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CN1180843C - 多表位疫苗 - Google Patents

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CN1180843C CNB951943685A CN95194368A CN1180843C CN 1180843 C CN1180843 C CN 1180843C CN B951943685 A CNB951943685 A CN B951943685A CN 95194368 A CN95194368 A CN 95194368A CN 1180843 C CN1180843 C CN 1180843C
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丹尼斯·詹姆斯·莫斯
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Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
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Abstract

本发明涉及一种重组多表位细胞毒T淋巴细胞疫苗。该疫苗包括至少一种重组蛋白，所述重组蛋白包括来自一种或多种病原体的多个细胞毒T淋巴细胞表位，其中所述的至少一种重组蛋白基本上不含天然存在于细胞毒T淋巴细胞表位旁侧的序列。此外，本发明还提供了一种多核苷酸，它包括至少一种编码来自一种或多种病原体的多个细胞毒T淋巴细胞表位的序列。

Description

多表位疫苗
技术领域
本发明涉及含多个细胞毒T淋巴细胞表位的疫苗，本发明还涉及包括多个细胞毒T淋巴细胞表位的编码序列的多核苷酸。
发明内容
CD8+αβ细胞毒T淋巴细胞(CTL)识别与I类主要组织相容复合物1(MHC)的特异等位基因相关联的短肽(表位，一般长度8-10氨基酸)。这些肽表位主要是通过一种被认为是涉及多催化性蛋白体复合物的蛋白水解过程2-7，由胞液蛋白所产生的。适当长度的肽被转运到内质网中，在内质网中特定的表位与MHC相联。然后MHC/表位复合物被转运到细胞表面供CTL识别。关于CTL表位旁侧的序列对这些表位的蛋白水解加工的影响尚存争议8-12。然而，通过构建编码含9种CD8 CTL表位的人工多肽蛋白的重组痘病毒，本发明人已确定天然位于CTL表位旁侧的序列不为I类加工所必需，即在多表位蛋白中的每一种表位总能通过自身多表位疫苗感染的靶细胞被有效地加工并呈递给相应的CTL克隆。
因此，本发明的首要方面是一种重组多表位细胞毒T淋巴细胞疫苗。该疫苗包括一种重组蛋白，所述重组蛋白包括来自一种或多种病原体的多个细胞毒T淋巴细胞表位，其中所述的至少一种重组蛋白基本上不含天然存在于细胞毒T淋巴细胞表位旁侧的序列。
优选的是，至少一种重组蛋白不含任何天然存在于细胞毒T淋巴细胞表位旁侧的序列。然而，应理解的是天然位于细胞毒T淋巴细胞表位旁侧的短序列(例如，1-5个氨基酸)可能被包括在内。术语“基本上不含天然存在于细胞毒T淋巴细胞表位旁侧的序列”应被认为包括这样的短旁侧序列。
本发明的第二个方面是一种多核苷酸，它包括至少一种编码来自一或多种病原体的多个细胞毒T淋巴细胞表位的序列，其中所述的至少一种序列基本上不含编码天然存在于细胞毒T淋巴细胞表位旁侧的肽的序列。
同样，术语“基本上不含编码天然存在于细胞毒T淋巴细胞表位旁侧的肽的序列”应理解为有可能包括天然位于细胞毒T淋巴细胞表位旁侧的短肽(1-5个氨基酸)编码序列。
本发明的第三个方面为核酸疫苗，该疫苗包括本发明第二个方面所涉及的多核苷酸及一种可接受的载体。
本发明的第四个方面为疫苗配制品，该疫苗包括本发明第一个方面所涉及的重组蛋白及一种可接受的载体和/或佐剂。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述的至少一种重组蛋白包括至少三种细胞毒T淋巴细胞表位，所述的至少一种序列编码至少三种细胞毒T淋巴细胞表位。
在另一个的优选实施方案中，表位来自多种病原体。
还应看到的是，本发明的疫苗可以包括免疫调节化合物(如细胞因子)，其它蛋白/化合物(如melittin或调节蛋白)和/或佐剂。该疫苗还可以包括辅助表位/CD4表位和蛋白，B细胞表位，或含有这类表位的蛋白，如破伤风毒素。本发明的疫苗的另一个例子包括一重组疫苗的构建物，其中含CTL表位的多表位连在含B细胞和/或CD4表位的胞外糖蛋白上。
本发明的疫苗可由各种载体，如痘病毒载体、禽痘病毒载体、细菌载体、病毒样颗粒(VLP’s)和棒状病毒载体来输送，或通过核酸接种技术来输送。由于多表位蛋白在制备中和/或注射后在血清中很容易对蛋白水解敏感，我们认为这种疫苗最好采用核酸接种技术12、或采用保护多表位蛋白不受蛋白水解作用的载体系统或佐剂系统输送。关于载体的其它资料可参见Chatfield等，疫苗，7，495-499，1989；Taylor等，疫苗，13，539-549，1995；Hodgson，细菌疫苗载体，《农业疫苗》。
本发明的多表位疫苗还可包括来自一种病原体的大量表位(如10个或更多)，以便靶种群HLA多样性也包括在内。例如含受HLA A1、A2、A3、A11和A24限制的表位的疫苗可以包括大约90％的高加索种群。
本发明的多表位疫苗还可由受单个HLA等位基因限制的多个表位来构建。
在本发明的第四个方面的优选实施方案中，疫苗配制品包括ISCOMs，关于ISCOMs的资料可参见澳大利亚专利558258，EP019942，US4578269和US4744983，这些公开的专利在此附上供参考。
附图说明
为了使本发明的性质得到更清楚的理解，现根据下面的实施例和附图对本发明的优选形式进行描述，其中：
图1：表达编码含有9种CTL表位的多表位蛋白的合成DNA插入物的重组痘病毒的构建。加框的序列表示线性B细胞表位。
图2：重组多表位痘病毒构建物表达的每种表位的CTL识别。
图3：多表位痘病毒可激发表位特异性应答。通过用多表位痘病毒以0.01MOI感染外周血单核细胞(PBMC)2小时并洗涤2次后，从供体(A)CM-A24，A11，B7，B44；(B)YW-A2，B8，B38；(C)NB-A2，A24，B7，B35产生了大量效应细胞。于10％FCS/1640 RPMI中培养10天后，在一标准的5小时铬释放检测14中，这些大量效应细胞用于对抗用所示肽(10μM)致敏的自体植物凝聚素T细胞的母细胞靶细胞(E∶T＝20∶1)。通过加入经照射的自体A型LCLs14产生的大量效应细胞(LCL∶PMBC＝1∶50)给出的结果与以上所示的相似。
图4：表示含10个鼠CTL表位的多表位DNA插入物的构建。
图5：示出图1的多表位DNA插入物的序列。
图6：提供了在脾细胞上进行的CTL检测的结果，该脾细胞收集自用包括图3所示的DNA插入物的重组痘病毒接种过的小鼠。
图7：显示多表位痘病毒接种后第5周与用MCMV进行攻击后第4天的脾细胞MCMV滴度比较(土标准误差)。p值-未配对的student T-测试
图8：用不同质粒对Balb/C小鼠进行的DNA接种。
图9：来自Balb/c、CBA、C56BL/6品系的小鼠用小鼠多表位痘病毒免疫接种(IP)后，取出其脾脏，用肽(如A和A’)重新刺激脾细胞，流感病毒NP肽“TYQRTRALV刺激产生效应细胞。效应细胞再用于肽包被的靶细胞(A-J)，病毒感染的靶细胞(A’-J’)和肿瘤靶细胞(I’)。病毒感染的靶细胞用尿囊液感染(A’、F’)作为阴性对照，或者鼠多表位痘病毒(Vacc Mu PT)(B’-D’、F’-J’)感染的靶细胞用人多表位痘病毒(VaccHu PT)感染作为阴性对照。
具体实施方式
实施例1
来自一些Epstein-Barr病毒核抗原(EBNA)的9种I类限制性CTL表位已在以前用CTL克隆确定10.18-20。这些克隆是从一系列正常健康的EB病毒(EBV)血清阳性供体分离而来的并受不同HLA等位基因限制(表1)。一种编码含所有这九种CTL表位的单一人工蛋白的重组多表位痘病毒(多表位痘病毒)已被构建(见图1)。编码这一蛋白的DNA序列是通过重叠延伸剪接(SOEing)和聚合酶链反应(PCR)连接六个重叠的寡核苷酸制备得到。该插入序列克隆人pBluescript II，测序鉴定后转入pBCBO715的痘病毒驱动子后，得到pSTPT1。该质粒随后通过利用标记-获救重组16产生多表位痘病毒。通过这种痘病毒表达的人工多表位蛋白因此不含在出发蛋白中发现的位于CTL表位旁侧的天然序列(图1)
CTL克隆       关联表位       来源       HLA限制性       参考文献
LC13          FLRGRAYGL      EBNA3      B8              13
LC15          QAKWRLQTL      EBNA3      B8              14
CS31          EENLLDFVRF     EBNA6      B44             15
YW22          SVRDRLARL      EBNA3      A0203           14
CM4           KEHVIQNAF      EBNA6      B44             13
NB26          YPLHEQHGM      EBNA3      B3501           14
LX1*         HLAAQGMAY      EBNA3      7               14
JSA2          DTPLIPLTIF     EBNA3      B51#/A2        13
CM9           IVTDFSVIK      EBNA4      A11             16
表1：CTL克隆、其关联表位、出发蛋白(来源)和它们的HLA限制性的描述。克隆的头两个字母指供体。*未测试(见图2)。#近期的证据提示此表位可能受HLA-B51限制。除了EENLLDFVRF和DTPLIPLTIF，所有表位均被最小化。
编码多表位氨基酸序列的DNA序列是以在哺乳动物中最常使用的密码子来设计的，并在起始密码上游加入一Kozac序列13和一BamHI位点。六个重叠20个碱基对的70聚体寡核苷酸通过重叠延伸剪接(SOEing)在20μl反应体系中剪接在一起，该反应体系包括标准PCR缓冲液、2mM MgCl2， 0.2mM dNTPs，1.5U Taq聚合酶(热起始温度94℃)，采用下面的热循环程序：94℃10秒，45℃20秒和72℃20秒(40个循环)。将每一凝胶纯化的二聚体样本的一半，与加入的0.5μl的α32P dCTP在第二次PCR反应中(12个循环)相结合，该反应液经6％丙烯酰胺凝聚电泳，将相应于六聚体产物位置的带分离出来。在退火温度56℃和25个循环的条件下，用2个20聚体的寡聚核苷酸PCR扩增所述的六聚体。凝胶纯化的片段克隆到pBluescriptII KS-的EcoRV位点，测序鉴定后，利用痘苗质粒载体pBCBO715中的BamH/SalI位点将该片段克隆人痘病毒P7.5早期/晚期启动子之后，得到pSTPT1。TK-重组病毒的构建是利用上述的标记获救组合16在pSTPT1和VV-WR-L929间进行的。噬菌斑纯化的病毒进行TK表型检验，以病毒DNA的Southern印迹分析16检测适当的基因组排列。
为了确定是否每种表位都可以从多表位蛋白中加工而得，用多表位痘病毒感染一组表达限制每种表位的HLA等位基因的靶细胞。在标准铬释放检测中每种表位的特异性自体CTL克隆用作为效应细胞。在所有检测中，CTL克隆均识别和杀伤与HLA相配的、用多表位痘病毒和适当的(见表1)EBNA痘病毒(阳性对照)感染的靶细胞，但不识别和杀伤TK-痘病毒(阴性对照)感染的靶细胞(见图2)。
图2显示了在多表位痘病毒构建物中表达的每种表位的CTL识别。效应细胞CTL如表1所列(E∶T＝5∶1)。靶细胞(见下面)用表达(i)由CTL克隆识别的EPV核抗原(EBNA)(见表1)(阳性对照)，(ii)TK-(阴性对照)，或(iii)多表位构建物(即多表位痘病毒)的重组痘病毒感染。靶细胞的痘病毒感染以5∶1的感染倍数进行，37℃孵育14-16小时后用于标准的5小时51Cr-释放检测29。检测时不再使用LX1克隆。有两种EBV类型的靶细胞，A型和B型，它们的EBNA蛋白序列存在显著差别。CTL克隆LC13，LC15，CM4，NB26，JSA2和CM9识别用A型EBV而非B型转化的细胞，CTL克隆CS31和YW22识别A型EBV和EBV转化的细胞10.18- 20。用于A型特异性CTL的靶细胞因此是用B型病毒转化的自身淋巴样干细胞细胞系(B-型LCLs)。用于CS31和YW22的靶细胞为EBV阴性B细胞母细胞，其是用抗CD40抗体和rIL-4确定的。
另一系列的实验采用了多表位痘病毒体外激发来自外周血单核细胞(PBMC)的二次CTL应答，该PBMC来自健康的EBV血清阳性供体。产生的大量CTL培养物随后在标准铬释放检测中用作效应细胞，以对抗肽表位致敏的自身PHA母细胞。多表位痘病毒能够激发CTL应答，该应答对由每一供体表达的HLA等位基因所限制的表位有特异性(图3)。
图3显示了多表位痘病毒能够激发起表位特异应答。用多表位痘病毒以0.01MOI感染外周血单核细胞(PBMC)2小时并洗涤两次后，从供体(A)CM-A24，A11，B7，B44；(B)YW-A2，B8，B38和(C)NB-A2，A24，B7，B35产生了大量效应细胞。在10％FCS/1640 RPMI中培养10天后，这些效应细胞在一标准的5小时铬释放检测19中用于对抗靶细胞，该靶细胞为用所示肽(10μM)致敏的自身植物凝聚素T细胞母细胞(E∶T＝20∶1)。另外通过加人受过辐射的自身A型LCLs19(LCL∶PBMC＝1∶50)产生的大量效应细胞所得到的结果与上述结果相似。
两种被单克隆抗体(分别为8G10/4822和8E7/5523)识别的线性B细胞表位(STNS和NNLVSGPEH)被掺入到多表位构建物(图1)的两端以跟踪多表位蛋白的表达。用这些抗体对多表位痘病毒感染的淋巴样干细胞细胞系(LCLs)和加工缺陷型T2细胞系6，7进行Western印迹分析和免疫荧光抗体染色，没有检测到多表位蛋白产物(数据未附)。用同样的P7.5启动子由痘病毒表达的重组蛋白通常很容易检测到24，这示意多表位蛋白在哺乳动物细胞的胞质中很快被降解。这一降解作用不依赖于LMP2和7，因为T2细胞系不表达这些与蛋白体相关的内肽酶6.7。这一现象与其它在哺乳动物细胞中表达截短的蛋白或肽的研究结果25一致，很可能反应了这种蛋白不能折叠为二级或三级结构。
构建了一个含人多表位的谷光甘肽S-转移酶的融合表达载体。编码人多表位的DNA序列用BamHI/HincII从pBSpolytope中切下来并克隆人pGex-3x(GST基因融合系统，Pharmacia)的BamHI/AmaI限制性位点中，得到pFuspoly。该质粒用于在细菌中通过标准的诱导方法表达多表位融合体。该细菌的一份于上样缓冲液中裂解并在20％SDSPAGE胶上与分子量标准一起电泳。电泳结果表明所期望的约为38KD的蛋白(人多表位加上GST结构(26KD))被含该质粒的细菌表达。用两种单克隆抗体8G10/48和8E7/55进行的Western印迹分析证明所检测的融合体含人多表位，在多表位构建物的每个末端附加有两个线性B细胞表位(分别为STNS和NNLVSCPEH)。这一蛋白可以组装入脂质体或ISCOMs中。
使用谷光甘肽琼脂糖珠进行的GST纯化以纯化融合蛋白的尝试由于在细菌抽提物上清中缺乏融合蛋白而失败。所有的融合蛋白都与细胞碎片共沉淀。由于在不同细菌培养物中由其自身表达的GST存在于细胞抽提物上清中并易于纯化，说明纯化方法没有问题。这些数据提示除非被隔离到细菌包涵体中，否则融合蛋白在细菌中被迅速降解，用GST系统纯化融合蛋白是很困难的。
实施例2
材料和方法
表达鼠多表位蛋白的重组痘病毒的构建
为了得到分别对应于三种品系小鼠所带的H-2Db、H-2Kb，H-2Kd，H-2Kk和H-2Ld的两种表位，选择了来源于各种疾病的10种I类小鼠CTL表位(见表2)。这些氨基酸序列是如此安排以便使头5个表位中的每一个都受不同的HLA等位基因的限制，紧接着是第二组6-10个表位。利用通用密码使用资料将这两组表位变换为DNA序列。这两种DNA序列用一个SpeI位点分开，并在5’端加上一个XbaI限制性位点，在3’端加上一个AvrII位点。同时在5’端还加入一BamHI限制性位点、一Kozac序列13和一甲硫氨酸起始密码。而在3’端有一个来自Plamodium falciparum的B细胞表位，一个终止密码和一个SaII限制性位点，见图4和5。代表这341bp序列的相互重叠20个碱基对的5个75聚体寡核苷酸和一个76聚体寡核苷酸，通过重叠延伸剪接(SOEing)14和聚合酶链反应(PCR)剪接在一起。引物二聚体由引物1和2、3和4、5和6(各0.4μg)组成，反应在含标准1×Pfu PCR缓冲液，0.2mM dNTPs和1U克隆的Pfu DNA聚合酶(热起始温度94℃)的40μl体系中进行，使用Perkin Elmer 9600 PCR仪，热程序如下：94℃10秒，42℃20秒和72℃20秒，5个循环。5个循环结束后PCR程序暂停于72℃，2号和3号反应液以20μl等分混合(1号反应液留在PCR仪中)并再进行5个循环。在第10个循环时程序暂停，20μl1号反应液加入2和3号反应混合物中，再继续进行5个循环。40μl的混合样品经4％Nusieve琼脂糖凝胶(FMC)纯化，将相应于正确大小的片段的胶带剪下并通过Watmann 3MM滤纸旋转离心回收。采用上述的标准反应混合液和50℃的退火温度，使用2个20聚体的寡核苷酸经25个循环PCR扩增全长产物。全长PCR片段用4％Nusieve琼脂糖凝胶纯化后，克隆到pBluescript II KS-中的EcoRV位点，得到pBSMP，并测序检测突变。含正确序列的质粒中的DNA插入物用BamHI/SalI限制酶切下，并用相同的酶克隆到穿梭载体质粒pBCB0715的痘病毒P7.5早期/晚期启动子的后面，得到pSTMOUSEPOLY。按前述方法16，通过标记获救重组，用pSTMOUSEPOLY和VV-WR-L929构建TK-重组病毒。噬菌斑纯化后的病毒用病毒DNA的Souther印迹分析17进行TK表型检测和正确基因组排列检测。
用重组鼠多表位痘病毒接种小鼠
重组痘病毒用于各接种3只Balb/cv，C57BL/6和CBA三种品系小鼠。静脉注射50μl含5×107pfu的痘病毒后，让小鼠恢复3个星期，本实验中用TK-痘病毒作为阴性对照注射三种品系的小鼠。
细胞毒T细胞检测
从接种3个星期的小鼠收集脾细胞，用适当的肽(1μg/ml)体外再刺激16。没有肽的再刺激作为阴性对照。培养7天后，收集再刺激的效应细胞用于5小时51Cr-释放检测。在检测中用作靶细胞的是分别来自这三种品系小鼠的被每种品系所带的肽包被的ConA母细胞，效应细胞与靶细胞之比为50∶1，10∶1和2∶1，结果如图6所示。
结果
鼠重组多表位痘病毒的构建
表2列出了包括在鼠多表位中的表位。
             表2  鼠CTL多表位中的CTL表位
Figure C9519436800161
多表位DNA插入物的构建概括于图4。图5表明多表位序列。
CTL检测
多表位中每一表位均引起带有相应MHC等位基因的小鼠的初次CTL应答。没有观察到受相同等位基因限制的两个表位间存在竞争。(作为TK-对照的CBA小鼠的高fluNP反应很可能是因为天然获得了流感病毒)。
含有来自各种病原体的受各种MHC等位基因限制的多CTL表位的多表位构建物，显然能够激发对多表位痘病毒中每种表位的初次CTL应答。这一点显然能应用于所有需要CTL应答作保护的疫苗中。例如，多HIV CTL表位可以包括在一治疗性疫苗中以预先保护逃逸突变表达的表位，从而防治疾病的发展。
鼠多表位小鼠具有能在体外和体内杀伤卵清蛋白转染的细胞系EG7的SHNFEKL特异性CTL
体外杀伤EG7肿瘤细胞的SIINFEKL特异性CTL
来自用鼠痘病毒致敏的小鼠的脾细胞于接种4周后收集，并在体外用10μg/mlSIINFEKL再刺激7天。效应细胞不能溶解未转染的亲代细胞系EL4但能溶解EG7肿瘤细胞和用SIINFEKL致敏的ELA细胞。
鼠多表位提供的体内抗EG7肿瘤的保护作用
通过皮下注射，小鼠(C57B6)接受人多表位痘病毒(Thomson等，1995)或鼠多表位痘病毒(107pfu/小鼠/ip)，4周后再接受107EL4或EG7肿瘤细胞(Moore等，1988，细胞54，777)(每组10或11只小鼠)
这里给出了第9天出现可见肿瘤(所有的肿瘤直径均大于1cm)的小鼠数目。
        人多表位痘病毒     鼠多表位痘病毒
    EG7     EL4     EG7     EL4
    10/10*     10/10     0/11     10/10
*(有两只小鼠的肿瘤直径小于1cm)
抗MCMV的保护作用
多表位痘病毒免疫BALB/c小鼠5周后，再用MCMV(K181株，8×103pfu，100μl腹膜内注射)攻击小鼠。攻击4天后测定每克脾脏的病毒滴度，结果见图7(方法参见Scalzo等17)。
DNA质粒输送的多表位疫苗的评价
上述多表位蛋白含有一种由单克隆抗体识别的线性抗体表位。然而，如上所述，该多表位蛋白不能在感染了多表位痘病毒的细胞中检测到，这表明它很不稳定；这很可能是它没有折叠结构所致。因此考虑采用核酸接种技术或采用一种防止蛋白水解的佐剂系统(如脂质体或ISCOMs)可能是最好的输送多表位疫苗的方法。
将来自pCIS2.CXXNH(Eaton et al(1986)“生物化学”25(26)p8343)的CMV启动子盒，按LacZ基因相同的方向，克隆到pUC8的EcoRI位点，得到质粒pDNAVacc(在DNA接种实验中用作对照质粒)。然后在该质粒多克隆位点的XhoI处插入小鼠多表位(来自pBSMP)，得到pSTMPDV。质粒pRSVGM/CMVMP带有许多来源于不同质粒的片段。RSV启动子取自pRSVHygro(Long etal(1991)，人类免疫学，31，229-235)，鼠GM-CSF基因来自pMPZen(GM-CSF)(Johnson etal(1989)，EMBO，8，441-448)，CMV启动子盒来自pCS(Kienzie etal(1992)Arch.Virol，124，p123-132)。鼠多表位肽被克隆到CMV盒的多克隆位点中的SmaI处。鼠GM-CSF基因和鼠多表位基因均采用来自SV40的双向polyA。
9只6周龄的Balb/c系雌鼠分别皮下注射在50μlPBS(见下图)中的50μg的pDNAVacc(质粒对照)，或pSTMPDV(仅有鼠多表位)，或pRSVGM/CMVMP(鼠GM-CSF和鼠多表位)。在第三周用另外50μg的相同质粒加强免疫。接种8周后处死这些小鼠并取出脾脏。分离出脾细胞并将之按上述方法与多肽共培养以用于痘病毒接种动物。然后采用标准51Cr-释放测试分析这些效应细胞对包被有下述肽的P815细胞的作用，所述的肽对应于鼠多表位中由Balb/c小鼠提呈的表位。测试分别以2∶1，10∶1和50∶1的E∶T比值进行6小时。
这些实验的结果如图8所示。
鼠多表位痘病毒诱导的抗肽包被的和病毒感染的靶细胞的特异性CTL活性
方法
1、接种与效应细胞的制备
用5×107pfu痘病毒腹膜内注射(IP)接种小鼠(每组3只)。3周后以同样的途径及同样的痘病毒用量加强免疫小鼠。初次接种6周后取出脾脏，用ACK缓冲液(0.15MNH4Cl，1mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA)溶解红细胞后，分离脾细胞(免疫学新方法，JECoLigan，AM Kruisbeek，DH Margulies，EM Shevach，W Strober编，1994，John Wiley andSans Inc.，USA)。每孔5×106脾细胞在T细胞培养液(RPMI/10％胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，5×10-5M2-巯基乙醇)中用肽(1μg/ml)再刺激7天，然后用51Cr标记的靶细胞17进行细胞毒T淋巴细胞(CTL)分析。再刺激所用的肽如上所述为A-J。效应细胞用于抗肽包被的靶细胞A-J，或病毒感染的靶细胞(A′-J′)或转染的抗原表达靶细胞(I′)。
2、靶细胞的制备
在这些检测中用作靶细胞的细胞系为对应于Balb/c(H-2d)的P815，对应于C57BL/6(H-2b)的EL-4和EG7，对应于CBA(H-2k)L929的L929，或分别来自Balb/c，C57BL/6或CBA小鼠的ConA母细胞1。为表达CTL杀伤所需的表位，将靶细胞与(i)肽(A-J)，(ii)痘病毒(B′-D′，F′-J′)，或(iii)流感病毒(A′，E′)预孵育，或(iv)在SILNFEKL表位系统的情况下作为E1-4(EG7)的卵清蛋白表达质粒转染子保存(I′)。
(i)肽包被的靶细胞(A-J)：靶细胞于1000rpm离心5分钟，倾去上清至细胞浓度约为200μg/ml，在细胞沉淀中加入10-20μl RPMI(无肽)或200μg/ml肽RPMI储存液(肽包被的)(终浓度10μg/ml)。细胞沉淀中加入100μl51Cr，细胞于37℃孵育1小时。然后用RPMI/10％FCS通过一FCS垫洗涤细胞二次，悬浮细胞至105/ml，以用作CTL检测中的靶细胞。
(ii)痘病毒(Vacc.)感染的靶细胞(B′-D′，F′-J′)：用于感染靶细胞的痘病毒为鼠多表位(Vacc MuPT)，以人多表位(Vacc HuPT)作阴性对照。痘病毒感染的细胞系为P815(B′-D′)，L929(F′)和EL-4(G′-J′)。靶细胞于1000rpm离心5分钟。倾去上清至大约200μl，加入20μl痘病毒(109pfu/ml)以10∶1的感染复数(MOI)感染细胞(约106个细胞)，于37℃孵育1小时。再加入5ml RPMI/10％FCS，混匀细胞并于37℃孵育过夜。随后离心弃上清，细胞沉淀中加入100μl51Cr，细胞于37℃孵育1小时。通过一FCS垫用RPMI/10％FCS洗涤细胞两次，细胞重悬至105/ml用作CTL检测中的靶细胞。
(iii)流感病毒感染的靶细胞(A′，E′)：A/PR/8/34流感病毒株用于感染Balb/c靶细胞(A′)，A/Taiwan/1/86(IVR-40)病毒株用于感染CBA靶细胞(E′)。尿囊液用作阴性对照。流感病毒感染的细胞系为P815(A′)和L929(E′)。于1000rpm/5分钟离心靶细胞，弃上清。向细胞沉淀加入50μl流感病毒(108/ml EID)或尿囊液，50μl51Cr，400μl RPMI/1％FCS，使总体积为500μl，于37℃孵育1小时。再加入10mlRPMI/10％FCS，继续于37℃孵育2小时。然后通过一FCS垫用RPMI/10％FCS洗涤细胞两次，细胞重悬至105/ml以用作CTL检测中的靶细胞。
(iv)表达卵清蛋白的靶细胞(I)：EG7细胞是用含鸡卵清蛋白cDNA的表达质粒转染的EL-4细胞(Moore MW，Carbone FR和Bevan BJ(1988)抗原加工和呈递的I类途径中的可溶蛋白的介绍，细胞54：777-785)。这些细胞保存于RPMI/10％FCS，20mM肝素，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，1001U/ml青霉素和100μg/ml链霉素中。每月一次在以500μg/mlGeneticin(G-418)中选择并保持质粒。不含肽的EL-4细胞(EL4 no pep.)用作阴性对照。于1000rpm/5分钟离心细胞，上清弃至约200μl。于细胞沉淀中加入100μl51Cr，细胞于37℃培养1小时。通过FCS垫用RPMI/10％FCS洗涤细胞2次，细胞重悬至105/ml用作CTL检测中的靶细胞。
3.CTL检测
再刺激的脾细胞(5×106ml)以三份分配(100μl)于三种效应细胞：靶细胞比(50，10，2×104效应细胞：1×104靶细胞)用于CTL检测。向所有的效应细胞和对照孔中加入100μl靶细胞(105/ml)(自发释放＝100μl培养液；最大释放＝100μl0.5％SDS/RPMI/10％FCS)。微滴板以500rpm离心5分钟，于37℃孵育6小时。500rpm/5分钟再次离心板，取25μl上清计数51Cr的释放。特异性溶解百分率表示三次计数的平均值：100×(检测cpm-自发cpm)/(最大cpm-自发cpm)。
结果如图9所示。
DNA接种实验
初次DNA接种实验说明多表位可用DNA接种输送。另外通过细胞因子基因(GM-CSF)的共输送，接种可以得以改善，尽管在这个实验中这种改善没有统计显著性。
目前的系统显然不是最优化的。有希望的改善可能是使用潜在的更好的质粒载体如来自Vical，San Diego的载体(Sedegah M，R Hedstrom，P Hobart，SLHoffman，1994，用编码环子孢子蛋白的质粒DNA免疫接种的抗疟疾保护作用，美国国家科学进展91，9866-9870)或使用采用基因枪的更好的输送系统(肌肉注射)(Sun WH，Burkholder JK，Sun J，CulpJ.Lu XG，Pugh TD，Ershler WB，YangNS  使用基因枪体内转送细胞因子基因减弱小鼠肿瘤生长。美国国家科学进展92：2889-2893，1995)。另外，CTL表位的活化常常要求CD4 T细胞的帮助17，因而在构建物中包括辅助表位或蛋白可以通过小鼠DNA疫苗多表位提高CTL活化的水平和可靠性。
“初始抗原过失”的缺乏或当个体已具有对多表位中的一个表位的应答时，某一多表位激发对多表位中所有表位的免疫反应能力
介绍
初始抗原过失(Orignal antigenic sin)是用于一种基于抗体的现象的术语，指对一个表位应答的现存抗体阻止与第一个表位处于相同蛋白的第二个表位的免疫反应的发生(Benjamini E.，Andria M.L.，Estin C.D.，Notron，F.L.and Leung C.Y.(1988)，对一种蛋白抗原的一个表位应答的克隆研究。表位识别克隆活化的随机性和克隆优势的发展，免疫学杂志141，55)。产生这一现象的原因是，特异于第一个表位的活化B细胞在特异于第二个抗体的幼稚B细胞有机会结合抗原并将之加工并提呈给T帮助者细胞之前，就结合并清除了所有可遇到的抗原。当一个体在已具有对多表位中某一表位的应答时再接受多表位接种，也可能发生类似的现象。在其它所有表位被提呈给幼稚T细胞前，已存在的CTL可能杀死了所有表达多表位的细胞。
方法
为了检测这一可能性，小鼠(Balb/c)被104pfu的鼠巨细胞病毒(MCMV)(K181株-Scalzo等，1995)感染，5周后，发生特异于MCMV表位YPHFMFTNL的强CTL应答(Scalzo等1995-图2A)。这些小鼠随后接种鼠多表位痘病毒，并于10天后检测脾细胞对其它三种由该系小鼠多表位携带的表位的CTL特异性(RPQASGVYM，淋巴细胞绒毛膜脑膜炎病毒核蛋白，H-2Ld；TYQRTRALV，流感病毒核蛋白，H-2K4和SYIPSAEKI，P.Berghei环子孢子蛋白，H-2Kd)。
结果
多表位接种后观察到对应于这三种新表位的各自的应答，说明当四种表位共存于多表位中时，YPHFMPTNL特异性CTL不阻止RPQASGVYM：TYQRTRALV和SYIPSAEKI特异性CTL的活化(对照动物接受人多表位痘病毒而接受小鼠多表位痘病毒，仅表现出YPHFMPTNL特异性CTL)。
这一系列实验说明，一种多表位假如设计为包括各种不同的疾病，一个已具有其中某一个疾病的个体再接受这种多表位疫苗仍可以对多表位中余下的CTL表位具有免疫能力。
正如本领域的熟练技术人员所显而易见的，本发明入已指出CTL表位的天然旁侧序列不为I类加工所需，也就是说多表位蛋白中的每一个表位总能通过自身痘病毒感染的靶细胞有效地被加工和提呈给适当的CTL克隆。本领域熟练技术人员会明白多表位可以包括非天然存在于表位旁侧的序列。
如上面所讨论的，本发明可以利用一系列表位，一系列的表位可以从Brusic等，核酸研究1994，22；3663-5所给的Internet地址上得到。
本领域的熟练技术人员应理解的是，在下违反前面充分阐述的本发明的实质或范围条件下，可对本发明的实施方案做大量的改变和/或修改。因而这里所提供的实施方案应看作是举例说明而非限制性的。
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Claims (77)

1、一种多核苷酸，包括编码多个CTL表位的核酸序列，其中每个CTL表位基本上不含天然存在的旁侧序列，且其中至少两个编码CTL表位的序列是邻接的或者由间插序列分隔，其中间插序列(i)不包含起始密码子或者(ii)不编码天然存在于这些表位旁侧的序列。
2、一种多核苷酸，包括编码多个CTL表位的核酸序列，其中每个CTL表位基本上不含天然存在的旁侧序列，且其中编码CTL表位的序列是邻接的。
3、权利要求1或2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码至少三个CTL表位。
4、权利要求1或2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码四个CTL表位。
5、权利要求1或2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码九个CTL表位。
6、权利要求1或2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码十个CTL表位。
7、权利要求1或2的多核苷酸，进一步限定为表达载体。
8、权利要求7的多核苷酸，其中所述的载体选自病毒载体和病毒样颗粒(VLP)。
9、权利要求8的多核苷酸，其中所述的病毒载体是痘苗病毒载体。
10、权利要求8的多核苷酸，其中所述的病毒载体是禽痘病毒载体。
11、权利要求8的多核苷酸，其中所述的载体是VLP。
12、权利要求1的多核苷酸，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或来自一种肿瘤抗原。
13、权利要求2的多核苷酸，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或来自一种肿瘤抗原。
14、权利要求3的多核苷酸，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或来自一种肿瘤抗原。
15、权利要求4的多核苷酸，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或来自一种肿瘤抗原。
16、权利要求5的多核苷酸，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或来自一种肿瘤抗原。
17、权利要求6的多核苷酸，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或来自一种肿瘤抗原。
18、权利要求1的多核苷酸，其中多个CTL表位来自多个病原体。
19、权利要求2的多核苷酸，其中多个CTL表位来自多个病原体。
20、权利要求3的多核苷酸，其中多个CTL表位来自多个病原体。
21、权利要求4的多核苷酸，其中多个CTL表位来自多个病原体。
22、权利要求5的多核苷酸，其中多个CTL表位来自多个病原体。
23、权利要求6的多核苷酸，其中多个CTL表位来自多个病原体。
24、权利要求12的多核苷酸，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
25、权利要求13的多核苷酸，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
26、权利要求14的多核苷酸，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
27、权利要求15的多核苷酸，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
28、权利要求16的多核苷酸，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
29、权利要求17的多核苷酸，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
30、权利要求18的多核苷酸，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
31、权利要求19的多核苷酸，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
32、权利要求20的多核苷酸，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
33、权利要求21的多核苷酸，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
34、权利要求22的多核苷酸，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
35、权利要求23的多核苷酸，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
36、权利要求1或2的多核苷酸，进一步包括一编码T辅助细胞表位、B细胞表位或毒素的核酸序列。
37、权利要求36的多核苷酸，其中所述核酸序列编码T辅助细胞表位。
38、权利要求36的多核苷酸，其中所述核酸序列编码B细胞表位。
39、权利要求36的多核苷酸，其中所述核酸序列编码毒素。
40、一种核酸疫苗，该疫苗包括一种多核苷酸和一种可接受的载体，该多核苷酸包括编码多个CTL表位的核酸序列，其中每个CTL表位基本上不含天然存在的旁侧序列，且其中至少两个编码CTL表位的序列是邻接的或者由间插序列分隔，其中间插序列(i)不包含起始密码子或者(ii)不编码天然存在于这些表位旁侧的序列。
41、一种核酸疫苗，该疫苗包括一种多核苷酸和一种可接受的载体，该多核苷酸包括编码多个CTL表位的核酸序列，其中每个CTL表位基本上不含天然存在的旁侧序列，且其中编码CTL表位的序列是邻接的。
42、包括多个CTL表位的合成或重组蛋白，其中每个CTL表位基本上不含天然存在的旁侧序列，且其中至少两个CTL表位是邻接的或者由间插序列分隔，其中间插序列(i)不包含甲硫氨酸或者(ii)不包含天然存在于这些表位旁侧的序列。
43、包括多个CTL表位的合成或重组蛋白，其中每个CTL表位基本上不含天然存在的旁侧序列，且其中CTL表位是邻接的。
44、权利要求42或43的合成或重组蛋白，其中所述的蛋白包括至少三个CTL表位。
45、权利要求42或43的合成或重组蛋白，其中所述的蛋白包括四个CTL表位。
46、权利要求42或43的合成或重组蛋白，其中所述的蛋白包括九个CTL表位。
47、权利要求42或43的合成或重组蛋白，其中所述的蛋白包括十个CTL表位。
48、权利要求42的合成或重组蛋白，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或一种肿瘤蛋白。
49、权利要求43的合成或重组蛋白，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或一种肿瘤蛋白。
50、权利要求44的合成或重组蛋白，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或一种肿瘤蛋白。
51、权利要求45的合成或重组蛋白，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或一种肿瘤蛋白。
52、权利要求46的合成或重组蛋白，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或一种肿瘤蛋白。
53、权利要求47的合成或重组蛋白，其中至少一个CTL表位来自一种病原体或一种肿瘤蛋白。
54、权利要求42的合成或重组蛋白，其中多个CTL表位衍生自多个病原体。
55、权利要求43的合成或重组蛋白，其中多个CTL表位衍生自多个病原体。
56、权利要求44的合成或重组蛋白，其中多个CTL表位衍生自多个病原体。
57、权利要求45的合成或重组蛋白，其中多个CTL表位衍生自多个病原体。
58、权利要求46的合成或重组蛋白，其中多个CTL表位衍生自多个病原体。
59、权利要求47的合成或重组蛋白，其中多个CTL表位衍生自多个病原体。
60、权利要求48的合成或重组蛋白，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
61、权利要求49的合成或重组蛋白，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
62、权利要求50的合成或重组蛋白，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
63、权利要求51的合成或重组蛋白，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
64、权利要求52的合成或重组蛋白，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
65、权利要求53的合成或重组蛋白，其中病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
66、权利要求54的合成或重组蛋白，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
67、权利要求55的合成或重组蛋白，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
68、权利要求56的合成或重组蛋白，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
69、权利要求57的合成或重组蛋白，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
70、权利要求58的合成或重组蛋白，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
71、权利要求59的合成或重组蛋白，其中该多个病原体选自Epstein Barr病毒、流感病毒、巨细胞病毒和腺病毒。
72、权利要求42或43的合成或重组蛋白，进一步包括一T辅助细胞表位，B细胞表位或毒素。
73、权利要求72的合成或重组蛋白，其中所述合成或重组蛋白进一步包括一T辅助细胞表位。
74、权利要求72的合成或重组蛋白，其中所述合成或重组蛋白进一步包括一B细胞表位。
75、权利要求72的合成或重组蛋白，其中所述合成或重组蛋白进一步包括一毒素。
76、多表位疫苗，该疫苗包括一合成或重组蛋白和可接受的载体，该合成或重组蛋白包括多个CTL表位，其中每个CTL表位基本上不含天然存在的旁侧序列，且其中至少两个CTL表位是邻接的或者由间插序列分隔，其中间插序列(i)不包含甲硫氨酸或者(ii)不包含天然存在于这些表位旁侧的序列。
77、多表位疫苗，该疫苗包括一合成或重组蛋白和可接受的载体，该合成或重组蛋白包括多个CTL表位，其中每个CTL表位基本上不含天然存在的旁侧序列，且其中CTL表位是邻接的。
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