 옥수수 식물로부터 유래된 조성물로서, 상기 조성물은 검출가능한 양의 서열번호:1 및 서열번호:2를 포함하고, 상기 조성물은 옥수수 가루, 옥수수 오일, 옥수수 케이크, 옥수수 배아, 옥수수 전분, 옥수수 분말, 옥수수 화분, 옥수수 실크, 옥수수 담금 액, 옥수수 맥아, 옥수수 당, 옥수수 시럽, 옥수수 오일로부터 생산된 마아가린, 주정박(DDGS), 화장품 및 증량제로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 다음을 포함하는, 곤충 저항성 옥수수 식물의 생산 방법:
    (a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 옥수수 식물을 이와 다른 옥수수 식물과 교배시키는 단계;
    (b) 상기 (a)의 교배로부터 유래된 적어도 하나의 자손 식물을 얻는 단계; 및
    (c) 서열번호:1 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 자손을 선별하는 단계,
    여기에서, 선별된 자손은 곤충 저항성 옥수수 식물이다.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 선별 단계 (c)는, (b)로부터 얻어진 상기 적어도 하나의 자손 식물을 핵산 증폭 반응에 적용시켜, 서열번호:1 또는 서열번호:2의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 증폭산물을 생산하는 자손을 선별하거나, (b)로부터 얻어진 상기 적어도 하나의 자손 식물을 핵산 혼성화 반응에 적용시켜, 45℃에서 6.0 x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)로 처리 후, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하는 것을 포함하는 엄격한 조건하에서 서열번호:1 또는 서열번호:2 또는 그의 상보체를 포함하는 프로브에 혼성화하는 자손을 선별하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 삽입물, 서열번호:1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는, 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물의 종자.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 옥수수 식물의 종자의 세포들의 게놈 중에 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 삽입물, 서열번호:1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는, 옥수수 식물의 종자.
  12. 제 11항에 있어서, 서열번호:5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 옥수수 식물의 종자.
  13. 제 10항에 있어서, MON89034 옥수수 계통으로부터 수득된 옥수수 식물의 종자로서, 상기 MON89034 옥수수 계통을 포함하는 대표 종자 샘플이 미국미생물보존센터(ATCC)에 PTA-7455로 기탁된 것을 특징으로 하는, 옥수수 식물의 종자.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 옥수수 식물의 종자로부터 유래된 조성물로서, 상기 조성물은 검출가능한 양의 서열번호:1 및 서열번호:2를 포함하는 것인 조성물.
  15. Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 삽입물, 서열번호:1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는, 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물 세포.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 옥수수 식물 세포의 게놈 중에 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 삽입물, 서열번호:1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 및 서열번호:2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는, 옥수수 식물 세포.
  17. 제 16항에 있어서, 서열번호:5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 옥수수 식물 세포.
  18. 제 15항에 있어서, MON89034 옥수수 계통으로부터 수득된 옥수수 식물 세포로서, 상기 MON89034 옥수수 계통을 포함하는 대표 종자 샘플이 미국미생물보존센터(ATCC)에 PTA-7455로 기탁된 것을 특징으로 하는, 옥수수 식물 세포.
  19. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 옥수수 식물 세포로부터 유래된 조성물로서, 상기 조성물은 검출가능한 양의 서열번호:1 및 서열번호:2를 포함하는 것인 조성물.
  20. 다음을 포함하는, 곤충 저항성 옥수수 식물의 생산 방법:
    (a) 옥수수 식물 세포를 서열번호:5를 포함하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환시키는 단계; 및
    (b) 상기 형질전환된 세포로부터 옥수수 식물을 재생시키는 단계,
    여기에서, 상기 옥수수 식물은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 곤충 저항성이다.
  21. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 형질전환 옥수수 식물의 세포 또는 세포들 또는 조직 또는 조직들을 살충 유효량으로 옥수수의 나비목 해충의 먹이로 제공하는 것을 포함하는, 곤충 침입으로부터 옥수수 식물의 보호 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 나비목 해충은 밤나방(Spodoptera frugiperda), 유럽조명나방(Ostrinia nubilalis), 왕담배나방(Helicoverpa zea), 사우스웨스턴 조명나방(Diatraea grandiosella) 및 검거세미나방(Agrotis ipsilon)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 형질전환 옥수수 식물의 종자를 살충 유효량으로 옥수수의 나비목 해충의 먹이로 제공하는 것을 포함하는, 곤충 침입으로부터 옥수수 식물의 보호 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 나비목 해충은 밤나방(Spodoptera frugiperda), 유럽조명나방(Ostrinia nubilalis), 왕담배나방(Helicoverpa zea), 사우스웨스턴 조명나방(Diatraea grandiosella) 및 검거세미나방(Agrotis ipsilon)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항의 형질전환 옥수수 식물 세포를 살충 유효량으로 옥수수의 나비목 해충의 먹이로 제공하는 것을 포함하는, 곤충 침입으로부터 옥수수 식물의 보호 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 나비목 해충은 밤나방(Spodoptera frugiperda), 유럽조명나방(Ostrinia nubilalis), 왕담배나방(Helicoverpa zea), 사우스웨스턴 조명나방(Diatraea grandiosella) 및 검거세미나방(Agrotis ipsilon)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1의 DNA 분자 및 제2의 DNA 분자를 포함하는 한 쌍의 DNA 분자들:
    여기에서, 상기 제 1의 DNA 분자 및 제2의 DNA 분자는 각각 옥수수 식물 MON89034 또는 그의 자손으로부터 추출된 DNA에 대하여 진단성인 DNA 프라이머들 또는 프로브들로서 작용하는, 서열번호:3 또는 서열번호:4 또는 서열번호:5의 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드들 또는 이들의 상보체를 포함한다.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 제1의 DNA 분자는 서열번호:3 또는 서열번호:5의 형질전환유전자 지역의 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하고, 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:3의 5' 인접 옥수수 게놈 DNA 지역의 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하며, 여기에서 (i) 상기 제1의 DNA 분자는 서열번호:5의 이종 삽입물 DNA 부분에 상보적인 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:3의 옥수수 게놈 부분의 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 (ii) 상기 제1의 DNA 분자는 서열번호:5의 뉴클레오티드 위치 2060 내지 12208과 특이적으로 혼성화하고, 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:3의 뉴클레오티드 위치 1 내지 2050에 상응하는 역상보체 서열과 특이적으로 혼성화하는 것을 특징으로 하는 한 쌍의 DNA 분자들.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 제1의 DNA 분자는 서열번호:4 또는 서열번호:5의 형질전환유전자 지역의 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하고, 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:4의 3' 인접 옥수수 게놈 DNA 지역의 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하며, 여기에서 (i) 상기 제1의 DNA 분자는 서열번호:5의 이종 삽입 DNA 부분의 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:4의 옥수수 게놈 부분에 상보적인 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 (ii) 상기 제1의 DNA 분자는 서열번호:5의 뉴클레오티드 위치 1 내지 11305에 상응하는 역상보체 서열과 특이적으로 혼성화하고, 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:4의 뉴클레오티드 위치 21 내지 914와 특이적으로 혼성화하는 것을 특징으로 하는 한 쌍의 DNA 분자들.
  30. 제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 제1의 DNA 분자는 서열번호:6을 포함하고, 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:7을 포함하거나; 또는
    (ii) 상기 제1의 DNA 분자 및 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5의 적어도 30개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 한 쌍의 DNA 분자들.
  31. 다음을 포함하는, 옥수수 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재의 검출 방법:
    (a) 상기 생물학적 샘플을, 제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 한쌍의 DNA 분자들을 포함하는 DNA 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;
    (b) 핵산 증폭 반응 조건을 제공하는 단계;
    (c) 상기 핵산 증폭 반응을 수행하여, DNA 증폭산물 분자를 생산하는 단계; 및
    (d) 상기 DNA 증폭산물 분자를 검출하는 단계,
    여기에서, 서열번호:1, 서열번호:2 및 이들의 상보체의 적어도 하나를 포함하는 증폭산물의 검출은 상기 생물학적 샘플에서 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재를 나타낸다.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 옥수수 식물로부터 추출된 DNA 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 다음을 포함하는, 옥수수 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재의 검출 방법:
    (a) 생물학적 샘플을, 45℃에서 6.0 x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)로 처리 후, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하는 것을 포함하는 엄격한 조건하에서 서열번호:1 또는 서열번호:2 또는 그의 상보체로 나타낸 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들과 혼성화하는 DNA 프로브와 접촉시키는 단계;
    (b) 45℃에서 6.0 x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)로 처리 후, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하는 것을 포함하는 엄격한 혼성화 조건에 상기 생물학적 샘플 및 DNA 프로브를 적용시키는 단계; 및
    (c) 상기 생물학적 샘플과 상기 DNA 프로브와의 혼성화를 검출하는 단계,
    여기에서, 혼성화의 검출은 상기 생물학적 샘플에서 상기 옥수수 계통 MON89034 DNA의 존재를 나타낸다.
  34. 제 33항에 있어서,
    (i) 상기 생물학적 샘플은 옥수수 식물로부터 추출된 DNA 샘플이거나; 또는
    (ii) 상기 DNA 프로브는 서열번호:1, 서열번호:2 또는 그의 상보체를 포함하거나; 또는
    (iii) 상기 DNA 프로브는 적어도 하나의 형광단으로 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 31항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 옥수수 가루, 옥수수 오일, 옥수수 케이크, 옥수수 종자, 옥수수 배아, 옥수수 전분, 옥수수 분말, 옥수수 화분, 옥수수 실크, 옥수수 담금 액, 옥수수 맥아, 옥수수 당, 옥수수 시럽, 옥수수 오일로부터 생산된 마아가린, 주정박(DDGS), 화장품 및 증량제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 옥수수 계통 MON89034 또는 그것의 자손에 대하여 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로 작용하는, 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5와 상동성 또는 상보성인 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는 DNA 검출 키트.
  37. 제 36항에 있어서,
    (i) 상기 적어도 하나의 DNA 분자는 서열번호:1, 서열번호:2 또는 그의 상보체를 포함하거나, 또는 서열번호:1, 서열번호:2 또는 그의 상보체이거나; 또는
    (ii) 제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 한 쌍의 DNA 분자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 검출 키트.
  38. 다음을 포함하는, 생물학적 샘플에서 옥수수 계통 MON89034를 포함하는 옥수수 식물의 DNA의 접합성의 결정 방법:
    (a) 상기 샘플을, (1) 옥수수 계통 MON89034 DNA를 포함하는 핵산 증폭 반응에서 사용될 때, 옥수수 계통 MON89034에 대하여 진단성인 제1의 증폭산물을 생산하고, (2) MON89034 DNA 이외의 옥수수 게놈 DNA를 포함하는 핵산 증폭 반응에서 사용될 때, MON89034 DNA 이외의 옥수수 게놈 DNA에 대하여 진단성인 제2의 증폭산물을 생산하는, 서열번호:6, 서열번호:7 및 서열번호:10을 포함하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계;
    (b) 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
    (c) 생산된 증폭산물을 검출하는 단계,
    여기에서, 양 증폭산물의 존재의 검출은 상기 샘플이 옥수수 계통 MON89034 DNA에 대하여 이형접합성임을 나타내고, 제1의 증폭산물만의 검출은 상기 샘플이 옥수수 계통 MON89034 DNA에 대하여 동형접합성임을 나타낸다.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 추가적으로 서열번호:14 및 서열번호:15와 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 다음 단계들을 포함하는, 샘플에서 옥수수 식물 MON89034에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법:
    (a) DNA를 포함하는 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 옥수수 계통 MON89034로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 서열번호:1 또는 서열번호:2를 포함하는 증폭산물을 생산하는, 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;
    (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여, 상기 증폭산물을 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계.
  41. 다음 단계들을 포함하는, 샘플에서 옥수수 식물 MON89034에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법:
    (a) DNA를 포함하는 샘플을, 엄격한 혼성화 조건하에서 옥수수 계통 MON89034로부터의 게놈 DNA와는 혼성화되지만, 엄격한 혼성화 조건하에서 상기 옥수수 계통 MON89034가 아닌 옥수수 식물과는 혼성화되지 않는 프로브와 접촉시키는 단계, 여기에서 상기 프로브는 서열번호:1 또는 서열번호:2에 대해 상동성 또는 상보적이고;
    (b) 상기 샘플과 상기 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용시키는 단계; 및
    (c) 상기 프로브의 상기 옥수수 계통 MON89034 DNA에의 혼성화를 검출하는 단계,
    여기에서 상기 엄격한 혼성화 조건은 45℃에서 6.0 x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)로 처리 후, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하는 것을 포함한다.
  42. 제1의 DNA 분자와 제2의 DNA 분자를 포함하고, (i) 상기 제1의 DNA 분자는 서열번호:6을 포함하고, 상기 제2의 DNA 분자는 서열번호:7을 포함하거나; 또는 (ii) 상기 제1 및 제2의 DNA 분자는 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5의 적어도 30개의 연속적인 뉴클레오티드들을 포함하는 DNA 검출 키트.
  43. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3 또는 서열번호:4 중의 어느 하나와 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, PS149B1, Cry3Bb, VIP3A, Cry1Ab 및 Cry1Fa로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물.
  44. 제 43항에 있어서, 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3 또는 서열번호:4 중의 어느 하나는 상기 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물의 게놈 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물.
  45. 제 43항에 있어서, 상기 옥수수 식물은 자손(progeny) 옥수수 식물인 것을 특징으로 하는, 옥수수 식물.
  46. 제 43항에 있어서, 상기 옥수수 식물은 화분(pollen), 밑씨(onule), 꽃(flowers), 싹(shoots), 뿌리(roots), 줄기(stalks), 실크(silks), 수염(tassels), 이삭(ears) 및 잎(leaves)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 옥수수 식물의 부분인 것을 특징으로 하는, 옥수수 식물.
  47. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5 중의 어느 하나와 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, PS149B1, Cry3Bb, VIP3A, Cry1Ab 및 Cry1Fa로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는, 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물로부터 유래된 조성물로서,
    상기 조성물은 검출가능한 양의 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5 중의 어느 하나를 포함하고,
    상기 조성물은 옥수수 가루, 옥수수 오일, 옥수수 케이크, 옥수수 종자, 옥수수 배아, 옥수수 전분, 옥수수 분말, 옥수수 화분, 옥수수 실크, 옥수수 담금 액, 옥수수 맥아, 옥수수 당, 옥수수 시럽, 옥수수 오일로부터 생산된 마아가린, 주정박(DDGS), 화장품 및 증량제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  48. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3 또는 서열번호:4 중의 어느 하나와 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, PS149B1, Cry3Bb, VIP3A, Cry1Ab 및 Cry1Fa로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물의 종자.
  49. 제 43항에 있어서, 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3 또는 서열번호:4 중의 어느 하나는 상기 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물의 종자의 게놈 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물의 종자.
  50. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5 중의 어느 하나와 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, PS149B1, Cry3Bb, VIP3A, Cry1Ab 및 Cry1Fa로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는, 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물의 종자로부터 유래된 조성물로서,
    상기 조성물은 검출가능한 양의 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5 중의 어느 하나를 포함하는 것인 조성물.
  51. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3 또는 서열번호:4 중의 어느 하나와 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, PS149B1, Cry3Bb, VIP3A, Cry1Ab 및 Cry1Fa로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물 세포.
  52. 제 51항에 있어서, 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3 또는 서열번호:4 중의 어느 하나는 상기 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물 세포의 게놈 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물 세포.
  53. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5 중의 어느 하나와 Cry2Ab 및 Cry1A.105를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, PS149B1, Cry3Bb, VIP3A, Cry1Ab 및 Cry1Fa로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는, 형질전환 곤충저항성 옥수수 식물 세포로부터 유래된 조성물로서,
    상기 조성물은 검출가능한 양의 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4 또는 서열번호:5 중의 어느 하나를 포함하는 것인 조성물.
  54. 서열번호:1 또는 서열번호:2 또는 서열번호:3 또는 서열번호:4 또는 서열번호:5의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체를 포함하는 DNA 분자.
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