CN104122400B

CN104122400B - 一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN104122400B
Application number: CN201410310072.6A
Authority: CN
Inventors: 郭亚楠; 秦俭; 陈刚
Original assignee: SHANGHAI EXCELL BIOLOGY PRODUCT CO Ltd
Current assignee: Suzhou Ecosai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2014-07-01
Filing date: 2014-07-01
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2034-07-01
Also published as: CN104122400A

Abstract

本发明涉及一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途，首先使用抗原β淀粉样前体蛋白免疫小鼠，确定免疫成功后，分离出小鼠脾脏和小鼠体内明显的淋巴结，提取总的RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增出抗体的轻、重链基因；然后组装与扩增scFv？DNA，构建pCANTAB5E-scFv重组质粒；再转化质粒得到单链抗体噬菌体库，通过筛选得到目标抗体；最后组装成人体β淀粉样前体蛋白检测试剂盒。本发明筛选得到的抗体检测范围较广，为0~1000pg/ml，线形相关系数高，检测灵敏度可达3.5pg/ml，且非常稳定，检测时可采用两步法、室温振荡的反应模式，对实验室条件及设备要求不高。

Description

一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途

【技术领域】

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途。

【背景技术】

人口老龄化是当今世界各国面临的重大社会问题，已经引起国际社会的广泛关注。据有关方面统计，我国北京、上海等大城市已迈入了老龄城市，下个世纪前半期我国就将进入老龄社会，老年人的心理及身体健康问题日益成为全社会关注的焦点。老年痴呆症是老年人脑部功能失调的一种表现，是以智力衰退、行为及人格变化为特征。典型临床症状包括有记忆力、抽象思考、定向力障碍，同时伴有社会活动能力减退。主要表现为健忘、目光呆滞、口齿迟钝，继而影响知觉神经，失去自理能力。它已成为老年人健康的一大克星。

阿尔兹海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是老年痴呆症一种常见形式。目前全世界大约有2500万AD患者。患者多为老年人，AD目前尚无有效疗法。该病患不仅患者自身痛苦，而且对于其家庭乃至整个社会都会造成极为消极的影响。迄今为止，AD发病的确切机理尚未完全清楚。但大量研究支持，淀粉样前体蛋白(Amyloidprecursorprotein，APP)产生的淀粉样蛋白(amyloid1-Peptide，A1)在AD的病理学上起了重要作用。患者大脑中β淀粉样蛋白出现异常蓄积，常在患者脑细胞内形成脑纤维组织纠结(neurofibrillarytangle，NFT)、脑细胞外形成老年斑(senileplague，SP)。因此，NFT和SP也被认为AD的病理诊断依据。β淀粉样蛋白(β-Amyloid)是由前体物质β淀粉样前体蛋白(APP)经酶解作用形成40到43个氨基酸的多肽。在机体内，APP普遍存在于人体的心脏、脑、肾、肺、肠等器官。在脑中，中枢神经系统神经元、星形细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞均能表达APP。正常情况下，Aβ仅有极少量表达，低浓度的Aβ对未分化、不成熟的神经元有营养作用，而高浓度的Aβ对已分化的成熟神经元则有毒性作用。Aβ的沉淀与APP的过度表达和异常加工有关，APP经β、γ分泌酶降解产生Aβ生成可溶性和不可溶性两种状态，不溶的以β折叠为主，上述构象有利于Aβ的聚集。Aβ在形成高密度、纤维状的聚合体后可引起神经毒性，从而妨碍神经细胞的正常生长与传导，最终导致神经细胞的死亡，引发AD。

目前，临床对于老年痴呆症的治疗，首先考虑的是对症治疗，如，神经节苷脂能有效修复受损或濒死的脑神经细胞，促进神经的修复再生及神经网络的重塑；补充胆碱类药物能改善其记忆和思维能力。研究β淀粉样蛋白在脑神经细胞内部的早期蓄积发现，在脑神经细胞外还未出现β淀粉样蛋白蓄积时，阿尔茨海默氏症就已经出现。这一发现或有助于提早诊断、治疗阿尔茨海默氏症，从而尽可能延缓病情恶化。研发人体β淀粉样蛋白检测试剂或试剂盒，尤其是操作方便、检测范围广、灵敏度高的检测抗体是十分重要的。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的结合分子。

本发明的再一的目的是，提供所述的结合分子的用途。

本发明的另一的目的是，提供一种核酸分子。

本发明的第四个目的是，提供所述的核酸分子的用途。

本发明的第五个目的是，提供一种表达载体。

本发明的第六个目的是，提供一种宿主细胞。

本发明的第七个目的是，提供一种组合物。

本发明的第八个目的是，提供一种检测阿尔茨海默氏症的试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种分离的结合分子，其能识别并结合人体β淀粉样蛋白或人体β淀粉样前体蛋白，所述的结合分子包含SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的结合分子在制备检测、治疗和/或预防阿尔茨海默氏症的药物中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

编码所述的结合分子的核酸分子。

所述的核酸分子序列如SEQIDNO.1所示。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的核酸分子在制备检测、治疗和/或预防阿尔茨海默氏症的药物中的应用。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种表达载体，所述的表达载体中含有编码如上所述的结合分子的DNA。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：

一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有如上所述的表达载体。

为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是：

一种组合物，所述的组合物含有有效量的如上所述的结合分子，以及药学上可接受的载体。

为实现上述第八个目的，本发明采取的技术方案是：

一种检测阿尔茨海默氏症的试剂盒，其包括如上所述的结合分子。

本发明优点在于：

1、本发明筛选的抗体非常稳定，检测时采用两步法、室温振荡的反应模式，此方法具有操作简便、反应快捷的优点，对实验室条件及设备要求不高，易于掌握和推广；

2、本发明的试剂盒检测范围较广，其检测范围为0～1000pg/ml，与市场主流产品相比，该试剂盒线形相关系数更高；

3、本发明的试剂盒灵敏度较高，其检测灵敏度最高可达3.5pg/ml，可用于老年痴呆症早期检测。

总体来说，本发明的试剂盒其质量及使用效果都达到了国内外领先的水平。

【附图说明】

附图1是pCANTAB-5E载体图谱。

附图2是血清抗体效价检测结果。

附图3是重链、轻链基因扩增产物的电泳图谱。

附图4是V_H和V_L连接后的ScFv基因的电泳图谱。

附图5是筛选的单链抗体的电泳图谱。

附图6是BioSource公司试剂盒的线性拟合曲线。

附图7是本发明试剂盒的线性拟合曲线。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明的技术路线是：

首先，使用抗原β淀粉样前体蛋白免疫小鼠，确定免疫成功后，分离出小鼠脾脏和小鼠体内明显的淋巴结，提取总的RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增出抗体的轻、重链基因。然后组装与扩增scFvDNA，构建pCANTAB5E-scFv重组质粒。再转化质粒得到单链抗体噬菌体库，通过筛选得到目标抗体。最后组装成人体β淀粉样前体蛋白检测试剂盒。

实施例1通过噬菌体展示技术构建和筛选单链抗体

1实验材料

1.1细胞及细胞株

E.coliTG1，用于pCANTAB-5E的转化；E.coliHB2151，用于scFv的表达。

1.2质粒载体

pCANTAB-5E：购自Pharmacia公司(被GE收购)，载体图谱见图1。

1.3试剂

Trizol总RNA抽提试剂盒、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂购自Invitrogen公司。TagDNA聚合酶、T4DNA连接酶及内切酶均购自NEB公司。DNA胶回收试剂盒购自天根公司。M13KO7辅助噬菌体购自Pharmacia公司(被GE收购)。

1.4基因扩增的引物序列(见表1)

表1基因扩增的引物序列表

2实验方法

2.1动物免疫

β淀粉样前体蛋白抗原与等量的弗氏完全佐剂混匀后，采用腹部和背部皮下多点注射方式免疫Balb/C小鼠。每隔14天免疫一次，4次加强免疫后，抽血用ELISA方法检测效价，具体方法为：

1)用磷酸盐缓冲液将血清按一定比例稀释后(稀释比例见图)，每孔50μl加在包被板上，于4℃放置过夜；

2)用200μl含牛血清白蛋白为2％(W/V)、蔗糖为3％(W/V)的磷酸盐缓冲液封闭液封闭包被板；

3)同时加入生物素化的抗人APPTotal抗体和标准品，每孔为50μl；样品中的APPTotal会与加入于孔中的生物素化的抗人APPTotal抗体及包被于酶标板上的单抗结合，形成免疫复合物；

4)用磷酸盐缓冲液洗涤包被板，游离的成分被洗去；

5)加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗去；

6)反应孔中有APPTotal，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变黄。在490nm处测OD值。

2.2分离纯化淋巴细胞

取出小鼠脾脏和小鼠体内明显的淋巴结。用PBS洗涤并移除多余脂肪组织，将脾脏和淋巴结置于200目不锈钢网膜中，轻轻研磨组织，使淋巴细胞通过网膜流入平皿中。用PBS轻轻冲洗不锈钢网膜和平皿后，轻轻吹打均匀后将细胞悬液置于15ml离心管中，离心收集细胞。

2.3提取淋巴细胞总RNA

按照Invitrogen公司的Trizol总RNA抽提试剂盒说明书提取淋巴细胞总RNA。

2.4反转录合成cDNA

反转录体系如下：

反应程序为：94℃5min，42℃60min，反应产物即为cDNA。

2.5扩增轻、重链基因

轻、重链基因扩增体系如下：

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。电泳胶回收纯化轻、重链基因片段。

2.6scFvDNA的组装与扩增

Linker引物和轻、重链基因扩增片段，通过重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)，使抗体V_H、V_L基因与Linker组装成V_H-Linker-V_L单链抗体。然后通过scFv单链抗体引物扩增scFvDNA。

重叠延伸拼接PCR反应体系为：

重叠延伸拼接PCR扩增条件为：94℃1min，63℃4min，作用7个循环；添加scFv单链抗体引物后再扩增scFvDNA，程序为94℃1min，55℃1min，72℃1min，作用30个循环，最后72℃延伸10min。

2.7单链抗体库的构建和鉴定

单链抗体scFv片段和噬菌粒载体pCANTAB-5E分别用SfiI和NotI进行酶切，之后连接、电转化入E.coliTG1感受态细胞。转化的细胞加入培养基37℃振荡培养，当OD600为0.8时，加入M13KO7辅助噬菌体，继续培养至终浓度10¹⁰pfu/ml。加氨苄青霉素至终浓度100μg/ml，继续培养过夜，即可得到单链抗体噬菌体抗体初级库。通过ELISA筛选最理想的单链抗体，并纯化出质粒，转入E.coliHB2151用于scFv的表达。

3实验结果

3.1ELISA方法检测血清效价

使用β淀粉样前体蛋白抗原免疫小鼠后，抽血用ELISA方法检测效价，结果见图2，结果表明稀释倍数增加到1:25600时血清中的抗体依然可明显检测到，表明免疫小鼠是成功的。

3.2重链、轻链基因扩增结果

取7μlPCR样品琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.3％，6V/cm电泳20min。结果如图3所示，V_H和V_L(具体是Vλ2back和MJλ4for的扩增产物)均位于250bp和500bp之间。

3.3V_H和V_L连接后的ScFv基因

取7μlPCR样品琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2％，6V/cm电泳20min。结果如图4所示，V_H和V_L拼接后，得到的ScFv基因约为750bp，其序列如SEQIDNO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，具体如下：

3.4单链抗体的鉴定

筛选获得步骤3.3所述序列的单链抗体后，纯化出质粒，转入E.coliHB2151用于scFv的表达，结果如图5所示，所得单链抗体分子量约为25KD。

实施例2组装人体β淀粉样前体蛋白试剂盒

ELISA筛选出合适单链抗体后，组装成人体β淀粉样前体蛋白试剂盒。该试剂盒包括抗体包被板条、标准品、浓缩生物素化抗体(单链抗体标记生物素)、浓缩酶结合物、试剂稀释液、浓缩洗涤液、显色剂及终止液。具体组成如表1所示。

表1本发明人体β淀粉样前体蛋白试剂盒的组成

抗体包被板条的制备包括以下步骤：用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液将本发明制备的鼠抗人体β淀粉样前体蛋白单链抗体稀释至1μg/ml，加在包被板上，用封板纸封板，在4℃放置24h过夜后，将包被板置于洗板机上，用pH值为7.2的吐温20含量为0.1wt％(V/V)的磷酸盐缓冲液洗板一次，然后加入pH值为7.2、含牛血清白蛋白为2wt％(W/V)、蔗糖为3wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液，在室温下放置2h，甩干封闭液，风干。风干的包被板装入铝箔袋中，加入干燥剂，密封即得抗体包被板条。

标准品的制备包括以下步骤：以pH值为7.2，含牛血清白蛋白为5wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液为溶剂，将人体β淀粉样前体蛋白重组蛋白标准品配制成2000pg/50μl/支的溶液，将该溶液置于-70℃低温环境中冻干2h，然后将其置于冷冻干燥机中冻干8h，密封即得标准品。

浓缩生物素化抗体为生物素标记的抗人体β淀粉样前体蛋白单链抗体，具体采用ThermoFisher：Sulfo-NHS-LC-BiotinKit(试剂盒货号：21435)来标记本发明的抗人体β淀粉样前体蛋白单链抗体。浓缩酶结合物为辣根过氧化物酶标记的链亲和素。试剂稀释液为pH值为7.2、牛血清白蛋白含量为1wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液。浓缩洗涤液为pH值为7.2、吐温20含量为0.1wt％(V/V)的磷酸盐缓冲液。显色剂为四甲基联苯二胺。终止液为1NHCL(1N盐酸)。

利用本发明的试剂盒进行人体β淀粉样前体蛋白检测，采用双抗体夹心ELISA法。抗人体β淀粉样前体蛋白单链抗体包被于酶标板上，同时加入标本、标准品和生物素化的抗人体β淀粉样前体蛋白单链抗体，标本、标准品中的APPTotal会与加入于孔中的生物素化的抗人APPTotal抗体及包被于酶标板上的单抗结合，形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗去。加入显色底物(显色剂)，若反应孔中有APPTotal，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变黄。在490nm处测OD值，APPTotal浓度与OD₄₉₀值之间呈正相关，可通过绘制标准曲线求出标本中APPTotal浓度。具体包括以下步骤：

试验所需自备试验器材：

1.酶标仪(490nm检测波长滤光片，570nm或630nm校正波长滤光片)；

2.高精度加液器及一次性吸头：0.5-10μl，2-20μl，20-200μl，200-1000μl；

3.微孔板振荡器，双蒸水或去离子水，坐标纸。

标本收集：

1.收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管；

2.血浆抗凝剂推荐使用EDTA，避免使用溶血，高血脂标本；

3.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除；

4.标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃或-70℃冰箱内，避免反复冻融；

5.可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释；

注：血清或血浆样本冻存后聚合的蛋白会遮盖抗原的表位，建议用试剂稀释液将血清或血浆样本做1:2稀释后检测。计算样本含量时应乘以稀释倍数。

注意事项：

1.试剂盒使用前请保存在2-8℃，除复溶后的标准品，其它成分不可冻结；

2.浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000rpm离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底；

3.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液；

4.若需要分次使用标准品，在标准品复溶后应按每一次用量分装，将其放在-20或-70℃贮存。避免反复冻融；

5.不同批号的试剂盒组份不能混用(洗涤液和反应终止液除外)；

6.充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻晃动酶标板，使加入孔中的反应液混匀；

7.酶免试验中标准品和样本检测时建议作复孔。

检测前准备工作：

1.提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温；

2.将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)，未用完的放回4℃冰箱；

3.标准品：加入试剂稀释液1.0ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)。然后根据需要进行稀释。建议标准曲线使用以下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/ml；

4.生物素化抗体工作液：按当次试验所需用量，用试剂稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)配置成生物素化抗体工作液。使用前30分钟准备。仅供当日使用；

5.酶结合物工作液：按当次试验所需要用量，用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1:100)配置成酶结合物工作液。使用前30分钟准备。仅供当日使用。

洗涤方法：

1.自动洗板机：要求注入的洗涤液为350μl，注入与吸出间隔20-30秒。洗板4次；

2.手工洗板：每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽孔内液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。

操作步骤：

1.从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于4℃；

2.留空白孔(若使用双波长读板，空白孔可以不设)；

3.提前准备好样本、标准品和生物素化抗体工作液；

4.先将不同浓度标准品(0mIU/ml孔加试剂稀释液)分别加入相应孔中(100μl/孔)；在每个样本孔中加入50μl样本稀释液和50μl样本(此时样本已做了1:2倍稀释，计算结果时样本含量要乘以2)；随后在样本和标准品孔中加入50μl生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔；

5.室温(20～25℃)孵育120分钟。最好使用微量振荡器(最低频率，100rpm)；

6.提前15分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置；

7.洗板5次；

8.除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔；

9.室温(20～25℃)避光孵育60分钟。最好使用微量振荡器(最低频率，100rpm)；

10.洗板5次；

11.加入显色底物(包括空白孔)100μl/孔，室温(22～25℃)，避光孵育15分钟；

12.加入终止液(包括空白孔)100μl/孔，混匀后即刻测量OD490值(10分钟内)。

结果判断：

1.每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值(若不减零孔值，标准曲线的零孔应相交于Y轴)；

2.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度；

3.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

实施例3本发明试剂盒的稳定性和灵敏度测试

比较本发明人体β淀粉样前体蛋白试剂盒与目前市场上的人体β淀粉样前体蛋白试剂盒(invitrogen，货号KHB3442)的稳定性和灵敏度。

1实验方法

(1)用磷酸盐缓冲液将鼠抗人β淀粉样前体蛋白抗体稀释至1μg/ml，每孔50μl加在包被板上，于4℃放置过夜；

(2)用200μl含牛血清白蛋白为2％(W/V)、蔗糖为3％(W/V)的磷酸盐缓冲液封闭液封闭包被板；

(3)同时加入标准品和生物素化的抗人APPTotal抗体，每孔为50μl，每个浓度梯度重复三次；标准品中的APPTotal会与加入于孔中的生物素化的抗人APPTotal抗体及包被于酶标板上的单抗结合，形成免疫复合物；

(4)用磷酸盐缓冲液洗涤包被板，游离的成分被洗去；

(5)加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗去；

(6)反应孔中有APPTotal，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变黄。在490nm处测OD值。

2实验结果

(1)稳定性

比较市场主流产品(BioSource)和本发明的试剂盒，参见表2和表3，发现检测相同浓度标准品时，本发明的试剂盒表现更稳定，读数标准差更低。使用Excell软件绘制标准曲线，参见图6和图7，本发明的试剂盒线性拟合曲线R²更高，显示更好的稳定性。

表2BioSource公司试剂盒ELISA原始数据读数

表3本发明试剂盒ELISA原始数据读数

(2)灵敏度

比较市场主流产品(BioSource)和本发明试剂盒，发现检测较低浓度样品时诸如：3.5pg/ml或4.5pg/ml(见表4)，本发明试剂盒表现更灵敏，3.5pg/ml或4.5pg/ml的真实读数和理论读数(通过标准曲线计算得到)较接近，3.5pg/ml或4.5pg/ml的真实读数低于15pg/ml的真实读数，符合实际。然而BioSource的试剂盒表现不佳，3.5pg/ml或4.5pg/ml的真实读数和理论读数(通过标准曲线计算得到)符合得不太好，更重要的是3.5pg/ml或4.5pg/ml的真实读数高于15pg/ml的真实读数，不符合实际。

表4本发明和BioSource公司试剂盒的灵敏度检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>上海依科赛生物制品有限公司

<120>一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途

<130>/

<160>16

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>768

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gtcctcgcaactgcggcccagccggccatggcccaagtgcaactgcaggagtctgacgct60

gagttggtgaagcctgtggcctcagggaagctgtcctgtaaggttggatggatcaacgct120

ggcaatggtactattcattggatgaagcagaggcccgtgcatggcctggaatggatttct180

ggctataccttcactagctatagtactaagtacaatgagaagttcaagggcaaggccacc240

ttgaccgcggacaaatccacaagcgcggcctacatggatctcagcagcctgacatctgag300

gactctgctgtctattattgtgcaagaagtcgtaggaattggggccaaggtaccacggtc360

accgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggac420

attgagctcacccagtctccagcttcccctgctgtgactgtggccattggacagacaatc480

tcatgcagggccagcaaaagtgtcagtaattctagcagtggtaaccatgtgcagcagaag540

ccaggacagccacccaaactctatggttataacaacgtattcggcgggatcggggtccct600

gccaggggctccagctcaggaaacgggacagacttgaccatcactggggctcctgtggaa660

gatgaggctgactattactgtcagcacagtagggagtattatgcaagctggtaccggccc720

tcaggagggacaaagttggaactgaaacgggcggccgcagaatgactc768

<210>2

<211>255

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

ValLeuAlaThrAlaAlaGlnProAlaMetAlaGlnValGlnLeuGln

151015

GluSerAspAlaGluLeuValLysProValAlaSerGlyLysLeuSer

202530

CysLysValGlyTrpIleAsnAlaGlyAsnGlyThrIleHisTrpMet

354045

LysGlnArgProValHisGlyLeuGluTrpIleSerGlyTyrThrPhe

505560

ThrSerTyrSerThrLysTyrAsnGluLysPheLysGlyLysAlaThr

65707580

LeuThrAlaAspLysSerThrSerAlaAlaTyrMetAspLeuSerSer

859095

LeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysAlaArgSerArgArg

100105110

AsnTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGly

115120125

SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleGluLeuThr

130135140

GlnSerProAlaSerProAlaValThrValAlaIleGlyGlnThrIle

145150155160

SerCysArgAlaSerLysSerValSerAsnSerSerSerGlyAsnHis

165170175

ValGlnGlnLysProGlyGlnProProLysLeuTyrGlyTyrAsnAsn

180185190

ValPheGlyGlyIleGlyValProAlaArgGlySerSerSerGlyAsn

195200205

GlyThrAspLeuThrIleThrGlyAlaProValGluAspGluAlaAsp

210215220

TyrTyrCysGlnHisSerArgGluTyrTyrAlaSerTrpTyrArgPro

225230235240

SerGlyGlyThrLysLeuGluLeuLysArgAlaAlaAlaGluLeu

245250255

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aggtsmarctgcagsagtcwgg22

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tgaggagacggtgaccgtggtcccttggcccc32

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gacattgagctcacccagtctcca24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccgtttgatttccagcttggtgcc24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ccgttttatttccagcttggtccc24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ccgttttatttccaactttgtccc24

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ccgtttcagctccagcttggtccc24

<210>10

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ggtggaggcggttcaggcggaggtgggtctggcggtggcggatcggacattgagctcacc60

cagtctcca69

<210>11

<211>77

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cgatccgccaccgccagagccacctccgcctgaaccgcctccacctgaggagacggtgac60

cgtggtcccttggcccc77

<210>12

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gtcctcgcaactgcggcccagccggccatggcccaggtsmarctgcagsagtcwgg56

<210>13

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gagtcattctgcggccgcccgtttgatttccagcttggtgcc42

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gagtcattctgcggccgcccgttttatttccagcttggtccc42

<210>15

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gagtcattctgcggccgcccgtttcagttccaactttgtccc42

<210>16

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gagtcattctgcggccgcccgtttcagctccagcttggtccc42

Claims

1.一种分离的结合分子，其能识别并结合人体β淀粉样前体蛋白，其特征在于，所述的结合分子具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的结合分子在制备检测、治疗和/或预防阿尔茨海默氏症的药物中的应用。

3.编码权利要求1所述的结合分子的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子序列如SEQIDNO.1所示。

5.权利要求3或4所述的核酸分子在制备检测、治疗和/或预防阿尔茨海默氏症的药物中的应用。

6.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体中含有编码权利要求1所述的结合分子的DNA。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求6所述的表达载体。

8.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的权利要求1所述的结合分子，以及药学上可接受的载体。

9.一种检测阿尔茨海默氏症的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的结合分子。