UA81215C2 - Method of prevention and treatment of amyloid-induced diseases - Google Patents

Description

Опис винаходу

Дана заявка являє собою часткове продовження заявки 5ЗМ 09/322,289, поданої 28 травня 1999р. і 2 включеної тут в усій її повноті шляхом посилання для всіх цілей.

Даний винахід стосується галузей імунології і медицини.

Хвороба Альцгеймера є прогресуючою хворобою, що призводить до старечого недоумства, див. |ЗеїКое,

ТІМ 16,403-409 (1993); Нагау ей а!., МО 92/13069; ЗеїКое, У. Меигораїйо! Ехр. Меийгої. 53,438-447 (1994);

Ой еї аї., Маїшге 373, 476-477 (1995); Сатевз еї аїЇ., Майте 373, 523 (1995)). Взагалі кажучи, ця хвороба 70 поділяється на дві категорії: пізнього виникнення, що спостерігається в літньому віці (65 плюс декілька років) і раннього виникнення, що розвивається задовго до старечого періоду життя, тобто між 35 і 60 роками.

Хвороби обох цих категорій мають однакову патологію, але аномалії виказують тендецію до більш тяжких і поширених станів, якщо хвороба розпочалася у більш ранньому віці. Для цієї хвороби характерними є два типи ушкоджень в мозку - старечі бляшки і нейрофібрілярні клубки. Старечі бляшки являють собою ділянки 12 неупорядкованого нейропіля поперечним розміром до 15Омкм зі зовнішньоклітинними амілоїдними відкладеннями в центрі, що спостерігаються під мікроскопом на зрізах мозкової тканини. Нейрофібрілярні клубки являють собою внутрішньоклітинні відкладення асоційованого з мікротрубочками тау-білка, що складається з двох сплетених в пари ниток.

Головною складовою бляшок є пептид, що зветься АВ або В-амілоїдний пептид. Пептид АВ складається із амінокислот 39-43 і являє собою внутрішній фрагмент прекурсорного білка, що зветься амілоїдним прекурсорним білком (АРР: атуїсід ргесигзог ргоїеіп). Була виявлена кореляція декількох мутацій в білку АРР з хворобою

Альцгеймера, див., наприклад, |Соаїе еї аї., Майшге 349,704 (1991) (валін'!"/" на ізолейцин); Спапієг Напап еї аЇ. Майцге, 353, 844 (1991)) (валін/"" на гліцин); Миттеї! еї а!., Зсіепсе 254, 97 (1991) (валін'!/ на фенілаланін); сч ов Мийап ей а, Майте Сепейї 1, 345 (1992) (подвійна мутація зі зміною лізин 95-метіоніну?бб на аспарагін595 дейцин 296), Вважається, що такі мутації викликають хворобу Альцгеймера шляхом збільшеного або о зміненого процесінгу АРР на АВ, і особливо процесінгу АРР на збільшені кількості довгої форми АВ (тобто

АВ1-42 і АВ1-43). Мутації в інших генах, таких, як пресенільні гени РБ1 і РБ2, очевидно, зачеплюють процесінг

АРР непрямим чином з генерацією збільшених кількостей довгомірного АВ, див., наприклад, ІНагау, ТІМ5 20, 154 юю (1997)). Ці спостереження вказують на те, що АВ, і особливо його довга форма, є каузальним елементом хвороби Альцгеймера. --

В патенті ЕР 526511 (автор МеМіснаеї) пропонується вводити пацієнтам з діагнозом хвороби Альцгеймера «С гомеопатичні дози АВ (до 10-2мг/день). У звичайної людини, організм якої містить приблизно 5л плазми, навіть максимальний рівень цієї дози навряд чи створить концентрацію більше 2пг/мл. Нормальна концентрація АВ в -- людській плазмі знаходиться, як правило, в межах 50-200пг/мл |Зецбрегі еї аїЇ., Майте 359, 325-327 (1992)|. (ее)

Таким чином, оскільки запропонована в ЕР 526,511 доза не дозволяє сподіватися на досягнення суттєвих змін рівня циркулюючого АВ, і оскільки в ЕР 526,511 не пропонується використання адюванту у якості імуностимулятора, здається малоймовірним одержання таким шляхом відчутного терапевтичного результату. «

У протилежність цьому даний винахід спрямований, поряд з іншим, на лікування хвороби Альцгеймера та інших амілоїдогенних хвороб шляхом уведення фрагментів АВ або антитіла проти певних епітопів в АВ пацієнту - с в умовах, що викликають у нього відчутну імунну реакцію. Таким чином, даний винахід задовільняє давно назрілу и потребу у визначенні терапевтичних режимів профілактики або поліпшення нейропатології і, у деяких випадках, є» когнітивного розладу, пов'язаного з хворобою Альцгеймера.

Дана заявка має своїми попередниками такі матеріали: УУ0О99/27944 від 30 листопада 1998р., О5БМ 60/067,740 від 2 грудня 1997р., О5БМ 60/080,970 від 7 квітня 1998р. і БОМ 09/201,430 від 30 листопада (ее) 1998р., включені тут в усій їхній повноті шляхом посилання для всіх цілей. - В одному зі своїх аспектів даний винахід стосується способів профілактики або лікування хвороб, пов'язаних із амілоїдними відкладеннями білка АВ в мозку пацієнта. До таких хвороб належать хвороба іме) Альцгеймера, синдром Дауна і когнітивний розлад. Останній може виникати як супроводжуваний характерними шу 20 ознаками амілоїдогенного захворювання, так і без них. У деяких способах згідно з даним винаходом застосовується введення ефективних доз антитіла, що специфічним чином зв'язується з компонентом сл амілоїдного відкладення у пацієнта. Такі способи є особливо ефективними у профілактиці або лікуванні хвороби

Альцгеймера у людей. У деяких запропонованих способах застосовується введення ефективних доз антитіла, що зв'язується з АВ. Деякі способи базуються на введенні ефективних доз антитіла, що специфічно зв'язується з епітопом у межах залишків 1-10 пептиду АВ. У деяких способах антитіло специфічним чином зв'язується з о епітопом у межах залишків 1-6 пептиду АВ. У деяких способах антитіло специфічним чином зв'язується з епітопом у межах залишків 1-5 пептиду АВ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епітопом у іме) межах залишків 1-7 пептиду АВ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епгтопом у межах залишків 3-7 пептиду АВ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епітопом у межах залишків 1-3 пептиду АВ. бо У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епітопом у межах залишків 1-4 пептиду АВ. У деяких способах антитіло зв'язується з епітопом, що містить вільний М-кінцевий залишок пептиду АВ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епгтопом у межах залишків 1-10 пептиду АВ, де залишком 1 і/або залишком 7 пептиду АВ є аспартанова кислота. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з пептидом АВ, не зв'язуючись при цьому з амілоїдним прекурсорним білком АРР повної довжини. У деяких способах ізотипом 65 антитіла є Ї(ДО1 людини.

У деяких способах антитіло зв'язується з амілоіїдним відкладенням у пацієнта і викликає реакцію видалення амілоїдного відкладення. Наприклад, така реакція видалення може здійснюватися шляхом фагоцитозу, опосередкованого Ес-рецептором.

Ці способи можуть застосовуватися як до пацієнтів, що не мають симптомів хвороби, так і до пацієнтів, які на даний час виказують її симптоми. Антитілами, застосовуваними в даних способах, можуть бути людські, пристосовані до людей (гуманізовані), химерні та іншого походження антитіла, які можуть бути моноклональними або поліклональними. У деяких способах антитіло беруть у людини, імунізованої пептидом АВ, причому такою людиною може бути сам пацієнт, для лікування якого призначене це антитіло.

У деяких способах антитіло вводять разом із фармацевтичним носієм у формі фармацевтичної композиції. У /о деяких способах антитіло вводять дозою від 0,0001 до 10Омг/кг, краще, якщо принаймні 1 мг/кг маси тіла пацієнта. У деяких способах антитіло вводять багатократними дозами протягом тривалого часу, наприклад, принаймні 6 місяців. У деяких способах антитіло вводять у формі композиції з підтримуваним виділенням.

Антитіло може вводитися, наприклад, інтраперитонеальним, пероральним, підшкірним, інтракраніальним, внутрішньом'язовим, місцевим, інтраназальним і внутрішньовенним шляхами.

У деяких способах антитіло вводять шляхом уведення полінуклеотиду, що кодує у пацієнта принаймні один ланцюг антитіла. Цей полінуклеотид експресується на продукування у пацієнта ланцюга антитіла. У разі протреби цей полінуклеотид кодує важкі і легкі ланцюги антитіла. Такий полінуклеотид експресується на продукування у пацієнта важких і легких ланцюгів. У деяких способах здійснюється моніторинг рівня введеного антитіла в крові пацієнта.

В іншому своєму аспекті даний винахід пропонує способи профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями пептиду АВ в мозку пацієнта. Такі способи можуть застосовуватися, наприклад, у лікуванні хвороби Альцгеймера або синдрому Дауна, або когнітивного розладу. Такі способи передбачають уведення фрагментів АВ або його аналогів, що викликають імуногенну реакцію на деякі епітопи в АВ. В деяких способах передбачається введення пацієнту ефективної дози поліпептиду, який містить М-кінцевий сегмент, сч принаймні, із залишків 1-5 пептиду АВ, де перший залишок пептиду АВ є М-кінцевим залишком поліпептиду, а поліпептид не має С-кінцевого сегмента АВ. В деяких способах застосовується введення пацієнту ефективної і) дози поліпептиду, що містить М-кінцевий сегмент пептиду АВ, де цей сегмент починається на залишку 1-3 АВ і закінчується на залишках 7-11 АВ. В деяких способах передбачається введення пацієнту ефективної дози агента, що викликає імуногенну реакцію на М-кінцевий сегмент пептиду АВ, де цей сегмент починається на ю зо Залишку 1-3 АВ і закінчується на залишках 7-11 АВ, не спричиняючи імуногенну реакцію на епітоп у межах залишків 12-43 пептиду АВ43. -

У деяких з вищезазначених способів М-кінцевий сегмент пептиду АВ зв'язується на його С-кінці з с гетерологічним поліпептидом. У деяких з вищезазначених способів М-кінцевий сегмент пептиду АВ зв'язується на його М-кінці з гетерологічним поліпептидом. У деяких з вищезазначених способів М-кінцевий сегмент пептиду 787

АВ зв'язується на його М- і С-кінцях з першим і другим гетерологічними поліпептидами. У деяких з со вищезазначених способів М-кінцевий сегмент пептиду АВ зв'язується на його М-кінці з гетерологічним поліпептидом, а на його С-кінці - принаймні з однією додатковою копією М-кінцевого сегмента. У деяких з вищезазначених способів гетерологічний поліпептид, а отже і В-клітина, реагують на М-кінцевий сегмент. У деяких з вищезазначених способів поліпептид містить також, принаймні, одну додаткову копію М-кінцевого « бегмента. У деяких з вищезазначених способів поліпептид містить від М-кінця до С-кінця М-кінцевий сегмент з с пептиду АВ, численні додаткові копії М-кінцевого сегмента і гетерологічний амінокислотний сегмент. У деяких з вищезазначених способів М-кінцевий сегмент складається із АВ 1-7. У деяких з вищезазначених способів з М-кінцевий сегмент складається із АВ 3-7.

У деяких способах згаданий фрагмент не містить, принаймні, 5 С-кінцевих амінокислот в АВ43. У деяких способах згаданий фрагмент містить до 10 суміжних амінокислот із АВ. Фрагменти зазвичай вводяться пацієнту у

Го! кількості більше 10 мікрограмів на дозу.

У деяких способах фрагмент уводять з ад'ювантом, що підсилює імунну реакцію на пептид АВ. Ад'ювант і - фрагмент можуть уводитися у будь-якому порядку або разом один з одним у формі композиції. У якості ко адюванту можуть застосовуватися, наприклад, гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію, МРІ тпм, 05-21 (Зітшоптм) або неповний ад'ювант Фрейнда. - Винаходом пропонуються також фармацевтичні композиції, що складаються із фрагментів пептиду АВ або сл інших агентів, які викликають імуногенну реакцію на такі самі епітопи АВ, як описано вище, і ад'юванту.

Винаходом пропонуються також фармацевтичні композиції, що містять будь-яке з вищеописаних антитіл і фармацевтично прийнятий носій.

В іншому своєму аспекті даний винахід пропонує способи скринінгу антитіла за його активністю у лікуванні хвороби, пов'язаної з відкладеннями пептиду АВ в мозку пацієнта (наприклад, хвороби Альцгеймера). Такі і) способи передбачають приведення в контакт антитіла з поліпептидом, що містить, принаймні, п'ять суміжних ко амінокислот М-кінцевого сегмента пептиду АВ, починаючи із залишку в межах від 1 до З пептиду АВ, де поліпептид не містить С-кінцевого сегмента пептиду АВ. Після цього визначають, чи зв'язується антитіло 60 специфічно з поліпептидом, причому специфічне зв'язування є показником того, що дане антитіло є активним у лікуванні даної хвороби.

В іншому своєму аспекті даний винахід пропонує способи скринінгу антитіла за його активністю у видаленні зв'язаного з антигеном біологічного матеріалу. Такі способи передбачають комбінування зв'язаного з антигеном біологічного матеріалу з антитілом і фагоцитами, що несуть Ес-рецептори у певному середовищі. При цьому 65 ведуть моніторинг кількості зв'язаного з антигеном біологічного матеріалу, що залишається в цьому середовищі.

Зменшення кількості зв'язаного з антигеном біологічного матеріалу є показником того, що дане антитіло здатне видаляти зв'язаний з антигеном біологічний матеріал. Антиген може постачатися у формі зразка тканини або в ізольованій формі. Наприклад, антиген може постачатися у формі зразка тканини із мозку пацієнта, що старждає на хворобу Альцгеймера, або ссавця з патологією Альцгеймера. До інших зразків тканин, по відношенню до яких антитіла можуть бути тестовані на їхню очищувальну активність, належать зразки ракових тканин, зразки вірус-інфікованих тканин, зразки тканин, що містять клітини зони запалення, культури неракових аномальних клітин або зразки тканини, що містять аномальну зовнішньоклітинну матрицю.

Ще в одному своєму аспекті даний винахід пропонує способи виявлення у пацієнта амілоїдних відкладень.

Такі способи передбачають уведення пацієнту антитіла, що специфічно зв'язується з епітопом на проміжку 70 амінокислот 1-10 пептиду АВ, і виявлення наявності цього антитіла в мозку пацієнта. В деяких способах дане антитіло зв'язується з епітопом в межах залишків 4-10 пептиду АВ. В деяких способах антитіло мітять парамагнітною міткою і виявляють його за допомогою ядерно-магнітної резонансної томографії.

Винаходом також пропонуються діагностичні набори, підхожі для застосування у вищезазначених способах.

В таю набори входять антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом в межах залишків 1-10 пептиду АВ. Деякі набори містять інформаційні матеріали з інструкціями щодо використання антитіла в іп мімо діагностиці або моніторингу хвороби Альцгеймера.

Фіг.1. Титр антитіл після ін'єкції АВ1-42 трансгенній миші.

Фіг.2. Амілоїдне навантаження в гіпокампі. Виражена у відсотках частина площі ділянки гіпокампу, зайнята амілоїдними бляшками і визначена за взаємодією з АВ-специфічним моноклональним антитілом 306 шляхом Комп'ютерного кількісного аналізу зображень зрізів мозку в місцях імунних реакцій. Величини, отримані від кожної з піддослідних мишей, показані по групах обробки. Горизонтальна лінія в кожній із груп відповідає середній величині розподілу.

Фіг.3. Нейритна дистрофія в гіпокампі. Виражена у відсотках частина площі ділянки гіпокампу, зайнята дистрофічними нейритами і визначена за Їхньою реакцією на людське АРР-специфічне моноклональне 8Е5 сч об Шляхом кількісного комп'ютерного аналізу зображень зрізів мозку в місцях імунних реакцій. Величини, одержані від кожної з піддослідних мишей подані по групах, одна з яких була оброблена АМ 1792, а інша являла собою (8) контрольну фупу, оброблену фізіологічним розчином РВ5. Горизонтальна лінія в кожній із груп відповідає середній величині розподілу.

Фіг4. Астроцитоз у ретроспленіальному кортикальному шарі. Виражена у відсотках частина площі му

Зо Кортикальної ділянки, зайнята астроцитами з позитивною реакцією на гліальний фібрилярний кислотний білок (СЕАР: аїїа! Яргійагу асідіє ргоїеіпл) і визначена шляхом кількісного комп'ютерного аналізу зображень зрізів -- мозку в місцях імунних реакцій. Величини, одержані від кожної піддослідної миші, показані по групах обробки, с а середні величини в кожній із фуп позначені горизонтальними лініями.

Фіг.5. Середні геометричні титрів антитіл проти АВ1-42 після імунізації низкою із восьми доз АМ 1792 у -- кількостях 0,14, 0,4,1,2, 3,7, 11, 33, 100 або ЗООмкг. со

Фіг.6. Кінетика реакції антитіла на імунізацію АМ 1792. Титри виражені через середні геометричні величини по шести тваринах в кожній групі.

Фіг.7. Кількісний аналіз зображень кортикального амілоїдного навантаження у мишей, оброблених РВЗ і АМ 1792. «

Фіг.8. Кількісний аналіз зображень нейритного бляшкового навантаження у мишей, оброблених РВ5 і АМ1792. ну с Фіг.9. Кількісний аналіз зображень частини (у відсотках) ретроспленіального кортикального шару, зайнятої астроцитозом у мишей, оброблених РВЗ і АМ1792. ;» Фіг.10. Аналіз проліферації лімфоцитів в клітинах селезінки тварин, оброблених АМ 1792 (верхній графію) і оброблених РВ5 (нижній графію).

Фіг.11. Загальні рівні АВ в кортикальному шарі. Діаграма розсіяння індивідуальних профілів АВ у мишей,

Го! імунізованих АВ або похідними АРР у комбінації з ад'ювантом Фрейнда.

Фіг.12. Амілоїдне навантаження в кортикальному шарі, визначене шляхом кількісного аналізу зображень - зрізів мозку в місцях імунних реакцій у мишей, імунізованих АВ-пептидними кон'югатами Ар1-5, Ар1-12 і АВ ко 13-28; фупи тварин, оброблених АВ-афвгатами АМ1792 (АВ1-42) і АМ1528 (АВ1-40) повної довжини, і Контрольній групі тварин, оброблених РВ5. - Фіг.13. Середні геометричні титрів АВ-специфічного антитіла в групах мишей, імунізованих АВ або похідними с АРР у комбінації з ад'ювантом Фрейнда.

Фіг.14. Середні геометричні титрів АВ-специфічного антитіла в групах морських свинок, імунізованих АМ 1792 або його пальмітоїльованою похідною в комбінації з різноманітними ад'ювантами. 5Б Фіг.15 (А-Е). Рівні АВ в кортикальному шарі 12-місячних мишей РОАРР, оброблених АМ 1792 або АМ1528 в комбінації з різноманітними ад'ювантами.

Ф) Фіг.16. Середній титр мишей, оброблених поліклональним антитілом проти АВ. ка Фіг.17. Середній титр мишей, оброблених моноклональним антитілом 1005 проти АВ.

Фіг.18. Середній титр мишей, оброблених моноклональним антитілом 2Е12 проти АВ. во Фіг.19. Епітопна карта: рестриктована М-кінцева імунна відповідь. Сироватка 175-го дня від мавп

Супотоїдиз була піддана твердофазному імуноферментному аналізу (ЕП ІЗА) у порівнянні зі серією 10-мерних пептидів (ЗЕО. ІЮ Мо. 1-41), що перекриваються і охоплюють повну послідовність АМ1792. Тварина за номером

Е10920М показала типову М-кінцеву рестриктовану відповідь на пептид ОАЕРКНОВБОМ (ЕС. ІЮ Мо. 9), що охоплює амінокислоти 1-10 пептиду АМ 1792, використовуваного у якості імунізаційного антигена. 65 Фіг.20. Епітопна карта: нерестриктована М-кінцева відповідь. Сироватка 175-го дня від мавп Супотої/див була піддана аналізу ЕІ ІЗА у порівнянні зі серією 10-мерних пептидів (ЗЕО. ІЮ Мо. 1-41), що перекриваються і охоплюють повну послідовність АМ1792. Тварина за номером Е10975Е показала типову нерестриктовану

М-кінцеву відповідь. Реактивність спостерігається проти двох М-кінцевих і одного С-кінцевого пептидів до пептиду ОАЕРКНОЗОМУ (5ЕО) ІЮ Мо. 9), що охоплює амінокислоти 1-10 пептиду АМ1792.

Термінологія

Термін "суттєва ідентичність" означає, що дві пептидні послідовності, піддані оптимальному вирівнюванню за допомогою, наприклад, програми САР або ВЕЗТРІТ, які в якості параметра за умовчуванням використовують вагові коефіцієнти пробілів, мають принаймні 6595 ідентичність за послідовністю, у кращому варіанті принаймні 8095 або 9095 індентичність, а у ще кращому варіанті принаймні 9595 (наприклад 9995 і більше) ідентичність. /о Бажано, щоб неідентичні положення залишків розрізнювались консервативними заміщеннями амінокислот.

При порівнянні послідовностей, як правило, одна послідовність приймається за еталонну, і з нею порівнюються послідовності, що аналізуються. При застосуванні алгоритму порівняння послідовностей порівнювана й еталонна послідовності вводяться в комп'ютер і, якщо необхідно, задаються координати послідовностей і параметри програми алгоритму послідовностей. Після цього алгоритм порівняння послідовностей обчислює відсоткову ідентичність порювнюваних послідовностей відносно еталонної послідовності на базі заданих параметрів програми.

Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, наприклад, за допомогою алгоритму локальної гомології (Зтійй 5 МУУафептап, Аду. Аррі. Майї. 2:482 (1981)), алгоритму гомологічного порівнювального аналізу |Меедіетап 5: МУуУцпеси, У. Мої. Віої 48:443 (1970)), методу дослідження подібності 2о ІРеагвоп 5 Пртап, Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 85:2444 (1988)), комп'ютеризованого здійснення цих алгоритмів -САР, ВЕЗТЕУТ, ЕАЗТА і ТЕА5ТА у |(М/ізсопвіп Сепеїйісв Зоїймаге РасКаде, Сепеїйїсв Сотршег сгоцр, 575 Зсіепсе

Ог., Мадівзоп, ММ, - а також візуального аналізу |Дизире! еї а, вище) Одним з прикладів алгоритмів, підходящих для визначення відсоткової ідентичності послідовностей і подібності послідовностей, є алгоритм

ВІАБЗТ, описаний в роботі |Айеспці ейфаі(, 9. Мої. Віої. 215:403-410 (1990)). Програмне забезпечення для сч

ВІ АзЗт-аналізів можна придбати в Національному інформаційному центрі з біотехнології (Майопа! Сепіег ог

Віоїесппоіоду Іпіогтайоп (пЕр://Лимлиу.псбрі.піт.пій.доМО|. У порівнювальному аналізі послідовностей, як і) правило, можуть використовуватися параметри програми за умовчуванням, хоч не виключається також застосування параметрів, підібраних для конкретного випадку. Для амінокислотних послідовностей програма

ВІ АТР використовує за умовчуванням довжину слова (МУ) З, очікування (Е) 10 і під рахункову матрицю ю зо ВІОЗзОМБа2, див. |Непікої 8. Непікоїї, Ргос. Маїй). Асай. зсі. ОЗА 89,10915 (1989).

У розрізнюванні консервативних і неконсервативних амінокислотних заміщень амінокислоти поділяються на -- такі групи: Група | (гідрофобні бічні ланцюги) - норлейцин, теї, аїа, маї, Іе), Не; Група І (нейтральні с гідрофільні бічні ланцюги) - суз, зег, (йг; Група Ш (кислотні бічні ланцюги) - азр, дій; Група ІМ (основні бічні ланцюги) - авп, діп, піз, уз, ага; Група М (залишки, що впливають на орієнтацію ланцюгів) - ду, рго; (7 і Група МІ (ароматичні бічні ланцюги) - ігр, їуг, рпе. До консервативних належать заміщення між со амінокислотами одного класу. Неконсервативні заміщення передбачають заміну члена одного з цих класів на член іншого класу.

Терапевтичні агенти за даним винаходом у загальному випадку практично не містять небажаних забруднень.

Це означає, що чистота того чи іншого агента становить принаймні близько 5095 (мас), а також практично не «

Містить білків і забруднень, що взаємодіють. В деяких випадках ці агенти мають чистоту принаймні 80905 (мас), а пт») с у кращих варіантах - принаймні 9095 (мас.) або 9595 (мас.). Але звичайна технологія очищування білків дозволяє й одержувати гомогенні пептиди чистотою принаймні 9995 (мас). ,» Специфічне зв'язування між двома матеріалами означає спорідненість між ними на рівні 102, 107,108109 М" або 1019 М7, Кращими є рівні спорідненості, більші ніж 108 М".

Терміном "антитіло" або "імуноглобулін' охоплюються інтактні антитіла та їхні зв'язувальні фрагменти. (ее) Фрагменти, як правило, конкурують з інтактним антитілом, із якого вони виведені, за специфічне зв'язування з - фрагментом антигена, включаючи відокремлені важкі ланцюги, легкі ланцюги, Бар, Рар'(ар)2, Рарс і ГУ.

Фрагменти одержують за методами рекомбінантних ДНК або шляхом ферментативного чи хімічного розділяння ко інтактних імуноглобулінів. Термін "антитіло" включає у себе також один або більше ланцюгів імуноглобуліну, що шо 90 є хімічно кон'югованими з білками, злитими з іншими білками, або вони експресуються як ці білки. Термін "антитіло" включає у себе також біспецифічне антитіло. Біспецифічне або біфункціональне антитіло являє собою сл штучне гібридне антитіло, яке має дві різні пари важких/легких ланцюгів і два різні сайти зв'язування.

Біспецифічні антитіла можна одержувати у різноманітні способи, включаючи злиття гібридом або зв'язування

Еав' фрагментів, див., наприклад, ІЗоповіміаі 5 І асптапп, Сіїп. Ехр. Іттипої. 79:315-321 (1990); КовієвІпу еї аї,». Іттипої. 148,1547-1553 (1992)). о Найменування АРР 995, АРР! і АРР"7О належать поліпептидам, що кодують людський ген АРР, довжиною відповідно 695, 751 і 770 амінокислотних залишків (Капд еї аїЇ., Маїшге 325, 773 (1987); Ропіе еї аї.. Майшге о 331, 525 (1988); Кіадиснпі еї аЇ., Мате 331,530 (1988). Амінокислоти в амілоїд ному прекурсорному білку (АРР) людини позначені номерами відповідно до послідовності ізоформи АРР79, Назви АВЗ39, АВ40, АВА1, АВ42 60 ідАВ4З стосуються пептиду АВ, що містить амінокислотні залишки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 і 1-43.

Термін "антиген" стосується речовини, з якою специфічно зв'язується антитіло.

Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" стосується сайта в антигені, на який реагують В- і/або

Т-клітини. В-клітинні епітопи можуть утворюватися як зі суміжних, так і з несуміжних амінокислот, суміщених третинною укладкою білка. Епітопи, утворені зі суміжних амінокислот, як правило, витримують дію розчинників, бо що денатурують, у той час як епітопи, утворені третинною складчатістю, як правило, втрачаються при оброблянні такими розчинниками. Епітоп, як правило, містить принаймні 3, а частіше принаймні 5, 8 або 10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Для визначення просторової конформації епітопів застосовуються методи, наприклад, рентгенівської кристалографії і двомірного ядерного магнітного резонансу, диВ., наприклад, ІЕріюре Марріпуд РгоїосоЇїв іп Меїйодз іп Моїесціаг Віоіоду, Мої. 6бб, Сіепп Е. Моїтів, Ева. (1996)). Антитіла, що розпізнають один і тий самий епітоп, можуть бути ідентифіковані за допомогою простого імуноаналізу, що показує здатність одного антитіла блокувати зв'язування іншого антитіла з антигеном-мішенню.

Т-клітини розпізнають безперервні епітопи довжиною приблизно 9 амінокислот у випадку клітин СО8, або приблизно 13-15 амінокислот у випадку клітин СО4. Т-клітини, що розпізнають даний епітоп, можуть бути 7/о ідентифіковані за допомогою аналізу іп мйго, що дозволяє вимірювати антиген-залежну проліферацію згідно з визначенням шляхом включення ЗН-тимідину примованими Т-клітинами ІВигке еї аї., 9). Іпї. Оів. 170, 1110-19 (1994)), антиген-залежним кілінгом (Т-Лімфоцитотоксичний тест |Тіддез еї аїЇ., У. Іттипої. 156, 3901-39101) або секрецією цитокінів.

Терміном "імунологічна" або "імунна" реакція зветься корисна гуморальна (опосередкована антитілом) і/або 75 Клітинна (опосередкована антиген-специфічними Т-клітинами або продуктами їхньої секреції) реакція, спрямована проти амілоїдного пептиду у пацієнта. Така реакція може бути активною, викликаною введенням імуногена, або пасивною, викликаною введенням антитіла або примованих Т-клітин. Клітинна імунна реакція виказує себе поданням антигенних детермінант поліпептидів у сполученні з молекулами МНС (головного комплексу гістосумісності) Класу | або Класу ІІ в активації антиген-специфічних Т-клітин-хелперів СО4" і/або цитотоксичних Т-клітин СО8". Ця реакція може також викликати активацію моноцитів, макрофагів, МК-клітин, базофілів, дендритних клітин, астроцитів, мікрогліальних клітин, еозинофілів та інших компонентів уродженого імунітету. Наявність клітинно-опосередкованої імунологічної реакції можна визначити аналізом проліферації (сС047-Т-клітини) або СТІ (цитотоксичні Т-лімфоцити) аналізом, див. |Вигке, вище; Тідде5, вище). Відповідні вклади гуморальної і клітинної реакцій у захисний або терапевтичний ефект імуногена можуть розрізнюватися с

Шляхом окремого виділення антитіл і Т-клітин у імунізованої сингенної тварини і вимірювання захисного або г) терапевтичного ефекта у іншого ссавця. "Імуногенний агент" або "імуноген' здатний викликати імунологічну реакцію на себе при введенні його ссавцю, якщо потрібно, разом з ад'ювантом.

Термін "відкритий полінуклеотид' стосується полінуклеотида без колоїдальних матеріалів. Відкриті о полінуклеотиди іноді клонуються в плазмідному векторі. «-

Терміном "ад'ювант" зветься сполука, яка при введенні її разом з антигеном підсилює імунну реакцію на цей антиген, але при введенні її одної вона не генерує імунну реакцію на цей антиген. Ад'юванти можуть с підсилювати імунну реакцію декількома механізмами, включаючи рекрутінг лімфоцитів, стимуляцію В- і/або «-

Т-клітин і стимуляцію макрофагів.

Зо Терміном "пацієнт" звуться люди та інші ссавці, що отримують профілактичну або терапевтичну допомогу. со

Дезагрегованим або мономерним АВ зветься розчинна мономерна пептидна одиниця АВ. Одним зі способів приготування мономерного АВ є розчинення ліофілізованого пептиду в чистому ЮОМ5О з опромінюванням ультразвуком. Отримуваний в результаті розчин піддають центрифугуванню для видалення нерозчинних часток. /«Ф

Агрегований АВ являє собою суміш олігомерів, в котрій мономерні одиниці утримуються разом нековалентними зв'язками. З с Конкуренція між антитілами визначається шляхом аналізу, в якому випробуваний імуноглобулін інгібує "» специфічне зв'язування еталонного антитіла зі загальним антигеном, яким є АВ. Відомо багато різноманітних " методів аналізу зв'язування, наприклад, твердофазний прямий або непрямий радіоїмунний аналіз (КІА), твердофазний прямий або непрямий ферментний імуноаналіз (ЕІА), конкурентний сендвіч-аналіз, див. І(-анйії еї а|.,, Меїйоав іп Епгутоіоду 9:242-253 (1983)), твердофазний прямий біотин-авідиновий ЕЇІА аналіз |Кігкіапа еї со аІ.,, У. Іттипої. 137:3614-3619 (1986)), твердофазний прямий аналіз із міченням, твердофазний прямий - сендвіч-аналіз із міченням |Нагіомжм/ апа Іапе, "Апіїбодіез, А Іарогаїюгу Мапиа!" Соій Зргіпд Нагрог Ргезв (1988)), твердофазний прямий КІА аналіз із міченням 1-125 |Могеї! еї аІ., МоЇес. Іттипої. 25():7-15 (1988)|, ю твердофазний прямий біотин-авідиновий ЕІА аналіз |Спецпдо еї аї., Мігоюду 176:546-552 (1990)|) і прямий -ь 20 радіоїмуноаналіз із міченням |МоІдеппацег еї аї., Зсапа. у). Іттипої. 32:77-82 (1990)). В такому аналізі, як правило, застосовується очищений антиген, зв'язаний з твердою поверхнею або клітинами, які несуть немічений сл імуноглобулін, що аналізується, і мічений еталонний імуноглобулін. Конкурентне інгібування вимірюють шляхом визначення кількості мітки, зв'язаною з твердою поверхнею або клітинами при наявності імуноглобуліну, що аналізується. Зазвичай, аналізований імуноглобулін знаходиться у надмірній кількості. Антитіла, 29 ідентифіковані за допомогою конкурентного аналізу (конкуруючі антитіла), включають до свого числа антитіла,

ГФ) котрі зв'язуються з тим самим епітопом, що й еталонне антитіло, і антитіла, котрі зв'язуються з сусіднім епітопом, достатньо близьким до епітопу, зв'язаного еталонним антитілом через виникнення стеричної де перешкоди. Зазвичай, коли конкуруюче антитіло знаходиться у надмірній кількості, воно інгібує специфічне зв'язування еталонного антитіла зі звичайним антигеном, принаймні, на 50 або 7595. 6о Композиції або способи, які "включають у себе" один або більше вищезазначених елементів, можуть містити також інші елементи, які тут не згадувалися. Наприклад, композиція, що містить пептид АВ, охоплює як ізольований пептид АВ, так і пептид АВ, котрий є компонентом більшої поліпептидної послідовності.

Докладний опис винаходу 1. Загальні відомості бо Наявність відкладень пептиду АВ, агрегованого з нерозчинною масою в мозку пацієнта, є характерною ознакою декількох амілоїдогенних хвороб або станів. До таких станів належать хвороба Альцгеймера, синдром

Дауна) когнітивний розлад. Останній є симптомом хвороби Альцгеймера і синдрому Дауна, але може спостерігатися також без інших характерних ознак цих хвороб. Наприклад, м'який когнітивний розлад або пов'язана з віком втрата пам'яті спостерігається у деяких пацієнтів, у яких хвороба Альцгеймера ще не розвинулася або не буде розвинута і в майбутньому. М'яку форму когнітивного розладу можна визначити за схемою Державних психологічних міні-обстежень (Міпі-Мепіа! Зіа(їе Ехат) згідно з конвенцією. Для таких хвороб характерною є наявність агрегатів АВ, які мають р-складчасту шарувату структуру і забарвлюються конго--ервоним. Основоположний підхід У профілактиці або лікуванні хвороби Альцгеймера або інших /о амілоїдогенних хвороб шляхом генерування імуногенної реакції на компонент амілоїдного відкладення у пацієнта описаний у (МО 99/27944| (включеному тут шляхом посилання). Дана заявка повторює і підтверджує ефективність цього підходу, але при цьому вона спрямована, головним чином, на поліпшення застосовуваних при цьому реагентів і способів. Відправним пунктом для цих поліпшень стали проведені авторами дослідження з локалізації кращих епітопів в АВ, проти якого повинна спрямовуватися імуногенна реакція. Ідентифікація кращих /5 епітопів в АВ привела авторів до речовин (агентів) і способів, що підвищують ефективність, зменшують можливість побічних ефектів та полегшують виготовлення, складання препаратів і їх уведення.

ІЇ. Терапевтичні агенти

Імуногенна реакція може бути активною, як у тому випадку, коли імуноген уводиться для індукування антитіл, реактивних щодо АВ у пацієнта, або пасивною, як у тому випадку, коли уведене антитіло саме 2о зв'язується з АВ у пацієнта. 1. Агенти, що викликають активну імунну реакцію

Терапевтичні агенти викликають імунну реакцію, специфічним чином скеровану на певні епітопи в пептидах

АВ. Кращими агентами є сам пептид АВ і його сегменти. Використовуватися можуть також різноманітні варіанти таких сегментів, аналоги і міметики природного пептиду АВ, що індукують антитіла до кращих епітопів пептиду сч дв АВ або вступають з ними у перехресні реакції

Пептид АВ, відомий також як В-амілоїдний пептид або пептид А4 (Патент США Мо4,666,829; СІеппег 8 Ууопа, о

Віоспет. Віорпуз. Кез. Соттип. 120, 1131 (1984)), є пептидом із 39-43 амінокислот, який являє собою головний компонент бляшок, характерних для хвороби Альцгеймера. Пептид АВ продукується шляхом процесінгу крупнішого білка АРР двома ферментами, що звуться В- і у-секретазами ІНагау, ТІМ 20, 154 (1997)). Відомі ю

Зо Мутації в АРР, пов'язані з хворобою Альцгеймера, виникають поблизу сайта В- або у-секретази, або в самому

АВ. Наприклад, положення 717 є найближчим до сайта розщеплення АРР у-секретазою в процессуванні АРР на --

АВ, а положення 670/671 є найближчими до сайта розщеплення В-секретазою. Вважається, що ці мутації Ге зумовлюють хворобу Альцгеймера через взаємодію з реакціями розщеплення, внаслідок чого АВ утворюється таким чином, що кількість 42-43 амінокислотної форми продукованого АВ збільшується. -

Пептид АВ має ту нетривіальну властивість, що він може фіксувати й активувати як класичні, так і (се) додаткові каскади комплементу. Зокрема, він зв'язується з Сід і, у кінцевому рахунку, з СЗБрі. Це об'єднання полегшує зв'язування з макрофагами, призводячи до активації В-клітин. Крім того, СЗБі розпадаються далі і зв'язуються з СК2 на В-клітинах залежним від Т-клітин чином, приводячи до 10000-кратного збільшення активації « цих клітин. Цей механізм зумовлює генерацію АВ в імунній реакції у кількості, більшій, ніж інших атигенів.

АВ має декілька форм природного утворення. Людські форми АВ мають назви АВЗ9, АВ40, АВА1, АВа4?2 і - с АВА43. Послідовності цих пептидів і їх співвідношення з АРР-попередником показані на Фіг.1 в роботі ІНагау еї а аї., ТІМ 20, 155-158 (1997). Наприклад, АВ42 має таку послідовність: "» Н2М-Авр-АїЇІа-СіІШ-РНпе-Аго-Ніз-Азр-Зег-О1у- Туг-сІш-Ма!І-Нів-Нів-СїІп-І уг-І еи-МаІ-Рпе-Рпе-Аіа-СІц-Авр-МаІ-СІу-Зег-Ав п-Ї ув-С1у-АїІа-ІПе-Пе-с1у- ен-Меї-МаІ-СІу-с1Іу-МаІ-Ма!І-ЧПе-АІіІа-ОН (5ЕО. ІЮ Мо. 42).

Пептиди АВ41, АВ40О і АВЗО відрізняються від АВ42 пропуском Аїа, АїІа-Не і Аїа-ІПе-Ма! відповідно від (ее) С-кінця. АВ4ІЗ відрізняється від АВ42 наявністю треонінового залишку на С-кінці. - Імуногенні фрагменти АВ мають переваги над інтактною молекулою, застосовуваною у відомих способах, з декількох причин. Першою з них є те, що оскільки корисну для лікування хвороби Альцгеймера імуногенну ко реакцію в АВ індукують лише певні епітопи, така сама доза (в одиницях маси) фрагмента, що містить такі ж шу 20 епітопи, дає більшу молярну концентрацію корисних імуногенних епітопів, ніж доза інтактного АВ. Другою причиною є те, що певні імуногенні фрагменти АВ генерують імуногенну реакцію проти амілоїдних відкладень, не сл генеруючи при цьому значну імуногенну реакцію проти білка АРР, із якого виведений цей АВ. Третя причина полягає в тому, що фрагменти АВ є простішими у виготовленні, ніж інтактний АВ завдяки їхньому меншому розміру. Четвертою причиною є те, що фрагменти АВ не агрегуються так, як інтактний АВ, що спрощує готування фармацевтичних композицій і їх введення.

Деякі імуногенні фрагменти АВ мають послідовність, принаймні, із 2, 3, 5, 6, 10 або 20 суміжних о амінокислот із природного пептиду. Деякі імуногенні фрагменти мають не більше 10, 9, 8, 7, 5 або З суміжні іме) залишки із АВ. Кращими є фрагменти від М-кінцевої половини АВ. До кращих імуногенних фрагментів належать

АВ1-5, 1-6,1-7, 1-10, 3-7,1-3 і 1-4. Наприклад, позначення АВ 1-5 належить фрагменту, що містить залишки 1-5 60 пептиду АВ і не містить інших його залишків. Особливо кращими є фрагменти, що починаються на залишках 1-3

АВ і закінчуються на залишках 7-11 АВ. Використовуватися також може фрагмент АВ1-12, але він є менш прийнятним. В деяких способах М-кінцевим є цей фрагмент, а не АВ1-10. юІншими менш прийнятними фрагментами є АВІ13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 і 35-42. Ці фрагменти перед тим, як їх використовувати, потребують відбирання (скринінгу) за активністю їх у видаленні або запобіганні виникненню амілоїдних 65 відкладень, як описано нижче в Прикладах. В деяких способах використовуються фрагменти, в яких бракує принаймні 1, а іноді принаймні 5 або 10 С-кінцевих амінокислот, наявних у формах АВ, утворених природним шляхом. Наприклад, фрагмент в якому не вистачає 5 амінокислот від С-кінця АВ4З, містить перші 38 амінокислот від М-кінця АВ. Для індукування імуногенної реакції можуть використовуватися також інші компоненти амілоїдних бляшок, наприклад, синуклеїн і його епітопні фрагменти.

Якщо не зазначено іншого, то позначення АВ охоплює природні людські амінокислотні послідовності, згадані вище, а також їхні аналоги, включаючи алельні варіанти, різновиди й індуковані варіанти. Аналоги, як правило, відрізняються від пептидів, утворених природним шляхом, на одне, два або декілька положень часто внаслідок консервативних заміщень. Аналоги виказують, як правило 8095 або 9095 ідентичність послідовностей з природними пептидами. Деякі аналоги також містять ненатуральні амінокислоти або модифікації М- або 70 С-кінцевих амінокислот в одному, двох чи декількох положеннях. Наприклад, природний залишок аспартанової кислоти в положенні 1 і/або 7 пептиду АВ може бути заміщений ізоаспартановою кислотою. У якості прикладів ненатуральних амінокислот можна назвати ОЮ-амінокислоти, а, а-двозаміщені амінокислоти, М-алкільні амінокислоти, молочну кислоту, 4-гідроксипролін, Г-карбоксиглютамат, Е-М,М,М-триметиллізин, Е-М-ацетиллізин,

О-фосфосерин, М-ацетилсерин, М-формілметіонін, З-метилгістидин, Б-гідроксилізин, Ї -М-метиларгінін та 75 ізослартанову кислоту. Фрагменти та їхні аналоги можуть відбиратися за їхньою профілактичною або терапевтичною ефективністю в трансгенних моделях тварин у порівнянні з необробленими чи обробленими плацебо контрольними особинами, як описано нижче.

АВ, його фрагменти й аналоги можуть одержуватися за методом твердофазного синтезу пептидів або рекомбінантної експресії або ж із природних джерел. У продажу є автоматичні синтезатори пептидів виробництва численних фірм, наприклад, фірми Арріїеа Віозузіетве, Ровіег Сйу, Саїйогпіа. Рекомбінантна експресія може проводитися в бактеріях, наприклад, Е. Соїї, дріжджах, клітинах комах або ссавців. Відповідні методики рекомбінантної експресії описані в ІЗатргооК еї аїЇ., Моїесшаг Сіопіпд. А Іарогаюгу Мапиаї! (С.5.Н.Р. Ргезз, МУ 2а ед., 1989)Ї. У продажу є також деякі форми пептиду АВ (наприклад, фірм Атегісап

Реріїдез Сотрапу, Іпс., Зиппумаіе, СА апа Саїйогпіа Рерііде Кезеагсі, Іпс. Мара, СА). Га

В число терапевтичних агентів також входять довші поліпептиди, які містять, наприклад, активний фрагмент із пептиду АВ разом з іншими амінокислотами. Наприклад, до кращих агентів належать злиті білки, що містять і9) сегмент АВ, злитий з гетерогенною амінокислотною послідовністю, що індукує відповідь Т-клітини-хелпера на гетерологічну амінокислотну послідовність і тим самим відповідь В-клітини на сегмент АВ. Такі поліпептиди можуть відбиратися за їхньою профілактичною або терапевтичною ефективністю на піддослідних тваринах у ю порівнянні з необробленими або обробленими плацебо контрольними особинами, як описано нижче. Пептид АВ, його аналог, активний фрагмент або інший поліпептид можуть уводитися в об'єднаній або мультимерній формі, -- чи в дисоційованій формі. В число терапевтичних агентів також входять мультимери мономерних імуногенних с агентів.

В інших варіантах імуногенний пептид, наприклад, фрагмент АВ може бути поданий вірусом або бактерією як -- частиною імуногенної композиції. При цьому в геном або епісому вірусу чи бактерії може вбудовуватися с нуклеїнова кислота, що кодує імуногенний пептид. Якщо потрібно, то нуклеїнова кислота вбудовується таким чином, щоб імуногенний пептид експресувався як секретований білок або злитий білок зовнішньоповерхневим білком вірусу або трансмембранним білком бактерії так, щоб відображався цей пептид. Віруси або бактерії, « застосовувані в таких способах, повинні бути непатогенними або пригніченими. До числа підходящих вірусів 70 входять аденовіруси, НОМ (вірус простого герпесу), вірус збудника венесуельського енцефаліту та інші - с А-віруси, везикулярний вірус стоматиту та інші рабдовіруси, віруси коров'ячої віспи і пташиної віспи. До й числа підходящих бактерій входять сальмонела і бацила Шига. Особливо прийнятним є продукт злиття "» імуногенного пептиду з НВзАд вірусу НВУ. Теапевтичними агентами можуть бути також пептиди та інші сполуки, подібність амінокислотних послідовностей яких до АВ не обов'язково є суттєвою, але які є міметичними з АВ і 435 індукують подібну йому імунну відповідь. Наприклад, на придатність до застосування можуть відбиратися (ее) пептиди і білки, що утворюють В-складчасті шари. Можуть застосовуватися також антиідіотипові антитіла проти моноклональних антитіл до АВ та інші амілоїдогенні пептиди. Такі анти-И-антитіла імітують антиген і генерують - імунну відповідь на нього |Евззепіїаї Іттипоіоду (Коїй ей., Віаскжеї! Зсіепійіс Рибііїсайоп5, Раю А, б ко ед.), р. 181). Агенти, що не є пептидами АВ, повинні індукувати імуногенну реакцію на один і більше бажаних цу фрагментів АВ, перелічених вище (наприклад, 1-10, 1-7, 1-3 їі 3-7). Краще, якщо такі агенти індукують імуногенну реакцію, яка специфічним чином спрямована на один з цих сегментів і не спрямовується при цьому сл на інші сегменти АВ.

На придатність до застосування можуть відбиратися також рандомізовані бібліотеки пептидів та інших сполук. Можуть створюватися комбінаторні бібліотеки для багатьох типів сполук, які можуть синтезуватися поступовим чином. В число таких сполук входять поліпептиди, міметики бета-оберту, полісахариди, фосфоліпіди, гормони, простагландини, стероїди, ароматичні сполуки, гетероциклічні сполуки, бензодіазепіни,

Ф, олігомерні М-заміщені гліцини й олігокарбамати. Великі комбінаторні бібліотеки сполук можуть бути ко сконструйовані за методом кодованих синтетичних бібліотек (ЕБІ: епсодей зупіНеїйіс Іргагіев), описаним в

І(АПутах, МО 95/12608; АПутах, УМО 93/06121; Соїштбіа Опімегейу, МО 94/08051; Рпаптасореїа, МУО 95/35503; бо Зспрре, МО 95/30642)| включених тут шляхом посиляння для всіх цілей. Пептидні бібліотеки можуть створюватися також за методами відображення фагів, див., наприклад, (Оеміїп, УМО 91/189801.

Комбінаторні бібліотеки та інші сполуки спочатку відбирають за їхньою спроможністю зв'язуватися з антитілами або лімфоцитами (В чи Т), які є специфічними щодо АВ або інших амілоїдогенних пептидів.

Наприклад, початковому скринінгу можуть піддаватися поліклональні сироватки або моноклональне антитіло до 65 АВ або його фрагмент. Після цього сполуки можна відбирати за їхнім зв'язуванням зі специфічним епітопом в АВ (наприклад, 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 і 3-7). Тестування сполук можна проводити за тими ж методиками, що описані для картування специфічностей епітопів антитіл. Сполуки, ідентифіковані шляхом такого скринінгу. після нього піддаються подальшому аналізу на їхню спроможність індукувати антитіла або реактивні лімфоцити до АВ чи його фрагментів. Наприклад, на мікротитрувальних планшетах, покритих перед тим АВ або його фрагментом, можна тестувати численні розчини сироваток, а стандартний аналіз ЕЇІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз) можна. застосовувати для тестування антитіл за їхньою реактивністю щодо АВ або його фрагмента. Після цього сполуки можна тестувати на їхню профілактичну і терапевтичну ефективність на трансгенних піддослідних тваринах, схильних до амілоїдогенних захворювань, як описано нижче в Прикладах.

Такими тваринами можуть бути, наприклад, миші з мутацією 717 білка АРР так, як описано в |(Сатез еї аї., 70 вище), і миші зі шведською мутацією 670/671 АРР, як описано в |МеСопіоднце еї аіІ., 05 5,612,486 апа Нвзіао еї аі., Зсіепсе 274, 99 (1996); е(ашепрієЇ ей аїЇ., Ргос. Май. Асай. сі ОБА 94, 13287-13292 (1997);

ЗіШигспіІег-Ріегтак ей аїЇ, Ртс. Май. Асай. Зсі. ОБА 94, 13287-13292 (1997); Вогспемй еї аїЇ.,, Мецгоп 19, 939-945 (1977))Ї. Така сама методика відбору може застосовуватися і до інших потенційних агентів-аналогів АВ і крупніших пептидів, включаючи фрагменти АВ, описані вище. 2. Агенти, що індукують пасивну імунну реакцію

До терапевтичних агентів згідно з даним винаходом належать також антитіла, що специфічно зв'язуються з

АВ або іншим компонентом амілоїдних бляшок. Такі антитіла можуть бути як моноклональними, так і поліклональними. Деякі з таких антитіл специфічно зв'язуються з агрегованою формою АВ, не зв'язуючись при цьому з його дисоційованою формою. Деякі антитіла специфічно зв'язуються з дисоційованою формою АВ і не го Зв'язуються з його агрегованою формою. Деякі ж антитіла зв'язуються з його як агрегованою, так і дисоційованою формами. Деякі з таких антитіл зв'язуються з утвореною природним шляхом короткою формою

АВ (тобто АВЗ9, 40 або 41), не зв'язуючись при цьому з довгою природною формою АВ (тобто АВ42 і АВ43).

Деякі антитіла зв'язуються з довгою формою і не зв'язуються з короткою формою АВ. Деякі антитіла зв'язуються з АВ, не зв'язуючись при цьому з амілоїдним прекурсорним білком повної довжини. Антитіла, що застосовуються ( об В терапевтичних способах, зазвичай, мають інтактну постійну ділянку або принаймні постійну ділянку, достатню для взаємодії з Ес-рецептором. Кращим тут є людський ізотип ІдсС1, оскільки він має найвищу спорідненість до і) людських ізотипів для ЕсКІ-рецептора на фагоцитних клітинах. Можуть застосовуватися також біспецифічні

Еар-фрагменти, в котрих одне плече антитіла має специфічність до АВ, а інше - до Ес-рецептора. Деякі антитіла зв'язуються з АВ з афінністю зв'язування, що є більшою або дорівнює 105, 107, 108, 109 або 1079 М", ю

Поліклональні сироватки, зазвичай, містять змішані популяції антитіл, що зв'язуються з декількома епітопами по довжині пептиду АВ. Але поліклональні сироватки можуть бути специфічними до певного сегмента --

АВ, наприклад, АВ1-10. Моноклональні антитіла зв'язуються зі специфічним епітопом в АВ, який може бути як Ге конформаційним, так і неконформаційним епітопом. Антитіла можуть бути тестовані на їхню профілактичну і терапевтичну ефективність на трансгенних піддослідних тваринах за методиками, описаними в Прикладах - нижче. Кращі моноклональні антитіла зв'язуються з епітопом на залишках 1-10 АВ (де перший М-кінцевий с залишок природного АВ позначений цифрою 1). Деякі кращі моноклональні антитіла зв'язуються з епітопом на ділянці амінокислот 1-5, а деякі - з епітопом на ділянці 5-10. Деякі кращі антитіла зв'язуються з епітопами на ділянках амінокислот 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 і 3-7. Деякі кращі антитіла зв'язуються з епітопом, починаючи « від залишків 1-3 і закінчуючи на залишках 7-11 пептиду АВ. До менш прийнятних антитіл належать такі, що зв'язуються з епітопами на ділянках залишків 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30 і 10-25 пептиду АВ. 8 с Пропонується, щоб такі антитіла перед тим, як їх використовувати, відбиралися за їхньою активністю на й піддослідних мишах так, як описано в Прикладах нижче. Наприклад, було знайдено, що деяким антитілам до и"? епітопів на ділянках залишків 10-18, 16-24, 18-21 і 33-42 бракує активності. В деяких способах використовуються численні моноклональні антитіла, котрі специфічно зв'язуються з різними епітопами. Такі 75 антитіла можуть уводитися як послідовно, так і одночасно. Можуть застосовуватися також антитіла до інших (ее) амілоїдних компонентів, що не є АВ. Наприклад, антитіла можуть спрямовуватися на амілоїд, зв'язаний з білковим синуклеїном. - Якщо в даному тексті зазначено, що антитіло зв'язується з епітопом в межах специфічних залишків, ко наприклад, АВ1-5, то мається на увазі, що це антитіло специфічно зв'язується з поліпептидом, який містить цу специфічні залишки (тобто у даному прикладі АВ1-5). При цьому зовсім не обов'язково, щоб антитіло контактувало з кожним залишком в межах АВ1-5. Не обов'язково також, щоб кожне заміщення або кожна делеція сл амінокислоти в межах АВ1-5 суттєво впливала на афінність зв'язування. Специфічність антитіла до епітопу може визначатися, наприклад, шляхом утворення бібліотеки відображення фагів, в котрій різні члени відображують різні послідовності АВ. Зі створеної бібліотеки відображення фагів відбирають члени, котрі специфічно

ЗВ'язуються з даним антитілом при тестуванні. Далі відділяють сімейство послідовностей. Таке сімейство, як правило, містить загальну серцевинну послідовність і бічні послідовності різної довжини в різних членах.

Ф, Епітоп, зв'язаний з антитілом, визначається найкоротшою серцевинною послідовністю, що виказує специфічне ко зв'язування з цим антитілом. Антитіла можуть бути також тестовані на епітопну специфічність шляхом конкурентного аналізу за участі антитіла, епітопна специфічність якого вже була визначена. Наприклад, бо антитіла, що конкурують з антитілом ЗОб за зв'язування з АВ, зв'язуються з тим самим або подібним 306 епітопом, тобто в межах залишків АВ1-5. Подібним чином антитіла, що конкурують з антитілом 1005, зв'язуються з тим самим або подібним епітопом, тобто в межах залишків АВЗ3-6. Скринінг антитіл за їхньою епітопною специфічністю дозволяє досить точно прогнозувати терапевтичну ефективність. Наприклад, антитіло, визначене як таке, що зв'язується з епітопом у межах залишків 1-7 АВ, є, очевидно, ефективним у профілактиці і 65 лікуванні хвороби Альцгеймера.

Моноклональні або поліклональні антитіла, що специфічно зв'язуються з бажаним сегментом АВ, не зв'язуючись при цьому з іншими ділянками АВ, мають цілу низку переваг над моноклональними антитілами, що зв'язуються з іншими ділянками або поліклональними сироватками до інтактного АВ. По-перше, за однакових масових доз дози антитіл, що специфічно зв'язуються з бажаними сегментами, містять більш високу молярну дозу антитіл, що є ефективними у видаленні амілоїдних бляшок. По-друге, антитіла, що специфічно зв'язуються з бажаними сегментами, можуть індукувати реакцію видалення проти амілоїдних відкладень, не викликаючи при цьому реакції видалення проти інтактного поліпептиду АРР, знижуючи тим самим можливість виникнення побічних ефектів. і. Загальні характеристики імуноглобулінів 70 Відомо, що базова структурна одиниця антитіла містить тетрамер із субодиниць. Кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один "легкий" (приблизно 25 КОа) і один "важкий" (приблизно 50-70 КОа) ланцюги. Аміно-кінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну ділянку приблизно від 100 до 110 і більше амінокислот, яка є головною відповідальною за розпізнавання антигенів. Карбокси-кінцева частина кожного ланцюга визначає постійну ділянку, що є головною відповідальною /5 за ефекторну функцію.

Легкі ланцюги діляться на капа- і лямбда-ланцюги. Важкі ланцюги діляться на гамма-, мю-, альфа-, дельта- і епсілон-ланцюги, визначаючи ізотили антитіл відповідно як Ід, ІМ, ДА, 9О і ІДЕ. В легких і важких ланцюгах варіабельні і постійні ділянки з'єднуються ")а-ділянкою із приблизно 12 і більше амінокислот, а важкий ланцюг, крім того, містить також "Р"-ділянку із приблизно 10 і більше амінокислот, див. |Гипдатепіаї!

Іттипоіоду (Раш, МУ. ед, 2па ей. Камеп Ргезв, М.У, 1989), СИ. 7) (включеній тут шляхом посилання в усій її повноті для всіх цілей).

Варіабельні ділянки кожної пари із легкого і важкого ланцюгів утворюють сайт зв'язування антитіла. Таким чином, інтактне антитіло має два сайти зв'язування. За винятком біфункціональних або біслецифічних антитіл, ці два сайти зв'язування є однаковими. Всі ланцюги показують однакову загальну структуру із відносно с об Консервативних каркасних ділянок (ЕК: їтатемогк гедіопв), об'єднаних трьома гіперваріабельними ділянками, які звуться також ділянками визначення ккомплементарності або СОМК (сотріетепіагійу аефептіпіпд і) гедіопз)-ділянками. СОК-ділянки із двох ланцюгів кожної пари вишиковуються в ряд каркасними ділянками, створюючи можливість зв'язування зі специфічним епітопом. Від М-кінця до С-кінця обидва ланцюги - легкий і важкий - містять домени ЕК7!, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ і ЕК4. Розподіл амінокислот по цих доменах ю зо відповідає визначенням, даним у (Караї, Зедцепсев ої Ргоїеіпв ої Іттипоіодіса! Іпіегеві (Майопа! Іпвійшев ої Неайй, Веїйезаа, МО, 1987 апа 1991)) або |Споїйіа 5: їевк, У. Мої. Віої. 196:901-917 (1987); СпоїфШіа ей 07 аІ., Майте 342:878-883 (1989)|. с і. Продукування антитіл тварин

Продукування моноклональних антитіл тварин, наприклад, мишей, морських свинок, приматів, кроликів, -- щурів, здійснюється, наприклад, шляхом імунізації тварини пептидом АВ. Можуть застосовуватися також довший со поліпептид, що містить Ар або імуногенний фрагмент АВ, або антиідіотипові антитіла до антитіла проти АВ, див.

ІНагіому 8: І апе, Апііродіевз. А І арогаїогу Мапиа! (С5НР МУ, 1988)| (включеній тут шляхом посилання для всіх цілей). Такий імуноген може бути отриманий із природного джерела, шляхом пептидного синтезу або рекомбінантної експресії. Уводитися пацієнту імуноген може у злитій формі або у формі кон'югату з носійним « білком, як описано нижче. Імуноген можна уводити також разом із ад'ювантом. Застосовувати можна декілька 7) с типів ад'ювантів, як описано нижче. Для імунізації піддослідних тварин кращим є повний ад'ювант Фрейнда, а також, хоча і менш кращим, неповний ад'ювант Фрейнда. Для вироблення поліклональних антитіл, зазвичай, ;» використовуються кропиш або морські свинки. Миші, як правило, використовуються для одержання моноклональних антитіл. Одержані антитіла відбирають за їхнім специфічним зв'язуванням з Ар. У разі потреби антитіла можуть додатково відбиратися за їхнім зв'язуванням зі специфічною ділянкою АВ. Останній скринінг

Го! може бути виконаний визначенням зв'язування антитіла з колекцією делеційних мутантів пептиду АВ і визначенням того, які делеційні мутанти зв'язуються з антитілом. Зв'язування можна оцінювати, наприклад, за - допомогою аналізу за методом вестерн-блотінгу або аналізу ЕПІЗА. Найменший фрагмент, що показує ко специфічне зв'язування з антитілом, визначає епітоп антитіла. Іншим чином епітопну специфічність можна визначати шляхом конкурентного аналізу, в якому випробуване й еталонне антитіла конкурують за зв'язування з - АВ. Якщо між випробуваним і еталонним антитілами відбувається конкуренція, то вони зв'язуються з одним і тим с самим епітопом або однаковими епітопами, близькими один до одного настільки, що зв'язування одного антитіла перешкоджає зв'язуванню іншого антитіла. Кращим ізотипом для таких антитіл є мишачий ізотип Ідс2а або еквівалентний йому ізотип в інших видах. Мишачий ізотип Ідо2а є еквівалентним людському ізотипу досі. ії. Химерні і гуманізовані антитіла

Химерні і гуманізовані антитіла мають однакову або подібну специфічність зв'язування як і миша або інше (Ф, антитіло тварини, що дає вихідний матеріал для конструювання химерного або гуманізованого антитіла. ка Химерними є такі антитіла, гени легких і важких ланцюгів яких сконструйовані, як правило, за допомогою генної інженерії, із сегментів імуноглобулінового гена від різних видів. Наприклад, варіабельні (М) сегменти генів во із моноклонального антитіла миші можуть бути з'єднані з постійними (С) сегментами людини, якими є, наприклад, 91 і 954. Кращим є людський ізотип ІдС! Таким чином, типовим хімерним антитілом є гібридний білок, що складається із М або антиген-зв'язуючого домену із антитіла миші і С або ефекторного домену із антитіла людини.

Гуманізовані антитіла мають каркасні залишки варіабельних ділянок практично із антитіла людини (яке 65 Зветься акцепторним антитілом) і ділянки, що визначають комплементарність, практично із антитіла миші (яке зветься донорним імуноглобуліном), див. (Оцееп еї аіЇ.. Ргос. Май). Асад. Беї БА 86:10029-10033 (1989) апа

МО 90/07861, 05 5,693,762, ОБ 5,693,761, 05 5,585,089, ОБ 5,530,101 апа М/іпіег, О5 5,225,539)| (включені тут шляхом посилання в усій їхній повноті для всіх цілей). Постійні ділянки, якщо вони є, також практично повністью або цілком є із імуноглобуліну людини. Варіабельні домени людини, зазвичай, вибирають із людських антитіл, каркасні послідовності яких показують високий ступінь ідентичності з мишачими доменами варіабельних ділянок, із котрих були виведені СОК. Каркасні залишки варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів можуть виводитися із однакових або різних послідовностей антитіла людини. Послідовностями антитіла людини можуть бути послідовності антитіл людини, що виникають природним шляхом, або консенсусні послідовності декількох антитіл людини, див. ІСапег еї аіІ., МО 92/22653). Деякі амінокислоти серед каркасних залишків варіабельних 7/0 ділянок людини відбирають за заміщенням, виходячи із їхнього можливого впливу на конформацію СОК і/або зв'язування з антигеном. Дослідження цих можливих форм впливу проводять шляхом моделювання, вивчення характеристик амінокислот на особливих ділянках або емпіричних спостережень ефектів заміщення або мутагенезу конкретних амінокислот.

Наприклад, у тому випадку, коли амінокислота каркасного залишку варіабельної ділянки миші відрізняється від амінокислоти відібраного каркасного залишку варіабельної ділянки людини, каркасна амінокислота людини, зазвичай, повинна заміщуватися еквівалентною каркасною амінокислотою із антитіла миші, якщо очікується, що ця амінокислота: (1) встановлює з антигеном прямий нековалентний зв'язок; (2) прилягає до СОК-ділянки; (3) іншим чином взаємодіє з СОК-ділянкою (наприклад, знаходиться від СОК-ділянки на відстані приблизно 6 ангстремів) або (4) бере участь у МІ-МН- взаємодії.

Кандидатами на заміщення можуть бути також каркасні амінокислоти людини-акцептора, які є незвичайними для людського імуноглобуліну в даному положенні. Ці амінокислоти можуть заміщуватися амінокислотами із сч ов еквівалентного положення донорного антитіла миші або із еквівалентних положень більш типових людських імуноглобулінів. Заміщуватися можуть також каркасні амінокислоти людини-акцептора, які є незвичайними для і) людського імуноглобуліну в даному положенні. Каркаси варіабельних ділянок гуманізованих імуноглобулінів, зазвичай, виказують 8595 ідентичність послідовності з каркасною послідовністю варіабельної ділянки людини або консенсус таких послідовностей. ю зо ім. Антитіла людини

Антитіла людини проти АВ можуть бути одержані у різноманітні способи, описані нижче. Деякі антитіла -- людини відбирають шляхом проведення експериментів з конкурентного зв'язування або іншим чином за такою с самою епітопною специфічністю, що й у конкретного антитіла миші, як це описано в Прикладі ХІ для мишачих моноклональних антитіл. Людські антитіла можуть відбиратися також за конкретною епітопною специфічністю, -- зв Використовуючи в якості імуногена лише фрагмент АВ, і/або піддаючи скринінгу антитіла проти колекції со делеційних мутантів АВ. У кращому варіанті людські антитіла мають ІдДС1 людини з ізотипною специфічністю. (І) Триома-методологія

Базовий підхід і типовий партнер 5РА72-4 у злитті клітин для застосування в цьому способі був описаний в роботах |Оевзірего еї аї., Нубгідота 2:361-367 (1983); Оезірегд, О.5. Раїепі Мо. 4,634,664; апа Епдіетап еї « 81, 05 Раїепі 4,634,666) (включених тут шляхом посилання в усій їхній повноті для всіх цілей). Отримувані в з с цей спосіб клітинні лінії, що продукують антитіла, звуться триомами, оскільки вони походять від трьох клітин - двох людських і однієї мишачої. Згідно з цим способом спочатку лінію мієломи миші зливають з людським ;» В-лімфоцитом, одержуючи ксеногенну гібридну клітину, що не продукує антитіла, якою є, наприклад, клітинна лінія ЗРА2-4, описана в (Оезірегуд еї аїЇ., вище). Після цього ксеногенну клітину зливають з імунізованим людським В-лімфоцитом, отримуючи триома-клітинну лінію, що продукує антитіла. Було встановлено, що триоми

Го! продукують більш стабільні антитіла, ніж звичайні гібридоми, приготовані із людських клітин.

Імунізовані В-лімфоцити отримуються з крові, селезінки, лімфовузлів і кісткового мозку людини-донора. - Якщо потрібні антитіла проти специфічного антигена або епітопу, то для імунізації бажано застосовувати цей ко антинген або його епітоп. Імунізацію можна здійснювати як іп мімо, та і іп міго. Для імунізації іп мімо

В-клітини, зазвичай, виділяють у людини, імунізованої Ар, його фрагментом, крупнішим поліпептидом, що містить - АВ або його фрагмент, чи антиідіотиповим антитілом до антитіла проти АВ. В деяких способах В-клітини сп виділяють у того самого пацієнта, якого лікують шляхом уведення антитіла. У випадку імунізації іп мйго

В-лімфоцити, як правило, обробляють антигеном протягом 7-14 днів у такому середовищі, як КРМІ-1640, див. (Епаіетап, вище), доповненому 1095 людської плазми.

Імунізовані В-лімфоцити зливають із ксеногенною гібридною клітиною, наприклад, ЗРА7-4 за допомогою добре відомих способів. Наприклад, ці клітини піддають оброблянню 40-5095 поліетиленгліколем молекулярною

Ф) масою 1000-4000 при температурі приблизно 372С протягом 5-10 хвилин. Клітини відділяють від суміші злиття ко і розподіляють у середовищі, що є селективним стосовно бажаних гібридів (наприклад, НАТ або АН). Клони, що секретують антитіла з потрібною специфічністю зв'язування, ідентифікуються шляхом аналізу середовища бо триома-культури на здатність до зв'язування з АВ або його фрагментом. Людські антитіла, що продукують триоми і мають бажану специфічність, піддають субклонуванню у спосіб обмеженого розведення і вирощуються іп міго в культурному середовищі. Одержані таким чином триома-клітинні лінії випробують на здатність до зв'язування з АВ або його фрагментом.

Хоча триоми є генетично стабільними клітинними лінями, вони не продукують антитіла на дуже високих б5 рівнях. їхні рівні експресії можна підвищити шляхом клонування генів антитіл із триом в один чи більше векторів експресії і трансформування цього вектора у стандартні клітинні лінії ссавцій, бактерій або дріжджів.

(2) Трансгенні ссавцнтварини

Людські антитіла проти Ар можуть бути одержані також із трансгенних ссавців-тварин, що мають трансгени, які кодують принаймні один сегмент локусу імуноглобуліну людини. Зазвичай, ендогенний імуноглобуліновий локус таких трансгенних тварин є функціонально неактивованим. Краще, якщо сегмент локусу імуноглобуліну людини містить непереупорядковані послідовності важких і легких ланцюгових компонентів. Як інактивація ендогенних імуноглобулінових генів, так і вбудовування екзогенних імуноглобулінових генів можуть здійснюватися шляхом скерованої гомологічної рекомбінації або вбудовування МАС-хромосом. Трансгенні ссавці після такої обробки здатні функціонально переупорядковувати послідовності імуноглобулінових 7/0 Компонентів і експресувати популяцію антитіл різних ізотипів, кодованих імуноглобуліновими генами людини, не експресуючи при цьому ендогенних імуноглобулінових генів. Продукування і властивості ссавців з такими характеристиками описані докладно, наприклад, в (опрегод еї аї.,, МУ093/12227 (1993); 5 5,877,397, 05 5,874,299, ОБ 5,814,318, 05 5,789,650, 05 5,770,429, 05 5,661,016, 05 5,633,425, 05 5,625,126, 05 5,569,825,

ОБ 5,545,806, Маїшге 148, 1547-1553 (1994), Маїшге Віоїесппоіоду 14, 826 (1996), Киспегіарай, УМО 91/10741 75. А1991)) (включених тут шляхом посилання в усій їхній повноті для всіх цілей). Особливо підходящими для цієї ролі є трансгенні миші. Антитіла проти Ар одержуються шляхом імунізації трансгенної тварини-ссавця так, як описано в (опрего, або Киспегіараїйі, див. вище), пептидом Ар або його фрагментом. Моноклональні антитіла готують, наприклад, шляхом злиття р-клітин від таких тварин з відповідними клітинними лініями мієломи за звичайною технологією Колера-Мільштайна (КопПіег-Міївівіп). Поліклональні антитіла людини також можна го одержувати у формі сироватки від людей, імунізованих імуногенним агентом. Якщо необхідно, то такі поліклональні антитіла можуть бути концентровані шляхом афінного очищування з використанням Ар або іншого амілоїдного пептиду в якості афінореагенту. (3) Фаговідображувальні способи

Одержувати людські антитіла проти Ар можна також шляхом скринінгу бібліотеки ДНК із В-клітин людини сч ов Відповідно до загального протоколу, запропонованого в |Низе еї аї., Зсіеєпсе 246:1275-1281 (1989)). Як ї у випадку триома-методики, такі В-клітини можна одержувати від людини, імунізованої АВ, його фрагментами, (8) довшими поліпептидами, що містять АВ або його фрагменти, чи антиідіотиповими антитілами. У разі потреби такі

В-клітини одержують від пацієнта, який буде піддаватися лікуванню антитілами. Для цього відбирають антитіла, що зв'язуються з АВ або його фрагментом. Після цього клонують і ампліфікують послідовності, що кодують такі ю зо антитіла (або зв'язувальні фрагменти). Протокол, описаний Хьюзом (Низе) стає більш ефективним в комбінації з фаговідображувальним способом, див., наприклад, |Оомег еї аї.,, УМО 91/17271 апа МсСайепу егоаі, МО С- 92/01047, 05 5,877,218, 05 5,871,907, 05 5,858,657, 05 5,837,242, 05 5,733,743 апа 05 5,565,332| (включені су тут шляхом посилання в усій їхній повноті і для всіх цілей). В цих способах готують фагові бібліотеки, члени яких на зовнішніх поверхнях відображують різноманітні антитіла. При цьому антитіла, як правило, -- відображуються як Ем або Рар-фрагменти. Фаговідображуючі антитіла з бажаною специфічністю відбирають за со збільшенням афінності до АВ-пептиду або його фрагменту.

Один із варіантів фаговідображувального способу дозволяє продукувати людські антитіла зі специфічністю зв'язування вибраного мишачого антитіла (М/іпіег, УМО 92/207911. У цьому способі в якості вихідного матеріалу використовується варіабельна ділянка важкого або легкого ланцюга відібраного мишачого антитіла. Якщо, « 70 наприклад, у якості вихідного матеріалу вибирається варіабельна ділянка легкого ланцюга, то конструюють в с фагову бібліотеку, члени якої відображують таку саму варіабельну ділянку легкого ланцюга (тобто мишачий вихідний матеріал) і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що відрізняється від неї. Важколанцюгові ;» варіабельні ділянки одержують із бібліотеки переупорядкованих важколанцюгових варіабельних ділянок людини.

Відбирають фаг, що виказує сильне специфічне зв'язування з АВ (наприклад, принаймні 10 8, а краще, якщо принаймні 109 М"). Важколанцюгова варіабельна ділянка людини із цього фага служить у якості вихідного (ее) матеріалу для конструювання наступної фагової бібліотеки. В цій бібліотеці кожний фаг відображує таку саму - важколанцюгову варіабельну ділянку (тобто ділянку, ідентифіковану із першої відображувальної бібліотеки) і легколанцюгову варіабельну ділянку, що від неї відрізняється. Легколанцюгові варіабельні ділянки одержують із ко бібліотеки переупорядкованих варіабельних легксоланцюгових ділянок людини. | знову відбирають фаги, що щу 20 виказують сильне специфічне зв'язування з АВ. Ці фаги відображують варіабельні ділянки повністю людських антитіл проти АВ. Ці антитіла, зазвичай, мають однакову або подібну до мишачого вихідного матеріалу епітопну сл специфічність.

М. Селекція постійної ділянки

Важколанцюгові і легксоланцюгові варіабельні ділянки химерних, гуманізованих або людських антитіл можуть бути зв'язані принаймні з частиною постійної ділянки людини. Вибір постійної ділянки залежить частково від того, чи є бажаними антитіло-залежне доповнення і/або клітинно-опосередкована токсичність. Наприклад, о ізотипи ІДС1 і (0053 мають комплементарну активність, а ізотипи Ідс2 | Ідс4 її не мають. Вибір ізотипу може іме) також впливати на перехід антитіла в мозок. Кращим є людський ізотип ІдС! Легколанцюгові постійні ділянки можуть бути лямбда- або капа-ділянками. Антитіла можуть експресуватися як тетрамери, що містять два легких і 60 два важких ланцюги, такі роздільні важкі ланцюги і легкі ланцюги, як Бар, Рар' Р(абв)2 і гм, або як однолацюгові антитіла, в котрих важколанцюгові і легколанцюгові варіабельні домени зв'язані через спейсер. мі. Експресія рекомбінантних антитіл

Химерні, гуманізовані і людські антитіла, як правило, отримують шляхом рекомбінантної експресії.

Рекомбінантні полінуклеотидні конструкти, як правило, містять послідовність контролю експресії, оперативно б5 зв'язану з кодуючими послідовностями ланцюгів антитіл, включаючи об'єднані природним шляхом або гетерологічні промоторні ділянки. У кращому варіанті послідовностями контролю експреси є еукаріотичні промоторні системи у векторах, здатних трансформувати або трансфектувати еукаріотичні клітини-хазяїни. Як тільки вектор вбудовується у відповідного хазяїна, останній підтримується в умовах, підходящих для високого рівня експресії нуклеотидних послідовностей збирання й очищення антитіл, що взаємодіють перехресним чином.

Ці вектори експресії як правило, можуть реплікуватися в організмах-хазяїнах чи як епісоми, чи як інтегральна частина хромосомної ДНК-хазяїна. У загальному випадку вектори експресії містять селекторні маркери, наприклад, ампіцилін-резистивність або гідроміцин-резистивність, для того, щоб дозволити на виявлення клітин, трансформованих бажаними ДН "-послідовностями.

Е. соїї є одним з прокаріотичних хазяїнів, особливо підходящих для клонування ДНК-послідовностей за даним /о винаходом. Застосовувати для експресії можна також мікроби, наприклад, дріжджі. Кращими дріжджами-хазяїнами є сахароміцети з відповідними векторами, що мають послідовності контролю експреси, ориджин-реплікації, кінцеві послідовності і т.п. До числа типових промоторів належать З-фосфогліцераткіназа та інші гліколітичні ферменти. До числа дріжджових промоторів, що індукуються, належать, поряд з іншими, промотори із алкогольдегідрогенази, ізоцитохрому С і ферментів, відповідальних за використання мальтози і /5 гапактози.

Кращими для експресії нуклеотидних сегментів, що кодують імуноглобуліни або їхні фрагменти, є клітини ссавців (М/іппасКег, ГРгот Сепез о Сіопез, (МСН Рибіїзпегв, МУ, 1987)). Була розроблена ціла низка підходящих ліній клітин-хазяїнів, здатних секретувати інтактні гетерологічні білки - СНо-клітинні лінії, різноманінті

Со5-клітинні лінії, Неї а-клітини, І-клітини і лінії клітин мієломи. Краще, якщо ці клітини не є клітинами людини. В число векторів експресії для цих клітин входять послідовності контролю експресії, якими є ориджин-реплікації, промотор, енхансер (Оцееп еї а!, Іттипої. Кему. 89:49 (1986))| і необхідні інформаційні сайти процесінгу, якими є сайти зв'язування рібосоми, сайти сплайсінгу РНК, сайти поліаденілювання і послідовності завершення транскрипції. Кращими послідовностями контролю експресії є промотори, виведені із ендогенних генів, цитомегаловірусу, 5М-40, аденовірусу, вірусу бичачої папіломи і под. |Со еї аї., 5. сч г Іттипої. 148:1149(1992)).

В альтернативному варіанті послідовності кодування антитіл можуть вбудовуватися в трансгени для і) введення в геном трансгенної тварини і наступної експресії в молоці трансгенної тварини див., наприклад, патенти США (5 5,741,957, ОБ 5,304,489, 5 5,849,9921. Підходящими трансгенами є кодувальні послідовності для легких і/або важких ланцюгів в оперативному зв'язуванні з промотором і енхансером зі специфічного гена ю зо залози ссавця, яким є, наприклад, казеїн або бета-лактоглобулін.

Вектори, що містять потрібні ДНК-сегменти, можуть бути перенесені до клітини-хазяїна у добре відомі -- способи залежно від типу клітини-хазяїна. Наприклад, для прокаріотичних клітин, зазвичай, застосовується с трансфекція хлоридом кальцію, а для інших клітин-хазяїнів можна застосовувати обробку фосфатом кальцію, електропорацію, ліпофекцію, біолістичну трансфекцію або трансфекцію на базі вірусів. Для трансформації клітин 87 ссавців можуть застосовуватися також полібрен, злиття протопластів, ліпосоми, електропорація і мікроін'єкція, со див. (ЗатргооК еї аі., вище)| У продукуванні трансгенних тварин трансгени можуть уводитися шляхом мікроін'єкцій в запліднені ооцити або можуть уводитися в геном ембріональних стовбурових клітин, а ядра таких клітин можуть бути перенесені до енуклеованих ооцитів.

Антитіла після їх експресії можна очищувати за стандартними методами і, у тому числі, рідинної « хроматографії високої розрізнювальності, колончастої хроматографії, гель-електрофорезу, тощо, див. Ше) с наприклад, (Зсоревз, Ргоїевіп Ригіїсайоп (Зргіпдег-Мегіад, МУ, 19821.

З. Білки-носії ;» Деякі агенти для індукування імунної реакції містять відповідний епітоп для індукування імунної реакції проти амілоїдних відкладень, але вони занадто малі для того, щоб бути імуногенними. У цій ситуації пептидний імуноген може бути зв'язаний з відповідним носієм, щоб допомогти йому викликати імунну відповідь.

Го! Підходящими для цього носіями є сироваточні альбуміни, гемоціанін лімфи равлика, молекули імуноглобуліну, тироглобулін, овальбумін, правцевий токсин, токсини від інших патогенних бактерій, наприклад, дифтерії, Е. - Соїї, холери, Н. руїогі або атенуйовані похідні токсинів. Носіями можуть бути також Т-клітинні епітопи, що ко зв'язуються з численними алелями головного комплексу гістосумісності, наприклад, зі 7595 всіх алелей головного 5р Комплексу гістосумісності людини. Такі носи іноді називають універсальними "Т-клітинними епітопами". У якості - прикладів універсальних Т-клітинних епітопів можна назвати: с - гемаглутинін інфлюенції: НАзо-з19 РКУУКОМТІ КІГ АТ (ЗЕО. ІО Мо. 43); - РАОКЕ (загальні залишки, виділені жирним шрифтом) АКХУМААМУТІ КААА (5ЕО). ІЮ МО. 44); - малярія С5: ТЗ-епітоп ЕККІАКМЕКАЗЗМЕММ (5ЕО). ІЮ Мо. 45); 5Б - поверхневий антиген гепатиту В: НВзА949-28 ЕЕГ ТАТІ (ЗЕО. ІО Мо. 46); - білок 65 теплового шоку: пзрбо5453171 ООБІСООАЕАМОКМОМЕС (ЕС. ІЮ Мо. 47);

Ф) - бацила СаІтеке-Сцегіп: ОМНЕОРІ РРАМУКІ. (ЗЕО. ІЮ Мо. 48); ка - правцевий токсин: ТТвзо-вляя ОХІКАМЗКРЇІСІТЕЇГ. (ЗЕС). ІЮ Мо. 49); - правцевий токсин: ТТод7ов7 ЕММЕТМЗЕУМ КМРКУЗАЗНІ Е (ЗЕО. ІО Мо. 50); 60 - вірус ВІЛ др120 Т1: КОПММУУ/ОЕМОКАМТА (ЗЕО). І Мо. 51);

У якості носіїв для стимулювання або підсилення імунної відповіді можна застосовувати цитокіни, наприклад, 1-1, 1-1 о- і В-пептиди, 1-2, Г-ІМЕ, 1-10, 5М-С5Е, і хемокіни, наприклад, МІРІ А і В ії КАМТЕ5.

Імуногенні агенти можна також зв'язувати з пептидами, що підсилюють транспортування крізь тканини, як описано в |(О"Мапопу УУО 97/17613 і УМО 97/17614). 65 Імуногенні агенти можна зв'язувати з носіями шляхом хімічного зшивання. Для зшивання імуногена з носієм застосовуються способи утворення дисульфідних зв'язків за допомогою

Мосукцинімідил-3-(2-піридилтіо)пропіонату (5РОР) і сукцинімідил-4-(Мо малеїімідометил)циклогексан-1-карбоксилату (ЗМСС) (якщо пептиду бракує сульфгідрильної групи, то ЇЇ наявність можна забезпечити добавленням цистеїнового залишку). Ці реагенти утворюють дисульфідний зв'язок між ними і цистеїновими залишками пептиду на одному білку і амідний зв'язок через Е-аміно на лізині, чи через іншу вільну аміногрупу в інших амінокислотах. Різноманітні агенти, що утворюють дисульфід/амідні зв'язки, описані в (ттип. Кем. 62, 185 (1982)). Інші біфункціональні зв'язувальні агенти утворюють тіоефірний, а не дисульфідний зв'язок. Багато з таких тіоефір-утворювапьних агентів є у продажу, і серед них можна назвати хімічно активні ефіри б-малеіїмідокапронової кислоти, 2-бромоцтової кислоти і 2-йодоцтової кислоти, 70 4-(М-малеіїмідометил)циклогексан-1-карбонової кислоти. Карбоксильні групи можна активувати шляхом комбінування з їх сукцинімідом або 1-гідроксил-2-нітро-4-сульфокислотою, сіллю натрію.

Імуногенні пептиди можуть також бути експресовані як злиті білки з носіями (тобто гетерологічні пептиди).

Імуногенний пептид може бути зв'язаний з носієм на своєму аміно-кінці, карбокси-кінці або на обох кінцях.

Якщо необхідно, то у злитому білку можуть бути наявними численні повтори імуногенного пептиду. Імуногенний /5 пептид може зв'язуватися з багатьма копіями гетерологічного пептиду, наприклад, на М- і на С-кінцях пептиду.

Деякі пептиди-носії служать для індукування відповіді Т-клітин-хелперів проти пептиду-носія. Індуковані

Т-клітини-хелпери, у свою Чергу, викликають В-клітинний відгук на імуногенний пептид, зв'язаний з пептидом-носієм.

Деякі агенти за даним винаходом містять злитий білок, в якому М-кінцевий фрагмент АВ зв'язаний з 2о пептидом-носієм на своєму С-кінці В таких агентах М-кінцевий залишок фрагмента АВ становить собою

М-кінцевий залишок злитого білка. Таким чином, такі злиті білки спроможні ефективно індукувати антитіла, що зв'язуються з епітопом, який потребує, щоб М-кінцевий залишок пептиду АВ знаходишся у вільній формі. Деякі агенти за даним винаходом містять численні повтори М-кінцевого сегмента АВ, зв'язаного на С-кінці з однієї чи більше коліями пептиду-носія. М-кінцевий фрагмент пептиду АВ, вбудований в такі злиті білки, іноді сч об починається на АВ1-3 і закінчується на АВ7-11. Кращими М-кінцевими фрагментами АВ є АВ1-7, АВ1-3, АВ1-4, 1-5 ії 3-7. Деякі злиті білки містять різні М-кінцеві сегменти АВ в тандемі. Наприклад, злитий білок може (8) містити АВ1-7, за яким слідує АВ1-3, за яким, у свою чергу, йде гетерологічний пептид.

В деяких злитих білках М-кінцевий сегмент АВ злитий на його М-кінці з гетерологічним пептидом-носієм. Ті ж самі різновиди М-кінцевих сегментів АВ можуть використовуватися як з С-кінцевими злиттями. Деякі злиті ю зо білки містять гетерологічний пептид, зв'язаний з М-кінцем М-кінцевого сегмента АВ, який у свою чергу зв'язаний з одним чи більше додаткових М-кінцевих сегментів АВ в тандемі. -

Нижче розглядаються деякі приклади злитих білків, підходящих для застосування у даному винаході. Деякі з с цих злитих білків містять сегменти АВ, зв'язані з епітопами правцевого токсину, як описано в (05 5,196,512,

ЕР 378,881 і ЕР 427,347). Деякі злиті білки містять сегменти АВ, зв'язані з пептидами-носіями, описаними в -- патенті США 5,736,142. Деякі гетерологічні пептиди являють собою універсальні Т-клітинні епітопи. В деяких со способах призначений для введення пацієнту агент являє собою простий одинарний злитий білок з

АВ-сегментом, зв'язаним з гетерологічним сегментом у лінійній конфігурації. В деяких способах агентом є мультимер злитих білків, що визначається як 2 Х, де х - ціле число від 1 до 5. У кращих варіантах х - 1,2, «

З, серед яких найкращим є х - 2. При значенні х - 2 такий мультимер має чотири злиті білки, зв'язані у кращій конфігурації, що зветься МАРА, див. патент США (05 5,229,490). Епітопи АВ підкреслені. - с Нижче показана конфігурація МАРА, де розгалужені структури одержують шляхом ініціації пептидного синтезу ц як на М-кінці, так і на амінах бічного ланцюга лізину. Лізин з різною кратністю вбудовується в послідовність "» і одержує змогу відгалужуватися, утворюючи структуру з численними М-кінцями. У даному прикладі на розгалуженому лізиновмісному стрижні утворено 4 ідентичних М-кінця. Така множинність значно збільшує реактивність споріднених В-клітин. (ее) - Рербдечн

З косо - рай

Б сл Реріїде КА й

Реріїде ш-- рай о ко їй Рерііде -К-КхО 60

АМОО0549 (АВ 1-7/правцевий токсин 830-844 в конфігурації МАР4): ОАЕРЕКНООМІКАМЗКАКОСІТЕЇ (ЗЕО. ІЮ Мо. 52)

АМОО550 (АВ 1І-7/правцевий токсин 947-967 в конфігурації МАР4): ОМХЕРЕКНОЄММЕТУЗЕУММІ КМРКМ5АЗНІ Е (ЗЕО. ІО Мо. 53) бо АМОО0542 (АВ 1-7/правцевий токсин 830-844 ня 947-967 в лінійній конфігурації):

РАЕРКНООХУІКАМЗКРЇІСІТЕ ЕММЕТУЗРУМ КМРКМЗАЗНІ Е (ЗЕО. ІЮО Мо. 54)

АМОО0576: (АВ 3-9/правцевий токсин 830-844 в конфігурації МАР4): ЕЕКНОЗСОМІКАМЗКРЇІСІТЕЇГ (ЗЕО. ІЮ Мо.

Пептид, описаний в патенті США Мо5,736,142 (все в лінійній конфігурації): АМО90562 (АВ1-7/пептид)

АКХМААМ/ТІ КАААВВАЕРКНО (ЗЕО. ІО Мо. 56) АМОО543 (АВІ-7 х З/пептид):

РАЕРКНОВАЕРКНОСАЕРКНОСАКХМААММТІ КААА (ЗЕ. ІЮ Мо. 57)

У якості прикладів злитих білків (муногенний епітоп пептиду АВ виділений жирним шрифтом) можна навести:

АКХМААМ/ТІ КААА-ПАЕРКНО-ВОАЕРКНО-ОАЕРКНО (5ЕО. ІЮО Мо. 58) 70 РАЕРКНО-АКХМУААМУТІ КААА (5ЕО). ІЮ Мо. 59)

ВАЕРКНО-ІЗОАМНААНАЕБІМЕАСОК (ЕС). ІЮО Мо. 60)

ЕКНОБЗОТУ-ІЗОАМНААНАБЕЇІМЕАСОК (5ЕО. ІЮ Мо. 61)

ЕРКНОБЗО-ІЗОАМНААНАБЕЇІМЕАСОК (5ЕО. ІЮ Мо. 62)

РКУУКОМТІ КІ АТ-ОАЕРКНО-ВОАЕРКНО-ОАЕРКНО (5ЕО. ІО Мо. 63)

ВАЕРКНО-РКУМКОМТІ КІ АТ-ПАЕРКНО (5ЕО. ІЮО Мо. 64)

ВАЕРКНО-ОАЕРКНО-ООАЕРКНО-РКУМКОМТІ КІ АТ (5ЕО. І Мо. 65)

РАЕРКНО-ПАЕРКНО-РКУМУКОМТІ КІ АТ (ЗЕО. ІЮ Мо. 66)

ВАЕРКНО-РКЮМУКОМТІ КГАТ-ЕККІАКМЕКАЗЗМЕММ-ОМІКАМЗКЕІСІТЕС-ЕММЕТМЗРЕУМСАМРКУМЗАЗНІ Е-ПОАЕБРК

НО (ЗЕО. ІО Мо. 67)

ВАЕРКНО-ПАЕРКНО-АОАЕРКНО-ОМІКАМЗКЕРЕІСІТЕГ-ЕММЕТМЗЕУМ КМРКМЗАЗНІ Е (ЗЕ. ІО Мо. 68)

РАЕРКНО-ОМІКАМЗКРІСІТЕ СЕММЕТУЗЕУМІ КЕУМРКМЗАЗНІ Е (ЗЕО. ІЮ Мо. 69)

РАЕРКНО-ОМІКАМЗКРІСІТЕ СЕММЕТУЗЕУМ КМРКУМЗАЗНІ Е-СЛАЕРКНО (5ЕО. ІЮ Мо. 70)

РАЕРКНО-ОМІКАМЗКРЇІСІТЕЇГ. (ЗЕО. ІЮ Мо. 52) на 2-гілчастій смолі с 7 реріїде о ра (С уз-Сіу-буз ви 30 . еріде т р с «-

ЕОМТММОСБАІЗОАУНААНАЕІМЕАО (5ЕО. ІО Мо. 71) (злітий білок синуклеїну в конфігурації МАР-4)

Зо Такі самі або подібні білки-носії і способи зв'язування можуть застосовуватися для генерування со імуногенів, призначених для продукування антитіл проти АВ, застосовуваних у пасивній імунізації. Наприклад,

АВ або його фрагмент, зв'язаний з носієм, може вводитися піддослідній тварині для продукування моноклональних антитіл проти АВ. « 4. Нуклеїнові кислоти, що кодують терапевтичні агенти

Імунні реакції проти амілоїдних відкладень можуть індукуватися також уведенням нуклеїнових кислот, які З с кодують сегменти пептиду АВ і його фрагменти, імуногени інших пептидів або антитіла і їхні складові ланцюги, "» що застосовуються для пасивної імунізації. Такими нуклеїновими кислотами можуть бути як ДНК, так і РНК. " Нуклеїнокислотний сегмент, що кодує імуноген, зазвичай, зв'язаний з регуляторними елементами, якими є промотори і енхансери, що дозволяють експресувати ДНК-сегмент в призначених для цього клітинах-мішенях пацієнта. У випадку експресії в клітинах крові, що є бажаним для індукування імунної відповіді, підходящими со для прямої експресії є промоторні й енхансерні елементи із легколанцюгових або важколанцюгових - імуноглобулінових генів або СММ головні проміжні ранішні промотор і енхансер. Зв'язані регуляторні елементи і кодуючі послідовності часто клонуються у вектор. Для введення дволанцюгових антитіл обидва їхні ланцюги о можуть бути клоновані в одному і тому ж або роздільних векторах. -о 70 У продажу є численні вірусні і векторні системи, включаючи ретровірусні системи, див., наприклад, | амгіе апа Титіп, Сиг. Оріп. Сепеї ЮОемеІор. З, 102-109 (1993)), аденовірусні вектори, див., наприклад, ІВей еї аї., сл У. Мігої. 67, 5911 (1993)), адено-асоційовані вірусні вектори, див., наприклад, (ло еї аї., У. Ехр. Меад, 179, 1867 (1994)), вірусні вектори родини сифілісних, включаючи вірус коров'ячої віспи і віруси пташиної віспи, вірусні вектори роду альфа-вірусів, якими є виведені із вірусів Зіпаріз і Зетіїкі лісний, див., 22 наприклад, (ОирепеКку еї аї., .. Міго!ї. 70, 508-519 (1996)), вірус венесуельського конячого енцефаліту, див.

ГФ) патент США (5 5,643,576), рабдовіруси, одним з яких є вірус везикулярного стоматиту, див., наприклад, (МО 96/34625| і віруси папіломи (Опе еї аіЇ.. Нитап Сепе ТПегару С, 325-333 (1995); М/со еї аі.,, МО 94/12629; Хіао 5 де Вгапазта, Мисіевїс Асідв. Кевз. 24,2630-2622 (1996)).

ДНК, що кодує імуноген, або вектор, який її містить може впаковуватися в ліпосоми. Підходящі для цього 60 ліпіди і відповідні аналоги описані в патентах США (ОБ 5,208,036; 5,264,618; 5,279,833; 5,283,185). Вектори і

ДНК, що кодують імуноген, можуть також адсорбуватися на порошкових носіях або зв'язуватися з ними; в якості таких носіїв можуть застосовуватися полімери поліметилметакрилату, полілактиди і полі(лактид-співгліколіди), див., наприклад, (Месоее еї аї., У. Місто Епсар. (1996).

Вектори генної терапії або відкриті ДНК можуть постачатися в організм пацієнта іп мімо шляхом уведення, бо зазвичай, у способи системного введення (наприклад, внутрішньовенно, інтраперитонеально, інтраназанально,

через шлунок, інтрадермально, внутрішньом'язово, субдермально або інтракраніальною інфузією) або шляхом місцевої аплікації, див., наприклад, патент США (5 5,399,346). Такі вектори можуть містити також сприятливі агенти, наприклад, бупівацин (05 5,593,970). ДНК можуть уводитися також за допомогою генної пушки |Хіао 8

Вгапазта, вище). ДНК, що кодує імуноген, осаджують на поверхню металевих мікрокульок. Мікрокулькам під дією ударної хвилі або розширюваного гелію надається прискорення, і вони проникають в тканину на глибину кількох клітинних шарів. Підходящим для цього є, наприклад, прилад для постачання генів марки Ассеї! м, який виробляє фірма Адасейив5, Іпс. Мідаіеютп УУІ. Можна також уводити відкриті ДНК крізь шкіру, в потік крові, просто прикладаючи ДНК на шкіру із засобами механічного або хімічного подразнення (МО 95/058531. 70 Можливі варіанти, в яких вектори, що кодують імуногени, постачаються в клітини ех мімо, тобто в клітини, експлантовані у пацієнта (наприклад, лімфоцити, аспіраційні біоптати кісткового мозку, тканинна біопсія) або універсальні донорні гематопоетичні стовбурові клітини, з наступною реімплантацією цих клітин у пацієнта, зазвичай, після відбору клітин, які мають вбудований вектор.

ПІ. Скринінг антитіл за їхньою очищувальною дією

Винаходом пропонуються способи скринінгу антитіла за його ефективністю у видаленні амілоїдного відкладення або іншого антигена, або ж асоційованої біологічної речовини, яка повинна бути піддана такого роду дії. Для відбирання антитіл за їхньою активністю проти амілоїдного відкладення зразок тканини із мозку пацієнта з хворобою Альцгеймера або піддослідної тварини, що має характеристичну патологію Альцгеймера, приводять у контакт з фагоцитними клітинами, що несуть Ес-рецептор, наприклад, мікроглі«альними клітинами, і го аналізованим антитілом в середовищі іп міго. У якості фагоцитних клітин може бути застосована первинна культура або клітинна лінія, якою є, наприклад, ВМ-2, С8-84 або ТНР-1. В деяких способах компоненти комбінують на предметному склі мікроскопу, що дозволяє полегшити мікроскопічні спостереження. Можна застосовувати способи, згідно з якими в ямках мікротитрувальних чашок паралельно здійснюють багато реакцій.

За таких розмірів мініатюрні предметні стекла мікроскопу можуть встановлюватися в окремі ямки, або ж може с бути застосований не мікроскопічний формат виявлення, наприклад, детектування АВ за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу ЕГІЗА. У кращому варіанті проводять серію вимірювань кількості о амілоїдного відкладення в реакційній суміші іп міго, починаючи від величини базового рівня, що відповідає дореакційному стану, і знімаючи потрібну кількість величин в процесі реакції. Антиген може бути виявлений шляхом забарвлення, наприклад, флуоресцентно міченим антитілом до АВ або іншого компонента амілоїдних ою бляшок. Антитіло, що використовується для забарвлення, може бути або не бути таким самим, як антитіло, що аналізується на очищувальну дію. Зниження кількості амілоїдних відкладень відносно базового рівня в процесі - реакції вказує на те, що дане антитіло вчиняє очищувальну дію. Такі антитіла, очевидно, можуть Га застосовуватися у профілактиці або лікуванні хвороби Альцгеймера та інших амілоїдогенних хвороб.

Аналогічні способи можуть бути застосовані для скринінгу антитіл за Їхньою активністю у видаленні інших - типів біологічних речовин. Такі випробування можуть застосовуватися для виявлення очищувальної активності Ге) проти біологічних речовин будь-якого типу. Як правило, така біологічна речовина відіграє певну роль у хворобі людини чи тварини. Біологічна речовина може подаватися для аналізу у формі зразка тканини або в ізольованій формі. У першому варіанті зразок тканини не повинен фіксуватися, щоб мати змогу легкого доступу до його компонентів, уникаючи при цьому порушень конформації компонентів внаслідок фіксації. У якості зразків тканин « для такого аналізу можуть братися: ракові тканини; предракові тканини; тканини з доброякісними утвореннями, 8 с якими є, наприклад, бородавки або родимки; тканини, інфектовані патогенними мікроорганізмами: тканини, й інфільтровані клітинами зони запалення; тканини з патологічними матрицями між клітинами (наприклад, «» фібринозний перикардит); тканини з аберантними антигенами і рубцеві тканини. У якості прикладів ізольованих речовин, які можуть застосовуватися у такому аналізі можна назвати АВ, вірусні антигени або віруси, протеоглікани, антигени інших патогенних мікроорганізмів, пухлинні антигени і адгезійні молекули. Такі о антигени можуть одержуватися із природних джерел, шляхом рекомбінантної експресії або хімічного синтезу та за допомогою інших засобів. Зразок тканини або ізольованої біологічної речовини приводять в контакт з - фагоцитними клітинами, що несуть Ес-рецептори, наприклад, моноцитами або мікрогліальними клітинами, і ко випробуваним антитілом у певному середовищі. Антитіло може бути спрямоване на біологічну речовину, що з ю аналізується, або на антиген, зв'язаний з цією речовиною. В останньому випадку об'єкт піддають тесту на те, чи є дана біологічна речовина опосередковано фагоцитованою антигеном. Зазвичай, хоч і не обов'язково, 4 антитіло і біологічна речовина (іноді зі зв'язаним з нею антигеном) перед добавленням фагоцитних клітин приводяться у взаємний контакт. Після цього ведуть спостереження за концентрацією біологічної речовини і/або зв'язаного антигена (якщо він є), що залишився у середовищі. Зменшення кількості або концентрації антигена чи ЗВв'ЯЗаної біологічної речовини у середовищі показує, чи має антитіло очищувальну реакцію проти антигена і/або зв'язаної біологічної речовини разом з фагоцитними клітинами (див. Приклад 14). іФ) ІМ. Пацієнти ко Пацієнтами, які погодились на лікування у запропоновані способи, можуть бути особи, що знаходяться в групі ризику даної хвороби, але не виказують її симптомів, а також пацієнти, які в даний час вже такі бо симптоми виявляють. У випадку хвороби Альцгеймера практично будь-яка людина достатньо великого віку знаходиться в її групі ризику. Отже запропоновані способи можуть застосовуватися профілактично до всіх, без винятку, і незалежно від того, чи знаходиться дана особа в групі ризику. Способи за даним винаходом є особливо ефективними щодо осіб, схильних генетично до хвороби Альцгеймера. Такими особами можуть бути ті що мають родичів, вже потерпілих від цієї хвороби, і ті, для яких ризик захворіти був виявлений в б5 результаті аналізу генетичних або біохімічних маркерів. Генетичними маркерами ризику стосовно хвороби

Альцгеймера є мутації в АРР-гені і, зокрема, мутації в положенні 717 і положеннях 670 і 671, які одержали назву відповідно мутацій Харді (Нагау) і шведських мутацій, див. (Нагау, ТІМ5, вище). Маркерами ризику можуть бути також мутації в пресенільних генах РБ1 і РБЗ2, і АроЕ4, історія хвороби Альцгеймера в родині, гіперхолестеролемія або атеросклероз. Особи, що страждають на хворобу Альцгеймера на час обстежень,

Виявляють себе по характерному недоумству, а також наявністю описаних вище факторів ризику. Крім того, існують численні діагностичні тести для ідентифікації осіб, що страждають на хворобу Альцгеймера. До них належать вимірювання рівней С5Е-тау і АВ42. Підвищений рівень тау і знижений рівень АВ42 свідчать про наявність хвороби Альцгеймера. Особи, що страждають на хворобу Альцгеймера, можуть бути виявлені також за критерієм АОКОА, як описано в Прикладах нижче. 70 Для пацієнтів, що виказують симптоми хвороби, лікування може починатися у будь-якому віці (10, 20, 30... років). Проте, зазвичай, починати лікування такого пацієнта раніше, ніж він досягне віку 40, 50, 60 або 70 років, необхідності немає. Лікування, як правило, полягає у призначенні пацієнту прийняття багатократних доз препаратів протягом певного часу. Спостереження в лроцессі лікування можна здійснювати шляхом аналізу антитіла або активованих Т-клітинних чи В-клітинних реакцій на терапевтичний агент (наприклад, пептид АВ). /5 Якщо реакція падає, то пацієнту призначають бустер-дозу. Лікування потенційних пацієнтів із синдромом Дауна може починатися до їх народження і здійснюватися шляхом уведення терапевтичного агента матері або ж одразу після народження.

М. Режими лікування

З метою профілактики фармацевтичні композиції або медикаменти вводять пацієнту, який є схильним до хвороби Альцгеймера або якимось іншим чином входить в її групу ризику, у кількості, достатній для позбавлення від цього ризику або зниження його, послаблення тяжкості або затримання виникнення хвороби, включаючи біохімічні, гістологічні симтоми і/або зовнішні ознаки цієї хвороби, ускладнення від неї і проміжні патологічні фенотипи, що виникають в процесі її розвитку. При застосуванні у терапевтичних цілях композиції або медикаменти вводять пацієнту, що знаходиться під підозрою на захворювання або вже страждає на таку с хворобу, у кількості, достатній для лікування або, принаймні, часткового припинення симптомів хвороби (біохімічних, гістологічних і/або зовнішніх ознак), включаючи ускладнення від неї і проміжні патологічні (8) фенотипи в процесі її розвитку. В деяких способах уведення лікувального агента зменшує або виключає міокогнітивний розлад у пацієнта, в якого ще не розвинулась характерна патологія Альцгеймера. Кількість, адекватна терапевтичному або профілактичному втручанню, зветься терапевтично або профілактично ю зо ефективною дозою. Як у профілактичному, так і в терапевтичному режимі втручання активні агенти, зазвичай, уводяться декількома дозами до тих пір, поки не буде досягнена достатня імунна відповідь. Далі в процесі - втручання як тільки по результатах спостережень імунна реакція починає слабнути, пацієнту призначають с повторні дози.

Ефективні дози композицій за даним винаходом у лікуванні вищеописаних станів залежать від багатьох -/їХ"7 факторів і, в тому числі, призначення медичного втручання, місця-мішені медичного втручання, фізіологічного со стану пацієнта, того, є пацієнт людиною чи твариною, інших застосовуваних медикаментів, а також того, чи є втручання профілактичним чи терапевтичним. Зазвичай, пацієнтом є людина, але лікуванню можуть піддаватися також ссавці-тварини, включаючи трансгенних тварин. Дозування медикаментів повинно бути протитроване, щоб оптимізувати лікування з точки зору безпеки й ефективності. Кількість імуногена залежить від того, чи «

Вводиться разом з ним також адювант, причому у разі відсутності адюванту дозу імуногена потрібно з с збільшувати. Кількість імуногена для введення іноді варіює у межах 1-500мкг на пацієнта і, як правило, в межах 5-500мкг на ін'єкцію для людини. В деяких випадках застосовуються і більші дози - від 1 до 2мг на з ін'єкцію. Як правило, в ін'єкціях для людей дози імуногена складають приблизно 10, 20, 50 або 100Омкг на пацієнта. Кількість імуногена в одиницях маси залежить також від масового співвідношення імуногенного епітопу 5 В імуногені і загальної маси імуногена. Зазвичай, використовуються від 10 З до 107 мікромолей імуногенного (ее) епітопу на мікрограм імуногена. Частота застосування ін'єкцій може змінюватися в широких межах від 1 ін'єкції на день до 1 ін'єкції на рік чи навіть на 10 років. У разі щоденних ін'єкцій доза на пацієнта складає більше - 1мкг, а у разі застосування ад'юванту - більше 1Омкг, і більше 1Омкг при зростанні її до 10Омкг на пацієнта у ко разі відсутності ад'юванту. Типовий режим лікування складається із імунізації з наступними бустер-ін'єкціями цу з інтервалами в б тижнів. Можливі також режими, в яких за імунізацією слідують бустер-ін'єкції через 1, 2 і 12 місяців. Ще в одному режимі ін'єкції роблять кожні 2 місяці протягом всього життя. Бустер-ін'єкції можна с також робити нерегулярно, відповідно до результатів спостережень за імунною реакцією.

У випадку пасивної імунізації антитілом доза може варіювати у межах приблизно від 0,0001 до 10Омг/кг і частіше у межах від 0,01 до бмг/кг маси тіла хазяїна. Наприклад, доза може становити мг/кг маси тіла або

ЛОмг/кг маси тіла чи знаходитися в межах 1-10мг/кг. У типовому режимі лікування введення медикаменту роблять кожні два тижні або один раз на місяць чи один раз за період від З до 6 місяців. В деяких способах одночасно

Ф, призначають два і більше моноклональних антитіл з різними специфічностями зв'язування, а дози при цьому для ко кожного антитіла знаходяться у вищезазначених межах. Антитіло, зазвичай, призначається в багатьох випадках.

Інтервали між уведеннями їхніх одиничних доз можуть бути тижневими, місячними і річними. Вони можуть бути бо також нерегулярними і встановлюватись відповідно до вимірюваних рівней антитіла до АВ у крові пацієнта. В деяких способах дозування антитіл регулюють у розрахунку на одержання їхньої концентрації в плазмі крові в межах 1-100Омкг/мл, а в деяких способах - в межах 25-300мкг/мл. В альтернативному варіанті антитіла можуть уводитися у формі препаратів пролонгованої дії, де частота їх прийому зменшується. Дози і частота їх прийому залежать від періоду напівжиття антитіла у пацієнта. У загальному випадку антитіла людей мають найбільший 65 період напівжиття. За ними слідують гуманізовані антитіла, далі - химерні антитіла і після них антитіла тварин. Дози і частота їх введення можуть варіювати залежно від того, є лікування профілактичним чи терапевтичним. У випадку профілактичного лікування дози є порівняно малими, а інтервали їх уведення - порівняно великими і займають тривалий час. Деякі пацієнти продовжують лікуватися і надалі протягом всієї решти життя. У терапевтичному застосуванні відносно великі дози за відносно коротких інтервалів їх уведення іноді потребуються до тих пір, поки розвинення хвороби не загальмується або не скінчиться, а в кращих випадках - до тих пір, поки пацієнт не викаже часткове або повне поліпшення симптомів хвороби. Після цього пацієнтові може бути призначений профілактичний режим лікування.

Дози нуклеїнових кислот, що кодують імуногени, варіюють в діапазоні від приблизно 1Онг до г, від 10Онг до 10Омг, від їмкг до 1Омг чи в межах 30-З0Омкг ДНК на пацієнта. Дози векторів на основі інфекційних вірусів /о Варіюють у межах 10-100 і більше віріонів на дозу.

Як у профілактичних, так і в терапевтичних цілях агенти для індукування імунної реакції можуть уводитися парентерально, місцево, внутрішньовенно, перорально, підшкірно, інтраартеріально, інтракраніально, інтраперитонеально, інраназально або внутрішньом'язово. Найбільш поширеним шляхом уведення імуногенного агента є підшкірний, хоча не менш ефективними є також інші шляхи. Наступним за ним, найпоширенішим способом є внутрішньом'язові ін'єкції. Частіше за усе їх роблять в м'язи рук або ніг. У деяких способах ін'єкції агентів роблять безпосередньо в ту тканину, де акумульвані відкладення, вживаючи для цього, наприклад, інтракраніальні ін'єкції. Внутрішньом'язові ін'єкції або внутрішньовенні інфузії застосовують для введення антитіл. В деяких способах конкретні терапевтичні антитіла вводять безпосередньо в череп. В деяких способах антитіла вводять у формі композиції або приладу пролонгованої дії, яким є, наприклад, прилад Меаіраа м,

Агенти за даним винаходом можуть необов'язково уводитися в комбінації з іншими агентами, які принаймні частково ефективні у лікуванні амілоїдогенних хвороб. У випадку хвороби Альцгеймера і синдрому Дауна, коли амілоїдні відкладення виникають в мозку, агенти за даним винаходом можуть уводитися також разом з іншими агентами, які розширюють прохід запропонованих винаходом агентів крізь гемато-мозковий бар'єр. с

Імуногенні агенти за даним винаходом, наприклад пептиди, часто вводять у комбінації з ад'ювантом. Для індукування імунної реакції в комбінації, наприклад, з пептидом АВ можуть уводитися найрізноманітніші о адюванти. Кращими серед них є такі, що підсилюють внутрішню реакцію на імуноген, не поводуючи конформаційних змін в імуногені, які впливають на якісну форму відповіді. До кращих ад'ювантів належать гідроксид і фосфат алюмінію, 3-Юе-О-ацильований монофосфорилліпід А (МРІ тм), див. патент Великобританії (З |В 2220211 (КіБі ІттипоСнет Кезеагсі Іпс., Натійоп, Мопіапа, тепер частина фірми Согіха))Ї. Препарат

Зійтцоптм 0)5-21 являє собою тритерпенглікозид або сапонін, виділений з кори дерева ОцШа|а Заропагіа --

Моїїпа, що росте в Південній Америці ІКепвіЇ ек аЇ., іп Массіпе ЮОезідп: Те Зи!Иирипії апа Адіомапі Арргоасп. СМ (едз. Роже 5 Меултап, Ріепит Ргезз, ММ, 1995); О5 Раїепі Мо. 5,057,540), (Адцийа ВіоРпагтасеціїісаї!в,

Егатіпдапат, МА)). Серед інших можливих для застосування ад'ювантів можна назвати емульсії типу "масло у - 3з5 воді" (наприклад, сквален або арахісове масло) у разі необхідності в комбінації з імунними стимулянтами, (се) такими, як монофосфорилліпід А ІЗіошіе еї аі., М. Епої. У. Меа. 336, 86-91 (1997)). Можна застосовувати також ад'ювант Сро МУО 98/40100). Пептид АВ може також зв'язуватися з ад'ювантом. Проте таке зв'язування не повинно суттєво змінювати конформацію АВ - настільки, щоб зачеплювати природу імунної відповіді на нього. «

Ад'юванти можуть уводитися як компонент терапевтичної композиції з активним агентом або окремо - до введення, водночас з уведенням або після введення терапевтичного агента. - с Кращим класом ад'ювантів є солі алюмінію, наприклад, гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію і сульфат а алюмінію. Такі ад'юванти можуть застосовуватися разом з іншими специфічними імуностимуляторними "» агентами, наприклад, МРІ або 3-ОМР, 05-21, полімерними чи мономерними амінокислотами, якими є, наприклад, поліглутамінова кислота або полілізин, чи без них. Іншим прийнятним класом ад'ювантів є емульсійні препарати типу "масло у воді". Такі ад'юванти можуть застосовуватися разом з іншими специфічними (ее) імуностимуляторними агентами, наприклад, мураміл-пептидами (наприклад, - М-ацетилмураміл-! -треоніл-О-ізоглютамін ((йг-МОР), М-ацетил-нормураміл-! -аланіл-О-ізоглютамін (пог-МОР),

М-ацетилмураміл-! -аланіл-О-ізоглютамініл-! -аланін-2-(1-2'дипальмітоїл-зп-гліцеро-3-гідроксифосфорилоксі)-ети ко ламін (МТР-РЕ), М-ацетилглюксамініл-М-ацетилмураміл-! -АІ-О-ізоглю-І -АІа-дипалмітоксипропиламід (ОТР-ОРР) шу 20 (ТнегатідеТтМ) або іншими компонентами стінок бактеріальних клітин або без них. У числі емульсій "масло у воді" можна назвати: (а) МЕ59 (МУ/О 90/14837)Ї, що містить 590 ЗацаІепе, 0,595 Тм'ееп 80 і 0.590 Зрап 85 (у разі сл необхідності з певною кількістю МТР-РЕ) у формі субмікронних часток, одержуваних за допомогою мікрозріджувача, наприклад, моделі 110У (фірми МісгоїІцідісв, Меулоп МА); (в) ЗАЕ, що містить 1095 Здцаїепе, 0,495 Тмееп 80, 596 плюронік-блокованого полімеру 1121 і (пг-МОР, мікрозріджений у субмікронній емульсії або інтенсивно перемішаний для утворення емульсії з крупнішими частками, і (с) ад'ювантну систему Кірітм (КАБ) о (фірма Ківі ІттипоСпет, Натійоп, МТ), що містить 295 сквалену, 0,295 Тмееп 80 і один чи більше компонентів стінок бактеріальних клітин із групи, що складається із монофосфорилліпіду А (МРІ)), трегалозодиміколату (ТОМ) їмо) і каркасу клітинної стінки (СМУ5), у кращому варіанті МРІ ї- СУМУ (Оєсіохтм). Іншим підходящим класом ад'ювантів є сапонінові ад'юванти, такі, як З(тиоптм (0)5-21, фірма Адшйа, Егатіпдапат, МА), або утворені з них порошки, 60 наприклад, ІЗСОМ (імуностимуляторні комплекси) й ІЗСОМАТЕЇХ. Серед інших підходящих ад'ювантів можна назвати повний адювант Фрейнда (СЕА: Сотрієїе Егепаз Адіимап) і неповний ад'ювант Фрейнда (ІРА:

Іпсотріеїе Ргешпаз Адіимап). Застосовувати в якості адювантів можна також цитокіни, наприклад, інтерлейкіни (ІІ -1, 1-2 і 1-12), колонієстимулючий фактор макрофагів (М-СЗЕ), фактор некрозу печінки (ТМЕ).

Ад'ювант може вводитися з імуногеном у формі єдиної композиції або перед ним, водночас з імуногеном або бо ж після введення імуногена. Імуноген і ад'ювант можуть пакуватися і постачатися в одній ампулі або ж в різних ампулах і змішуватися безпосередньо перед вживанням. Імуноген і ад'ювант, зазвичай, упаковують в тару з ярликом, на якому указане призначення препарату. Якщо імуноген і ад'ювант упаковані окремо один від одного, то на упаковці, зазвичай, дані інструкції щодо їх змішування перед вживанням. Відповідний ад'ювант і/або носій вибирають, виходячи з міркувань стабільності імуногенного препарату з цим ад'ювантом, способу введення, графіку дозування, ефективності ад'юванту для даного виду пацієнтів і, якщо це люди, то фармацевтично прийнятний ад'ювант повинен мати дозвіл на його застосування у фармакології від відповідних установ. Наприклад, повний ад'ювант Фрейнда не підходить для введення його людині. Кращими ад'ювантами є солі алюмінію, МРІ і 05-21. У разі необхідності можуть одночасно застосовуватися два і більше різних ад'юванти. Серед кращих комбінацій таких ад'ювантів можна назвати солі алюмінію з МРІ, солі алюмінію з 70 05-21, МРІ з 05-21 і солі алюмінію, 05-21 і МРІ. разом. Може бути застосований також неповний ад'ювант

Фрейнда |Спапд еї аІ., Адмапсей Огид Оеїїмегу Кеміемуз 32, 173-186 (1998)), у разі потреби в комбінації з будь-якою з солей алюмінію, 05-21 і МР'І,, а також будь-якими їхніми комбінаціями.

Агенти за даним винаходом часто вводять у формі фармацевтичних композицій, що містять активний терапевтичний агент та інші різноманітні фармацевтично прийнятні компоненти |Кетіпдіоп'є РНпагтасеціїсаї! /5 Зсівпсе (151 ей. Маск Рибіївпіпо Сотрапу, Еазіоп, Реппзуїмапіа, 1980)). Краща форма такої композиції залежить від передбачуваного способу її введення та її терапевтичного призначення. Такі композиції можуть включати у себе, залежно від бажаного складу, також фармацевтично прийнятні, нетоксичні носії або розріджувачі, які знаходять широке застосування в якості носіїв для готування фармацевтичних препаратів у ветеринарії чи медицині. Розріджувач вибирають у такому розрахунку, щоб він не впливав на біологічну 2о активність композиції В якості прикладів таких розріджувачів можна назвати дистильовану воду, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчини Рінгера, розчини декстрози і розчин Хенка. Крім того, фармацевтична композиція або препарат може містити інші носії, ад'юванти або нетоксичні, нетерапевтичні, неімуногенні стабілізатори, тощо.

Фармацевтичні композиції можуть включати у себе також великі макромолекули, що повільно сч метаболізуються, наприклад, білки, полісахариди, такі, як хітозан, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти і співполімери (такі, як латекс-активована сефароза(ТМ), агароза, целюлоза, тощо), полімерні амінокислоти, і) амінокислотні співполімери і ліпідні агрегати, такі, як масляні краплі або ліпосоми). Крім того, такі носії можуть діяти як імуностабілізаторні агенти (тобто ад'юванти).

Для парентерального введення агенти за даним винаходом можуть мати форму дозованих розчинів чи ю зо суспензій для ін'єкцій потрібних речовин у фізіологічно прийнятному розчиннику з фармацевтичним носієм, яким може бути стерильна рідина, наприклад, вода, масло, фізіологічний розчин, гліцерол або етанол. Крім того, - композиції можуть містити допоміжні речовини, наприклад, зволожувачі або емульгатори, поверхнево-активні с речовини, рН-буферні речовини, тощо. Інші компоненти фармацевтичних композицій можуть походити з нафти, мати тваринне, рослинне або синтетичне походження; ними можуть бути, наприклад, арахісова олія, соєва олія -- зв Та мінеральне масло. У загальному випадку кращими рідинними носіями, особливо в розчинах для ін'єкцій, є со гліколі, наприклад, проліленгліколь або поліетиленгліколь. Антитіла можуть уводитися у формі депо-ін'єкцій або імплантаційних препаратів, приготованих таким чином, щоб забезпечити довготривале звільнення активного інгредієнта. Типова композиція включає у себе моноклональне антитіло з концентрацією 5мг/мл, що знаходиться у водному буферному розчині із 5ОмММ І -гістидину і 150мМ Масі, відрегульованому на рН 6,0 соляною кислотою « зо (НС). 2 с Композиції, як правило, готують у формі для ін'єкцій в розчинах або суспензіях. Можливі також твердотілі форми, розраховані на розчинення або суспендування в рідинних носіях перед Їх ін'єкцією. Препарати можуть ;» також бути емульгованими або інкапсульованими в ліпосомах чи мікрочастках, наприклад, полілактидних, полігліколідних або співполімерних частках для підсилення ад'ювантного ефекту, як описано в роботі |і апдег, Зсівпсе 249, 1527 (1990) апа Напез, Адмапсей Огид Оеїїмегу Кеміемлв 28, 97-119 (1997)). Агенти за даним

Го! винаходом можуть уводитися у формі депо-ін'єкцій або імплантаційних препаратів, які можуть бути приготовані таким чином, щоб забезпечити довготривале або пульсаційне виділення активного інгредієнта. - Можуть готуватися також препарати, розраховані на інші способи введення, в тому числі пероральний, ко інтраназальний, легеневий, а також супозиторії і трансдермальні аплікації.

Для супозиторіїв у якості зв'язуючих і носіїв можна застосовувати, наприклад, поліалкіленгліколі або - тригліцериди. Такі супозиторії можна формувати із сумішей, що містять активний інгредієнт в межах від 0,595 до с 10956 і краще - від 195 до 295. Препарати для перорального прийому включають у себе ексципієнти - фармацевтичні сорти манітолу, лактози, крохмалю, стеарату магнію, натрійсахарину, целюлози і карбонату магнію. Ці композиції приймають форму розчинів, суспензій, таблеток, пілюль, капсул, препаратів пролонгованої дв ВІЇ або порошків і містять активний Інгредієнт у кількості 10-9596, і у кращому варіанті - 25-70905.

Аплікації для місцевого застосування розраховані на трансдермальне або інтрадермальне постачання. (Ф, Місцеве застосування може бути полегшене сумісним уведенням агента разом з токсином холери або його ка детоксифікованими похідними чи субодиницями або іншими подібними бактеріальними токсинами |Сіепп еї аї..

Маїшге 391,851 (1998)). При сумісному введенні компоненти можуть утворювати суміш або мати форму зв'язаних бо молекул, отриманих хімічним зшиванням або експресією, як для злитих білків.

В альтернативному варіанті трансдермальне постачання може здійснюватись із використанням шляхів крізь шкіру або трансферосом ГРаші еї аї!., Виг. У. Іттипої. 25, 3521-24 (1995); Семс еї а!., Віоспет. Віорпуз. Асіа 1368, 201-15 (1998).

МІ. Способи діагностики 65 Даний винахід передбачає способи виявлення імунної реакції проти пептиду АВ у пацієнта, що страждає на хворобу Альцгеймера або є схильним до неї. Ці способи є особливо корисними у спостереженнях за процесом лікування, призначеного даному пацієнту. Вони можуть використовуватися для спостережень як за терапевтичним лікуванням пацієнтів, що виказують симптоми захворювання, так і за профілактичним лікуванням пацієнтів, що таких симптомів не виказують. Запропоновані способи можуть застосовуватися для спостережень як за активною імунізацією (наприклад, антитіл, що продукуються як реакція на введення імуногена), так і за пасивною імунізацією (наприклад, вимірювання рівня введеного антитіла). 1. Активна імунізація

Деякі запропоновані способи передбачають визначення величини базового рівня імунної реакції у пацієнта до введення йому дози агента і порівняння цієї величини з величиною імунної реакції після лікування. Суттєве /0 Зниження (тобто більше, ніж типові межі похибки експерименту в групі повторних вимірювань одного зразка, вираженої через стандартне відхилення від середньої величині в даній групі вимірювань) величини імунної реакції означає позитивний результат лікування (тобто те, що введення агента викликало або збільшило імунну реакцію). Якщо ж величина імунної реакції не зазнала значних змін або зменшилася, це означає, що результат лікування є негативним. У загальному випадку у пацієнтів на початку курсу лікування імуногенним агентом 7/5 бпостерігається збільшення імунної реакції від однієї дози до наступної з виходом величини реакції на плоску ділянку графіка. Уведення агента, як правило, продовжують до тих пір, поки імунна реакція зростає. Досягнення плоскої ділянки вказує на те, що курс лікування може бути припинений або що можуть бути зменшені дози чи частота їх уведення.

В інших способах визначають контрольну величину (тобто середню величину і стандартне відхилення) 2о імунної реакції в контрольній групі. Члени контрольної групи, як правило, не проходять попереднього лікування. Після вимірювань одержані величини імунної відповіді на введення пацієнту терапевтичного агента порівнюють з контрольною величиною. Значне збільшення відносно контрольної величини (наприклад, більше одного стандартного відхилення від середнього значення) вказує на позитивний результат лікування. Якщо ж значного збільшення немає, а спостерігається навіть зменшення імунної відповіді, це вказує на те, що сч г5 результат лікування є негативним. Уведення агента у загальному випадку продовжують до тих пір, пока імунна реакція не зросте відносно контрольної величини. Як і в попередньому випадку, досягнення плоскої ділянки і) графіка відносно контрольних величин є показником того, що призначене лікування може бути перерване або дози чи частота їх уведення зменшена.

В інших способах визначається контрольна величина імунної реакції (наприклад, середнє значення і ю зо стандартне відхилення) в контрольній групі, яка була піддана лікуванню терапевтичним агентом і імунна реакція якої досягла плоскої ділянки графіка. Величини імунної реакції, одержані у пацієнта, порівнюють з цією -- контрольною величиною. Якщо рівень реакції пацієнта не відрізняється помітно від контрольної величини с (наприклад, більше одного стандартного відхилення), то лікування може бути перерване. Якщо ж рівень реакції у пацієнта є значно нижчий контрольної величини, то введення агента слід продовжувати. Якщо рівень реакції у (87 з5 пацієнта продовжує залишатися нижче контрольної величини, то це може означати, що потрібно внести змінив (у режим лікування, наприклад, використати інший ад'ювант.

Можливі також способи, в яких пацієнт в даний час лікування не проходить, але пройшов попередній курс лікування і тепер знаходиться під спостереженням за його імунною реакцією з метою визначення необхідності поновлення лікування. Величину імунної реакції, виміряну у пацієнта, можна привести у порівняння з величиною « імунної реакції, одержаною у того ж пацієнта після попереднього курсу лікування. Значне зниження імунної з с реакції відносно попередніх вимірювань (тобто більше типової межі похибки фупи вимірювань на одному зразку) є показником того, що лікування може бути поновлене. В альтернативному варіанті виміряна у пацієнта величина ;» може бути порівняна з контрольною величиною (середнє значення плюс стандартне відхилення), визначеною в групі пацієнтів після курсу лікування. Можливий також варіант, де виміряна у пацієнта величина порівнюється з

Контрольною величиною, одержаною в групі пацієнтів, що пройшли профілактичне лікування і не виказують

Го! симптомів захворювання, або в групі пацієнтів, що пройшли терапевтичне лікування і показують поліпшення характеристик хвороби. В усіх цих випадках значне зниження величини реакції відносно контрольного рівня - (тобто більше стандартного відхилення) є показником того, що лікування даного пацієнта повинно бути

ГІ поновлене.

У якості зразка тканини для аналізу у пацієнта беруть, як правило, кров, плазму, сироватку, слиз слизових - оболонок або спинномозкову рідину. Зразок аналізують на виявлення імунної реакції на будь-яку форму пептиду сп АВ, зазвичай, АВ42. Показником імунної реакції може служити наявність, наприклад, антитіл або Т-клітин, що специфічно зв'язуються з пептидом АВ. ЕІ ІЗА-методи виявлення антитіл, специфічних до АВ, описані в розділі

Приклади. Методи виявлення реактивних Т-клітин були описані вище (див. розд. Темінологія). В деяких способах дв імунна реакція визначається шляхом тесту на видалення, як описано вище в розд. І. Взятий у пацієнта зразок тканини, що піддається тесту, приводиться в контакт з амілоїдними відкладеннями (наприклад, від миші РОАРР) і

Ф) фагоцитними клітинами, що несуть Ес-рецептори. Далі ведуть спостереження за видаленням амілоїдного ка відкладення. Наявність і величина реакції видалення є показником наявності і рівня антитіл, здатних видаляти

АВ в зразку тканини пацієнта. во 2. Пасивна імунізація

Методика спостережень за пасивною імунізацією у загальному випадку є такою самою, що й для активної імунізації, описаної вище. Проте профіль антитіл, що супроводжує пасивну імунізацію, показує, як правило, проміжний пік концентрації антитіл, за яким слідує експоненціальний спад. Без подальшого введення препарату цей спад наближається до рівней попереднього лікування протягом часу від декількох днів до декількох місяців 65 Залежно від періоду напівжиття введених антитіл. Наприклад, період напівжиття деяких антитіл людини складає приблизно 20 днів.

В деяких способах спочатку вимірюють базовий рівень антитіла до АВ у пацієнта перед уведенням препарату. Невдовзі після введення препарату проводять друге вимірювання, визначаючи піковий рівень антитіла, а далі - одне чи більше подальших вимірювань з певними інтервалами для спостереження за

Зниженням рівня антитіла. Коли рівень антитіла знижується до базового або до певного відсотка піка над базовим рівнем, наприклад, 5095, 2595 чи 1095, пацієнту вводять наступну дозу антитіла. В деяких способах пік або послідовно виміряні рівні над базовим порівнюють з еталонними рівнями, визначеними перед тим для встановлення ефективного режиму профілактичного або терапевтичного лікування в інших пацієнтів. Якщо виміряні рівні антитіла є значно нижчими за еталонний рівень (наприклад, нижче середнього значення мінус одне 7/0 стандартне відхилення еталонного рівня в групі пацієнтів, що отримали лікування), то це означає, що введення антитіла потрібно продовжувати. 3. Діагностичні набори

Винаходом також пропонуються діагностичні набори для здійснення описаних вище способів діагностики.

Такі набори, як правило, включають у себе агент, що специфічно зв'язується з антитілами до АВ. В набір також /5 Може входити мітка. Мітка для виявлення антитіл до АВ подана в наборі, як правило, у формі мічених антиіїдіотипових антитіл. Для виявлення антитіл агент може входити в набір у попередньо зв'язаному з твердою фазою стані, наприклад, з ямками мікротитрувальної чашки. Набори можуть містити також інформаційні матеріали з інструкціями щодо користування цими наборами. В такі інформаційні матеріали може входити карта або інші засоби кореляції рівней виміряної мітки з рівнями антитіл до АВ. Терміном "інформаційні матеріали" охоплюються будь-які друковані чи записані на інших носіях матеріали, що додаються або у будь-який інший спосіб супроводжують набір під час його виготовлення, транспортування, продажу і використання. Це, наприклад, рекламні листки і брошури, пакувальні матеріали, інструкції, аудіо- і відеокасети, комп'ютерні диски, а також написи, друковані безпосередньо на наборах.

Винаходом також передбачені діагностичні набори для відображення іп мімо. Такий набір включає у себе, як с об правило, антитіло, що зв'язується з епітопом пептиду АВ у кращому варіанті на залишках 1-10. Краще, якщо антитіло, що входить в набір, або вже є міченим, або ж в набір включають допоміжний реагент для мічення. (8)

Краще, якщо набір забезпечується інструкціями щодо зображення іп мімо.

МІ. Зображення іп мімо

Винаходом пропонуються способи зображення іп мімо амілоїдних відкладень у пацієнта. Такі способи можуть ю зо застосовуватися в діагностиці або підтвердженні діагнозу хвороби Альцгеймера або схильності до неї.

Наприклад, ці способи можуть застосовуватися до пацієнтів, що виказують симптоми недоумства. Якщо у - пацієнта виявлені аномальні амілоїдні відкладення, то він з очевидністю страждає на хворобу Альцгеймера. Дані с способи можуть також застосовуватися до пацієнтів, які не виказують симптомів цієї хвороби. Наявність аномальних відкладень амілоїду вказує на схильність до симптоматичної хвороби у майбутньому. Запропоновані (8-7 способи можуть застосовуватися також у спостереженнях за розвитком хвороби і/або реакції на лікування у со пацієнтів, яким раніше був поставлений діагноз хвороби Альцгеймера.

Дані способи полягають у введенні реагента, наприклад, антитіла, що зв'язується з АВ пацієнта, і наступному виявленні цього агента після його зв'язування. Кращі антитіла зв'язуються з відкладеннями АВ у пацієнта, не зв'язуючись з АРР поліпептидом повної довжини. Антитіла, що зв'язуються з епітопом пептиду АВ в « межах амінокислот 1-10, є особливо прийнятними для застосування. В деяких способах антитіло зв'язується з з с епітопом в межах амінокислот 7-10 пептиду АВ. Такі антитіла, як правило, зв'язуються, не викликаючи суттєвої реакції видалення. В деяких способах антитіло зв'язується з епітопом в межах амінокислот 1-7 пептиду АВ. Такі ;» антитіла, зв'язуючись, зазвичай, викликають в АВ реакцію видалення. Проте реакції видалення можна уникнути, якщо використовувати фрагменти антитіла, такі, як Раб, в яких бракує постійної ділянки повної довжини. В деяких способах те саме антитіло може служити і як лікувальний і як діагностичний реагент. У загальному

Го! випадку антитіла, що зв'язуються з С-кінцневими епітопами залишку 10 пептиду АВ, не подають такого сильного сигналу, як антитіла, що зв'язуються з епітопами у межах залишків 1-10, причиною чого є, очевидно, те, що - С-кінцеві епітопи в амілоїдних відкладеннях є недоступними. Через це такі антитіла є менш прийнятними для

ГІ застосування.

Діагностичні реагенти можна вводити шляхом внутрішньовенних ін'єкцій в тіло пацієнта або безпосередньо в - мозок шляхом інтракраніальних ін'єкцій або через отвір, висвердлений у черепі. Доза реагенту при цьому с знаходиться в тих самих межах, що й застосовувані у способах лікування. Як правило, реагент тут є мічений, хоча в деяких способах первинний реагент з афінністю до АВ є неміченим, а поряд з ним використовується вторинний, маркерний реагент, призначений для зв'язування з первинним реагентом. Вибір тої чи іншої мітки ов Залежить від засобів її виявлення.

Наприклад, для оптичного виявлення підходящою є флуоресцентна мітка. Парамагнітні мітки є підходящими

Ф) для томографічних засобів виявлення без хірургічного втручання. Радіоактивні мітки можуть виявлятися за ка допомогою РЕТ або 5РЕСТ.

Діагноз встановлюють шляхом порівняння кількості, розмірів і/або інтенсивності мічених локусів з бо Відповідними величинами базового рівня. Величини базового рівня можуть являти собою середні рівні в фупі здорових особин. Величини базового рівня можуть також являти собою рівні, визначені перед тим у того самого пацієнта. Наприклад, величини базового рівня можуть бути визначені у пацієнта до початку його лікування, а порівнюватися з ними будуть величини, одержані у вимірюваннях після цього. У цьому випадку зниження величин порівняно з сигналами базового рівня буде являти собою позитивну реакцію на лікування. 65 Приклади

Ї. Профілактична ефективність АВ стосовно хвороби Альцгеймера

В цих Прикладах описане, ведення пептиду АВ42 в трансгенних мишей, що надекспресують АРР з мутацією в положенні 717 (АРР7417у-Е) ії таким чином, стають схильними до альцгеймеровської нейропатології.

Продукування і характеристики цих мишей (миші РОАРР) описані в роботі |Сатез еї а)., вище). Ці тварини в їхній гетерозиготній формі починають утворювати відкладення АВ на шостому місяці життя. На п'ятнадцятому місяці в них вже спостерігаються рівні відкладень АВ, еквівалентні тим, що є характерними для хвороби

Альцгеймера. Мишам РОАРР були зроблені ін'єкції агрегованого АВ42 або забуференого фосфатом фізіологічного розчину. Агрегований АВ42 був вибраний за його здатністю індукувати антитіла до численних епітопів АВ. 70 А. Методика 1. Піддослідні тварини

Тридцять гетерогенних самок мишей РОАРР були поділені випадковим чином на такі фупи: 10 мишей, що призначалися для ін'єкцій агрегованим АВ42 (одна загинула при транспортуванні), 5 мишей для ін'єкцій забуференим фосфатом фізіологічним розчином (РВЗ) і ад'ювантом або РВБ5, і 10 неін'єктованих контрольних /5 тварин. П'ять мишей були ін'єктовані пептидами, виведеними із послідовності сироваточного амілоїдного білка (ЗАР). 2. Готування імуногенів

Готування агрегованого АВ42. Два міліграми АВ42 (05 Рерійдев, Іпс., партія К-42-12) розчинили в 0, 9мл води і довели до їмл додаванням 0,1мл 10 х РВ5. Суміш інтенсивно перемішали і поставили на інкубування 2о протягом ночі при температурі 372С - умови, за яких агрегується пептид. Будь-який невикористаний АВ зберігали у формі сухого ліофілізованого порошку при -202С до наступної ін'єкції. 3. Готування ін'єкцій

Для кожної ін'єкції 10О0мкг агрегованого АВ42 в РВ5 на мишу емульгували у співвідношенні 1:11 з повним ад'ювантом Фрейнда (СЕРА) в кінцевому об'ємі 40О0мкл емульсії для першої імунізації з наступною за нею Га бустер-ін'єкцією такої ж самої кількості імуногена в неповному ад'юванті Фрейнда (ІРА) з двотижневим інтервалом. Дві додаткові дози в ІРА робили з місячними інтервалами. Подальші імунізації робили з місячними і) інтервалами в 50Омкл РВЗ5. ін'єкції робили інтраперитонеально.

Ін'єкції РВЗ робили за тією ж самою схемою, і мишам вводили ін'єкції у суміші 1:11 РВЗ/ад'ювант по 400мкл на мишу або 500мкл РВЗ на мишу. Ін'єкції ЗАР робились також за цією схемою дозою 10Омкг на ін'єкцію. юю 4. Титрування кровопускань, препарування тканин і імуногістохімія у мишей Методика описана нижче в розд.

Загальні матеріали і методи --

В. Отримані результати сі

Мишам РОАРР були зроблені ін'єкції агрегованого АВ42, пептидів ЗАР або розчину РВ5 по групах. Була виділена також група неін'єккгованих мишей РОАРР, тобто позитивних контрольних зразків. Титри мишей для - ін'єкцій агрегованого АВ42 обстежувались щомісячно, починаючи з четвертої бустер-дози до досягнення мишами ее однорічного віку. На тринадцятому місяці життя мишей препарували. В усі періоди обстежень 8 із 9 мишей, ін'єктованих агрегованим АВ42, показали високий титр антитіл, який залишався високим (більше 1/10000) на всіх серіях ін'єкцій. Дев'ята миша мала низький, але такий, що піддавався вимірюванням, титр приблизно 1/1000 « (Фіг.1, Табл. 1). Миші, ін'єктовані ЗАРР, мали титри від 1:1000 до 1:30000 для цього імуногена, і лише одна 70 миша перевищила рівень 1:100000. - с Миші, ін'єктовані РВ5, були титровані проти агрегованого АВ42 на шостий, десятий і дванадцятий місяці. ц При 1:100 розрідженні миші, ін'єктовані РВ5, як показало титрування їх проти агрегованого АВ42, перевищували "» рівень фону в 4 рази лише в одній точці даних, а в усіх інших точках їхні титри не досягали 4-кратного рівня над фоном (Табл. 1). В цих точках ЗАР-специфічна реакція була зневажливо малою в усіх точках спостережень, де всі титри складали менше 300. (ос) В мозку семи із дев'ятьох мишей, ін'єктованих агрегованим АВ42, амілоїду не було виявлено. У -3з протилежність цьому мозкова тканина у мишей, ін'єктованих 5АР і РВ5, містила численні амілоїдні відкладення в гіпокампі, а також у лобовій і сингулятній корі головного мозку. Обрис відкладення був подібний тому, що мали ко контрольні тварини, яким ін'єкції не робили, з характерною заплутаністю уразливих ділянок, таких, наприклад, як шу 20 зовнішній молекулярний шар зубчастої звилини гіпокампу. Одна миша із групи, ін'єктованої АВ1-42, мала значно зменшене амілоїдне навантаження, прикріплене до гіпокампу. У іншої міші, обробленої АВ 1-42, була сл виявлена ізольована бляшка.

Кількісний аналіз зображень амілоїдного навантаження в гіпокампі підтвердив його різке зниження у тварин, яким робили ін'єккції АВ42 (АМ1792) (Фіг.2). Середні величини амілоїдного навантаження в групі РВ5 (2,2290) і в контрольній групі необроблених тварин (2,6595) були значно вищі рівней, що спостерігалися у тварин, імунізованих АМ 1792 (0,0095, р-0,0005). У протилежність цьому середня величина у тварин, імунізованих о петидами ЗАРР, складала 5,7495. Мозкова тканина у необроблених, контрольних мишей містила численні ко АВ-амілоїдні відкладення, візуалізовані АВ-специфічним моноклональним антитілом (тАБ) 306 в гіпокампі, а також в ретроспленіальній корі. Подібна картина амілоїдних відкладень спостерігалася також у мишей, бо імунізованих БАРР або РВ5З (Фіг.2). Крім того, в останніх трьох групах мала місце характерна для хвороби

Альцгеймера заплутаність уразливих субділянок мозку, таких, як зовнішній молекулярний шар зубчастої звилини гіпокампу, в усіх цих трьох групах.

Мозок тварин, який не містив відкладень АВ, не мав також і нейритних бляшок, які, зазвичай, спостерігалися у мишей РОАРР з АРР антитілом 8Е5 людини. Всі зразки мозку решти груп (яким робили ін'єкції 65 ЗАР, РВ5 і яким ін'єкцій не робили) мали численні нейритні бляшки, типові для необроблених мишей РОАРР.

Невелика кількість нейритних бляшок мала місце в одної миші, обробленої АМ 1792, а один кластер дистрофічних нейритів був виявлений у другої миші, обробленої АМ1792. Аналіз зображень гіпокампу, як показано на Фіг.3, продемонстрував фактичне видалення дистрофічних нейритів у мишей, оброблених АМ 1792 (середній рівень 0,0095) порівняно з реципієнтами РВ5З (середній рівень 0,2895, р-0,0005).

Астроцитоз, характерний для супроводжуваних бляшками запалень, в зразках мозку тварин, ін'єктованих

АВ1-42, також був відсутній. Зразки мозку мишей інших груп містили численні кластеризован! ЗЕАР-позитивні астроцити, типові для супроводжуваного АВ-бляшками гліозу. Підгрупа ЗЕАР-прореагованих препаратів була забарвлена для зчитування Тіофлавіном З для локалізації відкладень АВ. СЕАР-позитивні астроцити зв'язувалися з АВ-бляшками у тварин, оброблених ЗАР, РВ5 і необроблених, контрольних тварин. Такого 70 зв'язування не було виявлено у мишей, оброблених АВ 1-42, які не мали бляшок, у той час як в одної з мишей, оброблених АМ1792, спостерігався мінімальний, зв'язаний з бляшками гліоз.

Аналіз зображень, як показано на Фіг4 для ретроспленіальної кори головного мозку, підтвердив, що зниження астроцитів із середнім рівнем 1,5696о був значним у тварин, оброблених АМ 1792, порівняно із середніми величинами, що перевищили 655 у тварин, імунізованих пептидами ЗАР, фізіологічним розчином РВ5 і 7/5 У неїмунізованих тварин (р-0,0017).

Асоційована з бляшками імунореактивність головного комплексу гістосумісності МНС ІІ, яку виявила підгрупа мишей, імунізованих ін'єкціями АВ1-42 і РВ5, була відсутньою у мишей, котрим робили ін'єкції АВ1-42, що співпадає з відсутністю пов'язаної з АВ запальної реакції.

Зрізи мозку мишей були також піддані реакції з тАбБ, специфічним до моноклонального антитіла, 2о специфічного до клітинного поверхневого білка МАС-1. Білок МАС-1 (СО11Б) є членом родини інтегрину й існує як гетеродимер з СО18. Комплекс СО110/СО18 є наявним на моноцитах, макрофагах, нейтрофілах і природних клітинах-кілерах Мак апа бітага). Резидентний тип МАС-1 реактивних клітин в мозку є, очевидно, мікроглією, якщо виходити з подібної фенотипової морфології на імунореактивних зрізах МАС-1. Зв'язане з бляшками мічення МАС-1 було нижчим в зразках мозку мишей, оброблених АМ 1792, порівняно з контрольною групою, сч котрій робилися ін'єкції РВ5, - факт, що збігається з відсутністю АВ-індукованої запальної реакції.

С. Висновок і)

Відсутність АВ-бляшок, а також реактивних, нейронних і гліотичних змін в мозку мишей, яким робились ін'єкції АВ1-42, вказує на те, що в мозку цих тварин амілоїдних відкладень чи зовсім не було, чи їх було дуже мало, як і не було патологічних наслідків, таких, як гліоз і невритна патологія. Миші РОАРР, оброблені ю зо АВ1-42, показали практично таку ж відсутність патології, що і контрольні, нетрансгенні миші. Отже ін'єкції

АВ1-42 є дуже ефективними у запобіганні утворенню відкладень і видаленні АВ людини із мозкової тканини, як і - у виключенні подальших нейронних і запальних дегенеративних змін. Таким чином, уведення пептиду АВ може су дати як профілактичний, так і терапевтичний позитивний результат у відверненні хвороби Альцгеймера.

ІЇ. Дослідження реакції на дозу --

Групи п'ятитижневих самок мишей шведський Вебстер (Змізз У/ерзіег) (кількість особин у групі М-6) були со імунізовані 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 04 або 0,1Змкг АВ, приготованого в препараті з СЕА/ЛЕА і введеного інтраперитонеальним шляхом. Три дози вводили з двотижневими інтервалами, а після них, через місяць уводили четверту дозу. Першу дозу емульгували з СЕРА, а решту доз - з ІРА. Через 4-7 днів після кожної імунізації, починаючи з другої дози, тваринам робили кровопускання для вимірювання титрів антитіл. Тваринам у « Підгруппі з трьох груп, імунізованих 71, 33 і З0Омкг антигена, робили додаткове кровопускання приблизно з з с місячними інтервалами протягом 4 місяців після четвертої імунізації для спостереження за спадом реакції . антитіл залежно від доз імуногенних препаратів. Ці тварини отримали п'яту, заключну імунізацію на сьомий и?» місяць від початку досліджень. Через тиждень після цього вони були препаровані для вимірювання імунних гуморальних реакцій на АМ 1792 і проведення токсикологічного аналізу.

У межах доз від З00 до З,7/мкг спостерігалося падіння реакції на дозу і відсутність реакції за двох

Го! найнижчих доз. Середні титри антитіл складали приблизно 1:1000 після трьох доз і приблизно 1:10000 після чотирьох доз 11-300Омкг антигена (Фіг.5). - Титри антитіл різко зростали в усій групі мінімальної дози з підвищенням МТ у 5-25 разів після третьої ко імунізації. Після цього спостерігалися низькі імунні реакції навіть у реципієнтів, що отримали 0,4мкг бо ін'єкції. Групи, ін'єктовані 1,2 і З,/мкг, мали титри, порівняні з СМТ приблизно 1000, а чотири найвищі дози - зібралися разом з ОМТ приблизно 25000, за винятком групи дози ЗЗмкг, де ОМТ був мінімальний і складав 3000. сп Після четвертої імунізації зростання титру антитіл у більшості груп було значно меншим. Тут спостерігався чіткий відгук на дозу в групах з мінімальною дозою антигена від 0,14мкг до 11мкг, який змінювався від невиявленого антитіла у реципієнтів О,14мкг до СМТ 36000 у реципієнтів 11мкг. Тут також титри в чотирьох ов групах найвищих доз від 11 до ЗО0Омкг зібрались разом. Таким чином, після двох імунізацій титр антитіл залежав від дози антигена у широкому діапазоні від 0,4 до ЗООмкг. У третьої імунізації титри від чотирьох найвищих (Ф) доз мали порівняні величини, і після додаткової імунізації залишалися на плоскій ділянці кривої. ка Через місяць після четвертої імунізації титри в групі ЗООмкг були у 2-3 рази вищими, ніж виміряні на зразках крові, відібраних через 5 днів після імунізації (Фіг). Це спостереження свідчить про те, що пік бо Вторинної імунної реакції настає більш ніж через 5 днів після імунізації. Помірніший (50905) зріст спостерігався у цей час в групі ЗЗмкг дози. В групі ЗООмкг дози через два місяці після останньої дози СМТ ступінчасто знизився приблизно на 7095. Ще через місяць спад склав 4595 (100мкг) і приблизно 1495 у доз ЗЗ і 11мкг. Таким чином, швидкість спаду в титрах циркулюючих антитіл після припинення імунізації є, очевидно, двофазною зі ступінчастим спадом у перший місяць після пікової реакції і більш помірною швидкістю зніження 65 після цього.

Титри антитіл і кінетика імунної реакції досліджених у даному експерименті мишей типу шведський Вебстер були подібні до тих, що спостерігалися у молодих особин гетерозиготних трансгенних мишей РОАРР, імунізованих паралельно. Дози препаратів, здатні індукувати імунну реакцію в людей, є, як правило, такими самими, що й аналогічні дози у мишей.

ПІ. Відбір за терапевтичною ефективністю щодо розвиненої хвороби Альцгеймера

Метою цих досліджень було проведення випробувань Імуногенних агентів за їхньою активністю щодо припинення або повернення у зворотному напрямку розвитку нейропатологічних характеристик хвороби

Альцгеймера у старших за віком тварин.

Імунізацію пептудом АВ довжиною в 42 амінокислоти (АМ 1792) почали у той час, коли амілоїдні бляшки вже /о З'явилися в мозку мишей РОАРР.

Протягом цих досліджень у мишей РОАРР, що не отримали ін'єкцій, розвилися численні нейродегенеративні зміни, аналогічні тим, що спостерігаються при хворобі Альцгеймера ІСатез еї аі!., див. вище; хУоппзоп-УуУоса еї аІ,, Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 94, 1550-1555 (1997)Ї. Відкладення АВ в амілоїд них бляшках асоціюється з дегенеративною нейронною реакцією із аберантних аксонних і дентритних елементів, що звуться дистрофічними нейритами. Амілоїдні відкладення, що оточуються дистрофічними нейритами і їх містять, звуться нейритними бляшками. Як у мишей із симптомами хвороби Альцгеймера, так і в мишей РОАРР дистрофічні нейрити мали чітку глобулярну структуру і виказували імунореактивність з планшетом антитіл, що розпізнають АРР і цитокаркасні компоненти, і відображали комплекс субклітинних дегенеративних змін на надструктурному рівні. Ці характеристики дозволяють здійснювати щодо відповідних хвороб селективні і відтворювані вимірювання 2о утворення нейритних бляшок в мозку РОАРР. Дистрофічний нейронний компонент нейритних бляшок РОАРР легко візуалізується антитілом, специфічним до АРР людини (моноклональним антитілом 8Е5), і просто вимірюється за допомогою комп'ютерного аналізу зображень. Таким чином, окрім вимірювань впливу АМ 1792 на утворення амілоїд них бляшок, автори вивчали вплив цієї обробки на розвиток нейритної дистрофії.

Астроцити і мікроглії є не-нейронними клітинами, що реагують на ступінь нейронного ушкодження |і сч ов Віддзеркалюють його. СЕАР-позитивні астроцити і МНО-ІІ-позитивні мікроглії, зазвичай, спостерігаються при хворобі Альцгеймера, і їх активація по мірі розвитку цієї хвороби збільшується. Таким чином, авторами були і) проведені також дослідження розвитку реактивного астроцитозу і мікрогліозу у мишей, оброблених АМ 1792.

А. Матеріали і методи

Сорок вісім гетерозиготних самок мишей РОАРР віком від 11 до 11,5 місяців, отримані від фірми Спагіез ю зо Гімег, були випадковим чином поділені на дві групи: 24 тварини для імунізації 10О0мкг АМ1792 і 24 тварини для імунізації РВ5, кожний з ад'ювантом Фрейнда. По досягненні приблизно 15-місячного віку групи АМ 1792 і РВ5 -- були знов поділені. У 15-місячному віці приблизно половина кожної групи АМ1792- і РВ5-імунізованих тварин с були піддані ейтаназії (п - 10 ії 9 відповідно), а решту тварин продовжували імунізувати до досягнення ними приблизно 18-місячного віку (п - 9 ії 12 відповідно). У процесі досліджень всього померло 8 тварин (5 тварин --

АМ1792 і З тварини РВ5). Окрім імунізованих тварин в дослідження були включені необроблені миші РОАРР со віком 1 рік (п - 10), 15 місяців (п - 10) ї 18 місяців (п - 10) для порівняння в аналізі ЕГІ5А за рівнями АВ і АРР в мозку; однорічні тварини були також включені в імуногістохімічний аналіз.

Методика досліджень в цілому була такою, як описано в Прикладі 1. У приготуванні антигена для шести імунізацій тварин у 15-місячому віці були використані партія 12 пептидів від О5 Реріїдез і партія МЕОЗ339 « пептиду АМ1792 від Саїйогпіа Реріїдез. Партії МЕОЗ39 | МЕО439 від Саїйогпіа Реріідез були використані в пл») с трьох додаткових імунізаціях, що проводились тваринам у віці між 15 і 18 місяцями.

Для здійснення імунізації пептид АМ1792 у кількості 100мкг у 200мкл розчину РВ5 або тільки РВ5 були ;» емульговані у співвідношенні 1:1 (об.) з повним ад'ювантом Фрейнда (СЕА), неповним ад'ювантом Фрейнда (ІБА) або РВ5З в кінцевому об'ємі 40О0мкл. Першу імунізацію робили з ад'ювантом СЕА, наступні 4 дози вводили з ад'ювантом ІРА, а заключні 4 дози - тільки РВ5 без добавлення ад'юванту. Вищеперелічені дев'ять імунізацій о були зроблені протягом семимісячного періоду з двотижневим інтервалом для перших трьох доз і чотиритижневим інтервалом для решти ін'єкцій. Група тварин, яка була імунізована чотири місяці, одержала - лише перші 6 імунізацій і була піддана ейтаназії у п'ятнадцятимісячному віці. ко В. Результати 1. Вплив ін'єкцій АМ 1792 на амілоїд не навантаження - Результати імунізації пептидом АМ 1792 на кортикальне амілоїд не навантаження визначені кількісним сп аналізом зображень і показані на Фіг.7. Середня величина кортикального амілоїд ного навантаження становила 0,2895 в групі неімунізованих 12-місячних мишей РОАРР - типовий рівень бляшок у мишей на початку досліджень. У 18-місячному віці амілоїдне навантаження зросло більш ніж в 17 разів і досягло 4,8795 у тварин, оброблених РВ5, у той час як у тварин, імунізованих АМ 1792, спостерігалося значне зниження амілоїдного навантаження, яке становило лише 0,0195, тобто значно менше, ніж у 12-місячних неімунізованих тварин і у

Ф) тварин як 15-місячного, так і 18-місячного віку, оброблених РВ5. Амілоїдне навантаження значно зменшилося у ка реципієнтів АМ1792 як у 15-місячному (9695 зниження; р-0,003), так і у 18-місячному (зниження 29990; р-0,0002) віці. во Утворення кортикальних амілоїдних відкладень у мишей РОАРР, як правило, починалося у лобовій і ретроспленіальній корах (КС) головного мозку і прогресувало далі у вентрально-бічному напрямку, залучаючи до цього процесу скриневу й енторхінальну кори (ЕС). У 12-місячних мишей - приблизний вік, в якому починалися ін'єкції АМ1792, -амілоїдні відкладення в ЕС були або дуже малими або нульовими. За чотири місяці ін'єкцій

АМ1792 амілоїдні відкладення значно зменшилися в КС, а прогресуюче залучення ЕС внаслідок обробки 65 пептидом АМ 1792 було повністю виключене. Останнє з цих спостережень свідчить про те, що АМ 1792 повністю зупиняє розвинення амілоїду, який, як завжди, захопив би темпоральну і вентральну кори головного мозку, а також зупиняє або, можливо, повертає у зворотному напрямку розвинення відкладень в КСО.

Значний вплив імунізації пептидом АМ1792 на розвинення кортикального амілоїдного навантаження у мишей

РОАРР був продемонстрований також в групі 18-місячних тварин, імунізація яких тривала 7 місяців. У тварин цієї групи, імунізованих АМ1792, кортикальний амілоїд був практично повністю відсутній, дифузійних бляшок не було зовсім, а кількість густих відкладень зменшилася. 2. Клітинні і морфологічні зміни, пов'язані з обробкою АМ 1792

В ділянках мозку, де зазвичай утворюються амілоїдні відкладення, була виявлена популяція АВ-позитивних клітин. Слід підкреслити, що в декількох зразках мозку реципієнтів АМ 1792 було знайдено дуже мало, а іноді уо не знайдено зовсім зовнішньоклітинних кортикальних амілої'їдних бляшок. Очевидно, що імунореактивність АВ зосереджена, головним чином, в клітинах з великою лобулярною або скупченою сомою. З фенотипічного погляду ці клітини нагадують активовані мікроглії або моноцити. Вони були імунореактивними з антитілами, що розпізнають ліганди, експресовані активованими моноцитами і мікрогліями (МНС І Її СО115) і були випадковим чином зв'язані зі стінками і порожнинами кровоносних судин. Порівняння близько один до одного розташованих /5 Зрізів, мічених АВ- Її МНС ІІ-специфічними антитілами, виявило, що обома класами антитіл були розпізнані подібні одна одній конфігурації цих клітин. Детальне обстеження зразків мозку, обробленого АМ 1792, показало, що МН ІІ-позитивні клітини були зосереджені поблизу обмеженого амілоїду, що залишився в цих тваринах. У застосованих умовах фіксації ці клітини не були імунореактивними до антитіл, які розпізнають Т-клітинні (СОЗ,

СОЗе) або В-клітинні (СО45КА, СО45КВ) ліганди або лейкоцитоспільний антиген (СО45), але були реактивними до антитіла, що розпізнає лейкозіалін (СО43), котрий вступає в перехресні реакції з моноцитами. У жодної з піддослідних тварин, оброблених РВ5, таких клітин знайдено не було.

У мишей РОАРР незмінно розвивалося важке амілоїдне відкладення у зовнішньому молекулярному шарі гіпокампової зубчастої звилини. Це відкладення утворювало чітку стрічку в перфоруючому проході - субділянці, яка незмінно містить амілоїдні бляшки при хворобі Альцгеймера. Характерний вигляд цих відкладень у мишей, сч оброблених РВ5, нагадував ті, що раніше спостерігалися у необроблених тварин РОАРР. Це амілоїдне відкладення складалося як із дифузійних, так і зі згущених бляшок у безперервній стрічці. У протилежність і) цьому в багатьох зразках мозку мишей, оброблених АМ 1792, ця картина була зовсім іншою. Тут гіпокампове амілоїдне відкладення більш не містило дифузійного амілоїду, а стрічкова конфігурація була повністю зруйнована. Замість цього спостерігалася велика кількість незвичайних крапкових структур, які реагували з ю зо антитілами до АВ і декілька із яких були, очевидно, клітинами, що містили амілоїд.

Поблизу зовнішньоклітинного амілоїду у тварин, імунізованих АМ1792, часто спостерігалися МНС П-позитивні (87 клітини. Ця картина сполучення АВ-позитивних клітин з амілоїдом була дуже схожою в декількох зразках мозку с мишей, оброблених АМ 1792. Розподіл цих моноцитних клітин був обмежений безпосередньою близкістю амілоїдного відкладення і був цілком відсутній в інших ділянках мозку, чистих від бляшок АВ. Конфокальні -- мікроскопічні обстеження МН 1І- і АВ-мічених зрізів показали, що бляшковий матеріал містився в багатьох со моноцитних клітинах.

Кількісний аналіз зображень МНС її і МАС 1-мічених зрізів показав тенденцію до збільшення імунореактивності в КЗС і гіпокампі мишей, оброблених АМ 1792 порівняно з групою РВ5, яка досягла значної, виміряної за допомогою МАС 1, реактивності в гіпокампі. «

Розглянуті результати свідчать про активне, клітинно-опосередковане видалення амілоїду на ділянках мозку, з с навантажених бляшками. . 3. Вплив АМ 1792 на рівні АВ; твердофазний імуноферментний аналіз и?» (а) Кортикальні рівні

У неімунізованих мишей РОАРР середній рівень загального АВ в корі головного мозку на дванадцятому

Місяці складав 160Онг/г і зростав до 870Онг/г по досягненню ними п'ятнадцяти місяців (Табл. 2). На 18 місяці

Го! ця величина становила 22000Онг/г і зростала більш ніж десятикратно протягом часу тривання експерименту.

Тварини, оброблені РВ5, мали рівень загального АВ 86б0Онг/г на 15 місяці, який зростав до 1900Онг/г на 18 - місяці. У протилежність цьому тварини, імунізовані АМ 1792, мали на 15 місяці на 81906 менше загального АВ ко (160Онг/г), ніж тварини, імунізовані РВ5. Значно менша кількість (р-0,0001) загального АВ (5200 нг/г) була знайдена у 18 місячних тварин при порівнянні груп, оброблених АМ 1792 | РВ5 (Табл. 2), що показало 7295 - зниження загального АВ, який би в іншому разі був наявним. Аналогічні результати були отримані при порівнянні сп кортикальних рівнів АВ42 і, зокрема, те, що група, імунізована АМ1792, містила набагато менше АВ42, але у цьому випадку різниця між АМ 1792- і РВЗ-групами була значною як у 15 місячних тварин (р-0,04), так і у 18 місячних тварин (р-0,0001, Табл. 2).

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 2. Середні рівні АЯ в корі головного мозку, чг/г

Неімунізовані тварини РАБ АМ1792

Вік | Всього | АВ42 Всього | Ар4? Всього | АВ42 12 1600 1300 | (10) 70 15 8700 8300 | (1031 8600 7200 (9) 1600 ! 130075 у (10) 18 22200 1185001 (103 1 19000 | 15900 1 (12) 1 52007 | 40001 (9) "р: 0,0412 "р: 0,0001 (5) Гіпокампові рівні

У необроблених мишей РОАРР середні ппокампові рівні загального Ар на 12 місяці віку становили 1500Онг/г ії зростали до 5100Онг/г на 15 місяці і далі до 8100Онг/г на 18 місяці (Табл. 3). Подібно цьому тварини, імунізовані РВ5, показали рівні АВ, що складали 400ООнг/г і б650ООнг/г на 15 і 18 місяцях відповідно.

Тварини, імунізовані АМ 1792, мали менші рівні загального АВ, які складали, зокрема, 2500О0Онг/г і 510ООнг/г на 15 місячному і 18 місячному віці відповідно. Група 18 місячних особин, імунізованих АМ 1792, мала значно менші кількості АВ, ніж група, оброблена РВЗ (р-0,0105; Табл. 3). Вимірювання АВ4А2 дали аналогічні результати і, зокрема, те, що в групі, обробленій АМ 1792, рівні АВ були значно меншими, ніж в групі РВ5 (3900Онг/г і сч 57000Онг/г відповідно; р-0,002) у 18 місячному віці (Табл. 3). о

Таблиця 3. Середні рівні АЯ в гіпокампї, нг/г

Неїмунізовані тварини Ро дм1792 ю "ет еез же е вне ке тва! де - 12 15500 5111001 (19) сч 15 | 5ІіБО0 | 444001 (1031 40100 1 3570 1 (93 1 2450 22100 (10) - г) 18 8800 |564200| (10) | 65400 5710 14132) 5090 зво (9) "р: 0,0105 - р 00022 ч 70 (с) Церебелярні рівні не с У 12 місячних неімунізованих мишей РОАРР середній церебелярний рівень загального АВ складав 15нг/г :з» (Табл. 4). На 15 місяці життя він зростав до 28нг/г, а на 18 місяці - до З5нг/г. Тварини, оброблені РВ5, показали середній рівень загального АВ 21нг/г на 15 місяці і 4Знг/г на 18 місяці. Тварини, оброблені АМ 1792, мали 22нг/г загального АВ на 15 місяці і значно менше (р-0,002) на 18 місяці (25нг/г) порівняно з відповідною 395 групою РВЗ (Табл. 4). (ее) - Таблиця 4. Середні рівні АД в мозочку, нг/г ко) Неімунізовані тварини Рв АМ1792 7 ас веж рсоте Бекетел сл 12 15,8 (10) їй 15 27,7 (10) 20,8 (9) 21,7 (10) о 18 35,0 (10) 431 (12) 24,8" (9) т "р х 0,0018 . 4. Вплив обробки пептидом АМ 1792 на рівні АРР 60 АРР-А і молекули АРР повної довжини містили всю або частину послідовності АВ і, таким чином, могли зазнати впливу від генерування АМ1792-спрямованої імунної реакції. В дослідженнях, проведених на сьогоднішній день, невеликий зріст рівнів АРР був відмічений як нейропатологічний у мишей РОАРР. В корі головного мозку рівні як АРР-А/РІ (Р: ШІ Іепд(й - повної довжини), так і АРР-А не зазнали значних змін внаслідок обробки, за винятком того, що АРР-А знизився, на 1995 у 18-місячній точці вимірювань у тварин, бо імунізованих АМ 1792, порівняно з групою, обробленою РВ5. Величини АРР у 18-місячних тварин, імунізованих

АМ1792, не відрізнялися у значній мірі від величин, отриманих у 12-місячній і 15-місячній неімунізованій і 15-місячній імунізованій РВ5 групах. В усіх випадках величини АРР залишалися в межах, що вважаються нормальними для мишей РОАРР. 5. Вплив імунізації пептидом АМ1792 на нейродегенеративну і гліотичну патології Нейритне бляшкове завантаження в лобовій корі мишей, імунізованих АМ1792, було значно нижчим порівняно з групою РВ5 як у 15-місячному (84905; р-0,03), так і у 18-місячному (5590; р-0,01) віці (Фіг. 8). Середня величина нейритного бляшкового завантаження зростала від 0,3295 до 0,4995 в групі РВ5 на відтинку між 15 і 18 місяцями віку. Це контрастувало зі суттєво зниженим розвитком нейритних бляшок в групі, імунізованій АМ 1792, де середні /р величини нейритного бляшкового навантаження складали 0,0595 і 0,2295 у 15-місячній і 18- місячній групах відповідно.

Імунізація пептидом АМ1792 показала себе як така, що добре переноситься організмом реципієнта, а реактивний астроцитоз був також значно зменшений у К5С мозку мишей, імунізованих АМ1792, порівняно з групою РВ5 як у 15-місячному (5690; р-0,011), так і у 18-місячному (3990; р-0,028) віці (Фіг.9). Середні /5 Величини відсотку астроцитозу в групі РВЗ зросли на відтинку від 15 до 18 місяців від 4,2695 до 5,21905.

Імунізація пептидом АМ1792 приглушує розвинення астроцитозу в обох вікових точках до 1,8995 і 3,295 відповідно. Це свідчить про те, що нейропіль не був ушкоджений процесом видалення амілоїду. 6. Гуморальні імунні реакції

Як зазначалося вище, був проведений експеримент, в якому 11-місячні гетерозиготні миші РОАРР (кількістю

М 24 особини) отримали серію із 5 імунізацій 10О0мкг АМ1792, емульгованого з ад'ювантом Фрейнда й уведеного інтраперитонеальним шляхом на 0, 2, 4, 8 і 12 тижні, і 6 імунізацій тільки РВ5 (без ад'юванту

Фрейнда) на 16-ому тижні. У якості негативних контрольних зразків використовувалась паралельна група із 24 трансгенних мишей аналогічного віку, які отримували імунізації РВ5, емульгованого з такими самими ад'ювантами й уведеного за такою самою схемою. Тваринам робили кровопускання через 3-7 днів після кожної сч ов імунізації починаючи з другої дози. імунну реакцію на АМ1792 виміряли за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу ЕГІЗА. Середні геометричні титрів (СМТ) тварин, імунізованих АМ 1792, складали і) приблизно 1900, 7600 і 45000 після другої, третьої і останньої (шостої) доз відповідно. Після шостої імунізації у контрольних тварин АВ-специфічного антитіла зареєстровано не було.

Приблизно половина тварин була піддана оброблянню протягом ще З місяців і одержала імунізацію ю зо приблизно на 20, 24 і 27 тижнях. Усі ці дози уводилися лише в РВ5-носії без ад'юванта Фрейнда. Протягом усього цього часу середні титри антитіл залишалися незмінними. Таким чином, титри антитіл залишалися - стабільними на відтинку від четвертого до восьмого кровопускання, що відповідало періоду від п'ятої до с дев'ятої ін'єкції.

Для визначення того, чи викликані імунізацією АВ-специфічні антитіла, виявлені у сироватці мишей, -- оброблених АМ 1792, були також пов'язані з відкладеним в мозку амілоїдом, підгрупа зрізів від мішей, со імунізованих АМ 1792 і РВ5, були піддані реакції з антитілом, специфічним до мишачого Ід. У протилежність групі РВ5, АВ-бляшки в зразках мозку, імунізованого АМ 1792, були покриті ендогенним до. Така різниця між двома групами спостерігалася як у 15-місячній, так і у 18-місячній групах. Особливо вражаючим був брак мічення в групі РВ5, незважаючи на наявність важкого амілоїдного навантаження у цих мишей. Ці результати « показують, що імунізація синтетичним білком АВ генерує антитіла, що розпізнають і зв'язуються іп мімо з АВ в з с амілоїдних бляшках. 7. Клітинно-опосередковані імунні реакції з У 9 мишей РОАРР 18-місячного віку, імунізованих АМ1792, і 12 мишей РОАРР того ж віку, імунізованих РВ5, на сьомий день після дев'ятої імунізації були видалені селезінки. Із селезінок відділили спленоцити, які

Вирощували протягом 72 годин у присутності АВ40, АВ42 або АВ40-1 (білок зворотного порядку). У якості

Го! позитивного контрольного зразка використовувався мітоген Соп А. Оптимальні реакції були одержані з білком 21,7мкМ. Клітини, відібрані у всіх У тварин, оброблених АМ 1792, проліферували у відповідь як на - білок АВ1-40, так і на білок АВ1-42 з однаковими рівнями вбудовування для обох білків (Фіг.10, верхній). На ко зворотний білок АВ40-1 реакції не було. Клітини від контрольних тварин не відповіли на жодний з АВ білків (Фіг.10, нижній). - С. Висновок сп Результати цих досліджень показують, що імунізація пептидом АМ 1792 мишей РОАРР, які мали амілоїдні відкладення, сповільнює розвинення амілоїдних відкладень і відвертає його, а також затримує зумовлені ними невропатологічні зміни в мозку старих мишей РОАРР. Імунізація пептидом АМ 1792 практично зупиняє ов розвинення амілоїду в структурах, які зазвичай уражаються амілоїдозом. Таким чином, уведення пептиду АВ дає терапевтично корисний ефект у лікуванні хвороби Альцгеймера.

Ф) ІМ. Відбирання фрагментів АВ ка Сто мишей РОАРР 9-11-місячного віку були імунізовані дев'ятьма різними ділянками АРР і АВ для визначення того, які епітопи дають ефективну реакцію. Мишам були ін'єктовані інтраперитонеально 9 різних імуногенів і 1 во контрольний препарат, як описано вище. В число імуногенів ввійшли 4 АВ-пептидні кон'югати людини 1-12, 13-28, 32-42, 1-5 -всі зв'язані з дб вівці проти миші через цистеїновий зв'язок; амінокислоти 592-695 поліпептиду АРР, агрегований АВ1-40 людини, агрегований Ар25-35 людини й агрегований АВ42 физуна.

Афегований Ар42 і фізіологічний розчин РВ5 використовувалися як позитивний і негативний контрольні препарати відповвідно. В кожну оброблювану фупу входило по 10 тварин. Спостереження за титрами б5 проводилось так, як описано вище, а ейтаназію мишей робили в кінці 4-місячного періоду після ін'єкцій.

Гістохімію, визначення рівнів АВ і токсикологічний аналіз проводили розі тогіет.

А. Матеріали і методи 1. Готування імуногенів

Готування зв'язаних пептидів АВ. Чотири кон'югати пептиду АВ людини (амінокислотні залишки 1-5,1-12,13-28 і 32-42, кожний кон'югований з Ід вівці проти миші) були приготовані шляхом зв'язування через штучний цистеїн, добавлений в пептид АВ за допомогою зшивного реагенту сульфо-ЕМО5. Похідні пептиду АВ були синтезовані такими кінцевими амінокислотними послідовностями:

Пептид Ар1-12: МН2-ОАДЕРКНОЗОМЕМС-СООН (5ЕО. ІО Мо. 72)

Пептид АВ1-5: МН2-ОАЕРКС-СООН (5ЕО ІО Мо. 73) 70 Пептид АВ33-42: МН2-С-аміногептанова кислота-зІЇ ММОСУМА-СООН (5ЕО. ІЮО Мо. 74)

Пептид АВІ13-28: Ас-МНАННОКІ МЕЕАЕОМОЗМКОСС-СООН (5ЕО. ІО Мо. 75)

В усіх випадках місцезнаходження вставленого цистеїнового залишку позначено підкреслюванням. Похідна пептиду АВ 13-28 мала також два гліцинових залишки, добавлених, як показано, перед карбокси-кінцневим цистеїном.

Для підготування реакції зв'язування 1Омг до вівці проти миші (Часквоп ІттипокКевзеагсі І арогайогіев) були піддані діалізу протягом ночі з протилежним 10ММ буферним розчином борату натрію, рН 8,5. Діалізоване антитіло було концентроване в об'ємі 2мл за допомогою центрифужної препаративної пробірки Атісоп

Сепігіргер. 1Омг сульфо-ЕМОС5 |М-(є-малеімідокупроілокси)сукциніміду| (фірма МоїІесшаг Зсіепсев Со.) розчинили в мл деіонізованої води. До дос вівці проти миші по краплях при перемішуванні був добавлений сульфо-ЕМОЗ у 40-кратному молярному надлишку, після чого розчин перемішали протягом ще 10 хвилин.

Активований дО вівці проти миші очистили, і буферний розчин замінили перепусканням над фільтраційною колонкою з 1Омл гелю (Ріегсе Ргевіо СоЇштп, від фірми Ріегсе СпетісаіІв), зрівноваженою 0,1М МаРої4, 5ММ

ЕОТА, рН 6.5. Фракції, які містили антитіла, були ідентифіковані шляхом світлопоглинання на хвилі 28Онм, об'єднані і розріджені до концентрації приблизно 1мг/мл, використовуючи в якості коефіцієнта екстинкції с

Величину 1,4мг на оптичну густину. Сорокакратний надлишок пептиду АВ розчинили в 20мл 10мМ МарРо4, рН 8,0, за винятком пептиду Ар33-42, 10мг якого було спочатку розчинено в О0,5мл ЮОМ5О, а потім розріджено до 20мл о 10ММ буферним розчином МаРо4. Кожний пептидний розчин добавили до 1Омл активованого дос вівці проти миші, і суміші струшували при кімнатній температурі протягом 4 годин. Отримані в результаті кон'югати концентрували до кінцевого об'єму менше 10мл за допомогою центрифужної пробірки Атісоп Сепігіргер, після ою чого їх піддали діалізу з протилежним РВ5, замінили буфер і видалили вільний пептид. Кон'югати перепустили через фільтри з 0,22мкм порами для стерилізації і потім розділили на фракції мг, які заморозили при - температурі -2020. Концентрацію кон'югатів визначали шляхом ВСА білкового аналізу (Ріегсе Спетісаї!5), де в Га якості стандартної кривої використовували конячий дО. Кон'югацію реєстрували за зростанням молекулярної маси кон'югованих пептидів відносно маси активованого дО вівці проти миші. Кон'югат АВ1-5 вівці проти миші - 3з5 являв собою пул із двох кон'югатів, а решту утворювали залишки поодиноких препаратів. ее) 2. Готування агрегованих пептидів АВ

Пептид 1-40 людини (АМ1528, Саїйогпіа Реріідез Іпс., партія МЕО541), пептид 1-42 людини (АМ1792,

Саїйогпіа Реріідез Іпс., партії МЕОЗ339 і МЕО0439), пептид 25-35 людини і пептид 1-42 гризуна (Саїйогпіа «

Реріїдевз Іпс., партії МЕО218) були солюбілізовані у свіжому стані для приготування наборів ін'єкцій із ліофілізованих порошків, які зберігалися висушеними при -202С. З цією метою 2мг пептиду добавляли до О009мл й с деіонізованої води, і суміш інтенсивно перемішували для утворення відносно однорідного розчину чи суспензії. а Із чотирьох вищеперелічених пептидів АМ1528 був єдиний, що піддавався розчиненню на цій стадії. Після цього "» добавили аліквоту 100мкл ТОХ РВЗ (1Х РВО: 0,15М Масі, 0,01М фосфату натрію, рН 7,5), і АМ 1528 одразу почав преципітувати. Суспензію знову інтенсивно перемішали і після перемішування залишили для інкубування протягом ночі при 372С для використання її наступного дня. (ее) Готування білка рВхб. За методикою, описаною в (ОГегзаогі еї аї.,.). Віої. Спет. 265, 4492-4497 (1990), - була сконструйована плазміда експресії, що кодує рВхб - злитий білок, який складається із 100-амінокислотної

М-кінцевої послідовності-лідера полімерази бактеріофагу М5-2, за якою слідують амінокислоти 592-695 АРР іме) (ВАРР). Плазміду трансфікували в Е. Соїї, і білок після індукування промотора експресували. Бактерії були -л 20 лізовані у 8М сечовині, і рВхб частково очистили препаративним ЗО5З-РАСЕ (електрофорезом в поліакриламідному гелі при наявності додецилсульфату натрію). Фракції, що містили рВхб, були ідентифіковані сл за допомогою вестерн-блотінгу із використанням поліклонального антитіла кролика проти рВхб, об'єднані, концентровані в центрифужній пробірці Атісоп Сепігіргер і діалізовані проти РВ5. Ступінь чистоти препарату, оцінена за допомогою БО5-РАСЕ, забарвленого Соотаззіе-голубим, складала приблизно 5-1095.

В. Отримані результати і їх обговорення о 1. План досліджень

Від фірм Спагіез Кімег І арогайгіевз і Тасопіс І арогаїогу були одержані 100 самців і самок гетерозиготних їмо) трансгенних мишей РОАРР віком від 9 до 11 місяців, яких поділили на 10 груп для імунізації різними ділянками

АВ або АРР разом з ад'ювантом Фрейнда. Тварин розподілили так, щоб вони якомога ближче збігалися в групах 60О за статтю, віком, родовідом і джерелом. Імуногени містили 4 пептиди АВ, виведені із послідовності людини: 1-5, 1-12,13-28 і 33-42, кожний з яких був кон'югований з дО вівці проти миші; 4 агреговані пептиди Ар: 1-40 (АМ1528) людини, 1-42 (АМ1792) людини, 25-35 людини і 1-42 гризуна; і злитий поліпептид, позначений як рВхб, який містив амінокислотні залишки 592-695 АРР. Десята група була імунізована РВ5, сполученим з ад'ювантом і виконувала роль контрольної групи. 65 Для кожної імунізації Т0О0мкг кожного пептиду АВ в 200мкл РВЗ або 20Омкг рВхб, виведеного із АРР, в однаковому об'ємі РВЗ або один лише РВ5 були емульговані у співвідношенні 1:1 (об.) з повним ад'ювантом

Фрейнда (СЕА) у кінцевому об'ємі 40О0мкл для першої імунізації, за якою слідувала бустер-ін'єкція такої ж кількості імуногена в неповному ад'юванті Фрейнда (ІБА) для наступних чотирьох доз і з РВ5 для заключної дози. Імунізаційні ін'єкції робились інтраперитонеально з двотижневим інтервалом для перших трьох дозі з місячним інтервалом для решти доз. Через 4-7 днів після кожної імунізації, починаючи з другої дози, тваринам робили кровопускання для вимірювання титрів антитіл. Ейтаназії тварин піддавали приблизно за тиждень після заключної дози. 2. Рівні АВ і АРР в мозку

Приблизно через 4 місяці після імунізації різними пептидами АВ або похідною АРР у кожної з просочених 70 фізіологічним розчином тварин видалили мозок. Одну півкулю мозку препарували для імуногістохімічного аналізу, а іншу використовували для кількісної оцінки рівнів АВ і АРР. Для вимірювання концентрацій різних форм В-амілоїдного пептиду і амілоїдного прекурсорного білка півкулю розсікали, і гомогенати гіпокампової, кортикальної і серебелярної ділянок препарували в 5М гуанідині. Препарати розрідили, і провели кількісну оцінку рівня амілоїду або АРР шляхом порівняння із серією розчинів стандартів пептиду Ар і АРР з відомими 7/5 Концентраціями у форматі ЕГІЗА.

Середня концентрація загального АВ в контрольній групі, імунізованій РВ5, була у 5,8 разів вищою в гіпокампі, ніж у корі головного мозку (середній рівень 24,318нг/г гіпокампової тканини порівняно з 4,221нг/г в корі головного мозку). Середній рівень в мозочку тварин контрольної групи (23,4нг/г в тканині) був приблизно в 1000 разів менше, ніж в гіпокампі. Ці рівні були подібними тим, про які доповідалося раніше стосовно гетерозиготних трансгенних мишей РОАРР такого ж віку Юоппзоп-Ууоовд3з еї аї., 1997, див. вище).

У корі головного мозку підгрупа із груп тварин, що піддавалися імунізації, мала середні рівні загального

АВ і АВ1-42, які значно відрізнялись від відповідних рівнів у контрольній групі (р 0,05). Ці тварини отримували

АМ-1792, АВ1-42 гризуна і кон'югат пептиду АВ 1-5, як показано на Фіг.11. Середні рівні загального АВ були знижені на 7595, 7995 і 6195, відповідно, порівняно з контрольними тваринами цих груп обробки. Помітної сч в Кореляції між титрами АВ-специфічного антитіла і рівнями АВ в кортикальній ділянці мозку в цих групах не було.

В гіпокампі середнє зниження загального АВ, пов'язане з імунізацією АМ-1792 (4695, р-0,0543), не було і) таким великим, як спостерігалося в корі головного мозку (7595, р-0,0021). Але величина зниження в гіпокампі була більшою, ніж в корі головного мозку, і становила 11,18бнг/г тканини в гіпокампі порівняно з 317нг/г тканини в корі головного мозку. В фупах тварин, що одержували АВ1-42 гризуна або АВ1-5, середні рівні ю зо загального АВ були знижені на З3бУю і 2695 відповідно. Проте з погляду на малі розміри груп і високу змінюваність рівнів амілоїдного пептиду поміж тваринами в обох групах, це зниження не було значним. --

Результати вимірювання рівнів АВ1-42 в гіпокампі показали, що жодне зі зумовлених імунізацією знижень не с було значним. Таким чином, внаслідок меншого навантаження АВ в корі головного мозку зміни в цій ділянці являють собою більш чутливий індикатор впливу імунізації. Зміни рівней АВ в корі головного мозку, визначені -- зв5 за допомогою аналізу ЕПІЗА, є подібними, але не ідентичними результатам, отриманим за допомогою со імуногістохімічного аналізу (див. нижче).

Загальна кількість АВ була також виміряна в мозочку - ділянці, яка зазвичай у найменшій мірі зачеплюється патологією хвороби Альцгеймера. Жодна зі середніх концентрацій АВ в групах, імунізованих різними пептидами

АВ або похідною АРР, не відрізнялась від концентрації в контрольній групі на цій ділянці мозку. Цей результат « бВвідчить про те, що на непатологічні рівні Ар проведена імунізація не впливає. з с Була визначена також концентрація АРР у корі головного мозку і мозочку імунізованих і контрольних мишей за допомогою аналізу ЕГІЗА. Було проведено два різних аналізи АРР. Перший із них, скерований на АРР-А/РІ, ;» розпізнав як АРР-А (А являє собою секретовану форму АРР, яка була розщеплена в межах послідовності АВ), такі форми АРР повної довжини (РІ), у той час як другий аналіз розпізнав лише АРР-А. У протилежність Зумовленому імунізацією зниженню АВ в підгрупі оброблених груп, рівні АРР тут залишалися незмінними в усіх

Го! імунізованих тваринах, порівняно з контрольними. Ці результати показують, що імунізація пептидами АВ не знижує АРР, а вплив її є скоріше специфічним до АВ. - Таким чином, підсумовуючи вищевикладене, можна сказати, що рівні загального АВ і АВ1-42 були значно ко знижені в корі головного мозку внаслідок імунізації АМ 1792, АВ1-42 гризуна і кон'югатом АВ1-5. В гіпокампі загальний АВ значно знизився лише через імунізацію пептидом АМ 1792. Всі інші пов'язані з імунізацією зміни - рівнів АВ або АРР в гіпокампі, кортикальній і церебелярній ділянках були незначними. сп 3. Гістохімічний аналіз

Зразки мозку тварин із шести груп були препаровані для імуногістохімічного аналізу: трьох груп, імунізованих АВ-пептидними кон'югатами АВ1-5, АВ1-12 | АВ 13-28; двох груп, імунізованих агрегатами АМ 1792 і дво АМ 1528 повної довжини і одної, контрольної, групи, обробленої РВ5. Результати аналізу зображень амілоїдного навантаження в зрізах мозку тварин цих груп показані на Фіг.12. Звідси видно, що місце мало значне зниження

Ф) амілоїдного навантаження в кортикальних ділянках мозку тварин трьох імунізованих груп порівняно з ка контрольними тваринами. Найбільше зниження амілоїдного навантаження спостерігалося в групі, імунізованій

АМ 1792, де середня величина його була знижена на 9795 (р-0,001). Значне зниження спостерігалося також у 6о тварин, імунізованих АМ-1528 (9595, р-0,005) ї АВ1-5 пептидним кон'югатом (6770, р-0,02).

Результати кількісної оцінки загального АВ або АВ1-42 за допомогою аналізу ЕГІЗА і визначення амілоїдного навантаження шляхом аналізу зображень у певній мірі відрізнялися між собою. Імунізація АМ 1528 показала значний вплив на рівень кортикального амілоїдного навантаження у вимірюваннях за допомогою кількісного аналізу зображень, але це не підтвердилося величиною концентрації загального АВ в тій самій ділянці, 65 обстеженій за допомогою аналізу ЕЇІЗА. Різниця між цими двома результатами зумовлена, очевидно, специфічністю цих методів аналізу. Аналіз зображень дозволяє вимірювати лише нерозчинний АВ, агрегований в бляшках. У протилежність цьому твердофазний імуноферментний аналіз ЕІ ІЗА зачеплює всі форми АВ - як розчинні, так і нерозчинні, мономерні і агреговані. Таким чином, оскільки патологія захворювання асоціюється з пов'язаною з бляшками нерозчинною формою АВ, техніка аналізу зображень може бути більш чутливою щодо

Виявлення ефектів імунізації. З іншого боку, оскільки методика аналізу ЕГІЗА є більш швидкою і легкою, ций метод є вельми корисний для скринінгу. Крім того, аналіз ЕІ ІЗА дозволяє встановити, що зумовлене імунізацією зниження АВ є більшим в тій частині АВ, що зв'язана з бляшками, ніж загального АВ.

Для визначення того, чи реагували індуковані імунізацією АВ-специфічні антитіла з амілоїдними відкладеннями в мозку імунізованих тварин, препарати зрізів мозку цих тварин і контрольних мишей були піддані /о реакціям з антитілом, специфічним до мишачого дб. У протилежність групі, обробленій РВ5, бляшки, що містили АВ, були покриті ендогенним дос на зразках тварин, імунізованих АВ-пептидними кон'югатами АВ1-5,

АВ1-12 і АВ 13-28 і повнодовжинними АВ-агрегатами АМ 1792 і АМ 1528. Зразки мозку тварин, імунізованих іншими пептидами АВ або АРР-пептидом рВхб, цьому аналізу піддані не були. 4. Вимірювання титрів антитіл

На 4-7 дні після кожної імунізації, починаючи з другої, мишам робили кровопускання у загальній кількості 5 разів. Титри антитіл вимірювали як антитіло, що зв'язує АВ1-42, за допомогою сендвіч-аналізу ЕГІ5А, де використовувались пластмасові багатоямкові планшети, покриті АВ1-42. Як показано на Фіг.13, пікові титри антитіл з'являлися після четвертої дози тих чотирьох імуногенних препаратів, які викликали найвищі титри АМ 1792-специфічних антитіл: АМ1792 (пік ЗМТ: 94647), АМ1528 (пік ОМТ: 88231), кон'югат АВ1-12 (пік ОМТ: 47216) 1 АВ1-42 гризуна (пік МТ: 10766). Титри цих груп в деякій мірі спадали після п'ятої або шостої доз. Для решти з п'яти імуногенів пікові титри одержувались після п'ятої і шостої доз і були значно меншої величини, ніж ті, що спостерігалися в чотирьох фупах з найвищими титрами: кон'югат АВ1-5 (пік ЗМТ: 2356), рВхб (пік

ОМТ: 1986), кон'югат АВ13-28 (пік ОМТ: 1183), кон'югат АВ33-42 (пік ОМТ: 658), АВ25-35 (пік ОМТ: 125). Були виміряні також титри антитіл проти гомологічних пептидів з використанням того самого сендвіч-формату ЕГІЗА сч ов для імуногенів по групах, імунізованих АВ1-5, АВ 13-28, АВ25-35, АВЗ33-42 або АВ1-42 физуна. Ці титри були приблизно такими самими, що й виміряні проти АВ1-42, за винятком імуногена АВ1-42 физуна, у випадку якого і) титри антитіла проти гомологічного імуногена були приблизно в два рази вищими. Величини титру

АМ1792-специфічного антитіла в окремих тварин або середні величини по імунізованих фупах не корелювали з ефективністю, виміряною за зниженням АВ в корі головного мозку. ю зо 5. Лімфопроліферативні реакції

АВ-залежну лімфопроліферацію вимірювали на клітинах селезінки, зібраних приблизно через тиждень після -- заключної шостої імунізації. Свіжозібрані клітини, 105 клітин на ямку, вирощували протягом 5 днів у с присутності АВ1-40 в концентрації 5мкМ для стимуляції. Клітини від 7 із 10 груп вирощували у присутності зворотного пептиду АВ40-1. У якості позитивного контрольного зразка були вирощені додаткові клітини з --

Т-клітинним мітогеном РНА, а в якості негативного контрольного зразка клітини культивувались без добавлення со пептиду.

Лімфоцити від більшості тварин проліферували у відповідь на РНА. Значних реакцій на зворотний пептид

АВ40-1 зареєстровано не було. Клітини від тварин, імунізованих більшими агрегованими АВ-пептидами,

АМ-1792, АВ1-42 физуна і АМ-1528 проліферували сильно, коли їх було стимульовано АВ1-40 з найвищим « числом імпульсів за хвилину у реципієнтів АМ-1792. Одна тварина в кожній з груп, імунізованих кон'югатом ств) с АВ1-12, конюгатом АВ13-28 і АВ25-35, проліферувала у відповідь на АВ1-40. Решта груп, що одержували кон'югат АВ1-5, кон'югат АВ33-42, рВхб або РВ5, не мали тварин, які б давали АВ-стимульовану відповідь. ;» Одержані результати наведені в Табл. 5 нижче. (ее) - іме) - 50 сл

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 5

Імуноген Кон'югат Амінокислоти АВ Респондери я 01220201 яв 11777771 ч о

Ці результати показують, що АМ 1792 і АМ 1528 стимулюють сильні Т-клітинні імунні реакції скоріше за усе фенотипу СО4-. Відсутність АВ-специфічної Т-клітинної імунної реакції у тварин, імунізованих АВ1-5, не є дивною, оскільки пептидні епітопи, розпізнані Т-клітинами СО4-, мають, зазвичай, довжину із приблизно 15 амінокислот, хоча коротші пептиди можуть іноді діяти з меншою ефективністю. Таким чином, більшість епітопів юю

Т-клітин-хеллерів для чотирьох пептидних кон'югатів розміщується, очевидно, в (до-кон'югатному партнері, а не на ділянці АВ. Ця гіпотеза підтверджується дуже сильним падінням проліферативних відповідей у тварин в. - кожній з цих імунізованих груп. Оскільки кон'югат АВ1-5 значно знижував рівень АВ в мозку за очевидної СМ відсутності АВ-специфічних Т-клітин, ключовим ефектором імунної реакції, викликаної імунізацією цим пептидом, є, очевидно, антитіло. -

Відсутність Т-клітинної реакції і низька імунна реакція від злитого пептиду рВхб, що охоплює амінокислоти (ее)

АРР 592-695, включаючи всі залишки АВ, можуть бути зумовлені слабкою імуногенністю цього препарату.

Слабка імуногенність афегату АВ25-35 зумовлена, очевидно, тим, що цей пептид є занадто малим, щоб містити добрий Т-клгтинний епітоп для сприяння індукуванню імунної реакції Якщо б цей пептид був кон'югований з « білком-носієм, він був би, очевидно, більш імуногенним.

М. Готування поліклональних антитіл для пасивного захисту - с Нетрансгенні миші у кількості 125 особин були імунізовані 100мкг АВ1-42 плюс ад'ювант СЕАЛРЕА і піддані ц ейтаназії на 4-5 місяці. У імунізованих мишей була відібрана кров. (90 був виділений із інших компонентів ,» крові. Антитіло, специфічне до імуногена, може бути частково очищене за допомогою афінної хроматографії. Від кожної тварини одержували в середньому 0,5-1мг імуноген-специфічного антитіла, що в сумі складало 60-120Омг.

МІ. Пасивна імунізація антитілами до Ар (ее) Групам 7-9-місячних мишей РОАРР були зроблені ін'єкції О,5мг поліклонального анти-АВ або специфічного -з моноклонального анти-АВ в РВ5, як показано нижче. Всі препарати антитіл були очищені до низьких рівнів ендотоксину. Моноклональні антитіла проти фрагмента можна приготувати шляхом ін'єкції миші фрагмента АВ ко або більш довгої форми АВ, препарування гібридом і скринінгу гібридом за антитілом, що специфічно зв'язується шу 20 з бажаним фрагментом АВ, не зв'язуючись при цьому з іншими фрагментами АВ, що не перекриваються. сп Таблиця 6

Хотите я

Ф) нин ИН доти іме) др1з- ав 60 2112 АВЗ3-42

Поліклональне АВ42 миші проти людини Агреговане анти-АВ42 65 Мишам робили інтраперитонеальні ін'єкції згідно з потребою з інтервалом 4 місяці для підтримання концентрації циркулюючого антитіла, вимірюваної за допомогою аналізу ЕГІЗА з титром більше 1/1000,

визначеним ЕГІЗА до АВ42 або іншого імуногена. Спостереження за титрами проводилися так, як описано вище.

Тварин піддавали ейтаназії наприкінці шостого місяця ін'єкцій. Гістохімічні дослідження, визначення рівнів АВ ії токсикологічні дослідження проводили розі птогіет. Кожна група складалася із 10 тварин. Додаткові дослідження пасивної імунізації описані в Прикладах ХІ і ХІЇ нижче.

МІ. Порівняння різних ад'ювантів

В цьому Прикладі порівнюються СРЕА, солі алюмінію, емульсія типу масло у воді і МР'/. за їхньою здатністю стимулювати імунну реакцію.

А. Матеріали і методи 70 1. План досліджень

Сто самок шеститижневих морських свинок породи Хартлі від фірми ЕЇт НІЇЇ були поділені на 10 груп для імунізації пептидом АМ 1792 або його пальмітоїльованою похідною, сполученими з різноманітними ад'ювантами.

Сім груп тварин одержали ін'єкції АМ 1792 (ЗЗмкг, якщо не зазначено іншого) у сполученнях з (а) РВ5, (Б) ад'ювантом Фрейнда, (с) МР, (4) скваленом, (е) МРІ /скваленом, (Її) малою дозою солі алюмінію і (д4) великою 7/5 дозою солі алюмінію (З0бмкг АМ 1792). Дві групи тварин отримували ін'єкції пальмітоїльованої похідної пептиду

АМ 1792 (ЗЗмкг) у сполученнях з (а) РВ5 і (р) скваленом. Заключна, десята, група отримувала лише РВ5 без антигена або додаткового ад'юванту. В групах, що отримували ад'ювант Фрейнда, першу дозу емульгували СЕА, а решту із чотирьох доз - ІРА. Антиген уводили з дозою ЗЗмкг для всіх груп, за винятком групи з високою дозою солі алюмінію, яка отримала ЗООмкг АМІ1792. Ін'єкції робили інтраперитонеально для СЕАЛЕА і 2о Внутрішньом'язовим шляхом у чотириголовий м'яз навперемінно лівої і правої задніх кінцівок у всіх інших групах. Перші три дози вводилися з двотижневим інтервалом, а наступні дві дози - з місячним інтервалом.

Кровопускання тваринам для вимірювань титрів антитіл робили на 6-7 дні після кожної імунізації, починаючи з другої дози. 2. Готування імуногенів сч

В 0,Умл дейіонізованої води добавляли 2мг АВ42 (Саїйогпіа Реріїде, партія МЕОЗ339), і суміш інтенсивно перемішували, внаслідок чого утворювалась відносно однорідна суспензія. В суспензію додали аліквоту 100мкл і)

Т1ОХ РВБ5 (1Х РВ5, 0,15М Масі, 0,01М фосфату натрію, рН 7,5). Далі суспензію знов інтенсивно перемішали і поставили на інкубування протягом ночі при 372С для використання її наступного дня. Невикористаний АВ1-42 зберігали з десикантом як ліофілізований порошок при -2026. ою

Пальмітоїльовану похідну пептиду АМ 1792 одержували шляхом зв'язування ангідриду пальмітинової кислоти, розчиненого в диметилформаміді, з амінокінневим залишком пептиду АМ1792 до видалення пептиду, -- що зароджувався, із смоли шляхом обробляння її фтористоводневою кислотою. сі

Для приготування доз препаратів з повним ад'ювантом Фрейнда (СЕА) (група 2) ЗЗмкг АМ1792 в 200мкл РВ5 емульгували у співвідношенні 1:1 (о06б.) з СЕРА у кінцевому об'ємі 40О0мкл для першої імунізації. Для наступних - імунізацій антиген був подібним чином емульгований з неповним ад'ювантом Фрейнда (ІРА). ее)

Для приготування доз препаратів з МРІ. для груп 5 і 8 ліофілізований порошок (Кірі ІттипоСпет Кезеагсй,

Іпс., Натійоп, МТ) додавали до 0,295 водного розчину триетиламіну до заключної концентрації мг/мл і інтенсивно перемішували. Суміш нагрівали до 65-702С7 протягом ЗОс для створення непрозорої однорідної « суспензії міцел. Цей розчин готували для кожної групи ін'єкцій перед його використанням. Для кожної ін'єкції 70 в 5 группі безпосередньо перед використанням змішували в боросилікатній пробірці ЗЗмкг АМ1792 в 16,5мкл - с РВ5, 5Омкг МР". (5Омкл) і 162мкл РВ5. а Для приготування доз препаратів з низькою емульсією типу "масло у воді" пептид АМ1792 в РВ5 додавали, ,» до 595 сквалену, 0,595 Тмееп 80, 0,595 Зрап 85 в РВ5 до одержання заключної однодозової концентрації ЗЗ3мкг

АМ1792 в 25Омкл (група 6). Суміш емульгували перепусканням її через двокамерний ручний прилад 15-20 разів

ДО тих пір, поки краплі емульсії не ставали приблизно однаковими в діаметрі і не приймали форму стандартних (ее) латексних кульок діаметром 1,0мкм при розгляді їх під мікроскопом. В результаті отримували каламутну - суспензію молочно-білого кольору. Емульсію готували для кожної серії ін'єкцій безпосередньо перед Її використанням. Для 8-ї групи триетиламін у кількості 0,296 додавали з концентрацією 5Омкг на дозу до суміші ко сквалену з детергентом для емульгування, як описано вище. Препарат пальмітоїлової похідної (група 7) шу 50 готували шляхом добавлення 33 мкг на дозу пальмітоїл-МН-А 81-42 до сквалену, і суміш інтенсивно перемішували. Після цього за інтенсивного перемішування до суміші додавали Гмееп 80 і рап 85. Далі суміш сл уводили в РВ5З до заключної концентрації 590 сквалену, 0,590 Туееп 80, 0,595 Зрап 85, і заключну суміш емульгували так, як описано вище.

Дози препарату з солями алюмінію (групи 9 і 10) готували шляхом добавлення розчину АМ 1792 в РВ5 до гелю гідроксиду алюмінію АІнудгоде! (фірма Ассигаге, МУУевіригу, МУ) до досягнення концентрації ЗЗмкг (низька о доза, група 9) і ЗО0Омкг (висока доза, група 10) АМ1792 на 5мг солі алюмінію в об'ємі заключної дози 25О0мкл.

Одержану суспензію обережно перемішували протягом 4 годин при кімнатній температурі. їмо) 3. Вимірювання титрів антитіл

Морським свинкам робили кровопускання на 6-7 день після імунізації, починаючи з другої імунізації. Всього бо кровопускання робили 4 рази. Титри антитіл проти АВ42 вимірювали за допомогою аналізу ЕГІ5А, як описано в розд. Загальні матеріали і методи. 4. Препарати тканин

Приблизно через 14 тижнів всіх морських свинок піддали ейтаназії введенням їм СО 5. Цереброспинальну рідину збирали, а мозок видаляли, розсікаючи його на три ділянки (гіпокамп, кора головного мозку і мозочок) 65 для вимірювань концентрації загального білка АВ за допомогою аналізу ЕП ІЗА.

В. Результати

1. Імунна реакція

Вимірювання імунної реакції на АМ1792 після імунізації показали широкий діапазон варіювання ефективності застосованих ад'ювантів. Як видно на Фіг.14, коли АМ 1792 вводили в РВ5, антитіла не виявлялися після 2-3 імунізацій, а після 4 і 5 доз спостерігалася дуже мала імунна відповідь із середнім геометричним титрів (ЗМТ) лише близько 45. Емульсія типу "масло у воді" викликала помірні титри після третьої дози (ЗМ 255), які підтримувалися після четвертої дози (СМТ З01) і падали після заключної дози (МТ 54). Спостерігалася чітка реакція на дозу антигена у випадку АМ 1792, зв'язаного з сіллю алюмінію, де в кількості ЗООмкг пептид був більш імуногенним в усіх часових точках вимірювань, ніж у кількості ЗЗмкг. На піку імунної відповіді після /о четвертої імунізації різниця між цими двома дозами складала 4375, а титри МТ становили приблизно 1940 (ЗЗмкг) і 3400 (З0Омкг). Імунна реакція на ЗЗмкг АМ 1792 плюс МРІ була дуже подібною до реакції, яка одержувалась з майже 10-кратно більшою дозою антигена (З0Омкг), зв'язаного з сіллю алюмінію. Добавлення

МР/. до емульсії типу "масло у воді" зменшує ефективність препаратів порівняно з тою, яку вони мають, коли у якості ад'юванту використовується лише один МРІ. Різниця складає порядку 7595. Пальмітоїльована похідна 7/5 пептиду АМ1792 була зовсім неімуногенною, коли вводилась в РВ5, і давала помірні титри в емульсії "масло у воді": СМТ становили 340 і 105 в третьому і четвертому кровопусканнях. Найвищі титри антитіл були отримані з ад'ювантом Фрейнда, де пікова величина МТ становила приблизно 87000 - майже в З0 разів вище, ніж ЗМТ від наступних двох найбільш сильних препаратів, МРІ і високої дози АМ1792/сіпр алюмінію.

Найбільш перспективними ад'ювантами, ідентифікованими в даних дослідженнях, є МРІ і сіль алюмінію.

Серед них МР'. виявляється більш прийнятним, оскільки з ним потребується десятикратно нижча доза антигена для генерування такої самої імунної відповіді, що отримується з сіллю алюмінію. Ця імунна відповідь може бути збільшена шляхом підвищення дози антигена і/або ад'юванту і шляхом оптимізації графіка проведення імунізації.

Емульсія типу "масло у водії показала себе дуже слабким ад'ювантом для АМ 1792, а добавлення її до

МРІ -ад'юванту зменшувало активність останнього порівняно з тою, яку МРІ. мав застосовуваний один. сч 2. Рівні АВ в мозку

У віці приблизно 14 тижнів морські свинки були піддані глибокій анестезії у них була витягнута і) цереброспинальна рідина (СЕ) і вирізаний мозок для зразків підгрупи з груп, імунізованих з ад'ювантом

Фрейнда (група 2), МРІ (група 5), сіллю алюмінію з високою дозою АМ 1792 ЗООмкг (група 10), і контрольної групи (група 3), імунізованої РВ5. Для вимірювання рівня пептиду АВ одна півкуля мозку була розсічена, і у 5М ю зо Гуанідині були приготовані гомогенати гіпокампової, кортикальної і церебелярної ділянок. Гомогенати розрідили і піддали кількісній оцінці шляхом порівняння з серією розчинів стандартного білка АД з відомими концентраціями (87 у форматі ЕГІЗА. Рівні білка АВ в гіпокампі, корі головного мозку і мозочку були дуже схожими один зодним в су усіх чотирьох фупах, незважаючи на широкий діапазон величин імунних відповідей на АВ, викликаних цими препаратами. Середні рівні АВ становили: в гіпокампі приблизно 25нг/г тканини, в корі головного мозку 2Інг/г 7

Зз5 тканини і в мозочку 12нг/г. Таким чином, наявність високого титру циркулюючого антитіла до АД протягом майже о трьох місяців у деяких з цих тварин не змінила рівні загального АВ в Їх мозку. Рівні АВ в С5Е також були досить схожими поміж цих груп. Відсутність сильного впливу імунізації пептидом АМ1792 на ендогенний АВ свідчить про те, що імунна реакція фокусувалася на патологічних утворах Ар. «

МІ. Імунна реакція мишей на ад'юванти різних типів

Ці дослідження проводили на б-тижневих самках мишей шведський Вебстер (Зм/ізз УУерзіег). В піддослідну - с групу входило 10-13 тварин. Імунізацію робили в дні 0, 14, 28, 60, 90 ії 20. Препарати вводили підшкірно а об'ємними дозами 20Омкл. В усіх препаратах у якості буферного розчину використовували РВ5. На сьомий день "» після кожної імунізації, починаючи від другої дози, тваринам робили кровопускання для аналізу титрів антитіл за методом ЕГІ5А. Режим обробки тварин в кожній з груп поданий в Табл. 7. (ее) - іме) - 50 сл

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 7 по іш о ж Й 8 фло фо 7777777 ронемє 25 емульгов. о домішаний алюмінію с ов лита | з | - 35 (ее) рова оме | Аюте |в 57176 1рова |ожнто| янт | 8 а р 175 0 ов рова; люте | 56 |з 5 171178 реве | вам) ямки | з з

Що ОБЛ НКЮ Б Боснії По ПВ

Со апюмінію - «Кількість тварин а кожній грулі на початку експерименту з Ад'юванти зазначені. У якості буферного розчину в усіх препаратах використовувався РВЗ. --ь 20 Для групи 8 ад'ювант і антиген не призначалися. с Одержані за методом ЕП ІЗА титри антитіл проти АВ42 в кожній групі подані в Табл. 8. (Ф) ко 60 65

Таблиця 8. Середні геометричні титрів антитіл

Тиждень кровопускання о Грула | 29 | 50 | 87 | 429 | 67 ля 7; м | 79701 2577 18180 17477 юю | а | вов | зима 3984 5287 6878 773 | 4372 | 50 | 7159 12333 12781 4 | 1278 20791 14368 20097 25631 я 775. | зав | гемо | 13229 9315 | 23742 8 | 61 | 2536 | 2301 | 442 | 4504 77. 1 37 | зо | 484 | 972 | 2149 87171195 | 25 | 25 1 05 | 8 о | 9. | 25 | 83 | 744 !| 952 | 1823 40125. | 89 | зи | віз | ві? 11. 1 29 | 708 | ов18 2165 7727771 96717155 171079 сі » | 13 | зв | 433 | Бе | 080 о 3247 1609 15. |. 212 | 2630 | 2472 1224 16 |. 83 | 72816 2085 1631 ю з» | 17 198 | 201. | 375 | 222 | 540 зі699 | 15544 | 23095 | 6412 | 8059 | сі 19 Її вз | 243 | 5Бм | 299 | 41 35 Як видно з цієї таблиці, найвищі титри були одержані в групах 4, 5 і 18, в котрих ад'ювантами були МРІ. со (125мкг), МР. ї 05-21 плюс МРІ. (5Омкг).

ЇХ. Терапевтична ефективність різних ад'ювантів

Дослідження терапевтичної ефективності проводили на трансгенних мишах РОАРР із застосуванням групи ад'ювантів, підходящих для людей. Метою досліджень було визначення здатності ад'ювантів викликати імунну « реакцію на АВ і індукувати імуноопосередковане видалення амілоїдних відкладень в мозку. з 40 й й с. - й й

Для досліджень були взяті 180 самців і самок гетерозиготних трансгенних мишей РОАРР віком від 7,5 до 8,5 с місяців (фірма Спапез Кімег І арогайогіев). Миші були поділені на 9 груп по 15-23 тварини в кожній групі для :з» імунізації їх АМ 1792 або АМ 1528, скомбінованими з різними ад'ювантами. Розподіл тварин по групах проводився з урахуванням їхньої статі, віку і родоводу так, щоб вони були якомога більш близькими за цими параметрами. У якості ад'ювантів застосовувались сіль алюмінію, МРІ. ії 05-21, скомбіновані з обома антигенами, со і адювант Фрейнда (БА), скомбінований лише з АМ 1792. Додаткову групу тварин імунізували АМ 1792 в буферному розчині РВ5 плюс консервувальний тімерозал без ад'юванту. Дев'яту групу імунізували тільки РВ5 і - використовували у якості негативної контрольної групи. т Готування агрегованих пептидів АВ. Пептид АВ1-40 (АМ1528, фірма Саїйогпіа Реріідез Іпс., Мара, СА, партія МЕО541) людини і пептид АВ1-42 (АМ 1792, фірма Саїйогпіа Реріїдез Іпс., Мара, СА, партія МЕО439) - людини нещодавно солюбілізували для готування ін'єкційних наборів із ліофілізованих порошків, які зберігали у сп висушеному стані при температурі -202С. Для цього 2 мг пептиду добавляли до О,9мл деїіонізованої води, і суміш інтенсивно перемішували, в результаті чого утворювався відносно однорідний розчин або суспензія. На цій стадії пептид АМ1528, у протилежність пептиду АМ1792, був розчинним. Після цього до розчину додали аліквоту 10О0мкл Т0Х РВБ5 (1Х РВ5: 0,15М Масі, 001М фосфату натрію, рН 7,5), і АМ1528 одразу почав преципітувати. Суспензію знову інтенсивно перемішали і залишили на інкубування протягом ночі при 372 для (Ф. використання її наступного дня. ко Для приготування доз препаратів з сіллю алюмінію (групи 1 і 5) пептид АВ в РВ5 додавали до гелю

АІпудгоде! (296 водний гель гідроксиду алюмінію, фірма Загдеапі, Іпс., Сійоп, М.) до концентрації 10Омкг бо пептиду АВ на 1мг солі алюмінію. Потім до суміші додавали 10Х РВ5 до об'єму заключної дози 200мкл в 1Х РВ5.

Приготовану таким чином суспензію перед ін'єкцією обережно перемішували протягом приблизно 4 годин при кімнатній температурі.

Для приготування доз препарату з МРІ (групи 2 і 6) ліофілізований порошок (фірма Ківі ІттипоСпет

Кезеагсп Іпс., Натійоп, МТ, партія 67039-Е0О8968) додавали до 0,295 водного триетиламіну до заключної 65 концентрації Тмг/мл і інтенсивно перемішували. Суміш нагрівали до 65-702С протягом ЗО0с, внаслідок чого утворювалась непрозора однорідна суспензія міцел. Розчин зберігали при 42С. Для кожного набору ін'єкцій

10О0мкг пептиду на дозу в 5О0мкл РВ5, 5Омкг МРІ на дозу (5БОмкл) і ї0О0мкл РВ5 на дозу змішували у боросилікатній пробірці безпосередньо перед вживанням.

Для приготування доз препаратів з 05-21 (групи З і 7) ліофілізований порошок (фірма Адцшійа, Егатіпдпат,

МА, партія 7018К) додавали до РВ5, рН 6,6-6,7 до заключної концентрації мг/мл і інтенсивно перемішували.

Розчин зберігали при -202С. Для кожного набору ін'єкцій 100мкг пептиду на дозу в бОмкл РВ5, 25мкг 05-21 на дозу в 25мкл РВ5 і 125мкл РВ5 на дозу змішували в боросилікатній пробірці безпосередньо перед вживанням.

Для приготування доз препарату з ад'ювантом Фрейнда (група 4) 100мкг АМ 1792 в 200мкл РВЗ піддавали емульгуванню з повним ад'ювантом Фрейнда (СЕА) у співвідношенні 1:1 (об.) у кінцевому об'ємі 400мкл для 7/0 першої імунізації. Для подальших імунізацій антиген емульгували подібним чином з неповним ад'ювантом

Фрейнда (ІБА). Для препаратів, які містили у якості ад'ювантів сіль алюмінію, МРІ або 25-21, 100мкг на дозу

АМ1792 або АМ1528 комбінували з сіллю алюмінію (1мг на дозу) або МРІ. (5Омкг на дозу) або 05-21 (25мкг на дозу) у кінцевому об'ємі 200мкл РВЗ і вводили піддослідній тварині шляхом підшкірної інокуляції в спину між лопатками. Для групи, що одержувала ад'ювант Фрейнда, 100мкг АМ1792 емульгували з повним ад'ювантом 75 Фрейнда (СЕРА) у співвідношенні 1:1 (06б.) у кінцевому об'ємі 40О0мкл і вводили піддослідній тварині інтраперитонеально для першої імунізації, після чого робили бустер-ін'єкції послідовно п'яти доз такої самої кількості імуногена в неповному ад'юванті Фрейнда (ІРА). Для групи, що отримувала АМ1792 без ад'юванту, 10мкг АМ 1792 комбінували з 5мкг тімерозалу в кінцевому об'ємі бОмкл РВЗ і вводили підшкірно. Дев'ята, контрольна, група одержувала лише 200мкл РВ5, який уводили підшкірно. Імунізації робили з двотижневим інтервалом для перших трьох доз, після чого слідували імунізації з місячним інтервалом; таким чином, імунізації робили в такі дні: 0, 16, 28, 56, 85 і 112. На 6-7 дні після кожної імунізації, починаючи з другої дози, тваринам робили кровопускання для вимірювання титрів антитіл. Приблизно через тиждень після заключної дози тварин піддавали ейтаназії. Рівні АВ і АРР в мозку вимірювали шляхом аналізу ЕГ ІА, а шляхом імуногістохімічної оцінки визначали наявність амілоїдних бляшок в зрізах мозку. Крім того, визначались титри с

АВ-специфічних антитіл і АВ-залежних проліферативної і цитокінної реакції. із Табл. 9 видно, що найбільші титри антитіл до АВ1-42 викликались ад'ювантом Фрейнда і АМ 1792; вони і) досягали піків після четвертої імунізації (пік МТ: 75386), а після заключної, шостої, імунізації падали на 5995. Піковий середній титр, викликаний МРІ. з АМ1792, був на 6295 нижчий, ніж той, що генерувався ад'ювантом

Фрейнда (пік МТ: 28867) і також досягався рано за імунізаційним графіком, після трьох доз, після чого ою

Зо слідував спад на 2895 пікової величини після шостої імунізації. Піковий середній титр, генерований 05-21, скомбінованим з АМ1792, (МТ: 1511) був приблизно в 5 разів нижчий за той, що був отриманий з МРІ Крім того, (7 кінетика реакції була повільнішою, оскільки для досягнення пікового відгуку потребувалася додаткова Га імунізація. Титри, генеровані АМ 1792, зв'язаним із сіллю алюмінію, були набагато більшими, ніж ті, що одержувались з 05-21, а кінетика реакції була швидшою. У випадку АМ1792, скомбінованого з РВ5 з (77 тімерозалом, частота і величина титрів вряд чи були більшими за ті, що одержувались з чистим РВ5. Пікові Ге) титри, генеровані з МРІ і АМ1528 (пік ОМТ: 3099) були приблизно в 9 разів нижчими за ті, що отримувались з

АМ1792. Пептид АМІ1528, зв'язаний із сіллю алюмінію, був слабоіїмуногенним і давав низькі титри, що генерувалися лише у деяких тварин. У контрольних тварин, імунізованих тільки РВ5, імунні реакції не « спостерігалися. ші с ;» (ее) - іме) - 50 сл

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 9. Середнє геометричне титрів антитіл" п ото. пн, он нн

Тиждень кровопускання

Сіль алюм,/ 102 1081 2366 1083 572

АМ1792 (12/21)? (17/20) (21/21) (19/21) (18/21)

МРІ/ 6241 28867 11242 5665 8204

АМ1792 (21/21) (21/21) (21/21) (20/20) (20/20) а25-21/ Зо 227 327 1,511 1188 7 АМ1792 (1/20) (10/19) (10/19) (78) (14/18)

СЕД/ 10076 61279 75386 41628 30574 й АМ1792 (15/15) (15/15) (15/15) (15/15) (15/15) сч

Сіль алюм./ 25 З3 39 37 31 о

АМ1528 (0721) (1121) (3/20) (1/20) (2/20)

ІС) зо МР 154 2591 1653 1156 з099 -

АМ1528 (15/21) (20/21) (21/21) (20/29) (20/20) сч 05-21/ 29 221 51 820 2994 -

АМІ1528 (1722) (13/22) (4/22) (20/22) (21/22) со

РВЗ плюс 25 з3 39 37 47 тімерозал (016) (2/16) (416) (316) (4/16) ч - 47 25 25 25 25 25 х» (016) (016) (015) (012) (016) 18 "Середні геометричні титрів антитіл вимірювались проти АВ1-42 со ьКількість респондерів на групу -й Результати Імунізації пептидами АМ1792 і АМ1528 з різними ад'ювантами або тімерозалом, та їх вплив на

ГФ кортикальне амілоїдне навантаження у 12-місячних мишей, визначений за допомогою аналізу ЕГІ5А, подані на

Фіг.15. У контрольних мишей РОАРР, імунізованих РВ5, середній рівень загального АВ в корі головного мозку на -й 12 місяці становив 1817нг/г. Значно знижені рівні АВ спостерігалися у мишей, імунізованих АМ 1792 плюс сл СЕАЛЕА, АМ1792 плюс сіль алюмінію, АМ1792 плюс МРІ їі 05-21 плюс АМ1792. Статистичної значності (р«е0,05) це зниження досягало лише для АМ 1792 плюс СЕАЛЕА. Але, як показано в Прикладах | і Ії, вплив імунізації на зниження рівнів АВ ставав набагато більшим у мишей 15-місячного і 18-місячного віку. Таким чином, можна очікувати, що принаймні композиції АМ 1792 плюс сіль алюмінію, АМ1792 плюс МРІ. і АМ1792 плюс 25-21 будуть досягати статистичної значності в імунізації старих мишей. У протилежність цьому пептид АМ 1792 у комбінації (Ф) з консервувальним тімерозалом показував середній рівень АВ, приблизно такий самий, що спостерігався у г мишей, оброблених РВ5. Аналогічні результати отримувалися при порівнянні кортикальних рівнів АВ42.

Середній рівень АВ42 у контрольних тварин, імунізованих РВ5, становив 1624нг/г. Значно знижені середні рівні во -403,1149, 620 і 714 - спостерігалися у мишей, імунізованих АМ1792 плюс СЕАЛЕА, АМ1792 плюс сіль алюмінію,

АМ 1792 плюс МРІ. і АМ1792 плюс 25-21 відповідно, де зниження досягало статистичної значності (р - 0,05) в групі, імунізованій АМ1792 плюс СЕАЛЕА. Середній рівень АВ42 у тварин, імунізованих АМ 1792 з тімерозалом становив 1619Ннг/г.

Подальші дослідження стосовно терапевтичної ефективності комбінацій ад'ювант/муноген проводились на ве гетерозиготних трансгенних мишах РОАРР, самцях і самках, віком від 9 до 10,5 місяців. Дослідження тривали 25 тижнів, і таким чином вік тварин в кінці досліджень становив 15-16,5 місяців. В кожну групу імунізації входило по 29-40 тварин. Нижче, в Табл. 10 наведені дані про групи піддослідних тварин і дослідження, що з ними проводились.

Таблиця 10

У - м я

Ад'ювант імуноген Розріджувальний Спосіб буфер уведення тю ІГрупал:! МРІ-ЗЕ | АМІ1792-6С5 (75 мкг) РВЯ | С (250 мкл)

Група 2:| /15А 51 АМ1792-5С5 (75 мкг) РІ ІР (400 мкл) вута5| ОБ: | АМтвевовсвнк РВБО 0 Бофво

Група 4:10521 скороч,| АМ1792-505 (75 мкг) РУ 5С (250 мкл) тлах| тв 17 5-1-- |Бсфют

Скорочення в Тафт, 10: МАР - мультиантигенний пептид; ТТ - Т-клітинний епітоп правцевого токсину (830-844); 5О - підшкірно; ІР - інтраперитонеально; РВ5 - забуферений фосфатом фізіологічний розчин; ІЗА-51 ринковий ад'оювант, подібний ІРА; сСоЗ-препарат гліцинцитратсахарозиї; МРІ-5Е -МРІ у стабілізованій масло-водній емульсії.

Графік імунізації в цих дослідженнях був ідентичний для всіх груп тварин, за винятком групи 3, позначеній сч скороченням. 05-21/АМ1792. Ін'єкції мишам уводили в такі тижні: 0, 2, 4, 8, 12,16, 20,24, а кровопускання робили в тижні 3, 5, 9,13, 17, 21 ії 25. Групи 1 і 2 отримали по 8 Ін'єкцій, а група 3-4 ін'єкції протягом (о) 25-тижневого періоду досліджень. Група 4, позначена скороченням 05-21/АМ1792, отримала ін'єкції лише на 0, 2, 4 ї 8 тижні. Цій групі подальші ін'єкції протягом досліджень не робили, хоча її тваринам робили кровопускання за тим самим графіком, що й решті тварин, з метою спостереження за спадом титру. Групи З і 5, ю зо позначені через 205-21/АМ1792 і РВ5 відповідно, служили в якості позитивно? і негативної контрольних груп для цього експерименту. --

Титри антитіл визначали шляхом аналізу титрів антитіл проти АВ. с

Група 1. Група МРІ -БЕ/"АМ1792 має пікове середнє геометричне значення титру (МТ) 17100 на 9 тижні і падіння МТ до 10000 на 25 тижні. Спочатку титри МРІ-5Е зростали зі швидкістю, трохи вищою, ніж у -- контрольній групі О521/АМ1792 (Група 4). со

Група 2. Група ІЗБА-51/АМ1792 продукувала високі титри протягом досліджень, які досягли величин СМТ більше 100000 за останні 9 тижнів досліджень.

Група 3. Контрольна група О521/АМ1792. її титр досяг пікового значення СМТ 16000 на 17 тижні. Після цього титр падав наступні 8 тижнів і наприкінці досліджень СМТ склав 8700. В одній із тварин з цієї групи титр не « 20 піднімався протягом усього експерименту. ш-в с Група 4. Група, що піддавалася ін'єкціям О521/АМ1792. її титр досяг пікового значення 7300 на 13 тижні, через 5 тижнів після заключної ін'єкції. Після цього титр упав до СМТ 2100 на заключному кровопусканні (25 :з» тиждень). Як і в контрольній групі, одна з тварин цієї групи не показала титру, який би можна було зареєструвати, у той час як інша тварина втратила весь титр наприкінці періоду спаду.

Група 5. Група, що отримала ін'єкції лише РВ5. Титрів не мала. оо Для оцінки кортикальних рівнів АВ, за методом ЕГ ІЗА були виміряні рівні загального АВ і АВ1-42. Для цього одну півкулю мозку розсікали на кортикальну, гіпокампову і церебелярну тканини, які піддавали гомогенізації в - 5М буферному розчині гуанідину і аналізували на АВ мозку. Результати вимірювань загального АВ І АВ42 на г) кортикальній ділянці були аналогічними. Для визначення статистичної значущості між групами був проведений статистичний аналіз Манна-Уїтні (Маппи-М/піїлеу), який дав величину р-0,05, що свідчило про значну зміну в АВ. - В групах, підданих імунізації, спостерігалося значне зниження рівнів загального АВ порівняно з с контрольною РВ5 групою (див. Табл. 11). Група МРІ -5Е/АМ1792 показала найбільшу зміну в АВ - найкращий результат порівняно з іншими групами імунізованих тварин. Група під назвою 0521/АМ1792 показала зміну АВ, подібну контрольній групі 0521, що отримала всі 8 Ін'єкцій. Рівні АВ в групі ІЗА-51/АМ1792 були знижені так вв само, як і в групі СЕА/ЛЕА: МАР(АВ 1-7).

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 11. Кортикальні рівні АД 22 месве ов овен

Середній, 7335 1236 3026 2995 нг/г тканини

Діапазон, 550-18358 70-3977 23-9777 210-11167 24-16834 нг/к тканини в 738 | 22 | з | зм | о

Ї на завершення, ад'юванти МРІ-5Е, ІБА-51 і 05-21 в комбінаціях з АМ1792 є ефективними в індукуванні достатньо сильної імунної реакції для затримання процесу утворення відкладень АВ в корі головного мозку.

Х. Аналіз токсичності

Наприкінці досліджень, описаних в Прикладах 2, З і 7, були зібрані тканини для гістопатологічного обстеження. Крім того, на зразках крові в кінці досліджень у Прикладах З і 7 були проведені гематологічний і клінічний хімічний аналізи. Таким чином, була обстежена більшість головних органів піддослідних тварин, включаючи мозкову, легеневу, лімфоїдну, гастроінтестинальну, печінкову, ниркову, адреналову системи і гонади.

Хоча дослідження показали наявність у тварин спорадичних ушкоджень, очевидних різниць при цьому не спостерігалося ні в зачеплених ними тканинах, ні в їхній тяжкості між тваринами, імунізованими АМ 1792 і с 259 Неімунізованими тваринами. У тварин, імунізованих АМ 1528, порівняно с тваринами, обробленими РВУ, і Ге) необробленими тваринами, унікальних гістопатологічних ушкоджень не спостерігалося. Не було також різниці і в клінічному хімічному профілі поміж тваринами, обробленими різними ад'ювантами, і тваринами, обробленими

РВБЗ у Прикладі 7. Хоча по декількох гематологічних параметрах поміж тваринами, імунізованими АМ1792 і ад'ювантом Фрейнда у Прикладі 7, порівняно з тваринами, обробленими РВ2, мав місце значний зріст, це явище, Щео, очевидно, зумовлене обробкою ад'ювантом Фрейнда і перитонітом, що цю обробку супроводжував, і не носило «- ознак небажаних наслідків імунізації пептидом АМ 1792. Хоча це і не стосується токсикологічної оцінки, але як частина оцінки ефективності були проведені широкі обстеження патології мозку мишей РОАРР. Ці обстеження не с дали жодних фактів виявлення ознак небажаного впливу імунізації на морфологію мозку. Ці результати свідчать «- про те, що імунізація пептидом АМ 1792 є такою, що добре переноситься і принаймні майже не дає побічних

Зо ефектів. со

ХІ. Терапія антитілами проти АВ

У даному розділі описані приклади тестів різноманітних моноклональних і поліклональних антитіл до АВ щодо їхньої спроможності інгібувати акумулювання АВ в мозку гетерозиготних трансгенних мишей. « 1. План досліджень

У якості піддослідних тварин для цього експерименту були взяті 60 самців і самок гетерозиготних о) с трансгенних мишей РОАРР віком від 8,5 до 10,5 місяців від фірми Спагіез Кімег І арогаїогу. Тварин поділили на "» 6 груп для обробки різними антитілами до АВ. Розподіл тварин по групах був проведений у розрахунку на " якомога більшу збіжність їх за статтю, віком, родоводом і джерелом походження. Як показано в Табл. 10, в дослідженнях використовувались чотири мишиних АВ-специфічних моноклональних антитіла - 2НЗ (спрямоване на залишки 1-12 АВ), 1005 (спрямоване на залишки 1-16 АВ), 266 (спрямоване на залишки 13-28 АВ і таке, що бо зв'язується з мономерним, але не агрегованим АМ 1792), 21212 (спрямоване на залишки 33-42 АВ). Тварини - п'ятої групи оброблялись фракцією АВ-специфічного поліклонального антитіла (індукованою |імунізацією агрегованим АМ 1792). Негативна контрольна група отримувала один лише розріджувач РВ5 без антитіла. де Ін'єкції моноклональних антитіл робили з дозою приблизно 1Омг/кг (у розрахунку на масу мишей 50Гг). --о3 20 Ін'єкції робили інтраперитонеально у середньому кожні 7 днів, підтримуючи титри анти-АВ вище 1000. Хоча у випадку тАб 266 були отримані нижчі титри, оскільки це антитіло не зв'язується добре з агрегованим АМ 1792, сл застосовуваним у даному . експерименті в якості імобілізованого антигена, графік дозування цієї групи залишився таким самим. Імунізація групи, яка одержувала моноклональне антитіло 2НЗ, була припинена в перші три тижні, оскільки це антитіло виводилося занадто швидко іп мімо. Перед кожним дозуванням тваринам робили го кровопускання для вимірювання титрів антитіл. Імунізація тривала протягом шестимісячного періоду і в цілому

ГФ! зайняла 196 днів. Тварини були піддані ейтаназії через тиждень після заключної дози. іме) 60 б5

Таблиця 12. План експерименту

Група Антитіло Специфічність до / Ізотип антитіла піддослідних антила тварин . 20118 |немаєишерву| МА | ОМА р фея | я | змен ме или ШСТО ССС я ше Пи ХО С АВІзав 6 рровнея рожа роб а. Кількість тварин в групі наприкінці експерименту. Всі групи на початку що експерименту мали в своєму складі по 10 тварин.

Ь.МА: Ме може бути застосований. с. тАБ: Моноклональне антитіло. сч 2. Матеріали і методи Ге) а. Готування антитіл

Поліклональне антитіло проти АВ готувалося із крові, зібраної в двох групах тварин. Перша з цих груп складалася із 100 самок мишей шведський Вебстер (Зм/ізз МУерзіег) віком від 6 до 8 тижнів. Імунізація цих тварин робилася в дні 0, 15 і 29 пептидом АМ1792 у кількості 100мкг, скомбінованим з СЕАЛЕА. Четверту юю ін'єкцію робили на 36 день половиною дози АМ 1792. Після умертвіння на 42 день тварини були знекровлені, з «ч- їхньої крові була приготована сироватка, яка після збирання мала загальний об'єм б4імл. Друга група складалася із 24 самок мишей віком 6-9 тижнів, ізогенних з мишами РОАРР, але не трансгенних стосовно АРР гена людини. с їх імунізацію проводили в дні 0, 14, 28 і 56 пептидом АМ 1792 у кількості 10О0мкг, скомбінованим з СЕАЛЕА. Ці «- тварини були знекровлені після умертвіння на 63 день, і з їхньої крові була приготована сироватка, яка після

Зо збирання мала загальний об'єм 14мл. Обидва ці лоти сироватки згрупували. Фракцію антитіла очистили двома со послідовними раундами преципітації 5096 насиченим сульфатом амонію. Заключний преципітат діалізували проти РВ5 і тестували на ендотоксин. Рівень ендотоксину становив менше 1 Є) (ендотоксинових одиниць)/мг.

Моноклональні антитіла проти АВ були приготовані із асцитичної рідини. Ця рідина була спочатку « деліпідована добавленням концентрованого натрійдекстрансульфату в охолоджену на льоду асцитичну рідину З 70 за перемішування до досягнення кінцевої концентрації О,238905. Після цього в рідину при перемішуванні додали с концентрований Сасі» до заключної концентрації б4мММ. Отриманий розчин піддали центрифугуванню при 10000

Із» х г, в результаті чого осад був видалений. Супернатант перемішали на льоду з однаковим з ним об'ємом насиченого сульфату амонію, який добавляли по краплях. Розчин знову піддали центрифугуванню при 10000 х г, в результаті чого супернатант був видалений. Осад ресуслендували і піддали діалізу проти 20мМ Тгіз-НСІ, 04М масі, рН 7,5. Цю фракцію помістили в колонку РІагтасіа для рідинної хроматографії швидкого розрізнювання на бо сефарозі 0) і елюювали з оберненим градієнтом 0,4 М -0,275М Масі в 20мМ Тгтгіз-НСІ, рН 7,5. - Пік імунної реакції ідентифікували за методом світлопоглинання на хвилі 28Онм, і відповідні фракції об'дєнали. Характеристики очищеного імунного препарату знімали шляхом вимірювання концентрації білка за ді методом ВСА і чистоти за методом 5О0О5-РАСЕ (електрофорезу на поліакриламідному гелі з додецилсульфатом -к 70 натрію). Зібраний пул піддали також тесту на ендотоксин. Рівень ендотоксину склав менше 1 ЕШ/мг. Титрам менше 100 довільно приписували величину титру 25. сл 3. Рівні Ар ї АРР в мозку

Приблизно через В місяців після імунізації різними препаратами антитіл проти АВ у тварин, перфузованих фізіологічним розчином, видалили мозок, одну півкулю якого препарували для імуногістохімічного аналізу, а другу використовували для кількісної оцінки рівнів АВ і АРР. Для вимірювань концентрації різних форм

ГФ) В-амілоїдного пептиду і амілоїдного прекурсорного білка (АРР) півкулю розсікали і з неї готували гомогенати гіпокампової, кортикальної і церебелярної ділянок в 5М гуанідині. Гомогенати розрідили по серіях, і провели о оцінку рівня амілоїдного пептиду або АРР шляхом порівняння з серією розчинів стандартів пептиду АВ або АРР відомих концентрацій у форматі ЕГ ІЗА. 60 Рівні загального АВ і АВ1-42, виміряні за методом ЕГІЗА в гомогенатах кори головного мозку і гіпокампу, і рівень загального АВ в мозочку подані в Табл. 11, 12 і 13 відповідно. Середня концентрація загального АВ в контрольній групі, інокульованої розчином РВ5, була в 3,6 рази більшою в гіпокампі, ніж в корі головного мозку (середня величина 63389нг/г гіпокампової тканини порівняно з 17818нг/г в корі головного мозку).

Середній рівень в мозочку мишей контрольної групи (30,бнг/г тканини) був більше ніж у 2000 разів нижчим, ніж бо у гіпокампі. Ці рівні є подібними до одержаних у гетерозиготних трансгенних мишей РОАРР цього ж віку, про які повідомлялося в роботі Моппзоп-Ууоса еї аї!:, 19971.

Як показано в Табл. 13, середній рівень АВ, виміряний як АВ 1-42 в корі головного мозку мишей однієї з імунізованих груп, значно відрізнявся від того, що був одержаний у контрольній групі (р «0,05), тварини якої отримували поліклональне антитіло проти АВ. В цій групі імунізованих тварин середній рівень АВ 1-42 порівняно з контрольною групою був знижений на 6595. Середні рівні АВ1-42, отримані в додатковій імунізованій групі, тварини якої отримували дози з тАБ 1005 (р-0,0433), були також значно знижені - на 5595 порівняно з контрольною групою.

Таблиця 13

Й

Обробка Середні статистичні величини

Загальний АВ4г Загальний| Араг2

АВ АВ

ЕЦБА | Величина | Зміни, 95 ЕПБА |Беличина ЕШБА ЕШ5А величина" р величина р величина | величина 17818 " МА МА 16150. | 12621-/- 7458" 5738

Поліклональне| 10 6160 -5 4892 0,0071 5912. | 44Б4ч. анти-АВ42 4492 3347 тАЬ 1005 7915 бло 6214 969Баи- | б843ч/. с 29 6929 з3Б1 Ге) тдь 266 9144 01255 -493 8481 01255 -39 9204- | тав. 9293 6921 гад 21212 15158 02898 13578 0,7003 12481. | 110055. ів) 7082 8324 «-- я Ц С " с а. Кількість тварин в групі наприкінці експерименту.

В. ної тканини. - с. Анапіз Манна-Уїтні. 4. ЧА: Не може бути застосований. со е. Стандартне відхилення

В гіпокампі середнє відсоткове зниження загального АВ, пов'язане з імунізацією поліклональним антитілом « проти АВ (5095, р-0,0055) не перевищувало того, що спостерігалося в корі головного мозку (65905) (Табл. 14).

Проте абсолютна величина цього зниження була майже в З рази більшою в гіпокампі, ніж в корі головного мозку - й с чисте зниження З316б8Знг/г тканини в гіпокампі порівняно з 11658нг/г тканини в корі головного мозку. При ц вимірюванні рівня більш амілоїдогенної форми АВ, АВ1-42, а не загального АВ, зниження, одержане з "» поліклональним антитілом, було значним (р-0,0025). Середні рівні в групах, імунізованих моноклональними антитілами 1005 і 266, були знижені на 3395 і 2195 відповідно. (ее) - іме) - 50 сл

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 14

Й ПІПОКАМП

| .

ІТИ

ПОН НН ПО ЗВННННЯ ПОН З ЗННННЯ Бай НАС . у 70 ЕБА Величина р" ЕШБА Величина р ЕЦВА ЕИБА величина" величина величина валичина 63389 і 54429 58351. Б528а014- 13308" 14701

Поліклональне 31706 27127 зоб. 248534- анти-АД42 22454 18262 тА 1005 48779 0,0875 -28 38290 44581. зв4аввн» "418632 17146 ть 266 48689 00990 43034 0,0990 -21 зва. з2919- 21304 25372 тАь 21212 0,7728 -13 47981 0,80959 57327 БОЗОБн- 28927 23927 а. Кількість тварин в групі наприкінці експерименту. й

Ь. не/г тканини. с. Аналіз Манна-Уїтні. с а, МА: Не може бути застосований. 8. Стандартне відхилення о

Рівень загального АВ також був виміряний в мозочку (Табл. 15). Групи тварин, імунізованих полікпональним ю антитілом проти АВ і антитілом 266, показали значне зниження рівнів загального АВ (4395 і 4695, Р - 00033 Р й й й й й - 0,0184 відповідно), а група, імунізована 1005, мала зниження рівня загального Ар близьке до суттєвого (2995, -

Р - 0,0675). сч

Таблиця 15 -

Мозочок со

Обробка Середні статистичні величини Середні величини « с 70 Загальний АВ Загальгий ДВ н- з» ЕПБА Величина РУ | Зміни, 96 ЕШИБА п Й ' величина" вепичина ши ГРО 1778 | 3556 | Або 0нА 0 фобонаияя з Поліклональне 17,81 -43 18,15-/-4,36 г) анти-Ар42 - 70 тА 1005 шкі 21,88 00675 шини 27,291-19,43 т тлвзе | 8 | 655 | оо товен вто а. Кількість тварин в групі наприкінці експерименту. (Ф) Ь. нг/г тканини. т с, Аналіз Манна-Уїтні. , 4. МА: Не може бути застосований. во е. Стандартне відхилення

Концентрація АРР в корі головного мозку і мозочку мишей, імунізованих антитілом і мишей контрольної групи, оброблених РВ5, також визначалася за методом ЕП ІЗА. Були проведені два різних аналізи АРР. Перший, позначений як АРР-А/РІ,, розпізнав як АРР- с (о, - секретована форма АРР, яка була розщеплена в межах 65 послідовності АВ), так і форми повної довжини (РІ) АРР, у той час як другий аналіз розпізнав лише АРР-с. У протилежність пов'язаному з імунізацією зниженню АВ в підгрупі імунізованих груп, рівні АРР були фактично незмінними в усіх імунізованих тваринах порівняно з контрольними. Ці результати вказують на те, що імунізація антитілами до АВ видаляє АВ, не видаляючи при цьому АРР.

Підсумовуючи вищевикладене, можна сказати, що рівні АВ були значно знижені в корі головного мозку, гіпокампі і мозочку у тварин, імунізованих поліклональним антитілом, генерованим проти АМ1792. У меньшому ступені моноклональні антитіла до амінокінцевої ділянки АВ1-42 і, зокрема, амінокислоти 1-16 і 13-28 також показують значний ефект імунізації. 4. Гістохімічний аналіз

Було проведене якісне порівняння морфології АВ-імунореактивних бляшок в підгрупі зразків мозку мишей, 70 оброблених РВ5, поліклональним АВ42, 2112, 266 і 1005, з даними попередніх досліджень, в яких застосовувались стандартні методи імунізації АВ42.

Найбільші зміни як у ступені, так і в зовнішьому вигляді амілоїдних бляшок спостерігалися у тварин, імунізованих поліклональним антитілом АВ42. Зниження амілоїдного навантаження, еродована морфологія бляшок і клітинно-пов'язана імунореактивність АВ дуже нагадували ефекти, одержувані від стандартних способів 7/5 імунізації. Ці спостереження підтверджують результати, отримані за допомогою аналізу ЕГІЗА, в яких значне зниження як загального АВ, так і АВ42 досягалося введенням поліклонального антитіла АВ42.

Аналогічна якісна оцінка в групі 1005 показала, що амілоїд ні бляшки тут також зменшилися у кількості і зовнішньому вигляді, виказуючи при цьому певні ознаки клітинно-пов'язаної АВ-імунореактивності. Відносно контрольних тварин фракція поліклонального Ід проти АВ і одне з моноклональних антитіл (1005) знизили бляшкове навантаження на 9395 і 8195 відповідно (р«0,005). Антитіло 2112 показало порівняно помірний вплив на бляшкове навантаження. Мікрознімки мозку після обробки поліклональним антитілом АВ1-42 показали наявність дифузійних відкладень і відсутність багатьох грубіших згущених бляшок в фупі, обробленій поліклональним АВ1-42, порівняно з контрольними тваринами. 5. Вимірювання титрів антитіл сч

В підгрупі з трьох випадково відібраних мишей із кожної групи робили кровопускання безпосередньо перед кожною інтраперитонеальною інокуляцією; всього було зроблено 30 кровопускань. Титри антитіл виміряли як і) антитіло, що зв'язується з АВ1-42, за методом сендвіч-аналізу ЕГІЗА, використовуючи пластмасові багатоямкові планшети, покриті АВ1-42, як це докладно описано в розд. Загальні матеріали і методи. Середні титри для кожного кровопускання показані на Фіг.16-148 для поліклонального антитіла і моноклональних антитіл 1005 і ю зо 21212 відповідно. Середня величина титрів складала приблизно 1000 на протязі всього часу для препаратів поліклональних антитіл і була трохи вищою цого рівня у тварин, імунізованих 1005 і 21212. -- 6. Лімфопроліферативна реакція с

На клітинах селезінки, зібраних за 8 днів після заключної інфузії антитіла, була виміряна АВ-залежна лімфопроліферація. Свіжозібрані клітини, у кількості 109 на ямку, були піддані культивуванню для стимуляції -- протягом 5 днів у присутності АВ1-40 в концентрації 5мкМ. У якості позитивного контрольного зразка були с вирощені додаткові клітини з Т-клітинним мітогеном РНА, а в якості негативного контрольного зразка клітини вирощувались без додання пептиду.

Спленоцити від старих мишей РОАРР, пасивно імунізованих різними антитілами проти АВ, були стимульовані « іп міго пептидом АМ1792 і були виміряні проліферативна і цитокінна реакції. Метою цього експерименту було 70 виявити те, чи полегшувала пасивна імунізація презентування антигена, а отже і праймування Т-клітинних - с імунних реакцій, специфічних до АМ 1792. Як показали ці дослідження, у мишей, пасивно імунізованих ц антитілами проти АВ, АМ1792-специфічних проліферативних або цитокінних реакцій не спостерігалося. и"? ХІІ. Подальші дослідження пасивної імунізації

В другому експерименті була повторена імунізація антитілом 1005 і проведені випробування ще двох антитіл проти АВ - моноклональних 306 (АВ1-5) і 16211 (АВЗ33-42). Контрольні групи тварин одержували РВ5 або (ее) антитіло збіжного ізотипу (ТМ2а), індиферентне до даних процесів. Піддослідні тварини були старшими за віком з (11,5 - 12 місячні гетерозиготи), ніж у попередніх дослідженнях, а решта плану експерименту була така сама.

Тут також після 6 місяців імунізації антитіло 1005 знижувало бляшкове навантаження більш ніж на 8095 відносно ко контрольних тварин, оброблених РВ5 або антитілом збіжного ізотипу (р-0,003). Приблизно таку ж ефективність шу 20 виявило одне з інших антитіл проти АВ - 306, яке дало 8695 зниження (р-0,003). У протилежність цьому третє антитіло проти даного пептиду - 16С11 - не виявило жодного впливу на бляшкове навантаження. Аналогічна сл картина спостерігалася у вимірюваннях АВ42 за методом ЕГІЗА. Ці результати показують, що імунна реакція проти пептиду АВ за відсутності Т-клітинного імунітету є достатньою для зменшення амілоїдних відкладень у мишей РОАРР, але що не всі антитіла проти АВ є в цьому ефективними. Антитіла, спрямовані на епітопи, що

Містять амінокислоти 1-5 або 3-7 АВ, є ефективними лише частково.

Підсумовуючи вищевикладене, можна сказати, що пасивно введені антитіла проти АВ зменшували

Ф, поширюваність бляшкових відкладень у мишачої модели хвороби Альцгеймера. Витримувані за помірних ко концентрацій сироватки (25-7Омкг/мл) ці антитіла досягли доступу до СМ5 на рівнях, достатніх для декорування

В-амілоїдних бляшок. Входження антитіл в СМ5 не було зумовлене аномальним витіканням гематомозкового бо бар'єра, оскільки збільшення судинної проникності, виміряної Емапз-голубим у мишей РОАРР, не спостерігалося.

Крім того, концентрація антитіла в мозковій паренхімі старих мишей РОАРР була така сама, що й у нетрасгенних мишей, концентрація антитіл у сироватці яких становила 0,195 (незалежно від ізотипу).

ХП. Моніторинг зв'язування антитіл

Для визначення того, чи можуть антитіла проти АВ діяти безпосередньо в СМ5, зразки мозку, взяті у 65 перфузованих фізіологічним розчином мишей наприкінці експерименту за Прикладом ХІЇ, були досліджені на наявність в них периферійно введених антитіл. Незафіксовані кріостатні зрізи мозку піддавалися дії флуоресцентного реагенту проти імуноглобуліну миші (Ідс-СуЗ кози проти миші). Бляшки в мозку тварин груп, імунізованих 1005 і 306, були сильно декоровані антитілом, у той час як в групі 16С11, забарвлення не було.

Для встановлення всього поширення бляшкового відкладення послідовні зрізи кожного мозку спочатку піддавалися імунній реакції з антитілом проти АВ, а потім з вторинним реагентом. Антитіла 1005 і 306 після периферійного введення досягли доступу до більшості бляшок в СМ5. В цих групах імунізованих тварин бляшкове навантаження було значно зменшене порівняно з групою 16С11. Ці результати свідчать про те, що периферійно введені антитіла можуть входити в СМ5, де вони можуть безпосередньо стимулювати видалення амілоїду. Ймовірно, що антитіло 16С11 також мало доступ до бляшок, але не було здатним зв'язуватися. 70 ХІМ. Скринінг ех мімо за активністю антитіла проти амілоїдних відкладень

Для вивчення впливу антитіл на видалення бляшок були проведені дослідження ех мімо, в яких найпростіші мікрогліальні клітини були культивовані незакріпленими кріостатними зрізами уражених хворобою Альцгеймера мозку миші РОАРР або мозку людини. Мікрогліальні клітини були одержані із церебральної кори неонатних мишей ОВА/2М (1-3 дні). Зразки кори головного мозку були механічно дисоційовані в НВО5 (збалансованому /5 больовому розчині Хенка, Зідта) з 5Омкг/мл дезоксирибонуклеази !| (Зідта). Дисоційовані клітини профільтрували 100мкм клітинним штамом (Раіїсоп) і піддали центрифугуванню при 1000об/хв протягом 5 хвилин. Осад був ресуспендований у живильному середовищі (високоглюкозне ОМЕМ: модифіковане у спосіб

Дульбеко середовище Ігла, 1095 ЕВ5, 25нг/мл птОМ-СЗ5РЕ), і клітини були поміщені з густиною 2 мозки на одну пластикову колбу для культивування Т-75. Через 7-9 днів колби піддали обертанню на ротаційному шейкері зі швидкістю 200об/хв протягом 2 годин при 372. Клітинна суспензія була центрифугована при 1ОООоб/хв і ресуспендована у випробувальному середовищі.

Кріостатні зрізи розміром ТОмкм зразків ураженого хворобою Альцгеймера мозку миші РОАРР і людини (Інтервал розі-тогпет « З години) були покладені в стані розтоплення на покриті полілізином круглі покривні стекла і поміщені в ямки 24-ямкових планшетів для культивування тканин. Покривні стекла двічі промили с випробувальним середовищем, що складалося із Н-5ЕМ (гібридомне безсироваточне середовище, сірсо ВК) з 195 ЕВ, глутаміну, пеніцилін-стептоміцину і 5нг/мл пгтОМ-СЗЕ (КО). Контрольний компонент або антитіла проти о

АВ добавляли з 2х концентрацією (заключна мкг/мл) протягом 1 години. Після цього мікрогліальні клітини висівали з густиною 0,8 х 109 клітин на мл випробувального середовища. Культури витримувались у зволоженому інкубаторі (372С, 5956 СО) протягом 24 годин або більше. Наприкінці інкубування культури юю закріплювали 495 параформальдегідом і робили проникними за допомогою 0,195 Тпйоп-Х100. Зрізи - забарвлювали біотинілюьованим 306, а слідом за цим стрептавідин/СуЗ окон'югатом (фірма дасквоп

ІттипоКезеагсі). Екзогенні мікрогліальні клітини візуалізувались ядровим барвником (ОАРІ). Культури вивчали С під імерсійним флуресцентним мікроскопом (Місоп, ТЕЗО0), а Їхні мікрознімки робили за допомогою цифрової - камери ЗРОТ з програмою ЗРОТ (Оіадповіїс іпвігитепів). Для вестерн-блотінгу культури екстрагували у 8М сечовині, розрідженій у співвідношенні 1:11 у відновлюваному трициновому буфері для зразків і поміщали в (ее) 1696-ний трициновий гель (Момех). Після перенесення на імобілон блоти піддавали дії 5мкг/мл рарАВа42, а потім

НеР-кон'югованого антитіла проти миші і вирощували з ЕСІ (Атегзпат).

При проведенні аналізу зрізів мозку РОАРР за наявності 16С11 (одне з антитіл проти АВ, яке було « неефективним іп мімо), В-амілоїдні бляшки залишалися інтактними і фагоцитозу не спостерігалося. У протилежність цьому при вирощуванні сусідніх зрізів за наявності 1005 амілоїдні відкладення широко - с розповсюдилися, і мікрогліальні клітини виказали наявність численних фагоцитних вакуолей, що містили АВ. и Ідентичні результати були одержані також зі зрізами мозку, ураженого хворобою Альцгеймера; антитіло 1005 ,» індукувало фагоцитоз пов'язаних з цією хворобою бляшок, у той час як 16С11 був неефективним. Крім того, даний аналіз дав порівнювальні результати поміж мікрогліальними клітинами мишей і людей, а також поміж антитілами мишей, кролика і приматів проти АВ. (ее) В Табл. 16 наведені дані, по яких можна бачити, що викликало специфічні зв'язування різних антитіл - - зв'язування чи фагоцитоз. Таким чином, з цих даних випливає, що антитіла, які зв'язуються з епітопами на ділянці амінокислот 1-7, як зв'язують, так і видаляють амілоїдні відкладення, у той час як антитіла, що ко зв'язуються з епітопами на ділянці амінокислот 4-10, зв'язують амілоїдні відкладення, але не видаляють їх. -л 20 Антитіла, що зв'язуються з епітопами С-кінця на залишку 10, ні зв'язують, ні видаляють амілоїдні відкладення. сл

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 16. Аналіз епітопної специфічності

Антитіло Забарвлення фагоцитоз епітоп ізотип

М-кінець таб зоб 1-5 юд52Б - я 1005 3-8 юс - - 2208 3-7 ідсга Кя - бЕТО 5-10 Петі т - 1448 4-10 ЧСС щура вя - 7 13-28 тво" 10-18 6О1 - - 266 16-24 Ід - - сч 22012 18-21 доль - - о)

С-кінець ою 253 -40 юс - - - 1562211 -40/-42 Ідс1 - - с 2112 -42 Ідога - - - г)

Імунна сироватка (СЕРА) кролика 16 - ж « (СЕРА) миші 3-7 ня ї - - (08-21) миші 37 у . . » " (05-21) мавпи 1-5 к - (МАР1-7) миші Б я (ее) -- В Табл. 17 подані результати, одержані з кількома антитілами проти АВ, де порівнюється їхня здатність т індукувати фагоцитоз у випробуваннях ех мімо і зменшувати бляшкове навантаження іп мімо в дослідженнях з пассивного переносу. Хоч антитіла 16С11 і 21212 зв'язувалися з агрегованим синтетичним пептидом АВ з - великою жадібністю, проте вони не були спроможні реагувати з В-амілоїдними бляшками в незакріплених зрізах сп мозку, не могли стимулювати фагоцитоз в експерименті ех мімо і не були ефективними іп мімо. Антитіла 1005,

ЗО06 і поліклональне антитіло проти АВ показали активність на усіх трьох рівнях. Антитіло 22028 сильніше зв'язується з формою аналога природного АВ, в котрій аспартанова кислота в положеннях 1 і 7 заміщена ізоаспартановою кислотою. Ці результати показують, що активність іп омімо зумовлена прямим антитіло-опосередкованим видаленням бляшок в СМ5 і що випробування ех мімо дозволяють прогнозувати

ГФ) ефективність іп мімо. з Аналогічний аналіз був застосований для оцінки видалення антитіла проти фрагмента синуклеїну, який має назву МАС. Про синуклеїн відомо, що він є амілоїдним білком, асоційованим з бляшками. Антитіло до МАС було во приведено в контакт зі зразком тканини мозку, що містив амілоїдні бляшки, мікрогліальні клітини, як вище. У якості контрольного зразка використовувалася кроляча сироватка. Наступний моніторинг показав значне зменшення кількості і розмірів бляшок, засвідчуючи цим очищувальну дію цього антитіла. б5

Таблиця 17. Аналіз ех умо як засіб прогнозування ефективності /п Уї/о

Антитіло ізотип Прагнення до Зв'язуванняз Ефективність Ефективність агрегованого р.амілоїдними Ех ммо Їп Уїо

АВ(РМ) бляшками ю Моноклональні зоб дСсгь 470 - - к 1005 Ідс1 43 - я - в 18011 юс 90 - - - 2112 ба 500 - - - тТМ2а Ід - - - -

Поліклональні 1-42 змішаний бо я ня ж

Для підтвердження того, чи інтерналізувався АВ в процесі досліджень ех мімо був застосований конфокальний мікроскоп. При наявності контрольних антитіл екзогенні мікрогліальні клітини залишались у се конфокальній площині над тканиною, були відсутні фагоцитні вакуолі, що містили АВ, а бляшки в зрізах о залишалися інтактними. При наявності антитіла 1005 майже весь бляшковий матеріал містився у вакуолях в екзогенних мікрогліальних клітинах. Щоб дізнатися про долю інтерналізованого пептиду, оброблені антитілом 1005 культури були екстраговані 8М сечовиною на різних відтинках часу і досліджені за допомогою вестерн-блотінгу. Через 1 годину, коли фагоцитоз ще не виникав, реакція з поліклональним антитілом проти АВ Іс) виявила сильну 4 КО стрічку (що відповідала пептиду АВ). Імунореактивність АВ знизилася на перший день і «- була відсутньою на З день. Таким чином, антитіло-опосередкований фагоцитоз АВ приводить до його деградації.

Для визначення того, чи був фагоцитоз у дослідженнях ех мімо опосередкований Ес, були приготовані с фрагменти К(аб)2 антитіла 306 проти АВ. Хоча фрагменти К(ар)2 повністю зберегли свою здатність реагувати з «- бляшками, проте вони були неспроможні активувати фагоцитоз мікрогліальними клітинами. Крім того, фагоцитоз 3З5 з усім антитілом міг блокуватися реагентом проти мишачих Ес-рецепторів (анти-СО16/32). Ці дані свідчатьпро 0 те, що видалення АВ іп мімо відбувається через опосередкований Ес-рецептором фагоцитоз.

ХМ. Проходження антитіл через гематомозковий бар'єр

У даному експерименті визначається концентрація антитіла, що постачається в мозок після внутрішньовенної « ін'єкції в периферійну тканину звичайної миші або РОАРР миші. Піддослідні миші - РОАРР і звичайні - були перфузовані 0,995 Масі. Ділянки мозку (гіпокамп і кора головного мозку) були розсічені і швидко заморожені. - с Мозок гомогенізували 0,195 тритоном з інгібіторами протеази. Імуноглобулін виявляли в екстрактах за методом "з ЕІГ15А. Імуноглобуліном Рар'2 кози проти миші у якості захоплюючого реагента покрили планшет КІА. Екстракти " сироватки або мозку інкубували протягом 1 години. Ізотипи виявляли ІдсС1-НКР, ІдДо2а-НКР або ІдСб2Б-НАКР проти миші (фірма Саїад). Антитіла, незалежно від ізотипу, були наявними в СМЗ5 з концентрацією 1:1000, виміряною в крові. Наприклад, коли концентрація Ід1 перевищувала в З рази концентрацію ІдсСл2а в крові, його (ее) концентрація в мозку також в З рази перевищувала концентрацію там Ідс2а, де вони обидва були наявними у - кількості 0,195 від їхніх відповідних рівней в крові. Це спостереження мало місце як у трансгенних, так і у нетрансгенних мишей, а отже РОАРР не має унікального гематомозкового бар'єра, що тече. іме) ХМІ. Терапевтична ефективність пептиду АВ в конфігурації МАР шу 70 Дослідження терапевтичної ефективності комплексу ад'ювант/муноген проводили на самцях і самках гетерозиготних трансгенних мишей РОАРР віком 9 -10,5 місяців. Метою досліджень було перевірити сл ефективність злитого білка, що містить АВ1-7 в тетрамерній конфігурації МАР, описаній вище. Дослідження тривали 25 тижнів. Піддослідні тварини були поділені на групи по 29-40 тварин в кожній. Таким чином, в кінці досліджень вік тварин склав 15-16,5 місяців. Методика досліджень була такою самою, що й у терапевтичних дослідженнях різних ад'ювантів у Прикладі МІІІ. Характеристики груп піддослідних тварин наведені в Табл. ХМІІЇ. (Ф) Таблиця ХУНІ І дк Ад'ювант Імуноген Розріджувальний | Спосіб уведення во В Фе

Група 4: | СЕАЛЕА | МАР(АВІ-7:ТТ) (100 мк/) ІР (400 мкл)

Група2:) 0521 АМі?732-ос5(75мю) | 0 РВ5 | 50 (250 мкл) б5 тиехІ 51 000--01-- 1 вобюомк

Скорочення: МАР - мультиантигенний пептид; ТТ - Т-клітинна антигенна детермінанта правцевого 2 тексину (830-844); 5С - підшкірно; Р - інтраперитонеально; РВ5 - забуферений фосфатом фізіологічний розчин; 305 - гліцинцитратсахарозний препарат.

Графік імунізації був ідентичний для всіх груп піддослідних тварин. Тваринам робили ін'єкції в такі тижні: 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24; кровопускання робили по таких тижнях: З, 5, 9, 13, 17, 21 і 25: Групи 1, то 2, 3,4 і 6 отримали 8 ін'єкцій; групи 2 і З отримали О521/АМ1792 і РВ5 відповідно і служили у якості позитивної і негативної контрольних груп.

Титри визначали шляхом аналізу титрів антитіл проти АВ.

Група 1. Група СРАЛЕА:МАР(АВ1-7:1Т), мала низькі рівні титрів. Пік ЗМТ склав лише 1200 і був досягнутий на 13 тижні, після чого упав до СМТ 600 на 25 тижні. У трьох з 30 мишей титр не піднявся зовсім, а ще у 7 т мишей він не перевищив рівня 400 наприкінці досліджень.

Група 2. Контрольна група 0О521/АМ1792, її піковий титр ОМТ був досягнутий на 17 тижні і склав 16000.

Після цього він упав протягом наступних 8 тижнів до рівня ОМТ 8700. Одна з тварин цієї групи не показала зростання титру на протязі всього експерименту.

Група 3. Група, що отримувала лише РВ5, титрів не мала.

Обидві імунізовані групи показали значне зниження кортикальних рівнів АВ порівняно з контрольною фупою

РВ5 (Табл. 19). Група СРАЛЕА:МАР(АВ1-7) мала значно знижений АВ порівняно з контрольною РВЗ-групою, незважаючи на зареєстровані у неї відносно низькі титри антитіл проти АВ. зв Таблиця 19. Кортикальні рівні АД с (8)

ШЮ0700200172756 Їм Би нг/г тканини ю |Діапазон, нг/гт тканини 550-18358 240-10782 210-11187 «-

Веляенає 177-166 тоб с 18111 | | | | ' що не)

Підсумовуючи, можна сказати, що імуноген АВ1-7МАР є ефективним в індукуванні доволі сильної імунної реакції, достатньої для затримання відкладення АВ в корі головного мозку.

ХМІЇ. Картування епітопів імуногенної реакції на АВ у мавп

В цьому експерименті був проведений аналіз реакції приматів на імунізацію пептидом АМ1792 (тобто АВ1-42). « 20 Пептидом АМ1792 (75 або ЗО0Омкг на дозу) в комбінації з ад'ювантом 05-21 (50 або 10Омкг на дозу) або з 595 ш-в с стерильною декстрозою у воді (ОБМУ, контрольна група) було імунізовано 11 груп мавп (по 4 особини тої та іншої статі на групу). Ін'єкції всім тваринам робились у внутрішньом'язовий спосіб за будь-яким з трьох графіків, :з» показаних в Табл. 20, із загальною кількістю 4, 5 або 8 доз. Зразки сироватки від чотирьох мавп тої та іншої статі на групу, зібрані на 175 день експерименту, і зразки С5Е (від трьох мавп тої та іншої статі на групу), зібрані на 176 день досліджень (на б місяці аутопсія), були оцінені за їхньою здатністю зв'язуватися з о пептидом АВ1-40 і АРР. - іме) - 50 сл

Ф) іме) 60 б5

Таблиця 20. Характеристики груп піддослідних тварин і рівні доз

Група Графік" Мавпи Доза АМ1792,1 Доза 15-21 Спосіб й Ме (самці/самки)) мкгнадозу | мкгнадозу | уведення ромом 021118 |оней | 59 | мМ шили и С СС ПОЛО СТО 451111 | 5 | юю | м птротрою ровм 811 ро | ром ромом 21751175 м 8112 9439 | о | МоО 71311511 ямою фо о а. Графік 1, дні імунізації: 1, 15, 29, 57, 85, 113, 141, 169; Графік 2, дні імунізації: 1, 29, 57, 113, 169;

Графік 3, дні імунізації: 7, 43, 85, 1689.

Б. Контрольна група, ін'єкція ОБУМ, ю в. Носій складався із буферного розчину гліцин/цитрат/сахарози, який для АМ1792 є ексципієнтом, -

Точний ряд лінійних пептидів, розпізнаних антитілами в сироваточних зразках від тварин, імунізованих с

АМ1792, був визначений шляхом аналізу ЕПІЗА, який виміряв зв'язування цих антитіл з пептидами, що перекриваються і охоплюють всю послідовність АВ 1-42. Біотинільовані пептиди з частковими послідовностями -- з5 пептиду АМ 1792 були отримані від фірми Спігоп Тесппоіодіез як 10-амінокислотні пептиди з перекриттям 9 со залишків з кроком в 1 залишок на пептид (синтез Мо536б, Мо5331 і Мо5814). Перші 32 пептиди (від положення 8 амінокислоти уверх за потоком від М-кінця АМ 1792 до 24 амінокислоти АМ1792) були біотинільовані на С-кінці лінкером ОК. Решта 10 пептидів (що повторювали 32 пептид із попередньої серії) були біотинільовані на

М-кінці лінкером, що складався із ЕСЕС (5ЕС). ІЮ Мо: 76). Ліофілізовані біотинільовані пептиди були розчинені « 40. 3 концентрацією 5 ММ в ОМ5О. Одержані таким чином пептидні маси були розріджені до 5 мкМ в ТТВ5 (0,059 пт») с Тмееп 20, 25ММ Ттіз-НСІ, 37мМ Масі, 5,1мМ КСІ, рН 7,5). Аліквоти 10Омкл із цього 5мкМ розчину були поміщені в 2 екземплярах на покриті стрептавідином 96б-ямкові планшети (Ріегсе). Планшети були піддані інкубуванню :з» протягом 1 години при кімнатній температурі, а після цього чотирикратно промиті ТТВ5. Зразки сироватки розрідили в розріджувачі для зразків без азиду для нормалізації титрів і по 10О0мкл розчину були введені в

Кожну ямку. Ці планшети інкубувались протягом 1 години при кімнатній температурі і потім були промиті чотири о рази ТТВ5. НКР-кон'юговане антитіло кози проти людини (дасквоп ІттипоКезеагсі) було розріджено у співвідношенні 1:10000 в розріджувачі для зразків без азиду, і по 100мкл розчину ввели в кожну ямку. Планшети - знов піддали інкубуванню і промили. Для розвинення кольорової реакції в ямки ввели по 100мкл ТМВ (Ріегсе), і

ГІ планшет інкубували протягом 15 хвилин перед добавленням ЗОмкл Н 550; для зупинення реакції. Оптичну Густину вимірювали на хвилі 450нм на приладі Моіесцшаг ЮОемісеве Мтах або Зресігатах зчитування - колориметричних планшетів. с Імунізація пептидом АМ1792 привела до продукування антитіл у всіх тварин в усіх дозових фупах на 175 день. Середні титри по групах становили від 14596 до 56084. Спостерігалася тенденція до зростання титрів в межах графіка імунізації за наявності більш високих концентрацій антигена і/або ад'юванта. Але статистично 5Б значущої різниці при цьому досягнуто не було через велику змінність індивідуальних реакцій піддослідних особин на імунізацію. (Ф; Зразки сироватки, що були позитивними для антитіл до АМ 1792, були також позитивними для антитіл до ка АВ1-40. Середні титри по групах складали від 36867 до 165991 і, як у випадку титрів проти АМ1792, не досягали статистично значущої різниці поміж групами на 175 день. Зв'язування з АМ 1792 продемонструвало високу бо позитивну кореляцію (Зреагтап р-0,8671) зі зв'язуванням з АВ 1-40.

Із 48 мавп, імунізованих за різними графіками АМ1792, у 33 тварин зразки С5Е для аналізу були адекватного об'єму і якості. 32 (9795) із цих мавп мали позитивні титри до АМ 1792. Титри мали величини від 2 до 246, а їхня середня величина складала 49,44 - 21,34. Рівні анти- АМ1792 в СЕ становили 0,18 з 0,1195 від виміряних в сироватці і продемонстрували високу позитивну кореляцію (Зреагтап г-0,7840) з титрами сироватки. По фупах бБ і поміж особин різної статі різниці відсоткового вмісту антитіла в С5Е виявлено не було. Рівень антитіл в СЗЕ збігався з пасивним перенесенням периферійно генерованого антитіла крізь гематомозковий бар'єр в -БО0-

центральну нервову систему.

Тестування підгрупи анти-АМ792 позитивних зразків СЕ продемонструвало, що, як і антитіло в сироваточних зразках, антитіло в С5Е перехресно реагувало з АВ1-40. Титри до АВ1-40 показали високу кореляцію (Зреагтап г-0,9634) з Їхніми відповідними титрами АМ1792. Тестування підгрупи зразків СЕ з найвищими титрами до

АМ1792 не показало зв'язування з АРР, як і у випадку сироваточних антитіл.

При тестуванні сироваток 175 дня проти серії 10-мерних пептидів, що перекриваються, антитіла від усіх мавп зв'язувались з пептидом, послідовність якого перекривала амінокислоти 1-10 пептиду АМ1792 (амінокислоти 653-672 АРР). У деяких тварин це був єдиний пептид, зв'язування з яким могло бути виміряне 7/0 (див. Фіг.19).

У інших тварин спостерігалися інші реактивності, але в усіх випадках реактивність до М-кінцевої пептидної послідовності була домінуючою. Додаткові реактивності ділилися на дві фупи. Перше і найбільш загальне було зв'язування з пептидами, що центрувалися навколо М-кінцевого 1-10 пептиду АМ1792 (Фіг.20). Зв'язування цього типу було спрямоване на пептиди, що перекривали амінокислоти 1-8, 1-9 і 2-11 пептиду АМ1792. Ці реактивності /5 разом з реактивністю до пептиду 1-10 являють собою переважну більшість реактивності у всіх тварин.

Картування епітопів окремих тварин в часі показує, що реактивність антитіл до пептиду 1-10 веде до поширення на сусідні пептиди. Це свідчить про сильне зміщення імунної реакції до М-кінця пептиду АМ1792, на вільному кінці якого знаходиться залишок аспартанової кислоти. Друга, незначна активність, що піддається виявленню, у деяких тварин була зв'язана з пептидами, розміщеними С-кінцями до головної ділянки і центрованими навколо 2о пептидів, що перекривають амінокислоти 7-16, 11-20 ії 16-25 пептиду АМ1792. Ці реактивності спостерігалися лише у 10-3095 мавп.

Змінність реакції між різними тваринами (наприклад, в одних тварин амінокислоти 1-10 являли собою ексклюзивний, а в інших - домінуючий реактивний епітоп) не корелювала з дозою комбінації антиген/ад'ювант, графіком імунізації або титром антитіл і, очевидно, є віддзеркаленням генетичних особливостей кожної із тварин. сч

ХМІІ. Профілактика і лікування людей

Ступінь небезпеки даного винаходу стосовно людей встановлювали шляхом однодозових випробувань (фаза і) 1). Терапевтичний агент уводили різним пацієнтам у зростаючих дозах, починаючи від приблизно 0,01 рівня передбачуваної ефективності з подальшим трикратним збільшенням до рівня, що приблизно у 10 разів перевищував ефективну дозу для мишей. ю зо Терапевтичну ефективність винаходу визначали шляхом випробувань на фазі 2. Для цих випробувань були відібрані пацієнти зі стадіями хвороби Альцгеймера від ранньої до середньої, визначених за критеріями -- асоціації АОКОА (Асоціація хвороби Альцгеймера і споріднених з нею розладів) на ймовірність хвороби с

Альцгеймера. На державних обстеженнях ментальності за мініпрограмою (ММ5Е: Міпі-МепіаІ! біаїе Ехат) відібрані пацієнти отримали оцінки в межах від 12 до 26. Іншими критеріями відбору пацієнтів була їхня -- з5 Здатність витримати всю програму досліджень без появи ускладнень, наприклад, супровідного лікування. Базова ((уу оцінка функціональності пацієнтів проводилась із використанням класичних психометричних досліджень, таких, як ММ5Е і АБАФ, які дають вичерпну схему для оцінки пацієнтів, що знаходяться у стані хвороби Альцгеймера.

Ці психометричні схеми дозволяють оцінити ступінь розвитку стану Альцгеймера. Для моніторингу лікування можна застосовувати також підходящі схеми якісної натуральної оцінки. Розвиток хвороби може простежуватися « також за допомогою МК. Можна вести також спостереження за профілями крові пацієнтів, проводячи в тому з с числі аналіз імуноген-специфічних антитіл і Т-клітинних реакцій.

Після базових обстежень пацієнти починали отримувати лікування. Лікування їх проводилося у випадковому ;» порядку із застосуванням всліпу терапевтичних агентів або плацебо. Пацієнти обстежувались принаймні кожні 6 місяців. Ефективність лікування визначали за значним зниженням розвитку хвороби в групі, що піддавалася лікуванню, порівняно з групою плацебо.

Го! На фазі ІІ були проведені також другі випробування, метою яких стала оцінка ступеня ризику перетворення стану ранньої втрати пам'яті, не зумовленого хворобою Альцгеймера, який іноді зветься віковим розладом - пам'яті (ААМІ: аде-аззосіаФеій тетогу ітраіптепі) або м'яким когнітивним розладом (МС: тій содпійме ко ітраігптепі), на можливу хворобу Альцгеймера згідно з визначенням за критеріями АОКОА. Пацієнти з високим аю ступенем ризику перетворення на хворобу Альцгеймера були відібрані з неклінічної групи хворих, які мали ранні ознаки втрати пам'яті, або інші труднощі, пов'язані з предальцгеймеровською симптоматологією, фамільною сп історією хвороби Альцгеймера, генетичними факторами ризику, віком, статтю та іншими факторами, які могли б передбачати високий ризик хвороби Альцгеймера. Були зібрані базові оцінки за відповідними схемами, включаючи ММ5Е і АБАЗ разом з іншими схемами, призначеними для оцінки пацієнтів, близьких до нормального ов стану. Цих пацієнтів було поділено на відповідні групи з плацебо-порівнянням проти альтернативного дозування імунізаційним агентом. Ці пацієнти були відстежені приблизно з шестимісячними інтервалами, а завершувальним (Ф, пунктом для кожного з них було визначення того, перетворився його (або її) стан на хворобу Альцгеймера за ка критеріями АОКОА наприкінці обстежень чи ні.

ХІХ. Загальні матеріали і методи во 1. Вимірювання титрів антитіл

Кровопускання мишам робили через малий надріз у хвостовій вені, кров із якої збирали у кількості 200мкл у мікроцентрифужну пробірку. Для кровопускання у морських свинок спочатку видаляли волосяний покрив на ділянці заднього сухожилля, після чого голку номер 18 вводили у метатарзальну вену, і кров збирали у мікрофужну пробірку. Крові давали згорнутися протягом 1 години при кімнатній температурі, після чого її 65 інтенсивно перемішували, піддавали центрифугуванню зі швидкістю 14000 х г протягом 10 хвилин, вщділяючи зсілу кров від сироватки. Сироватку переносили до очищувальної мікрофужної пробірки і після цього зберігали при температурі 42С до титрування.

Титри антитіл виміряли за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу ЕГІ5БА. 96-Ямкові мікротитрувальні планшети (Совзіаг ЕІА) покривали 100мкл розчину, що містив 1О0мкг/мл АВ42 або ЗАРР чи інших антигенів згідно із записом по кожному дослідженню, у буфері для сенсибілізування ямок (0,1М фосфату натрію, рН 8,5, 0,195 азиду натрію) і витримували протягом ночі при кімнатній температурі. Вміст ямок відсмоктували, і в них уводили сироватку, починаючи з розрідження 1/100 у розріджувачі для зразків (0,014М фосфату натрію, рн 7,4, 0,15М масі, 0,695 бичачого сироваточного альбуміну, 0,0595 тімерозалу). Сім послідовних розчинів зразків готували безпосередньо на планшетах в три стадії до кінцевого розрідження 1/218700. Розчини інкубували в 7/0 ямках на покритому планшеті протягом 1 години при кімнатній температурі. Після цього планшети промивали чотири рази забуференим фосфатом фізіологічним розчином (РВ5), який містив 0,0595 Тмееп 20. В ямки вводили друге антитіло Ід кози проти миші, кон'юговане із пероксидазою із хріну (від фірми Военйгіпдег

Маппеїт) у 10Омкл розчині з розрідженням 1/3000 в розріджувачі для зразків і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Далі планшети знов чотирикратно промивали розчином РВ5 із Тжмееп 20. Для 75 вирощування хромогена в кожну ямку добавляли 100мкл повільного ТМВ (3,3,5,5'-тетраметилбензидин від фірми Ріегсе Спетіса!5), і планшет інкубували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Реакцію зупиняли добавленням 25мкл 2М Нь»ЗО),. Після цього зчитували колірну інтенсивність на приладі Моіесціаг Оемісев Мтах на хвилі 450-65Онм.

Титри визначали як обернені величини розрідження сироватки, що дає половину максимальної оптичної густини (00: оріїса! депезйу). Максимальну ОО у загальному випадку визначали при початковому розрідженні 1/100, за винятком випадків дуже високих титрів, де було необхідним більше високе початкове розрідження для встановлення максимальної ОЮ. Якщо 5095 точка потрапляла між двома розрідженнями, то для обчислення кінцевого титру проводили лінійну екстраполяцію. Для обчислення середньої геометричної титрів антитіл титрам величиною менше 100 довільно приписували величину 25. с 2. Аналіз проліферації лімфоцитів о

Мишей піддавали анестезії ізофлураном. Після цього у них видаляли селезінки, які двічи промивали 5 мл

РВ5, що містив 1095 термодезактивованої фетальної бичачої сироватки (РВЗ-ЕВ5) і потім гомогенізували у приладі 502 Сепігісоп (фірма ЮОако А/5, Данія) в 1,5мл РВ5З-ЕВ5 протягом 71Ос при 100об/хв в приладі

Меаітасніпе (ОСако) з наступною фільтрацією через нейлонну сітку з отворами 100мкм. Спленоцити однократно цО промивали 15мл РВЗ-ЕВ5, після чого їм надавали форму кульки шляхом центрифугування при 200 х г протягом 5 хвилин. Червоні клітини крові лізували шляхом ресуспендування кульки в мл буферу, що містив 0,15М --

МНАСІ, М КНСО», 0,1М МаєгєюЮтТА, рН 7,4 протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Далі лейкоцити сі промивали, як описано вище. Свіжовиділені клітини селезінки (102 клітин на ямку) культивували протягом 96 годин при 372С в триплікатних наборах в 96-ямковому мікротитрувальному планшеті з О-подібним дном ямок, -- обробленому під вирощування тканини (фірма Сотіпо, Сатрбгідде, МА) в середовищі КРМІ 1640 (КН с

Віозсіепсез, Ііепеха, КЗ), доповненому 2,05 мМ І-глютаміну, 195 пеніцилін/стрептоміцину і 1095 термодезактивованого ЕВ5. В чотири стадії добавляли також різноманітні пептиди АВ, АВ1-16, АВ1-40, АВ1-42 або АВ40-1 з оберненою послідовністю білка дозами від 5 до 0,18 мкМ. Клітини в контрольних ямках « культивували з конканаваліном А (Соп А) (фірма бідта, каталог Мо С-5275, з концентрацією 1 мкг/мл) без добавлення білка. Протягом заключних 24 годин клітини піддавали імпульсній обробці ЗН-тимідином (1мксі на - с ямку, від фірми Атегепат Соф., Апіпдіоп Неїіднів І). Далі клітини збирали на універсальні фільтрувальні м планшети і підраховували на сцинтиляційному лічильнику Тор Соцпі Місгоріаїе ЗсіпіШайноп Соипіег (фірми я Раскага Іпвігитепів, Оом/пеге Огоме, І). Отримані результати виражали в кількості імпульсів за хвилину (срт) радіоактивності, введеної в нерозчинні макромолекули. 4. Готування тканини мозку (ог) Після ейтаназії мозок піддослідної тварини видаляли і одну його півкулю препарували для - імуногістохімічного аналізу, у той час як три ділянки мозку (гіпокамп, кору головного мозку і мозочок) відсікали від решти півкулі і використовували для вимірювань концентрації різних білків АВ і форм АРР за іме) допомогою специфічного аналізу ЕГІЗА МЮоппзоп-Ууоса еї а!., див. вище). шу 70 Тканини, призначені для аналізу ЕГПІЗА, гомогенізували в 10 об'ємах охолодженого на льоду гуанідинового буферу (5,0М гуанідин-НСІ, 5О0мММ Тгіз-НСІ, рН 8,0). Гомогенати обережно перемішували на нутаторі Адамса сл (Різпег) протягом 3-4 годин при кімнатній температурі і потім зберігали при -202С перед кількісним аналізом АВ і

АРР. Попередні експерименти показали, що в цих умовах зберігання призначені для аналізу речовини були стабільними і що кількість синтетичного білка АВ (Васпет) можна було відновлювати, якщо його закріпити в гомогенаті контрольного зразка мозкової тканини від новонароджених мишей Юоппзоп-Умоса еї а!., див. вище).

ГФ! 5. Вимірювання рівнів АВ

Гомогенати мозку розріджували до 1:10 охолодженим на льоду казеіїновим розріджувачем (0,2590 казеїну, ю РВ5, 0,0595 азиду натрію, 2Омкг/мл апротиніну, 5мММ ЕОТА рн 8,0, 1Омкг/мл лейпептину) і піддавали центрифугуванню при 16000 х г протягом 20 хвилин при 42. Готували стандарти штучного білка АВ (1-42 60 амінокислот) і стандарти АРР для включення 0,5М гуанідину і 0,195 бичачого сироваточного альбуміну (В5А) в кінцевій композиції. Сендвіч-аналіз ЕІ ІЗА загального АВ проводили з використанням моноклонального антитіла 266, специфічного до амінокислот 13-28 пептиду Ар ІЗецбрегі еї а, у якості імобілізованого антитіла і біотинільованого моноклонального антитіла 306, специфічного до амінокислот 1-5 пептиду АВ ЮМоппзоп-Ууоса еї а!.), у якості антитіла-репортера. Моноклональне антитіло 306 не розпізнавало секретованого АРР або АРР бо повної довжини, а детектувало лише види АВ з амінокінцевою аспартановою кислотою. Цей аналіз мав нижню межу чутливості приблизно 5Онг/мл (11нНМ) і не показував перехресної реактивності щодо ендогенного мишачого білка АВ при концентраціях до Інг/мл Моппзоп-Умуоса еї а!., див вище).

В АВ 1-42 специфічному сендвіч-аналізі ЕГІЗА використовувалося антитіло тАр 2112, специфічне до амінокислот 33-42 Ар ЮМоппзоп-Ууоса еї а)/.)| у якості імобілізованого антитіла. Біотинільоване антитіло тАр 306 в цьому аналізі, нижня межа чутливості якого складала приблизно 125мкг/мл (28мкМ, доппзоп-Ууоса еї а!.), також виконувало роль антитіла-репортера. Для імуноферментного аналізу ЕГІЗА пептиду АВ в ямки 96б-ямкових планшетів для імуноаналізу (Совіаг) поміщали 100мкл антитіла тАб 266 (1Омкг/мл) або тАр 21212 (5мкг/мл) і інкубували протягом ночі при кімнатній температурі. Далі розчин видаляли шляхом відсмоктування, а ямки 76 блокували добавленням 200мкл 2595 людського сироваточного альбуміну в РВ5 буфері принаймні на 1 годину при кімнатній температурі. Блокувальний розчин видаляли, і планшети зберігали у висушеному стані при 42 до їх використання. Далі планшети регідрували мийним буфером (Тгіз-забуферений фізіологічний розчин (0,15 масі, 0,01 Тгів-НСІ, рН 7,5) плюс 0,0595 Тжмееп 20) перед використанням. Зразки і стандарти вводили у потрійних аліквотах 10Омкл на ямку, після чого проводили інкубування протягом ночі при 4 С. Планшети промивали 75 принаймні три рази мийним буфером по закінченні кожної стадії аналізу. В ямки добавляли біотинільоване антитіло тАр 306, розріджене до 0,5мкг/мл в казеїновому аналітичному буфері (0,25905 казеїн, РВ5, 0,0590 Тмееп 20, рН 7.4) і піддавали Інкубуванню протягом 1 години при кімнатній температурі. В ямки додавали кон'югат авідину з пероксидазою хріну (авідин-НКР від фірми Месіог, Вигіпдате, СА), розріджений у співвідношенні 14000 в казеїновому аналітичному буфері протягом 1 години при кімнатній температурі. Далі додавали Кколориметричний субстрат, повільний ТМВ-ЕГІЗА (Ріегсе) і залишали для реакції протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, після чого ферментативну реакцію зупиняли добавленням 25мкл 2М Н 550,4. Продукт реакції піддавали кількісному аналізу на приладі Моіесшаг Юемісез Мтах, що вимірює різницю поглинання на 450 і б5Онм. 6. Вимірювання рівнів АРР Га

Застосовували два різних аналізи АРР. Перший, позначений як АРР-о/гї,, розпізнавав як АРР-о, (0-форму), так і форму повної довжини (РІ) АРР. Другий аналіз був специфічним до АРР-о. Аналіз АРР-о/РІ. розпізнавав о секретований АРР, включаючи перші 12 амінокислот пептиду АВ. Оскільки антитіло-репортер (2Н3) не є специфічним до о-кліп-сайта, що виникає між амінокислотами 612-613 АРРбОБ5 (Евзсп еї аїЇ.,, Зсіепсе 248, 1122-1124 (1990)), цей аналіз також розпізнає повнодовжинний АРР (АРР-ЕІ). В попередніх експериментах, де М використовувались імунізовані АРР-антитіла до цитоплазмового хвоста АРР-РІЇ для збіднення гомогенатів «-

АРР-РЇ мозку, припускалося, що приблизно 30-4095 АРР-А/РІЇ АРР є РІ (дані не наведені), (мобілізоване антитіло як для аналізу АРР-о/Рї,, так і для аналізу АРР-у, яким було тАБ 8Е5, викликало антитілогенез проти с амінокислот від 444 до 592 форми АРРбБ95 |Сатез еї аї!., див. вище). Репортером тАБ для аналізу АРР-о/РІ. «- було тАБ 2НЗ, специфічне для амінокислот 597-608 форми АРРбБО5 Моппзоп-УУоойд еї аї., див вище), а 32 антитілом-репортером для аналізу АРР- у була біотинільована похідна антитіла тАБ 16Н9, що викликало со антитілогенез до амінокислот 605-611 пептиду АРР. Нижня межа чутливості аналізу АРР- здР| становила приблизно 1Інг/мл (15006М) Моппзоп-Ууоод еї аІД., а нижня межа чутливості АРР- о-специфічного аналізу становила 22нг/мл (0,ЗНМ). В обох аналізах АРР антитіло тАБ 8Е5 наносили на ямки 96-ямкових планшетів ЕЇІА, « як описано вище для тАбБ 266. Очищений рекомбінантний секретований АРР- у використовувався у якості з й й й еталона для аналізу АРР-о, і для аналізу АРР- о/РІ |Евсп еї аї., див. вище). Зразки гомогенату мозку в 5М с гуанідині розріджували у співвідношенні 1:10 в розріджувачі для зразків аналізу ЕГІЗБА (0,014М фосфатний :з» буфер, рН 7,4, 0,695 бичачий сироваточний альбумін, 0,0595 тімерозал, 0,5М Масі, 0,195 МР4А0). Далі їх розріджували у співвідношенні 1:4 в розріджувачі для зразків, що містив О,5М гуанідін. Розріджені гомогенати піддавали центрифугуванню при 16000 х г протягом 15с при кімнатній температурі. На планшет поміщали оо стандарти АРР і зразки у подвійних аліквотах і інкубували протягом 1,5 години при кімнатній температурі.

Біотинільоване антитіло-репортер 2НЗ3 або 16НО інкубували зі зразками протягом 71 години при кімнатній - температурі. Стрептавідиналкалінфосфатазу (Виепгіпдег МаппПпеїт), розріджену у співвідношенні 1:1000 в г) розріджувачі для зразків, інкубували в ямках протягом 1 години при кімнатній температурі. На планшети додавали флуоресцентний субстрат 4-метилумбеліферилфосфату протягом З0 хвилин при кімнатній - температурі інкубування, і планшети зчитували на флуориметрі Суїойцог (т 2350 (МіПіроге) при збудженні на с Збонм і емісії на 45Онм. 7. Імуногісгохімія

Зразки мозку фіксували протягом З днів при 402С в 495 параформальдегіді в РВ5З і потім зберігали 1-7 днів дво при 42С в 196 параформальдегіді в РВ5 до розрізання. Корональні зрізі завтовшки 40 мкм різали на вібратомі при кімнатній температурі і зберігали в кріопротекторі (3095 гліцеролу, 3096 етиленгліколю у фосфатному буфері) при

Ф) температурі -202С перед імуногістохімічною обробкою. Для кожного зразка мозку 6 зрізів на рівні дорсального ко гілокампу, кожний розділений послідовними інтервалами 24Омкм, інкубували протягом ночі з одним із таких антитіл: (1) біотинільоване тАб 306 проти АВ, специфічне до людського АВ, розріджене в концентрації 2мкг/мл в бо РВБ і 195 конячої сироватки; (2) біотинільоване тАр 8Е5, специфічне до людського АРР, розріджене в концентрації Змкг/мл в РВБ5 і 1,095 конячої сироватки; (3) тАБ, специфічне до гліального, фібрілярного кислотного білка (СБАР; бідта СПетіса! Со.), розріджене у співвідношенні 1:500 0,2595 Титйоп Х-100 ї 1960 конячої сироватки в Тгіз-забуференому фізіологічному розчині, рН 7,4 (ТВ5); (4) тАБ, специфічне до СО116,

МАС-1 антигена, (Спетісоп Іпіегпайопаї!), розріджене у співвідношенні 1:100 0,259 Ттійоп Х-100 і 195 кролячої 65 сироватки в ТВ5; (5) тАб, специфічне до МН ІІ антигена (Рпагтіпдеп), розріджене у співвідношенні 1:100 0,2590

Тійоп хХ-100 і 195 кролячої сироватки в ТВ5; (6) тАБ щура, специфічне до СО43 (РНагтіпдеп), розріджене у співвідношенні 1:100 195 кролячою сироваткою в РВ5; (7) тАБ щура, специфічне до С045КА (РНагтіпдеп), розріджене у співвідношенні 1:100 195 кролячою сироваткою в РВ5; (8) моноклональне АВ щура, специфічне до сра5вВ (РНагтіпдеп), розріджене у співвідношенні 1:100 195 кролячою сироваткою в РВ5; (9) моноклональне АВ щура, специфічне до СО45 (РНагтіпдеп), розріджене у співвідношенні 1:100 195 кролячою сироваткою в РВ5; (10) біотинільоване поліклональне АВ хом'яка специфічне до СОЗе (Рпапгтіпдеп), розріджене у співвідношенні 1:100 195 кролячою сироваткою в РВ5; (11) тАБ щура, специфічне до СОЗ (Зегоїес), розріджене у співвідношенні 1:200 195 кролячою сироваткою в РВ5; (12) розчин РВ5 без первинного антитіла, що містив 195 нормальної конячої сироватки. 70 Зрізи, які реагували з розчинами антитіл, переліченими в пп. 1, 2 і 6-12 вище, перед тим оброблялись 190

Топ х-100, 0,495 перекису водню в РВ5 протягом 20 хвилин при кімнатній температурі для блокування ендогенної пероксидази. Далі їх інкубували протягом ночі при 42С з первинним антитілом. Зрізи, що реагували з тАБ антитілами 306, 8Е5 і СОЗе, після цього піддавалися реакції протягом 1 години при кімнатній температурі з комплексом пероксидаза хріну - авідин - біотин з компонентами "А" і "В" із наборів, розрідженими у 75 співвідношенні 1:75 у РВЗ (Месіог ЕІШе Зіапдага Кі Месіог Гарз, Випіпдате, СА). Зрізи, що реагували з антитілами, специфічними до СО45КА, СО45КВ, СО45, СОЗ і розчином РВ5 без первинного антитіла, піддавалися інкубуванню протягом 1 години при кімнатній температурі з біотинільованим ІдсС проти щура (Месіог), розрідженим 1:75 в РВ5, або біотинільованим дО проти миші (Месіог), розрідженим 1:75 в РВ5, відповідно. Далі зрізи піддавали реакції протягом 1 години при кімнатній температурі з комплексом пероксидаза

Хріну - авідин - біотин з компонентами "А" і "В" із наборів, розрідженими у співвідношенні 1:75 у РВЗ (Месіог

ЕїШе 5іапаага Кії, Месіог І абз, Вигіпдате, СА).

Зрізи розвивалися в 0,0195 перекису водню, 0,05905 З,3'-діамінобензидині (САВ) при кімнатній температурі.

Зрізи, призначені для інкубування з ЗЕАР-, МАС-1- і МНС ІІ-специфічними антитілами, перед тим піддавалися оброблянню 0,695 перекисом водню при кімнатній температурі для блокування ендогенної пероксидази, а потім с піддавалися інкубуванню протягом ночі з первинним антитілом при 42С. Зрізи, які реагували з антитілом СЕАР, інкубувалися протягом 1 години при кімнатній температурі з біотинільованим до проти миші, зробленому в коні і) (Месіог І арогайогіев; Месіавіайїпй ЕІШе АВС Кі) і розрідженому у співвідношенні 1:200 ТВ5. Далі зрізи піддавалися реакції протягом 1 години з комплексом авідин-пероксидаза хріну (Месіог І арогайгієв; Месіавіаіп

ЕїШе АВС Кі), розрідженим у співвідношенні 1:1000 ТВ5. Зрізи, що інкубувалися з МАС-1- або МНС юю

І-специфічним моноклональним антитілом у якості первинного антитіла, після цього піддавалися реакції протягом 1 години при кімнатній температурі з біотинільованим ДС проти щура, зробленим у кролику і -- розрідженим у співвідношенні 111000 ТВ5, з наступним інкубуванням протягом 1 години з комплексом сі авідин-біотин-пероксидаза, розрідженим у співвідношенні 1:1000 ТВ5. Зрізи, інкубовані з ЗЕАР-, МАС-1- і МНС

П- специфічними антитілами, після цього піддавалися візуалізації обробкою при кімнатній температурі 0,0595 --

ОАВ, 0,0195 перекисом водню, 0,04905 хлориду нікелю, ТВ5 протягом 4 і 11 хвилин відповідно. ее

Імуномічені зрізи поміщали на предметні стекла (МУМУК, Зирептгові віїдев), сушили на повітрі протягом ночі, зануряли в Ргораг (Апайїесі) і накривали покривними стеклами, використовуючи Рептоипі (Різпег) у якості середовища укладки. «

Для контрастного забарвлення бляшок Ар частину СГАР-позитивних зрізів клали на предметні стекла ЗиМйрептові і інкубували у водному розчині 195 ТВіойаміп З (Зідта) протягом 7 хвилин з наступною - с імуногістохімічною обробкою. Далі зрізи дегідратували і освітлювали в середовищи Ргораг і накривали ц покривними стеклами у середовищі Регтоишпі "» 8. Аналіз зображень

Для кількісної оцінки імунореактивних мікропрепаратів застосовувалася система аналізу зображень Мідеотейіс 150 ітаде Апаїузів Бувіет (Опсог, Іпс., Сайпегериго, МО), сполучена з мікроскопом Мікоп (оо) МісгорпоЇ-ЕХ через ССО відеокамеру і монітор Зопу Тгіпігоп. Зображення зрізу зберігалось у відеобуфері, а -3з для селекції і обчислення загальної площі пікселів, зайнятої імуноміченими структурами визначався поріг по кольору і насиченості. Для кожного зрізу вручну наносили контур гіпокампу і обчислювали загальну площу ко пікселів, яку займав гіпокамп. Відсоток амілоїдного навантаження вимірювали як (частину гіпокампової площі, шу 20 що містила АВ- відкладення, імунореактивне до тАБ 306) х 100. Аналогічним чином відсоток нейритного навантаження виміряли як (частину гіпокампової площі, що містила дистрофічні нейрити, реактивні до сл моноклонального антитіла 8Е5) х 100. До мікроскопа Мікоп МісгорпоЇ-ЕХ через камеру Орігопісз була підключена система аналізу зображень С-Ітадіпд Зувіет (Сотріх, Іпс., Стапрегу Томупепір, РА), яка застосовувала прикладну програму Зітріе 32 Боїймшаге і використовувалася для кількісної оцінки у відсотках частини ретроспленіальної кори головного мозку, зайнятої ЗЕРАР-позитивними астроцитами і МАС-1-апа МНС

П-позитивними мікрогліями. Зображення імунореактивного зрізу зберігалося у відеобуфері, а для селекції і о обчислення загальної площі пікселів, зайнятої імуноміченими клітинами, визначався монохроматичний поріг. Для ко кожного зрізу вручну окреслювали контур ретроспленіальної кори головного мозку (КС) і обчислювали загальну площу пікселів, зайняту КЗС. Відсоток астроцитозу визначали як (частину К5С, зайняту СРАР-реактивними бо астроцитами) х100. Аналогічним чином відсоток мікрогліозу визначали як (частину кори КС, зайняту МАС-1- або

МНО ПП-реактивними мікрогліями) х100. В усіх аналізах зображень для кожної тварини проводили кількісну оцінку 6 зрізів на рівні дорсального гіпокампу, кожний з яких був відділений послідовними інтервалами 24Омкм. В усіх випадках стан лікування тварини оператору був невідомий.

Поданий тут докладний опис даного винаходу має на меті лише максимально зрозуміле подання сутності 65 винаходу і жодною мірою не обмежує його можливих модифікацій, що охоплюються доданою тут Формулою винаходу. Всі цитовані тут публикації і патентні документи включені в опис шляхом посилання в усій їхній -Б4-

повноті і для всіх цілей у такому ж ступеню, як би кожний з них був відмічений індивідуально.

Із вищевикладеного очевидно, що даний винахід передбачає численні можливості його застосування.

Наприклад, винаходом передбачається застосування описаних тут антитіл до АВ у лікуванні, профілактиці або діагностиці амілоїдогенних захворювань, або у виготовленні медикаментів чи діагностичних композицій для використання в цій самій сфері. Подібним чином, винаходом передбачається застосування будь-якого з списаних вище епітопних фрагментів АВ для лікування або профілактики амілоїдогенних захворювань, або у виготовленні медикаментів для цього.

Claims (85)

Формула винаходу

1. Спосіб профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями А Б в мозку пацієнта, який включає у себе введення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, що містить 75 антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом на залишках 1-10А Р, причому антитілом є ізотип ЇДО1 людини.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хвороба характеризується когнітивним розладом.

3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хворобою є хвороба Альцгеймера.

4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хворобою є синдром Дауна.

5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хворобою є м'який когнітивний розлад.

6. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що пацієнтом є людина.

7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом на залишках 1-6 АБ.

8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом на с ов залишках 1-5 Ар. о

9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом на залишках 1-7 АБ.

10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом на ю зо залишках 3-7 Ав.

11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом на -- залишках 1-3 АБ. сі

12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом на - залишках 1-4 АБ. 35 , . ! о, ! . со

13. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що після введення антитіло зв'язується з амілоїдним відкладенням у пацієнта і викликає реакцію видалення цього амілоїдного відкладення.

14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що реакцією видалення є опосередкована Ес-рецепторами реакція фагоцитозу. « 20

15. Спосіб за п. 13 або 14, який відрізняється тим, що він включає у себе також моніторинг реакції видалення. з с

16. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом, який містить вільний М-кінцевий залишок А в. . ,»

17. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитіло зв'язується з епітопом на залишках 1-10АР, де залишком 1 і/або залишком 7 А Р є ізоаспартанова кислота. 45

18. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що пацієнтом є пацієнт, який не со виказує симптомів хвороби. -

19. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що вік пацієнта є менше 50 років.

20. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що пацієнт має успадкований фактор о ризику, який вказує на його схильність до хвороби Альцгеймера. - 70

21. Спосіб за будь-яким з пп. 1-20, який відрізняється тим, що пацієнт не має відомих факторів ризику хвороби Альцгеймера. сл

22. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитілом є антитіло людини.

23. Спосіб за будь-яким з пп. 1-21, який відрізняється тим, що антитілом є гуманізоване антитіло.

24. Спосіб за будь-яким з пп. 1-21, який відрізняється тим, що антитілом є химерне антитіло.

25. Спосіб за будь-яким з пп. 1-21, який відрізняється тим, що антитілом є антитіло миші. ГФ)

26. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитілом є поліклональне антитіло. юю

27. Спосіб за будь-яким з пп. 1-25, який відрізняється тим, що антитілом є моноклональне антитіло.

28. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що він включає у себе також введення о ефективної дози принаймні одного іншого антитіла, що зв'язується з іншим епітопом А р.

29. Спосіб за будь-яким з пп. 1-28, який відрізняється тим, що антитіло містить дві копії одної і тої самої пари легкого і важкого ланцюгів.

30. Спосіб за будь-яким з пп. 1-28, який відрізняється тим, що антитілом є біспецифічне антитіло, яке містить першу пару легкого і важкого ланцюгів, яка специфічно зв'язується з епітопом А Р, і другу пару легкого б5 і важкого ланцюгів, яка специфічно зв'язується з Ес-рецептором на мікрогліальних клітинах.

31. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що ланцюг антитіла злитий з гетерологічним поліпептидом.

32. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що доза антитіла складає принаймні 1 мг/кг маси тіла пацієнта.

33. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що доза антитіла складає принаймні 10 мг/кг маси тіла пацієнта.

34. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитіло вводять з носієм як фармацевтичну композицію.

35. Спосіб за пп. 1-22, 26, 27-34, який відрізняється тим, що антитілом є антитіло людини до Ар, приготоване із В-клітин людини, імунізованої пептидом АВ. 710

36. Спосіб за п. 35, який відрізняється тим, що людина, імунізована пептидом АР, є пацієнтом.

37. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитіло специфічно зв'язується з пептидом Ав, не зв'язуючись з амілоїдним прекурсорним білком повної довжини (АРР).

38. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитіло вводять 75 інтраперитонеально, перорально, інтраназально, підшкірно, внутрішньом'язово, місцевим шляхом або внутрішньовенно.

39. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитіло вводять шляхом уведення полінуклеотиду, що кодує принаймні один ланцюг антитіла, пацієнтові, де полінуклетид експресується для продукування ланцюга антитіла в пацієнті.

40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що полінуклеотид кодує важкий і легкий ланцюги антитіла, де полінуклеотид експресується для продукування важкого і легкого ланцюгів в пацієнті.

41. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що він включає у себе також моніторинг рівня введеного антитіла в крові пацієнта.

42. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антитіло вводять багатьма дозами Га протягом часу, який складає принаймні 6 місяців.

43. Спосіб за будь-яким з пп. 1-41, який відрізняється тим, що антитіло вводять як композицію з о підтримуваним звільненням.

44. Спосіб профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями А Р в мозку пацієнта, який відрізняється тим, що він включає у себе введення пацієнту ефективної дози поліпептиду, що юю містить М-кінцевий сегмент принаймні на залишках 1-5 АВ, де перший залишок А Б є М-кінцевим залишком - поліпептиду, а поліпептид не містить С-кінцевого сегментад р. сч

45. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що хвороба характеризується когнітивним розладом.

46. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що хворобою є хвороба Альцгеймера. --

47. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що хворобою є синдром Дауна. (ее)

48. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що хворобою є м'який когнітивний розлад.

49. Спосіб профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями Ар в мозку пацієнта, який відрізняється тим, що він включає у себе введення пацієнту ефективної дози поліпептиду, що « містить М-кінцевий сегмент Ав, де сегмент починається на залишках 1-3 А Р і закінчується на залишках 7-11 Ав. т0

50. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що хвороба характеризується когнітивним розладом. 8 с

51. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що хворобою є хвороба Альцгеймера. з»

52. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що хворобою є синдром Дауна.

53. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що хворобою є м'який когнітивний розлад.

54. Спосіб за будь-яким з пп. 44-53, який відрізняється тим, що М-кінцевий сегмент А Р зв'язаний на його Го! 7 С-кінці з гетерологічним поліпептидом.

55. Спосіб за п. 54, який відрізняється тим, що М-кінцевий сегмент складається із амінокислотної - послідовності ОСАЕРКНО (ЗЕО). І. Мо 77). ко

56. Спосіб за п. 55, який відрізняється тим, що поліпептид містить амінокислотну послідовність ОАЕРКНОРОХІКАМЗКРІСІТЕЇ. (ЗЕО. І. Мо 52). -

57. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що М-кінцевий сегмент А Р зв'язаний на його М-кінці з сл гетерологічним поліпептидом.

58. Спосіб за п. 57, який відрізняється тим, що поліпептид містить амінокислотну послідовність АКХМААМУТІ КАААВАЕРНКНО (ЗЕО. ІЮ. Мо 56).

59. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що М-кінцевий сегмент А Б зв'язаний на його М- і С-кінцях з ГФ) першим і другим гетерологічними пептидами. 7

60. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що М-кінцевий сегмент Ар зв'язаний на його М-кінці з гетерологічним поліпептидом і зв'язаний на його С-кінці принаймні з однією додатковою копією М-кінцевого сегмента. бо

61. Спосіб за будь-яким з пп. 54-58 і 60, який відрізняється тим, що гетерологічний поліпептид викликає Т-клітинну реакцію проти гетерологічного поліпептиду і тим самим В-клітинну реакцію проти М-кінцевого сегмента.

62. Спосіб за будь-яким з пп. 44-58 і 61, який відрізняється тим, що поліпептид також містить принаймні одну додаткову копію М-кінцевого сегмента. 65 63. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що поліпептид містить від М-кінця до С-кінця М-кінцевий сегмент А -58в-

В, множину додаткових копій М-кінцевого сегмента і гетерологічний амінокислотний сегмент.

64. Спосіб за будь-яким з пп. 44-63, який відрізняється тим, що М-кінцевий сегмент складається із А БВ 1-7.

65. Спосіб за будь-яким з пп. 44-54, 57 і 59, який відрізняється тим, що М-кінцевий сегмент складається із А 2 3-7.

66. Спосіб за будь-яким з пп. 44-53, який відрізняється тим, що поліпептид складається із А В 1-7.

67. Спосіб за будь-яким з пп. 44-53, який відрізняється тим, що поліпептид складається із А БВ 3-7. 70

68. Спосіб за будь-яким з пп. 44-63, який відрізняється тим, що поліпептид не містить принаймні 5 С-кінцевих амінокислот в А Р43.

69. Спосіб за будь-яким з пп. 44-67, який відрізняється тим, що поліпептид уводять з ад'ювантом, який підсилює імунну реакцію на М-кінцевий сегмент.

70. Спосіб за п. 69, який відрізняється тим, що ад'ювант і поліпептид уводять разом як композицію.

71. Спосіб за п. 69, який відрізняється тим, що ад'ювант уводять перед поліпептидом.

72. Спосіб за п. 69, який відрізняється тим, що ад'ювант уводять після поліпептиду.

73. Спосіб за будь-яким з пп. 69-72, який відрізняється тим, що ад'ювантом є сіль алюмінію.

74. Спосіб за будь-яким з пп. 69-72, який відрізняється тим, що ад'ювантом є МРІ.

75. Спосіб за будь-яким з пп. 69-72, який відрізняється тим, що ад'ювантом є 05-21.

76. Спосіб за будь-яким з пп. 69-72, який відрізняється тим, що ад'ювантом є неповний ад'ювант Фрейнда.

77. Спосіб за будь-яким з пп. 44-76, який відрізняється тим, що доза поліпептиду є більшою, ніж 10 мкг.

78. Спосіб профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями А Р в мозку пацієнта, який включає у себе введення пацієнту ефективної дози агента, який викликає імуногенну реакцію на сч М-кінцевий сегмент АВ, де сегмент починається на залишках 1-3 А Б і закінчується на залишках 7-11 АБ, не викликаючи імунну реакцію проти епітопу на залишках 12-43 А р43. о

79. Спосіб за п. 78, який відрізняється тим, що хвороба характеризується когнітивним розладом.

80. Спосіб за п. 78, який відрізняється тим, що хворобою є хвороба Альцгеймера.

81. Спосіб за п. 78, який відрізняється тим, що хворобою є синдром Дауна. юю

82. Спосіб за п. 78, який відрізняється тим, що хворобою є м'який когнітивний розлад. «-

83. Фармацевтична композиція, яка містить поліпептид згідно з визначенням за будь-яким з пп. 44-67 і ад'ювант. с

84. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло згідно з визначенням за будь-яким з пп. 1-17, 22-27, «- 29-31, 35 і 36 і фармацевтично прийнятний носій.

85. Спосіб скринінгу антитіла за активністю в лікуванні хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями А В со в мозку пацієнта, який відрізняється тим, що включає у себе приведення в контакт антитіла з поліпептидом, що містить принаймні п'ять суміжних амінокислот М-кінцевого сегмента АР, який починається на залишку між 1 і З АР, де поліпептид не має С-кінцевого сегменталАРр, і « визначення того, чи зв'язується антитіло специфічно з поліпептидом, де специфічне зв'язування служить - с ознакою того, що дане антитіло є активним у лікуванні хвороби Альцгеймера. . а (ее) - ко - 70 сл ко бо б5