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WO1988006183A1 - Compositions liquides d'enzymes - Google Patents

Compositions liquides d'enzymes Download PDF

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WO1988006183A1
WO1988006183A1 PCT/DE1988/000061 DE8800061W WO8806183A1 WO 1988006183 A1 WO1988006183 A1 WO 1988006183A1 DE 8800061 W DE8800061 W DE 8800061W WO 8806183 A1 WO8806183 A1 WO 8806183A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzymes
liquid
liquid formulation
enzymes according
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE1988/000061
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Christner
Ernst Pfleiderer
Tilman Taeger
Ursula Bernschein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roehm GmbH Darmstadt
Original Assignee
Roehm GmbH Darmstadt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roehm GmbH Darmstadt filed Critical Roehm GmbH Darmstadt
Priority to BR8805403A priority Critical patent/BR8805403A/pt
Publication of WO1988006183A1 publication Critical patent/WO1988006183A1/de
Priority to FI884592A priority patent/FI93656C/fi
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C14—SKINS; HIDES; PELTS; LEATHER
    • C14C—CHEMICAL TREATMENT OF HIDES, SKINS OR LEATHER, e.g. TANNING, IMPREGNATING, FINISHING; APPARATUS THEREFOR; COMPOSITIONS FOR TANNING
    • C14C1/00—Chemical treatment prior to tanning
    • C14C1/06—Facilitating unhairing, e.g. by painting, by liming
    • C14C1/065—Enzymatic unhairing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38663—Stabilised liquid enzyme compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Definitions

  • the invention relates to liquid formulations of enzymes using anhydrous organic solvents, preferably together with special additives which influence the rheology and which are particularly suitable for use in the leather industry.
  • Important representatives of the enzymes used industrially include ⁇ -aminobutyro-transaminase, amylase, cellulase, collagenase, glucose oxidase, glutamic acid decarboxylase, hemicellulase, invertase, catalase, lipase, pectinase, penicillase, protease, streptokinase.
  • the aqueous medium may be the standard medium for enzymatic reactions.
  • liquid enzyme preparations are faced with a whole range of problems.
  • the first priority is the stability of such enzyme preparations.
  • enzymes in aqueous medium are influenced by the other constituents of the medium, such as acids, bases, salts, surface-active and complex-active constituents, other macromolecules, in particular other enzymes, the substrates of the enzyme action, etc.
  • These additives can have both a stabilizing and a destabilizing effect.
  • stabilizing additives for certain enzymes in aqueous solutions are, for example, glycols, polyglycols, surfactants, proteins and protein hydrolyzates, synthetic polymers, carboxylic acids, specific cations, or anions and others. been proposed. [See. U.S. Patent No. 4,519,934;
  • liquid dosing has gained a lot more ground compared to solids dosing, since it actually has advantages in handling, among other things.
  • the problem with the production of liquid preparations containing enzymes lies in the inadequate stability of such products.
  • the instability, especially of pancreatic preparations is by no means unexpected; some of them are already known from enzyme processing.
  • proteases are concerned, the self-digesting effect and the degrading effect on other enzyme proteins present must also be expected. (See K. Martinek, VP Torchilin, Enzyme Microb. Technol. Vol. 1, pp. 74-82 (1979). It remains to be stated that liquid enzyme preparations have so far not been successful in practice.
  • the invention relates to liquid formulations of enzymes for industrial use, at least one essentially water-free organic solvent (LM) or mixtures thereof being used as the carrier liquid for the enzymes.
  • Suitable solvents are solvents which are in accordance with the above-mentioned, advantageously conventional per se, preferably environmentally harmless, in particular less toxic, non-enzyme-damaging solvents.
  • the organic solvents LM to be used according to the invention preferably contain no further heteroatoms in addition to carbon, hydrogen and optionally oxygen and less preferably sulfur.
  • Solvents of structure I are preferred Ri - X - R 2
  • solvents of structure II can be used as solvents LM - R5 II
  • Particular representatives of the formula I are carbonic acid esters, in particular cyclic carbonic acid esters, especially propylene carbonate.
  • polyhydric alcohols such as glycerol, ethylene glycol, butyl glycol, butyl diglycol, diethylene glycol, polyethylene glycols as far as they are liquid, monohydric alkanols such as methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, 2-ethylhexanol, cyclohexanol, ethers such as diethyl ether, in particular cyclic ethers such as dioxane, tetrahydrofuran, ketones such as acetone, ethyl ethyl ketone, esters such as ethyl acetate, butyl acetate, lactones such as ⁇ * - butyrol
  • Toluene and styrene may be mentioned as representatives of the formula II, furthermore turpentine, solvent naphtha, mineral spirits, aliphatic hydrocarbons and mineral oils (boiling ranges preferably between 50 and 180 degrees C, especially between 70 and 150 degrees C) can be used.
  • the solvents LM are usually those with a molecular weight ⁇ 110 and predominantly with boiling points below 300 degrees C at normal pressure. (Further data on the solvents can be found, for example, in the monograph Gramm, Fuchs, solvents and plasticizers, 8th edition, Horsch. Verlagsgesellschaft, Stuttgart 1980).
  • the organic solvents LM to be used according to the invention are essentially water-free, ie they generally contain less than 1% by weight of water, preferably not more than the usual adhesive moisture.
  • the solvents LM are dried in a conventional manner, for example by using customary drying agents, distillation, azeotroping, etc. (see Houben Weyl. Edition, Vol. 1/2, pg 765-886, Georg Thieme-Verlag 1959).
  • the presence of water in the formulations according to the invention is generally not intended, at least not in quantities which impair the purpose of the invention.
  • the enzyme formulations can additionally contain surfactants.
  • nonionic surfactants of the fatty alcohol / alkylphenol ethoxylate type for example with oleocetyl and oleic alcohol
  • nonionic surfactants of the fatty alcohol / alkylphenol ethoxylate type for example with oleocetyl and oleic alcohol
  • polyglycols with 4-42 moles of ethylene oxide in addition to anionic types such as alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkyl phosphates, alkyl ether phosphates, alkyl sulfonates and alkyl aryl sulfonates.
  • the proportion of the surfactants is generally 0.001 to 50% by weight, preferably 0.005 to 20% by weight, based on the carrier liquid.
  • the HLB value of the emulsifiers is 8-18, preferably 9-15.
  • the solvents LM which mix with water, in particular the solvents which are miscible with water in any ratio. In a first approximation it can be assumed that the enzymes remain completely undissolved in the solvents LM. Therefore, the tendency towards self-digestion or the breakdown of other enzymes largely disappears.
  • the amount of solvent LM used is measured primarily from the convenience in handling the enzymes; it is not actually critical. In general, for reasons of manageability, the weight ratio of enzyme to solvent LM will not be less than 1:10. In the interest of reasonable concentration ratios, the upper limit of the enzyme to LM weight ratio will generally be 1: 30 to 1: 500. As a rule of thumb, an enzyme to LM ratio of 1 to about 50 has proven to be useful. Mixtures of the solvents LM mentioned above may also be suitable. When the enzymes consisting essentially of protein are added to the essentially water-free solvents LM, problems can arise, such as hesitant wetting and / or distribution problems, such as signs of wetting or creaming.
  • inorganic powdery additives AZ are dispersed into the solvents LM.
  • Powdery additives from inorganic dispersants have been described for completely different purposes, for example as dispersants of "oil in water” dispersions, or as dispersants in free-radical bead polymerization (see Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Volume XIV / 1 Macromolecular Substances, pp. 420 - 421, Georg-Thieme-Verlag 1961).
  • inorganic dispersants for example, insoluble salts of alkaline earth metals (carbonates, phosphates, sulfates, silicates), aluminum hydroxide, talc and bentonite are recommended. Clays, in particular bentonite, are recommended for solving the present task. Kaolin and bentonite are known to form thixotropic gels with a number of polar and non-polar organic liquids. The thixotropy of the gels disappears, for example, by adding small amounts of longer-chain alcohols (see Ulimanns Enzyclopadie der techn. Chemie, 4th edition, vol. 23, pp. 318 - 326, Verlag Chemie 19; U. Hoffmann et al. Kolloid Z. 151 , 97-115 (1957)). 10
  • Toning means the usual aluminum silicates
  • bentonite means the commercially available preparations consisting mainly of mont orillonite (Al2 ⁇ 3.4.Si ⁇ 2-H2 ⁇ ).
  • organically activated bentonites e.g. those resulting from the reaction of Na mont orillonite with quaternary alkyl monium compounds.
  • organophilic bentonites form through cation exchange and swell in organic liquids (see Ulimann loc.cit. P. 323).
  • the delivery forms of the trade platelets, particle sizes in the range 0.5-5 .mu.m
  • a treatment under shear stress should take place in the chosen solvent LM.
  • the content of inorganic additives AZ in the solvents LM is 0.1 to 3% by weight, based on the solvent, preferably 0.3 to 1% by weight. It has proven to be particularly advantageous to subject the inorganic addition of the enzyme concentrate together with the solvent LM to the shear action by means of a suitable aggregate, in particular a dispersant. Commercially available devices can be used as dispersants (cf. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 4th edition, vol. 1, p. 239, Verlag Chemie 1972).
  • the speeds and the processing times to be used depend primarily on the type of unit. 2 to 60 minutes at a circumferential speed of 4-36 m / sec may be mentioned as a guide for the action of commercially available dispersing aggregates on bentonite in one of the solvents LM to be used according to the invention.
  • the propylene carbonate solvent has proven particularly suitable, particularly in combination with bentonite. 11
  • the formulations according to the invention are not subject to any restrictions which have become apparent with regard to the enzyme component (unless with regard to the stability of the enzymes themselves against organic solvents such as alcohols). It is assumed that the solvent component LM is compatible with the final use of the enzymes. In order to increase the anti-settling or anti-creaming effect, little polar solvents can be added to the carrier liquids, especially if the solvents are polar, for example of the type of the formula I. Thus, it can be advantageous for the carrier liquid to contain 1-10% by weight of hydrocarbons, in particular branched or straight-chain aliphatics with 5 to 20 carbon atoms. For example, Petroleum fractions approximately in the boiling range 50-180 degrees C (cf. also the above definition of LM). The enzymes that are already used industrially or in other fields of application should be emphasized (cf. state of the art, above).
  • Pancreatin especially trypsin, chymotrypsin (pH range approx. 7 - 10)
  • Pepsin (EC 3.4.23.1) (pH range approx. 1.5 - 4.0) Cathepsin (EC3.4.23.5) (pH range approx. 4.0 - 5.0) b) of vegetable origin c papain (EC 3.4.22.1) pH effective range approx. 5.0 - 8.0 ß) ficin (EC 3.4.22.3) pH effective range approx. 4.0 - 9.0) Bro elain (EC 3.4.22.4 and 3.4.22.5) pH range of action approx. 5.0 - 7.0
  • Alkaline proteases with an optimum activity in the range from pH 7.5 to 13, in particular alkaline bacterial proteases (EC3.4.21.) (which mostly belong to the serine type) and alkaline fungal proteases
  • Neutral proteases with an optimum activity in the range from pH 6.0 - 9.0, in particular neutral bacterial protease (EC3.4.24.) (which belong to the metalloenzymes) and fungal proteases, for example Bacillus proteases, Pseudomonas proteases, Streptomyces proteases, Aspergillus proteases.
  • Acidic proteases with optimal activity in the range of pH 2.0-5.0 (E.C.
  • Proteases are used, among other things, in leather production, in detergents and in cleaning, in desizing, in cheese production, in meat degradation and in the stabilization of beer. 14
  • subtilisins alkaline bacterial proteinases of the serine type, which are stable in the pH range 9-10 and are somewhat insensitive to perborate, may be mentioned as alkaline proteases.
  • the proteolytic activity of enzymes is customarily determined according to the Anson-Hemoglobin method (ML Anson J. Gen. Physiol.
  • Löhlein-Volhard unit is the amount of enzyme that digests 1.725 mg casein under the specific conditions of the method
  • units which are derived from the Anson method are used for determining the activity of the enzymes which are active in the acidic region and are referred to as "proteinase units (hemoglobin)" U.
  • Bacillus species such as B. subtilis, B. esentericus, B. polymixa, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, and also from fungi, in particular from Aspergillus species such as A. niger, A. phoenicis, A. oryzae, is particularly favorable , A. awamori, Mucor species such as M. rouxianus, Rhizopus species such as R. delemar, R. oryzae, R. Japonicus, and Endomyces species such as E. fibuliger.
  • the pH optimum of the oi-amylases is predominantly in the range from 4.7 to 7.2.
  • Amylases are used, inter alia, in the food sector [cf. H.-J. Rehm & G. Reed Ed. "Biotechnology” Vol. 5, Verlag Chemie 1983; B. Spencer, Ed. Industrial aspects of biochemistry; Vol. 3_, part I, pp. 139 - 186, 213 - 260, Elseviers (1973)] in starch liquefaction, malt extraction, in ethanol extraction, desizing, in leather production, etc.
  • the activity of ⁇ -amylases using starch as substrate can be determined by the Sandstedt method, Kneen & Blish (Cereal Chem. _16_, 172 (1939) and Technical Bulletin No. 1024, US Dept. of Agriculture).
  • Willettir's method is also used to determine the activity of pancreatic amylase (Hoppe-Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 (1923).
  • a Will Wur amylase unit is defined as one hundred times the amount of enzyme described under given the experimental conditions, the starch cleaves at such a rate that the monomolecular reaction constant is 0.01.
  • lipoxies are carboxylesterases that cleave glycerol esters in an aqueous emulsion. They differ from other carboxylesterases in that they cleave the substrate in aqueous solution.
  • pancreatic enzyme complex In addition to lipases, the pancreatic enzyme complex mostly contains esterases as well as proteases and amylases as technically important accompanying enzymes.
  • the pH optimum (compared to olive oil) is in the range 7 - 8.5 and the activity range is pH 6.5 - 9.5.
  • Lipases are generally very unstable, especially with regard to proteolytic degradation by accompanying proteases. 17
  • microbiological lipases e.g. from Pseudo onas fragi, Aspergillus sp. (e.g. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp. (e.g. chrysogenum, P. oxalicum, Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae)
  • lipases generally have at least one pH optimum at pH> 7.0. As far as their instability permits, lipases are used, among other things. in waste disposal, leather industry and in the food industry.
  • ot from animal tissue e.g. from liver ( ⁇ ) from plants e.g. from horseradish monkey) from microorganisms e.g. from Micrococcus lysodeicticus
  • Catalases are used for peroxide bleaching and in the milk industry.
  • cellulase is an enzyme complex, the components of which are gradually involved in the breakdown of native cellulose. 18th
  • Cellulases are found in insects, mollusks and microorganisms (bacteria / molds). Commercial sources of cellulases are in particular Aspergillus, Neurospora, Rhizopus, Trichoderma and Trametes species. The optimum effect of technical preparations is between pH 4-6. State-of-the-art cellulase preparations lose approximately 10-20% of their activity per year when stored in cool and dry conditions.
  • Cellulases are used industrially in the food industry to convert cellulose-containing waste materials, etc.
  • enzymes especially proteolytic enzymes
  • Enzymes has been enzymatic since the introduction
  • Enzyme preparations also serve to dissolve machine glue leather and the like.
  • other by-products of leather production US Pat. No. 4,210,721, CH Pat. No. 631,486, US Pat. No. 4,293,647, US Pat. No. 4,220,723
  • keratin-containing raw materials US Pat. No. 4,232,123
  • elastin-containing preparations US -PS 4 179 333
  • enzyme-liquid formulations according to the present claims can be used in the individual steps of leather production (cf. Ullmanns Encyclopadie der Techn. Chemie, 3rd edition, vol. 11, p. 609, Urban / Schwarzenberg, Ullmanns Encyclopedia of Techn. Chemistry, 4th edition, vol. _16_, pp. 111 - 174, Verlag Chemie, 1978, F. Stather, Gerdasse Chemistry and Gerber Technology, 4th edition, Akademie-Verlag Berlin 1967)
  • the softness of skin material in which the hardening of the skins that occurs when salt preservation is reversed, is usually carried out at pH 7.0 to 10.0.
  • the use of enzymes, in particular proteolytic enzymes [see A)] accelerates the softening effect by "digesting" the water-soluble and other protein bodies that do not belong to the collagenous fiber structure of the skin.
  • enzymes with the range of action or pH optimum of the proteolytic effect
  • pH 7.0-10.0 are used in the switch. Removing the non-collagen proteins ensures faster and more intensive wetting of the skin.
  • the soft water is advantageously made slightly alkaline, but the pH must always remain ⁇ 12.
  • softening agents for example monoethanolamine with an antiseptic such as zephyrene or naphthalenesulfonic acid in combination with substituted phenols; highly sulfated butyl ricinoleate with methylhexalin; fatty alcohol sulfates with solvent
  • concentration ranges 10-1000 g / l
  • Suitable enzymatic additives in the enzyme-liquid formulations according to the invention are, for example, the proteases mentioned above under A), in particular the proteases mentioned under A) c): specifically microbial proteases in the range of activity 4-9.5, in particular fungal proteinases, eg from Aspergillus species such as A. saitoi and A. usamii, especially acidic proteinases with a pH range of 2.5 to 21
  • the concentration of proteolytic activities of the proteinases used is in the range 0.1-1.0, Anson units or 1000 to 3000 Löhlein-Volhard units per 1 soft broth.
  • the soft liquors can also contain amylases according to B).
  • the amylases occur e.g. as accompanying enzymes of fungal proteinases. They promote the cleavage of glycosidic bonds in the proteoglycans and glycoproteins of the skin.
  • Amylases of microbial origin are particularly suitable, especially those from Aspergillus species such as A. oryzae and A. niger, especially those with a pH range from 3.0 to 5.8, and also those of bacterial origin such as e.g. from Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. polymixa with an effective range of 5.0-7.0.
  • the glycolytic activities of the amylases are in the range of 500-2000 SKB.
  • the temperature of the soft broths is advantageously> 20 degrees C.
  • the soft duration should be as short as possible, it is generally between 4 and 36 hours.
  • anti-swelling liming aids e.g. wetting agents, especially cationic wetting agents in combination with monoethanolamine and disinfectants such as quaternary alkyl-dimethyl-benzylammonium compounds, or dialkylamine and its sulfate.
  • enzymes can be used for loosening the hair and opening the skin, which remain sufficiently stable in this pH range. The switch and liming can be combined by gradually increasing the pH and using the appropriate enzymes.
  • the enzymes are generally used in connection with the liming / hair loosening / dehairing action in the pH range from 9 to 13, especially 9 to 12.
  • the skin freed from the preserving salt can first be pretreated with disulfide-bridging substances in the acidic pH range and then effective without prior softening using alkaline range Proteases with a pH of approx. 11 - 13 hair loosening and skin disruption can be brought about at the same time.
  • Proteases with a pH of approx. 11 - 13 hair loosening and skin disruption can be brought about at the same time.
  • steps III) and IV which are usual in the water workshop.
  • alkaline proteases of type i) are used in the operations of the water workshop under II), in particular alkaline bacterial proteinases (serine proteases), for example from B. subtilis, B. licheniformis, B. irmus, B alcalophilus, B. polymixa, B. mesenthericus.
  • proteases generally have an activity of between 8,000 and 10,000 Löhlein-Volhard units (LVE) 23
  • the enzymatic reaction during hair extraction / skin disruption is carried out at approx. 18 - 28 degrees C, the reaction times generally. between 12 and 24 hours, especially between 12 and 16 hours.
  • Dehairing or decoating can also be carried out with alkaline fungal proteinases of type i), for example with Aspergillus proteases, in particular from A. niger and A. flavus, with a range of action at pH 9.5 to 11.0.
  • alkaline fungal proteinases of type i for example with Aspergillus proteases, in particular from A. niger and A. flavus, with a range of action at pH 9.5 to 11.0.
  • the enzymatic depilation process according to DE-A 34 29 047 can be used, according to which hides and skins were treated in a liquor in the pH range from 9 to 11 with such proteolytic enzymes whose effectiveness optimum was in a pH range from 2 to 7 , 5 lies and the hair removal is carried out.
  • Proteases of type iii) (see above) from A. oryzae, A. saitoi, A. parasiticus, A. usamii, A. awamori, from Paelomyces sp. from Penicillium sp. also Rhizopus sp. and / or from Mucor pusillus, as well as the acidic proteases under A) a) and A) b) (see above).
  • the activity is generally in the range of 50 to 200 mUjjb « 24
  • Enzymes are preferred for descaling and pickling.
  • Decalcification serves to reduce the alkalinity of the nakedness from pH values from 13 to 14 to pH values in the range 7 to 8.
  • For decalcification preferably not strongly dissociated, but rather weak organic acids, e.g. of the type of dicarboxylic acids or weakly acidic salts can be used. With the stain, epidermis, hair and pigment residues are to be removed and an additional skin disruption is to be brought about. In addition, non-collagenous protein components are removed (see Ulimann, 4th edition, vol. 16 loc.cit p. 119-120).
  • the pickling process is carried out conventionally at pH 7.5 to 8.5.
  • DE-A 31 08 428 discloses the use of cyclic carbonates in decalcification.
  • lipases according to C. for example pancreatic lipases with a range of action at pH 7.0-9.0, can also be used in the pickling.
  • Amylases according to B. for example pancreatic amylases, with a range of action at pH 5.5-8.5, which promote the cleavage of glycosidic bonds in the stain, (especially as accompanying enzymes of trypsin and chymotrypsin) have a favorable influence on the Stain.
  • the pimple which is an acid / salt solution in water, for example sulfuric acid or formic acid together with table salt.
  • the liquid formulations according to the present invention offer a generalizable and relatively problem-free solution to the frequently existing, if not always stated, task, namely to be able to use liquid enzyme formulations.
  • Another advantage is the possibility of combining enzymes with other components that impair the enzyme action in an aqueous environment and with a longer exposure time. This is especially true for the combination of different enzymes, e.g. of proteases with amylases, lipases, etc., but also with hydrotropics such as Urea, guanidini salts, cumene sulfonate etc.
  • non-ionic wetting agent based on fatty alcohol ethoxylate with 6 mol ethylene oxide
  • 0.2% of a bactericide based on chloroacetamide 0.4% non-ionic wetting agent based on fatty alcohol ethoxylate with 6 mol ethylene oxide
  • the skins After 5 hours of soaking, the skins have completely receded and at the same time are ready for loosening. A large part of the natural skin fat is emulsified in the soft liquor.
  • the skins softened in the above manner are cremated using known methods and further processed to crust leather for shoes. 29
  • 1,000 g of petroleum Kp 110-130 degrees C are heated to 40 degrees C and dispersed for 10 minutes after adding an organically modified bentonite (for example MPA-X-2,000, from Kronos-Titan, Leverkusen), then 2.5 g an acidic fungal protease (pH optimum 3.5 - 5) from Aspergillus parasiti ⁇ us (80,000 LVE / g) was added and dispersed for a further 5 minutes.
  • an organically modified bentonite for example MPA-X-2,000, from Kronos-Titan, Leverkusen
  • a liquid enzyme formulation with an activity of 200 LVE is obtained, which shows no decrease in activity after 4 weeks at 20 degrees C.
  • the solution is homogeneous and neither creams nor deposits.
  • the nakedness is well degreased and loosened up by the action of the enzyme / surfactant / petroleum combination.
  • pickling tanning agents For pickling, commercially available pickling tanning agents can be added in an extended or new fleet and can be worked on in a known manner.
  • 927.5 g of a nonionic water-free wetting agent based on nonylphenol + 8.5 moles of ethylene oxide are mixed with 12 g of Aerosil 38 ⁇ S / (from Degussa, Hanau, W-Germany, highly disperse amorphous silicon dioxide) in a stirred kettle, and 5 g of Borchigen STIiS ( Wetting and disintegrating agent, based on modified fatty acid, Borchers, Goslar, W-Germany) for 15 minutes at 15 - 18 m / sec with a
  • Toothed disk stirrer dispersed.
  • the viscosity increases from 15 Pas to 255 Pas. (Determination with the Brookfield viscometer, condition 1/6 rpm).
  • 55.5 g of o-amylase concentrate (90,000 SKB / g (SKB analysis see Sandstedt, RME, E. Kneen and MJ Blish, Cereal Che. 16, 712 (1939) obtained from Bacillus subtilis) are then added disperses another 15 minutes, the liquid finished formulation with a
  • the desized fabric has a nice soft feel.
  • Aerosil 380 / highly disperse silicon dioxide, Degussa, W-
  • a liquid enzyme product with 80 LCA / mg activity is obtained, which after 6 weeks of storage at 25 ° C. has neither settled nor creamed. The activity after this storage period is still 77-78 LCA / mg.
  • a liquid, easily pourable, homogeneous pectinase product with 5,000 PGU / mg activity is obtained, which after 6 weeks of storage at 25 ° C. has neither creamed nor settled.
  • nonionic surfactant based on C 1 -C oxo alcohol + 6 mol ethylene oxide and 682 g nonionic surfactant based on C 3 oxo alcohol + 9 mol ethylene oxide with 13 g Aerosil 380% (highly disperse silicon dioxide, Degussa, W -Germany) and 5 g Borchigen STL R (wetting and disintegrating agent based on a modified fatty acid, Borchers, Goslar, W-Germany) dispersed for 15 minutes with a toothed disk stirrer at a speed of rotation of 15-18 m / sec.
  • Aerosil 380% highly disperse silicon dioxide, Degussa, W -Germany
  • Borchigen STL R wetting and disintegrating agent based on a modified fatty acid, Borchers, Goslar, W-Germany
  • a liquid, homogeneous, easily pourable and pumpable enzyme product is obtained, which after 4 weeks of storage has neither settled nor creamed.
  • the activity after this time is still 97% of the initial activity of 4,400 LVE / g at a storage temperature of 25 degrees C.
  • ethylene carbonate 400 g are introduced into a stirred kettle and mixed with 300 g of methyl ethyl ketone and 264 g of nonionic surfactant (cig-cis fatty alcohol with 9 mol of ethylene oxide), heated to 40 ° C. and with 10 g of Aerosil 380%) (highly disperse silicon dioxide, Degussa, W-Ger any) and 6 g Borchigen STL) (Borchers, Goslar, W-Ger any, see example Q). The mixture is dispersed for 15 minutes at a speed of 15-18 m / sec with a toothed disk stirrer.
  • nonionic surfactant cig-cis fatty alcohol with 9 mol of ethylene oxide
  • pancreatic enzyme concentrate (activity 40 000 LVE / g) 39
  • the final pH of the liquor is pH 7.8.
  • the natural fat is well removed from the skin and emulsified in the liquor.
  • Peroxidase 1000 units / g, definition and determination: Taele, FW., Biochem. Biophys. Acta, 35, 543 (1959) added and further dispersed for 10 minutes.
  • a product formulation with good fluid flow (280 mPas) is obtained, which according to 4 Weeks of storage neither discontinue nor cream, after which time activity has decreased by 2%.

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Description

- 1
Flüssig-Formulierungen von Enzymen
BESCHREIBUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Flüssig-Formulierungen von Enzymen unter Verwendung wasserfreier organischer Lösungsmittel, vorzugsweise zusammen mit speziellen, die Rheologie beeinflussenden Additiven, die sich besonders zur Anwendung in der Lederindustrie eignen.
Stand der Technik
Die industrielle Anwendung von Enzymen kann gegenwärtig hohes Interesse beanspruchen, gilt sie doch als der Proto¬ typ einer "sanften" Technologie.
Die Art und die Anzahl der industriellen Verfahren, in denen Enzyme eingesetzt werden, ist noch begrenzt. Eine Erweiterung ist jedoch zu erwarten (Vgl. Ullmann's Encyclopädie der technischen Chemie, Band l_p_, S. 522 - 526 ff, Verlag Chemie 1975; Kirk-Oth er, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd Ed. Vol. 9_, pp. 173 - 224, J. ' iley 1980) .
Zu nennen sind insbesondere die Gebiete der Nahrungs- und Futtermitteltechnologie, der Waschmitteltechnologie und der Lederherstellung, auf denen die Enzymanwendung bereits eine längere Tradition hat. Darüber hinaus finden Enzyme auch für gezielte chemische Umsetzungen Anwendung (vgl. Raul Präwe, Jahrbuch Biotechnologie, 1986/87, Carl Häuser Verlag München, Wiem, S. 359 - 397) Wichtige Vertreter der industriell verwendeten Enzyme (Industrial Enzymes = IE) sind u.a. ^-Aminobutyro- transaminase, Amylase, Cellulase, Collagenase, Glucose- Oxidase, Glutaminsäure-Decarboxylase, Hemicellulase, Invertase, Katalase, Lipase, Pectinase, Penicillase, Protease, Streptokinase.
Da es sich bei den Medien, in denen die in der Natur vorge¬ fundenen Enzymen wirksam sind, ganz überwiegend um wassrige Medien handelt, wobei oft auch noch eine gewisse Abhängig¬ keit vom pH-Wert und den gelösten Bestandteilen des wässrigen Mediums registriert wird, darf das wassrige Milieu als Standardmedium bei enzymatischen Reaktionen gelten.
Da Enzyme als Polypeptide, deren Wirksamkeit in erster Näherung von ihrer strukturellen Organisation abhängt, wie andere Proteine auch durch gewisse organische Lösungsmittel denaturiert werden können, empfahl sich von jeher Zurück¬ haltung bei der Anwendung organischer Lösungsmittel zusammen mit Enzymen.
In neuerer Zeit hat man z.B. bei Untersuchungen an immobilisierten Enzymen den Einfluß von Zusätzen wasser¬ löslicher organischer Solventien zum wässrigen Medium bestimmt und festgestellt, daß mit abnehmender Dielektrizitätskonstante die Reaktionsgeschwindigkeit steigt. [Vgl. H. Weetall, P. Vann in "Enzyme Engineering Vol. 4. (Ed. G.B.Brown, et al) "NCI Monograph No. 27 (Ed. M.P. Stulberg) 1967, pp 141 - 152]. Aufgabe und Lösung
Bei der Handhabung, insbesondere der Dosierung von chemischen Agentien wird oft als vorteilhaft empfunden, wenn diese in flüssiger Form vorliegen. In der Regel ist das Einmischen von flüssigen Zubereitungen in flüssige Reaktionsmedien mit weniger Problemen behaftet als das Eintragen von Pulvern oder anderen Festkörpern. Dies gilt auch für Enzympräparationen.
Entsprechende Tendenzen lassen sich z.B. in der Waschmittelindustrie verfolgen. Auf der anderen Seite sieht man sich gerade bei flüssigen Enzympräparaten einer ganzen Reihe von Problemen gegenüber. An erster Stelle steht die Stabilität solcher Enzympräparate. Wie bereits angedeutet, unterliegen Enzyme in wässrige Medium der Beeinflussung durch die übrigen vorhandenen Bestandteile des Mediums wie Säuren, Basen, Salze, oberflächenaktive und komplexaktive Bestandteile, andere Makromoleküle, insbesondere andere Enzyme, die Substrate der Enzymwirkung u.a. Diese Zusätze können sowohl stabilisierend als destabili- sierend wirken. Als stabilisierende Zusätze für bestimmte Enzyme in wässrigen Lösungen sind beispielsweise Glykole, Polyglykole, Tenside, Proteine und Proteinhydrolysate, synthetische Polymere, Carbonsäuren, spezifische Kationen, bzw. Anionen u.a. vorgeschlagen worden. [Vgl. US-Patent Nr. 4 519 934;
L. Kravetz, K.F. Guin, Journal of the Am. Oil, Chem. Soc. Vol. 62, 5 (1985) ; L. Gianfreda, M. Modafferri und G. Greco, Enzyme Microb.
Technol. 1_, 78 - 82 (1985);
K. Martinek, V. P. Torchilin, Enzyme Microb. Technol.
Vol.l, 74 - 82 (1979) ;
US-A 4 111 855 (1978) ;
ÜS-A 4 318 818 (1982) ;
US-A 3 557 002 (1971) ;
US-A 4 169 817 (1979)]
Als eine weitere Möglichkeit, Enzyme in wassriger Lösung zu stabilisieren, wurde die Bildung inverser Micellen im System Wasser/Tensid/organisches Lösungsmittel in Betracht gezogen (vgl. P.L. Luisi, Angew. Chem. Sl_, 449 - 460 (1985)).
Die vorliegende Aufgabe sei am Beispiel der in der Leder¬ herstellung angewendeten Enzyme bzw. Enzymsysteme näher erläuter .
Gerade bei der Lederherstellung hat die Flüssigdosierung gegenüber der Feststof dosierung in jüngerer Zeit stark an Boden gewonnen, da sie in der Tat Vorteile u.a. bei der Handhabung aufweist. Das Problem bei der Herstellung flüssiger, Enzyme enthaltender Präparationen, beispiels¬ weise enzymatischer Beiz- und Weichhilfsmittel liegt jedoch in der ungenügenden Stabilität solcher Produkte. Die Instabilität, insbesondere von Pankreaspraparationen, kommt keinesfalls unerwartet; man kennt sie zum Teil bereits von der Enzymaufarbeitung her. Soweit es sich um Proteasen handelt, muß speziell auch mit der s&lbstverdauenden Wirkung und mit der Abbauwirkung auf sonstige anwesende Enzymproteine gerechnet werden. (Vgl. K. Martinek, V.P. Torchilin, Enzyme Microb. Technol. Vol. 1, S. 74 - 82 (1979) . Es bleibt zu konstatieren, daß sich Flüssig-Enzympräparate in der Praxis bislang nicht durchsetzen konnten. Es bestand also nach wie vor die Aufgabe, flüssige Formulierungen für Enzyme zur Verfügung zu stellen, die a) unter Praxisbe¬ dingungen hinreichend stabil sein sollten, b) bei denen die Aktivität der Enzyme möglichst nicht, bzw. nicht irrever¬ sibel beeinflußt sein sollte, c) die mit den vorgesehenen Einsatzgebieten der Enzyme kompatibel sein sollten und die d) oekono isch und oekologisch tragbar sein sollten. Die Anforderungen an ein solches sogenanntes "Flüssigenzym" für die modernen Methoden der Lederherstellung gehen dahin, daß der Aktivitätsabfall innerhalb 4 bis 6 Monaten nicht größer als 15 % sein darf.
Lösung
Es wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäßen flüssigen Enzymformulierungen die Anforderungen der Technik über¬ raschenderweise in hohem Maße erfüllen. Die Erfindung betrifft Flüssig-Formulierungen von Enzymen zur technischen Anwendung, wobei als Trägerflüssigkeit für die Enzyme mindestens ein im wesentlichen wasserfreies organisches Lösungsmittel (LM) oder Gemische von solchen eingesetzt werden. Als Lösungsmittel kommen im Einklang mit den oben dargestellten Aufgaben stehende, vorteilhaft an sich übliche, vorzugsweise umweltunbedenkliche, insbesondere wenig toxische, nicht-enzymschädigende Lösungsmittel in Frage. Die erfindungsgemäß zu verwendenden organischen Lösungsmittel LM enthalten vorzugsweise neben Kohlenstoff, Wasserstoff und gegebenenfalls Sauerstoff und weniger bevorzugt Schwefel keine weiteren Heteroatome. Bevorzugt sind Lösungsmittel der Struktur I Ri - X - R2
worin X für Sauerstoff oder Schwefel und worin Ri für einen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoff¬ atomen, oder für einen Rest - CH - OH, wobei R3
*3
Wasserstoff -CH3 oder -CH2OH bedeutet oder für einen Rest -(CH2 - CH2θ)n - H, wobei n eine Zahl von 1 bis 15 bedeutet und R2 für Wasserstoff- oder einen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht oder, worin Rj und R2 für einen Rest -CH2-CH2OH stehen oder worin Rτ_ und R2 zusammen mit dem Sauerstoff einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring bilden, wobei alle Ring¬ glieder" aus -CH2~Gruppen bestehen oder ein Ring¬ glied eine Carbonylgruppe darstellen, und wobei gegebenenfalls ein weiteres Ringglied aus Sauer¬ stoff bestehen kann, oder worin X für eine Carbonylgruppe -C=0 steht, mit der Ma߬ gabe, daß in diesem Falle Ri und R einen Alkyl¬ rest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder worin X für eine COO-Gruppe steht, mit der Maßgabe, daß in diesem Fall Rτ_ und R2 für einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen stehen oder Ri für Wasser¬ stoff und 2 für einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht.
Weiter sind als Lösungsmittel LM solche der Struktur II brauchbar - R5 II
worin R'5 für einen Rest-CH3 oder -CH = CH2 steht. Besonders genannt seien als Vertreter der Formel I Kohlen¬ säureester, insbesondere cyclische Kohlensäureester, speziell Propylencarbonat. Weiter sind von Interesse mehrwertige Alkohole wie Glycerin, Ethylenglykol, Butyl- glykol, Butyldiglykol, Diethylenglykol, Polyethylenglykole soweit sie flüssig sind, einwertige Alkanole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, 2- Ethylhexanol, Cyclohexanol, Äther wie Diethylether, insbesondere cyclische Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Ketone wie Aceton, Ethyl ethylketon, Ester wie Ethylacetat, Butylacetat, Lactone wie^*-Butyrolacton. Als Vertreter der Formel II seien Toluol und Styrol genannt, ferner sind Terpentin, Solventnaphtha, Lackbenzine, aliphatische Kohlenwasserstoffe und Mineralöle (Siedebereiche vorzugs¬ weise zwischen 50 und 180 Grad C, speziell zwischen 70 und 150 Grad C) brauchbar. Mit Ausnahme der Polyethylenglykole handelt es sich bei den Lösungsmitteln LM in der Regel um solche mit einem Molekulargewicht < 110 und überwiegend mit Siedepunkten unter 300 Grad C bei Normaldruck. (Weitere Daten zu den Lösungsmitteln können z.B. der Monographie Gramm, Fuchs, Lösungsmittel und Weichmachungsmittel., 8. Auflage, Wissensch. Verlagsgesellschaft, Stuttgart 1980 entnommen werden) . Die erfindungsgemäß zu verwendenden organischen Lösungsmittel LM sind im wesentlichen wasserfrei, d.h. sie enthalten in der Regel weniger als 1 Gew.-% Wasser, vorzugsweise nicht mehr als die übliche Haftfeuchtigkeit. Die Trocknung der Lösungsmittel LM wird in an sich üblicher Weise vorgenommen, z.B. durch Anwendung gebräuchlicher Trockenmittel, Destillation, Azeotropierung usw. (vgl. Houben Weyl. Auflage, Bd. 1/2, pg 765 - 886, Georg Thieme-Verlag 1959) . Das Vorhandensein von Wasser in den erfindungsgemäßen Formulierungen ist im allgemeinen nicht vorgesehen, zumindest nicht in den Erfindungszweck beeinträchtigenden Mengen. Bei der Verwendung von Lösungsmitteln, welche sich nicht mit Wasser mischen, können die Enzymformulierungen zusätzlich Tenside enthalten. Bevorzugt sind hier nicht¬ ionische Tenside von Typ Fettalkohol-/Alkylphenol- ethoxylate (z.B. mit Oleocetyl- und Oleinalkohol) ferner Addukte von Polyglykolen mit 4 - 42 Mol Ethylenoxid neben anionischen Typen wie Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylsulfonate und Alkylarylsulfonaten. (Vgl. DE-A 33 22 840) . Der Anteil an den Tensiden beträgt im allgemeinen 0,001 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 0,005 bis 20 Gew.-% bezogen auf die Träger¬ flüssigkeit. Im allgemeinen liegt der HLB-Wert der Emul- gatoren (bez. ö/W-Emulgierwirkung) bei 8 - 18, vorzugsweise 9 - 15. (Zu Emulgatoren und HLB-Wert. Vgl. Kirk-Othmer 3.rd. Ed. Vol.8., 910 - 916). Bevorzugt sind ferner die Lösungsmittel LM, die sich mit Wasser mischen, insbesondere die mit Wasser in jedem Verhältnis mischbaren Lösungs¬ mittel. In erster Näherung ist davon auszugehen, daß die Enzyme in den Lösungsmitteln LM völlig ungelöst bleiben. Daher tritt die Tendenz zur Selbstverdauung bzw. zum Abbau anderer Enzyme weitestgehend zurück.
Die Menge der eingesetzten Lösungsmittel LM bemißt sich in erster Linie aus der Zweckmäßigkeit bei der Handhabung der Enzyme; sie ist nicht eigentlich kritisch. Im allgemeinen wird man aus Gründen der Handhabbarkeit ein Gewichtsver¬ hältnis Enzym zu Lösungsmittel LM von 1 : 10 nicht unter¬ schreiten. Im Interesse vernünftiger Konzentrationsver¬ hältnisse wird die obere Grenze der Gewichtsrelation Enzym zu LM in der Regel mit 1 : 30 bis 1 : 500 anzusetzen sein. Als Faustregel hat sich ein Verhältnis Enzym zu LM von 1 zu ca. 50 als gut brauchbar erwiesen. Geeignet sind gegebenen¬ falls auch Gemische aus den oben genannten Lösungsmitteln LM. Bei der Zugabe der im wesentlichen aus Protein bestehenden Enzyme zu den im wesentlichen wasserfreien Lösungsmitteln LM können Probleme auftreten wie zögernde Benetzung und/oder Verteilungsprobleme wie Absatz- oder Aufrahmerscheinungen.
In einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, daß sich die mit der Herstellung homogener flüssiger Enzym-Formulierungen verbundenen Probleme wie Aufrahmen und Absetzen zumindest teilweise lösen lassen, wenn man anorganische pulverförmige Zusätze AZ in die Lösungsmittel LM eindispergiert. Pulverförmige Zusätze aus anorganischen Dispergatoren sind für gänzlich andere Anwendungszwecke beschrieben worden, z.B. als Dispergatoren von "öl in Wasser"-Dispersionen, bzw. als Dispergatoren bei der radikalischen Perlpoly eri- sation (Vgl. Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band XIV/1 Makromolekulare Stoffe, S. 420 - 421, Georg- Thieme-Verlag 1961) . Als solche anorganische Dispergatoren werden z.B. unlösliche Salze der Erdalkalimetalle (Carbonate, Phosphate, Sulfate, Silikate) Aluminium¬ hydroxid, Talkum und Bentonit empfohlen. Zur Lösung der vorliegenden Aufgabe werden Tone, insbesondere Bentonit empfohlen. Kaolin und Bentonit bilden bekanntlich mit einer Reihe polarer und unpolarer organischer Flüssigkeiten thixotrope Gele. Die Thixotropie der Gele verschwindet z.B. durch Zugabe geringer Mengen längerkettiger Alkohole (Vgl. Ulimanns Enzyclopädie der techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. 23, S. 318 - 326, Verlag Chemie 19; U. Hoffmann et al. Kolloid Z. 151, 97 - 115 (1957)). 10
Unter Tonen seien die üblichen Aluminiumsilikate, unter Bentonit die hauptsächlich aus Mont orillonit (Al2θ3.4.Siθ2-H2θ) bestehenden, handelsüblichen Präparationen verstanden. Von besonderem Interesse sind organisch aktivierte Bentonite, z.B. die durch Umsetzung von Na-Mont orillonit mit guartären Alkyla moniumverbin- dungen entstandenen. Durch Kationenaustausch bilden sich sogenannte organophile Bentonite, die in organischen Flüssigkeiten quellen (Vgl. Ulimann loc.cit. S. 323) . Im allgemeinen können die Lieferformen des Handels (Plättchen, Teilchengrößen im Bereich 0,5 - 5 um) eingesetzt werden, wobei zweckmäßigerweise aber eine Behandlung unter Scherbeanspruchung in dem gewählten Lösungsmittel LM erfolgen soll. Im allgemeinen beträgt der Gehalt der Lösungsmittel LM an anorganischen Zusätzen AZ 0,1 bis 3 Gew.-% bezogen auf das Lösungsmittel, vorzugsweise 0,3 bis 1 Gew.-%. Als besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, den anorganischen Zusatz des Enzymkonzentrats zusammen mit dem Lösungsmittel LM mittels eines geeigneten Aggregats, insbesondere eines Dispergators der Scherwirkung zu unterwerfen. Als Dispergatoren kommen handelsübliche Geräte in Frage (Vgl. Ullmanns Encyclopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Bd. 1, S. 239, Verlag Chemie 1972) .
Die Drehzahlen bzw. die anzuwendenden BearbeitungsZeiten sind in erster Linie von der Art des Aggregats abhängig. Als Anhalt für die Einwirkung handelsüblicher dispergier- wirkεa er Aggregate auf Bentonit in einem der erfindungs¬ gemäß zu verwendenden Lösungsmittel LM seien 2 bis 60 Minuten genannt bei einer Umfangsgeschwindigkeit von 4 - 36 m/sec.
Als besonders geeignet hat sich das Lösungsmittel Propylen- carbonat insbesondere in Kombination mit Bentonit herausge¬ stellt. 11
Die erfindungsgemäßen Formulierungen unterliegen in Bezug auf die Enzymkomponente keinen erkennbar gewordenen Be¬ schränkungen (es sei denn im Hinblick auf die Stabilität der Enzyme selbst gegenüber organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen) . Vorausgesetzt werden soll, daß die Lösungs¬ mittelkomponente LM mit der endgültigen Verwendung der Enzyme kompatibel ist. Zur Steigerung des Anti-Absetz- bzw. Antiaufrahmeffekts können den Trägerflüsigkeiten, insbe¬ sondere, wenn es sich um polare Lösungsmittel, etwa vom Typ der Formel I handelt, noch wenig polare Lösungsmittel zuge¬ setzt werden. So kann es vorteilhaft sein, daß die Träger¬ flüssigkeit 1 - 10 Gew.-% Kohlenwasserstoffe, insbesondere verzweigte oder geradkettige Aliphaten mit 5 bis 20 Kohlen¬ stoffatomen enthält. Genannt seien z.B. Petroleumfrak¬ tionen etwa im Siedebereich 50 - 180 Grad C (Vgl. auch vor¬ stehende Definition von LM) . Als Enzyme seien insbesondere die bereits industriell oder in sonstigen Anwendungsfeldern genutzten hervorgehoben (vgl. Stand der Technik, oben)
A) Proteasen (E.C. 3.4; Kirk-Othmer, loc.cit. Vol. 9_, K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industrial Aspects of Bio- chemistry, Vol. 3_£ (I), pp 23 - 46, North Holland 1974.) a) tierischen Ursprungs, wie beispielsweise OÜ Rennin (E.C. 3.4.23.4) ß) Pankreas-Proteasen
Pancreatin, insbesondere Trypsin, Chymotrypsin (pH-Wirkungsbereich ca. 7 - 10)
Pepsin (E.C. 3.4.23.1) (pH-Wirkungs¬ bereich ca. 1,5 - 4,0) Kathepsin (E.C.3.4.23.5) (pH- Wirkungsbereich ca. 4,0 - 5,0) b) pflanzlichen Ursprungs c Papain (E.C. 3.4.22.1) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0 - 8,0 ß) Ficin (E.C. 3.4.22.3) pH-Wirkungsbereich ca. 4,0 - 9,0 ) Bro elain (E.C. 3.4.22.4 und 3.4.22.5) pH- Wirkungsbereich ca. 5,0 - 7,0
c) mikrobiellen Ursprungs (Vgl. L. Keay in "Process Biochemistry", 1971, 17 - 21. oC) aus Bacillus-Arten wie B. subtilis, B. lichenifor is, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides. ß) aus Streptococcus-Arten /+) aus Strepto yces-Arten wie Streptomyces fradiae, S. griseus, S.rectus ^) aus Aspergillus-Arten wie Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usa ii £) aus Mucor- und Rhizopus-Arten wie Mucor pusillus, M. mietrei ) Endothia-Arten wie Endothia parasitica l^) aus Trametes-Arten wie Trametes sanguinea
Außer der Unterscheidung nach der Herkunft findet auch die Unterscheidung gemäß dem Angriffsort (Exo-versus Endo-Enzyme) und aufgrund der "Active Site" der Proteasen (Serin-Proteasen, die durch DFP gehemmt werden, Sulfhydryl-Enzyme) Anwendung.
Weiter ist von erheblicher praktischer Bedeutung die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität.
Man unterscheidet daher vor allem unter praktischen
Gesichtspunkten
i) Alkalische Proteasen, mit WirkungsOptimum etwa im Bereich von pH 7,5 bis 13, insbesondere alkalische Bakterienproteasen (E.C.3.4.21.) (die zumeist dem Serin-typ angehören) und alkal. Pilzproteasen ii) Neutrale Proteasen, mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 6,0 - 9,0 insbesondere neutrale Bakterienprotease (E.C.3.4.24. ) (die zu den Metalloenzymen gehören) und Pilzproteasen, beispielsweise Bacillus- Proteasen, Pseudomonas-Proteasen, Streptomyces- Proteasen, Aspergillus-Proteasen. iii) Saure Proteasen mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 2,0 - 5,0 (E.C. 3.4.23) insbesondere saure Pilzproteasen, z.B. aus Rhizopus spp. , Aspergillus spp., Pennicillium spp., Mucor spp., und Impex lacteus und Endothitia parasitica
Proteasen finden u.a. bei der Lederherstellung, in Waschmitteln und bei der Reinigung, in der Entschlichtung, bei der Käseherstellung, beim Fleisch-'- abbau und bei der Stabilisierung von Bier industrielle Anwendung. 14
Genannt seien als alkalische Proteasen insbesondere die Subtilisine, alkalische Bakterienproteinasen vom Serin- Typ, die im pH-Bereich 9 - 10 stabil und gegen Perborat einigermaßen unempfindlich sind. Die proteolytische Wirksamkeit von Enzymen wird gebräuchlicherweise nach der Anson-Haemoglobin-Methode (M.L. Anson J. Gen. Physiol. £2_> 79 (1939) bzw. nach der Löhlein-Volhard-Methode (die Löhlein-Volhard'sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität. Gerbereichem. Taschenbuch. Dresden-Leipzig, 1955) als "LVE" (Löhlein-Volhard-Einheit) bestimmt. Unter einer Löhlein-Volhard-Einheit ist diejenige Enzymmenge zu verstehen, die unter den spezifischen Bedingungen der Methode 1,725 mg Casein verdaut. Weiter werden im folgenden für die Aktivitätsbestimmung der im sauren Bereich wirksamen Enzyme Einheiten verwendet, die aus der Anson-Methode abgeleitet sind. Diese werden als "Proteinase-Units (Haemoglobin) " U^ bezeichnet. Eine U^ entspricht der Enzymmenge, welche die Frei¬ setzung von trichloressigsäure-löslichen Bruchstücken aus Haemoglobin äquivalent 1 μMol Tyrosin pro Minute bei 37 Grad C (gemessen bei 280 nm) katalysiert. (1 mUH = 10-3 ÜHb.)
B) Amylasen (E.C. 3.2, Vgl. Ullmann, loc.cit Bd. ^£, S. 506 - 510, und B. Spencer, Industrial Aspects of Biochemistry loc.cit, pp 143 - 144, 175). 0Ü Endo-A ylasen o^) of-Amylasen (ei - 1,4 Glucanhydrolasen)
(E.C.3.2.1.1) 2) oC-l/6-Glucanhydrolasen ß) Exo-A ylasen (saccharogene Amylasen) l) ß-Amylasen ( t< -1,4-Glucanmaltohydrolasen)
(E.C.3.2.1.2) 02) Glucamylasen (o -1,4-Glucan-Glucohydrolasen) (E.C.3.2.1.3)
σ -Amylasen kommen bekanntlich u.a. in Pflanzen zusammen mit ß-Amylasen vor. Die technische Gewinnung erfolgt z.B. aus Pankreasdrüsen und aus Bakterien- und Pilzkulturen.
Besonders günstig ist die Herstellung aus Bacillus- Arten wie B. subtilis, B. esentericus, B. polymixa, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, ferner aus Pilzen, insbesondere Aspergillus-Arten wie A. niger, A. phoenicis, A. oryzae, A. awamori, Mucor-Arten wie M. rouxianus, Rhizopus-Arten wie R. delemar, R. oryzae, R. Japonicus, und Endomyces-Arten wie E. fibuliger. Das pH-Optimum der oi-Amylasen liegt überwiegend im Bereich von 4,7 bis 7,2. Amylasen finden u.a. Anwendung auf dem Ernährungssektor [Vgl. H.-J. Rehm & G. Reed Ed. "Biotechnology" Vol. 5, Verlag Chemie 1983; B. Spencer, Ed. Industrial Aspects of Biochemistry; Vol. 3_ , part I, pp. 139 - 186, 213 - 260, Elseviers (1973)] in der Stärkeverflüssigung, Malzgewinnung, in der Ethanolge- winnung, Entschlichtung, in der Lederherstellung u.a. Die Aktivität von θ-Amylasen unter Verwendung von Stärke als Substrat kann nach der Methode von Sandstedt, Kneen & Blish (Cereal Chem. _16_, 172 (1939) und Technical Bulletin Nr. 1024, U.S. Dept. of Agriculture) bestimmt werden. Dabei ist 1 Amylasen- einheit (= 1 SKB-Einheit) diejenige Enzymmenge, die bei 30 Grad C und den im übrigen gegebenen Reaktionsbe¬ dingungen instande ist, 1 g lösliche Stärke im Laufe von 1 Stunde zu dextrinieren.
Ferner wird die Methode von Willstätter zur Bestimmung der Aktivität der Pankreas-Amylase herangezogen (Hoppe- Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 (1923) . Dabei wird eine Willstätter-Amylase-Einheit als das Hundertfache derjenigen Enzymmenge definiert, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen die Stärke mit einer solchen Geschwindigkeit spaltet, daß die monomolekulare Reaktionskonstante gleich 0,01 ist.
Lipasen (E.C.3.1.1.3)
Als Lipasen werden bekanntlich Carboxylesterasen bezeichnet, die Glycerinester in wassriger Emulsion spalten. Sie unterscheiden sich insofern von anderen Carboxylesterasen, die das Substrat in wassriger Lösung spalten.
d) Pankreas-Lipasen
Der pankreatische Enzymkomplex enthält neben Lipasen meist Esterasen sowie Proteasen und Amylasen als technisch wichtige Begleitenzyme. Das pH-Optimum (gegenüber Olivenöl) liegt im Bereich 7 - 8,5 der Aktivitätsbereich liegt bei pH 6,5 - 9,5.
Lipasen sind i.a. sehr instabil, insbesondere gegenüber proteolytischem Abbau durch Begleit- proteasen. 17
ß) Mikrobiologische Lipasen z.B. aus Pseudo onas fragi, Aspergillus sp. (z.B. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp. (z. B. chrysogenum, P. oxalicum, Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae)
Diese Lipasen weisen in der Regel mindestens ein pH- Optimum bei pH > 7,0. Lipasen finden, soweit ihre Instabilität dies zulässt, Verwendung u.a. in der Abfallbeseitigung, Lederindustrie und in der Ernährungsbranche.
D) Katalasen/Hydroperoxidasen (E.C. 1.11.1.6)
ot) aus tierischem Gewebe z.B. aus Leber (}) aus Pflanzen z.B. aus Meerrettich Äff) aus Mikroorganismen z.B. aus Micrococcus lysodeicticus
Katalasen finden Anwendung zur Peroxid-Bleichung und in der Milchindustrie.
E) Cellulasen [E.C. 3.2.1.4] (Vgl. Ulimann loc.cit, pp. 510 - 511)
Cellulase ist bekanntlich ein Enzymkomplex, dessen Komponenten sukzessive am Abbau der nativen Cellulose beteiligt sind. 18
Cellulasen finden sich in Insekten, Mollusken und Mikroorganismen (Bakterien/Schimmelpilzen) Kommerziell genutzte Quellen für Cellulasen sind insbesondere Aspergillus-, Neurospora-, Rhizopus-, Trichoderma- und Trametes-Arten. Das Wirkungsoptimum technischer Präparate liegt zwischen pH 4 - 6. Cellulasepräparate des Standes der Technik verlieren bei kühler und trockner Lagerung ca. 10 - 20 % ihrer Aktivität pro Jahr.
Cellulasen finden technisch Anwendung in der Nahrungs¬ mittelindustrie zur Umwandlung cellulosehaltiger Abfallstoffe u.a..
Die vorliegende Erfindung sei am Beispiel der Verwendung von Enzymen in der Lederherstellung näher erläutert.
Die Anwendung von Enzymen, insbesondere von proteolytischen
Enzymen ist seit der Einführung der enzymatischen
Beize/tryptische Verdauungsenzyme der Bauchspeicheldrüse in der OROPON -Beize durch Dr. Otto Röhm (DE-PS 20 05 19) vor rd. 80 Jahren fester Bestandteil der Lederherstellung, insbesondere der Wasserwerkstatt:
Neben den Anwendungen in der Beize (DE-PS 9 27 464;
DE-PS 9 76 107; DE-PS 9 41 811; DE-PS 9 74 813,
DE-PS 9 75 095; DE-PS 9 76 928; DE-PS 11 20 066; -
DE-PS 11 34 474; DE-PS 12 19 620; DE-PS 12 82 837;
US-PS 3 939 040; US-PS 4 273 876) finden Enzympräparate auch Anwendung in der Weiche (DE-PS 2 88 095;
DE-PS 9 76 602; DE-PS 10 22 748; DE-PS 10 34 317,
DE-PS 12 82 838, DE-PS 20 59 453, US-PS 4 278 432,
US-PS 4 344 762) bei der Haarlockerung und dem Hautauf-
Schluß (US-PS 4 294 087) . 19
Zur Enthaarung (DE-PS 10 26 038, DE-PS 12 11 349, DE-PS 11 55 560, DE-PS 12 30 169, DE-PS 12 88 728, US-PS 3 623 950) und im Äscher (DE-PS 10 23 183; DE-PS 12 03 416, DE-PS 20 53 016, DE-OS 34 29 047) im Pickel (DE-PS 8 47 947, DE-PS 9 41 680) oder in einem Kompaktverfahren (US-PS 3 986 926, US-PS 3 986 926, US-PS 3 966 551) , zur Naßentfettung (DE-A 33 12 840) , zur Lockerung des Fasergefüges von Rauchwaren (US-PS 3 549 495; US-PS 3 558 430) usw. Ferner dienen Enzympräparationen zum Auflösen von Maschinenleimleder u. sonstigen Nebenprodukten der Leder¬ herstellung (US-PS 4 210 721, CH-PS 631 486, US-PS 4 293 647, US-PS 4 220 723) von keratinhaltigen Rohstoffen (US-PS 4 232 123) von elastinhaltigen Präparaten (US-PS 4 179 333) zur Aufarbeitung von kollagenhaltigem Rohmaterial (US-PS 4 220 714) u.a.
In Anlehnung an die vorstehend genannten, enzymatischen Verfahren können Enzym-Flüssig-Formulierungen entsprechend den vorliegenden Ansprüchen in den einzelnen Schritten der Lederherstellung eingesetzt werden (Vgl. Ullmanns Encyclopädie der Techn. Chemie, 3. Auflage, Bd. 11, S. 609, Urban / Schwarzenberg, Ullmanns Encyclopädie der Techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. _16_, S. 111 - 174, Verlag Chemie, 1978, F. Stather, Gerbereichemie und Gerbereitechnologie, 4. Auflage, Akademie-Verlag Berlin 1967)
I) In der Weiche
II) Bei der Haarlockerung, im Äscher und in der Enthaarung III)Bei der Entkälkung und in der Beize und gegebenenfalls IV) Im Pickel 20
Zu I.) Die Weiche
Die Weiche von Hautmaterial bei der die bei der Salz- konservierung eintretende Verhärtung der Häute rückgängig gemacht wird, wird üblicherweise bei pH 7,0 bis 10,0 durchgeführt. Die Mitverwendung von Enzymen, insbesondere von proteolytischen Enzymen [siehe A) ] beschleunigt die Weichwirkung durch "Verdauen" der wasserlöslichen und sonstigen Eiweißkörper, die nicht zum kollagenen Faser- gefüge der Haut gehören.
Im allgemeinen finden in der Weiche Enzyme mit dem Wirkungsbereich (bzw. pH-Optimum der proteolytischen Wirkung) bei pH 7,0 - 10,0 Anwendung. Mit der Entfernung der nicht-kollagenen Eiweiße wird eine schnellere und intensivere Benetzung des Haut gewährleistet. Vorteilhafterweise wird das Weichwasser leicht alkalisch gestellt, jedoch muß der pH-Wert stets < 12 bleiben. Außerdem sind Weichhilfsmittel (wei z.B. Monoethanolamin mit Antiseptikum wie Zephyrol oder Naphthalinsulfosäure in Kombination mit substituierten Phenolen; hochsulfierter Ricinolsäurebutylester mit Methylhexalin; Fettalkohol¬ sulfate mit Lösungsmittel) in den üblichen Konzentrations- bereichen (10 - 1000 g/1) vorteilhaft. Als enzymatische Zusätze in den erfindungsgemäßen Enzym-Flüssig-For ulie- rungen kommen z.B. die vorstehend unter A) genannten Proteasen insbesondere die unter A)c) genannten Proteasen in Frage: speziell mikrobielle Proteasen im Wirkungsbereich 4 - 9,5, insbesondere Pilzproteinasen, z.B. aus Aspergillusarten wie A. saitoi und A. usamii, insbesondere saure Proteinasen mit pH-Wirkungsbereich 2,5 bis 21
4,5, weiter solche aus A. oryzae mit pH-Wirkungsbereich 4,0 - 9,5, ferner aus A niger und A. flavus mit pH- Wirkungsbereich 9,5 - 11,0.
Im allgemeinen liegt die Konzentration proteolytischer Aktivitäten der verwendeten Proteinasen im Bereich 0,1 - 1,0, Anson-Einheiten bzw. 1000 bis 3000 Löhlein-Volhard- Einheiten pro 1 Weichbrühe.
Schließlich können die Weichbrühen noch A m y l a s e n gemäß B) enthalten. Die Amylasen treten z.B. als Begleit¬ enzyme von Pilzproteinasen auf. Sie begünstigen die Spaltung glykosidischer Bindungen bei den Proteoglykanen und Glykoproteinen der Haut.
Insbesondere eignen sich Amylasen mikrobiellen Ursprungs, besonders solche aus Aspergillus-Arten wie A. oryzae und A. niger speziell solche mit einem pH-Wirkungsbereich von 3,0 - 5,8, außerdem solche bakteriellen Ursprungs wie z.B. aus Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. polymixa mit einem Wirkungsbereich von 5,0 - 7,0.
Im allgemeinen liegen die glykolytischen Aktivitäten der Amylasen im Bereich von 500 - 2000 SKB. Die Temperatur der Weichbrühen liegt vorteilhaft bei > 20 Grad C. Die Weichdauer ist möglichst kurz zu bemessen, sie liegt im allgemeinen zwischen 4 und 36 Stunden.
Zu II) Haarlockerung, Äscher, HautaufSchluß
Zur Enthaarung werden meist Äscher benutzt (Vgl. Ulimann loc. cit. , 3. Auflage Bd. 11, S. 560; 4. Auflage Bd. 16, S. 118 - 119. Man arbeitet durchweg mit sogenannten ange¬ schärften Äschern, vorzugsweise einer Kombination von 22
Calciu hydroxid und Natriumsulfid und in Anwesenheit von puffernden, quellungshemmenden Äscherhilfsmitteln (z.B. Netzmittel, insbesondere kationenaktive Netzmittel in Kombination mit Monoethanolamin und Desinfektionsmittel wie quartäre Alkyl-dimethyl-benzylammoniumverbindungen, bzw. Dialkylamin und dessen Sulfat) . Für die Haarlockerung und den Hautaufschluß können Enzyme neben den üblichen Äscher¬ chemikalien verwendet werden, die in diesem pH-Bereich genügend stabil bleiben. Die Weiche und der Äscher lassen sich durch allmähliches Ansteigen des pH-Wertes und Einsatz entsprechender Enzyme zusammenfassen.
Die Anwendung der Enzyme im Zusammenhang der Äscher/Haar- lockerungs-/Enthaarungswirkung geschieht im allgemeinen im pH-Bereich von 9 - 13, speziell 9 - 12.
Im Anschluß an die DE-A 29 17 376 bzw. US-A 4 294 687 kann die vom Konservierungssalz befreite Haut zunächst im sauren pH-Bereich mit Disulfid-brücken-spaltenden Substanzen vorbehandelt und anschließend ohne vorhergehende Weiche unter Verwendung von im alkalischen Bereich wirksamen Proteasen bei einem pH-Wert von ca. 11 - 13 Haarlockerung und Hautaufschluß gleichzeitig herbeigeführt werden. Es folgen dann die weiteren, in der Wasserwerkstatt üblichen Bearbeitungsschritte III) und gegebenenfalls IV) . Zweσk äßigerweise werden in den Operationen der Wasser¬ werkstatt unter II) a l k a l i s c h e Proteasen vom Typ i) (s* oben) angewendet, insbesondere alkalische Bakterienproteinasen (Serin-Proteasen) , beispielsweise aus B. subtilis, B. licheniformis, B. irmus, B. alcalophilus, B. polymixa, B. mesenthericus.
Diese Proteasen haben im allgemeinen eine Aktivität die zwischen 8 000 und 10 000 Löhlein-Volhard-Einheiten (LVE) 23
pro Gramm liegt. Man verwendet sie zweckmäßig in Mengen, die bei 0,1 - 10 Gew.-%, vorzugsweise 1 - 5 Gew.-% bezogen auf das Gewicht der gesalzenen Häute und Felle (Rohgewicht) ausmachen.
Die enzymatische Reaktion bei der Haargewinnung/Hautauf¬ schluß führt man bei ca. 18 - 28 Grad C durch, wobei die Reaktionszeiten i.a. zwischen 12 und 24 Stunden, speziell bei 12 - 16 Stunden liegen.
Enthaarung bzw. Entwollung kann auch mit alkalischen Pilzproteinasen vom Typ i) durchgeführt werden, beispiels¬ weise mit Aspergillus-Proteasen, insbesondere aus A. niger und A. flavus mit einem Wirkungsbereich bei pH 9,5 bis 11,0.
Weiter ist das enzymatische Enthaarungsverfahren nach DE-A 34 29 047 anwendbar, demzufolge Häute und Felle .in einer Flotte im pH-Bereich von 9 - 11 mit solchen proteolytischen Enzymen behandelt wurden, deren Wirkungs- optimum in einem pH-Bereich von 2 bis 7,5 liegt und man die Enthaarung durchführt. Zur Anwendung kommen somit Proteasen vom Typ iii) (s. oben) insbesondere aus A. oryzae, A. saitoi, A. parasiticus, A. usamii, A. awamori, aus Paelomyces sp. aus Penicillium sp. auch Rhizopus sp. und/oder aus Mucor pusillus, sowie die sauren Proteasen unter A)a) und A)b) (s. oben).
Am allgemeinen werden 0,5 bis 6 Gew.-% vorzugsweise 1,0 bis 3 Gew.-% bezogen auf das Gewicht der gesalzenen Häute oder Felle angewendet. Dabei liegt die Aktivität im allgemeinen im Bereich von 50 bis 200 mUjjb« 24
ZU III)
Bei der Entkälkung und in der Beize finden bevorzugt Enzyme Anwendung. Die Entkälkung dient dazu, die Alkalität der Blößen von pH-Werten von 13 - 14 auf pH-Werte im Bereich 7 - 8 herabzusetzen. Zum Entkalken sollen vorzugsweise keine stark dissoziierten, sondern schwache organische Säuren, z.B. vom Typ der Dicarbonsauren oder schwachsauren Salze verwendet werden. Bei der Beize sollen Epidermis-, Haar- und Pigmentreste entfernt und ein zusätzlicher Haut¬ aufschluß bewirkt werden. Außerdem werden nicht-kollagene Eiweißbestandteile entfernt (Vgl. Ulimann, 4. Auflage, Bd. 16 loc.cit S. 119 - 120) Bei der Beize wird konventionell bei pH 7,5 bis 8,5 gearbeitet. Aus der DE-A 31 08 428 ist die Anwendung cyclischer Carbonate in der Entkälkung bekannt.
Gleichzeitig können bei der Beize auch Lipasen gemäß C. , beispielsweise Pankreas-Lipasen mit einem Wirkungsbereich bei pH 7,0 - 9,0 eingesetzt werden.
Auch Amylasen gemäß B., beispielsweise Pankreas-Amylasen, mit einem Wirkungsbereich bei pH 5,5 - 8,5, welche die Spaltung glykosidischer Bindungen bei der Beize begünstigen, sind (vor allem als Begleitenzyme von Trypsin und Chymotrypsin) von günstigem Einfluß auf die Beize.
Zu IV) Im Pickel
Bekanntlich muß die Blöße zur Vorbereitung auf die mineralische Gerbung sauer gestellt werden, d.h. vom pH- Wert von ca 8 auf 3 - 4 gebracht werden. Dies geschieht 25
z.B. im Pickel, der eine Säure/Salzlösung in Wasser darstellt, beispielsweis Schwefelsäure oder Ameisensäure zusammen mit Kochsalz.
Empfohlen werden z.B. Schimmelpilztryptasen, Pankreas- tryptasen und Bakterientryptasen gegebenenfalls zusammen mit Kohlehydrat-spaltenden Enzymen, insbesondere aus Bakterien oder Schimmelpilzen.
Vorteilhafte Wirkungen
Die Flüssig-Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung bieten eine verallgemeinerungsfähige und relativ problem¬ lose Lösung der vielfach vorhandenen, wenn auch nicht immer ausgesprochenen Aufgabe, nämlich flüssige Enzymformulie¬ rungen zur Anwendung bringen zu können. Vorteilhaft ist auch die Möglichkeit Enzyme mit anderen Komponenten zur kombinieren, die in wässrigem Milieu und bei längerer Einwirkungsdauer die Enzymwirkung beeinträchtigen. Dies gilt vor allem für die Kombination verschiedener Enzyme, z.B. von Proteasen mit Amylasen, Lipasen, u.a., aber auch mit Hydrotropica wie z.B. Harnstoff, Guanidiniu salze, Cumolsulfonat etc.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der erfindungsgemäßen Flüssig-Formulierungen und ihrer" Anwendung. 26
BEISPIELE
Beispiel A
Herstellung einer flüssigen Enzympräparation auf Basis Pankreas- und Pilzenzym.
700 g Propylencarbonat (0,6 % Wasser) werden nach Zusatz von 3,5 g eines organisch modifizierten Betonits (z.B. Betone 27, Fa. Kronos/Titan Leverkusen) 45 bis 60 Minuten lang bei einer Umdrehung von 16 m/Sek. in einem Zahnscheibenrührer dispergiert (Scheibe: Gefäß = 1 : 2,5; Einfüllhöhe ist das 2 bis 2,5fache des
Scheibendurchmessers, der Bodenabstand des Rührers ist der halbe Scheibendurchmesser) .
Unter weiterem Dispergieren werden 2,54 g eines Pilzproteasekonzentrates aus Aspergillus parasiticus (pH- Optimum 7,5 - 9) (150 000 LVE) und 1,48 g eines Pankreasenzy präparates (pH-Optimum 6 - 8) (220 000 LVE) zugegeben. Bei gleichbleibender Drehzahl wird weitere 30 Minuten lang dispergiert, wobei darauf zu achten ist, daß die Temperatur 40 Grad C nicht überschreitet. Das Endprodukt hat eine Aktivität von 1 000 LVE und nach 4 Wochen bei 20 Grad C keinen Aktivitätsabfall. Das Produkt zeigt keine Aufrahm- bzw. Absetzerscheinungen des Enzyms.
Entsprechend der Art des Lösungsmittels, der Korngröße und der Konzentration des Enzymkonzentrates müssen die Dispergierbedingungen (Drehzahl) und der Typ des organisch modifizierten Bentone geändert werden. 27
Beispiel B
Kombinierte Entkälkung und Beize mit einem flüssigen Enzym¬ produkt auf Basis Pankreas- und Pilzenzym in Propylen¬ carbonat.
10 kg geäscherte und gewaschene Rindsblößen, Spaltstärke 3 bis 4 mm, 30 % Wasser, Temperatur 35 Grad C, 3 % Enzym- lösung auf Pankreas- und Pilzenzymbasis in Propylencarbonat wie in Beispiel A (Aktivität 1 000 LV/g) , 0,2 % nichtionogenes Netzmittel auf Basis Fettalkoholethoxylat mit 8 bis 9 mol Ethylenoxyd.
Nach 80 Minuten ist die Blöße vollständig durchentkälkt sowie Grund und Gneist hervorragend gelockert. Der End-pH der Flotte liegt bei 8,0. Während der Entkälkung entweicht kein giftiger Schwefelwasserstoff, da der pH nie unter pH 8,0 fällt.
Beispiel C
920 g Butylglykol und 40 g Petroleum Kp 110 - 130 werden nach Zusatz von 30 g eines organisch, modifizierten Bentonits (z.B. Bentone 27, Firma Kronos-Titan, Leverkusen) 38 Minuten lang in einem Ultra-Turrax-Rührer mit 16 m/sec. dispergiert.
Die Dispersion läßt man 24 Stunden stehen. Unter obigen Dispersionsbedingungen werden nun 18,5 g einer neutralen Protease aus einem Bazillus subtilis-Stamm (pH-Optimum 28
5,5 - 7) (70.000 LVE/g) zugegeben. Man dispergiert insgesamt weitere 5 Minuten. Das Endprodukt hat eine Aktivität von 1300 LVE. Nach 5 Wochen ist kein Aktivitätsabfall in der LVE-Messung zu beobachten. Die Enzymflüssigformulierung bleibt homogen ohne abzusetzen bz . aufzurahmen.
Beispiel D
Enzymatische Weiche und Entfettung von schmutzgeweichten Rindshäuten
Prozentangaben auf Salzgewicht:
100,0 kg schmutzgeweichte Rindshäute,
200,0 % Wasser mit T = 26 Grad C
0,8 % Enzymflüssigformulierung aus Beispiel C,
0,4 % nichtionogenes Netzmittel auf Basis Fettalkohol- ethoxylat mit 6 Mol Ethylenoxid, 0,2 % eines Bakterizids auf Basis Chloracetamid.
Nach 5 Stunden Weichdauer sind die Häute völlig zurückgeweicht und gleichzeitig zur Haarlockerung bereit. Ein großer Teil des Naturhautfetts ist in der Weichflotte emulgiert.
Die auf obiger Art und Weise geweichten Häute werden nach bekannten Verfahren geäschert und zum Crustleder für Schuhe weitergearbeitet. 29
Beispiel E
1 000 g Petroleum Kp 110 - 130 Grad C werden auf 40 Grad C erhitzt und nach Zusatz eines organisch modifizierten Bentonits (z.B. MPA-X-2 000, Firma Kronos-Titan, Leverkusen) 10 Minuten lang dispergiert, dann werden 2,5 g einer sauren Pilzprotease (pH-Optimum 3,5 - 5) aus Aspergillus parasitiσus (80.000 LVE/g) zugesetzt und weitere 5 Minuten dispergiert.
Man erhält eine flüssige Enzymformulierung mit einer Aktivität von 200 LVE, welche nach 4 Wochen bei 20 Grad C keinen Aktivitätsabfall zeigt. Die Lösung ist homogen und rahmt weder auf noch setzt sie ab.
Beispiel F
Entfetten und enzmyatische Auflockerung von Schaf- und Lammpickelblößen.
Aufwalken
(Prozentangaben auf Pickelgewicht)
200 % Wasser 35 Grad C, 15 % Kochsalz, 5 Minuten bewegen, 10 kg Pickelblößen zugeben und 30 Minuten bewegen, entfleischen, Flotte ablassen. 30
Entfetten
(Prozentangaben auf Entfleischgewicht)
30 % Wasser, 35 Grad C, 2 % eines nichtionogenen Netzmittels auf Basis Fettalkohol thoxylat (6 - 8 Mol Ethylenoxid) , 6 % des Flüssigenzyms aus Beispiel E (200 LVE/g) , 8 kg Pickelblöße, 30 Minuten bewegen.
Die Blößen sind durch die Wirkung der Kombination Enzym/Tensid/Petroleum gut entfettet und aufgelockert.
Zur Entpicklung können in verlängerter bzw. neuer Flotte handelsübliche Entpickelungsgerbstoffe zugegeben werden und kann in bekannter Weise weitergearbeitet werden.
31
Beispiel G
In einem Rührkessel werden 927,5 g eines nichtionogenen wasserfreien Netzmittels auf der Basis Nonylphenol + 8,5 Mol Ethylenoxid mit 12 g Aerosil 38θS/(Fa. Degussa, Hanau, W-Germany, hochdisperses amorphes Siliziumdioxid) versetzt sowie 5 g Borchigen STIiS (Netz- und AufSchlußmittel, Basis modifizierte Fettsäure, Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang bei 15 - 18 m/sec mit einem
Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 15 Pas auf 255 Pas. (Bestimmung mit dem Brookfield- Viscometer, Bedingung 1/6 upm) . Nun wird 55,5 g o-Amylase- Konzentrat (90 000 SKB/g (SKB-Analyse siehe Sandstedt, R.M.E., E. Kneen und M.J. Blish, Cereal Che . 16, 712 (1939) gewonnen aus Bacillus subtilis) zugegeben. Man dispergiert weitere 15 Minuten. Die flüssige Fertigformulierung mit einer
Ausgangsstabilitat von 5 000 SKG/g hat nach 4 Wochen weder abgesetzt noch aufgerahmt. Der Aktivitätsverlust bei Lagerung bis 25 Grad C beträgt 3,4 %.
Beispiel H
Enzymatisches Vorweichen von Jeansstoffen
10 kg Deni gewebe (Jeansstoffe) , welches mit einer Stärkeschlichte behandelt ist, wird in 50 1 Wasser bei 40 Grad C gegeben. Nach Zusatz von 50 ml des Produktes aus Beispiel G wird die Temperatur innerhalb 10 Minuten auf 32
60 Grad C erhöht und das Gewebe 5 - 10 Minuten lang gewaschen und anschließend mit je 50 1 Wasser von 40 Grad C zweimal gespült. Ein zusätzlicher Waschvorgang mit einem Netzmittel zur Entfernung der Stärkeabbauprodukte entfällt. Das entschlichtete Gewebe hat einen schönen weichen Griff.
Beispiel I
Flüssiges, biologisch abbaubares Grobwaschmittel
In einem Rührkessel werden 466 g 1,2-Propylenglykol, 400 g nichtionisches Tensid Marlipal 013-9cfe/ (Isotridecylalkohol
+ 9 Mol Ethylenoxid, Produkt der Chemischen Werke Hüls, W-
Germany) , 100 g Ethylalkohol (98 %ig) mit 10 g
Aerosil 380 / (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W-
Germany) und 4 g Borchigen STI-Sy (Netz- und AufSchlußmittel auf Basis modifizierter Fettsäuren (verethert) ,
Fa. Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang bei 15 -
18 m/sec mittels eines Zahnscheibenrührers dispergiert. Die Viskosität steigt auf 1250 mPas. Nun werden in folgender Reihenfolge unter weiterem Dispergieren folgende Festprodukte zugegeben: 6 g alkalische Protease (aus Bacillus subtilis,
Aktivität 92 000 LVE/g) 4 gc<-Amylase (aus Bacillus subtilis, 90 000 SKB/g 6 g optischer Aufheller (4,4 '-Bis-(4-amino-6-[N-(2- hydroxyethyl)-N-(2-carbamoylethyl)-a ino]-S-triaxin-
2-yl-amino-2,2'-stilben-disulfonsäure 2 g Na-Salz von EDTA (Ethylendamin-tetraessigsäure) 6 g -C9-Ci2_01efinsulfonat Na-salz (-98 %) 33
Nach erfolgter Zugabe wird weitere 15 Minuten dispergiert.
Die erhaltene dickflüssige, gut gießbare Lösung hat nach 4
Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt.
Der Aktivitätsverlust anσC-Amylase betrug nach 4 Wochen bei 25 Grad C 1 %, die Protease hatte 1,4 % an ihrer
Ausgangsaktivität verloren.
Beispiel J
Weiche eines blutverschmierten Baumwollgewebes bei
60 Grad C
500 g weißes Baumwollgewebe, welches mit Rinderblut getränkt und getrocknet wurde, wird in 2,5 1 Wasser mit 6 g Flüssigwaschmittel (Lagerzeit 3 Monate) aus Beispiel I und 2 g Natriu -metasilikat 15 Minuten bei 60 Grad C behandelt und anschließend 2 x bei 30 Grad C mit 2,5 1 Wasser gewaschen.
Im Vergleich dazu wurde dasselbe Gewebe unter gleichen Bedingungen mit ebenfalls 6 g eines Flüssigwasch ittels gleicher Lagerzeit behandelt, welches identisch ist mit Beispiel I, jedoch wurde anstelle von 1,2-Propylenglykol Wasser verwendet.
Die Auswertung der beiden Versuchsgewebe im Remissionsphotometer ELREFOMAT DFC 3& (Zeiss, W-Germany) ergab für die Behandlung mit dem wasserfreien Waschmittel ein um 46 % bessere Entfernung des Bluts vom Gewebe. 34
Beispiel K
Herstellung eines flüssigen Lipaseproduktes
In einem Rührkessel werden 968 g Genapol 0 - 05Ö£y (C_g- Cis-Fettalkohol mit 5 Mol Ethylenoxid, Hoechst AG, W- Germany) mit 12 g Aerosil 38θS (hochdisperses Siliciumdioxid, Degussa, W-Germany) und 4 g Borchigen STBS) (Netz- und AufSchlußmittel auf der Basis modifizierter Fettsäuren, Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten bei 15 - 18 m/sec mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 18 mPas auf 290 mPas an. Nun werden 16 g eines Lipasekonzentrats (aus Pseudomonas spez. Aktivität 5 000 LCA/mg, Definition und Bestimmung von LCA- Einheiten: Semeriva, Biochem. 10, 2143 (1971) zugegeben und 10 Minuten weiterdispergiert.
Man erhält ein flüssiges Enzymprodukt mit 80 LCA/mg Aktivität, welches nach 6 Wochen Lagerung bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Lagerzeit beträgt noch 77 - 78 LCA/mg.
Beispiel L
Verseifunq von Rindertalg
400 g Rindertalg und 600 g Wasser werden mit 5 g Lipaseprodukt aus Beispiel K bei 50 Grad C emulgiert und 3 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird durch Titration der durch Hydrolyse freigesetzten Fettsäuren (JUPAC-Standard Methods of oils, Fats and Derivatives, Pergamon Press, Oxford, 6th edition, pg. 56, 1979) ein Hydrolysegrad von 72 % festgestellt. 35
Beispiel M
Herstellung eines flüssigen
Cellulase/Hemicellulasepräparates
In einem Rührkessel werden 882 g Ethylenglykol mit 13 g Aerosil 20θδJ (hochdisperses Siliziumdioxid, Hoechst AG, W- Germany) und 5 g Borchigen STDS (Netz- und Aufschlußmittel auf der Basis modifizierte Fettsäure, Fa. Borchers, Goslar, W-Germany) 10 Minuten bei 15 - 18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 35 mPas auf 330 mPas. Nun werden 100 g eines Cellulase/He icellulase Konzentrats (aus Trichoder a viridi, Aktivität 10 000 FPU/g, FPU-Einheit: Mandels, M. , Andreotti, R. , and Röche C. , (1976) Biotech. Bioe p. Sy p. 6, 17) zugegeben und weitere 10 Minuten dispergiert. Man erhält ein viskoses, homogenes Enzymprodukt (2 600 mPas) 1000 FPU/g, welches nach 5 Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Lagerzeit beträgt 95 %.
Beispiel N
Cellulase/Hemicellulasen für die Glutenfiltration
10 kg Glutensuspension (Trockengehalt^-30 %) , welche durch Zentrifugation von Maisstärke getrennt wird, wird mit 3 g des Cellulaseproduktes 1 Stunde bei 40 Grad C behandelt. Polysaccharide, welche die Filtration behindern, werden abgebaut und eine schnellere und eifachere Filtration auf dem Vakuumdrehfilter ist das Ergebnis. 36
Beispiel 0
In einem Rührkessel werden 975 g Glycerin (Wassergehalt .1 %) mit 20 g Aerosil 38ofe/(hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W-Germany) 15 Minuten lang mit einem Zahnscheibenrührer (Umdrehungsgeschwindigkeit 15 - 18 /sec dispergiert. Man gibt nun 5 g eines Pectinase- Konzentrats (aus Aspergillus oryzae, Aktivität 100 000 PGU/mg, Definition und Bestimmung PGU-Einheit, vgl. Röhm- Analysenvorschrift PZV-30) zu und dispergiert weitere 10 Minuten.
Man erhält ein flüssiges, gut gießbares, homogenes Pectinaseprodukt mit 5 000 PGU/mg Aktivität, welches nach 6 Wochen Lagerung bei 25 Grad C weder aufgerahmt noch abgesetzt hat.
Die Aktivität nach dieser Lagerzeit beträgt noch 97 % des Ausgangswertes.
Beispiel P
Pectinasen zur Saftklärung
1000 1 frisch abgepreßter Apfelsaft werden mit 50 g des Pectinaseproduktes aus Beispiel O behandelt. Es erfolgt der Abbau von Pectinen sowie von kolloidalen Substanzen, welche in den Trubpartikeln sitzen. Diese Kolloide stören bei der Trubflockung, bzw. bei einer Klärung durch Ultra¬ oder Mikrofiltration. Nach 2 Stunden Behandlung wird durch Zugabe von Bentoniten eine Trubflockung durchgeführt. Der anschließende Filtrationsprozeß gestaltet sich leicht und unproblematisch. 37
Beispiel Q
Flüssiges Hilfsmittel für die enzymatische Weiche
In einem Rührkessel werden 300 g nichtionisches Tensid auf der Basis C^-Oxo-alkohol + 6 Mol Ethylenoxid und 682 g nichtionisches Tensid, Basis Ci3-Oxoalkohol, + 9 Mol Ethylenoxid mit 13 g Aerosil 380% (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W-Germany) und 5 g Borchigen STLR (Netz- und AufSchlußmittel auf Basis einer modifizierten Fettsäure, Fa. Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang mit einem Zahnscheibenrührer bei 15 - 18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit dispergiert.
Nun werden nacheinander 27,5 g einer alkalischen Protease (aus Bacillus subtilis, Aktivität 80 000 LVE/g) und 10 g einer Pilzprotease (aus Aspergillus parasiticus, 220 000 LVE/g) zugegeben und weitere 10 Minuten dispergiert.
Man erhält ein flüssiges homogenes, gut gieß- und pumpbares Enzymprodukt, welches nach 4 Wochen Lagerzeit weder abgesetzt, noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Zeit beträgt bei 25 Grad C Lagertemperatur noch 97 % der Ausgangsaktivität von 4 400 LVE/g.
38
Beispiel R
Enzymatische Weiche von schmutzgeweichten Rindshäuten
(Prozentangaben beziehen sich auf Salzgewicht)
100 kg schmutzgeweichte Rindshäute 200 % Wasser, 26 Grad C
0,25 % Enzymprodukt aus Beispiel Q
0,2 % Natronlauge, 50 %ig
Nach 5 Stunden Weichdauer im Faß sind die gesalzenen Häute vollständig zurückgeweicht, von einem Großteil des Hautfetts und Schmutzes befreit und zur Haarlockerung vorbereitet.
Beispiel S
Herstellung eines flüssigen Beizmittels mit entkalkender und entfettender Wirkung
In einem Rührkessel werden 400 g Ethylencarbonat eingetragen und mit 300 g Methylethylketon und 264 g nichtionisches Tensid (Cig-Cis-Fettalkohol mit 9 Mol Ethylenoxid) gemischt, auf 40 Grad C erwärmt und mit 10 g Aerosil 380%) (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W- Ger any) sowie 6 g Borchigen STL ) (Borchers, Goslar, W- Ger any, siehe Beispiel Q) versetzt. Die Mischung wird 15 Minuten bei 15 - 18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert.
Die Viskosität steigt von 60 mPas auf 1040 mPas. Nun wird 20 g Pankreasenzym Konzentrat (Aktivität 40 000 LVE/g) 39
zugegeben und weitere 20 Minuten dispergiert. Man erhält eine flüssige, gut gießbare homogene Enzymformulierung, welche nach 5 Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C nicht absetzt oder aufrahmt. Die Aktivität nach dieser Zeit bei 25 Grad C beträgt 760 LVE/g. (Ausgangsaktivität 800 LVE/g) .
Beispiel T
Enzymatische Beize und Entkälkung von Rindsblößen
10 kg geäscherte und gewaschene Rindsblößen, Spaltstärke 3 - 4 mm, 30 % Wasser, 35 Grad C, 1 Gew.-% Enzymprodukt (800 LVE/g, identisch mit Beispiel S) , 2 Gew.-% Ammoniumsulfat.
Nach 70 Minuten ist die Blöße vollständig durchentkälkt, sowie Grund und Gneist hervorragend gelockert. Der End-pH- Wert der Flotte liegt bei pH 7,8. Das Naturfett ist gut aus der Haut entfernt und in der Flotte e ulgiert.
Beispiel U
In einem Becherglas werden 984 g 1,2-Propylenglykol (wasserfrei) mit 10 g Aerosil 380%^(siehe Beispiel G) und 5 g Borchigen STlxv (siehe Beispiel G) 10 Minuten mit einem Zahnscheibenrührer bei 15 - 18 m/sec
Umdrehungsgeschwindigkeit dispergiert. Die Viskosität steigt von 20 mPas auf 310 mPas. Nun wird 1 g Meerrettich- 40
Peroxidase (1000 Units/g, Definition und Bestimmung: Taele, F.W. . , Biochem. Biophys. Acta, 35, 543 (1959) zugegeben und 10 Minuten weiter dispergiert. Man erhält eine flüssig gut fließende Produktformulierung (280 mPas) , welche nach 4 Wochen Lagerzeit weder absetzt noch aufrahmt. Die Aktivität ist nach dieser Zeit um 2 % zurückgegangen.
Beispiel V
Herstellung einer Farbstofflösung (Modellreaktion)
Lösung A
1 g m-Phenylendiamin wird in 999 g 0,1 m Phosphatpuffer
(0,1 m, pH 7) gelöst.
Lösung B Wasserstoffperoxid (30 %) .
Reaktionsdurchführung
1 g des Peroxidaseprodukts aus Beispiel U werden in 1000 g Lösung A gegeben und unter Rühren mit 5 g Lösung B versetzt. Man beobachtet die Bildung eines roten, nach einigen Minuten immer dunkler werdenden Azofarbstoffs.

Claims

- 41 -PATENTANSPRÜCHE
1. Flüssigformulierung von Enzymen zur technischen Anwendung
dadurch gekennzeichnet,
daß die Trägerflüssigkeit für das Enzym aus wenigstens einem wasserfreien organischen Lösungsmittel besteht.
2. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserfreien organischen Lösungsmittel ein Molekulargewicht < 110 und einen Siedepunkt unterhalb 300 Grad C Normaldruck besitzen.
3. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gewichtsverhältnis Enzym zu Lösungsmittel von 1 : 10 bis 1 : 500 besteht.
4. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit aus einem wasserfreien, aber an sich wassermischbaren, organischen Lösungsmittel besteht.
5. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit aus einem nicht mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel besteht. 88/06183
4 2
6. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit anorganische, pulverförmige Dispergatoren enthält.
7. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an anorganischen pulverför igen Dispergatoren 0,1 bis 6 Gew.-% bezogen auf die Trägerflüssigkeit beträgt.
8. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die wassermischbaren, organischen Lösungsmittel 1 bis 10 Gew.-% bezogen auf diese an Kohlenwasserstoffen mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen enthalten.
9. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie Tenside in Anteilen von 0,001 bis 50 Gew.-% bezogen auf die Trägerflüssigkeit enthält.
10. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
Trägerflüssigkeit aus einem cyclischen Kohlensäureester besteht oder diesen enthält.
11. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit aus Propylencarbonat besteht oder dieses enthält. - 3 -
12. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Proteasen (nach E.C.3. ) sind.
13. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen l bis ll, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Amylasen (nach E.C.3.2) sind.
14. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Lipasen (nach E.C. 3.1.1.3) sind.
15. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Katalasen (nach E.C.1.11.1.6) sind.
16. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Cellulasen (nach E.C. 3.2.1.4) sind.
17. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 14 bei der Lederherstellung.
18. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 14 in Wasch- und Reinigungsmitteln.
19. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß Anspruch 12 und 13 bei der Entschlichtung. 6183
20 Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß Anspruch 15 zur Peroxidbleichung .
21. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß Anspruch 16 zur technischen Umwandlung cellulosehaltiger Substrate.
22. Verfahren zur Entkälkung und Beize von Blößen, dadurch gekennzeichnet, daß man Flüssigformulierungen der Enzyme gemäß den Ansprüchen 1 - 13 einsetzt.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flussigformulierungen von Pankreasenzymen einsetzt.
24. Verfahren zur enzymatischen Weiche von Häuten und Fellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Flüssigformulierungen der Enzyme gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 einsetzt.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigformulierungen von neutralen Proteasen einsetzt.
26. Verfahren zur Entfettung von Blößen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigformulierungen einer sauren Protease gemäß den ANsprüchen 1 - 13 einsetzt.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigformulierung einer Aspergillus- Protease einsetzt.
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