Opis wynalazku Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej i zastosowania immunogennego srodka sku- tecznego w wywo lywaniu odpowiedzi immunologicznej obejmuj acej przeciwcia la przeciw A ß do wy- twarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby charakteryzuj acej si e z logami amyloidowymi. Choroba Alzheimera (AD) jest post epuj ac a chorob a wywo luj ac a ot epienie starcze. Patrz ogólnie Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy i inni, WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff i inni, Nature 373, 476-477 (1995); Games i inni, Nature 373, 523 (1995). Ogólnie chorob e mo zna podzieli c na dwie kategorie: o pó znym pocz atku, która pojawia si e w pode- sz lym wieku (od 65 roku zycia) oraz o wczesnym pocz atku, która rozwija si e przed okresem staro sci, to jest pomi edzy 35 a 60 rokiem zycia. W obu typach choroby patologia jest taka sama, ale nieprawi- d lowo sci wydaj a si e by c znacznie powa zniejsze i bardziej rozleg le w przypadkach, gdy choroba roz- poczyna si e w m lodszym wieku. Chorob e charakteryzuj a dwa typy uszkodze n w mózgu, p lytki starcze oraz k lebki neurofibrylarne. P lytki starcze stanowi a obszary zdezorganizowanego neuropilu o szero- ko sci do 150 µm z zewn atrzkomórkowymi z logami amyloidowymi wyst epuj acymi w centrum widocz- nym przy analizie mikroskopowej przekrojów tkanki mózgowej. K lebki neurofibrylarne stanowi a we- wn atrzkomórkowe z logi bia lka tau sk ladaj ace si e z dwóch filamentów owini etych parami wokó l siebie. Glównym sk ladnikiem p lytek jest peptyd nazywany A ß lub peptydem ß-amyloidowym. Peptyd A ß jest wewn etrznym fragmentem 39-43 aminokwasów bia lka prekursorowego nazywanego bia lkiem prekursorowym amyloidu (APP). Kilka mutacji bia lka APP powi azano z wyst epowaniem choroby Alzheimera. Patrz np. Goate i inni, Nature 349, 704 (1991) (walina 717 do izoleucyny); Chartier Harlan i inni, Nature 353, 844 (1991) (walina 717 do glicyny); Murrell i inni, Science 254, 97 (1991) (walina 717 do fenyloalaniny); Mullan i inni, Nature Genet. 1, 345 (1992) (podwójna mutacja zmieniaj aca lizyn e 595 - -metionin e 596 w asparagin e 595 -leucyn e 596 ). Uwa za si e, ze mutacje te wywo luj a chorob e Alzheimera w wyniku zwi ekszonego lub zmienionego przetwarzania APP w A ß, w szczególno sci przetwarzania APP w zwi ekszone ilo sci d lugich form A ß (czyli A ß1-42 i A ß-1-43). Uwa za si e, ze mutacje w innych genach, takich jak geny preseniliny, PS1 i PS2, po srednio wp lywaj a na przetwarzanie APP powoduj ac powstanie zwi ekszonych ilo sci d lugich form A ß (patrz Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Obserwacje te wskazuj a, ze A ß, a zw laszcza jego d luga forma, jest elementem przyczynowym w chorobie Alzhe- imera. McMichael, EP 526511, zaproponowa l podawanie homeopatycznych dawek (mniejszych ni z lub równych 10 -2 mg/dzie n) A ß pacjentom z wcze sniej rozwini et a AD. Oczekuje si e, ze u typowego cz lo- wieka z oko lo 5 litrami osocza nawet wy zsza granica tej dawki wytworzy st ezenie nie wi eksze ni z 2 pg/ml. Normalne st ezenie A ß w osoczu cz lowieka wynosi 50 - 200 pg/ml (Seubert i inni, Nature 359, 325-327 (1992). Ze wzgl edu na to, ze dawka proponowana w EP 526511 w niewielkim stopniu zmie- nia poziom endogennego A ß w kr azeniu oraz ze EP 526511 nie zaleca stosowania adiuwanta, wydaje sie niemo zliwym, ze wyst api jakikolwiek skutek leczniczy. W przeciwie nstwie do powy zszego wynalazek dotyczy leczenia lub profilaktyki choroby amylo- idogennej przez podawanie A ß lub innego immunogenu pacjentowi w warunkach wywo luj acych ko- rzystn a odpowied z immunologiczn a u pacjenta. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzuj aca si e tym, ze zawiera immunogenny srodek skuteczny w wywo lywaniu odpowiedzi immunologicznej obejmuj acej przeciwcia- la przeciw A ß u pacjenta oraz farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant, przy czym ten srodek jest wybrany z grupy obejmuj acej (i) A ß, (ii) fragment z co najmniej pi eciu przylegaj acych aminokwasów A ß42 i (iii) kwas nukleinowy koduj acy (i) lub (ii); i adiuwant jest wybrany z grupy obejmuj acej a lun, wodorotlenek glinu, fosforan glinu, siarczan glinu, 3-de-O-acylowany monofosforylowany lipid A, M-CSF i GM-CSF, emulsje olej w wodzie, takie jak skwalenu lub oleju arachidowego, MF59, SAF, CpG, polimeryczne lub monomeryczne aminokwa- sy, takie jak poli(kwas glutaminowy) lub polilizyna, peptydy muramylowe (np. N-acetylomuramylo-L- -treonylo-D-izoglutamina (thr-MDP), N-acetylonormuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina (nor-MDP), N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfos- foryloksy)etyloamina (MTP-PE), N-acetyloglukozaminylo-N-acetylomuramylo-L-A1-D-izoglu-L-Ala-di- palmitoksypropyloamid (DTP-DPP)) oraz inne sk ladniki scian komórek bakteryjnych, takie jak dimikoli- nian trehalozy (TDM), szkielet sciany komórkowej (CWS), MPL+CWS, adiuwanty saponinowe (QS21),PL 203 431 B1 3 ISCOM (kompleksy immunostymuluj ace), cytokiny, takie jak interleukiny (IL-1, IL-2 i IL-12), czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnik martwicy nowotworu (TNF); oraz A ß42 ma naturaln a ludzk a sekwencj e: H 2 N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln- Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val- Val-Ile-Ala-OH. Korzystnie srodek jest kapsu lkowany w cz astce. Korzystniej cz astk e stanowi cz astka kopolime- ru polilaktyd-poliglikolid (PLPG). W korzystnej postaci A ß stanowi A ß43, A ß42, A ß41, A ß40 lub A ß39. Fragment A ß pochodzi korzystnie z N-ko ncowej polowy A ß. Fragment A ß korzystnie zawiera A ß1-5, a korzystniej stanowi A ß1-5. Tak ze korzystniej fragment A ß stanowi A ß1-6, lub A ß1-12. Korzystnie fragment A ß jest wybrany z grupy obejmuj acej A ß1-5, A ß1-6, A ß1-12, A ß13-28, A ß17-28, A ß25-35, A ß33-42, A ß35-40 i A ß35-42. W korzystnej postaci kompozycja zawiera co najmniej 10 µg lub co najmniej 20 µg A ß, lub co najmniej 50 µg A ß, lub co najmniej 100 µg A ß lub jego fragmentu. Przedmiotem wynalazku jest tak ze zastosowanie immunogennego srodka skutecznego w wy- wo lywaniu odpowiedzi immunologicznej obejmuj acej przeciwcia la przeciw A ß do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby charakteryzuj acej si e z logami amyloidowymi u pacjenta, w którym srodek zawiera (i) A ß, (ii) fragment z co najmniej pi eciu przylegaj acych aminokwasów A ß42; lub (iii) kwas nukleinowy koduj acy (i) lub (ii); oraz A ß42 ma naturaln a ludzk a sekwencj e: H 2 N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val- His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly- Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH. W korzystnym zastosowaniu lek ponadto zawiera farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant wy- brany z grupy obejmuj acej a lun, wodorotlenek glinu, fosforan glinu, siarczan glinu, 3-de-O-acylowany monofosforylowany lipid A, M-CSF i GM-CSF, emulsje olej w wodzie, takie jak skwalenu lub oleju arachidowego, MF59, SAF, CpG, polimeryczne lub monomeryczne aminokwasy, takie jak poli(kwas glutaminowy) lub polilizyna, peptydy muramylowe (np. N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutamina (thr-MDP), N-acetylonormuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina (nor-MDP), N-acetylomuramylo-L-alanylo- -D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'di-palmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)etyloamina (MTP-PE), N-acetyloglukozaminylo-N-acetylomuramylo-L-A1-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksypropyloamid (DTP-DPP)), lub inne sk ladniki scian komórek bakteryjnych, takie jak dimikolinian trehalozy (TDM), szkielet sciany komórkowej (CWS), MPL+CWS, adiuwanty saponinowe (QS21), ISCOM (kompleksy immunostymulu- jace), cytokiny, takie jak interleukiny (IL-1, IL-2 i IL-12), czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii makro- fagów (M-CSF), czynnik martwicy nowotworu (TNF). W korzystnym zastosowaniu srodek jest kapsu lkowany w cz astce, któr a korzystniej stanowi cz astka kopolimeru polilaktyd-poliglikolid (PLPG). W korzystnym zastosowaniu A ß stanowi A ß43, A ß42, A ß41, A ß40 lub A ß39. Korzystnie fragment A ß pochodzi z N-ko ncowej po lowy A ß. W korzystnym zastosowaniu fragment A ß zawiera A ß1-5. Korzystniej fragment A ß stanowi A ß1-5, lub A ß1-6, lub A ß1-12. W korzystnym zastosowaniu fragment A ß jest wybrany z grupy obejmuj acej A ß1-5, A ß1-6, A ß1-12, A ß13-28, Aß17-28, A ß25-35, A ß33-42, A ß35-40 i A ß35-42. W korzystnym zastosowaniu ilo sc A ß lub jego fragmentu wynosi co najmniej 10 µg, lub co naj- mniej 20 µg, lub co najmniej 50 µg, lub co najmniej 100 µg. Korzystnie pacjentem jest cz lowiek. W korzystnym zastosowaniu chorob e stanowi choroba Alzheimera. W innym korzystnym zasto- sowaniu u pacjenta nie wyst epuj a objawy. W korzystnym zastosowaniu pacjent ma mniej ni z 50 lat. W innym korzystnym zastosowaniu pacjent ma odziedziczone czynniki ryzyka wskazujace podatno sc na chorob e Alzheimera, a w kolej- nym innym korzystnym zastosowaniu pacjent nie ma znanych czynników ryzyka choroby Alzheimera. W korzystniejszym zastosowaniu A ß wyst epuje w postaci zagregowanej. Korzystnie lek podaje si e doustnie, podskórnie, domi esniowo, miejscowo lub do zylnie. Korzyst- niej lek podaje si e domi esniowo lub podskórnie.PL 203 431 B1 4 W korzystniejszym zastosowaniu srodek stanowi skuteczna dawka kwasu nukleinowego kodu- jacego A ß lub fragment z co najmniej pi eciu przylegaj acych aminokwasów A ß42, gdzie kwas nukle- inowy jest eksprymowany w organizmie pacjenta z wytworzeniem A ß lub fragmentu z co najmniej pi eciu przylegaj acych aminokwasów A ß42 wywo luj acego odpowied z immunologiczna. Korzystniej lek podaje si e miejscowo. Korzystniej lek stosuje si e miejscowo w postaci plastra. W korzystniejszym zastosowaniu pacjent jest monitorowany pod wzgl edem odpowiedzi immu- nologicznej. Sposoby profilaktyki lub leczenia chorób charakteryzuj acych si e odk ladaniem amyloidu u pa- cjenta powoduj a wywo lanie odpowiedzi immunologicznej przeciw peptydowemu sk ladnikowi z logów amyloidowych u pacjenta. Takie wywo lanie odpowiedzi mo ze zaj sc czynnie przez podanie immuno- genu, albo biernie przez podanie przeciwcia la lub aktywnego fragmentu lub pochodnej przeciwcia la. U niektórych pacjentów z logiem amyloidowym jest skupisko peptydu A ß i choroba jest chorob a Alzhe- imera. W niektórych sposobach u pacjenta brak objawów. W niektórych sposobach pacjent ma ponad 50 lat. W niektórych sposobach pacjent odziedziczy l czynniki ryzyka wskazuj ace na podatno sc na chorob e Alzheimera. Te czynniki ryzyka obejmuj a zmienne allele genów preseniliny PS1 i PS2 oraz zmienne formy APP. W innych sposobach nie ma znanych czynników ryzyka wyst apienia choroby Alzheimera. W leczeniu pacjentów cierpi acych na chorob e Alzheimera jeden ze sposobów leczenia obejmu- je podawanie pacjentowi dawki peptydu A ß, aby wywo lac odpowied z immunologiczn a. Niekiedy pep- tyd A ß podaje si e z adiuwantem wzmacniaj acym odpowied z immunologiczn a na peptyd A ß. Mo ze nim by c a lun lub MPL. Dawka peptydu A ß podawanego pacjentowi zazwyczaj wynosi co najmniej 1 lub 10 µg przy podawaniu z adjuwantem, a co najmniej 50 µg przy podawaniu bez adiuwanta. Mo ze rów- nie z wynosi c co najmniej 100 µg. Peptydem A ß mo ze te z by c A ß1-42. Niekiedy peptyd A ß jest podawany w postaci zagregowanej lub w postaci zdysocjowanej. Srodkiem leczniczym mo ze te z by c skuteczna dawka kwasu nukleino- wego koduj acego A ß lub jego aktywny fragment lub jego pochodn a. Kwas nukleinowy koduj acy A ß lub jego fragment jest eksprymowany u pacjenta z wytworzeniem A ß lub jego aktywnego fragmentu wy- wo luj acego odpowied z immunologiczn a. Niekiedy kwas nukleinowy podaje si e przez skór e, ewentual- nie w postaci plastra. Srodek leczniczy mo zna znajdowa c przeszukuj ac bibliotek e zwiazków w celu zidentyfikowania zwi azku oddzia lywuj acego z przeciwcia lami wzgl edem A ß oraz podawa c zwi azek pacjentowi w celu wywo lania odpowiedzi immunologicznej. Odpowied z immunologiczna mo ze by c skierowana przeciw peptydowi A ß w postaci zagregowa- nej, a nie przeciw peptydowi A ß w postaci zdysocjowanej. Przyk ladowo na odpowied z immunolo- giczn a mog a sk lada c si e przeciwcia la wiaz ace zagregowan a posta c peptydu A ß, niewiaz ace zdyso- cjowanego peptydu A ß. Odpowied z immunologiczna mo ze obejmowa c komórki T wiaz ace A ß skom- pleksowany z MCHI lub MCHII na komórkach CD8 lub CD4, lub jest indukowana przez podanie pa- cjentowi przeciwcia la przeciw A ß. Odpowied z immunologiczna mo ze te z by c indukowana przez po- branie komórek T od pacjenta, poddanie komórek T dzia laniu peptydu A ß w warunkach, w których komórki T s a aktywowane, a nast epnie ponowne umieszczenie komórek T w organizmie pacjenta. Srodek leczniczy zazwyczaj podaje si e doustnie, donosowo, sródskórnie, podskórnie, domi e- sniowo, miejscowo lub do zylnie. Pacjenta po podaniu leku mo zna monitorowa c w celu okre slenia od- powiedzi immunologicznej. Je zeli podczas monitorowania wyst api obni zenie odpowiedzi immunolo- gicznej w czasie, pacjentowi mo zna poda c jedn a lub wi eksz a liczb e kolejnych dawek leku. Srodki farmaceutyczne mog a zawiera c A ß oraz zaróbk e odpowiedni a do podawania doustnego i innymi drogami, lub te z srodek skuteczny w wywo lywaniu u pacjenta odpowiedzi immunologicznej przeciw A ß oraz dopuszczalny farmaceutycznie adiuwant. Srodkiem mo ze by c niekiedy A ß lub jego aktywny fragment. Adiuwant mo ze stanowi c a lun, a niekiedy jest to emulsja typu olej w wodzie. A ß lub jego aktywny fragment mo ze tak ze by c sk ladnikiem kopolimeru polilaktyd-poliglikolid (PLPG) lub innej cz astki. Mo zliwe jest laczenie A ß lub jego aktywnego fragmentu z cz asteczk a koniugatow a sprzyjaj ac a dostarczaniu A ß do krwioobiegu pacjenta i/lub sprzyjaj ac a odpowiedzi immunologicznej przeciw A ß. Koniugat mo ze na przyk lad sprzyja c wywo laniu odpowiedzi immunologicznej przeciw A ß i mo ze nim by c toksyna cholery, immunoglobulina, atenuowana toksyna b lonicy CRM 197 (Gupta, Vaccine 15, 1341-3 (1997)). Srodek farmaceutyczny mo ze zawiera c srodek skutecznie wywo luj acy u pacjenta odpowied z immunologiczn a przeciw A ß, z tym, ze srodek nie powinien zawiera c kompletnego adiuwantu Freunda. Srodek mo ze tak ze zawiera c wektor wirusowy koduj acy A ß lub jego aktywny fragment skuteczniePL 203 431 B1 5 wywo luj acy odpowied z immunologiczn a przeciw A ß. Odpowiednimi wektorami wirusowymi mog a by c: wirus opryszczki, adenowirus, wirus adenosatelitarny, retrowirus, wirus Sindibs, wirus gor aczki Semliki Forest, wirus ospy krowiej lub ospy ptasiej. W sposobach zapobiegania chorobie Alzheimera oraz jej leczenia pacjentowi podaje si e sku- teczn a dawk e peptydu A ß. Mo zna stosowa c A ß lub przeciwcia la skierowane przeciw niemu do wytwa- rzania leku przeciwdzia laj acego chorobie Alzheimera lub lecz acego j a. Mo zna równie z ocenia c skuteczno sc sposobu leczenia choroby Alzheimera u pacjenta. Ozna- cza si e w próbkach tkanek pacjenta podstawow a ilosc przeciwcia l specyficznych przeciw A ß przed podaniem srodka. Ilosc przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß w próbkach tkanek pacjenta po leczeniu srodkiem mo zna porówna c z podstawow a ilo sci a przeciwcia l specyficznych przeciw pep- tydowi A ß. Ilosc przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß zmierzona po leczeniu, znacz aco wi eksza od ilo sci podstawowej przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß, wskazuje na pozy- tywny wynik leczenia. W ocenie skuteczno sci sposobów leczenia choroby Alzheimera u pacjenta mo zna oznacza c w próbkach tkanek pacjenta podstawow a ilosc przeciwcia l specyficznych przeciw A ß przed podaniem srodka. Ilosc przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß w próbkach tkanek pacjenta po leczeniu srodkiem mo zna porówna c z podstawow a ilo scia przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß. Obni zenie ilo sci lub brak znacz acej ró znicy pomi edzy ilo scia przeciwcia l specyficznych przeciw pepty- dowi A ß zmierzon a po leczeniu a ilo scia podstawow a przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß wskazuje na negatywny wynik leczenia. W ocenie innym sposobem skuteczno sci leczenia choroby Alzheimera u pacjenta mo zna ozna- cza c w próbkach tkanek kontrolnej populacji kontroln a ilo sc przeciwcia l specyficznych przeciw A ß. Ilosc przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß w próbkach tkanek pacjenta po leczeniu srod- kiem mo zna porówna c z kontroln a ilo scia przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß. Ilosc prze- ciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß zmierzona po leczeniu, znacz aco wi eksza od ilo sci kon- trolnej przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß, wskazuje na pozytywny wynik leczenia. W ocenie innym sposobem skuteczno sci leczenia choroby Alzheimera u pacjenta mo zna ozna- cza c w próbkach tkanek kontrolnej populacji kontroln a ilo sc przeciwcia l specyficznych przeciw A ß. Ilosc przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß w próbkach tkanek pacjenta po podaniu srodka mo zna porówna c z kontroln a ilo sci a przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß. Brak znacz acej ró znicy pomi edzy ilo sci a przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß zmierzon a po rozpocz eciu leczenia a ilo sci a kontroln a przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß wskazuje na negatywny wynik leczenia. Inne sposoby monitorowania u pacjenta choroby Alzheimera lub podatno sci na t e chorob e mo- g a obejmowa c wykrywanie odpowiedzi immunologicznej przeciw peptydowi A ß w próbce pobranej od pacjenta. Niekiedy pacjentowi podaje si e srodek skuteczny w leczeniu choroby Alzheimera lub jej zapobieganiu, a poziom odpowiedzi okre sla przysz ly tryb leczenia pacjenta. W ocenie innym sposobem skuteczno sci leczenia choroby Alzheimera u pacjenta mo zna ozna- cza c ilo sc przeciwcia l specyficznych przeciw peptydowi A ß w próbce tkanki pacjenta leczonego srod- kiem. Ilo sc t e mo zna porówna c z kontroln a ilo sci a oznaczon a w populacji pacjentów, u których wyst e- puje poprawa lub zanik objawów choroby Alzheimera pod wp lywem leczenia srodkiem. Wartosc u pacjenta równa co najmniej warto sci kontrolnej wskazuje na pozytywn a odpowied z na leczenie. Zestawy do takich ocen zazwyczaj mog a zawiera c odczynnik specyficznie wi azacy si e z prze- ciwcia lami przeciw A ß lub stymuluj acy proliferacj e komórek T reaktywnych wobec A ß. Wynalazek stanie si e bardziej zrozumia ly dzi eki zalaczonym rysunkom, przy czym Fig. 1: Miano przeciwcia l po iniekcji transgenicznym myszom A ß1-42. Fig. 2: Obci azenie hipokampu amyloidem. Na podstawie wspomaganej komputerowo ilo sciowej analizy obrazu immunoreaktywnych obszarów mózgu oznaczono procent powierzchni regionu hipo- kampu zajmowanego przez p lytki amyloidowe, okre slony na podstawie reaktywno sci z mA ß 3D6 spe- cyficznymi dla A ß. Warto sci dla poszczególnych myszy podano dziel ac je na grupy badawcze. Linia pozioma dla ka zdej z grup wskazuje warto sc mediany rozk ladu. Fig. 3 Dystrofia neurytowa w hipokampie. Na podstawie wspomaganej komputerowo ilo sciowej analizy obrazu immunoreaktywnych obszarów mózgu oznaczono procent powierzchni regionu hipo- kampu zajmowany przez zwyrodnia le neuryty, okre slony przez ich oddzia lywanie z ludzkimi mA ß 8E5 specyficznymi dla APP. Warto sci dla poszczególnych myszy podano dla grupy traktowanej AN1792PL 203 431 B1 6 oraz grupy kontrolnej traktowanej PBS. Linia pozioma dla ka zdej z grup wskazuje warto sc mediany rozk ladu. Fig. 4 Astrocytoza w korze pozamodzelowatej. Na podstawie wspomaganej komputerowo ilo- sciowej analizy obrazu immunoreaktywnych obszarów mózgu oznaczono procent powierzchni regionu korowego zajmowany przez astrocyty pozytywne pod wzgl edem kwa snego w lóknistego bia lka glejo- wego (GFAP). Warto sci dla poszczególnych myszy podano dziel ac je na grupy badawcze, a warto sci mediany dla grup wskazano poziomymi liniami. Fig. 5 Srednie geometryczne mian przeciwcia l przeciw A ß1-42 po immunizacji w zakresie o smiu dawek AN1792 zawieraj acych 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100 lub 300 µg. Fig. 6 Kinetyka odpowiedzi na przeciwcia l po immunizacji AN1792. Miana wyra zono w postaci srednich geometrycznych warto sci dla 6 zwierz at w ka zdej z grup. Fig. 7 Ilo sciowa analiza obrazu obci azenia kory amyloidem u myszy poddanych dzia laniu PBS i AN1792. Fig. 8 Ilo sciowa analiza obrazu obci azenia p lytkami neurytycznymi u myszy poddanych dzia la- niu PBS i AN1792. Fig. 9 Ilo sciowa analiza obrazu procentu kory pozamodzelowatej obj etej astrocytoz a u myszy poddanych dzia laniu PBS i AN1792. Fig. 10 Test proliferacji limfocytów na komórkach sledziony u myszy poddanych dzia laniu AN1792 (górny wykres) i PBS (dolny wykres). Fig. 11 Ca lkowity poziom A ß w korze. Wykres rozrzutu poszczególnych profili A ß u myszy im- munizowanych A ß lub pochodnymi APP w po laczeniu z adiuwantem Freunda. Fig. 12 Obciazenie kory amyloidem okre slono na podstawie sterowanej komputerowo ilo sciowej analizy obrazu immunoreaktywnych obszarów mózgu myszy immunizowanych koniugatami peptydu A ß - A ß1-5, A ß1-12, A ß13-28, agregatami AN1792 o pe lnej d lugo sci A ß (A ß1-42) i AN1528 (A ß1-40) oraz poddanej dzia laniu PBS grupy kontrolnej. Fig. 13 Srednie geometryczne mian przeciwcia l specyficznych dla A ß dla grup myszy immuni- zowanych A ß lub pochodnymi APP, w po laczeniu z adiuwantem Freunda. Fig. 14 Srednie geometryczne mian przeciwcia l specyficznych dla A ß dla grup swinek morskich immunizowanych AN1792 lub jego palmitoliowan a pochodn a, w polaczeniu z ró znymi adiuwantami. Fig. 15 Poziomy A ß w korze 12-miesi ecznych myszy PDAPP poddanych dzia laniu AN1792 lub AN1528, z ró znymi adiuwantami. Okre slenie „zasadniczo identyczne" oznacza, ze dwie sekwencje bia lkowe, najlepiej przyrów- nywane z zastosowaniem takich programów jak GAP lub BESTFIT, z u zyciem domy slnych wa zno sci luk (gap weights), wykazuj a co najmniej 65 procent identyczno sci sekwencji, korzystnie co najmniej 80 lub 90 procent identyczno sci sekwencji, korzystniej co najmniej 95 procent identyczno sci sekwencji lub wi ecej (np. 99 procent identyczno sci sekwencji lub wi ecej). Korzystnie pozycje reszt, które nie sa takie same, ró zni a si e podstawieniem konserwatywnymi aminokwasami. Przy przyrównywaniu sekwencji zazwyczaj jedn a z sekwencji stosuje si e jako sekwencj e odnie- sienia, z któr a porównuje si e badane sekwencje. Z zastosowaniem algorytmu porównuj acego se- kwencje, sekwencj e badan a i odniesienia wprowadza si e do komputera, je zeli jest to konieczne okre- sla si e wspó lrz edne podsekwencji, a nast epnie ustala si e parametry algorytmu programowego. Nast epnie algorytm porównuj acy sekwencje oblicza procent identyczno sci sekwencji badanej (ych) do sekwencji odniesienia na podstawie ustalonych parametrów programu. Optymalne przyrównanie porównywanych sekwencji mo zna przeprowadzi c, np. z zastosowa- niem algorytmu homologii lokalnej Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algorytmu przyrównuj acego homologie Needelemana i Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), szukaj ac podo- bie nstw metod a Pearsona i Lipmana, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), za pomoc a skom- puteryzowanych wersji tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA oraz TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) albo na podstawie oceny wzrokowej (patrz g lównie Ausubel i inni, supra). Jednym z przyk ladów algorytmu odpowied- niego do okre slania procentu podobie nstwa i identyczno sci sekwencji jest algorytm BLAST opisany przez Altschul i inni, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Oprogramowanie do przeprowadzania algo- rytmu BLAST jest publicznie dost epne przez National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Zazwyczaj domy slne parametry programu mo zna stosowa c do wyko- nywania porównania sekwencji, ale mo zna tak ze u zy c dostosowanych parametrów. Dla sekwencji aminokwasowych program BLAST u zywa jako domy slnych d lugo sci s lowa (wordlength) (W) równej 3,PL 203 431 B1 7 oczekiwania (expectation) (E) równego 10 oraz macierzy punktuj acej (scoring matrix) BLOSUM62 (patrz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)). Celem klasyfikacji podstawie n aminokwasowych konserwatywnych i niekonserwatywnych ami- nokwasy grupuje si e w nast epuj acy sposób: Grupa I (hydrofobowe, la ncuchy boczne): norleucyna, met, ala, val, leu, ile; Grupa II (oboj etne, hydrofilowe lancuchy boczne): cys, ser, thr; Grupa III (kwa- sowe, lancuchy boczne): asp, glu; Grupa IV (zasadowe, la ncuchy boczne): asn, gln, his, lys, arg; Grupa V (aminokwasy wp lywaj ace na orientacj e la ncucha): gly, pro oraz Grupa VI (aromatyczne lan- cuchy boczne): trp, tyr, phe. Konserwatywne podstawienia obejmuj a podstawienia pomi edzy amino- kwasami tej samej klasy. Niekonserwatywne podstawienia obejmuj a zmiany aminokwasu jednej klasy na aminokwas drugiej klasy. Srodki lecznicze zawarte w kompozycjach wed lug wynalazku zazwyczaj s a zasadniczo czyste. Oznacza to, ze srodek jest zazwyczaj co najmniej w 50% (wagowo) czysty, a ponadto s a zasadniczo wolne od przeszkadzaj acych bia lek lub zanieczyszcze n. Czasem srodki s a co najmniej w 80% (wago- wo), korzystniej w co najmniej 80 lub oko lo 95% (wagowo) czyste. Jednak ze za pomoc a standardo- wych technik oczyszczania bia lek mo zna uzyska c preparaty bia lek homogenne co najmniej w 99%. Specyficzne wi azanie dwóch jednostek oznacza powinowactwo co najmniej 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 M -1 lub 10 10 M -1 . Korzystne s a warto sci powinowactwa wi eksze ni z 10 8 M -1 . Okre slenie „przeciwcia lo" stosowano tutaj w odniesieniu do nienaruszonych przeciwcia l jak i ich fragmentów wi az acych. Zazwyczaj fragmenty wspó lzawodnicz a w wi azaniu antygenu z nienaruszo- nymi przeciwcia lami, od których pochodz a. Ponadto przeciwciala lub ich fragmenty wi azace mog a by c chemicznie po laczone lub wyeksprymowane jako bialka fuzyjne z innymi bia lkami. APP 695 , APP 751 i APP 770 dotycz a odpowiednio polipeptydów o d lugo sci 695, 751 i 770 amino- kwasów kodowanych przez ludzki gen APP. Patrz Kang i inni, Nature 325, 773 (1987); Ponte i inni, Nature 331, 525 (1988), oraz Kitaguchi i inni, Nature 331, 530 (1988). Aminokwasy w obr ebie ludzkie- go bia lka prekursorowego amyloidu (APP) maj a przypisane numery zgodnie z sekwencj a izoformy APP770. Okre slenia takie jak A ß39, A ß40, A ß41, A ß42 i A ß43 oznaczaj a peptydy A ß zawieraj ace aminokwasy 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 i 1-43. Okre slenie „epitop" lub „determinanta antygenowa" oznacza miejsce na antygenie, na które od- powiadaj a komórki B i/lub T. Epitopy komórek B mog a by c utworzone z dwóch przylegaj acych lub nieprzylegaj acych aminokwasów zestawionych obok siebie przez trzeciorz edowe z lo zenie bia lka. Epitopy utworzone z przylegaj acych aminokwasów s a zazwyczaj zachowane przy dzia laniu rozpusz- czalników denaturuj acych, podczas gdy epitopy utworzone w wyniku trzeciorz edowego sk ladania zni- kaj a po dzia laniu rozpuszczalnikami denaturuj acymi. Epitop zazwyczaj obejmuje co najmniej 3, a cz esciej co najmniej 5 lub 8-10 aminokwasów w unikatowej konformacji przestrzennej. Sposoby okre slania przestrzennej konformacji epitopów obejmuj a np. krystalografi e rentgenowsk a i dwuwymia- rowy j adrowy rezonans magnetyczny. Patrz np. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tom 66, red. Glenn E. Morris (1996). Przeciwcia la rozpoznaj ace ten sam epitop mo zna ziden- tyfikowa c w prostym te scie immunologicznym pokazuj acym zdolno sc jednego przeciwcia la do bloko- wania wi azania innego przeciwcia la z docelowym antygenem. Komórki T rozpoznaj a ci ag le epitopy o d lugo sci oko lo 9 aminokwasów dla komórek CD8 lub oko lo 13-15 aminokwasów dla komórek CD4. Komórki T rozpoznaj ace epitop mo zna zidentyfikowa c w testach in vitro mierz acych zale zn a od anty- genu proliferacj e, oznaczan a przez inkorporacj e 3 H-tymidyny w uczulonych komórkach T, w odpowie- dzi na epitop (Burke i inni, J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), zale zne od antygenu u smiercanie (test limfocytów T cytotoksycznych, Tigges i inni, J. Immunol. 156, 3901-3910) lub wydzielanie cytokin. Okre slenie „immunologiczny" lub odpowied z „immunologiczna" oznacza rozwój korzystnej od- powiedzi humoralnej (po sredniczonej przez przeciwcia la) i/lub komórkowej (po sredniczonej przez specyficzne dla antygenu komórki T lub ich produkty wydzielnicze) skierowanej przeciw peptydowi amyloidowemu u pacjenta biorcy. Taka odpowied z mo ze by c czynn a odpowiedzi a wywo lan a przez podanie immunogenu, albo biern a odpowiedzi a wywo lan a przez podanie przeciwcia l lub uczulonych komórek T. Komórkowa odpowied z immunologiczna jest wywo lywana przez prezentacj e epitopów polipeptydowych w po laczeniu z cz asteczkami MHC Klasy I lub Klasy II w celu aktywowania specy- ficznych dla antygenu pomocniczych komórek T CD4 + i/lub cytotoksycznych komórek T CD8 + . Odpo- wied z mo ze tak ze obejmowa c aktywacje monocytów, makrofagów, komórek NK, bazofili, komórek dendrytycznych, astrocytów, komórek mikrogleju, eozynofili lub innych sk ladników odporno sci wro- dzonej. Wyst apienie po sredniczonej przez komórki odpowiedzi immunologicznej mo zna oke sli c w testach proliferacji (komórek T CD4 + ) lub testach CTL (limfocytów T cytotoksycznych) (patrz Burke,PL 203 431 B1 8 supra; Tiggers, supra). Wzgl edne udzia ly odpowiedzi humoralnej i komórkowej w ochronnym lub lecz- niczym dzia laniu immunogenu mo zna rozró zni c oddzielnie izoluj ac IgG i komórki T z immunizowanego syngeneicznego zwierz ecia i mierz ac ochronne lub lecznicze dzia lanie u drugiego zwierz ecia. „ Srodek immunogenny" lub „immunogen" jest zdolny po podaniu pacjentowi wywo la c odpo- wied z immunologiczn a przeciw sobie samemu, ewentualnie w polaczeniu z adiuwantem. Okre slenie „nagi polinukleotyd" oznacza polinukleotyd nie skompleksowany z materia lem kolo- idalnym. Nagie polinukleotydy czasem klonuje si e w wektory plazmidowe. Okre slenie „adiuwant" oznacza zwi azek, który podany razem z antygenem wzmaga odpowied z immunologiczn a na antygen, ale podany oddzielnie nie wywo luje odpowiedzi immunologicznej na antygen. Adiuwanty mog a wzmaga c odpowied z immunologiczn a na drodze kilku ró znych mechani- zmów, w lacznie z rekrutacj a limfocytów, stymulacj a komórek B i/lub T oraz stymulacj a makrofagów. Okre slenie „pacjent" oznacza cz lowieka lub innego ssaka poddawanego profilaktyce lub le- czeniu. Zdezintegrowany lub monomeryczny A ß oznacza rozpuszczalne, monomeryczne jednostki pep- tydowe A ß. Jednym ze sposobów preparowania monomerycznych A ß jest rozpuszczenie liofilizowa- nego peptydu w czystym DMSO z rozbijaniem ultrad zwi ekami. Powsta ly roztwór odwirowuje si e w celu usuni ecia cz astek nierozpuszczalnych. Zagregowany A ß jest mieszanin a oligomerów, w której mono- meryczne jednostki s a utrzymywane razem wi azaniami niekowalencyjnymi. Srodki lub sposoby „obejmuj ace" jeden lub wi eksz a liczb e wymienionych elementów mog a zawiera c inne elementy nie wymienione specyficznie. Przyk ladowo srodek zawieraj acy peptyd A ß obejmuje zarówno wyizolowany peptyd A ß, jak i peptyd A ß jako sk ladnik d lu zszej sekwencji poli- peptydowej. Wynalazek dotyczy srodków leczniczych oraz sposobów profilaktyki i leczenia chorób charakte- ryzuj acych si e nagromdzeniem z logów amyloidowych. Z logi amyloidowe zawieraj a peptydy zagrego- wane w nierozpuszczaln a mas e. Natura peptydów rózni si e w ró znych chorobach, ale w wi ekszo sci przypadków agregat ma struktur e ß-pofa ldowanej kartki i wybarwia si e barwnikiem Congo Red. Choroby charakteryzuj ace si e z logami amyloidowymi obejmuj a chorob e Alzheimera (AD), zarówno o wczesnym jak i pó znym pocz atku. W obu chorobach z logi amyloidowe zawieraj a peptyd nazywany A ß, który gromadzi si e w mózgu osób chorych. Przyk ladami innych chorób charakteryzuj acych si e z logami amyloidu s a amyloidoza SAA, dziedziczny zespó l islandzki, szpiczak mnogi oraz encefalopa- tie g abczaste, w lacznie z chorob a szalonych krów, chorob a Creutzfeldta Jakoba, encefalopati a owiec oraz encefalopati a g abczast a norek (patrz Weissmenn i inni, Curr. Opin. Neurobiol. 7, 695-700 (1997); Smits i inni, Veterinary Quarterly 19, 101-105 (1997)), Nathanson i inni, Am. J. Epidemiol. 145, 959- 969 (1997)). Peptydy tworz ace agregaty w tych chorobach, to odpowiednio dla pierwszych trzech surowiczy amyloid A, cystantyna C, lekki lancuch IgG ? oraz bia lka prionowe dla pozosta lych. Srodki lecznicze zawarte w kompozycjach farmaceutycznych wed lug wynalazku wywo luj a od- powied z immunologiczn a przeciw peptydowi A ß. Srodki te obejmuj a sam peptyd A ß oraz jego odmia- ny, analogi i mimetyki peptydu A ß indukuj ace przeciwcia la skierowanymi przeciw peptydowi Aß i/lub reaguj ace z nimi krzy zowo oraz przeciwcia la lub komórki T reagujace z peptydem A ß. Wywo lanie odpowiedzi immunologicznej mo ze by c czynne, np. w przypadku podania pacjentowi immunogenu w celu zaindukowania przeciwcia l lub komórek T reaguj acych z A ß, albo bierne, np. w przypadku podania pacjentowi przeciwcia l, które same wi az a A ß. A ß znany tak ze jako peptyd ß-amyloidowy lub peptyd A4 (patrz US 4666829; Glenner i Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984), jest peptydem o d lugo sci 39-43 aminokwasów, który jest g lówn a sk ladow a charakterystycznych p lytek w chorobie Alzheimera. A ß powstaje w wyniku przetwarzania wi ekszego bia lka APP przez dwa enzymy, nazywane sekretazami ß i ? (patrz. Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Znane mutacje w APP zwi azane z chorob a Alzheimera wyst epuj a proksymalnie do miejsc ß lub ? sekretaz lub w obr ebie A ß. Przyk ladowo pozycja 717 le zy proksymalnie do miejsca ciecia APP przez sekretaz e ? podczas obróbki do A ß, a pozycje 670/671 le za proksymalnie do miejsca ci ecia przez sekretaz e ß. Uwa za si e, ze mutacje powoduj a chorob e AD przez wp lywanie na reakcje ci ecia, w wyniku których powstaje A ß, tak ze zwi ekszaj a ilo sc wytwarzanej 42/43 aminokwasowej formy A ß. A ß ma t e niezwyk la zdolnosc, ze mo ze utrwala c i aktywowa c zarówno klasyczn a, jak i alterna- tywn a kaskad e dope lniacza. W szczególno sci wiaze si e on z Clq i ostatecznie z C3bi. To po laczenie u latwia wi azanie do makrofagów, prowadz ace do aktywacji komórek B. Ponadto C3bi dalej rozpada sie i wi aze z CR2 na komórkach B w sposób zale zny od komórek T, co prowadzi do 10000 krotnegoPL 203 431 B1 9 wzrostu aktywacji tych komórek. Mechanizm ten powoduje, ze A ß wytwarza wi eksz a ni z inne antygeny odpowied z immunologiczn a. Srodek leczniczy zawarty w kompozycji farmaceutycznej mo ze by c dowoln a naturalnie wyst epu- jac a postaci a peptydu A ß, a zw laszcza ludzk a postaci a (to jest A ß39, A ß40, A ß41, A ß42 lub A ß43). Sekwencje tych peptydów i ich pokrewie nstwo z prekursorowym APP przedstawiono na fig. 1 w Hardy i inni, TINS 20, 155-158 (1997). Przyk ladowo A ß42 ma sekwencj e: H 2 N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala- Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH A ß41, A ß40 i A ß39 ró zni a si e od A ß42 pomini eciem odpowiednio Ala, Ala-Ile i Ala-Ile-Val na C-ko ncu. A ß43 ró zni si e od A ß42 obecno scia reszty treoniny na C-ko ncu. Srodkiem leczniczym mo ze tak ze by c aktywny fragment lub analog naturalnego peptydu A ß, zawieraj acy epitop indukuj acy po- dobn a ochronn a lub lecznicz a odpowied z immunologiczn a po podaniu cz lowiekowi. Immunogenne fragmenty zazwyczaj maj a ci ag la sekwencj e co najmniej z 3, 5, 6, 10 lub 20 sasiednich aminokwasów naturalnego peptydu. Immunogenne fragmenty obejmuj a A ß1-5, 1-6, 1-12, 13-28, 17-28, 25-25, 35-40 i 35-42. Fragmenty z N-ko ncowej po lowy A ß s a korzystniejsze w niektórych sposobach. Analogi obej- muja odmiany alleliczne, gatunkowe i indukowane. Analogi zazwyczaj ró zni a si e od naturalnie wyst e- puj acych peptydów w jednym lub kilku miejscach, cz esto przez konserwatywne podstawienia. Analogi zazwyczaj wykazuj a co najmniej 80 lub 90% identyczno sci sekwencji z naturalnymi peptyda- mi. Niektóre analogi zawieraj a tak ze nienaturalne aminokwasy lub modyfikacje N- lub C-ko ncowych aminokwasów. Przyk ladami nienaturalnych aminokwasów s a a, a-dwupodstawione aminokwasy, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy, 4-hydroksyprolina, ?-karboksyglutaminian, e-N,N,N-trimetylo- lizyna, e-N-acetylolizyna, O-fosfoseryna, N-acetyloseryna, N-formylometionina, 3-metylohistydyna, 5-hydroksylizyna, ?-N-metyloarginina. Profilaktyczne lub lecznicze dzia lanie fragmentów i analogów mo zna selekcjonowa c z u zyciem zwierz ecych modeli transgenicznych, co opisano poni zej. A ß, jego fragmenty, analogi i inne peptydy amyloidogenne mo zna zsyntetyzowa c drog a syntezy peptydów w fazie sta lej lub przez ekspresj e rekombinacyjn a, albo mo zna je otrzyma c z naturalnych zróde l. Automatyczne syntetyzatory bia lek s a dost epne w handlu od wielu dostawców, takich jak Applied Biosystems, Foster City, California. Ekspresj e rekombinacyjn a mo zna przeprowadzi c w bakte- riach, takich jak E. coli, w dro zd zach, komórkach owadzich lub komórkach ssaczych. Procedury eks- presji rekombinacyjnej opisali Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2 wyd., 1989). Niektóre postacie peptydu A ß s a tak ze dost epne w handlu (np. American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA i California Peptide Research, Inc. Napa, CA). Srodki lecznicze obejmuj a tak ze d lu zsze polipeptydy obejmuj ace np. peptyd A ß, aktywny frag- ment lub analog razem z innymi aminokwasami. Przyk ladowo peptyd A ß mo ze by c obecny w nieak- tywnym bia lku APP lub jego segmencie, takim jak fragment C-100 zaczynaj acy si e na N-ko ncu A ß i biegn acy do ko nca APP. Takie polipeptydy mo zna przebada c pod wzgl edem ich dzia lania profilak- tycznego lub leczniczego na modelach zwierz ecych w sposób opisany poni zej. Peptyd A ß, analog, aktywny fragment lub inny polipeptyd mo zna poda c w zasocjowanej postaci (to jest jako peptyd amy- loidowy) lub w postaci zdysocjowanej. Srodki lecznicze obejmuj a tak ze multimery monomerycznych srodków immunogennych. W kolejnej odmianie peptyd immunogenny, taki jak A ß, mo ze by c stosowany jako szczepionka wirusowa lub bakteryjna. Kwas nukleinowy koduj acy peptyd immunogenny wprowadza si e do genomu lub episomu wirusa lub bakterii. Ewentualnie kwas nukleinowy wprowadza si e w taki sposób, ze pep- tyd immunogenny jest eksprymowany jako bia lko wydzielnicze lub bia lko fuzyjne z bia lkiem zewn etrz- nej powierzchni wirusa lub transb lonowym bia lkiem bakterii, tak ze peptyd jest eksponowany. Wirusy lub bakterie u zyte w takich metodach powinny by c niepatogenne lub atenuowane. Odpowiednie wiru- sy obejmuj a adenowirusy, HSV, osp e krowi a i osp e drobiu. Fuzja peptydu immunogennego z HBsAg z HBV jest szczególnie odpowiednia. Srodki lecznicze obejmuj a tak ze peptydy i inne zwi azki, które niekoniecznie wykazuj a znacz ace podobie nstwo sekwencji z A ß, ale tym niemniej dzia laj a jako mime- tyki A ß i wywo luj a podobn a odpowied z immunologiczn a. Mo zna np. przebada c pod wzgl edem przy- datno sci dowolne peptydy lub bia lka tworz ace ß-pofa ldowane kartki. Mo zna tak ze stosowa c przeciw- cia la przeciw-idiotypowe przeciw przeciwcia lom monoklonalnym przeciw A ß lub innym peptydom amy- loidogennym. Takie przeciwcia la przeciw-Id na sladuj a antygen i wytwarzaj a odpowied z immunolo- giczn a na niego (patrz Essential Immunology (red. Roit, Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, wyd. 6) str. 181).PL 203 431 B1 10 Mo zna tak ze zbada c pod wzgl edem przydatno sci losowe biblioteki peptydów lub innych zwi az- ków. Biblioteki kombinatoryjne mo zna wytworzy c dla wielu typów zwi azków, które mog a by c syntety- zowane krok-po-kroku. Zwi azki takie obejmuj a polipeptydy, mimetyki ß-skr etu, polisacharydy, fosfolipi- dy, hormony, prostaglandyny, steroidy, zwi azki aromatyczne, zwi azki heterocykliczne, benzodiazepi- ny, oligomeryczne N-podstawione glicyny i oligokarbaminiany. Du ze biblioteki kombinatoryjne zwi az- ków mo zna skonstruowa c metod a kodowanych syntetycznych bibliotek opisan a w Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/0851, Pharmacopeia, WO 95/35503 i Scripps, WO 95/30642 (z których ka zdy cytuje si e tutaj jako pozycj e literaturow a do wszystkich zastosowa n). Biblioteki peptydowe mozna tak ze skonstruowa c metodami ekspozycji fago- wej. Patrz np. Devlin, WO 91/18980. Pocz atkowo biblioteki kombinatoryjne i inne zwiazki bada si e pod wzgl edem przydatno sci okre- slaj ac ich zdolno sc do wi azania si e do przeciwcia l lub limfocytów (B lub T) znanych jako specyficzne dla A ß lub innych peptydów amyloidogennych. Na przyk lad pocz atkowe przeszukiwania mo zna prze- prowadzi c stosuj ac jakiekolwiek surowice poliklonalne lub przeciwcia la monoklonalne przeciw A ß lub innym peptydom amyloidogennym. Nast epnie zwi azki zidentyfikowane w tych badaniach dalej analizu- je si e pod wzgl edem ich zdolno sci do indukowania przeciwcia l lub reaktywnych limfocytów przeciw A ß lub innym peptydom amyloidogennym. Na przyk lad mo zna przebada c wielokrotne rozcie nczenia su- rowicy na p lytkach do mikromianowania wcze sniej powleczonych peptydem A ß i przeprowadzic stan- dardowy test ELISA w celu wykrycia reaktywnych przeciwcia l na A ß. Nast epnie zwi azki mo zna zbada c pod wzgl edem ich profilaktycznej lub leczniczej skuteczno sci na zwierz etach transgenicznych predys- ponowanych do choroby amyloidogennej, co opisano w przyk ladach. Zwierz eta takie obejmuj a, np. myszy nios ace mutacj e 717 APP opisane przez Games i innych, supra, oraz myszy nios ace mutacj e Swedish APP, takie jak opisane przez McConlogue i innych, US 5612486 i Hsiao i innych, Science 274, 99 (1996); Staufenbiela i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchlera- Pierrata i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Brochleta i innych, Neuron 19, 939-945 (1997). To samo podej scie badawcze mo zna zastosowa c w przypadku innych potencjalnych srodków, takich jak opisane powy zej fragmenty A ß, analogi A ß i d lu zsze peptydy zawieraj ace A ß. Srodki lecznicze zawarte w kompozycjach farmaceutycznych wed lug wynalazku zawieraja tak ze przeciwcia la specyficznie wiaz ace A ß. Takie przeciwcia la mog a by c przeciwcia lami monoklonalnymi lub poliklonalnymi. Niektóre z takich przeciwcia l specyficznie wi aza si e z zagregowana form a A ß, nie wiaz ac si e z form a zdysocjowan a. Niektóre wiaz a si e z form a zdysocjowan a, nie wiaz ac si e z form a zagregowan a. Niektóre wi aza si e zarówno z form a zagregowan a, jak i zdysocjowan a. Wytwarzanie przeciwcia l monoklonalnych nie-cz lowieczych, np. mysich lub szczurzych, mo zna osi agn ac np. przez immunizacj e zwierz ecia z u zyciem A ß. Patrz Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (przytoczony tutaj jako pozycja literaturowa do wszystkich zastosowa n). Taki immunogen mo zna otrzyma c ze zród la naturalnego przez syntez e peptydów lub ekspresj e rekombinacyjn a. Humanizowane postacie mysich przeciwcia l mo zna tworzy c z zastosowaniem technik rekombi- nacji DNA lacz ac regiony CDR nie-cz lowieczych przeciwcia l ze sta lymi regionami ludzkimi. Patrz Queen i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989) i WO 90/07861 (przytoczone tutaj jako pozycje literaturowe do wszystkich zastosowa n). Ludzkie przeciwcia la mo zna uzyska c metodami ekspozycji fagowej. Patrz np. Dower i inni, WO 91/17271; McCafferty i inni, WO 92/01047. W tych metodach wytwarza si e biblioteki fagowe, których cz lonkowie eksponuj a ró zne przeciwcia la na swoich powierzchniach zewn etrznych. Przeciwcia la za- zwyczaj s a eksponowane jako fragmenty Fv lub Fab. Fagi eksponujace przeciwcia la o wymaganej specyficzno sci wybiera si e przez wzbogacenie powinowactwa do A ß lub jego fragmentów. Mo zna tak ze wytworzy c ludzkie przeciwcia la przeciw A ß z nieb ed acych lud zmi ssaków transgenicznych nio- s acych transgeny koduj ace co najmniej segment ludzkiego locus immunoglobulinowego oraz inak- tywowane endogenne locus immunoglobulinowe. Patrz Lonberg i inni, WO93/12227 (1993); Kucherla- pati, WO 91/10741 (1991) (z których ka zde jest przytoczone tutaj jako pozycja literaturowa do wszyst- kich zastosowa n). Ludzkie przeciwcia la mo zna wybra c w do swiadczeniach wi azania kompetycyjnego lub inaczej, jako maj ace t e sam a specyficzno sc epitopow a jak konkretne przeciwcia lo mysie. Takie przeciwcia la szczególnie prawdopodobnie wykazuj a korzystne funkcjonalne w lasciwo sci przeciwcia l mysich. Ludzkie przeciwcia la poliklonalne tak ze mo zna otrzyma c w postaci surowicy od pacjentów immunizowanych srodkiem immunogennym. Ponadto takie przeciwcia la poliklonalne mo zna zagesci c drog a oczyszczania na zasadzie powinowactwa stosuj ac A ß lub inny peptyd amyloidowy jako odczyn- nik z powinowactwem.PL 203 431 B1 11 Ludzkie lub humanizowane przeciwcia la mo zna tak zaprojektowa c, zeby mia ly region sta ly IgG, IgD, IgA lub IgE oraz jakikolwiek izotyp, w lacznie z IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Przeciwcia la mo zna eks- prymowa c jako tetramery zawieraj ace dwa lancuchy lekkie i dwa ci ezkie, jako oddzielne la ncuchy ciezkie, lancuchy lekkie, jako Fab, Fab', F(ab') 2 i Fv lub jako pojedyncze lancuchy przeciwcia l, w któ- rych domeny zmienne lancuchów lekkich i ci ezkich s a po laczone razem przez odst epnik. Srodki lecznicze zawarte w kompozycjach farmaceutycznych wed lug wynalazku obejmuj a tak ze komórki T wi azace peptyd A ß. Przyk ladowo komórki T mog a by c aktywowane przeciw peptydowi A ß przez wyeksprymowanie ludzkiego genu MHC klasy I i ludzkiego genu ß-2-mikroglobuliny z owadziej linii komórkowej, gdzie pusty kompleks jest tworzony na powierzchni komórek i mo ze zwi aza c peptyd A ß. Komórki T, które wystawiono na dzia lanie linii komórkowej, staj a si e specyficznie zaktywowane prze- ciw peptydowi. Patrz Peterson i inni, US 5314813. Linie komórek owadzich eksprymuj ace antygen MHC klasy II mo zna w podobny sposób stosowa c do aktywacji komórek T CD4. Wytwarzanie leczniczych srodków do leczenia innych chorób amyloidogennych okre slaj a te same lub analogiczne zasady. Ogólnie srodki wymienione powy zej do zastosowa n w leczeniu choroby Alzheimera mo zna tak ze stosowa c do leczenia choroby Alzheimera o wczesnym pocz atku, zwi azanej z zespo lem Downa. W chorobie szalonych krów stosuje si e peptyd prionowy, jego aktywne fragmenty lub analogi oraz przeciwcia la przeciw peptydowi prionowemu zamiast peptydu A ß, jego aktywnych fragmentów lub analogów oraz przeciwcia l przeciw peptydowi A ß stosowanych w leczeniu choroby Alzheimera. W leczeniu szpiczaka mnogiego stosuje si e lekkie la ncuchy IgG oraz ich analogi i prze- ciwcia la przeciw nim, itd. w przypadku innych chorób. Niektóre srodki wywo luj ace odpowied z immunologiczn a zawieraj a odpowiedni epitop do indu- kowania odpowiedzi immunologicznej przeciw z logom amyloidu, ale s a zbyt ma le, zeby mog ly by c immunogenne. W tej sytuacji immunogenny peptyd mo zna po laczy c z odpowiednim no snikiem, aby u latwi c wywo lanie odpowiedzi immunologicznej. Odpowiednie no sniki obejmuj a albuminy surowicze, hemocjanin e z mi eczaka z rodzaju Fisurella (ang. keyhole limpet), cz asteczki immunoglobulin, tyro- globulin e, albumin e jaja kurzego, toksyn e t ezca lub toksyn e z innych bakterii patogennych, takich jak b lonica, E. coli, cholera lub H. pylori lub atenuowne pochodne toksyn. Inne no sniki do stymulacji lub wzmacniania odpowiedzi immunologicznej obejmuj a cytokiny, takie jak IL-1, peptydy IL-1 a i ß, IL-2, ?lNF, IL-10, GM-CSF oraz chemokiny, takie jak M1P1 a i ß oraz RANTES. Srodki immunogenne mo z- na tak ze polaczy c z peptydami polepszaj acymi transport przez tkanki, co opisano w O'Mahony, WO 97/17613 i WO 97/17614. Srodki immunogenne mo zna po laczy c z no snikami przez sieciowanie chemiczne. Techniki la- czenia immunogenu z no snikiem obejmuj a tworzenie disulfidowych mostków z u zyciem N-sukcyny- midylo-3-(2-pirydylotio)propionianu (SPDP) i 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sukcymidylu (SMCC) (je zeli w peptydzie nie ma grupy tiolowej, mo zna j a wprowadzi c przez dodanie cysteiny). Te reagenty tworz a wi azania disulfidowe mi edzy sob a i resztami cysteiny peptydu na jed- nym bia lku i wi azanie amidowe przez grup e e-amidow a lizyny lub inn a woln a grup e aminow a w innych aminokwasach. Wiele z takich srodków tworz acych mostki disulfidowe/amidowe opisano w Immun. Rev. 62, 185 (1982). Inne dwufunkcyjne srodki sprz egaj ace tworz a raczej tioetery ni z mostki disulfi- dowe. Wiele z tych srodków tworz acych tioetery jest dost epnych w handlu i obejmuj a one reaktywne estry kwasu 6-maleimidokapronowego, kwasu 2-bromooctowego, kwasu 2-jodooctowego i kwasu 4-(maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylowego. Grupy karboksylowe mo zna zaktywowa c lacz ac je z imidem kwasu bursztynowego lub sola sodow a kwasu 1-hydroksylo-2-nitro-4-sulfonowego. Peptydy immunogenne mo zna tak ze wyeksprymowa c jako bia lka fuzyjne z no snikami. Peptyd immunogenny mo zna polaczy c z no snikiem na N-ko ncu, C-ko ncu lub w srodku. Ponadto w bia lku fuzyjnym mog a by c obecne wielokrotne powtórzenia peptydu immunogennego. Odpowied z immunologiczn a skierowan a przeciw z logom amyloidowym mo zna tak ze wywo la c podaj ac kwasy nukleinowe kodujace peptyd A ß lub inne immunogeny peptydowe. Takim kwasem nukleinowym mo ze by c DNA lub RNA. Segment kwasu nukleinowego koduj acy immunogen jest za- zwyczaj po laczony z elementami regulatorowymi, takimi jak promotor i wzmacniacz, które umo zliwiaj a ekspresj e segmentu DNA w przewidywanych komórkach docelowych pacjenta. Do ekspresji w komór- kach krwi, co jest wymagane do wywo lania odpowiedzi immunologicznej, do bezpo sredniej ekspresji odpowiednie s a elementy promotora i wzmacniacza z genów lekkich i ci ezkich la ncuchów immunoglo- bulin lub promotor i wzmacniacz g lównego produktu po sredniego CMV. Po laczone elementy regula- cyjne i sekwencje koduj ace cz esto wklonowuje si e do wektora.PL 203 431 B1 12 Dost epnych jest wiele wirusowych uk ladów wektorowych obejmuj acych uk lady retrowirusowe (patrz np. Lawrie i Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)), wektory adenowirusowe (patrz np. Bett i inni, J. Virol. 67, 5911 (1993)), wektory wirusów adenosatelitarnych (patrz np. Zhou i inni, J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), wektory wirusowe z rodziny ospy obejmuj ace wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirusowe wektory z rodzaju alfawirus, takie jak wyprowadzone z wirusów Sindibs i gor aczki Semliki Forest (patrz np. Dubensky i inni, J. Virol. 70, 508-519 (1996)) oraz wirusy brodawek (Ohe i inni, Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo i inni, WO 94/12692 i Xiao i Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 1996)). DNA koduj acy immunogen lub zawieraj acy go wektor mo zna umie scic w liposomach. Odpo- wiednie lipidy i pokrewne analogi opisano w US 5208036, 5264618, 5279833 i 5283185. Wektory i DNA koduj acy immunogen mog a by c tak ze zaadsorbowane lub zwi azane z odpowiednimi no snikami w postaci cz astek, takimi jak np. polimetakrylan metylu, polimleczany i poli(mleczano-koglikolidy), patrz np. McGee i inni, J. Micro Encap. (1996). Wektory do terapii genowej lub nagi DNA mozna dostarczy c in vivo podaj ac konkretnemu pa- cjentowi, zazwyczaj ogólnoustrojowo (np. do zylnie, sródotrzewnowo, donosowo, do zo ladkowo, sród- skórnie, domi esniowo, podskórnie lub przez wlew wewn atrzczaszkowy) albo miejscowo (patrz np. US 5399346). DNA mo zna tak ze podawa c za pomoc a dzia la genowego. Patrz Xiao i Brandsma, supra. DNA koduj acy immunogen osadza si e na powierzchni mikroskopijnych metalowych kulek. Mikropoci- ski s a przyspieszane przez fal e szokow a lub rozpr ezany hel i przenikaj a do tkanek na gleboko sc kilku warstw komórek. Odpowiednie jest np. urz adzenie The Accel™ Gene Delivery Device wytwarzane przez Agacetus, Inc. Middleton WI. Ponadto nagi DNA mo ze przej sc przez skór e do krwi, po prostu w wyniku naniesienia DNA na skór e podra znion a chemicznie lub mechanicznie (patrz, WO 95/05853). W innej odmianie wektory koduj ace immunogeny mo zna dostarczy c do komórek ex vivo, takich jak komórki eksplantowane od pojedynczego pacjenta (np. limfocyty, aspirat szpiku kostnego, biopsja tkankowa) albo uniwersalne donorowe hematopoetyczne komórki macierzyste, a nast epnie reimplan- towa c te komórki pacjentowi, zazwyczaj po selekcji pod wzgl edem komórek, które maj a w laczony wektor. Pacjenci, których mo zna leczy c, stanowi a osoby z ryzykiem choroby, ale u których nie wyst api ly objawy, a tak ze pacjenci, u których wyst api ly objawy. Je sli chodzi o chorob e Alzheimera, praktycznie u ka zdego wyst epuje ryzyko choroby Alzheimera je zeli on lub ona zyja dostatecznie d lugo. Zatem niniejsze sposoby mo zna stosowa c profilaktycznie do ogólnej populacji, bez okre slania ryzyka u da- nego pacjenta. Niniejsze sposoby s a szczególnie u zyteczne w przypadku pacjentów ze znanym gene- tycznym ryzykiem choroby Alzheimera. Pacjenci tacy obejmuj a osoby maj ace krewnych, u których wyst api la ta choroba, a tak ze osoby, u których ryzyko okre sla si e analizuj ac znaczniki genetyczne i biochemiczne. Znaczniki genetyczne ryzyka choroby Alzheimera obejmuj a mutacje genu APP, w szczególno sci mutacje w pozycji 717 oraz pozycjach 670 i 671 nazywane odpowiednio mutacjami Hardy'ego i Swedish (patrz Hardy, TINS, supra). Innymi znacznikami ryzyka s a mutacje genów pre- seniliny, PS1 i PS2 oraz ApoE4, rodzinna historia AD, hipercholesterolemia lub mia zd zyca t etnic. Osoby obecnie cierpi ace na chorob e Alzheimera mo zna rozpozna c po charakterystycznym ot epieniu, a tak ze po obecno sci opisanych wy zej czynników ryzyka. Ponadto dost epnych jest wiele testów dia- gnostycznych do identyfikacji osób z AD. Obejmuj a one pomiary poziomów CSF t i A ß42. Podniesione poziomy t i obni zone poziomy A ß42 wskazuj a na obecno sc AD. Pacjentów z chorob a Alzheimera mo zna tak ze zdiagnozowa c pod wzgl edem kryteriów MMSE i ADRDA, co opisano ni zej w cz esci z przyk ladami. U pacjentów, u których nie wyst epuja objawy, leczenie mo zna rozpoczac w dowolnym wieku (np. 10, 20, 30). Jednak ze zazwyczaj nie jest konieczne rozpoczynanie leczenia zanim pacjent osi a- gnie 40, 50, 60 lub 70 rok zycia. Leczenie zazwyczaj obejmuje podawanie wielu dawek w pewnym okresie czasu. Leczenie mo zna monitorowa c okre slaj ac odpowiedzi przeciwcia l lub aktywowanych komórek T lub B na srodek leczniczy (np. peptyd A ß) w czasie. Je zeli odpowied z s labnie, wskazana jest wzmocniona dawka. W przypadku pacjentów z potencjalnym zespo lem Downa leczenie mo zna rozpocz ac przed urodzeniem podaj ac srodek leczniczy matce, lub wkrótce po urodzeniu. W zastosowaniach profilaktycznych srodki farmaceutyczne lub leki podaje si e pacjentowi, po- datnemu na konkretn a chorob e lub z ryzykiem konkretnej choroby, w ilo sci wystarczaj acej do wyelimi- nowania lub zmniejszenia ryzyka lub opó znienia pojawienia si e choroby. W zastosowaniach leczni- czych srodki farmaceutyczne lub leki podaje si e pacjentowi, u którego podejrzewa si e tak a chorob e lub u którego ju z wyst api la taka choroba, w ilo sci wystarczaj acej do wyleczenia lub co najmniej cz e-PL 203 431 B1 13 sciowego zahamowania objawów choroby i jej powik lan. Ilo sc odpowiedni a do osi agni ecia tego defi- niuje si e jako leczniczo lub profilaktycznie skuteczn a dawk e. Zarówno w trybie leczenia, jak i profilak- tyki srodki zazwyczaj podaje si e w kilku dawkach do uzyskania wystarczaj acej odpowiedzi immunolo- gicznej. Zazwyczaj odpowied z immunologiczn a monitoruje si e i kolejne dawki podaje si e gdy odpo- wied z immunologiczna zaczyna zanika c. Skuteczne dawki srodków wed lug wynalazku do leczenia opisanych powy zej stanów ró zni a si e zale znie od wielu ró znych czynników, w lacznie z sposobem podawania, docelowym miejscem, stanem fizjologicznym pacjenta, czy pacjent jest cz lowiekiem czy zwierz eciem, innymi przyjmowanymi lekami, oraz od tego czy leczenie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. Zazwyczaj pacjent jest cz lowiekiem, ale w niektórych chorobach, takich jak choroba szalonych krów, pacjent mo ze by c ssakiem nie b ed a- cym cz lowiekiem, takim jak byd lo. Dawki lecznicze powinno si e mianowa c w celu zoptymalizowania bezpiecze nstwa i skuteczno sci. Ilo sc immunogenu zale zy od tego, czy równie z podaje si e adiuwant, przy czym przy braku adiuwanta wymagane s a wy zsze dawki. Ilo sc immunogenu do podawania cza- sami wynosi od 1 do 500 µg na pacjenta, a czesciej 5 - 500 µg na zastrzyk przy podawaniu ludziom. Czasami stosuje si e wy zsz a dawk e 1 - 2 mg na zastrzyk. Zazwyczaj przy podawaniu ludziom stosuje sie 10, 20, 50 lub 100 µg na zastrzyk. Okresy wstrzykiwania mog a si e znacz aco ró zni c od jednego raza dziennie do jednego raza na rok, oraz do jednego raza na dekad e. W dowolnym danym dniu, w którym podaje si e dawk e immunogenu, dawka jest wi eksza ni z 1 µg/pacjenta, a zazwyczaj wi eksza ni z 10 µg/ml gdy tak ze podaje si e adiuwant oraz wi eksza ni z 10 µg/pacjenta, a zazwyczaj 100 µg/pacjenta w przypadku braku adiuwanta. Typowy tryb leczenia obejmuje immunizacj e, a po niej zastrzyki dawek przypominaj acych z przerwami 6-tygodniowymi. Inny tryb leczenia obejmuje immuni- zacj e, a nast epnie zastrzyki dawek przypominaj acych po 1, 2 i 12 miesi acach. Inny tryb leczenia obejmuje zastrzyki co 2 miesi ace przez ca le zycie. Ponadto zastrzyki przypominaj ace mog a by c nie- regularne, wykonywane w oparciu o monitorowanie odpowiedzi immunologicznej. Dla biernej immuni- zacji przeciwcia lami dawki wynosz a od 0,0001 do 100 mg/kg, a cz esciej 0,01 do 5 mg/kg wagi cia la biorcy. Dawki kwasów nukleinowych koduj acych immunogeny wynosz a od 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 µg do 10 mg lub 30-300 µg DNA na pacjenta. Dawki dla infekcyjnych wektorów wirusowych wynosz a od 10 - 10 9 lub wi ecej wirionów na dawk e. Srodki do wywo lywania odpowiedzi immunologicznej mo zna podawa c pozajelitowo, miejscowo, do zylnie, doustnie, podskórnie, dootrzewnowo, donosowo lub domi esniowo przy leczeniu profilaktycz- nym i/lub terapeutycznym. Najcz estsz a drog a podawania jest droga podskórna, ale inne mog a by c równie skuteczne. Kolejn a najcz estsz a drog a s a zastrzyki domiesniowe. Ten typ zastrzyków najcz e- sciej wykonuje si e w mi esnie r eki lub nogi. Tak ze skuteczne w wytwarzaniu odpowiedzi immunolo- gicznej s a zastrzyki do zylne, a tak ze zastrzyki sródotrzewnowe, dot etnicze, wewn atrzczaszkowe lub sródskórne. W niektórych sposobach srodki wstrzykuje si e bezpo srednio do konkretnej tkanki gdzie nagromadzi ly si e z logi. Ponadto srodki wed lug wynalazku mo zna podawa c w polaczeniu z innymi srodkami, które s a co najmniej cz esciowo skuteczne w leczeniu choroby amyloidogennej. W przypadku choroby Alzheimera i zespo lu Downa, gdzie z logi amyloidowe wyst epuj a w mózgu, srodki wed lug wynalazku mo zna poda- wa c w polaczeniu z innymi srodkami polepszaj acymi przenikanie srodków wed lug wynalazku przez barier e krew-mózg. Srodki immunogenne wed lug wynalazku, takie jak peptydy, czasami podaje si e w po laczeniu z adiuwantem. Mo zna stosowa c wiele ró znych adiuwantów w po laczeniu z peptydem, takim jak A ß, aby wywo la c odpowied z immunologiczn a. Korzystne adiuwanty wzmacniaj a wewn etrzn a odpowied z na immunogen nie powoduj ac konformacyjnych zmian immunogenu, które wp lywa lyby na jako sciow a posta c odpowiedzi. Korzystne adiuwanty obejmuj a a lun, de-O-acylowany monfosforylowany lipid A (MPL) (patrz GB 2220211). QS21 jest glikozydem triterpenu lub saponin a wyizolowan a z kory drzew Quillaja Saponaria Molina rosn acego w Po ludniowej Ameryce (patrz Kensil i inni, w Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (red. Powell i Newman, Plenum Press, NY, 1995); opis patento- wy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5057540). Inne adiuwanty to emulsje olej w wodzie (np. skwa- lenu lub oleju arachidowego), ewentualnie w po laczeniu z immunostymulantami, takimi jak monofosfo- rylowany lipid A (patrz Stoute i inni, N. Engl. Med. 336, 86-91 (1997)). Innym adiuwantem jest CpG (Bioworld Today, 15 listopada 1998 r.). Ponadto A ß mo ze by c sprz ezony z adiuwantem. Przyk ladowo lipopeptydow a wersj e A ß mo zna otrzyma c przez sprz eganie kwasu palmitynowego lub innych lipidów bezpo srednio z N-ko ncem A ß, jak opisano dla szczepionek antygenem zapalenia w atroby typu B (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)). Jednak ze takie sprz eganie nie powinno zasadniczoPL 203 431 B1 14 zmieni c konformacji A ß tak, ze wp lyn eloby to tak ze na natur e odpowiedzi na niego. Adiuwanty mo zna podawa c jako sk ladnik srodka leczniczego razem ze srodkiem czynnym lub osobno, przed podaniem, równocze snie lub po podaniu srodka leczniczego. Korzystn a klas a adiuwantów s a sole glinu (a lun), takie jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu, siarczan glinu. Takie adiuwanty mo zna stosowa c z innymi konkretnymi srodkami immunostymuluj a- cymi albo bez innych konkretnych srodków immunostymuluj acych, takich jak MPL lub 3-DMP, QS21, polimeryczne lub monomeryczne aminokwasy, takie jak polikwas glutaminowy lub polilizyna. Inn a klas a adiuwantów s a preparaty typu emulsji olej w wodzie. Takie adiuwanty mo zna stosowa c z innymi konkretnymi srodkami immunostymuluj acymi albo bez innych konkretnych srodków immunostymuluj a- cych, takich jak peptydy muramylowe (np. N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutamina (thr-MDP), N-acetylonormuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina (nor-MDP), N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izogluta- minylo-L-alanino-2-(1'-2'dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)etyloamina (MTP-PE), N-acetylo- glukozaminylo-N-acetylomuramylo-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksypropyloamid (DTP-DPP) tera- mid™) lub inne sk ladniki scian komórek bakteryjnych. Emulsje olej w wodzie obejmuj a (a) MF59 (WO 90/14837), zawieraj acy 5% skwalenu, 0,5% Tween 80 i 0,5% Span 85 (ewentualnie zawieraj ace ró zne ilo sci MTP-PE) w postaci submikronowych cz astek utworzonych z u zyciem mikrofluidyzatora, takiego jak mikrofluidyzator Model 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, zawieraj acy 10% skwa- lenu, 0,4% Tween 80, 5% polimeru blokowego Pluronic L121 i thr-MDP, wytworzony w postaci submi- kronowej emulsji drog a mikrofluidyzacji lub zworteksowane w celu wytworzenia emulsji cz astek o wi ekszym rozmiarze oraz (c) uk lad adiuwantowy Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) zawieraj acy 2% skwalenu, 0,2% Tween 80 i jeden lub wi eksz a liczb e sk ladników scian komórek bakte- ryjnych z grupy obejmuj acej monofosforylolipid A (MPL), dimikolinian trehalozy (TDM) i szkielet sciany komórkowej (CWS), korzystnie MPL+CWS (Detox™). Inn a klas e korzystnych adiuwantów stanowi a adiuwanty saponinowe, takie jak Stimulon™ (qs21, Aquila, Worcester, MA) lub wytworzone z niego cz astki, takie jak ISCOM (kompleksy immunostymuluj ace) i ISCOMATRIX. Inne adiuwanty obejmuj a kompletny adiuwant Freunda (CFA) i niekompletny adiuwant Freunda (IFA). Inne adiuwanty obejmuj a cytokiny, takie jak interleukiny (IL-1, IL-2 i IL-12), czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnik martwicy nowotworu (TNF). Adiuwant mo zna podawa c z immunogenem w jednym preparacie przed podaniem, równocze- snie z podaniem albo po podaniu immunogenu. Immunogen i adiuwant mog a by c zapakowane i do- starczane w tej samej fiolce albo mog a by c umieszczone w oddzielnych fiolkach i mieszane przed u zyciem. Immunogen i adiuwant zazwyczaj pakuje si e z etykietk a wskazuj ac a zamierzone zastosowa- nie lecznicze. Je zeli immunogen i adiuwant s a zapakowane osobno, zazwyczaj opakowanie zawiera instrukcje odno snie mieszania przed u zyciem. Wybór adiuwanta i/lub no snika zale zy od trwa lo sci szczepionki zawieraj acej adiuwant, drogi podawania, harmonogramu dawkowania, skuteczno sci ad- iuwanta u szczepionych gatunków oraz u ludzi. Farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem jest taki, który zosta l dopuszczony lub jest dopuszczalny do podawania ludziom przez stosowne organy ustawodawcze. Na przyk lad kompletny adiuwant Freunda nie jest odpowiedni do podawania ludziom. A lun, MPL i QS21 s a korzystne. Ewentualnie mo zna równocze snie stosowa c jeden lub wi eksz a liczb e adiuwantów. Korzystne po laczenia obejmuj a a lun z MPL, a lun z QS21, MPL z QS21 oraz a lun, QS21 i MPL razem. Ponadto mo zna stosowa c niekompletny adiuwant Freunda (Chung i inni, Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), ewentualnie w po laczeniu z jakimkolwiek sk ladnikiem wybranym spo sród a lunu, QS21 i MPL i wszystkich ich kombinacji. Srodki wed lug wynalazku cz esto podaje si e jako srodki farmaceutyczne zawieraj ace srodek leczniczo czynny i ró zne farmaceutycznie dopuszczalne sk ladniki. Patrz Remington's Pharmaceutical Science (wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Korzystna posta c zale zy od zamierzonej drogi podawania oraz zastosowania leczniczego. Srodki mog a tak ze zawiera c, zale z- nie od wymaganego preparatu, farmaceutycznie dopuszczalne, nietoksyczne no sniki lub rozcie nczal- niki, które okre sla si e jako no sniki powszechnie stosowane do formu lowania srodków farmaceutycz- nych do podawania ludziom i zwierz etom. Rozcie nczalnik wybiera si e tak, zeby nie wp lywa l na aktyw- nosc biologiczn a danego srodka. Przyk ladami takich rozcie nczalników s a woda destylowana, fizjolo- giczna sól buforowana fosforanem, p lyny Ringera, roztwór dekstrozy oraz p lyn Hanka. Ponadto sro- dek farmaceutyczny lub preparat mo ze tak ze zawiera c inne no sniki, adiuwanty lub nietoksyczne, nie- lecznicze, nieimmunogenne stabilizatory itp. Jednak ze niektóre odczynniki odpowiednie do podawania zwierz etom, takie jak kompletny adiuwant Freunda, zazwyczaj nie wchodz a w sk lad srodków dla ludzi.PL 203 431 B1 15 Srodki farmaceutyczne mog a tak ze zawiera c du ze, wolno metabolizowane makrocz asteczki, ta- kie jak bia lka, polisacharydy, polikwasy mlekowe, polikwasy glikolowe i kopolimery (takie jak funkcjo- nalizowana lateksem sefaroza, agaroza, celuloza itp.), polimeryczne aminokwasy, kopolimery amino- kwasów i agregaty lipidów (takie jak kropelki oleju lub liposomy). No sniki te mog a ponadto dzia lac jako srodki immunostymuluj ace (to jest adiuwanty). Do podawania pozajelitowego srodki wed lug wynalazku mo zna podawa c jako wstrzykiwane dawki roztworów lub zawiesin substancji w fizjologicznie dopuszczalnym rozcie nczalniku z farmaceu- tycznym no snikiem, którym mo ze by c ja lowa ciecz, taka jak woda, oleje, roztwór soli, gliceryna lub etanol. Ponadto w preparatach mog a by c obecne substancje pomocnicze, takie jak srodki zwil zaj ace lub emulguj ace, powierzchniowo czynne, substancje buforuj ace pH itp. Innymi sk ladnikami srodków farmaceutycznych s a srodki pochodz ace z ropy naftowej, zwierz ece, ro slinne lub syntetyczne, np. olej arachidowy, olej sojowy i olej mineralny. Ogólnie glikole, takie jak glikol propylenowy lub glikol poliety- lenowy, s a korzystnymi ciek lymi no snikami, szczególnie do roztworów do wstrzykiwania. Zazwyczaj srodki wytwarza si e jako preparaty do wstrzykiwania, jako p lynne roztwory lub za- wiesiny; mo zna tak ze wytwarza c sta le postacie odpowiednie do rozpuszczania lub dyspergowania w ciek lych no snikach przed iniekcj a. Preparat mo ze tak ze by c zemulgowany lub kapsu lkowany w lipo- somach lub mikrocz astkach, takich jak polilaktyd, poliglikolid lub kopolimer, w celu wzmocnienia dzia- lania adiuwanta, co opisano powy zej (patrz Langer, Science 249, 1527 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Srodki wed lug wynalazku mo zna tak ze podawa c jako za- strzyki typu depot lub preparaty w postaci wszczepów, które mo zna wytwarza c w taki sposób, aby umo zliwi c przed lu zone lub pulsacyjne uwalnianie sk ladnika czynnego. Dodatkowe preparaty odpowiednie do innych sposobów podawania obejmuj a preparaty doust- ne, donosowe i dop lucne, czopki i preparaty przezskórne. W przypadku czopków, substancje wiazace i no sniki obejmuj a np. glikole polialkilenowe lub tri- glicerydy; takie czopki mo zna wytwarza c z mieszanin zawieraj acych sk ladnik czynny w ilo sci od 0,5% do 10%, korzystnie 1%-2%. Doustne preparaty zawieraj a zaróbki, takie jak mannitol, laktoz e, skrobi e, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloz e i w eglan magnezu jako sci farmaceutycznej. Srodki te maj a posta c roztworów, zawiesin, tabletek, pigulek, kapsu lek, preparatów o przed lu zonym uwalnia- niu lub proszków i zawieraj a 10%-95% sk ladnika czynnego, korzystnie 25%-70%. Podawanie miejscowe mo zna osi agn ac drog a przezskórn a lub sródskórn a. Podawaniu miej- scowemu mo ze sprzyja c równoczesne podawanie srodka z toksyn a cholery lub jej detoksykowanymi pochodnymi lub podjednostkami, albo z podobnymi toksynami bakteryjnymi (patrz Glenn i inni, Nature 391, 851 (1998)). Równoczesne podawanie mo zna osi agnac stosuj ac sk ladniki w postaci mieszaniny lub po laczone cz asteczki uzyskane przez chemiczne sieciowanie lub ekspresj e bia lka fuzyjnego. Alternatywnie dostarczanie przezskórne mozna osi agn ac stosuj ac plastry na skór e lub transfe- rosomy (Paul i inni, Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc i inni, Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)). Mo zliwe jest wykrywanie odpowiedzi immunologicznej przeciw peptydowi A ß u pacjenta cierpi a- cego na lub podatnego na chorob e Alzheimera. Sposoby takie s a szczególnie przydatne do monito- rowania przebiegu leczenia stosowanego u pacjenta. Sposoby mo zna stosowa c do monitorowania zarówno leczenia terapeutycznego u pacjentów, u których wyst api ly objawy, jak i leczenia profilak- tycznego u pacjentów, u których nie wyst api ly objawy. Mo zliwe jest ustalanie warto sci podstawowej odpowiedzi immunologicznej u pacjenta przed podaniem dawki srodka i porównanie jej z warto sci a odpowiedzi immunologicznej po leczeniu. Znacz acy wzrost (to jest wi ekszy ni z typowy margines b ledu do swiadczalnego w powtarzanych pomia- rach tej samej próbki, wyra zony jako jedno odchylenie standardowe od sredniej z tych pomiarów) war- to sci odpowiedzi immunologicznej sygnalizuje pozytywny wynik leczenia (to jest, ze podanie srodka wywo la lo lub wzmocni lo odpowied z immunologiczn a). Je zeli warto sc odpowiedzi immunologicznej nie zmienia si e znacz aco lub obni za si e, wskazuje to na negatywny wynik leczenia. Ogólnie u pacjentów w pocz atkowym okresie leczenia srodkiem oczekuje si e wzrostu odpowiedzi immunologicznej po ko- lejno nast epuj acych dawkach, która ewentualnie mo ze osi agnac plateau. Ogólnie podawanie srodka kontynuuje si e gdy odpowied z immunologiczna wzrasta. Osi agni ecie plateau wskazuje, ze leczenia mo zna dalej nie kontynuowa c lub zmniejszy c dawk e albo cz estosc jej podawania. Mo zliwe jest te z ustalenie kontrolnej warto sci (to jest sredniej z odchyleniem standardowym) odpowiedzi immunologicznej dla populacji kontrolnej. Zazwyczaj osoby w populacji kontrolnej nie by ly wcze sniej poddawane leczeniu. Warto sci odpowiedzi immunologicznej zmierzone u pacjenta poPL 203 431 B1 16 podaniu srodka leczniczego porównuje si e z warto scia kontroln a. Znacz acy wzrost w porównaniu z warto scia kontroln a (to jest wi ekszy ni z jedno odchylenie standardowe od sredniej z tych pomiarów) sygnalizuje pozytywny wynik leczenia. Brak znacz acego wzrostu lub obni zenie sygnalizuje negatywny wynik leczenia. Ogólnie podawanie srodka kontynuuje si e do czasu gdy odpowied z immunologiczna zacznie wzrasta c w odniesieniu do warto sci kontrolnej. Tak jak poprzednio, osi agni ecie plateau w odniesieniu do warto sci kontrolnych wskazuje, ze leczenia mo zna dalej nie kontynuowa c lub zmniej- szy c dawk e albo cz estosc jej podawania. Wartosc kontroln a odpowiedzi immunologicznej (np. sredni a i odchylenie standardowe) mo zna te z ustala c z kontrolnej populacji osobników, którzy przeszli leczenie srodkiem leczniczym i których odpowiedzi immunologiczne osi agn ely plateau w odpowiedzi na leczenie. Warto sci odpowiedzi immu- nologicznej zmierzone u pacjenta porównuje si e z warto scia kontroln a. Je zeli zmierzony u pacjenta poziom nie ró zni si e znacz aco (np. wi ecej ni z jedno odchylenie standardowe) od warto sci kontrolnej leczenia mo zna dalej nie kontynuowa c. Je zeli poziom u pacjenta jest znacz aco ni zszy od warto sci kontrolnej, wskazane jest dalsze podawanie srodka. Je zeli poziom u pacjenta utrzymuje si e poni zej warto sci kontrolnej wskazana mo ze by c zmiana trybu leczenia, np. zastosowanie innego adiuwanta. Pacjenta, który obecnie nie jest leczony, ale który przeszed l okres leczenia, mo zna te z monito- rowa c pod wzgl edem odpowiedzi immunologicznej w celu okre slenia, czy wymagane jest wznowienie leczenia. Wartosc odpowiedzi immunologicznej zmierzon a u pacjenta mo zna porówna c z warto sci a odpowiedzi immunologicznej wcze sniej osi agni etej u pacjenta podczas okresu leczenia. Znacz ace obni zenie w porównaniu z poprzednimi pomiarami (to jest wi eksze ni z typowy margines b ledu w po- wtórzonych pomiarach tej samej próbki) wskazuje, ze leczenie nale zy wznowi c. Ponadto wartosc zmierzon a u pacjenta mo zna porówna c z warto scia kontroln a ( srednia plus odchylenie standardowe) oznaczon a dla populacji pacjentów po przej sciu okresu leczenia. Ponadto warto sci zmierzone u pa- cjenta mo zna porówna c z warto scia kontroln a populacji pacjentów leczonych profilaktycznie, u których nie wyst api ly objawy choroby lub leczonych terapeutycznie, u których wyst api la poprawa cech charak- terystycznych choroby. We wszystkich tych przypadkach znacz ace obni zenie w odniesieniu do pozio- mów kontrolnych (to jest wi eksze ni z odchylenie standardowe) wskazuje, ze leczenie pacjenta powin- no by c wznowione. Tkank a pobieran a od pacjenta do analizy jest zazwyczaj krew, osocze, surowica, sluz lub p lyn mózgowo-rdzeniowy. Próbk e analizuje si e pod wzgl edem wska zników odpowiedzi immunologicznej na jak akolwiek posta c peptydu A ß, zazwyczaj A ß42. Odpowied z immunologiczn a mo zna okre sli c na podstawie obecno sci, np. przeciwcia l lub komórek T, które specyficznie wiaz a peptyd A ß. Metody ELISA stosowane do wykrywania przeciwcia l specyficznie wiazacych peptyd A ß opisano w cz esci z przyk ladami. Sposoby wykrywania reaktywnych komórek T opisano powy zej (patrz Definicje). Mo zna sporz adza c zestawy diagnostyczne do realizacji metod diagnostycznych opisanych po- wy zej. Zazwyczaj takie zestawy zawieraj a srodek specyficznie wiazacy przeciwcia la przeciw A ß lub reaguj acy z komórkami T specyficznymi dla A ß. Zestaw mo ze tak ze zawiera c znacznik. Do wykrywa- nia przeciwcia l przeciw A ß znacznik jest zazwyczaj w postaci znakowanych przeciwcia l przeciw- idiotypowych. Do wykrywania przeciwcia l mo zna dostarczy c srodek wcze sniej zwi azany z faz a sta la, tak a jak studzienki na p lytce do mikromianowania. Do wykrywania reaktywnych komórek T znacznik mo zna dostarczy c jako 3 H-tymidyn e w celu zmierzenia odpowiedzi proliferacyjnej. Zestawy tak ze za- zwyczaj zawieraj a etykiety z wskazówkami jak zastosowa c zestaw. Etykieta mo ze tak ze zawiera c wykres lub inn a form e koreluj ac a poziomy zmierzonego znacznika z przeciwcia lami przeciw A ß lub komórek T reaktywnych z A ß. Okre slenie etykieta odnosi si e do jakiegokolwiek pisanego lub nagrane- go materia lu do laczonego do zestawu lub w inny sposób towarzysz acego zestawowi, w dowolnym momencie podczas jego wytwarzania, transportu, sprzeda zy i stosowania. Na przyk lad okre slenie etykieta obejmuje ulotki reklamuj ace oraz broszury, materia ly opakowaniowe, instrukcje, kasety audio i wideo, dyskietki komputerowe, a tak ze napisy wydrukowane bezpo srednio na zestawach, towarzy- sz acego zestawowi, w dowolnym momencie podczas jego wytwarzania, transportu, sprzeda zy i stosowania. Na przyk lad okre slenie etykieta obejmuje ulotki reklamuj ace oraz broszury, materia ly opakowaniowe, instrukcje, kasety audio i wideo, dyskietki komputerowe, a tak ze napisy wydrukowane bezpo srednio na zestawach. P r z y k l a d y I. Skuteczno sc profilaktyczna A ß przeciw AD W przyk ladach tych opisano podawanie peptydu A ß 42 myszom transgenicznym nadeksprymuj a- cym APP z mutacj a w pozycji 717 (APP 717V—F ) predysponuj ac a je do rozwoju neuropatologii typuPL 203 431 B1 17 Alzheimera. Wytwarzanie i charakterystyk e tych myszy (myszy PDAPP) opisano w Games i inni, Natu- re, supra. U zwierz at tych, w postaci heterozygot, zaczyna odk lada c si e A ß poczynaj ac od wieku 6 miesi ecy. W wieku 15 miesi ecy wykazuj a one poziomy z logów A ß porównywalne z obserwowanymi w chorobie Alzheimera. Myszom PDAPP wstrzykni eto zagregowany A ß 42 (zagregowany A ß 42 ) lub sól buforowan a fosforanem. Zagregowany A ß 42 wybrano ze wzgl edu na jego zdolnosc indukowania prze- ciwcia l na wielokrotne epitopy A ß. A. Metody 1. Zród lo myszy Trzydzie sci heterogenicznych samic myszy PDAPP losowo podzielono na nast epuj ace grupy: 10 myszy, którym wstrzykiwano zagregowany A ß 42 (jedna zdech la w transporcie), 5 myszy, którym wstrzykiwano PBS/adiuwant lub PBS oraz 10 myszy kontrolnych, którym nie podawano zastrzyków. Pi eciu myszom wstrzykni eto osoczowe bia lko amyloidu (SAP). 2. Przygotowanie immunogenów Przygotowanie zagregowanego A ß 42 : 2 mg A ß 42 (US Peptides Inc, partia K-42-12) rozpuszczo- no w 0,9 ml wody i doprowadzono do 1 ml przez dodanie 0,1 ml 10xPBS. Nast epnie mieszanin e zwor- teksowano i inkubowano przez noc w 37°C w warunkach, w których peptyd ulega agregacji. Jakikol- wiek nieu zywany A ß przechowywano w postaci suchego liofilizowanego proszku w -20°C do czasu nast epnego zastrzyku. 3. Przygotowanie zastrzyków 100 µg zagregowanego A ß 42 w PBS na mysz zemulgowano w stosunku 1:1 z kompletnym ad- iuwantem Freunda (CFA) w ko ncowej obj eto sci 400 µl emulsji do pierwszej immunizacji, a nast epnie podano przypominaj ac a dawk e tej samej ilo sci immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) po 2 tygodniach. Dwie dodatkowe dawki w IFA podano z przerwami miesi ecznymi. Kolejne im- munizacje wykonywano z miesi ecznymi przerwami w 500 µl PBS. Zastrzyki wykonywano sródotrzew- nowo (i.p.). Zastrzyki PBS podawano w takim samym porz adku i myszom wstrzykni eto mieszanin e 1:1 PBS/adiuwant w obj eto sci 400 µl na mysz lub 500 µl PBS na mysz. Zastrzyki z SAP podobnie poda- wano w tym samym porz adku stosuj ac dawki 100 µg na zastrzyk. 4. Mianowanie krwi mysiej, preparowanie tkanek i immunohistochemia Powy zsze metody opisano poni zej w Ogólnych Materia lach i Metodach. B. Wyniki Myszom PDAPP podano zagregowany A ß 42 (zagregowany A ß 42 ), peptydy SAP lub sól buforo- wan a fosforanem. Jedn a grup e myszy traktowano jako kontrol e pozytywn a i nie podawano im zastrzy- ków. Miana z myszy z grupy zagregowanego A ß 42 monitorowano ka zdego miesi aca od czwartej dawki przypominaj acej a z myszy osi agn ely rok. Myszy u smiercono w wieku 13 miesi ecy. We wszystkich badanych punktach czasowych 8 z 9 myszy z grupy zagregowanego A ß 42 rozwin elo wysokie miano przeciwcia l, które pozosta lo wysokie przez seri e zastrzyków (miana wy zsze ni z 1/10000). Dziewi ata mysz mia la niskie, ale mierzalne miano oko lo 1/1000 (fig. 1, tabela 1). Myszy, którym wstrzykni eto SAPP mia ly miana 1:1000 do 1:30000 wobec tego immunogenu, przy czym tylko u jednej myszy mia- no przekracza lo 1:100000. U myszy, którym podawano PBS zmierzono miana przeciw zagregowanemu A ß 42 w wieku 6, 10 i 12 miesi ecy. Miana przeciw zagregowanemu A ß 42 myszy PBS w rozcie nczeniach 1/100 przekroczy ly tylko 4-krotnie warto sc podstawow a w jednym punkcie danych, a w pozosta lych punktach danych wynosily mniej ni z 4-krotna wartosc podstawowa (tabela 1). Odpowied z specyficzna dla SAP by la nieistotna dla tych punktów czasowych i wszystkie miana by ly mniejsze ni z 300. Siedem z dziewi eciu myszy z grupy zagregowanego Aß1-42 nie mia lo wykrywalnego amyloidu w mózgach. Natomiast tkanka mózgowa z myszy w grupach SAP i PBS zawiera la wiele 3D6- dodatnich z logów amyloidowych w hipokampie, a tak ze korach czo lowej i obr eczowej. Wzór utworzo- nych z logów by l podobny jak u nieleczonych myszy kontrolnych, z charakterystycznym wyst epowa- niem wra zliwych na uszkodzenie podregionów, takich jak zewn etrzna cz asteczkowa warstwa hipo- kampowego zakr etu z ebatego. Jedna z myszy z grupy, której podawano A ß1-42 mia la znacznie zmniejszone obci azenie amyloidem, granicz acym z hipokampem. Zidentyfikowano odizolowan a p lytk e u innej myszy leczonej A ß1-42. Ilo sciowa analiza obrazu dla obci azenia amyloidem hipokampu wykaza la znaczne zmniejszenie osi agni ete u zwierz at leczonych AN1792 (fig. 2). Warto sci mediany obciazenia amyloidem dla grupy PBS (2,22%) i dla nieleczonej grupy kontrolnej (2,65%) by ly znacznie wi eksze ni z dla myszy immuni-PL 203 431 B1 18 zowanych AN1792 (0,00%, p=0,0005). Natomiast warto sc mediany dla grupy immunizowanej pepty- dami SAP (SAPP) wynosi la 5,74%. Tkanka mózgowa nieleczonych myszy kontrolnych zawiera la licz- ne z logi A ß, ujawnione za pomoc a specyficznych dla A ß przeciwcia l monoklonalnych (mAb) 3D6, w hipokampie, a tak ze w korze pozamodzelowatej. Podobny wzór z logów amyloidowych obserwowa- no tak ze u myszy immunizowanych SAPP lub PBS (fig. 2). Ponadto we wszystkich trzech ostatnich grupach obserwowano znacz acy udzia l wra zliwych na uszkodzenie podregionów mózgu klasycznie obserwowanych w AD, takich jak zewn etrzna cz asteczkowa warstwa hipokampowego zakr etu z ebatego. Mózgi, które nie zawiera ly z logów A ß, by ly tak ze pozbawione p lytek neurytycznych zazwyczaj widocznych u myszy PDAPP z ludzkim przeciwcia lem przeciw APP 8E5. Wszystkie mózgi z pozosta- lych grup, (którym wstrzykiwano SAP, PBS lub którym nie podawano zastrzyków) zawiera ly wiele p lytek neurytycznych typowych dla nieleczonych myszy PDAPP. Niewielka liczba p lytek neurytycz- nych by la obecna u jednej z myszy leczonych AN1792 oraz pojedyncze skupisko dystroficznych neu- rytów znaleziono u drugiej myszy leczonej AN1792. Analiza obrazu dla hipokampu, przedstawiona na fig. 3, wykaza la faktyczn a eliminacj e dystroficznych neurytów u myszy leczonych AN1792 (mediana 0,00%) w porównaniu z biorcami PBS (mediana 0,28%, p=0,0005). Astrocytoza charakterystyczna dla towarzysz acego plytkom zapalenia tak ze nie wyst epowa la w mózgach grupy, której podawano A ß1-42. Mózgi myszy z innych grup zawiera ly znaczn a ilo sc zgru- powanych GFAP-dodatnich astrocytów typowych dla zwi azanej z p lytkami A ß glejozy. Cz es c z reagu- jacych z GFAP preparatów histologicznych wybarwiono przeciwnie Tioflawin a S w celu zlokalizowania z logów A ß. GFAP-dodatnie astrocyty by ly zwi azane z p lytkami A ß u myszy SAP, PBS oraz nieleczo- nych kontrolnych. Nie stwierdzono takiego zwi azku u p lytko-ujemnych myszy leczonych A ß1-42, pod- czas gdy minimaln a glejoz e zwi azan a z p lytkami obserwowano u jednej z myszy leczonych AN1792. Analiza obrazu, przedstawiona na fig. 4 dla kory pozamodzelowatej, potwierdzi la, ze zmniej- szenie astrocytozy by lo znacz ace, z warto scia mediany 1,56% dla myszy leczonych AN1792 wobec warto sci mediany wi ekszych ni z 6% dla grup immunizowanych peptydami SAP, PBS lub nieleczonymi (p=0,0017). Dane z podzestawu myszy A ß1-42 i PBS wykaza ly brak zwi azanej z p lytkami MHC II immuno- reaktywno sci u myszy A ß1-42, co zgadza lo si e z brakiem zwi azanej z A ß odpowiedzi zapalnej. Fragmenty mózgów myszy tak ze poddano dzia laniu mA ß specyficznych dla MAC-1, komórko- wego bia lka powierzchniowego. MAC-1 (CD11b) jest cz lonkiem rodziny integryn i wyst epuje w postaci heterodimeru z CD18. Kompleks CD11b/CD18 wyst epuje na monocytach, makrofagach, neutrofilach i komórkach NK (Mak i Simard). Komórka typu MAC-1-reaktywnego wyst epuj aca w mózgu jest naj- prawdopodobniej mikroglejem, w oparciu o podobn a morfologi e fenotypow a w MAC-1 immunoreak- tywnych fragmentach. Zwi azane z p lytkami znakowanie MAC-1 by lo ni zsze w mózgach myszy leczo- nych AN1792 w porównaniu z kontroln a grup a PBS, przy czym obserwacja ta zgadza la si e z brakiem zwi azanej z A ß odpowiedzi zapalnej. C. Wnioski Brak p lytek A ß i reaktywnych neuronalnych i glejowych zmian w mózgach myszy, którym poda- no A ß1-42 wskazuj a, ze w ich mózgach amyloid nie odk lada l si e lub odk lada la si e jego minimalna ilosc oraz, ze nie wyst api ly konsekwencje patologiczne, takie jak glejoza i patologia neurytów. Myszy PDAPP leczone A ß1-42 wykaza ly zasadniczo taki sam brak patologii, co kontrolne myszy nietransge- niczne. Tak wi ec zastrzyki z A ß1-42 s a bardzo skuteczne w zapobieganiu z logom lub w oczyszczeniu tkanki mózgowej z ludzkiej formy A ß oraz w eliminacji nast epuj acych pó zniej neuronalnych lub zapal- nych zmian degeneracyjnych. Zatem podawanie peptydu A ß przynosi lecznicze korzy sci w zapobie- ganiu AD. II. Badania odpowiedzi na dawk e Grupy 5-tygodniowych samic myszy Swiss Webster (N=6 na grup e) immunizowano dootrzew- nowo 300, 100, 33, 3,7, 1,2, 0,4 lub 0,13 µg A ß przygotowanymi w CFA/IFA. Podano 3 dawki z dwuty- godniowymi przerwami, a nast epnie czwart a dawk e miesi ac pó zniej. Pierwsz a dawk e zemulgowano z CFA, a pozosta le dawki zemulgowano z IFA. Od zwierz at pobierano krew do pomiaru miana w 4-7 dni po ka zdej z immunizacji zaczynaj ac po drugiej dawce. Od zwierz at z zestawu trzech grup, immuni- zowanych 11, 33 lub 300 µg antygenu, dodatkowo pobierano krew z oko lo miesi ecznymi przerwami przez 4 miesi ace po czwartej immunizacji w celu monitorowania zaniku odpowiedzi przeciwcia l w ró z- nym zakresie dawek szczepionki. Zwierz etom tym wykonano pi at a dodatkow a immunizacj e w 7 mie- siecy po rozpocz eciu badania. Zwierz eta u smiercono tydzie n pó zniej celem zmierzenia odpowiedzi przeciwcia l na AN1792 i przeprowadzenia analizy toksykologicznej.PL 203 431 B1 19 Przy dawkach od 300 do 3,7 µg obserwowano obni zaj ac a si e odpowied z na dawk e, a przy dwóch ni zszych dawkach nie obserwowano odpowiedzi. Srednie warto sci miana przeciwcia l wynosi ly oko lo 1:1000 po trzech dawkach i oko lo 1:10000 po czterech dawkach 11-300 µg antygenu (patrz fig. 5). Miana przeciwcia l znacznie wzrasta ly po trzeciej immunizacji dla wszystkich grup, z wyj atkiem grupy najni zszej dawki, ze wzrostem GMT w zakresie od 5 do 25 razy. Niskie odpowiedzi przeciwcia l wykryto wtedy nawet u biorców dawek 0,4 µg. Grupy 1,2 i 3,7 µg mialy porównywalne miana z GMT oko lo 1000, a cztery najwy zsze dawki zgrupowa ly si e razem z GMT oko lo 25000, z wyj atkiem grupy dawki 33 µg z ni zsz a GMT wynosz ac a 3000. Po czwartej immunizacji wzrost miana by l bardziej umiarkowany dla wszystkich grup. Zaobserwowano wyra zn a odpowied z na dawk e w grupach ni zszych dawek antygenu od 0,14 µg do 11 µg, wynosz ac a od niewykrywalnych przeciwcia l dla biorców 0,14 µg do GMT 36000 dla biorców 11 µg. Ponownie miana czterech najwy zszych grup od 11 do 300 µg zgrupowa ly si e razem. Zatem przez dwie kolejne immunizacje miano przeciwcia l zale za lo od dawki antygenu w szerokim zakresie od 0,4 do 300 µg. Po trzeciej immunizacji miana z grup najwy zszych czterech dawek by ly porównywalne i pozosta ly jako plateau po dodatkowej immunizacji. Miesi ac po czwartej immunizacji miana by ly 2- do 3-krotnie wy zsze w grupie 300 µg ni z miana zmierzone w krwi pobranej 5 dni po immunizacji (fig. 6). Obserwacja ta sugeruje, ze szczytowa anamnestyczna odpowied z przeciwcia l wyst api la pó zniej ni z 5 dni po immunizacji. Mniejszy (50%) wzrost obserwowano w tym czasie dla grupy 33 µg. W grupie dawki 300 µg po dwóch miesi acach od ostatniej dawki GMT obni zy la si e stopniowo o oko lo 70%. Po kolejnym miesi acu miano przeciwcia l spada lo mniej gwa ltownie, o 45% (100 µg) i oko lo 14% dla 33 i 11 µg dawek. Zatem szybko sc obni za- nia miana przeciwcia l w kr azeniu po zaprzestaniu immunizacji jest dwufazowa z gwa ltownym spad- kiem w pierwszym miesi acu po szczytowej odpowiedzi, po którym nast epuje lagodniejszy spadek. Miana przeciwcia l i kinetyka odpowiedzi tych myszy Swiss Webster by la podobna jak u m lo- dych, heterozygotycznych, transgenicznych myszy PDAPP, immunizowanych w podobny sposób. Dawki skuteczne w wywo lywaniu odpowiedzi immunologicznej u ludzi s a zazwyczaj podobne do da- wek skutecznych u myszy. III. Poszukiwanie srodków skutecznych leczniczo przeciw wyst epuj acej AD Test ten zaprojektowano w celu przebadania srodków immunogennych pod wzgl edem aktyw- no sci w zatrzymywaniu lub odwracaniu charakterystyki neuropatologicznej AD u starych myszy. Immunizacje A ß o d lugo sci 42 aminokwasów (AN1792) zacz eto w punkcie czasowym, w którym p lytki amyloidowe by ly ju z obecne w mózgach myszy PDAPP. Z up lywem czasu w badaniu u nieleczonych myszy PDAPP rozwin elo si e wiele zmian neurode- generacyjnych przypominaj acych wyst epuj ace w AD (Games i inni, supra, oraz Johnson-Wood i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). Odk ladanie A ß w p lytkach amyloidowych jest zwi a- zane z degeneracyjn a odpowiedzi a neuronaln a, obejmuj ac a niew la sciwe elementy aksonalne i dendrytyczne, nazywane dystroficznymi neurytami. Z logi amyloidowe otoczone przez i zawieraj ace dystroficzne neuryty nazywane s a p lytkami neurytycznymi. Zarówno u myszy AD, jak i u myszy PDAPP, neuryty dystroficzne maj a wyró zniaj ace si e struktury globularne, s a immunoreaktywne z zespo lem przeciwcia l rozpoznaj acych APP i sk ladniki cytoszkieletu i wykazuj a z lo zone, wewn atrz- komórkowe zmiany degeneracyjne na poziomie ultrastrukturalnym. Charakterystyki te pozwalaj a na istotne dla choroby, wybiórcze i powtarzalne pomiary tworzenia p lytek neurytycznych w mózgach PDAPP. Dystroficzny sk ladnik neuronalny p lytek neurytycznych PDAPP latwo jest uwidoczni c przy pomocy przeciwcia l specyficznych dla ludzkiego APP (mA ß 8E5) i latwo jest go zmierzy c przy pomocy komputerowo wspomaganej analizy obrazu. Zatem dodatkowo poza pomiarem dzia lania AN1792 na tworzenie p lytek amyloidowych monitorowano wp lyw tego leczenia na rozwój dystrofii neurytycznej. Astrocyty i mikroglej stanowi a nieneuronalne komórki odpowiadaj ace na i odzwierciedlaj ace stopie n uszkodzenia neuronalnego. W AD cz esto obserwuje si e astrocyty GFAP-dodatnie i MHC II-dodatni mikroglej, a ich aktywacja zwieksza si e z ostro scia choroby. Zatem monitorowano tak ze rozwój reaktywnych astrocytów i mikroglejozy u myszy leczonych AN1792. A. Materia ly i metody Czterdzie sci osiem heterozygotycznych samic myszy PDAPP w wieku 11 do 11,5 miesi ecy, otrzymanych z Charles River, losowo podzielono na dwie grupy: 24 myszy immunizowano 100 µg AN1792, a 24 immmunizowano PBS, w ka zdym przypadku w po laczeniu z adiuwantem Freunda. Grupy AN1792 i PBS powtórnie podzielono w wieku oko lo 15 miesi ecy. W wieku 15 miesi ecy zwierz e- ta z oko lo po lowy z ka zdej z grup AN1792 i PBS u smiercono (odpowiednio n=10 i 9), a pozosta le nadal otrzymywa ly immunizacje a z do ko nca w wieku oko lo 18 miesi ecy (odpowiednio n=9 i 12).PL 203 431 B1 20 W czasie bada n zdech lo 8 zwierz at (5 AN1792, 3 PBS). Ponadto, poza immunizowanymi zwierz etami, do do swiadczenia w laczono nieleczone myszy PDAPP jednoroczne (n=10), 15-miesieczne (n=10) i 18-miesi eczne (n=10) dla porównania w testach ELISA pomiarów poziomu a ß i APP w mózgach; dodatkowo zwierz eta jednoroczne w laczono do analizy immunohistochemicznej. Metodologia by la taka jak w przyk ladzie 1, z wyj atkiem przypadków, gdy wskazano inaczej. Do przygotowania antygenu do 6 immunizacji, podawanych przed 15 miesi acem, zastosowano AN1792 z US Peptides seria 12 i California Peptides seria ME0339. Do 3 dodatkowych immunizacji podawanych pomi edzy 15 a 18 miesi acem zastosowano California Peptides serie ME0339 i ME0439. Do immunizacji zemulgowano 100 µg AN1792 w 200 µl PBS, lub samej PBS, w stosunku 1:1 z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) lub niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA) lub PBS w ko ncowej obj eto sci 400 µl. Pierwsz a immunizacj e wykonano z CFA jako adiuwantem, nast epne 4 dawki podano z IFA, a ko ncowe 4 dawki z sam a PBS bez dodatku adiuwanta. Lacznie wykonano 9 immunizacji w okresie 7 miesi ecy z dwutygodniowymi przerwami dla pierwszych 3 dawek, a nast epnie z czterotygodniowymi przerwami dla pozosta lych dawek. Grupie leczonej przez 4 miesi ace, u smierco- nej w wieku 15 miesi ecy, wykonano tylko pierwszych 6 immunizacji. B. Wyniki Wp lyw leczenia AN1792 na obci azenie amyloidem Wyniki leczenia AN1792 na obci azenie kory amyloidem oznaczone metod a ilo sciowej analizy obrazu, przedstawiono na fig. 7. Wartosc mediany dla obciazenia amyloidem kory wynosi la 0,28% w grupie nieleczonych 12-miesi ecznych myszy PDAPP, która to warto sc odpowiada la obciazeniu p lyt- kami u myszy na pocz atku badania. W wieku 18 miesi ecy obci azenie amyloidem wzros lo ponad 17-krotnie do 4,87% w myszach leczonych PBS, podczas gdy myszy leczone AN1792 mia ly znacznie obni zone obciazenie amyloidem wynosz ace 0,01%, znacz aco mniej ni z 12-miesi eczne nieleczone myszy i grupy 15- i 18-miesi eczne leczone PBS. Obci azenie amyloidem by lo znacznie obni zone u biorców AN1792 zarówno w 15 (96% zmniejszenia, p=0,003) i 18 (99% zmniejszenia, p=0,0002) miesi acu. Zazwyczaj z logi amyloidowe w korze myszy PDAPP zaczyna ly si e w korze czo lowej i poza- modzelowatej (RSC), post epowa ly w kierunku brzuszno-bocznym i obejmowa ly kor e skroniow a i w e- chow a (EC). Znaleziono niewiele lub wcale nie znaleziono amyloidu znaleziono w EC myszy 12-mie- siecznych, tj. w wieku oko lo którego podano pierwsz a dawk e AN1792. Po 4 miesi acach leczenia AN1792 z logi amyloidowe znacznie zmala ly w RSC, a post epuj acy udzia l EC zosta l ca lkowicie wyeli- minowany przez leczenie AN1792. Ostatnia obserwacja pokaza la, ze AN1792 ca lkowicie zatrzyma l post epowanie amyloidu, który normalnie zaatakowa lby kor e skroniow a i w echow a, a tak ze zatrzyma l i ewentualnie cofn al odk lanianie w RSC. Znacz ace dzia lanie leczenia AN1792 na rozwój obci azenia kory amyloidem u myszy PDAPP pokazano dla grupy 18-miesi ecznej, któr a leczono przez 7 miesi ecy. Stwierdzono prawie ca lkowity brak amyloidu w korze u myszy leczonych AN1792, z ca lkowitym brakiem rozproszonych p lytek, a tak ze zmniejszeniem litych z logów. 2. Zmiany komórkowe i morfologiczne towarzysz ace leczeniu AN1792. Populacj e komórek A ß-dodatnich znaleziono w regionach mózgu zazwyczaj zawieraj acych z logi amyloidowe. Znacz ace by lo to, ze w kilku mózgach biorców AN1792 znaleziono bardzo niewiele ko- rowych p lytek amyloidowych lub nie znaleziono ich wcale. Wi ekszo sc immunoreaktywno sci A ß okaza- la si e by c zwi azana z komórkami o du zym, p latkowym lub pozlepianym ciele. Fenotypowo komórki te przypomina ly aktywowany mikroglej lub monocyty. By ly one immunoreaktywne z przeciwcia lami roz- poznaj acymi ligandy eksprymowane przez aktywowane monocyty i mikroglej (MHC II i CD11b), a czasami by ly zwi azane ze scian a lub swiat lem naczy n krwiono snych. Porównanie blisko s asiaduj a- cych fragmentów znakowanych przeciwcia lami specyficznymi dla A ß i MHC II ujawni lo, ze podobne wzory tych komórek by ly rozpoznawane przez obydwie klasy przeciwcia l. Szczegó lowe badanie mó- zgów myszy leczonych AN1792 ujawni lo, ze MHC II-dodatnie komórki by ly ograniczone do s asiedztwa ograniczonego amyloidu pozostaj acego u tych zwierz at. W zastosowanych warunkach utrwalania komórki nie by ly immunoreaktywne z przeciwcia lami rozpoznaj acymi ligandy komórek T (CD3, CD3e) lub B (CD45RA, CD45RB) lub zwyk ly antygen leukocytowy (CD45), ale by ly reaktywne z przeciwcia- lami rozpoznaj acymi leukosialin e (CD43), która reaguje krzy zowo z monocyctami. Nie znaleziono takich komórek u zadnej z myszy leczonych PBS. U myszy PDAPP niezmiennie rozwija ly si e ciezkie z logi amyloidowe w zewn etrznej warstwie cz asteczkowej hipokampowego zakr etu z ebatego. Z logi tworzy ly wyra zn a smug e w obr ebie scie zkiPL 203 431 B1 21 perforacji, regionu zazwyczaj zawieraj acego p lytki amyloidowe w AD. Charakterystyczne wyst epowa- nie tych z logów u myszy leczonych PBS przypomina lo wcze sniej scharakteryzowane u nieleczonych myszy PDAPP. Z logi amyloidowe sk lada ly si e z zarówno rozproszonych, jak i z litych p lytek w ci ag lym pa smie. Natomiast w wielu mózgach myszy leczonych AN1792 wzór ten by l znacznie zmieniony. Z logi amyloidowe w hipokampie nie zawiera ly rozproszonego amyloidu i wzór pasmowy by l cz esciowo zniszczony. Zamiast tego wyst epowa lo wiele niezwyk lych struktur nakrapianych, reagujacych z prze- ciwcia lami przeciw-A ß, z których kilka okaza lo si e komórkami zawieraj acymi amyloid. Komórki MHC II-dodatnie cz esto obserwowano w s asiedztwie amyloidu zewn atrzkomórkowego u zwierz at leczonych AN1792. Wzór zwi azania komórek A ß-dodatnich z amyloidem by l bardzo podob- ny w kilku mózgach myszy leczonych AN1792. Rozmieszczenie tych komórek monocytów by lo ogra- niczone do s asiedztwa z logów amyloidowych i by lo ca lkowicie nieobecne w innych regionach mózgu pozbawionych p lytek A ß. Ilo sciowa analiza obrazu fragmentów znakowanych MHC II i MAC I wykaza la tendencj e w kie- runku zwi ekszonej reaktywno sci w RSC i hipokampie u myszy leczonych AN1792, w porównaniu z grup a PBS, która osi agn ela wartosc znacz ac a dla pomiarów reaktywno sci MAC 1 w hipokampie. Wyniki te wskazuj a na aktywne, kierowane przez komórki, usuwanie amyloidu w regionach mó- zgu, w których wyst epuj a p lytki. 3. Dzia lanie AN1792 na poziomy A ß: oznaczenia ELISA. (a) Poziomy korowe U nieleczonych myszy PDAPP poziom mediany ca lkowitego A ß w korze w wieku 12 miesi ecy wynosila 1600 ng/g, w wieku 15 miesi ecy wzros la do 8700 ng/g (tabela 2). W wieku 18 miesi ecy war- tosc wynosi la 22000 ng/g, co oznacza, ze wzros la ponad 10-krotnie podczas do swiadczenia. Zwierz e- ta leczone PBS mia ly 8600 ng/g ca lkowitego A ß w wieku 15 miesi ecy, która to warto sc wzros la do 19000 ng/g w 18 miesi acu. W porównaniu z tym, zwierz eta leczone AN1792 mia ly 81% mniej ca lkowi- tego A ß w wieku 15 miesi ecy (1600 ng/g) ni z grupa immunizowana PBS. Znacz aco mniej (0=0,0001) ca lkowitego A ß (5200 ng/g) znaleziono w 18 miesi acu porównuj ac grupy AN1792 i PBS (tabela 2), co odpowiada lo 72% zmniejszeniu ilo sci A ß, który by normalnie wyst epowa l. Podobne wyniki uzyskano porównuj ac korowe poziomy A ß42, gdy z stwierdzono, ze grupa leczona AN1792 zawiera la znacznie mniej A ß42, ale w tym wypadku ró znice pomi edzy grupami AN1792 i PBS by ly znacz ace zarówno w 15 (p=0,04), jak i 18 miesi acu (p=0,0001, tabela 2). T a b e l a 2 Poziomy mediany A ß (ng/g) w korze Nieleczone PBS AN1792 Wiek Ca lkowity A ß Aß42 (n) Ca lkowity A ß Aß42 (n) Ca lkowity A ß A ß42 (n) 12 1600 1300 (10) 15 8700 8300 (10) 8600 7200 (9) 1600 1300* (10) 18 22200 18500 (10) 19000 15900 (12) 5200** 4000** (9) *p = 0,0412 **p = 0,0001 (b) Poziomy w hipokampie U nieleczonych myszy PDAPP poziomy mediany w hipokampie ca lkowitego A ß w wieku 12 mie- siecy wynosi ly 15000 ng/g, która to wartosc wzros la do 51000 ng/g w wieku 15 miesi ecy i dalej wzra- stala osi agaj ac 81000 ng/g w wieku 18 miesi ecy (tabela 3). Podobnie myszy immunizowane PBS mia- ly 40000 ng/g i 65000 ng/g odpowiednio w wieku 15 i 18 miesi ecy. U zwierz at leczonych AN1792 stwierdzono mniejsz a ca lkowit a ilo sc A ß, to znaczy 25000 ng/g i 51000 ng/g odpowiednio w wieku 15 i 18 miesi ecy. Warto sc dla grupy leczonej AN1792 w wieku 18 miesi ecy by la znacz aco ni zsza ni z dla grupy leczonej PBS (p=0,0105; tabela 3). Pomiary A ß42 da ly ten sam uk lad wyników, to znaczy po- ziomy u grupy leczonej AN1792 by ly znacz aco ni zsze ni z u grupy leczonej PBS (odpowiednio 39000 ng/g wobec 57000 ng/g; p=0,0022) w wieku 18 miesi ecy (tabela 3).PL 203 431 B1 22 T a b e l a 3 Poziomy mediany A ß (ng/g) w hipokampie Nieleczone PBS AN1792 Wiek Ca lkowity A ß A ß42 (n) Ca lkowity A ß Aß42 (n) Ca lkowity A ß A ß42 (n) 12 15500 11100 (10) 15 51500 44400 (10) 40100 35700 (9) 24500 22100 (10) 18 80800 64200 (10) 65400 57100 (12) 50900* 38900** (9) *p = 0,0105 **p = 0, 0022 (c) Poziomy w mó zd zku U 12 miesi ecznych nieleczonych myszy PDAPP mediana poziomu ca lkowitego A ß wynosi la 15 ng/g (tabela 4). W wieku 15 miesi ecy mediana ta wzros la do 28 ng/g, a w wieku 18 miesi ecy do 35 ng/g. U zwierz at leczonych PBS warto sci mediany ca lkowitego A ß wynosi ly 21 ng/g w wieku 15 miesi ecy i 43 ng/g w wieku 18 miesi ecy. U zwierz at leczonych AN1792 znaleziono 22 ng/g ca lkowite- go A ß w wieku 15 miesi ecy i znacz aco mniej (p=0,002) ca lkowitego A ß w wieku 18 miesi ecy (25 ng/g), ni z w odpowiadaj acej im grupie PBS (tabela 4). T a b e l a 4 Srednie poziomy A ß (ng/g) w mó zd zku Nieleczone PBS AN1792 Wiek (miesi ace) Ca lkowity A ß (n) Ca lkowity A ß (n) Ca lkowity A ß (n) 12 15,6 (10) 15 27,7 (10) 20,8 (9) 21,7 (10) 18 35,0 (10) 43,1 (12) 24,8* (9) *p=0,0018 4. Wp lyw leczenia AN1792 na poziomy APP APP- a oraz pe lnej d lugo sci cz asteczka APP zawieraj a ca lo sc lub cz esc sekwencji A ß, a zatem mo ze na nie potencjalnie wp lywa c wytworzenie odpowiedzi immunologicznej kierowanej przez AN1792. W dotychczasowych badaniach stwierdzono niewielki wzrost poziomów APP wraz ze wzro- stem neuropatologii u myszy PDAPP. W korze podczas leczenia poziomy zarówno APP- a/FL (pe lnej d lugo sci), jak i APP- a pozosta ly zasadniczo bez zmian, z wyj atkiem tego, ze poziom APP- a by l zmniejszony o 19% u myszy w wieku 18 miesi ecy w grupie leczonej AN1792 wobec grupy leczo- nej PBS. Warto sci APP u 18 miesi ecznych zwierz at z grupy AN1792 nie ró zni ly si e znacz aco od tych warto sci dla zwierz at 12- i 15-miesi ecznych nieleczonych oraz 15-miesi ecznych leczonych PBS. We wszystkich przypadkach warto sci APP utrzymywa ly si e w zakresie normalnie wyst epuj acym u myszy PDAPP. 5. Dzia lanie leczenia AN1792 na patologi e neurodegeneracyjn a i glejow a. Obci azenie p lytkami neurytycznymi by lo znacz aco zmniejszone w korze czo lowej u myszy le- czonych AN1792 w porównaniu z grup a leczon a PBS zarówno w wieku 15 (84%; p=0,03) jak i 18 mie- siecy (55%; p=0,01) (fig. 8). Warto sci mediany obci azenia p lytkami neurytycznymi wzros ly od 0,32% do 0,49% w grupie PBS pomi edzy 15, a 18 miesi acem zycia. W odró znieniu od tego, rozwój p lytek neurytycznych w grupie leczonej AN1792 by l znacznie zmniejszony, z warto sciami mediany obci aze- nia p lytkami neurytycznymi wynosz acymi 0,05% i 0,22% odpowiednio dla wieku 15 i 18 miesi ecy. Immunizacje AN1792 wydawa ly si e by c dobrze tolerowane, reaktywna astrocytoza tak ze zmala- la znacz aco w RSC u myszy leczonych AN1792 w porównaniu z grup a leczon a PBS zarówno w wieku 15 (56%; p=0,011), jak i 18 miesi ecy (39%; p=0,028) (fig. 9). Warto sci mediany procentu astrocytozy w grupie PBS wzros ly pomi edzy 15 a 18 miesi acem od 4,26% do 5,21%. Leczenie AN1792 przyt lumi- lo rozwój astrocytozy w obu punktach czasowych odpowiednio do 1,89% i 3,2%. Sugeruje to, ze neu- ropil nie by l niszczony przez proces klirensu.PL 203 431 B1 23 6. Odpowiedzi przeciwcia l Jak opisano powy zej, 11-miesi eczne, heterozygotyczne myszy PDAPP (n=24) otrzyma ly seri e 5 immunizacji, 100 µg AN1792 zemulgowanymi z adiuwantem Freunda, podawanych dootrzewnowo w tygodniach 0, 2, 4, 8 i 12, a szóst a immunizacj e wykonano sam a PBS (bez adiuwanta Freunda) w 16 tygodniu. Jako kontrole negatywne przygotowano zestaw dobranych wiekowo 24 myszy, które immu- nizowano PBS zemulgowan a z tymi samymi adiuwantami i podawano w takim samym harmonogra- mie. Od zwierz at pobierano krew 3-7 dni po ka zdej immunizacji zaczynaj ac od drugiej dawki. Odpowiedzi przeciwcia l na AN1792 zmierzono metod a ELISA. Srednie geometryczne mian (GMT) dla zwierz at immunizowanych AN1792 wynosi ly oko lo 1900, 7600 i 45000 odpowiednio po drugiej, trze- ciej i ostatniej (szóstej) dawce. Po szóstej immunizacji nie stwierdzono specyficznych dla A ß przeciw- cia l u zwierz at kontrolnych. Oko lo po low e zwierz at leczono przez kolejne 3 miesi ace, immunizuj ac je oko lo 20, 24 i 27 tygo- dnia. Ka zd a z dawek podawano w pod lozu sam a PBS, bez adiuwanta Freunda. Srednie miana prze- ciwcia l nie zmieni ly si e przez ten czas. W rzeczywisto sci miana przeciwcia l pozosta ly stabilne w okre- sie od czwartego do ósmego pobrania krwi odpowiadaj acym okresowi od pi atej do dziewi atej iniekcji. Aby stwierdzi c, czy przeciwcia la specyficzne dla A ß, wytworzone przez immunizacje, które wy- kryto w surowicy u myszy leczonych AN1792, tak ze by ly zwi azane z amyloidem od lo zonym w mózgu, zestaw preparatów histologicznych z myszy leczonych AN1792 i PBS poddano dzia laniu przeciwcia l specyficznych dla mysich IgG. W odró znieniu od grupy PBS, p lytki A ß w mózgach myszy leczonych AN1792 by ly pokryte endogennymi IgG. T e ró znic e pomi edzy oboma grupami zaobserwowano za- równo dla myszy w wieku 15, jak i 18 miesi ecy. Szczególnie ra zacy by l brak znakowania w grupie PBS, pomimo obecno sci du zego obciazenia amyloidem u tych myszy. Wyniki te pokazuj a, ze immuni- zacja syntetycznym bia lkiem A ß wytwarza przeciwcia la rozpoznaj ace i wiaz ace si e in vivo z A ß w p lytkach amyloidowych. 7. Komórkowe odpowiedzi immunologiczne Z dziewi eciu myszy immunizowanych AN1792 i 12 immunizowanych PBS myszy PDAPP w wieku 18 miesi ecy pobrano sledziony w 7 dni po dziewi atej immunizacji. Wyizolowano limfocyty sledziony i hodowano je przez 72 godziny w obecno sci A ß40, A ß42 lub A ß40-1 (bia lko o odwrotnej sekwencji). Mitogen Con A pos lu zy l jako kontrola pozytywna. Optymalne odpowiedzi uzyskano stosu- jac 1,7 µM bia lko. Komórki ze wszystkich dziewi eciu myszy leczonych AN1792 proliferowa ly w od- powiedzi na bia lka A ß1-40 lub A ß1-42, z równym poziomem inkorporacji obu bia lek (fig. 10, górny wykres). Nie stwierdzono odpowiedzi na bia lko o odwrotnej sekwencji A ß40-1. Komórki ze zwierz at kontrolnych nie odpowiada ly na którekolwiek z bia lek A ß (fig. 10, dolny wykres). C. Wnioski Wyniki tego badania wykaza ly, ze immunizacja AN1792 myszy PDAPP maj acych z logi amylo- idowe spowalnia post epuj ace odk ladanie amyloidu i zapobiega mu, oraz hamuje wyst epuj ace w kon- sekwencji zmiany neuropatologiczne w mózgach starych myszy PDAPP. Immunizacje AN1792 zna- cz aco hamuj a rozwój amyloidu w strukturach, które normalnie ulegaj a amyloidozie. Zatem podawanie peptydu A ß ma pozytywne dzia lanie w leczeniu AD. VI. Poszukiwanie fragmentów A ß 100 myszy PDAPP w wieku 9-11 miesi ecy immunizowano dziewi ecioma ró znymi regionami APP i A ß w celu oznaczenia, które epitopy uczestnicz a w odpowiedzi. Dziewi ec ró znych immunoge- nów oraz jeden kontrolny podano i.p., jak opisano powy zej. Immunogeny zawiera ly 4 koniugaty ludz- kich peptydów A ß 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, wszystkie po laczone przez lacznik cysteinowy z owczymi przeciwcia lami przeciwmysiej IgG, polipeptyd APP aminokwasy 592-695, zagregowany ludzki A ß1-40, zagregowany ludzki A ß25-35 oraz zagregowany A ß42 z gryzoni. Zagregowany A ß42 i PBS zastoso- wano jako kontrole. Na ka zd a z grup leczniczych przypada lo 10 myszy. Miana monitorowano jak wy- zej, a myszy u smiercano na koniec 4-miesi ecznych immunizacji. Po smierci oznaczono histochemi e, poziomy A ß oraz toksykologi e. A. Materia ly i metody 1. Przygotowanie immunogenów Przygotowanie sprz ezonych peptydów A ß: 4 koniugaty ludzkich peptydów A ß (aminokwasy 1-5, 1-12, 13-28 i 33-42, ka zdy po laczony z owczymi przeciwcia lami przeciwmysiej IgG) przygotowano sprz egaj ac przez cystein e sztucznie dodan a do peptydu A ß przy pomocy srodka sieciuj acego sulfo- EMCS. Pochodne peptydu A ß zsyntetyzowano z nast epuj acymi ko ncowymi sekwencjami aminokwa- sowymi. W ka zdym przypadku umiejscowienie wstawionej cysteiny wskazano przez podkre slenie.PL 203 431 B1 24 Pochodna peptydu A ß13-28 mia la równie z, jak wskazano, dodane dwie glicyny przed C-ko ncow a cystein a. peptyd A ß1-12 NH 2 -DAEFRHDSGYEVC COOH peptyd A ß1-5 NH 2 -DAEFRC COOH peptyd A ß33-42 NH 2 -C-kwas aminoheptanowy-GLMVGGVVIA COOH peptyd A ß13-28 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH W celu przygotowania do reakcji sprz egania 10 mg owczych przeciwcia l przeciwmysiej IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) dializowano przez noc wobec 10 mM buforu boranu sodu, pH 8,5. Nast epnie oddializowane przeciwcia la zag eszczono do obj eto sci 2 ml z u zyciem rurki Ami- con Centriprep. Dziesiec mg sulfo-EMCS [N( e-maleimidokuproiloksy)-sukcynimidu] (Molecular Sciences Co.) rozpuszczono w 1 ml dejonizowanej wody. Czterdziestokrotny cz asteczkowy nadmiar sulfo-EMCS wkroplono w trakcie mieszania do owczego przeciwcia la przeciwmysiej IgG, a nast ep- nie roztwór mieszano nadal przez kolejnych 10 minut. Aktywowane owcze przeciwcia la przeciwmy- siej IgG oczyszczono i wymieniono bufor przez przepuszczanie przez 10 ml kolumn e do filtracji ze- lowej (Pierce Presto Column, uzyskana z Pierce Chemicals) równowazon a 0,1 M NaPO 4 , 5 mM EDTA, pH 6,5. Frakcje zawieraj ace przeciwcia la, zidentyfikowane przez pomiar absorbancji przy 280 nm, po laczono i rozcie nczono do stezenia oko lo 1 mg/ml, z u zyciem 1,4 mg na OD jako wspó l- czynnik ekstynkcji. Czterdziestokrotny nadmiar cz asteczkowy peptydu A ß rozpuszczono w 20 ml 10 mM NaPO 4 , pH 8,0, z wyj atkiem peptydu A ß33-42, którego 10 mg najpierw rozpuszczono w 0,5 ml DMSO, a nast epnie rozcie nczono do 20 ml 10 mM buforem NaPO 4 . Ka zdy z roztworów peptydów dodano do 10 ml aktywowanych owczych przeciwcia l przeciwmysiej IgG i ko lysano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Powsta le koniugaty zag eszczono do ko ncowej obj eto sci poni zej 10 ml z u zyciem rurki Amicon Centriprep, a nast epnie dializowano wobec buforu PBS, aby wymieni c bufor i usun ac wolne peptydy. Koniugaty przepuszczono przez filtry o srednicy porów 0,22 µ w celu wyja- lowienia, a nast epnie podzielono na równe frakcje po 1 mg i przechowywano zamro zone w -20°C. St ezenia koniugatów oznaczono z u zyciem bia lkowego testu BSA (Pierce Chemicals) z ko nsk a IgG jako krzyw a standardow a. Sprz ezenie zosta lo potwierdzone przez wzrost masy cz asteczkowej sprz ezonych peptydów w porównaniu z aktywowanymi przeciwcia lami przeciwmysiej IgG. Preparat koniugatu A ß1-5 z owczym przeciwcia lem przeciwmysiej IgG zawiera l po laczone koniugaty z dwóch reakcji sprz egania, reszta stanowi la pojedynczy preparat. 2. Przygotowanie zagregowanych peptydów A ß Peptydy ludzki 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., seria ME0541), ludzki 1-42 (AN1792; California Peptides Inc., serie ME0339 i ME0439), ludzki 25-35 i z gryzoni 1-42 (California Peptides Inc., seria ME0218) swie zo solubilizowano do przygotowania ka zdego z zestawu zastrzyków z liofi- lizowanych proszków, które przechowywano wysuszone w -20°C. W tym celu 2 mg peptydu dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mieszanin e zworteksowano aby wytworzy c wzgl ednie jednorodny roztwór lub zawiesin e. Z czterech peptydów jedynym rozpuszczalnym na tym etapie by l AN1528. Nast epnie dodano równe obj eto sci po 100 µl 10x PBS (1x PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5) i wtedy AN1528 zaczal si e wytr aca c. Zawiesin e ponownie zworteksowano i inkubowano przez noc w 37°C do zastosowania nast epnego dnia. Przygotowanie bia lka pBx6: Plazmid ekspresyjny koduj acy pBx6, bia lko fuzyjne sk ladaj ace si e z 100 aminokwasowej N-ko ncowej sekwencji liderowej z polimerazy bakteriofaga MS-2 oraz amino- kwasów 592-695 z APP ( ßAPP) skonstruowano w sposób opisany w Oltersdorf i inni, J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Plazmid transfekowano do E. coli i bia lko wyeksprymowano po indukcji pro- motora. Bakterie zlizowano w 8M moczniku i pBx6 czesciowo oczyszczono metod a preperatywnej SDS PAGE. Frakcje zawieraj ace pBx6 zidentyfikowano metod a Western blot u zywaj ac króliczych przeciwcia l poliklonalnych przeciw pBx6, zebrano, zag eszczono za pomoc a rurki Amicon Centriprep i dializowano wobec PBS. Czystosc preparatu, oznaczona przez wybarwienie Coomassie Blue SDS PAGE, wynosi la oko lo 5 do 10%. B. Wyniki i ich omówienie 1. Projekt bada n Sto samic i samców, w wieku od 9 do 11 miesi ecy heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP uzyskano z Charles River Laboratory i Taconic Laboratory. Myszy podzielono na 10 grup do immunizacji ró znymi regionami A ß lub APP razem z adiuwantem Freunda. Zwierz eta podzielono tak by dobra c p le c, wiek, rodziców oraz zród lo w obr ebie grupy tak blisko jak to by lo mo zliwe. Immunoge- ny obejmowa ly 4 peptydy A ß wyprowadzone z ludzkiej sekwencji, 1-5, 1-12, 13-28 i 33-42, ka zdyPL 203 431 B1 25 sprz ezony z owczym przeciwcia lem przeciw mysiej IgG; 4 zagregowane peptydy A ß, ludzki 1-40 (AN1528), ludzki 1-42 (AN1792), ludzki 25-35 i z gryzoni 1-42; oraz fuzyjny polipeptyd nazwany pBx6, zawieraj acy aminokwasy APP 592-695. Dziesi at a grup e immunizowano PBS w po laczeniu z adiuwan- tem jako kontrol a. Do ka zdej immunizacji zemulgowano 100 µg ka zdego z peptydów A ß w 200 µl PBS lub 200 µg pBx6 pochodnej APP w tej samej obj eto sci PBS, lub sam a PBS w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w ko ncowej obj eto sci 400 µl do pierwszej immunizacji, po czym stosowa- no dawki przypominaj ace z t a sam a ilo sci a immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) w kolejnych czterech dawkach i PBS do ko ncowej dawki. Immunizacje stosowano sródotrzewnowo w trybie dwutygodniowym przez 3 pierwsze dawki, a nast epnie w trybie miesi ecznym. Od zwierz at pobierano krew w 4-7 dni po ka zdej immunizacji, zaczynaj ac od drugiej dawki, do pomiarów miana przeciwcia l. Zwierz eta u smiercono oko lo tydzie n po ko ncowej dawce. 2. Poziomy A ß i APP w mózgu Po 4 miesi acach immunizacji ró znymi peptydami A ß lub pochodn a APP ze zwierz at perfundo- wanych sol a usuni eto mózgi. Jedn a pó lkule wypreparowano do analizy immunohistochemicznej, a drug a u zyto do oznaczenia poziomów A ß i APP. Aby zmierzy c stezenie ró znych postaci peptydu ß-amyloidowego i bia lka prekursorowego amyloidu, pó lkul e poci eto na cz esci i przygotowano homo- genaty regionów hipokampu, kory i mó zd zka w 5 M guanidynie. Rozcie nczono je i oznaczono poziom amyloidu lub APP, porównuj ac do serii rozcie ncze n wzorców peptydu A ß lub APP o znanych st eze- niach, w formacie ELISA. Srednie stezenie ca lkowitego A ß dla grup kontrolnych immunizowanych PBS by la 5,8-raza wi eksza w hipokampie ni z w korze (mediana 24318 ng/g tkanki hipokampa w porównaniu do 4221 ng/g kory). Poziom mediany w mó zd zku grupy kontrolnej (23,4 ng/g tkanki) by l oko lo 1000-razy ni zszy ni z w hipokampie. Poziomy te by ly podobne do wcze sniej opisanych dla heterozygotycznych transgenicz- nych myszy PDAPP w tym wieku (Johnson-Woods i inni, 1997, supra). Dla kory, zestawy grup leczniczych mia ly srednie ca lkowite poziomy A ß i A ß1-42 znacznie ró z- ni ace si e od grupy kontrolnej (p<0,05), zwierz eta otrzymuj ace peptydy AN1792, gryzoni A ß1-42 lub koniugat A ß1-5 przedstawiono na fig. 11. Poziomy mediany ca lkowitego A ß zmniejszy ly si e odpowied- nio o 75%, 79% i 61% w porównaniu z kontrol a dla tych grup leczniczych. Nie stwierdzono dostrze- galnych wspó lzale zno sci pomi edzy mianami przeciwcia l specyficznych dla A ß i poziomami A ß w re- gionie korowym mózgu dla jakiejkolwiek z tych grup. W hipokampie srednie zmniejszenie ca lkowitej ilo sci A ß towarzysz ace leczeniu AN1792 (46%, p=0,0543) nie by la tak du za jak obserwowana w korze (75%, p=0,0021). Jednak ze stopie n zmniej- szenia by l znacznie wy zszy w hipokampie ni z w korze, zmniejszenie netto wynosi lo 11186 ng/g tkanki w hipokampie wobec 3171 ng/g tkanki w korze. Dla grup zwierz at otrzymuj acych A ß1-42 z gryzoni lub A ß1-5 srednie ca lkowitych poziomów A ß zmniejszy ly si e odpowiednio o 36% i 26%. Jednak ze, bior ac pod uwag e fakt, ze grupy by ly ma le oraz ze wzgl edu na zmienno sc poziomów peptydu amyloidowego u poszczególnych zwierz at w grupie, zmiany te nie by ly znacz ace. Przy po- miarach A ß1-42 w hipokampie zadna ze zmian wywo lanych leczeniem nie by la znacz aca. Zatem, ze wzgl edu na ni zsze obci azenie A ß kory, zmiany w tym regionie s a znacznie czulszym wska zni- kiem skutków leczenia. Zmiany poziomów A ß zmierzone metod a ELISA w korze by ly podobne, ale nie takie same, jak wyniki analizy immunohistochemicznej (patrz poni zej). Ca lkowity A ß zmierzono tak ze w mó zd zku, regionie zazwyczaj niedotkni etym w patologii AD. Zadne ze srednich st eze n A ß jakiejkolwiek z grup immunizowanych ró znymi peptydami A ß lub po- chodn a APP nie ró zni lo si e od warto sci dla grupy kontrolnej w tym regionie mózgu. Wynik ten sugeru- je, ze leczenie nie wp lywa na niepatologiczne poziomy A ß. St ezenie APP oznaczono tak ze metod a ELISA w korze i mó zd zku z leczonych i kontrolnych zwierz at. Zastosowano dwa ró zne testy APP. Pierwszy, nazwany APP- a/FL, rozpoznaje zarówno APP- a ( a, wydzielan a posta c APP, która zosta la wzi eta w obr ebie sekwencji A ß), jak i postaci APP pe lnej d lugo sci (FL), podczas gdy drugi rozpoznaje tylko APP- a. W odró znieniu od towarzysz acego leczeniu zmniejszenia A ß w zestawie grup leczniczych, poziomy APP pozosta ly bez zmian u wszyst- kich zwierz at leczonych w porównaniu z kontrolnymi. Wyniki te wskazuja, ze immunizacje peptydami A ß nie usuwaj a APP, a skutek leczniczy jest raczej specyficzny dla A ß. W podsumowaniu, ca lkowite poziomy A ß i A ß1-42 by ly znacz aco zmniejszone w korze przez le- czenie AN1792, gryzonim A ß1-42 lub koniugatem A ß1-5. W hipokampie ca lkowity A ß by l znaczniePL 203 431 B1 26 zmniejszony tylko przez leczenie AN1792. Zadne inne zwi azane z leczeniem zmiany poziomów A ß lub APP w regionach hipokampu, kory lub mó zd zku nie by ly znacz ace. 2. Analiza histochemiczna Mózgi z podzestawu sze sciu grup przygotowano do analizy immunohistochemicznej, 3 grupy immunizowane koniugatami peptydu A ß - A ß1-5, A ß1-12 i A ß13-28; 3 grupy immunizowane agrega- tami A ß pe lnej d lugo sci - AN1792 i AN1528 oraz grup e kontroln a leczon a PBS. Wyniki analizy obrazu dla obciazenia amyloidem skrawków histologicznych mózgu z tych grup przedstawiono na fig. 12. Stwierdzono znacz ace obni zenie obciazenia amyloidem regionów korowych w 3 grupach leczniczych w stosunku do zwierz at kontrolnych. Najwi eksze obni zenie obciazenia amyloidem obserwowano w grupach otrzymuj acych AN1792, gdzie srednia warto sc by la zmniejszona o 97% (p=0,001). Znacz ace obni zenie obserwowano tak ze dla zwierz at leczonych AN1528 (95%, p=0,005) i koniugatem peptydu A ß1-5 (67%, p=0,02). Wyniki uzyskane przez pomiar ca lkowitego A ß lub A ß1-42 metod a ELISA oraz obci azenia amy- loidem metod a analizy obrazu w pewnym stopniu ró zni a si e. Leczenie AN1528 mia lo znacz acy wp lyw na poziom obciazenia amyloidem kory w pomiarach metod a ilo sciowej analizy obrazu, ale nie mia lo wp lywu na st ezenie ca lkowitego A ß zmierzone metod a ELISA w tym samym regionie. Ró znica pomi e- dzy tymi dwoma wynikami prawdopodobnie zwi azana jest ze specyfik a testów. Analiza obrazu mierzy tylko nierozpuszczalne A ß zagregowane w p lytkach. W odró znieniu od tego ELISA mierzy wszystkie postaci A ß, zarówno rozpuszczalne, jak i nierozpuszczalne, monomeryczne i zagregowane. Poniewa z przypuszcza si e, ze patologia choroby jest zwi azana z nierozpuszczaln a form a A ß zwi azan a z p lytka- mi, technika analizy obrazu mo ze mie c wi eksz a czulosc w ocenie skutków leczenia. Jednak ze z uwagi na to, ze test ELISA jest szybszym i latwiejszym testem, jest on bardzo u zyteczny do celów poszuki- wania nowych leków. Ponadto mo ze to oznacza c, ze zwi azane z leczeniem zmniejszenie A ß jest wi ek- sze dla zwi azanego z p lytkami ni z ca lkowitego A ß. Aby stwierdzi c, czy specyficzne dla A ß przeciwcia la wytworzone przez immunizacj e u leczonych zwierz at reagowa ly z od lo zonym w mózgu amyloidem, podzestaw skrawków histologicznych ze zwie- rz at leczonych i kontrolnych poddano dzia laniu przeciwcia l specyficznych dla mysich IgG. W odró z- nieniu od grupy PBS, p lytki zawieraj ace A ß by ly pokryte endogenn a IgG u zwierz at immunizowanych koniugatami peptydów A ß- A ß1-5, A ß1-12 i A ß13-28; oraz agregatami pe lnej d lugo sci A ß - AN1792 i AN1528. Mózgów zwierz at immunizowanych innymi peptydami A ß lub peptydem APP pBx6 nie anali- zowano w tym te scie. 3. Pomiar mian przeciwcia l Od myszy pobrano krew w 4-7 dni po ka zdej immunizacji, poczynaj ac od drugiej immunizacji, lacznie 5 razy. Zmierzono miana przeciwcia l jako przeciwcia la wi az ace A ß1-42 metod a kanapkowego ELISA na wielostudzienkowych p lytkach z tworzywa sztucznego, powleczonych A ß1-42. Jak pokaza- no na fig. 13, szczytowe miana przeciwcia l by ly wytworzone po czwartej dawce dla tych 4 szczepio- nek, które wywo lywa ly najwy zsze miana przeciwcia l specyficznych dla AN1792: AN1792 (szczytowa GMT: 94647), AN1528 (szczytowe GMT: 88231), koniugat A ß1-12 (szczytowe GMT 47216) i gryzonia A ß1-42 (szczytowa GMT: 10766). Miana dla tych grup obni zy ly si e w pewnym stopniu po pi atej i szó- stej dawce. Dla pozosta lych pi eciu immunogenów szczytowe miana osi agni eto po pi atej i szóstej daw- ce i by ly one znacznie mniejsze ni z uzyskane dla czterech grup najwy zszych mian: koniugat A ß1-5 (szczytowa GMT: 2356), pBx6 (szczytowa GMT: 1986), koniugat A ß13-28 (szczytowa GMT: 1183), koniugat A ß33-42 (szczytowa GMT: 658), A ß25-35 (szczytowa GMT: 125). Miana przeciwcia l zmie- rzono tak ze wobec homologicznych peptydów stosuj ac ten sam format kanapkowego ELISA dla pod- zestawu immunogenów, grup immunizowanych A ß1-5, A ß13-28, A ß25-35, A ß33-42 i gryzonim A ß1-42. Miana te by ly w przybli zeniu takie same, jak zmierzone wzgl edem A ß1-42, z wyj atkiem immunogenu gryzoniego A ß1-42, dla którego miana przeciwcia l wzgl edem homologicznego immunogenu by ly oko lo 2-krotnie wy zsze. Wielko sc miana przeciwcia l specyficznych wzgl edem AN1792 u poszczególnych zwierz at lub srednia warto sc dla grup leczniczych nie mia la zwi azku ze skuteczno scia zmierzon a jako zmniejszenie A ß w korze. 4. Odpowiedzi limfoproliferacyjne Zale zn a od A ß limfoproliferacj e zmierzono stosuj ac komórki sledziony zebrane oko lo tydzie n po ko ncowej, szóstej, immunizacji. Swie zo zebrane komórki, 10 5 na studzienk e, hodowano przez 5 dni w obecno sci A ß1-40 w stezeniu 5 µM w celu stymulacji. Komórki z podzestawu siedmiu spo sród dzie- sieciu grup tak ze hodowano w obecno sci peptydu o odwrotnej sekwencji A ß40-1. Jako pozytywn aPL 203 431 B1 27 kontrol e hodowano dodatkowe komórki z mitogenem komórek T, PHA, a jako negatywn a kontrol e komórki hodowano bez dodanego peptydu. Limfocyty z wi ekszo sci zwierz at proliferowa ly w odpowiedzi na PHA. Nie stwierdzono znacz a- cych odpowiedzi na peptyd o odwrotnej sekwencji A ß40-1. Komórki ze zwierz at immunizowanych wi ekszymi zagregowanymi peptydami A ß, AN1792, gryzonim A ß1-42 i AN1528 silnie proliferowa ly po stymulacji A ß1-40 z najwy zszymi cmp u biorców AN1792. U jednego ze zwierz at w ka zdej z grup im- munizowanych koniugatami A ß1-12, A ß13-28 i A ß25-35 komórki proliferowa ly w odpowiedzi na A ß1-40. W pozosta lych grupach otrzymuj acych koniugaty A ß1-5, A ß33-42 oraz pBx6 lub PBS nie by lo zwierz at z odpowiedzi a stymulowan a A ß. Wyniki te zestawiono w tabeli 5 poni zej. T a b e l a 5 Immunogen Koniugat Aminokwasy A ß Zwierz eta odpowiadaj ace Aß1-5 tak 5-mer 0/7 Aß1-12 tak 12-mer 1/8 Aß13-28 tak 16-mer 1/9 Aß25-35 11-mer 1/9 Aß33-42 tak 10-mer 0/10 Aß1-40 40-mer 5/8 Aß1-42 42-mer 9/9 gryzoni A ß1-42 42-mer 8/8 pBx6 0/9 PBS 0-mer 0/8 Wyniki te wskazuj a, ze AN1792 i AN1528 najsilniej stymuluj a odpowiedzi komórek T, najpraw- dopodobniej o fenotypie CD4 + . Brak specyficznej wzgl edem A ß odpowiedzi komórek T u zwierz at im- munizowanych A ß1-5 nie jest zaskakuj aca, gdy z epitopy peptydowe rozpoznawane przez komórki T CD4 + maj a zazwyczaj d lugosc 15 aminokwasów, jakkolwiek krótsze peptydy mog a czasem dzia la c z mniejsz a skuteczno scia. Zatem wi ekszosc epitopów komórek T pomocniczych dla czterech koniuga- tów peptydów znajduje si e w czesci IgG koniugatu, a nie w regionie A ß. Hipotez e t e potwierdza bardzo niska cz esto sc odpowiedzi proliferacyjnych dla zwierz at z ka zdej z tych grup leczniczych. Z uwagi na to, ze koniugat A ß1-5 by l skuteczny w znacz acym obni zaniu poziomu A ß w mózgu, przy widocznym braku komórek T specyficznych dla A ß, kluczow a efektorow a odpowiedzi a immunologiczn a wywo lan a przez immunizacj e tym peptydem okazuje si e by c przeciwcia lo. Brak komórek T oraz niska odpowied z przeciwcia l dla bia lka fuzyjnego pBx6, zawierajacego aminokwasy APP 592-695 w lacznie ze wszystkimi aminokwasami A ß, mo ze by c spowodowana s lab a immunogenno scia konkretnego preparatu. S laba immunogenno sc agregatu A ß25-35 jest prawdopo- dobnie spowodowana tym, ze peptyd jest za ma ly, aby by lo prawdopodobne, ze zawiera dobry epitop dla komórki T, aby wspomóc indukcj e odpowiedzi przeciwcia l. Je zeli peptyd ten by lby sprz ezony z bia lkiem no snikowym prawdopodobnie by lby bardziej immunogenny. V. Przygotowanie przeciwcia l poliklonalnych do biernej ochrony 20 nietransgenicznych myszy immunizowanych A ß lub innym immunogenem, dodatkowo z ad- iuwantem, u smiercono w wieku 4-5 miesi ecy. Zebrano krew immunizowanych myszy. Ewentualnie IgG wydzielono z innych sk ladników krwi. Przeciwcia la specyficzne dla immunogenu cz esciowo oczysz- czono metod a chromatografii powinowactwa. Otrzymano srednio 0,5-1 mg przeciwcia l specyficznych dla immunogenu na mysz, co da lo lacznie 5-10 mg. VI. Bierna immunizacja przeciwcia lami na A ß Grupom 7-9 -miesi ecznych myszy PDAPP podano 0,5 mg w PBS przeciwcia l poliklonalnych przeciw-A ß lub specyficznych monoklonalnych przeciw-A ß, co pokazano poni zej. Przeciwcia la mono- klonalne mo zna przygotowa c przeciw fragmentowi przez wstrzykni ecie myszy fragmentu lub d lu zszej formy A ß, przygotowanie hybrydom i przeszukiwanie hybrydom pod wzgl edem przeciwcia la specyficz- nie wiaz acego wymagany fragment A ß nie wiaz ac przy tym innych niezachodz acych fragmentów A ß.PL 203 431 B1 28 T a b e l a 6 Przeciwcia lo Epitop 2H3 A ß1-12 10D5 A ß1-12 266 A ß13-28 21F12 A ß33-42 Mysie poliklonalne przeciwludzkie A ß42 przeciw zagregowanemu A ß42 Zwierz etom podawano przez 4 miesi ace sródotrzewnowo preparaty, gdy by lo to potrzebne, aby utrzyma c przeciwcia la w kr azeniu w st ezeniach, mierzonych jako miana ELISA, wi ekszych ni z 1/1000, oznaczanych w ELISA wobec A ß42 lub innego immunogenu. Miana monitorowano jak wy zej i myszy u smiercono na koniec 4-miesi ecznych wstrzykiwa n. Po smierci wykonano histochemi e, oznaczanie poziomów A ß i toksykologi e. W ka zdej z grup u zyto po 10 myszy. VII. Porównanie ró znych adiuwantów Przyk lady te porównuj a CFA, a lun, emulsj e olej w wodzie i MPL pod wzgl edem ich zdolno sci stymulowania odpowiedzi immunologicznej. A. Materia ly i metody 1. Projekt bada n Sto samic sze sciotygodniowych swinek morskich rasy Hartley, otrzymanych z Elm Hill, podzie- lono na 10 grup do immunizacji AN1792 lub jego palmitoilowan a pochodn a, po laczonymi z ró znymi adiuwantami. Siedem grup immunizowano przez iniekcj e AN1792 (33 µg, z wyj atkiem gdy zaznaczo- no inaczej) po laczonym z a) PBS, b) adiuwantem Freunda, c) MPL, d) skwalenem, e) MPL/skwale- nem, f) nisk a dawk a z a lunem lub g) wysok a dawk a z a lunem (300 µg AN1792). Dwie grupy immuni- zowano przez iniekcj e palmitoliowan a pochodn a AN1792 (33 µg) po laczon a z a) PBS lub b) skwale- nem. Na koniec, dziesi ata grupa otrzymywa la sam a PBS, bez antygenu i dodatkowego adiuwanta. Dla grupy otrzymuj acej adiuwant Freunda pierwsz a dawk e zemulgowano z CFA, a pozosta le 4 dawki z IFA. Antygen podawano w dawce 33 µg dla wszystkich 11 grup, z wyj atkiem grupy wysokiej dawki z a lunem, która otrzymywa la 300 µg AN1792. Immunizacje wykonywano sródotrzewnowo dla CFA/IFA i domi esniowo do miesnia czterog lowego tylnej lapy, na zmian e po prawej i lewej stronie dla wszystkich innych grup. Pierwsze trzy dawki podawano w trybie dwutygodniowym, a nast epnie poda- no dwie dawki z miesi eczn a przerw a. Krew pobierano 6-7 dni po ka zdej immunizacji, zaczynaj ac od drugiej dawki, w celu pomiaru miana przeciwcia l. 2. Przygotowanie immunogenów Dwa mg A ß42 (California Peptide, seria ME0339) dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mie- szanin e zworteksowano, aby utworzy c wzgl ednie jednorodn a zawiesin e. Dodano 100 µl 10x PBS (1x PBS, 0,15 M NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5). Zawiesin e ponownie zworteksowano i inkubo- wano przez noc w 37°C do zastosowania nast epnego dnia. Niezu zyte A ß1-42 przechowywano z osu- szaczem jako liofilizowany proszek w -20°C. Palmitoilowan a pochodn a AN1792 otrzymano przez sprz eganie bezwodnika palmitynowego, zawieszonego w dimetyloformamidzie, z N-ko ncowym aminokwasem AN1792, przed usuni eciem po- wstaj acego peptydu z zywicy przez podzia lanie kwasem fluorowodorowym. Aby przygotowa c dawki szczepionek z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) (grupa 2) ze- mulgowano 33 µg AN1792 w 200 µl PBS w stosunku 1:1 (obj.) z CFA w ko ncowej obj eto sci 400 µl do pierwszej immunizacji. Do kolejnych immunizacji antygen podobnie emulgowano z niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA). Aby przygotowa c dawki szczepionek z MPL dla grup 5 i 8 liofilizowany proszek (Ribi Immu- noChem Research, Inc., Hamilton, MT) dodano do 0,2% wodnego roztworu trietyloaminy, do ko n- cowego st ezenia 1 mg/ml i ca lo sc zworteksowano. Mieszanin e podgrzano do 65 do 70°C przez 30 sekund aby wytworzy c lekko nieprzezroczyst a jednorodn a zawiesin e miceli. Roztwór swie zo przygo- towywano do ka zdego zestawu zastrzyków. Do ka zdego zastrzyku w grupie 5, zmieszano 33 µg AN1792 w 16,5 µl PBS, 50 µg MPL (50 µl) i 162 µl PBS w probówce borokrzemianowej bezpo sred- nio przed u zyciem. Aby przygotowa c dawki szczepionek z ma la ilo sci a emulsji olej w wodzie, AN1792 w PBS do- dano do 5% skwalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 w PBS, do ko ncowego st ezenia w pojedyn-PL 203 431 B1 29 czej dawce 33 µg AN1792 w 250 µl (grupa 6). Mieszanin e zemulgowano przepuszczaj ac przez dwukomorowe r eczne urz adzenie 15 do 20 razy do momentu otrzymania kropelek emulsji o sredni- cy zbli zonej do standardowej pere lki lateksowej o srednicy 1 µm, przy analizie mikroskopowej. otrzymana zawiesina by la opalizuj aca, mlecznobia la. Emulsje swie zo przygotowywano dla ka zdej z serii iniekcji. Dla grupy 8 dodano MPL w 0,2% trietyloaminie w st ezeniu 50 µg na dawk e do mie- szaniny skwalenu w detergencie w celu zemulgowania jak opisano powy zej. Dla pochodnej palmito- ilowych (grupa 7), 33 µg na dawk e palmitoilo-NH-A ß1-42 dodano do skwalenu i zworteksowano. Nast epnie dodano Tween 80 i Span 85 i zworteksowano. Mieszanin e t e dodano do PBS, aby osi a- gn ac ko ncowe st ezenia 5% skwalenu, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 i mieszanin e zemulgowano jak powy zej. Aby przygotowa c dawki szczepionek z a lunem (grupy 9 i 10), AN1792 w PBS dodano do Alhy- drogel ( zel wodorotlenku glinu, Accurate, Wetsbury, NY) do osi agni ecia st ezenia 33 µg (niska dawka, grupa 9) lub 300 µg (wysoka dawka, grupa 10) AN1792 na 5 mg a lunu, w ko ncowej obj eto sci dawki 250 µl. Zawiesin e delikatnie mieszano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. 3. Pomiary mian przeciwcia l Od swinek morskich pobierano krew 6-7 dni po immunizacji, zaczynaj ac po drugiej immunizacji, wykonuj ac to 4 razy. Miana przeciwcia l przeciw A ß42 zmierzono metod a ELISA, jak opisano w ogól- nych materia lach i metodach. 4. Preparaty tkanek Po oko lo 14 tygodniach wszystkim swinkom morskim podano CO 2 . Zebrano p lyn mózgowo- -rdzeniowy i usuni eto mózgi, po czym wypreparowano 3 regiony mózgowe (hipokamp, kor e i mó z- d zek), które u zyto do pomiarów st ezenia ca lkowitego A ß metod a ELISA. B. Wyniki 1. Odpowiedzi przeciwcia l Zaobserwowano szeroki zakres skuteczno sci ró znych adiuwantów mierzonej w testach odpo- wiedzi przeciwcia l na AN1792 po immunizacji. Jak pokazano na fig. 14, gdy AN1792 podawano w PBS, nie wykryto przeciwcia l po dwóch lub trzech immunizacjach, a niewielkie odpowiedzi wykryto po czwartej i piatej dawce ze sredni a geometryczn a mian (GMT) zaledwie oko lo 45. Emulsja olej w wodzie wytworzy la umiarkowane miana po trzeciej dawce (GMT 255), które utrzymywa ly si e po czwartej dawce (GMT 301) i spad ly po ko ncowej dawce (GMT 54). Wyst api la wyra zna odpowied z antygenowa na dawk e dla AN1792 zwi azanego z a lunem, przy czym 300 µg by lo bardziej immuno- genne we wszystkich punktach czasowych ni z 33 µg. W szczytowej odpowiedzi przeciwcia l, po czwartej immunizacji, ró znica pomi edzy dwoma dawkami wynosi la 43% z GMT oko lo 1940 (33 µg) i 3400 (300 µg). Odpowied z przeciwcia l na 33 µg AN1792 plus MPL by la bardzo podobna do wytwo- rzonej przez prawie 10-krotnie wi eksz a dawk e antygenu (300 µg) zwi azanego z a lunem. Dodatek MPL do emulsji olej w wodzie zmniejszy l si le szczepionki w stosunku do szczepionki z MPL, jako jedynym adiuwantem, a z o 75%. Palmitoilowana pochodna AN1792 by la ca lkowicie nieimmunogen- na przy podawaniu w PBS i da la srednie miana przy podawaniu w emulsji olej w wodzie z GMT, 340 i 105 dla trzeciego i czwartego pobrania krwi. Najwy zsze miana przeciwcia l wytworzy l adiuwant Freunda z szczytem GMT oko lo 87000, która to warto sc by la prawie 30-krotnie wy zsza ni z GMT kolejnych najsilniejszych szczepionek, MPL i wysokiej dawki AN1792/a lun. Najbardziej obiecuj acymi adiuwantami zidentyfikowanymi w tym badaniu s a MPL i a lun. Z tych dwóch MPL wydaje si e by c korzystny, gdy z 10-krotnie ni zsza dawka antygenu by la niezb edna do wytworzenia tej samej odpowiedzi przeciwcia l, co uzyskana dla a lunu. Odpowied z mo zna wzmocni c przez zwi ekszenie dawki antygenu i/lub adiuwanta, oraz optymalizacj e trybu immunizacji. Emulsja olej w wodzie by la bardzo s labym adiuwantem dla AN1792, tak ze dodanie emulsji olej w wodzie do adiu- wanta MPL zmniejszy lo wewn etrzn a aktywno sc samego adiuwanta MPL. 2. Poziomy A ß w mózgu W wieku oko lo 14 tygodni swinki morskie g leboko u spiono, pobrano p lyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i usuni eto zwierz etom mózgi w podzestawie grup immunizowanych adiuwantem Freuda (grupa 2), MPL (grupa 5), a lunem z wysok a dawk a, 300 µg AN1792 (grupa 10) i z immunizowanej PBS grupy kontrolnej (grupa 3). Aby zmierzy c poziom peptydu A ß, jedn a pó lkul e wypreparowano i przygotowa- no homogenaty regionów hipokampa, kory i mó zd zku w 5 M guanidynie. Nast epnie rozcie nczono je i oznaczono przez porównanie z seri a rozcie ncze n standardowego bia lka A ß o znanych st ezeniach, w formacie ELISA. Poziomy A ß w hipokampie, korze i mó zd zku by ly bardzo podobne dla wszystkich grup, pomimo szerokiego zakresu odpowiedzi przeciwcia l na A ß wywo lanej przez te szczepionki.PL 203 431 B1 30 Zmierzono srednie poziomy A ß w tkance, wynosz ace oko lo 25 ng/g w hipokampie, 21 ng/g w korze i 12 ng/g w mó zd zku. Zatem obecno sc w krazeniu wysokiego miana przeciwcia l przeciw A ß przez prawie 3 miesi ace u niektórych z tych zwierz at nie zmieni la ca lkowitych poziomów A ß w ich mózgach. Poziomy A ß w CFS tak ze by ly podobne pomi edzy grupami. Brak wyra znych skutków immunizacji AN1792 na endogenny A ß wskazuje, ze odpowied z immunologiczna jest skupiona na patologicznych formach A ß. VIII. Odpowied z immunologiczna na ró zne adiuwanty u myszy Sze sciotygodniowe samice myszy Swiss Webster zastosowano do tych bada n z 10-13 zwierz e- tami na grup e. Immunizacje wykonywano sródotrzewnowo w dniach 0, 14, 28, 60, 90 i 20, w dawkach o obj eto sci 200 µl. Do wszystkich stymulacji jako bufor zastosowano PBS. Od zwierz at pobrano krew w 7 dni po ka zdej immunizacji, zaczynaj ac po drugiej dawce, do analizy mian przeciwcia l w tescie ELISA. Tryb leczenia ka zdej z grup podano w tabeli 7. T a b e l a 7 Projekt do swiadczenia badania Betabloc 010 Grupa N a Adiuwant b Dawka Antygen Dawka ( µg) 1 10 MPL 12,5 µg AN1792 33 2 10 MPL 25 µg AN1792 33 3 10 MPL 50 µg AN1792 33 4 13 MPL 125 µg AN1792 33 5 13 MPL 50 µg AN1792 150 6 13 MPL 50 µg AN1528 33 7 10 PBS AN1792 33 8 10 PBS - 9 10 zemulgowany skwalen 5% AN1792 33 10 10 domieszany skwalen 5% AN1792 33 11 10 a lun 2 mg AN1792 33 12 13 MPL+a lun 50 µg/2 mg AN1792 33 13 10 QS21 5 µg AN1792 33 14 10 QS21 10 µg AN1792 33 15 10 QS21 25 µg AN1792 33 16 13 QS21 25 µg AN1792 150 17 13 QS21 25 µg AN1528 33 18 13 QS21+MPL 25 µg/ 50 µg AN1792 33 19 13 QS21+a lun 25 µg/ 2 mg AN1792 33 Odno sniki: a Liczba myszy w ka zdej grupie na pocz atku do swiadczenia b Wskazano adiuwanty. Jako bufor do wszystkich preparatów zastosowano PBS. Grupie 8 nie podano antygenu ani adiuwanta.PL 203 431 B1 31 Miana ELISA przeciwcia l przeciw A ß42 dla ka zdej grupy przedstawiono w tabeli 8 poni zej. T a b e l a 8 Geometryczne srednie mian przeciwcia l Tydzie n pobierania krwi Grupa lecznicza 2,9 5,0 8,7 12,9 16,7 1 248 1797 2577 6180 4177 2 598 3114 3984 5287 6878 3 1372 5000 7159 12333 12781 4 1278 20791 14368 20097 25631 5 3288 26242 13229 9315 23742 6 61 2536 2301 1442 4504 7 37 395 484 972 2149 8 25 25 25 25 25 9 25 183 744 952 1823 10 25 89 311 513 817 11 29 708 2618 2165 3666 12 198 1458 1079 612 797 13 38 433 566 1080 626 14 104 541 3247 1609 838 15 212 2630 2472 1224 1496 16 183 2616 6680 2085 1631 17 28 201 375 222 1540 18 31699 15544 23095 6412 9059 19 63 243 554 299 441 Tabela wykazuje, ze najwy zsze miana uzyskano dla grup 4, 5 i 18, w których adiuwantami by lo 125 µg MPL, 50 µg MPL oraz QS21 plus MPL. IX. Lecznicza skuteczno sc ró znych adiuwantów Badania nad skuteczno sci a lecznicz a prowadzono na transgenicznych myszach PDAPP, z ze- stawem adiuwantów odpowiednich do stosowania u ludzi, aby oznaczy c ich zdolnosc do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciw A ß i wywo la c kierowane immunologicznie oczyszczanie z logów amyloidowych z mózgu. Sto osiemdziesi at samców i samic, w wieku 7,5 do 8,5 miesi ecy, heterozygotycznych transge- nicznych myszy PDAPP otrzymano z Charles River Laboratories. Myszy podzielono na 9 grup zawie- rajacych po 15 do 23 zwierz eta w grupie, do immunizacji AN1792 i AN1528 w po laczeniu z ró znymi adiuwantami. Zwierz eta podzielono tak, by dobra c p le c, wiek oraz rodziców zwierz at w obr ebie grupy tak blisko jak to tylko by lo mozliwe. Jako adiuwanty zastosowano a lun, MPL i QS21, ka zdy w po lacze- niu z dwoma antygenami, oraz adiuwant Freunda (FA) po laczony tylko z AN1792. Dodatkow a grup e immunizowano AN1792 w buforze PBS ze srodkiem konserwuj acym tymerozalem bez adiuwanta. Dziewi at a grup e, jako negatywn a kontrol e, immunizowano sam a PBS. Przygotowanie zagregowanych peptydów: peptydy ludzki A ß1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; seria ME0541), ludzki A ß1-42 (AN1792; California Peptides Inc., seria ME0439), swie- zo solubilizowano do przygotowania ka zdego z zestawu zastrzyków z liofilizowanych proszków, które przechowywano wysuszone w -20°C. W tym celu 2 mg peptydu dodano do 0,9 ml dejonizowanej wody i mieszanin e zworteksowano, aby wytworzy c wzgl ednie jednorodny roztwór lub zawiesin e. AN1528 by l rozpuszczalny na tym etapie, w odró znieniu od AN1792. Nast epnie dodano równe obj eto sci po 100 µlPL 203 431 B1 32 10x PBS (1x PBS: 0,15 NaCl, 0,01 M fosforan sodu, pH 7,5) i wtedy AN1528 zacz al si e wytr aca c. Zawiesin e ponownie zworteksowano i inkubowano przez noc w 37°C do zastosowania nast epnego dnia. Aby przygotowa c dawki szczepionek z a lunem (grupy 1 i 5), peptyd A ß w PBS dodano do Alhy- drogelu (2% wodny zel wodorotlenku glinu, Sargeant, Inc., Clifton, NJ), do osi agni ecia st ezenia 100 µg peptydu A ß na 1 mg a lunu. Dodano 10x PBS do ko ncowej obj eto sci dawki wynosz acej 200 µl w 1x PBS. Zawiesin e delikatnie mieszano przez oko lo 4 godziny w temperaturze pokojowej przed wstrzykiwaniem. Aby przygotowa c dawki szczepionek z MPL (grupy 2 i 6) liofilizowany proszek (Ribi Immuno- Chem Research, Inc., Hamilton, MT; seria 67039-E0896B) dodano do 0,2% wodnego roztworu triety- loaminy, do ko ncowego st ezenia 1 mg/ml i zworteksowano. Mieszanin e podgrzano do 65 do 70°C przez 30 s, aby otrzyma c lekko nieprzezroczyst a jednorodn a zawiesin e miceli. Roztwór przechowy- wano w 4°C. Do ka zdego zestawu iniekcji zmieszano 100 µg peptydu na dawk e w 50 µl PBS, 50 µg MPL na dawk e (50 µl) i 100 µl PBS na dawk e, w probówce borokrzemianowej, bezpo srednio przed u zyciem. Aby przygotowa c dawki szczepionek z QS21 (grupy 3 i 7) liofilizowany proszek (Aquila, Framin- gham, MA; seria A7018R) dodano do PBS, pH 6,6-6,7 do ko ncowego stezenia 1 mg/ml i zwortekso- wano. Roztwór przechowywano w -20°C. Do ka zdego zestawu zastrzyków zmieszano 100 µg peptydu na dawk e w 50 µl PBS, 25 µg QS21 na dawk e w 25 µl PBS i 125 µl PBS na dawk e w probówce boro- krzemianowej bezpo srednio przed u zyciem. Aby przygotowa c dawki szczepionek z adiuwantem Freunda (grupa 4) zemulgowano 100 µg AN1792 w 200 µl PBS w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w ko ncowej obj eto sci 400 µl do pierwszej immunizacji. Do kolejnych immunizacji antygen podobnie zemulgowano z niekompletnym adiuwantem Freunda (IFA). Do szczepionek zawieraj acych adiuwanty a lun, MPL lub QS21, polaczono 100 µg na dawk e AN1792 lub AN1528 z a lunem (1 mg na dawk e) lub MPL (50 µg na dawk e) lub QS21 (25 µg na dawk e), w ko ncowej obj eto sci 200 µl PBS i podawano szczepi ac pod- skórnie na boku pomi edzy lopatkami. Dla grupy otrzymuj acej FA 100 µg AN1792 zemulgowano w stosunku 1:1 (obj.) z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA) w ko ncowej obj eto sci 400 µl i poda- wano sródotrzewnowo przy pierwszej immunizacji, a nast epnie podawano dawki przypominaj ace tej samej ilo sci immunogenu w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) przez kolejnych pi ec dawek. Dla grupy otrzymuj acej AN1792 bez adiuwanta 10 µg AN1792 po laczono z 5 µg tymerozalu w ko nco- wej obj eto sci 50 µl PBS i podawano podskórnie. Dziewi ata grupa kontrolna otrzymywala tylko 200 µl PBS w zastrzykach podskórnych. Immunizacje wykonywano w trybie dwutygodniowym przez 3 pierw- sze dawki, a nast epnie w trybie miesi ecznym, a zatem w dniach 0, 16, 28, 56, 85 i 112. Od zwierz at pobierano krew w 6-7 dni po ka zdej immunizacji, zaczynaj ac od drugiej dawki, do pomiarów miana przeciwcia l. Zwierz eta u smiercono oko lo tygodnia po ko ncowej dawce. Wyniki oznaczono w te scie ELISA mierz ac poziomy A ß i APP w mózgu i na podstawie immunohistochemicznej oceny obecno sci p lytek amyloidowych w skrawkach histologicznych mózgu. Ponadto oznaczono miana specyficznych przeciwcia l przeciw A ß oraz zale zne od A ß odpowiedzi, proliferacyjn a i cytokin. Z tabeli 9 wynika, ze najwy zsze miana przeciwcia l przeciw A ß1-42 wytworzy l FA z AN1792, miana, które osi agn ely szczyt po czwartej immunizacji (szczytowa GMT: 75386), a nast epnie spad ly o 59% po ko ncowej, szóstej immunizacji. Szczytowe miano przeciwcia l wytworzone przez MPL z AN1792 by lo o 62% ni zsze ni z wytworzone przez FA (szczytowa GMT: 28867) i tak ze zosta lo osi a- gni ete wcze snie podczas immunizacji, po trzech dawkach, a nast epnie spad lo do 28% szczytowej warto sci po szóstej immunizacji. Szczytowe miano przeciwcia l wytworzone przez QS21 polaczony z AN1792 (GMT: 1511) by lo oko lo 5-krotnie ni zsze ni z uzyskane dla MPL. Ponadto kinetyka odpowie- dzi by la wolniejsza, gdy z dodatkowa immunizacja by la konieczna do uzyskania szczytowej odpowie- dzi. Miana wytworzone przez a lun zwi azany z AN1792 by ly niewiele wy zsze ni z uzyskane dla QS21, a kinetyka odpowiedzi by la szybsza. Dla AN1792 podawanego w PBS z tymerozalem cz estosc i wiel- ko sc mian by la niewiele wy zsza ni z uzyskana dla samej PBS. Szczytowe miana wytworzone przez MPL i AN1528 (szczytowa GMT 3099) by ly oko lo 9-krotnie ni zsze ni z dla AN1792. AN1528 zwi azany z a lunem by l w niewielkim stopniu immunogenny, z niskimi mianami wytworzonymi tylko u paru zwie- rz at. Nie obserwowano odpowiedzi przeciwcia l u zwierz at kontrolnych immunizowanych sam a PBS.PL 203 431 B1 33 T a b e l a 9 Srednie geometryczne mian przeciwcia l a Tydzie n pobierania krwi Leczenie 3,3 5,0 9,0 13,0 17,0 Alun/AN1792 102 (12/21) b 1081 (17/20) 2366 (21/21) 1083 (19/21) 572 (18/21) MPL/AN1792 6241 (21/21) 28867 (21/21) 11242 (21/21) 5665 (20/20) 8204 (20/20) QS21/AN1792 30 (1/20) 227 (10/19) 327 (10/19) 1511 (17/18) 1188 (14/18) CFA/AN1792 10076 (15/15) 61279 (15/15) 75386 (15/15) 41628 (15/15) 30574 (15/15) Alun/AN1528 25 (0/21) 33 (1/21) 39 (3/20) 37 (1/20) 31 (2/20) MPL/AN1528 184 (15/21) 2591 (20/21) 1653 (21/21) 1156 (20/20) 3099 (20/20) QS21/AN1528 29 (1/22) 221 (13/22) 51 (4/22) 820 (20/22) 2994 (21/22) PBS+tymerozal 25 (0/16) 33 (2/16) 39 (4/16) 37 (3/16) 47 (4/16) PBS 25 (0/16) 25 (0/16) 25 (0/15) 25 (0/12) 25 (0/16) Odno sniki: a Srednie geometryczne mian przeciwcia l zmierzonych wzgl edem A ß1-42. b Liczba odpowiadaj acych na grup e. Wyniki leczenia AN1792 lub AN1592 z ró znymi adiuwantami lub tymerozalem na obciazenie ko- ry amyloidem u 12-miesi ecznych myszy oznaczone metod a ELISA przedstawiono na fig. 15. U PBS kontrolnych myszy PDAPP sredni poziom ca lkowitego A ß w korze w wieku 12 miesi ecy wynosi l 1817 ng/g. Znacznie obni zone poziomy A ß obserwowano u myszy leczonych AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus a lun, AN1792 plus MPL oraz QS21 plus AN1792. Obni zenie osi agn elo znacz ac a staty- stycznie warto sc (p<0,05) tylko dla AN1792 plus CFA/IFA. Jednak ze, jak pokazano w przyk ladach I i III, dzia lanie immunizacji na obni zenie poziomów A ß by lo znacz aco wi eksze u 15 i 18-miesi ecznych myszy. Zatem oczekuje si e, ze przynajmniej leczenie preparatami AN1792 plus a lun, AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS21 osi agnie znaczenie statystyczne u starszych myszy. W porównaniu z tym, AN1792 plus srodek konserwuj acy tymerozal wytwarza l sredni poziom A ß prawie tak a sam a jak u myszy leczonych PBS. Podobne wyniki uzyskano porównuj ac korowe poziomy A ß42. Sredni poziom A ß42 w kontrolach PBS wynosi l 1624 ng/g. Wyra zne obni zenie srednich poziomów o warto sciach 403, 1149, 620 i 714 obserwowano u myszy leczonych odpowiednio preparatami AN1792 plus CFA/IFA, AN1792 plus a lun, AN1792 plus MPL i AN1792 plus QS21, ze zmniejszeniem osi agaj acym znaczenie statystyczne (p=0,05) dla grupy leczonej AN1792 plus CFA/IFA. Warto sc srednia w grupie leczonej AN1792 z tymerozalem wynosi la 1619 ng/g A ß42. X. Analiza toksyczno sci Po zako nczeniu bada n opisanych w przyk ladach 2, 3 i 7 zebrano tkanki do oceny histopatolo- gicznej. Ponadto w ko ncowych próbkach krwi z przyk ladów 3 i 7 wykonano analizy hematologiczne i chemiczne. Oceniono wi ekszo sc g lównych organów, w lacznie z mózgiem, p lucami, tkank a limfatycz- n a, przewodem zo ladkowo-jelitowym, w atrob a, nerkami, nadnerczami i gruczo lami p lciowymi. Pomi- mo, ze zaobserwowano sporadyczne uszkodzenia u badanych zwierz at, nie stwierdzono zadnych oczywistych ró znic, ani w zaatakowanych tkankach, ani w ostro sci uszkodze n pomi edzy zwierz etami leczonymi AN1792 a nieleczonymi. Nie stwierdzono unikatowych uszkodze n histopatologicznych u myszy immunizowanych AN1782 w porównaniu z myszami leczonymi PBS lub nieleczonymi. Nie stwierdzono tak ze ró znic w profilu analiz chemicznych pomi edzy grupami leczonymi adiuwantemPL 203 431 B1 34 a zwierz etami leczonymi PBS w przyk ladzie 7. Jakkolwiek zaobserwowano znaczne wzrosty kilku parametrów hematologicznych pomi edzy zwierz etami leczonymi AN1792 z adiuwantem Freunda w przyk ladzie 7 w porównaniu do zwierz at leczonych PBS, ale ten typ dzia lania by l oczekiwany z le- czenia adiuwantem Freunda i towarzysz acego mu zapalenia otrzewnej i nie wskazuje na jakiekolwiek niekorzystne dzia lanie leczenia AN1792. Szczegó lowe badania patologii mózgów myszy PDAPP wy- konano nie jako cz es c oceny toksykologicznej, ale jako cz esc punktów ko ncowych badania skutecz- no sci. W zadnym z tych bada n nie stwierdzono jakichkolwiek oznak niekorzystnego dzia lania na mor- fologi e mózgu. Wyniki te wskazuj a, ze leczenie AN1792 jest dobrze tolerowane i przynajmniej w znacznym stopniu pozbawione skutków ubocznych. XI. Profilaktyka i leczenie pacjentów Przeprowadzono I faz e prób z pojedyncz a dawk a, aby oznaczy c bezpiecze nstwo. Srodek lecz- niczy podawano w wzrastaj acych dawkach ró znym pacjentom zaczynaj ac od dawki oko lo 0,01, po- ziomu o przypuszczalnej skuteczno sci, i zwi ekszano j a 3-krotnie do czasu gdy poziom osi agn al 10-krotno sc skutecznej mysiej dawki. Badania fazy II prób przeprowadzono, by oznaczyc skuteczno sc lecznicz a. Wybrano pacjentów we wczesnej do sredniej fazie choroby Alzheimera, z u zyciem kryterium Alzheimer's disease and Related Disorders Association (ADRDA) na prawdopodobie nstwo AD. Odpowiedni pacjenci lokowali sie w zakresie 12-26 w badaniach Mini-Mental State Exam (MMSE). Innymi kryteriami wyboru by lo to, ze pacjenci s a w stanie prze zy c czas trwania testu oraz brak komplikuj acych danych, takich jak rów- noczesne stosowanie leków, które mog a wp lywa c na leczenie. Podstawow a ocen e funkcjonowania pacjentów wykonano z u zyciem klasycznych pomiarów psychometrycznych, takich jak MMSE i ADAS, które stanowi a ogóln a skal e oceny stanu i dzia lania pacjentów z chorob a Alzheimera. Te skale psy- chometryczne dostarczaj a miary post epu stanu choroby Alzheimera. Do monitorowania leczenia mo z- na tak ze zastosowa c odpowiednie skale jako sci zycia. Post ep choroby mo zna tak ze monitorowa c metod a MRI. Mo zna tak ze monitorowa c profile krwi pacjentów, w lacznie z testami dla specyficznych dla antygenu odpowiedzi przeciwcia l i komórek T. Po podstawowych pomiarach pacjentów zacz eto poddawa c leczeniu. Losowo podzielono ich i leczono srodkiem leczniczym lub placebo. Pacjentów monitorowano co najmniej 6 miesi ecy. Skuteczno sc oznaczono jako znaczne zmniejszenie post epu w grupie leczonej wzgl edem grupy placebo. Druga faz e II próby przeprowadzono w celu oceny przej scia pacjentów z nie-Alzheimerowskiej wczesnej utraty pami eci, czasami nazywanej upo sledzeniem pami eci zwi azanym z wiekiem (AAMI), do prawdopodobnej choroby Alzheimera, okre slanej na podstawie kryterium ADRDA. Wybrano pa- cjentów z wysokim ryzykiem przej scia do choroby Alzheimara z nieklinicznej populacji, przeszukuj ac populacje odniesienia pod wzgl edem wczesnych oznak utraty pami eci lub innych trudno sci zwi aza- nych z przed-Alzheimerowskimi objawami, historii rodzinnej choroby Alzheimera, genetycznych czyn- ników ryzyka, wieku, p lci oraz innych cech, które wskazuj a wysokie ryzyko choroby Alzheimera. Zebrano punkty podstawowe odpowiednich miar w lacznie z MMSE i ADAS, razem z innymi miernika- mi zaprojektowanymi do oceny bardziej normalnej populacji. Populacje tych pacjentów podzielono na dwie odpowiednie grupy z porównaniem placebo wobec wariantów dawek srodka. Losy pacjentów z tych populacji sledzono z przerwami oko lo sze sciomiesi ecznymi, a ko ncowym punktem dla ka zdego pacjenta by lo, czy na koniec obserwacji osoba ta przejdzie do fazy prawdopodobnej choroby Alzhe- imera oznaczonej na podstawie kryterium ADRDA. XII. Ogólne materia ly i metody 1. Pomiary miana przeciwcia l Od myszy pobrano krew robi ac niewielkie nak lucie w zyle ogonowej i zebrano oko lo 200 µl krwi do probówki mikrowirówkowej. Od swinek morskich pobrano krew przez wygolenie najpierw okolicy tylnego golenia, a nastepnie nak lucie za pomoc a ig ly nr 18 zy ly sródstopowej i zebranie krwi do pro- bówek mikrowirówkowych. Krew zostawiono do skrzepni ecia przez 1 godzin e w temperaturze pokojo- wej (RT), zworteksowano, a nast epnie odwirowano przy 14000 x g przez 10 minut, aby oddzieli c skrzep od surowicy. Surowic e przeniesiono do czystych probówek mikrowirówkowych i przechowywa- no w 4°C do czasu oznaczania miana. Miana przeciwcia l zmierzono metod a ELISA. 96-studzienkowe p lytki do mikromianowania (p lytki Costar EIA) powleczono 100 µl roztworu zawieraj acego 10 µg/ml A ß42 lub SAPP albo innych antyge- nów, jak wskazano w ka zdym z poszczególnych przypadków, w buforze Well Coating Buffer (0,1 M fosforan sodu, pH 8,5, 0,1% azydek sodu) i trzymano przez noc w RT. Z p lytek odessano p lyn i doda- no surowic e do studzienek, zaczynaj ac od rozcie nczenia 1/100 w Specimen Diluent (0,014 M fosforanPL 203 431 B1 35 sodu, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,6% surowiczej albuminy bydl ecej, 0,05% tymerozalu). Bezpo srednio na p lytkach wykonano 7 kolejnych 3-krotnych rozcie ncze n próbek, tak by osi agn ac ko ncowe rozcie ncze- nie 1/218700. Rozcie nczone preparaty inkubowano w powleczonych studzienkach na p lytce przez 1 godzin e w RT. Nast epnie p lytki przemyto 4-krotnie za pomoc a PBS zawieraj acej 0,05% Tween 20. Nast epnie dodano do studzienek drugie przeciwcia lo, kozie przeciwmysiej Ig, sprz ezone z pe- roksydaz a chrzanow a (otrzymane z Boehringer Mannheim), w ilo sci 100 µl rozcie nczenia 1/3000 w Specimen Diluent i inkubowano przez 1 godzin e w RT. P lytki ponownie przemyto 4-krotnie za po- moc a PBS, Tween 20. Aby wywo lac chromogen do ka zdej studzienki dodano 100 µl Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametylo-benzydyna otrzymana z Pierce Chemicals) i inkubowano przez 15 minut w RT. Reakcj e zatrzymano przez dodanie 25 µl 2M H 2 SO 4 . Nast epnie odczytano intensywno sc barwy w Molecular Devices Vmax przy 450 nm-650 nm. Miana zdefiniowano jako odwrotno sc rozcie nczenia surowicy wywo luj acego po low e maksymal- nego OD. Zazwyczaj maksymalne OD odczytywano z pocz atkowego rozcie nczenia 1/100, z wyj atkiem przypadków bardzo wysokich mian, przy których niezb edne by lo wi eksze pocz atkowe rozcie nczenie do ustalenia maksymalnej OD. Je zeli punkt 50% znajdowa l si e pomi edzy dwoma rozcie nczeniami, wykonywano liniow a ekstrapolacj e aby wyznaczy c ko ncowe miano. Aby policzy c sredni a geometrycz- n a mian przeciwcia l, miana ni zsze ni z 100 by ly umownie oznaczane jako warto sc miana 25. 2. Test proliferacji limfocytów Myszy u spiono izofluranem. Sledziony usuni eto i przep lukano dwukrotnie w 5 ml PBS zawiera- jacej 10% inaktywowanej termicznie p lodowej surowicy bydl ecej (PBS-FBS), zhomogenizowano w 50 µ Centricon Unit (Dako A/S, Denmark) w 1,5 ml PBS-FBS przez 10 sekund przy 10 rpm w Medimachine (Dako), a nast epnie przefiltrowano przez nylonowe sito o srednicy porów 100 µ. Limfocyty sledziono- we przemyto jeden raz 15 ml PBS-FBS, nast epnie osadzono przez wirowanie przy 200 x g przez 5 minut. Czerwone krwinki zlizowano zawieszaj ac osad w 5 ml buforu zawieraj acego 0,15 M NH 4 CI, 1M KHCO 3 , 0,1 M NaEDTA, pH 7,4 przez 5 minut w RT. Nast epnie leukocyty przemyto w sposób opisany powy zej. Swie zo wyizolowane komórki sledzionowe (10 5 na studzienk e) hodowano w 3 powtórzeniach zestawów w 96-studzienkowych p lytkach do mikromianowania, do hodowli tkankowych, o dnie w kszta lcie litery U (Corning, Cambridge, MA) w po zywce RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) wzbogaconej 2,05 ml L-glutaminy, 1% penicylin a/streptomycyn a oraz 10% inaktywowan a termicznie FBS, przez 96 godzin w 37°C. Dodawano tak ze ró zne peptydy A ß, A ß1-16, A ß1-40, A ß1-42 lub o od- wrotnej sekwencji aminokwasowej A ß40-1, w dawkach wynosz acych od 5 µM do 0,18 µM w czterech etapach. Komórki w studzienkach kontrolnych hodowano z konkanawalin a A (Con A) (Sigma, nr kata- logowy C-5275, w st ezeniu 1 µg/ml) bez dodawania bia lka. Do komórek na ostatnie 24 godziny doda- no 3 H-tymidyn e (1 µCi/studzienk e uzyskanej z Amersham Corp., Arlington Heights IL). Nast epnie ko- mórki zebrano na p lytki UniFilter i zmierzono radioaktywno sc licznikiem Top Count Microplate Scintilla- tion Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Wyniki wyra zono jako impulsy na minut e (cpm) radioaktywno sci wlaczonej do nierozpuszczalnych makrocz asteczek. 4. Preparowanie tkanek mózgowych Po u smierceniu zwierz at mózgi usuni eto i jedn a pó lkul e przygotowano do analizy immunohisto- chemicznej, a z drugiej pó lkuli wypreparowano 3 regiony mózgu (hipokamp, kor e i mó zd zek) i zasto- sowano do zmierzenia st eze n ró znych bia lek A ß i form APP metod a specyficznych testów ELISA (Johnson-Wood i inni, supra). Tkanki przeznaczone do testów ELISA zhomogenizowano w 10 obj eto sciach lodowatego buforu guanidynowego (5,0 M guanidyna-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogenaty zmieszano przez deli- katne wstrz asanie w aparacie Adams Nutator (Fisher) przez 3-4 godziny w RT i przechowywano w -20°C przed oznaczeniem A ß i APP. Wcze sniejsze do swiadczenia wykaza ly, ze preparaty anali- tyczne by ly stabilne w tych warunkach przechowywania, oraz ze syntetyczne bia lko A ß (Bachem) mo zna ilo sciowo odzyska c po wk luciu homogenatów kontrolnej tkanki mózgowej z miotów mysich (Johnson-Wood i inni, supra). 5. Pomiar poziomów A ß Homogenaty mózgu rozcie nczono w stosunku 1:10 lodowatym Casein Diluent (0,25% kazeina, PBS, 0,05% azydek sodu, 20 µg/ml aprotyniny, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 µg/ml leupeptyny), a nast ep- nie odwirowano przy 16000 x g przez 20 minut w 4°C. Wzorce syntetycznego peptydu A ß (aminokwa- sy 1-42) i wzorce APP przygotowano tak, by zawiera ly 0,5 M guanidyn e i 0,1% surowicz a albumin e bydl ec a (BSA) w ostatecznym preparacie. W te scie kanapkowym ELISA „ca lkowitego" A ß stosowano monoklonalne przeciwcia la (mA ß) 266, specyficzne dla aminokwasów 13-28 A ß (Seubert i inni) jakoPL 203 431 B1 36 przeciwcia lo wychwytuj ace oraz biotynylowane mA ß 3D6, specyficzne dla aminokwasów 1-5 A ß (Johnson-Wood i inni) jako przeciwcia lo reporterowe. 3D6 mA ß nie rozpoznaje wydzielanej APP ani pe lnej d lugo sci APP, ale wykrywa tylko A ß z N-ko ncowym kwasem asparaginowym. Test ten ma ni z- sz a granic e czu lo sci ~ 50 ?g/ml (11 ?M) i nie wykazuje reaktywno sci krzy zowej z endogennym mysim bia lkiem A ß w stezeniach do 1 ng/ml (Johnson-Wood i inni, supra). W specyficznym dla A ß1-42 kanapkowym te scie ELISA stosuje si e mA ß 21F12, specyficzne dla aminokwasów 33-42 A ß (Johnson-Wood i inni) jako przeciwcia lo wychwytuj ace. Biotynylowane mA ß 3D6 jest tak ze przeciwcia lem reporterowym w tym te scie, który ma ni zsz a granic e czu lo sci, wynosz a- c a oko lo 125 ?g/ml (28 ?M, Johnson-Wood i inni). Do testów A ß ELISA studzienki 96-studzienkowych p lytek do immunotestów (Costar) powlekano 100 µl mA ß 266 (w st ezeniu 10 µg/ml) lub mA ß 21F12 (w st ezeniu 5 µg/ml) z inkubowaniem przez noc w RT. Roztwór usuni eto przez odessanie i studzienki zablokowano przez dodanie 200 µl 0,25% surowiczej albuminy ludzkiej w buforze PBS na co najmniej 1 godzin e w RT. Roztwór blokuj acy usuni eto i p lytki przechowywano wysuszone w 4°C do czasu za- stosowania. P lytki przed u zyciem nawodniono buforem Wash Buffer [sól buforowana Tris (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5), plus 0,05% Tween 20]. Próbki i wzorce dodano w trzech powtórze- niach równych cz esci po 100 µl na studzienk e, a nast epnie inkubowano przez noc w 4°C. P lytki prze- mywano co najmniej 3-krotnie buforem Wash Buffer pomi edzy ka zdym z etapów testu. Dodano bioty- nylowane mA ß 3D6, rozcie nczone do 0,5 µl/ml w buforze Casein Assay Buffer (0,25% kazeina, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i inkubowano w studzienkach przez 1 godzin e w RT. Koniugat awidyna- peroksydaza chrzanowa (Avidin-HRP uzyskana z Vector, Burlingame, CA) rozcie nczony 1:4000 w Casein Assay Buffer dodano na 1 godzin e w TP. Dodano kolorymetryczny substrat, Slow TMB-ELISA (Pierce) i pozostawiono do reakcji przez 15 minut w RT, po czym reakcj e enzymatyczn a zatrzymano przez dodanie 25 µl 2N H 2 SO 4 . Produkt reakcji oznaczono stosuj ac Molecular Devices Vmax mierz acy ró znic e absorpcji przy 450 nm i 650 nm. 6. Pomiar poziomów APP Zastosowano dwa ró zne testy APP. Pierwszy, nazwany APP- a/FL, rozpoznaje zarówno APP- alfa ( a), jak i formy APP pe lnej d lugo sci (FL). Drugi test rozpoznaje tylko APP- a. Test APP-a/FL roz- poznaje wydzielan a posta c APP w lacznie z pierwszymi 12 aminokwasami A ß. Poniewa z przeciwcia lo reporterowe (2H3) nie jest specyficzne dla miejsca a-klamerki, wyst epuj acego pomi edzy 612-613 aminokwasem APP695 (Esch i inni, Science 248, 1122-1124 (1990)), test ten rozpoznaje równie z pe lne d lugo sci APP (APP-FL). Wst epne do swiadczenia z immobilizowanymi przeciwcia lami APP przeciw cytoplastycznemu ogonowi APP-FL, w celu usuni ecia APP-FL z homogenatów mózgowych zasugerowa ly, ze oko lo 30-40% APP- a/FL APP jest FL (dane nie prezentowane). Przeciwcia lem wy- chwytuj acym w obu testach APP- a/FL i APP- a jest mA ß 8E5 wytworzone przeciw aminokwasom 444 do 592 formy APP695 (Games i inni, supra). Reporterowym mA ß dla testu APP- a/FL jest mA ß 2H3, specyficzne dla aminokwasów 597-608 formy APP695 (Johnson-Wood i inni, supra), a przeciwcia lem reporterowym dla testu APP- a jest biotynylowana pochodna mA ß 16H9, wytworzona przeciw amino- kwasom 605 do 611 APP. Ni zsza granica czu lo sci testu APP- a/FL wynosi 11 ng/ml (150 ?M) (John- son-Wood i inni), a testu specyficznego dla APP- a wynosi 22 ng/ml (0,3 nM). Dla obydwu testów APP studzienki 96-studzienkowych p lytek EIA powlekano mA ß 8E5, jak opisano powy zej dla mA ß 266. Oczyszczone, zrekombinowane wydzielane APP- a zastosowano jako wzorzec do testu APP- a i testu APP- a/FL (Esch i inni, supra). Próbki homogenatu mózgu w 5 M guanidynie rozcie nczono 1:10 w ELISA Specimen Diluent (0,014 M bufor fosforanowy, pH 7,4, 0,6% surowicza albumina bydl eca, 0,05% tymerozal, 0,5 M NaCl, 0,1% NP40). Nast epnie rozcie nczono je 1:4 w Specimen Diluent zawie- rajacym 0,5 M guanidyn e. Rozcie nczone homogenaty odwirowano przy 16000 x g przez 15 sekund w RT. Wzorce APP i próbki dodano do p lytek w dwóch powtórzeniach tych samych ilo sci i inkubowano przez 1,5 godziny w RT. Biotynylowane przeciwcia la reporterowe 2H3 i 16H9 inkubowano z próbkami przez 1 godzin e w RT. Streptawidyn e-alkaliczn a fosfataz e (Boehringer Mannheim) rozcie nczon a 1:1000 w Specimen Diluent inkubowano w studzienkach przez 1 godzin e w RT. Dodano fluorescen- cyjnego substratu, fosforanu 4-metylo-umbeliferylu i inkubowano 30 minut w RT, a nast epnie p lytki odczytano w fluorymetrze Cytofluor tm 2350 (Millipore) przy 365 nm pobudzenia i 450 nm emisji. 7. Immunohistochemia Mózgi utrwalano przez 3 dni w 4°C w 4% paraformaldehydzie w PBS, a nast epnie przechowy- wano 1-7 dni w 4°C w 1% paraformaldehydzie, PBS przed poci eciem na skrawki. Wie ncowe skrawki histologiczne o grubo sci 40 mikronów ci eto na wibratomie w RT i przechowywano w buforze chroni a- cym przed zamarzni eciem (30% gliceryna, 30% glikol etylenowy w buforze fosforanowym) w -20°CPL 203 431 B1 37 przed obróbk a immunohistochemiczn a. Dla ka zdego mózgu 6 fragmentów na poziomie hipokampu grzbietowego, ka zdy oddzielony kolejnymi 240 µm przerwami, inkubowano przez noc z jednym z na- st epuj acych przeciwcia l: (1) biotynylowanym przeciw-A ß (mA ß, 3D6, specyficznym dla ludzkiego A ß) rozcie nczonym do st ezenia 2 µg/ml w PBS i 1% surowicy ko nskiej; lub (2) biotynylowanym mA ß, spe- cyficznym dla ludzkiego APP, 8E5, rozcie nczonym do st ezenia 3 µg/ml w PBS i 1,0% surowicy ko n- skiej; lub (3) mA ß specyficznym dla glejowego w lókienkowego bia lka kwasowego (GFAP; Sigma Chemical Co.) rozcie nczonym 1:500 w 0,25% Triton X-100 i 1% surowicy ko nskiej w soli buforowanej Trisem, pH 7,4 (TBS); lub (4) mA ß specyficznym dla CD11b, antygenu MAC-1, (Chemicon Internatio- nal) rozcie nczonym w stosunku 1:100 w 0,25% Triton X-100 i 1% króliczej surowicy w TBS; lub (5) mA ß specyficznym dla antygenu MHC II, (Pharmigen) rozcie nczonym w stosunku 1:100 w 0,25% Triton X-100 i 1% króliczej surowicy w TBS; lub (6) szczurzym mA ß specyficznym dla CD 43, (Phar- mingen) rozcie nczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (7) szczurzym mA ß specyficznym dla CD 45RA, (Pharmingen) rozcie nczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (8) szczurzym monoklonalnym A ß specyficznym dla CD 45RB, (Pharmingen) rozcie nczo- nym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (9) szczurzym monoklonalnym A ß specy- ficznym dla CD 45, (Pharmingen) rozcie nczonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (10) biotynylowanym chomiczym poliklonalnym A ß specyficznym dla CD3e, (Pharmingen) rozcie n- czonym w stosunku 1:100 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub (11) szczurzym mA ß specyficznym dla CD3, (Serotec) rozcie nczonym w stosunku 1:200 z 1% króliczej surowicy w PBS; lub z (12) roztworem PBS nie zawieraj acym pierwotnych przeciwcia l, zawieraj acym 1% normaln a surowic e ko nsk a. Skrawki histologiczne poddane dzia laniu roztworów przeciwcia l wymienionych w 1, 2 i 6-12 po- wy zej wcze sniej traktowano roztworem 1,0% Triton X-100, 0,4% nadtlenku wodoru w PBS przez 20 minut w RT aby zablokowa c endogenne peroksydazy. Nast epnie inkubowano je przez noc w 4°C z pierwotnymi przeciwcia lami. Skrawki poddane dzia laniu 3D6 lub 8E5 lub CD3e mA ß nast epnie pod- dano przez 1 godzin e w RT reakcji z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna ze sk lad- nikami zestawu „A" i „B" rozcie nczonymi 1:75 w PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlin- game, CA.). Skrawki poddane dzia laniu przeciwcia l specyficznych dla CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 i roztworem PBS pozbawionym pierwotnych przeciwcia l inkubowano przez 1 godzin e w RT od- powiednio z biotynylowanymi przeciwcia lami przeciw-szczurzym IgG (Vector) rozcie nczonymi 1:75 w PBS lub biotynylowanymi przeciwcia lami przeciw-mysim IgG (Vector) rozcie nczonymi 1:75 w PBS. Nast epnie skrawki przez 1 godzin e w RT reakcji z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna- biotyna ze sk ladnikami zestawu „A" i „B" rozcie nczonymi 1:75 w PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.). Skrawki wywo lano w 0,01% nadtlenku wodoru, 0,05% 3,3'-diaminobenzydynie (DAB) w RT. Skrawki przeznaczone do inkubacji z przeciwcia lami specyficznymi dla GFAP, MAC-1 i MHC II wcze- sniej traktowano 0,6% nadtlenkiem wodoru w RT aby zablokowa c endogenne peroksydazy, a nast ep- nie inkubowano przez noc w 4°C z pierwotnymi przeciwcia lami. Skrawki poddane dzia laniu przeciw- cia la GFAP inkubowano 1 godzin e w RT z biotynylowanymi przeciwcia lami przeciwmysiej IgG, wytwo- rzonymi u koni (Vector Laboratories; zestaw Vectastain Elite ABC Kit) rozcie nczonymi 1:200 w TBS. Nast epnie skrawki inkubowano przez 1 godzin e z kompleksem peroksydaza-awidyna-biotyna (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) rozcie nczonym 1:1000 w TBS. Skrawki inkubowane z przeciwcia lami mA ß specyficznymi dla MAC-1 i MHC II jako pierwotnymi przeciwcia lami kolejno pod- dano reakcji przez 1 godzin e w RT z biotynylowanymi przeciwcia lami przeciw-szczurzym IgG wytwo- rzonymi w królikach, rozcie nczonymi 1:200 w TBS, nast epnie inkubowane przez 1 godzin e z komplek- sem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna rozcienczonym 1:1000 w TBS. Skrawki inkubowane z przeciwcia lami specyficznymi dla GFAP, MAC-1 i MHC II wywo lano inkubuj ac je w RT z 0,05% DAB, 0,01% nadtlenkiem wodoru, 0,04% chlorkiem niklu, TBS odpowiednio przez 4 i 11 minut. Wyznakowane immunologicznie skrawki umieszczono na szklanych szkie lkach przedmiotowych (VWR, Superfrost slides), wysuszono na powietrzu przez noc, zanurzono w Propar (Anatech) i na lo- zono na nie szkie lka nakrywkowe stosuj ac Permount (Fisher) jako srodek osadzaj acy. Aby przeciwnie wybarwi c p lytki A ß podzestaw GFAP-dodatnich skrawków umieszczono na szkie lkach przedmiotowych Superfrost i inkubowano w wodnej 1% Thioflavin S (Sigma) przez 7 minut po obróbce immunohistochemicznej. Nast epnie skrawki odwodniono i oczyszczono w Propar, po czym na lo zono na nie szkie lka nakrywkowe osadzaj ac je z u zyciem Permount.PL 203 431 B1 38 8. Analiza obrazu Do oceny ilo sciowej immunoreaktywnych skrawków zastosowano Videometric 150 Image Ana- lysis System (Oncor, Inc. Gaithersburg, MD) sprzezony z mikroskopem Nikon Microphot-FX przez kamer e wideo CCD i monitor Sony Trinitron. Obraz skrawków by l przechowywany w buforze wideo i oznaczono próg koloru i nasycenia aby wybra c i policzy c ca lkowity obszar pikseli zajmowany przez wyznakowane immunologicznie struktury. Dla ka zdego skrawka hipokamp obrysowano r ecznie i obli- czono ca lkowity obszar pikseli zajmowany przez hipokamp. Procent obci azenia amyloidem zmierzono jako: (frakcja obszaru hipokampu zawieraj aca z logi A ß immunoreaktywne z mA ß 3D6) x 100. Podob- nie procent obci azenia neurytycznego zmierzono jako: (frakcja obszaru hipokampu zawieraj aca dys- troficzne neuryty reaguj ace z mA ß 8E5) x100. C-Imaging System (Comprix, Inc., Cranberry Township, PA) wykorzystuj acy program Simple 32 Software Application po laczono z mikroskopem Nikon Microphot-FX przez kamer e Optronics i zastosowano do ilo sciowej oceny procentu kory pozamodze- lowatej zaj etej przez GFAP-dodatnie astrocyty i MAC-1- i MHC II-dodatni mikroglej. Obraz immunore- aktywnych skrawków przechowywano w buforze wideo i wyznaczono próg monochromatyczny, aby wybra c i policzy c ca lkowity obszar pikseli zajmowany przez wyznakowane immunologicznie komórki. Dla ka zdego skrawka kor e pozamodzelowat a (RSC) r ecznie obrysowano i obliczono ca lkowity obszar pikseli zajmowany przez RSC. Procent astrocytozy zdefiniowano jako: (frakcja obszaru RSC zajmo- wana przez GFAP-reaktywne astrocyty) x 100. Podobnie procent mikroglejozy zdefiniowano jako: (frakcja obszaru RSC zajmowana przez mikroglej reaktywny z MAC-1 i MHC II) x 100. Do wszystkich analiz obrazu 6 skrawków na poziomie hipokampu grzbietowego, ka zdy oddzielony kolejnymi 240 µm przerwami, oznaczono ilo sciowo dla ka zdego zwierz ecia. We wszystkich przypadkach status leczniczy zwierz at nie by l znany obserwatorowi. Jakkolwiek powy zszy wynalazek opisano szczegó lowo w celu jego wyja snienia i zrozumienia, oczywiste jest, ze dokona c mo zna pewnych modyfikacji w ramach zakresu za laczonych zastrze ze n. Wszystkie cytowane publikacje i dokumenty patentowe wprowadza si e niniejszym w ca lo sci jako od- no sniki we wszystkich celach w stopniu, w jakim zosta ly one wymienione.PL 203 431 B1 39PL 203 431 B1 40 PL PL PL PL