NO20160043A1

NO20160043A1 - Aß fragment, farmasøytisk sammensetning, samt anvendelse

Info

Publication number: NO20160043A1
Application number: NO20160043A
Authority: NO
Inventors: Frédérique Bard; Nicki J Vasquez; Ted Yednock; Dale B Schenk
Original assignee: Janssen Alzheimer Immunotherap
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2002-01-25
Also published as: ATE434444T1; US20040265308A1; NO340768B1; UY26182A1; EA200501560A1; SG140456A1; BG66083B1; DE60042451D1; IL146435A0; IS6154A; CN1359301A; EP2305302A3; EP2305302B1; US20110306756A1; KR101058482B1; IL187526A0; WO2000072880A2; EA200101251A1; SG143032A1; NO337301B1

Abstract

Oppfinnelsen tilveiebringer forbedrede agenser og fremgangsmåter for behandling av sykdommer assosiert med amyloide avleiringer av A??i hjernen til en pasient. Slike fremgangsmåter medfører å administrere agenser som induserer en fordelaktig immunogen respons mot den amyloide avleiringen. Fremgangsmåtene er egnet for profylaktisk og terapeutisk behandling av Alzheimers sykdom. Foretrukne agenser innbefatter N-terminale fragmenter av A??og antistoffer som binder til det samme.

Description

Denne søknaden er en delvis fortsettelse av USSN 09/322.289, innlevert 28. mai, 1999, som er inkorporert med referanse i dens helhet for alle formål.

Teknisk område

Oppfinnelsen er i de tekniske områdene i immunologi og medisin.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv sykdom som resulterer i senil demens. Se generelt Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff et al., Nature 373, 476-477

(1995); Games et al., Nature 373, 523 (1995). Generelt faller sykdommen i to kategorier: sen igangsetting, som forekommer i høy alder (65+ år) og tidlig igangsetting, som utvikles i god tid før den senile perioden, dvs. mellom 35 og 60 år.

I begge sykdomstypene er patologien den samme, men abnormitetene har en tendens til å være mer alvorlige og omfattende i tilfeller som begynner i ung alder. Sykdommen karakteriseres ved minst to typer lesjoner i hjernen, senile plakk og knipper av nervefibriller. Senile plakk er områder med uorganisert nevropil opp til 150 nm på tvers med ekstracellulær lagring av amyloid i midten, som er synlig med mikroskopisk analyse av hjernevevssnitt. Knipper av nervefibriller er intracellulære avleiringer av mikrotubuli-assosiert tau-protein som består av to filamenter tvunnet rundt hverandre i par.

Den prinsipielle bestanddelen i plakkene er et peptid kalt Ap eller p-amyloid peptid. Ap-peptid er et indre fragment på 39-43 aminosyrer av et forløperprotein kalt amyloidforløperprotein (APP). Flere mutasjoner i APP-proteinet har blitt korrelert med nærværet av Alzheimers sykdom. Se f.eks. Goate et al., Nature 349, 704 (1991)

(valin717til isoleucin); Chartier Harlan et al., Nature 353, 844 (1991) (valin<717>til glysin); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (valin<717>til fenylalanin); Mullan et al., Nature Genet. 1, 345 (1992) (en dobbeltmutasjon som forandrer lysin59<5->metionin5<96>til asparagin<595->leucin<596>). Slike mutasjoner er antatt å forårsake Alzheimers sykdom med økt eller forandret prosessering av APP til Ap, spesielt prosessering av APP til

økte mengder av den lange formen av Ap (dvs. Api-42 og Api-43). Mutasjoner i andre gener, slik som presenilingenene PS1 og PS2, er antatt å affisere prosessering av APP indirekte til å generere økte mengder av lang form Ap (se Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Disse observasjonene indikerer at Ap, og spesielt dets lange form, er et forårsakende element i Alzheimers sykdom.

McMichael, EP 526.511, foreslår administrering av homeopatiske doser (mindre enn eller lik 10-<2>mg/dag) av Ap til pasienter med AD fastsatt på forhånd. I et typisk menneske med ca. 5 liter plasma vil selv den øvre grensen av denne dosen forventes å generere en konsentrasjon som ikke er høyere enn 2 pg/ml. Den normale Ap-konsentrasjonen i humant plasma er vanligvis i området 50-200 pg/ml (Seubert et al., Nature 359, 325-327 (1992)). Fordi den foreslåtte dosen i EP 526.511 med nød og neppe ville forandre nivået av endogent sirkulerende Ap og fordi EP 526.511 ikke anbefaler anvendelse av et adjuvans, slik som et immunstimulerende middel, virker det usannsynlig at noen terapeutisk gevinst vil bli oppnådd.

I motsetning til dette er den foreliggende oppfinnelsen bl.a. rettet mot behandling av Alzheimers og andre amyloidogene sykdommer ved administrering av Ap-fragmenter eller antistoff til bestemte epitoper i Ap til en pasient under betingelser som genererer en fordelaktig immunrespons i pasienten. Oppfinnelsen innfrir dermed et stort behov for terapeutiske kurer for å forebygge eller bedre nevropatologien og, i noen pasienter, den kognitive svekkelsen assosiert med Alzheimers sykdom.

Denne søknaden er relatert til W099/27944, innlevert 30. november, 1998; USSN 60/067.740, innlevert 2. desember, 1997; USSN 60/080.970, innlevert 7. april, 1998; og USSN 09/201.430, innlevert 30. november, 1998, der hver av disse er inkorporert med referanse i sin helhet for alle formål.

Oppsummering av den krevde oppfinnelsen

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å forebygge eller behandle en sykdom assosiert med amyloide avleiringer av Ap i hjernen til en pasient. Slike sykdommer innbefatter Alzheimers sykdom, Downs syndrom og kognitiv svekkelse. Sistnevnte kan forekomme med eller uten andre karakteristika for en amyloidogen sykdom. Noen fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer administrering av en effektiv dose av et antistoff som binder spesifikt til en komponent i en amyloid avleiring i pasienten. Slike fremgangsmåter er spesielt egnet for å forebygge eller behandle Alzheimers sykdom i mennesker. Noen fremgangsmåter medfører administrering av en effektiv dose av et antistoff som binder til Ap. Noen fremgangsmåter medfører administrering av en effektiv dose av et antistoff som binder spesifikt til en epitope i restene 1-10 i Ap. I noen fremgangsmåter binder antistoffet spesifikt til en epitope i restene 1-6 i Ap. I noen fremgangsmåter binder antistoffet spesifikt til en epitope i restene 1-5 i Ap. I noen fremgangsmåter binder antistoffet spesifikt til en epitope i restene 1-7 i Ap. I noen fremgangsmåter binder antistoffet spesifikt til en epitope i restene 3-7 i Ap. I noen fremgangsmåter binder antistoffet spesifikt til en epitope i restene 1-3 i Ap. I noen fremgangsmåter binder antistoffet spesifikt til en epitope i restene 1-4 i Ap. I noen fremgangsmåter binder antistoffet til en epitope innbefattende en fri N-terminal rest i Ap. I noen fremgangsmåter binder antistoffet til en epitope i restene 1-10 i Ap, der rest 1 og/eller rest 7 i Ap er asparaginsyre. I noen fremgangsmåter binder antistoffet spesifikt til Ap-peptid uten å binde til fullengde amyloidforløperprotein (APP). I noen fremgangsmåter er antistoffisotypen humant lgG1.

I noen fremgangsmåter binder antistoffet til en amyloid avleiring i pasienten og induserer fjerning av den amyloide avleiringen. En slik fjerning kan for eksempel bli utført med Fc-reseptormediert fagocytose.

Fremgangsmåtene kan bli anvendt på både symptomfrie pasienter og de som har sykdomssymptomer. Antistoffet anvendt i slike fremgangsmåter kan være et humant, humanisert, kimærisk eller ikke-humant antistoff og kan være monoklonalt eller polyklonalt. I noen fremgangsmåter fremstilles antistoffet fra et menneske immunisert med Ap-peptid, der mennesket kan være pasienten som skal bli behandlet med antistoff.

I noen fremgangsmåter administreres antistoffet med en farmasøytisk bærer som en farmasøytisk blanding. I noen fremgangsmåter administreres antistoff ved en dose på 0,0001 til 100 mg/kg, fortrinnsvis minst 1 mg/kg kroppsvekt av antistoff. I noen fremgangsmåter administreres antistoffet i flere doser over en lengre periode, for eksempel på minst seks måneder. I noen fremgangsmåter administreres antistoffet som en langvarig frigjøringsblanding. Antistoffet kan for eksempel bli administrert intraperitonealt, oralt, subkutant, intrakranialt, intramuskulært, lokalt, intranasalt eller intravenøst.

I noen fremgangsmåter administreres antistoffet til pasienten ved å administrere et polynukleotid som koder for minst én antistoffkjede. Polynukleotidet blir uttrykt for å produsere antistoffkjeden i pasienten. Eventuelt koder polynukleotidet for tunge og lette antistoffkjeder. Polynukleotidet blir uttrykt for å produsere de tunge og lette kjedene i pasienten. I noen fremgangsmåter blir pasienten monitorer! for nivå av administrert antistoff i pasientens blod.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å forebygge eller behandle en sykdom assosiert med amyloide avleiringer av Ap i hjernen til en pasient. For eksempel kan fremgangsmåtene bli anvendt for å behandle Alzheimers sykdom, Downs syndrom eller kognitiv svekkelse. Slike fremgangsmåter medfører å administrere fragmenter av Ap eller analoger derav for å utløse en immunogen respons mot bestemte epitoper i Ap. Noen fremgangsmåter medfører å administrere en effektiv dose til en pasient av et polypeptid inneholdende et N-terminalt segment på i hvert fall restene 1-5 i Ap, der den første resten i Ap er den N-terminale resten til polypeptidet, der polypeptidet er fri for et C-terminalt segment av Ap. Noen fremgangsmåter medfører å administrere en effektiv dose til en pasient av et polypeptid inneholdende et N-terminalt segment av Ap, der segmentet begynner på restene 1-3 i Ap og slutter på restene 7-11 i Ap. Noen fremgangsmåter medfører å administrere en effektiv dose til en pasient av en agens som induserer en immunogen respons mot et N-terminalt segment av Ap, der segmentet begynner på restene 1-3 i Ap og slutter på restene 7-11 i Ap, uten å indusere en immunogen respons mot en epitope i restene 12-43 i Ap43.

I noen av fremgangsmåtene ovenfor kobles det N-terminale segmentet til Ap på dets C-terminal til et heterologt polypeptid. I noen av fremgangsmåtene ovenfor kobles det N-terminale segmentet til Ap på dets N-terminal til et heterologt polypeptid. I noen av fremgangsmåtene ovenfor kobles det N-terminale segmentet til Ap på dets N- og C-terminaler til første og andre heterologe polypeptider. I noen av fremgangsmåtene ovenfor kobles det N-terminale segmentet til Ap på dets N-terminal til et heterologt polypeptid og på dets C-terminal til minst én ekstra kopi av det N-terminale segmentet. I noen av fremgangsmåtene ovenfor, det heterologe polypeptidet og dermed en B-cellerespons mot det N-terminale segmentet. I noen av fremgangsmåtene ovenfor innbefatter polypeptidet videre minst én ekstra kopi av det N-terminale segmentet. I noen av fremgangsmåtene ovenfor består polypeptidet fra N-terminal til C-terminal av det N-terminale segmentet til Ap, flere ekstra kopier av det N-terminale segmentet og det heterologe aminosyresegmentet. I noen av fremgangsmåtene ovenfor innbefatter det N-terminale segmentet Ap 1-7. I noen av fremgangsmåtene ovenfor innbefatter det N-terminale segmentet Ap3-7.

I noen fremgangsmåter er fragmentet fri for minst de 5 C-terminale aminosyrene i Ap43. I noen fremgangsmåter består fragmentet av opp til 10 sammenhengende aminosyrer fra Ap. Fragmenter administreres vanligvis ved mer enn 10 mikrogram per dose per pasient.

I noen fremgangsmåter administreres fragmentet med et adjuvans som øker immunresponsen til Ap-peptidet. Adjuvanset og fragmentet kan enten bli administrert etter hverandre eller sammen som en blanding. Adjuvanset kan for eksempel være aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat, MPL™, QS-21 (Stimulon™) eller ufullstendig Freunds adjuvans.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre farmasøytiske blandinger innbefattende fragmenter av Ap eller andre agenser som utløser immunogen respons til de samme epitopene i Ap, som beskrevet ovenfor, og et adjuvans. Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske blandinger innbefattende ethvert av antistoffene beskrevet ovenfor og en farmasøytisk godkjent bærer.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å screene et antistoff for aktivitet i behandling av en sykdom assosiert med avleiringer av Ap i hjernen til en pasient (f.eks. Alzheimers sykdom). Slike fremgangsmåter medfører å la antistoffet komme i kontakt med et polypeptid inneholdende minst fem sammenhengende aminosyrer av et N-terminalt segment av Ap, som begynner på en rest mellom 1 og 3 i Ap, der polypeptidet er fri for et C-terminalt segment av Ap. Deretter bestemmer man om antistoffet binder spesifikt til polypeptidet, fordi spesifikk binding gir en indikasjon på at antistoffet har aktivitet i behandling av sykdommen.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å screene et antistoff for evnen til å fjerne en antigenassosiert biologisk enhet. Slike fremgangsmåter medfører å kombinere den antigenassosierte biologiske enheten og antistoffet og fagocytterende celler som har Fc-reseptorer i et medium. Mengden av den antigenassosierte biologiske enheten som er igjen i mediet blir deretter monitorert. En reduksjon i mengden av den antigenassosierte biologiske enheten indikerer at antistoffet bidrar til å fjerne den antigenassosierte biologiske enheten. Antigenet kan bli gitt som en vevsprøve eller i isolert form. For eksempel kan antigenet bli tilveiebragt som en vevsprøve fra hjernen til en pasient med Alzheimers sykdom eller et pattedyr som har Alzheimers patologi. Andre vevsprøver der antistoffer kan bli testet mot fjerningsaktivitet innbefatter kreftvevsprøver, viralt infiserte vevsprøver, vevsprøver innbefattende inflammatoriske celler, ikke-malign unormal cellevekst eller vevsprøver som innbefatter en unormal ekstracellulær matriks.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for deteksjon av en amyloid avleiring i en pasient. Slike fremgangsmåter medfører å administrere til pasienten et antistoff som binder spesifikt til en epitope i aminosyrene 1-10 i Ap, og detektere nærvær av antistoffet i hjernen til pasienten. I noen fremgangsmåter binder antistoffet til en epitope i restene 4-10 i Ap. I noen fremgangsmåter er antistoffet merket med en paramagnetisk markør og detekteres med kjernemagnetisk resonanstomografi.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre diagnostiske testsett egnet for anvendelse i fremgangsmåtene ovenfor. Et slikt testsett innbefatter et antistoff som binder spesifikt til en epitope med restene 1-10 i Ap. Noen testsett har en markør som beskriver anvendelse av antistoffet for diagnose in vivo eller monitorering av Alzheimers sykdom.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1: Antistofftiter etter injeksjon av transgene mus med Api-42.

Figur 2: Amyloid mengde i hippocampus. Prosenten av området i hippocampusregionen okkupert av amyloide plakk, definert med reaktivitet med det Ap-spesifikke monoklonale antistoffet 3D6, ble bestemt med kvantitativ bildeanalyse på datamaskin av immunreagerte hjernesnitt. Verdiene for individuelle mus er vist sortert etter behandlingsgruppe. Den horisontale linjen for hver gruppe indikerer medianverdien til fordelingen. Figur 3: Nevrittisk dystrofi i hippocampus. Prosenten av området i hippocampusregionen okkupert av dystrofisk nevritt, definert med deres reaktivitet med det humane APP-spesifikke monoklonale 8E5, ble bestemt med kvantitativ bildeanalyse på datamaskin av immunreagerte hjernesnitt. Verdiene for individuelle mus er vist for gruppen behandlet med AN1792 og den PBS-behandlede kontrollgruppen. Den horisontale linjen for hver gruppe indikerer medianverdien til fordelingen. Figur 4: Astrocytose i retrosplenial korteks. Prosenten av området i den kortikale regionen okkupert av astrocytter positive for glialt fibrillært surt protein (GFAP) ble bestemt med kvantitativ bildeanalyse på datamaskin av immunreagerte hjernesnitt. Verdiene for individuelle mus er vist sortert etter behandlingsgruppe og mediangruppeverdier er indikert med horisontale linjer. Figur 5: Geometrisk gjennomsnittlige antistofftitere til Api-42 etter immunisering med åtte ulike doser av AN1792 inneholdende 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100 eller 300 H9- Figur 6: Kinetikk av antistoffrespons til AN1792-immunisering. Titere er uttrykt som geometrisk gjennomsnitt av verdier for de 6 dyrene i hver gruppe. Figur 7: Kvantitativ bildeanalyse av den kortikale amyloidmengden i PBS- og AN1792-behandlede mus. Figur 8: Kvantitativ bildeanalyse av den nevrittiske plakkmengden i PBS- og AN 1792-behandlede mus. Figur 9: Kvantitativ bildeanalyse av prosenten av retrosplenial korteks okkupert av astrocytose i PBS- og AN1792-behandlede mus. Figur 10: Lymfocyttproliferasjonstest på miltcellerfra AN1792-behandlet (øvre panel) eller PBS-behandlet (nedre panel) gruppe. Figur 11: Totale Ap-nivåer i korteksen. Et scatterplott av individuelle Ap-profiler i mus immunisert med Ap eller APP-derivater kombinert med Freunds adjuvans. Figur 12: Amyloid mengde i korteksen ble bestemt med kvantitativ bildeanalyse av immunreagerte hjernesnitt for mus immunisert med Ap-peptidkonjugatene Api-5, Ap1-12 og AP13-28; fullengde Ap-aggregatene AN 1792 (Api-42) og AN 1528 (Ap1-40) og den PBS-behandlede kontrollgruppen. Figur 13: Geometrisk gjennomsnittlige titere til Ap-spesifikt antistoff for grupper med mus immunisert med Ap eller APP-derivater kombinert med Freunds adjuvans. Figur 14: Geometrisk gjennomsnittlige titere til Ap-spesifikt antistoff for grupper med marsvin immunisert med AN 1792, eller et palmitoylert derivat derav, kombinert med ulike adjuvantia. Figur 15 (A-E): Ap-nivåer i korteksen til 12 måneder gamle PDAPP-mus behandlet med AN 1792 eller AN 1528 med ulike adjuvantia. Figur 16: Gjennomsnittlig titer til mus behandlet med polyklonalt antistoff til Ap. Figur 17: Gjennomsnittlig titer til mus behandlet med monoklonalt antistoff 10D5 til Ap. Figur 18: Gjennomsnittlig titer til mus behandlet med monoklonalt antistoff 2F12 til Ap. Figur 19: Epitopekart: Begrenset N-terminal respons. Dag 175 serum fra cynomolgusaper ble testet med ELISA mot en serie av 10-mer overlappende peptider (SEKV ID NR:1-41) som dekker den fullstendige AN1792-sekvensen. Dyr nummer F10920M viser en representativ N-terminalbegrenset respons til peptidet DAEFRHDSGY (SEKV ID NR:9), som dekker aminosyrene 1-10 i AN1792-peptidet som ble anvendt som immuniserende antigen. Figur 20: Epitopekart: Ikke-begrenset N-terminal respons. Dag 175 serum fra cynomolgusaper ble testet med ELISA mot en serie av 10-mer overlappende peptider (SEKV ID NR:1-41) som dekker den fullstendige AN1792-sekvensen. Dyr nummer F10975F viseren representativ ikke-begrenset N-terminal respons. Reaktivitet er observert mot de to N-terminale peptidene og ett C-terminalt peptid til peptidet DAEFRHDSGY (SEKV ID NR:9), som dekker aminosyrene 1-10 i AN1792-peptidet.

Definisjoner

Begrepet "vesentlig likhet" betyr at to peptidsekvenser, når de blir sammenlignet optimalt, slik som med programmene GAP eller BESTFIT ved å anvende standardinnstilte "gap-lengder", har minst 65 prosent sekvenslikhet, fortrinnsvis minst 80 eller 90 prosent sekvenslikhet, mer foretrukket minst 95 prosent sekvenslikhet eller mer (f.eks. 99 prosent sekvenslikhet eller høyere). Fortrinnsvis er restposisjoner som ikke er like forskjellige med konservative aminosyresubstitusjoner.

For sekvenssammenligning fungerer vanligvis én sekvens som en referansesekvens, som testsekvenser sammenlignes med. Når man anvender en sekvenssammenligningsalgoritme, blir test- og referansesekvenser lagt inn i en datamaskin, subsekvenskoordinater blir bestemt om nødvendig og sekvensalgoritmeprogramparametre blir bestemt. Sekvenssammenligningsalgoritmen kalkulerer deretter prosent sekvenslikhet for testsekvensen(e) i forhold til referansesekvensen, basert på de bestemte program parametrene.

Optimal oppstilling av sekvenser for sammenligning kan f.eks. bli utført med den lokale homologialgoritmen til Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), med homologioppstillingsalgoritmen til Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443

(1970), med søk etter likhetsfremgangsmåten til Pearson & Lipman, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), med datamaskinbaserte utførelser av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i "Wisconsin Genetics"-programvarepakken, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) eller med visuell undersøkelse (se generelt Ausubel et al., supra). Ett eksempel på algoritme som er egnet for å bestemme prosent sekvenslikhet er BLAST-algoritmen, som er beskrevet i Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Programvare for å utføre BLAST-analyser er tilgjengelig for publikum via "National Center for Biotechnology Information" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Normalt kan standardinnstilte programparametre bli anvendt for å utføre sekvenssammenligningen, selv om spesialtilpassede parametre også kan bli anvendt. For aminosyresekvenser anvender BLASTP-programmet som standardinnstilling en ordlengde (W) på 3, en forventning (E) på 10 og BLOSUM62 analysematriksen (se Henikoff & Henikoff, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89, 10915

(1989)).

For å klassifisere aminosyresubstitusjoner som konservative eller ikke-konservative, grupperes aminosyrer som følger: Gruppe I (hydrofobe sidekjeder): norleucin, met, ala, val, leu, ile; Gruppe II (nøytrale hydrofile sidekjeder): cys, ser, thr; Gruppe III (sure sidekjeder): asp, glu; Gruppe IV (basiske sidekjeder): asn, gin, his, lys, arg; Gruppe V (rester som influerer retningen på kjeden): gly, pro; og Gruppe VI (aromatiske sidekjeder): trp, tyr, phe. Konservative substitusjoner innbefatter substitusjoner mellom aminosyrer i den samme klassen. Ikke-konservative substitusjoner utgjør utskiftning av et medlem i én av disse klassene med et medlem i en annen klasse.

Terapeutiske agenser i den foreliggende oppfinnelsen er vanligvis vesentlig rene for uønsket kontaminant. Dette betyr at en agens vanligvis har minst ca. 50 vektprosent/vekt renhet, så vel som å være vesentlig fri for interfererende proteiner og kontaminanter. Noen ganger har agensene minst ca. 80 vektprosent/vekt og mer foretrukket minst 90 eller ca. 95 vektprosent/vekt renhet. Imidlertid, ved å anvende konvensjonelle proteinrensingsteknikker, kan homogene peptider med minst 99 vektprosent/vekt bli fremskaffet.

Spesifikk binding mellom to enheter betyr en affinitet på minst 10<6>,10<7>, 10<8>,10<9>eller 10<10>M"<1>. Affiniteter som er større enn 10<8>M_<1>er foretrukket.

Begrepet "antistoff" eller "immunglobulin" inkluderer intakte antistoffer og bindende fragmenter derav. Normalt konkurrerer fragmenter med det intakte antistoffet som de er avledet fra for spesifikk binding til et antigenfragment, innbefattende separate tunge kjeder, lette kjeder Fab, Fab' F(ab')2, Fabc og Fv. Fragmenter fremstilles med rekombinante DNA-teknikker, eller med enzymatisk eller kjemisk separering av intakte immunglobuliner. Begrepet "antistoff" inkluderer også én eller flere immunglobulinkjeder som er kjemisk konjugert til, eller uttrykt som, fusjonsproteiner med andre proteiner. Begrepet "antistoff" inkluderer også bispesifikt antistoff. Et bispesifikt eller bifunksjonelt antistoff er et kunstig hybridantistoff som har to ulike tung/lett-kjedepar og to ulike bindingsseter. Bispesifikke antistoffer kan bli produsert med mange fremgangsmåter, innbefattende fusjon av hybridomer eller kobling av Fab' fragmenter. Sef.eks. Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321

(1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

APP69<5>, APP<751>og APP77<0>henviser til polypeptidene kodet av det humane APP-genet som er henholdsvis 695, 751 og 770 aminosyrerester lange. Se Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525 (1988); og Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). Aminosyrer i det humane amyloidforløperproteinet (APP) er tildelt numre i henhold til sekvensen av APP770-isoformen. Uttrykk som Ap39, Ap40, Ap41, Ap42 og Ap43 henviser til et Ap-peptid inneholdende aminosyrerestene 1-39,1-40, 1-41,1-42 og 1-43.

Et "antigen" er en enhet som et antistoff binder til spesifikt.

Begrepet "epitope" eller "antigen determinant" henviser til et sete på et antigen som B- og/eller T-celler responderer til. B-celleepitoper kan bli dannet fra både sammenhengende aminosyrer eller ikke-sammenhengende aminosyrer sidestilt ved hjelp av tertiær folding av et protein. Epitoper dannet fra sammenhengende aminosyrer bevares vanligvis ved eksponering for denaturerende løsningsmidler, mens epitoper dannet med tertiær folding vanligvis forsvinner ved behandling med denaturerende løsningsmidler. Vanligvis innbefatter en epitope minst 3, og mer normalt minst 5 eller 8-10 aminosyrer i en unik spatial konformasjon. Fremgangsmåter for å bestemme spatial konformasjon av epitoper innbefatter for eksempel røntgenstrålekrystallografi og todimensjonal kjernemagnetisk resonans. Se f.eks. "Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology", vol. 66, Glenn E. Morris, red. (1996). Antistoffer som gjenkjenner den samme epitopen kan bli identifisert i en enkel immuntest som viser evnen ett antistoff har til å blokkere bindingen av et annet antistoff til et målantigen. T-celler gjenkjenner epitoper på ca. ni sammenhengende aminosyrer for CD8-celler eller ca. 13-15 aminosyrer for CD4-celler. T-celler som gjenkjenner epitopen kan bli identifisert med in v/fro-tester som måler antigenavhengig proliferasjon, som bestemt med<3>H-tymidininkorporering med primede T-celler i respons til en epitope (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19

(1994)), med antigenavhengig dreping (cytotoksisk T-lymfocyttest, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) eller med cytokinsekresjon.

Begrepet "immunologisk" eller "immun" respons er utviklingen av en fordelaktig humoral (antistoffmediert) og/eller en cellulær (mediert av antigenspesifikke T-celler eller deres sekresjonsprodukter) respons rettet mot et amyloidpeptid i en mottakerpasient. En slik respons kan være en aktiv respons indusert ved administrering av immunogen eller en passiv respons indusert ved administrering av antistoff eller primede T-celler. En cellulær immunrespons utløses ved presentasjonen av polypeptidepitoper i assosiering med Klasse I eller Klasse II MHC-molekyler for å aktivere antigenspesifikke CD4<+>T-hjelperceller og/eller CD8<+>cytotoksiske T-celler. Responsen kan også innbefatte aktivering av monocytter, makrofager, NK-celler, basofiler, dendrittiske celler, astrocytter, mikrogliaceller, eosinofiler eller andre komponenter av medfødt immunitet. Tilstedeværelsen av en cellemediert immunologisk respons kan bli bestemt med proliferasjonstester (CD4<+>T-celler) eller CTL (cytotoksisk T-lymfocytt) -tester (se Burke, supra; Tigges, supra). De relative bidragene av humorale og cellulære responser til den beskyttende eller terapeutiske effekten av et immunogen kan bli identifisert ved å isolere antistoffer og T-celler separat fra et immunisert syngent dyr og måle beskyttende eller terapeutisk effekt i et annet individ.

En "immunogen agens" eller "immunogen" er i stand til å indusere en immunologisk respons mot seg selv ved administrering til et pattedyr, eventuelt i forbindelse med et adjuvans.

Begrepet "nakent polynukleotid" henviser til et polynukleotid som ikke er i kompleks med kolloidale materialer. Nakne polynukleotider er enkelte ganger klonet i en plasmidvektor.

Begrepet "adjuvans" henviser til en forbindelse som ved administrering sammen med et antigen øker immunresponsen til antigenet, men som når den blir administrert alene ikke genererer en immunrespons til antigenet. Adjuvantia kan øke en immunrespons med flere mekanismer, inkludert lymfocyttrekruttering, stimulering av B- og/eller T-celler og stimulering av makrofager.

Begrepet "pasient" innbefatter et menneske og andre pattedyr som enten mottar profylaktisk eller terapeutisk behandling.

Ikke-aggregert eller monomert Ap betyr løselig, monomere peptidenheter av Ap. Én fremgangsmåte for å fremstille monomert Ap er å løse opp frysetørket peptid i ren DMSO med sonikering. Den resulterende løsningen sentrifugeres for å fjerne enhver uløselig partikkel. Aggregert Ap er en blanding av oligomerer, der de monomere enhetene holdes sammen med ikke-kovalente bindinger.

Konkurranse mellom antistoffer blir bestemt med en test der immunglobulinet som blir testet inhiberer spesifikk binding av et referanseantistoff til et vanlig antigen, slik som Ap. Utallige typer av kompetitive bindingstester er kjent, for eksempel: fast-fase direkte eller indirekte radioaktiv immuntest (RIA), fast-fase direkte eller indirekte enzym im muntest (EIA), sandwich-konkurransetest (se Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); fast-fase direkte biotin-avidin EIA (se Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); fast-fase direkte merket test, fast-fase direkte merket sandwich-test (se Harlow og Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1988)); fast-fase direkte markør RIA ved å anvende 1-125 markør (se Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); fast-fase direkte biotin-avidin EIA (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); og direkte merket RIA (Moldenhaueret al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Vanligvis involverer en slik test anvendelsen av renset antigen bundet til en fast overflate, eller celler som enten har et umerket testimmunglobulin eller et merket referanseimmunglobulin. Kompetitiv inhibisjon måles ved å bestemme mengden av markør bundet til den faste overflaten eller celler i nærvær av testimmunglobulinet. Vanligvis foreligger det et overskudd av testimmunglobulinet. Antistoffer identifisert med konkurransetest (konkurrerende antistoffer) inkluderer antistoffer som binder til den samme epitopen som referanseantistoffet og antistoffer som binder til en nærliggende epitope, som er tilstrekkelig proksimal til epitopen bundet av referanseantistoffet for at sterisk hindring vil forekomme. Vanligvis, når det er et overskudd av konkurrerende antistoff, vil det inhibere spesifikk binding av et referanseantistoff til et vanlig antigen med minst 50 eller 75 %.

Blandinger eller fremgangsmåter "innbefattende" ett eller flere nevnte elementer kan inkludere andre elementer som ikke er nevnt spesifikt. For eksempel omfatter en blanding som innbefatter Ap-peptid både et isolert Ap-peptid og Ap-peptid som en komponent av en større polypeptidsekvens.

Detaljert beskrivelse

I. Generelt

Flere amyloidogene sykdommer og tilstander erkarakterisert vednærvær av avleiringer av Ap-peptid aggregert til en uløselig masse i hjernen til en pasient. Slike sykdommer inkluderer Alzheimers sykdom, Downs syndrom og kognitiv svekkelse. Sistnevnte er et symptom på Alzheimers sykdom og Downs syndrom, men kan også eksistere uten andre karakteristika for noen av disse sykdommene. For eksempel forekommer mild kognitiv svekkelse eller aldersassosiert hukommelsestap i noen pasienter som enda ikke har utviklet, eller aldri vil utvikle, full Alzheimers sykdom. Mild kognitiv svekkelse kan bli definert med evaluering på den mini-mentale tilstandseksamenen i samsvar med skikk og bruk. Slike sykdommer erkarakterisertved aggregater av Ap som har en p-foldet lagstruktur og blir farget med Kongo-rødfarge. Den grunnleggende tilnærmingen for å forebygge eller behandle Alzheimers sykdom eller andre amyloidogene sykdommer ved å generere en immunogen respons til en komponent i den amyloide avleiringen i en pasient, er beskrevet i WO 99/27944 (inkorporert med referanse). Den foreliggende anvendelsen tar opp igjen og bekrefter effektiviteten til den grunnleggende tilnærmingen. Den foreliggende anvendelsen er imidlertid først og fremst rettet mot forbedrede reagenser og fremgangsmåter. Disse forbedringene er delvis basert på at oppfinnerne heri har lokalisert de foretrukne epitopene i Ap som en immunogen respons bør bli rettet mot. Identifiseringen av foretrukne epitoper i Ap resulterer i agenser og fremgangsmåter med økt effektivitet, redusert potensial for bivirkninger og/eller enklere fremstilling, formulering og administrering.

II. Terapeutiske agenser

En immunogen respons kan være aktiv, som når et immunogen administreres for å indusere antistoffer reaktive med Ap i en pasient, eller passiv, som når et antistoff administreres som selv binder til Ap i en pasient.

1. Agenser som induserer aktiv immunrespons

Terapeutiske agenser induserer en immunogen respons rettet spesifikt mot bestemte epitoper i Ap-peptider. Foretrukne agenser er selve Ap-peptidet og segmenter derav. Varianter av slike segmenter, analoger og etterligninger av naturlig Ap-peptid som induserer og/eller kryssreagerer med antistoffer til de foretrukne epitopene i Ap-peptid kan også bli anvendt.

Ap, også kjent som p-amyloid peptid, eller A4-peptid (se US 4.666.829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), er et peptid på 39-43 aminosyrer, som er den prinsipielle komponenten til karakteristiske plakk i Alzheimers sykdom. Ap genereres ved å prosessere et større protein APP med to enzymer kalt p- og y-sekretaser (se Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Kjente mutasjoner i APP assosiert med Alzheimers sykdom forekommer nær setet til p- eller y-sekretase eller i Ap. For eksempel er posisjon 717 nær setet til y-sekretasekutting i APP i dets prosessering til Ap, og posisjonene 670/671 er nær setet til p-sekretasekutting. Det er antatt at mutasjonene forårsaker AD ved å interagere med kuttereaksjonene som Ap blir dannet ved, for å øke mengden av 42/43 aminosyreformen av generert Ap.

Ap har den uvanlige egenskapen at det kan binde og aktivere både klassiske og alternative komplementkaskader. Spesielt binder det til C1q og til slutt til C3bi. Denne assosieringen letter binding til makrofager som fører til aktivering av B-celler. I tillegg brytes C3bi videre ned og binder deretter til CR2 på B-celler på en T-celleavhengig måte som fører til en 10.000 økning i aktivering av disse cellene. Denne mekanismen fører til at Ap genererer en immunrespons som overgår den andre antigener har.

Ap har flere naturlig forekommende former. De humane formene av Ap henvises til som Ap39, Ap40, Ap41, Ap42 og Ap43. Sekvensene til disse peptidene og forholdet deres til APP-forløperen er illustrert med Figur 1 til Hardy et al., TINS 20, 155-158

(1997). Foreksempel harAp42 sekvensen: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala-OH (SEKV ID NR:42). Ap41, Ap40 og Ap39 er forskjellige fra Ap42 med utelatelsen av henholdsvis Ala, Ala-lle og Ala-lle-Val fra den C-terminale enden. Ap43 er forskjellig fra Ap42 med nærvær av en treoninrest på C-terminalen.

Immunogene fragmenter av Ap er fordelaktige i forhold til det intakte molekylet i de foreliggende fremgangsmåtene av flere årsaker. For det første, fordi bare bestemte epitoper i Ap induserer en egnet immunogen respons for behandling av Alzheimers sykdom, tilveiebringer en lik massedose av et fragment inneholdende slike epitoper en større molar konsentrasjon av de egnede immunogene epitopene enn en dose av intakt Ap. For det andre genererer bestemte immunogene fragmenter av Ap en immunogen respons mot amyloide avleiringer uten å generere en betydelig immunogen respons mot APP-protein som Ap er avledet fra. For det tredje er fragmenter av Ap enklere å fremstille enn intakt Ap pga. deres kortere lengde. For det fjerde aggregerer ikke fragmenter av Ap på samme måte som intakt Ap, hvilket forenkler fremstilling av farmasøytiske blandinger og administrering derav.

Noen immunogene fragmenter av Ap har en sekvens på minst 2, 3, 5, 6, 10 eller 20 sammenhengende aminosyrer fra et naturlig peptid. Noen immunogene fragmenter har ikke mer enn 10, 9, 8, 7, 5 eller 3 sammenhengende rester fra Ap. Fragmenter fra den N-terminale halvparten av Ap er foretrukket. Foretrukne immunogene fragmenter innbefatter Ap1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 og 1-4. Betegnelsen Ap 1-5, for eksempel, indikerer et fragment som innbefatter restene 1-5 av Ap og mangler andre rester av Ap. Fragmenter som begynner på restene 1-3 av Ap og slutter på restene 7-11 av Ap er spesielt foretrukket. Fragmentet Api-12 kan også bli anvendt, men er mindre foretrukket. I noen fremgangsmåter er fragmentet et annet N-terminalt fragment enn Api-10. Andre mindre foretrukne fragmenter inkluderer Ap 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 og 35-42. Disse fragmentene krever screening etter fjerningsaktivitet eller forhindring av amyloide avleiringer, som beskrevet i Eksemplene, før anvendelse. Fragmenter som mangler minst én, og enkelte ganger minst 5 eller 10, C-terminal aminosyre foreliggende i en naturlig forekommende form av Ap anvendes i noen fremgangsmåter. For eksempel inkluderer et fragment som mangler 5 aminosyrer fra den C-terminale enden av Ap43 de første 38 aminosyrene fra den N-terminale enden av Ap. Andre komponenter av amyloide plakk, for eksempel synuklein, og epitopefragmenter derav kan også bli anvendt for å indusere en immunogen respons.

Hvis ikke noe annet er antydet, inkluderer referanse til Ap de naturlige humane aminosyresekvensene indikert ovenfor, så vel som analoger innbefattende allel-, arts- og induserte varianter. Vanligvis er analoger forskjellige fra naturlig forekommende peptider i én, to eller noen få posisjoner, ofte i form av konservative substitusjoner. Analoger har vanligvis minst 80 eller 90 % sekvenslikhet med naturlige peptider. Noen analoger innbefatter også ikke-naturlige aminosyrer eller modifiseringer av N- eller C-terminale aminosyrer i én, to eller noen få posisjoner. For eksempel kan den naturlige asparaginsyreresten i posisjon 1 og/eller 7 i Ap bli erstattet med iso-asparaginsyre. Eksempler på ikke naturlig forekommende aminosyrer er D-aminosyrer, a, a-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyre, 4-hydroksyprolin, y-karboksyglutamat, s-N,N,N-tri metyl ly sin, s-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, æ-N-metylarginin og iso-asparaginsyre. Fragmenter og analoger kan bli screenet for profylaktisk eller terapeutisk effekt i transgene dyremodeller ved sammenligning med ubehandlede- eller placebokontroller, som beskrevet nedenfor.

Ap, dets fragmenter og analoger kan bli syntetisert med fast-fase peptidsyntese eller rekombinant ekspresjon, eller kan bli fremskaffet fra naturlige kilder. Automatiske peptidsyntesemaskiner er kommersielt tilgjengelig fra mange leverandører, slik som Applied Biosystems, Foster City, California. Rekombinant ekspresjon kan skje i bakterier, slik som E. coli, gjær, insektceller eller pattedyrceller. Fremgangsmåter for rekombinant ekspresjon er beskrevet av Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (C.S.H.P. Press, NY, 2. utgave, 1989). Noen former av Ap-peptid er også tilgjengelig kommersielt (f.eks. American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA, og California Peptide Research, Inc. Napa, CA).

Terapeutiske agenser inkluderer også lengre polypeptider som for eksempel innbefatter et aktivt fragment av Ap-peptid sammen med andre aminosyrer. Foretrukne agenser inkluderer for eksempel fusjonsproteiner innbefattende et segment av Ap fusjonert til en heterolog aminosyresekvens som induserer en T-hjelpercellerespons mot den heterologe aminosyresekvensen og dermed en B-cellerespons mot Ap-segmentet. Slike polypeptider kan bli screenet for profylaktisk eller terapeutisk effekt i dyremodeller ved sammenligning med ubehandlede dyr eller placebokontroller, som beskrevet nedenfor. Ap-peptidet, analogen, det aktive fragmentet eller annet polypeptid kan bli administrert i assosiert eller multimerform eller oppløst. Terapeutiske agenser innbefatter også multimerer av monomere, immunogene agenser.

I ytterligere en variasjon kan et immunogent peptid, slik som et fragment av Ap, bli presentert av et virus eller en bakterie som del av en immunogen blanding. En nukleinsyre som koder for det immunogene peptidet inkorporeres i et genom eller episom av viruset eller bakteriene. Eventuelt inkorporeres nukleinsyren på en slik måte at det immunogene peptidet uttrykkes som et sekrert protein eller som et fusjonsprotein med et ytre overflateprotein til et virus eller et transmembrant protein til en bakterie slik at peptidet blir vist fram. Virus eller bakterier anvendt i slike fremgangsmåter skal være ikke-patogene eller svekkede. Egnede virus innbefatter adenovirus, HSV, venezuelansk hesteencefalittvirus og andre alfavirus, vesikulært stomatittvirus og andre rabdovirus, vaccinia og fowl pox. Egnede bakterier inkluderer salmonella og shigella. Fusjon av et immunogent peptid til HBsAg av HBV er spesielt egnet. Terapeutiske agenser innbefatter også peptider og andre forbindelser som ikke nødvendigvis har en signifikant aminosyresekvenslikhet med Ap, men som ikke desto mindre fungerer som etterligninger av Ap og induserer en lignende immunrespons. For eksempel kan ethvert peptid og protein som danner p-foldede flak bli screenet for egnethet. Anti-idiotypiske antistoffer mot monoklonale antistoffer til Ap eller andre amyloidogene peptider kan også bli anvendt. Slike anti-ld antistoffer etterligner antigenet og genererer en immunrespons til det (se "Essential Immunology" (Roit red., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6. utgave), s. 181). Andre agenser enn Ap-peptider burde indusere en immunogen respons mot ett eller flere av de foretrukne segmentene av Ap nevnt ovenfor (f.eks. 1-10, 1-7, 1-3 og 3-7). Fortrinnsvis induserer slike agenser en immunogen respons som er rettet spesifikt mot ett av disse segmentene uten å være rettet mot andre segmenter av Ap.

Tilfeldige biblioteker av peptider eller andre forbindelser kan også bli screenet for egnethet. Kombinatoriske biblioteker kan bli produsert for mange typer av forbindelser som kan bli syntetisert på en trinnvis måte. Slike forbindelser innbefatter polypeptider, beta-omdreiningsetterligninger, polysakkarider, fosfolipider, hormoner, prostaglandiner, steroider, aromatiske forbindelser, heterosykliske forbindelser, benzodiazepiner, oligomere N-substituerte glysiner og oligokarbamater. Store kombinatoriske biblioteker av forbindelsene kan bli konstruert med den kodede syntetiske biblioteks (ESL)-fremgangsmåten beskrevet i Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia universitet, WO 94/08051, farmakopé, WO 95/35503 og Scripps, WO 95/30642 (der hver av disse er inkorporert med referanse for alle formål). Peptidbiblioteker kan også bli generert med

fagdisplayfremgangsmåter. Se f.eks. Devlin, WO 91/18980.

Kombinatoriske biblioteker og andre forbindelser screenes først for egnethet ved å bestemme deres kapasitet til å binde til antistoffer eller lymfocytter (B eller T) kjent for å være spesifikke for Ap eller andre amyloidogene peptider. For eksempel kan innledende screeninger bli utført med ethvert polyklonalt serum eller monoklonalt antistoff til Ap eller et fragment derav. Forbindelser kan deretter bli screenet for binding til en spesifikk epitope i Ap (f.eks. 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 og 3-7). Forbindelser kan bli testet med de samme fremgangsmåtene beskrevet for kartlegging av antistoffepitopespesifisiteter. Forbindelser identifisert med slike screeninger blir deretter analysert videre for kapasitet til å indusere antistoffer eller reaktive lymfocytter til Ap eller fragmenter derav. For eksempel kan flere serumfortynninger bli testet på mikrotiterplater som har blitt belagt på forhånd med Ap eller et fragment derav, og en standard ELISA kan bli utført for å teste for reaktive antistoffer til Ap eller fragmentet. Forbindelser kan deretter bli testet for profylaktisk og terapeutisk effekt i transgene dyr predisponert for en amyloidogen sykdom, som beskrevet i Eksemplene. Slike dyr innbefatter for eksempel mus som har en 717-mutasjon i APP, beskrevet av Games et al., supra, og mus som har en 670/671 svensk mutasjon i APP, som beskrevet av McConlogue et al., US 5.612.486 og Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). Den samme screeningstilnærmingen kan bli anvendt på andre potensielle agensanaloger av Ap og lengre peptider innbefattende fragmenter av Ap, beskrevet ovenfor.

2. Agenser som induserer passiv immunrespons

Terapeutiske agenser i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer også antistoffer som binder spesifikt til Ap eller annen komponent i amyloide plakk. Slike antistoffer kan være monoklonale eller polyklonale. Noen slike antistoffer binder spesifikt til den aggregerte formen av Ap uten å binde til den dissosierte formen. Noen binder spesifikt til den dissosierte formen uten å binde til den aggregerte formen. Noen binder til både aggregerte og dissosierte former. Noen slike antistoffer binder til en naturlig forekommende kort form av Ap (dvs. Ap39, 40 eller 41) uten å binde til en naturlig forekommende lang form av Ap (dvs. Ap42 og Ap43). Noen antistoffer binder til en lang form uten å binde til en kort form. Noen antistoffer binder til Ap uten å binde til fullengde amyloidforløperprotein. Antistoffer anvendt i terapeutiske tilnærminger har vanligvis en intakt konstant region, eller i hvert fall tilstrekkelig av den konstante regionen, for å interagere med en Fc-reseptor. Human isotype lgG1 er foretrukket fordi den har høyest affinitet av humane isotyper for FcR I-reseptoren på fagocytterende celler. Bispesifikke Fab-fragmenter kan også bli anvendt, der én arm av antistoffet har spesifisitet for Ap og den andre for en Fc-reseptor. Noen antistoffer binder til Ap med en bindingsaffinitet som er større enn eller lik ca. 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>eller 1010M"1.

Polyklonale sera inneholder vanligvis blandede populasjoner av antistoffer som binder til flere epitoper langs lengden av Ap. Imidlertid kan polyklonale sera være spesifikke for et spesielt segment av Ap, slik som Api-10. Monoklonale antistoffer binder til en spesifikk epitope i Ap, som kan være en konformasjons- eller ikke-konformasjonsepitope. Profylaktisk og terapeutisk effekt av antistoffer kan bli testet ved å anvende de transgene dyremodellfremgangsmåtene beskrevet i Eksemplene. Foretrukne monoklonale antistoffer binder til en epitope i restene 1-10 i Ap (der den første N-terminale resten til naturlig Ap er kalt 1). Noen foretrukne monoklonale antistoffer binder til en epitope i aminosyrene 1-5 og noen til en epitope i 5-10. Noen foretrukne antistoffer binder til epitoper i aminosyrene 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 eller 3-7. Noen foretrukne antistoffer binder til en epitope som begynner på restene 1-3 og slutter på restene 7-11 i Ap. Mindre foretrukne antistoffer innbefatter de som binder til epitoper med restene 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30 eller 10-25 i Ap. Det anbefales at slike antistoffer blir screenet for aktivitet i musemodellen beskrevet i Eksemplene før anvendelse. For eksempel har det blitt funnet at bestemte antistoffer til epitoper i restene 10-18, 16-24, 18-21 og 33-42 ikke har aktivitet. I noen fremgangsmåter anvendes multiple monoklonale antistoffer som har bindingsspesifisiteter til ulike epitoper. Slike antistoffer kan bli administrert sekvensielt eller samtidig. Antistoffer til andre amyloide komponenter enn Ap kan også bli anvendt. For eksempel kan antistoffer bli rettet mot det amyloidassosierte proteinet synuklein.

Når det blir sagt at et antistoff binder til en epitope innenfor spesifiserte rester, slik som for eksempel Ap 1-5, betyr det at antistoffet binder spesifikt til et polypeptid inneholdende de spesifiserte restene (dvs. Ap 1-5 i dette eksempelet). Et slikt antistoff trenger ikke nødvendigvis å komme i kontakt med hver rest i Ap 1-5. Og heller ikke trenger hver enkle aminosyresubstitusjon eller -delesjon innenfor Api-5 nødvendigvis affisere bindingsaffinitet signifikant. Epitopespesifisitet til et antistoff kan for eksempel bli bestemt ved å lage et fagdisplaybibliotek der forskjellige medlemmer har ulike subsekvenser av Ap. Fagdisplaybiblioteket selekteres deretter for medlemmer som binder spesifikt til et antistoff som blir testet. En sekvensfamilie isoleres. Normalt inneholder en slik familie en felles kjernesekvens og varierende lengder av flankerende sekvenser i forskjellige medlemmer. Den korteste kjernesekvensen som viser spesifikk binding til antistoffet definerer epitopen bundet av antistoffet. Antistoffer kan også bli testet for epitopespesifisitet i en konkurransetest med et antistoff som allerede har fått epitopespesifisitet bestemt. For eksempel antistoffer som konkurrerer med 3D6-antistoffet for binding til Ap, binder til den samme eller lignende epitope som 3D6, dvs. i restene Ap 1-5. På samme måte binder antistoffer som konkurrerer med 10D5-antistoffet til den samme eller lignende epitope, dvs. i restene Ap 3-6. Screening av antistoffer for epitopespesifisitet er egnet for å forutsi terapeutisk effekt. Et antistoff som binder til en epitope i restene 1-7 i Ap er for eksempel sannsynligvis effektiv i forebyggelse og behandling av Alzheimers sykdom.

Monoklonale eller polyklonale antistoffer som binder spesifikt til et foretrukket segment av Ap, uten å binde til andre regioner av Ap, har flere fordeler i forhold til monoklonale antistoffer som binder til andre regioner eller polyklonale sera til intakt Ap. For det første, for like massedoser, inneholder doser av antistoffer som binder spesifikt til foretrukne segmenter en høyere molar dose av antistoffer som er effektive i fjerning av amyloide plakk. For det andre kan antistoffer som binder spesifikt til foretrukne segmenter indusere fjerning av amyloide avleiringer uten å indusere fjerning av intakt APP-polypeptid, og dermed redusere potensialet for bivirkninger.

i. Generelle karakteristika av immunglobuliner

Grunnstrukturen til et antistoff er kjent for å innbefatte en tetramer av subenheter. Hver tetramer er sammensatt av to identiske par av polypeptidkjeder, der hvert par har en "lett" (ca. 25 kDa) og en "tung" kjede (ca. 50-70 kDa). Den aminoterminale delen til hver kjede inkluderer en variabel region på ca. 100 til 110 eller flere aminosyrer som primært er ansvarlige for å gjenkjenne antigen. Den karboksyterminale delen av hver kjede definerer en konstant region primært ansvarlig for effektorfunksjon.

Lette kjeder klassifiseres enten som kappa eller lambda. Tunge kjeder klassifiseres som gamma, mu, alfa, delta eller epsilon og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgG, IgM, IgA, IgD og IgE. I lette og tunge kjeder er de variable og konstante regionene forbundet med en "J"-region på ca. 12 eller flere aminosyrer, der den tunge kjeden også innbefatter en "D"-region på ca. 10 flere aminosyrer. Se generelt Fundamental Immunology (Paul, W., red., 2. utgave, Raven Press, NY, 1989), kap. 7 (inkorporert med referanse i dens helhet for alle formål).

De variable regionene til hvert lett/tung-kjedepar danner antistoffbindingssetet. Derfor har et intakt antistoff to bindingsseter. Bortsett fra i bifunksjonelle eller bispesifikke antistoffer, er de to bindingssetene like. Alle kjedene har den samme generelle strukturen med relativt konserverte strukturregioner (FR) forbundet med tre hypervariable regioner, også kalt komplementbestemmende regioner eller CDR'er. CDR'ene fra de to kjedene til hvert par er ved hjelp av strukturregionene stilt ved siden av hverandre, hvilket muliggjør binding til en spesifikk epitope. Fra N-terminal til C-terminal innbefatter både lette og tunge kjeder domenene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Anvisningen av aminosyrer til hvert domene er i samsvar med definisjonene til Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"

(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 og 1991) eller Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

ii. Produksjon av ikke-humane antistoffer

Produksjon av ikke-humane monoklonale antistoffer, f.eks. mus, marsvin, gris, primat, kanin eller rotte, kan bli oppnådd ved for eksempel å immunisere dyret med Ap. Et lengre polypeptid inneholdende Ap, eller et immunogent fragment av Ap eller anti-idiotypiske antistoffer til et antistoff til Ap kan også bli anvendt. Se Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (inkorporert med referanse for alle formål). Et slikt immunogen kan bli fremskaffet fra en naturlig kilde med peptidsyntese eller med rekombinant ekspresjon. Eventuelt kan immunogenet bli administrert fusjonert eller på annen måte satt sammen med et bærerprotein, som beskrevet nedenfor. Eventuelt kan immunogenet bli administrert med et adjuvans. Flere adjuvanstyper kan bli anvendt, som beskrevet nedenfor. Fullstendig Freunds adjuvans etterfulgt av ufullstendig adjuvans er foretrukket for immunisering av laboratoriedyr. Kaniner eller marsvin blir vanligvis benyttet for å lage polyklonale antistoffer. Mus blir vanligvis anvendt for å lage monoklonale antistoffer. Antistoffer screenes for spesifikk binding til Ap. Eventuelt blir antistoffer screenet videre for binding til en spesifikk region i Ap. Den sistnevnte screeningen kan bli utført ved å bestemme binding av et antistoff til en samling av delesjonsmutanter av et Ap-peptid, og bestemme hvilke delesjonsmutanter som binder til antistoffet. Binding kan for eksempel bli vurdert med Western blott eller ELISA. Det minste fragmentet som viser spesifikk binding til antistoffet definerer epitopen til antistoffet. Alternativt kan epitopespesifisitet bli bestemt med en konkurransetest, der et test- og referanseantistoff konkurrerer om binding til Ap. Hvis test- og referanseantistoffene konkurrerer, så binder de til den samme epitopen eller epitopene som er tilstrekkelig proksimale slik at binding av ett antistoff interfererer med binding av det andre. Den foretrukne isotypen for slike antistoffer er mus isotype lgG2a eller ekvivalent isotype i

andre arter. Mus isotype lgG2a er ekvivalenten til human isotype lgG1.

Mi. Kimæriske og humaniserte antistoffer

Kimæriske og humaniserte antistoffer har den samme eller lignende bindingsspesifisiteten og -affiniteten som et museantistoff eller annet ikke-humant antistoff som utgjør startmaterialet for konstruksjon av et kimærisk eller humanisert antistoff. Kimæriske antistoffer er antistoffer hvis gener for lett og tung kjede har blitt konstruert, vanligvis med genetisk modifisering, fra immunglobulingensegmenter som tilhører ulike arter. For eksempel kan de variable (V) segmentene til genene fra et musemonoklonalt antistoff være bundet til humane konstante (C) segmenter, slik som lgG1 og lgG4. Human isotype lgG1 er foretrukket. Et typisk kimærisk antistoff er dermed et hybrid protein som består av V- eller antigenbindende domene fra et museantistoff og C- eller effektordomenet fra et humant antistoff.

Humaniserte antistoffer har strukturrester i den variable regionen som hovedsakelig er fra et humant antistoff (kalt et akseptorantistoff) og komplementbestemmende regioner som hovedsakelig er fra et museantistoff (henvist til som donorimmunglobulinet). Se Queen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:10029-10033

(1989) og WO 90/07861, US 5.693.762, US 5.693.761, US 5.585.089, US 5.530.101 og Winter, US 5.225.539 (inkorporert med referanse i deres helhet for alle formål). Den konstante regionen(e), hvis foreliggende, er også hovedsakelig eller fullstendig fra et humant immunglobulin. De humane variable domenene er vanligvis valgt fra humane antistoffer hvis struktursekvenser har en høy grad av sekvenslikhet med de variable murine regiondomenene som CDR'ene ble avledet fra. Strukturrestene i tung og lett kjede variabel region kan være avledet fra de samme eller forskjellige humane antistoffsekvensene. De humane antistoffsekvensene kan være sekvensene til naturlig forekommende humane antistoffer eller kan være konsensussekvenser til flere humane antistoffer. Se Carter et al., WO 92/22653. Visse aminosyrer fra strukturrestene i den humane variable regionen selekteres for substitusjon basert på deres mulige innflytelse på CDR-konformasjon og/eller binding til antigen. Undersøkelse av slike mulige påvirkninger skjer ved modellering, gransking av karakteristikaene til aminosyrene på bestemte steder eller empirisk observasjon av effektene til substitusjon eller mutagenese av bestemte aminosyrer. Når for eksempel en aminosyre er forskjellig mellom en strukturrest i murin variabel region og en selektert strukturrest i human variabel region, skal den humane strukturaminosyren vanligvis bli substituert med den ekvivalente strukturaminosyren fra museantistoffet når det er rimelig å forvente at aminosyren:

(1) direkte binder antigen ikke-kovalent,

(2) grenser til en CDR-region,

(3) på annen måte interagerer med en CDR-region (f.eks. er innenfor ca. 6 A av en CDR-region) eller

(4) deltar i VL-VH grenseflaten.

Andre kandidater for substitusjon er humane akseptorstrukturaminosyrer som er uvanlige foret humant immunglobulin i den posisjonen. Disse aminosyrene kan bli substituert med aminosyrer fra den ekvivalente posisjonen i musedonorantistoffet eller fra de ekvivalente posisjonene i mer typiske humane immunglobuliner. Andre substitusjonskandidater er humane akseptorstrukturaminosyrer som er uvanlige for et humant immunglobulin i den posisjonen. De variable regionstrukturene til humaniserte immunglobuliner har vanligvis minst 85 % sekvenslikhet med en human struktursekvens til variabel region eller konsensus av slike sekvenser.

iv. Humane antistoffer

Humane antistoffer mot Ap fremskaffes med mange teknikker beskrevet nedenfor. Noen humane antistoffer selekteres med kompetitive bindingsforsøk, eller på annen måte, til å ha den samme epitopespesifisiteten som et spesielt museantistoff, slik som ett av de monoklonale museantistoffene beskrevet i Eksempel XI. Humane antistoffer kan også bli screenet for en bestemt epitopespesifisitet ved å bare anvende et fragment av Ap som immunogenet og/eller ved å screene antistoffer mot en samling av delesjonsmutanter av Ap. Humane antistoffer har fortrinnsvis isotypespesifisitet human IgGl

(1) Triom-metodologi

Den grunnleggende fremgangsmåten og et eksempel på cellefusjonspartner, SPAZ-4, for anvendelse i denne tilnærmingen har blitt beskrevet av Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. patent nr. 4.634.664; og Engleman et al., US patent nr. 4.634.666 (der hver av disse er inkorporert med referanse i sin helhet for alle formål). De antistoffproduserende cellelinjene fremskaffet med denne fremgangsmåten er kalt triomer, fordi de stammet fra tre celler - to humane og én mus. Innledningsvis fusjoneres en musemyelomlinje med en human B-lymfocytt for å oppnå en ikke-antistoffproduserende, xenogen, hybrid celle, slik som SPAZ-4 cellelinjen beskrevet av Oestberg, supra. Den xenogene cellen fusjoneres deretter med en immunisert human B-lymfocytt for å oppnå en antistoffproduserende triomcellelinje. Triomer har blitt funnet å produsere antistoff mer stabilt enn vanlige hybridomer laget fra humane celler.

De immuniserte B-lymfocyttene fremskaffes fra blodet, milten, lymfeknutene eller beinmargen til en menneskedonor. Hvis antistoffer mot et spesifikt antigen eller epitope er ønsket, er det fordelaktig å anvende dette antigenet eller epitope derav for immunisering. Immunisering kan enten være in vivo eller in vitro. For in vivo-immunisering isoleres B-celler vanligvis fra et menneske immunisert med Ap, et fragment derav, større polypeptid inneholdende Ap eller fragment eller et anti-idiotypisk antistoff til et antistoff til Ap. I noen fremgangsmåter isoleres B-celler fra den samme pasienten som til slutt som skal få administrert antistoffterapi. For in wfro-immunisering eksponeres B-lymfocytter vanligvis for antigen i en periode på 7-14 dager i et medium som RPMI-1640 (se Engleman, supra) supplementer! med 10 % humant plasma.

De immuniserte B-lymfocyttene fusjoneres til en xenogen, hybrid celle som SPAZ-4 med velkjente fremgangsmåter. For eksempel behandles cellene med 40-50 % polyetylenglykol med molekylvekt på 1000-4000, ved ca. 37 °C, i ca. 5-10 min. Celler separeres fra fusjonsblandingen og ekspanderes i medium selektivt for de ønskede hybridene (f.eks. HAT eller AH). Kloner som skiller ut antistoffer med den ønskede bindingsspesifisiteten identifiseres ved å teste triomkulturmediet for evnen til å binde til Ap eller et fragment derav. Triomer som produserer humane antistoffer med den ønskede spesifisiteten subklones med seriefortynningsteknikken og dyrkes in vitro i kulturmedium. Triomcellelinjene som blir fremskaffet testes deretter for evnen til å binde Ap eller et fragment derav.

Selv om triomer er genetisk stabile, produserer de ikke veldig høye antistoffnivåer. Ekspresjonsnivåer kan bli økt ved å klone antistoffgener fra triomen inn i én eller flere ekspresjonsvektorer og transformere vektoren inn i standard pattedyr-, bakterie-eller gjærcellelinjer.

(2) Transgene ikke-humane pattedyr

Humane antistoffer mot Ap kan også bli produsert fra ikke-humane transgene pattedyr som har transgener som i hvert fall koder for et segment av det humane immunglobulinlokuset. Vanligvis er det endogene immunglobulinlokuset til slike transgene pattedyr inaktivert funksjonelt. Fortrinnsvis inkluderer segmentet av det humane immunglobulinlokuset ikke-rearrangerte sekvenser av tung og lett kjede komponenter. Både inaktivering av endogene immunglobulingener og introduksjon av eksogene immunglobulingener kan bli oppnådd med målstyrt homolog rekombinasjon eller med introduksjon av YAC-kromosomer. De transgene pattedyrene som resulterer fra denne fremgangsmåten kan rearrangere immunglobulinkomponentsekvensene funksjonelt og uttrykke et repertoar av antistoffer av ulike isotyper kodet av humane immunglobulingener, uten å uttrykke endogene immunglobulingener. Produksjonen og egenskapene til pattedyr med disse egenskapene er beskrevet i detalj av f.eks. Lonberg et al., WO 93/12227

(1993); US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US 5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (der hver er inkorporert med referanse i sin helhet for alle formål). Transgene mus er spesielt egnet. Anti-Ap antistoffer fremskaffes ved å immunisere et transgent ikke-humant pattedyr, slik som beskrevet av Lonberg eller Kucherlapati, supra, med Ap eller et fragment derav. Monoklonale antistoffer fremstilles f.eks. ved å fusjonere B-celler fra slike pattedyr til egnede myelomcellelinjer ved anvendelse av konvensjonell Kohler-Milstein teknologi. Humane polyklonale antistoffer kan også bli gitt i form av serum fra mennesker immunisert med en immunogen agens. Eventuelt kan slike polyklonale antistoffer bli konsentrert med affinitetsrensing ved å anvende Ap eller annet amyloidpeptid som et affinitetsreagens.

(3) Fagdisplayfremgangsmåter

En videre tilnærming for å fremskaffe humane anti-Ap antistoffer er å screene et DNA-bibliotek fra humane B-celler i henhold til den generelle protokollen beskrevet av Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Som beskrevet for triom-metodologi, kan slike B-celler bli fremskaffet fra et menneske immunisert med Ap, fragmenter, lengre polypeptider inneholdende Ap eller fragmenter eller anti-idiotypiske antistoffer. Eventuelt fremskaffes slike B-celler fra en pasient som til slutt skal motta antistoffbehandling. Antistoffer som binder til Ap eller et fragment derav selekteres. Sekvenser som koder for slike antistoffer (eller et bindende fragment) blir deretter klonet og amplifisert. Protokollen beskrevet av Huse er gjort mer effektiv i kombinasjon med fagdisplayteknologi. Sef.eks. Doweretal., WO 91/17271 og McCafferty et al., WO 92/01047, US 5.877.218, US 5.871.907, US 5.858.657, US 5.837.242, US 5.733.743 og US 5.565.332 (der hver er inkorporert med referanse i sin helhet for alle formål). I disse fremgangsmåtene fremstilles fagbiblioteker, der medlemmer viser forskjellige antistoffer på deres ytre overflater. Antistoffer vises vanligvis som Fv- eller Fab-fragmenter. Fag som fremviser antistoffer med en ønsket spesifisitet selekteres med affinitetsanrikning til et Ap-peptid eller fragment derav.

I en variasjon av fagdisplayfremgangsmåten kan humane antistoffer med bindingsspesifisiteten til et selektert murint antistoff bli produsert. Se Winter, WO 92/20791. I denne fremgangsmåten anvendes enten tung eller lett kjede variabel region til det selekterte murine antistoffet som et startmateriale. Hvis for eksempel en lett kjede variabel region selekteres som startmaterialet, konstrueres et fagbibliotek der medlemmer har den samme lett kjede variable regionen (dvs. det murine startmaterialet) og en ulik tung kjede variabel region. De tung kjede variable regionene fremskaffes fra et bibliotek med rearrangerte humane tung kjede variable regioner. En fag som viser sterk spesifikk binding for Ap (f.eks. minst 10<8>og fortrinnsvis minst 10<9>M"<1>) selekteres. Den humane tung kjede variable regionen fra denne fagen fungerer deretter som et startmateriale for å konstruere ytterligere et fagbibliotek. I dette biblioteket har hver fag den samme tung kjede variable regionen (dvs. regionen identifisert fra det første displaybiblioteket) og en annen lett kjede variabel region. De lett kjede variable regionene fremskaffes fra et bibliotek med rearrangerte humane lett kjede variable regioner. Igjen selekteres fag som viser sterk spesifikk binding for Ap. Disse fagene fremviser de variable regionene til fullstendig humane anti-Ap antistoffer. Disse antistoffene har vanligvis den samme eller lignende epitopespesifisitet som det murine startmaterialet.

v. Seleksjon av konstant region

Tung og lett kjede variable regioner til kimæriske, humaniserte eller humane antistoffer kan bli koblet til minst en del av en human konstant region. Valget av konstant region er delvis avhengig av om antistoffavhengig komplement og/eller cellulær mediert toksisitet er ønsket. For eksempel har isotypene lgG1 og lgG3 komplementaktivitet, mens isotypene lgG2 og lgG4 ikke har det. Valg av isotype kan også affisere passering av antistoff inn i hjernen. Human isotype lgG1 er foretrukket. Lett kjede konstante regioner kan være lambda eller kappa. Antistoffer kan bli uttrykt som tetramerer inneholdende to lette og to tunge kjeder, som separate tunge kjeder, lette kjeder, som Fab, Fab' F(ab')2 og Fv, eller som enkeltkjedede antistoffer, der variable domener på tung og lett kjede er koblet ved hjelp av en mellomliggende sekvens.

vi. Ekspresjon av rekombinante antistoffer

Kimæriske, humaniserte og humane antistoffer produseres vanligvis ved rekombinant ekspresjon. Rekombinante polynukleotidkonstruksjoner innbefatter vanligvis en ekspresjonskontrollsekvens koblet funksjonelt til de kodende sekvensene til antistoffkjeder, innbefattende naturlig assosierte eller heterologe promoterregioner. Fortrinnsvis er ekspresjonskontrollsekvensene eukaryote promotersystemer i vektorer som kan transformere eller transfektere eukaryote vertsceller. Når vektoren har blitt inkorporert i den egnede verten, dyrkes verten under betingelser egnet for høyt ekspresjonsnivå av nukleotidsekvensene og oppsamlingen og rensingen av de kryssreagerende antistoffene.

Disse ekspresjonsvektorene kan vanligvis replikere i vertsorganismene enten som episomer eller som en integrert del av det vertskromosomale DNA'et. Vanligvis inneholder ekspresjonsvektorer seleksjonsmarkører, f.eks. ampicillin- eller hygromycinresistens, for å muliggjøre deteksjon av de cellene som er transformert med de ønskede DNA-sekvensene.

E. coli er én prokaryot vert som er spesielt egnet for å klone DNA-sekvensene i den foreliggende oppfinnelsen. Mikrober, slik som gjær, egner seg også for ekspresjon. Saccharomyces er en foretrukket gjærvert med egnede vektorer som har ekspresjonskontrollsekvenser, et replikasjonsstartsete, termineringssekvenser og lignende etter ønske. Typiske promotere inkluderer 3-fosfoglyseratkinase og andre glykolytiske enzymer. Induserbare gjærpromotere innbefatter blant annet promotere fra alkoholdehydrogenase, isocytokrom C og enzymer ansvarlige for maltose- og galaktoseutnyttelse.

Pattedyrceller er en foretrukket vert for å uttrykke nukleotidsegmenter som koder for immunglobuliner eller fragmenter derav. Se Winnacker, "From Genes to Clones", (VCH Publishers, NY, 1987). Flere egnede vertscellelinjer som kan sekrere intakte, heterologe proteiner har blitt utviklet i faget og innbefatter CHO-cellelinjer, ulike COS-cellelinjer, HeLa-celler, L-celler og myelomcellelinjer. Cellene er fortrinnsvis ikke fra et menneske. Ekspresjonsvektorer for disse cellene kan innbefatte ekspresjonskontrollsekvenser, slik som et replikasjonsstartsete, en promoter, en enhanser (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) og nødvendige informasjonsprosesseringsseter, slik som ribosombindingsseter, RNA-spleiseseter, polyadenyleringsseter og transkripsjonene stoppsignalsekvenser. Foretrukne ekspresjonskontrollsekvenser er promotere avledet fra endogene gener, cytomegalovirus, SV40, adenovirus, bovint papillomavirus og lignende. Se Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).

Alternativt kan antistoffkodende sekvenser bli inkorporert i transgener for introduksjon i genomet til et transgent dyr og påfølgende ekspresjon i melken til det transgene dyret (se f.eks. US 5.741.957, US 5.304.489, US 5.849.992). Egnede transgener innbefatter kodende sekvenser for lette og/eller tunge kjeder i funksjonell kobling med en promoter og enhanser fra et brystkjertelspesifikt gen, slik som kasein eller beta laktoglobulin.

Vektorene inneholdende DNA-segmentene av interesse kan bli ført inn i vertscellen med velkjente fremgangsmåter, avhengig av den cellulære vertstypen. For eksempel er kalsiumkloridtransfeksjon mye anvendt for prokaryote celler, mens kalsiumfosfatbehandling, elektroporering, lipofeksjon, partikkelbombardement eller viralbasert transfeksjon kan bli anvendt for andre cellulære verter. Andre fremgangsmåter anvendt til å transformere pattedyrceller innbefatter anvendelsen av polybren, protoplastfusjon, liposomer, elektroporering og mikroinjeksjon (se generelt Sambrook et al., supra). For produksjon av transgene dyr kan transgener bli mikroinjisert i befruktede eggceller eller kan bli inkorporert i genomet til embryonale stamceller og kjernen til slike celler ført inn i eggceller der kjernen er fjernet.

Når de først blir uttrykt, kan antistoffer bli renset i henhold til standard fremgangsmåter i faget, innbefattende HPLC-rensing, kolonnekromatografi, gelelektroforese og lignende (se generelt Scopes, "Protein Purification" (Springer-Verlag, NY, 1982)).

3. Bærerproteiner

Noen agenser for induksjon av en immunrespons inneholder den egnede epitopen for å indusere en immunrespons mot amyloide avleiringer, men er for små til å være immunogene. I dette tilfellet kan et peptidimmunogen bli koblet til en egnet bærer for å hjelpe til med å utløse en immunrespons. Egnede bærere inkluderer serumalbuminer, "keyhole limpet" hemocyanin, immunglobulinmolekyler, tyroglobulin, ovalbumin, tetanustoksoid eller et toksoid fra andre patogene bakterier, slik som difteri, E. coli, kolera eller H. pylori eller et attenuert toksinderivat. Andre bærere innbefatter T-celleepitoper som binder til multiple MHC-alleler, f.eks. minst 75 % av alle humane MHC-alleler. Slike bærere er enkelte ganger kjent i faget som "universelle T-celleepitoper". Eksempler på universelle T-celleepitoper inkluderer: Influensa-hemagluttinin: HA307-319PKYVKQNTLKLAT (SEKV ID NR:43)

PADRE (vanlige rester i fet skrift): AKXVAAWTLKAAA (SEKV ID NR:44)

Malaria CS: T3-epitope EKKIAKMEKASSVFNV (SEKV ID NR:45)

Hepatitt B-overflateantigen: HBsAgi9-28FFLLTRILTI (SEKV ID NR:46) Varmesjokkprotein 65: hsp65i53-i7i DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEKV ID NR:47) Calmette-Guérins basill: QVHFQPLPPAVVKL (SEKV ID NR:48)

Tetanustoksoid: TT830-844QYIKANSKFIGITEL (SEKV ID NR:49)

Tetanustoksoid: TT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEKV ID NR:50) HIVgp120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA (SEKV ID NR:51).

Andre bærere for å stimulere eller øke en immunrespons inkluderer cytokiner som IL-1, IL-1 a- og p-peptider, IL-2, ylNF, IL-10, GM-CSF og kjemokiner, slik som MIP1a og p og RANTES. Immunogene agenser kan også bli koblet til peptider som øker transport over vev, som beskrevet i 0'Mahony, WO 97/17613 og WO 97/17614.

Immunogene agenser kan bli koblet til bærere med kjemisk kryssbinding. Fremgangsmåter for å koble et immunogen til en bærer innbefatter dannelsen av disulfidbindinger ved å anvende N-suksinimidyl-3-(2-pyridyl-tio)propionat (SPDP) og suksinimidyl 4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-1-karboksylat (SMCC) (hvis peptidet mangler en sulfhydrylgruppe kan denne bli tilveiebragt ved tilsetning av en cysteinrest). Disse reagensene danner en disulfidbinding mellom dem selv og peptidcysteinrester på ett protein og en amidbinding via e-amino på et lysin eller annen fri aminogruppe i andre aminosyrer. Mange slike disulfid/amid-dannende agenser er beskrevet i Immun. Rev. 62,185 (1982). Andre bifunksjonelle bindingsagenser danner en tioeter i stedet for en disulfidbinding. Mange av disse tioeter-dannende agensene er tilgjengelig kommersielt og innbefatter reaktive estere av 6-maleimidokapronsyre, 2-bromeddiksyre og 2-jodeddiksyre, 4-(N-maleimido-metyl)sykloheksan-1-karboksylsyre. Karboksylgruppene kan bli aktivert ved å kombinere dem med suksinimid eller 1-hydroksyl-2-nitro-4-sulfonsyre, natriumsalt.

Immunogene peptider kan også bli uttrykt som fusjonsproteiner med bærere (dvs. heterologe peptider). Det immunogene peptidet kan bli bundet på dets aminoterminal, dets karboksylterminal eller begge steder til en bærer. Eventuelt kan flere repetisjoner av det immunogene peptidet foreligge i fusjonsproteinet. Eventuelt kan et immunogent peptid bli koblet til flere kopier av et heterologt peptid, for eksempel på både N- og C-terminalene av peptidet. Noen bærerpeptider bidrar til å indusere en T-hjelpercellerespons mot bærerpeptidet. De induserte T-hjelpercellene induserer i sin tur en B-cellerespons mot det immunogene peptidet koblet til bærerpeptidet.

Noen agenser i den foreliggende oppfinnelsen innbefatter et fusjonsprotein der et N-terminalt fragment av Ap er koblet på dets C-terminal til et bærerpeptid. I slike agenser utgjør den N-terminale resten til fragmentet av Ap den N-terminale resten til fusjonsproteinet. Derfor er slike fusjonsproteiner effektive til å indusere antistoffer som binder til en epitope som krever at den N-terminale resten til Ap er i fri form. Noen agenser i den foreliggende oppfinnelsen innbefatter et flertall repetisjoner av et N-terminalt segment av Ap koblet på C-terminalen til én eller flere kopier av et bærerpeptid. Det N-terminale fragmentet av Ap inkorporert i slike fusjonsproteiner starter enkelte ganger på Api-3 og ender på Ap7-11. Api-7, Api-3, 1-4, 1-5 og 3-7 er foretrukne N-terminale fragmenter av Ap. Noen fusjonsproteiner innbefatter ulike N-terminale segmenter av Ap i tandem. For eksempel kan et fusjonsprotein innbefatte Api-7, etterfulgt av Api-3 etterfulgt av et heterologt peptid.

I noen fusjonsproteiner er et N-terminalt segment av Ap smeltet sammen på dets N-terminale ende til et heterologt bærerpeptid. Den samme mangfoldigheten av N-terminale segmenter av Ap kan bli anvendt som for C-terminale fusjoner. Noen fusjonsproteiner innbefatter et heterologt peptid koblet til N-terminalen av et N-terminalt segment av Ap, som igjen er koblet til ett eller flere ekstra N-terminale segmenter av Ap i tandem.

Noen eksempler på fusjonsproteiner egnet for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen er vist nedenfor. Noen av disse fusjonsproteinene innbefatter segmenter av Ap koblet til tetanustoksoidepitoper, slik som beskrevet i US 5.196.512, EP 378.881 og EP 427.347. Noen fusjonsproteiner innbefatter segmenter av Ap koblet til bærerpeptider beskrevet i US 5.736.142. Noen heterologe peptider er universelle T-celleepitoper. I noen fremgangsmåter er agensen for administrering et enkelt fusjonsprotein med et Ap-segment koblet til et heterologt segment i lineær konfigurasjon. I noen fremgangsmåter er agensen multimer av fusjonsproteiner representert med formelen 2X, der x er et helt tall fra 1 -5. Fortrinnsvis er x lik 1, 2 eller 3, der 2 er mest foretrukket. Når x er 2, har en slik multimer fire fusjonsproteiner bundet i en foretrukket konfigurasjon henvist til som MAP4 (se US 5.229.490). Epitoper i Ap er understreket.

MAP4-konfigurasjonen er vist nedenfor, der forgreinede strukturer produseres ved å igangsette peptidsyntese på både N-terminalen og sidekjedeaminer til lysin. Avhengig av antallet ganger som lysin er inkorporert i sekvensen og får lage forgreiningspunkter, vil den resulterende strukturen ha flere N-terminaler. I dette eksempelet har fire identiske N-terminaler blitt produsert på den forgreinede lysininneholdende kjernen. Slik multiplisitet øker kraftig responsiviteten til beslektede B-celler.

AN90549 (Ap 1-7/Tetanustoksoid 830-844 i en MAP4-konfigurasjon):

AN90550 (Ap 1-7/Tetanustoksoid 947-967 i en MAP4-konfigurasjon):

AN90542 (Ap 1-7/Tetanustoksoid 830-844 + 947-967 i en lineær konfigurasjon):

AN90576: (Ap 3-9)/Tetanustoksoid 830-844 i en MAP4-konfigurasjon):

Peptider beskrevet i US 5.736.142 (alle i lineære konfigurasjoner):

Andre eksempler på fusjonsproteiner (immunogen epitope i Ap i fet skrift) inkluderer:

(Synukleinfusjonsprotein i MAP-4 konfigurasjon)

De samme eller lignende bærerproteinene og bindingsfremgangsmåtene kan bli anvendt for å generere immunogener til anvendelse i dannelsen av antistoffer mot Ap til anvendelse i passiv immunisering. For eksempel kan Ap eller et fragment koblet til en bærer bli administrert til et laboratoriedyr i produksjonen av monoklonale antistoffer til Ap.

4. Nukleinsyre som koder for terapeutiske agenser

Immunresponser mot amyloide avleiringer kan også bli indusert ved administrering av nukleinsyrer som koder for segmenter av Ap-peptid, og fragmenter derav, andre peptidimmunogener, eller antistoffer og deres komponentkjeder anvendt for passiv immunisering. Slike nukleinsyrer kan være DNA eller RNA. Et nukleinsyresegment som koder for et immunogen er vanligvis koblet til regulatoriske elementer, slik som en promoter og enhanser, som muliggjør ekspresjon av DNA-segmentet i de tenkte målcellene i en pasient. For ekspresjon i blodceller, som er fordelaktig for induksjon av en immunrespons, er promoter- og enhanserelementer fra immunglobulingener til lett eller tung kjede eller CM V hovedintermediær tidlig promoter og enhanser egnet for å styre ekspresjon. De koblede regulatoriske elementene og kodende sekvensene er ofte klonet inn i en vektor. For administrering av dobbeltkjedede antistoffer kan de to kjedene være klonet i den samme eller separate vektorer.

Flere virale vektorsystemer er tilgjengelige, innbefattende retrovirale systemer (se f.eks. Lawrie og Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); adenovirale vektorer (se f.eks. Bett et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)); adenoassosierte virusvektorer (se f.eks. Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), virale vektorer fra pox-familien innbefattende vacciniavirus og fuglepoxvirusene, virale vektorer fra alfavirusslekten, slik som de avledet fra Sindbis og Semliki Forest Virus (se f.eks. Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), venezuelansk hesteencefalittvirus (se US 5.643.576) og rhabdovirus, slik som vesikulært stomatittvirus (se WO 96/34625) og papillomavirus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al., WO 94/12629 og Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).

DNA som koder for et immunogen, eller en vektor inneholdende det samme, kan bli pakket inn i liposomer. Egnede lipider og relaterte analoger er beskrevet av US 5.208.036, 5.264.618, 5.279.833 og 5.283.185. Vektorer og DNA som koder for et immunogen kan også bli adsorbert til eller assosiert med partikkelbærere, der eksempler på dette inkluderer polymetylmetakrylatpolymerer og polylaktider og poly(laktid-ko-glykolider), se f.eks. McGee et al., J. Micro Encap. (1996).

Genterapivektorer eller nakent DNA kan bli avlevert in vivo ved administrering til en individuell pasient, vanligvis med systemisk administrering (f.eks. intravenøs-, intraperitoneal-, nasal-, gastrisk-, intradermal-, intramuskulær-, subdermal- eller intrakranial infusjon) eller lokal påføring (se f.eks. US 5.399.346). Slike vektorer kan videre innbefatte hjelpeagenser som bupivacine (US 5.593.970). DNA kan også bli administrert ved å anvende en genpistol. Se Xiao & Brandsma, supra. DNA'et som koder for et immunogen presipiteres på overflaten av mikroskopiske metallkuler. Mikroprosjektilene akselereres med en sjokkbølge eller ekspanderende heliumgass og penetrerer vev til en dybde på flere cellelag. For eksempel er Accel™ Gene Delivery Device, produsert av Agacetus, Inc., Middleton Wl, egnet. Alternativt kan nakent DNA passere gjennom huden inn i blodet ved å sette DNA'et på huden med kjemisk eller mekanisk irritasjon (se WO 95/05853).

I ytterligere en variasjon kan vektorer som koder for immunogener bli avlevert til celler ex vivo, slik som celler eksplantert fra en individuell pasient (f.eks. lymfocytter, beinmargsaspirater, vevsbiopsi) eller universelle hematopoetiske donorstamceller, etterfulgt av reimplantering av cellene i en pasient, vanligvis etter seleksjon av celler som har inkorporert vektoren.

III. Screening av antistoffer for fjerningsaktivitet

Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å screene et antistoff for evnen til å fjerne en amyloid avleiring eller ethvert annet antigen, eller assosiert biologisk enhet, der en slik egenskap er ønsket. For å screene for aktivitet mot en amyloid avleiring, kommer en vevsprøve fra en hjerne til en pasient med Alzheimers sykdom eller en dyremodell med karakteristisk Alzheimers patologi i kontakt med fagocytterende celler som har en Fc-reseptor, slik som mikrogliaceller, og antistoffet som blir testet i et medium in vitro. De fagocytterende cellene kan være en primærkultur eller en cellelinje, slik som BV-2, C8-B4 eller THP-1. I noen fremgangsmåter blir komponentene kombinert på et mikroskopobjektglass for å lette mikroskopisk monitorering. I noen fremgangsmåter utføres flere reaksjoner parallelt i brønnene i en mikrotiterplate. I et slikt format kan et separat miniatyrmikroskopobjektglass bli montert i de separate brønnene, eller et ikke-mikroskopisk deteksjonsformat, slik som ELISA-deteksjon av Ap, kan bli anvendt. Fortrinnsvis lages en målingsserie av amyloidmengden avleiret i in wfro-reaksjonsblandingen, med start fra en utgangsverdi før reaksjonen har begynt og én eller flere testverdier i løpet av reaksjonen. Antigenet kan bli detektert med farging, for eksempel med et fluorescensmerket antistoff til Ap eller annen komponent av amyloide plakk. Antistoffet anvendt for farging kan eller kan ikke være det samme som antistoffet som blir testet for fjerningsaktivitet. En reduksjon i forhold til utgangsverdien i løpet av reaksjonen av de amyloide avleiringene indikerer at antistoffet som blir testet har fjerningsaktivitet. Slike antistoffer er trolig egnet til forebyggelse eller behandling av Alzheimers og andre amyloidogene sykdommer.

Analoge fremgangsmåter kan bli anvendt for å screene antistoffer for evnen til å fjerne andre typer biologiske enheter. Testen kan bli anvendt for å detektere fjerningsaktivitet mot praktisk talt enhver type av biologisk enhet. Normalt har den biologiske enheten en rolle i sykdom hos menneske eller dyr. Den biologiske enheten kan bli tilveiebragt som en vevsprøve eller i isolert form. Hvis den er fremskaffet som en vevsprøve, er vevsprøven fortrinnsvis ikke fiksert for å muliggjøre lett tilgang til komponenter i vevsprøven og for å unngå ødeleggelse av konformasjonen til komponentene som skyldes fiksering. Eksempler på vevsprøver som kan bli testet i denne testen inkluderer kreftvev, pre-kreftvev, vev inneholdende godartet vekst, slik som vorter eller føflekker, vev infisert med patogene mikroorganismer, vev infiltrert med inflammatoriske celler, vev som har patologiske matriser mellom celler (f.eks. fibrinøs perikarditt), vev som har avvikende antigener og arrvev. Eksempler på isolerte biologiske enheter som kan bli anvendt innbefatter Ap, virale antigener eller virus, proteoglykaner, antigener av andre patogene mikroorganismer, tumorantigener og adhesjonsmolekyler. Slike antigener kan blant annet bli fremskaffet fra naturlige kilder, rekombinant ekspresjon eller kjemisk syntese. Vevsprøven eller den isolerte biologiske enheten kommer i kontakt med fagocytterende celler som har Fc-reseptorer, slik som monocytter eller mikrogliaceller, og et antistoff som blir testet i et medium. Antistoffet kan bli rettet mot den biologiske enheten som blir testet eller til et antigen assosiert med enheten. I det siste tilfellet er målet å teste om den biologiske enheten blir fagocyttert med det stedfortredende antigenet. Vanligvis, selv om det ikke er nødvendig, kommer antistoffet og den biologiske enheten (enkelte ganger med et assosiert antigen) i kontakt med hverandre før tilsetning av de fagocytterende cellene. Konsentrasjonen av den biologiske enheten og/eller det assosierte antigenet, hvis det foreligger, som er igjen i mediet blir deretter monitorert. En reduksjon i mengden eller konsentrasjonen av antigen eller den assosierte biologiske enheten i mediet indikerer at antistoffet har en fjerningsrespons mot antigenet og/eller assosiert biologisk enhet i forbindelse med de fagocytterende cellene (se f.eks. Eksempel 14).

IV. Pasienter som er egnet for behandling

Pasienter som er egnet for behandling innbefatter individer som har risiko for sykdom, men som ikke har symptomer, så vel som pasienter som har symptomer. Når det gjelder Alzheimers sykdom, vil praktisk talt hvem som helst risikere å lide av Alzheimers sykdom hvis han eller hun lever lenge nok. Derfor kan de foreliggende fremgangsmåtene bli administrert profylaktisk til den generelle populasjonen uten behov for risikovurdering av den individuelle pasienten. De foreliggende fremgangsmåtene er spesielt egnet for individer som har en kjent genetisk risiko for Alzheimers sykdom. Slike individer inkluderer de som har slektninger med denne sykdommen, og de der risiko er bestemt med analyse av genetiske eller biokjemiske markører. Genetiske risikomarkører mot Alzheimers sykdom innbefatter mutasjoner i APP-genet, spesielt mutasjoner i posisjon 717 og posisjonene 670 og 671, henvist til som henholdsvis Hardy og svenske mutasjoner (se Hardy, TINS, supra). Andre risikomarkører er mutasjoner i presenilingenene, PS1 og PS2, og ApoE4, familiehistorie med AD, hyperkolesterolemi eller aterosklerose. Individer som lider av Alzheimers sykdom har karakteristisk demens, så vel som tilstedeværelse av risikofaktorer beskrevet ovenfor. I tillegg er flere diagnostiske tester tilgjengelig for identifisering av individer med AD. Disse innbefatter måling av CSF tau- og Ap42-nivåer. Forhøyede tau- og reduserte Ap42-nivåer tilkjennegir nærværet av AD. Individer som lider av Alzheimers sykdom kan også diagnostiseres med ADRDA-kriterier, som diskutert i avsnittet med eksempler.

I symptomfrie pasienter kan behandling begynne i en hvilken som helst alder (f.eks. 10, 20, 30). Vanligvis er det derimot ikke nødvendig å begynne behandling før en pasient blir 40, 50, 60 eller 70 år. Behandling innbefatter vanligvis flere doser over en tidsperiode. Behandling kan bli monitorert ved å undersøke antistoff, eller aktiverte T-celle- eller B-celleresponser til den terapeutiske agensen (f.eks. Ap-peptid) overtid. Hvis responsen avtar, er en boosterdose indikert. I tilfellet med potensielle Downs syndrompasienter, kan behandling begynne før fødsel ved å administrere terapeutisk agens til moren eller kort tid etter fødsel.

V. Behandlingskurer

I profylaktiske anvendelser administreres farmasøytiske blandinger eller legemidler til en pasient mottakelig for, eller på annen måte med risiko for, Alzheimers sykdom i en mengde tilstrekkelig for å eliminere eller redusere risikoen, redusere alvorlighetsgraden, eller forsinke sykdomsutbruddet, innbefattende biokjemiske-, histologiske- og/eller adferdssymptomer på sykdommen, dens komplikasjoner og intermediære patologiske fenotyper som presenteres i løpet av sykdomsutviklingen. I terapeutiske anvendelser administreres blandinger eller legemidler til en pasient mistenkt for, eller som allerede lider av, en slik sykdom i en mengde tilstrekkelig for å kurere, eller i hvert fall delvis stanse, sykdomssymptomene (biokjemisk, histologisk og/eller adferd), innbefattende dens komplikasjoner og intermediære patologiske fenotyper i utvikling av sykdommen. I noen fremgangsmåter reduserer eller eliminerer administrering av agens myokognitiv svekkelse i pasienter som ikke enda har utviklet karakteristisk Alzheimers patologi. En mengde som er tilstrekkelig for å oppnå terapeutisk eller profylaktisk behandling er definert som en terapeutisk eller profylaktisk effektiv dose. I både profylaktiske og terapeutiske kurer administreres agenser vanligvis i flere doser til en tilstrekkelig immunrespons har blitt oppnådd. Normalt monitoreres immunresponsen og repeterte doser gis hvis immunresponsen begynner å avta.

Effektive doser av blandingene i den foreliggende oppfinnelsen for behandlingen av de ovenfor beskrevne tilstandene varierer avhengig av mange ulike faktorer, innbefattende administreringsmåter, målsete, pasientens fysiologiske tilstand, om pasienten er menneske eller et dyr, andre medisinske behandlinger administrert og om behandlingen er profylaktisk eller terapeutisk. Vanligvis er pasienten et menneske, men ikke-humane pattedyr, innbefattende transgene pattedyr, kan også bli behandlet. Behandlingsdoser trenger å bli titrert for å optimalisere sikkerhet og effektivitet. Immunogenmengden er avhengig av om adjuvans også blir administrert, der høyere doser er nødvendig i fravær av adjuvans. Mengden av et immunogen for administrering varierer enkelte ganger fra 1-500ug per pasient og mer normalt fra 5- 500 ug per injeksjon for administrering til menneske. Av og til anvendes en høyere dose på 1-2 mg per injeksjon. Normalt anvendes ca. 10, 20, 50 eller 100ug for hver injeksjon til menneske. Immunogenmassen er også avhengig av masseforholdet av immunogen epitope i immunogenet til immunogenmassen under ett. Normalt anvendes 10"<3>til 10"<5>mikromol av immunogen epitope for mikrogram av immunogen. Tidspunktet for injeksjoner kan variere betydelig fra én gang daglig, til én gang i året, til én gang i tiåret. På enhver gitt dag som en dose av immunogen gis er dosen større enn 1ug/pasient og vanligvis større enn 10ug/pasient hvis adjuvans også administreres, og større enn 10ug/pasient og vanligvis større enn 100ug/pasient i fravær av adjuvans. En typisk kur består av en immunisering etterfulgt av boosterinjeksjoner på tidsintervaller, slik som 6 ukers intervaller. En annen kur består av en immunisering etterfulgt av boosterinjeksjoner 1, 2 og 12 måneder senere. En annen kur innbefatter en injeksjon annen hver måned på livstid. Alternativt kan boosterinjeksjoner bli gitt på en uregelmessig basis, som indikert med monitorering av immunrespons.

For passiv immunisering med et antistoff varierer dosen fra ca. 0,0001 til 100 mg/kg, og mer normalt 0,01 til 5 mg/kg, av vertens kroppsvekt. For eksempel kan doser være 1 mg/kg kroppsvekt, eller 10 mg/kg kroppsvekt eller i området på 1-10 mg/kg. Et eksempel på behandlingskur innbefatter administrering én gang annen hver uke, eller én gang i måneden eller én gang hver 3. til 6. måned. I noen fremgangsmåter administreres to eller flere monoklonale antistoffer med ulike bindingsspesifisiteter samtidig, der dosen av hvert administrerte antistoff er innenfor de indikerte områdene. Antistoff administreres vanligvis ved flere anledninger. Intervaller mellom enkle doser kan være ukentlig, månedlig eller årlig. Intervaller kan også være uregelmessige, som indikert ved å måle blodnivåer av antistoff til Ap i pasienten. I noen fremgangsmåter justeres dosen for å oppnå en antistoffkonsentrasjon i plasma på 1-1000ug/ml og i noen fremgangsmåter 25-300ug/ml. Alternativt kan antistoff bli administrert som en langvarig frigjøringsformulering, der mindre frekvent administrering er nødvendig. Dose og frekvens varierer avhengig av halveringstiden til antistoffet i pasienten. Generelt har humane antistoffer lengst halveringstid, etterfulgt av humaniserte-, kimæriske- og ikke-humane antistoffer. Dosen og frekvensen av administreringen kan variere avhengig av om behandlingen er profylaktisk eller terapeutisk. I profylaktiske anvendelser administreres en relativt lav dose med relativt sjeldne intervaller over en lang tidsperiode. Noen pasienter fortsetter å motta behandling på livstid. I terapeutiske anvendelser er en relativt høy dose med relativt korte intervaller enkelte ganger nødvendig før sykdomsprogresjonen reduseres eller termineres, og fortrinnsvis til pasienten viser delvis eller fullstendig bedring av sykdomssymptomer. Deretter kan pasienten få administrert en profylaktisk kur.

Doser for nukleinsyrer som koder for immunogener varierer fra ca. 10 ng til 1 g, 100 ng til 100 mg, 1ug til 10 mg eller 30-300ug DNA per pasient. Doser for infeksiøse virale vektorer varierer fra 10-100 virioner eller mer per dose.

Agenser for induksjon av en immunrespons kan bli administrert parenteralt, lokalt, intravenøst, oralt, subkutant, intraarterielt, intrakranialt, intraperitonealt, intranasalt eller intramuskulært for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Den mest vanlige administreringsveien for en immunogen agens er subkutant, selv om andre veier kan være like effektive. Den nest mest vanlige veien er intramuskulær injeksjon. Denne typen av injeksjon utføres vanligvis i arm- eller lårmusklene. I noen fremgangsmåter injiseres agenser direkte i et bestemt vev der avleiringer har akkumulert, for eksempel intrakranial injeksjon. Intramuskulær injeksjon eller intravenøs infusjon er foretrukket for administrering av antistoff. I noen fremgangsmåter injiseres bestemte terapeutiske antistoffer direkte i kraniet. I noen fremgangsmåter administreres antistoffer som en langvarig frigjøringsblanding eller -anordning, slik som en Medipad™ anordning.

Agenser i den foreliggende oppfinnelsen kan eventuelt bli administrert i kombinasjon med andre agenser som i hvert fall er delvis effektive i behandling av amyloidogen sykdom. I tilfellet med Alzheimers og Downs syndrom, der amyloide avleiringer forekommer i hjernen, kan agenser i den foreliggende oppfinnelsen også bli administrert sammen med andre agenser som øker passering av agensene i oppfinnelsen over blod-hjerne-barrieren.

Immunogene agenser i den foreliggende oppfinnelsen, slik som peptider, blir enkelte ganger administrert i kombinasjon med et adjuvans. Mange adjuvantia kan bli anvendt i kombinasjon med et peptid, slik som Ap, for å utløse en immunrespons. Foretrukne adjuvantia øker den reelle responsen til et immunogen uten å forårsake konformasjonsforandringer i immunogenet som affiserer den kvalitative formen av responsen. Foretrukne adjuvantia inkluderer aluminiumhydroksid og aluminiumfosfat, 3 De-O-acylert monofosforyl lipid A (MPL™) (se GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, nå del av Corixa). Stimulon™ QS-21 er et triterpenglykosid eller saponin isolert fra barken til Quillaja Saponaria Molina-treet funnet i Sør-Amerika (se Kensil et al., i "Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach" (red. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US patent nr. 5.057.540) (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Andre adjuvantia er olje-i-vann emulsjoner (slik som squalen eller peanøttolje), eventuelt i kombinasjon med immunstimulerende forbindelser, slik som monofosforyl lipid A (se Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Et annet adjuvans er CpG (WO 98/40100). Alternativt kan Ap bli koblet til et adjuvans. Slik binding skal imidlertid ikke forandre konformasjonen til Ap vesentlig slik at immunresponsen blir affisert. Adjuvantia kan bli administrert som en komponent av en terapeutisk blanding med en aktiv agens eller kan bli administrert separat, før, samtidig med eller etter administrering av den terapeutiske agensen.

En foretrukket klasse med adjuvantia er aluminiumsalter (alun), slik som aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat og aluminiumsulfat. Slike adjuvantia kan bli anvendt med eller uten andre spesifikke immunstimulerende agenser som MPL eller 3-DMP, QS-21, polymere eller monomere aminosyrer som polyglutaminsyre eller polylysin. En annen klasse med adjuvantia er olje-i-vann emulsjonsformuleringer. Slike adjuvantia kan bli anvendt med eller uten andre spesifikke immunstimulerende agenser, slik som muramylpeptider (f.eks. N-acetylmuramyl-L-treonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'dipalmitoyl-sn-glysero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamin (MTP-PE), N-acetylgluksaminyl-N-acetylmuramyl-L-AI-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoksypropylamid (DTP-DPP) teramidTM) eller andre bakterielle celleveggkomponenter. Olje-i-vann emulsjoner inkluderer (a) MF59 (WO 90/14837), inneholdende 5 % Squalen, 0,5 % Tween 80 og 0,5 % Span 85 (eventuelt inneholdende ulike mengder av MTP-PE) formulert til submikronpartikler ved å anvende en mikrofluidisator som Modell 110Y mikrofluidizer (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, inneholdende 10 % Squalen, 0,4 % Tween 80, 5 % pluronisk blokkert polymer L121, og thr-MDP, enten mikrofluidisert til en submikronemulsjon eller vortekset for å generere en emulsjon med større partikkelstørrelse og (c) Ribi™ adjuvanssystem (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) inneholdende 2 % squalen, 0,2 % Tween 80 og én eller flere bakterielle celleveggkomponenter fra gruppen bestående av monofosforyl lipid A (MPL), trehalosedimykolat (TDM) og celleveggskjelett (CWS), fortrinnsvis MPL + CWS (Detox™). En annen klasse med foretrukne adjuvantia er saponinadjuvantia, slik som Stimulon™ (QS-21, Aquila, Framingham, MA) eller partikler generert derfra, slik som ISCOM'er (immunstimulerende komplekser) og ISCOMATRIX. Andre adjuvantia innbefatter fullstendig Freunds adjuvans (CFA) og ufullstendig Freunds adjuvans (IFA). Andre adjuvantia inkluderer cytokiner, slik som interleukiner (IL-1, IL-2 og IL-12), makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og tumornekrosefaktor (TNF).

Et adjuvans kan bli administrert med et immunogen som en enkel blanding eller kan bli administrert før, samtidig med eller etter administrering av immunogenet. Immunogen og adjuvans kan bli pakket og levert i det samme røret eller kan bli pakket i separate rør og blandet før anvendelse. Immunogen og adjuvans pakkes vanligvis med en merkelapp som indikerer den tenkte terapeutiske anvendelsen. Hvis immunogen og adjuvans pakkes separat, inneholder pakningen vanligvis instruksjoner for blanding før anvendelse. Valget av et adjuvans og/eller bærer er avhengig av stabiliteten til den immunogene formuleringen inneholdende adjuvanset, administreringsveien, doseringsplanen, effektiviteten til adjuvanset for arten som blir vaksinert, og i mennesker er et farmasøytisk godkjent adjuvans et adjuvans som har blitt godkjent eller kan godkjennes for administrering til menneske av aktuelle regulatoriske myndigheter. For eksempel er ikke fullstendig Freunds adjuvans egnet for administrering til menneske. Alun, MPL og QS-21 er foretrukket. Eventuelt kan to eller flere ulike adjuvantia bli anvendt samtidig. Foretrukne kombinasjoner innbefatter alun med MPL, alun med QS-21, MPL med QS-21, og alun, QS-21 og MPL til sammen. Også ufullstendig Freunds adjuvans kan bli anvendt (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), eventuelt i kombinasjon med enhver av alun, QS-21 og MPL og alle kombinasjoner derav.

Agenser i den foreliggende oppfinnelsen administreres ofte som farmasøytiske blandinger innbefattende en aktiv terapeutisk agens og en rekke andre farmasøytisk godkjente komponenter. Se Remingtons Pharmaceutical Science (15. utgave, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Den foretrukne formen er avhengig av den tenkte administreringsmåten og terapeutiske anvendelsen. Blandingene kan også innbefatte, avhengig av den ønskede formuleringen, farmasøytisk godkjente, ikke-toksiske bærere eller fortynningsmidler, som er definert som bindemidler mye anvendt til å formulere farmasøytiske blandinger for administrering til dyr eller menneske. Fortynningsmiddelet selekteres slik at det ikke affiserer den biologiske aktiviteten til kombinasjonen. Eksempler på slike fortynningsmidler er destillert vann, fysiologisk fosfatbufret saltvann, Ringers løsninger, dekstroseløsning og Hanks løsning. I tillegg kan den farmasøytiske blandingen eller formuleringen også inkludere andre bærere, adjuvantia eller ikke-toksiske, ikke-terapeutiske, ikke-immunogene stabilisatorer og lignende.

Farmasøytiske blandinger kan også innbefatte store, sakte metaboliserte makromolekyler som proteiner, polysakkarider som kitosan, polymelkesyrer, polyglykolsyrer og kopolymerer (slik som lateksfunksjonalisert sefarose (TM), agarose, cellulose og lignende), polymere aminosyrer, aminosyrekopolymerer og lipidaggregater (slik som oljedråper eller liposomer). I tillegg kan disse bærerne fungere som immunstimulerende agenser (dvs. adjuvantia).

For parenteral administrering kan agenser i den foreliggende oppfinnelsen bli administrert som injiserbare doser av en løsning eller suspensjon av substansen i et fysiologisk godkjent fortynningsmiddel med en farmasøytisk bærer som kan være en steril væske, slik som vann, oljer, saltvann, glyserol eller etanol. I tillegg kan hjelpesubstanser, slik som fuktende eller emulgerende agenser, overflateaktive agenser, pH-bufrende substanser og lignende foreligge i blandinger. Andre komponenter av farmasøytiske blandinger er de som er av petroleum-, dyre-, plante-eller syntetisk opprinnelse, som for eksempel peanøtt-, soyabønne- og mineralolje. Generelt er glykoler, slik som propylenglykol eller polyetylenglykol, foretrukne flytende bærere, spesielt for injiserbare løsninger. Antistoffer kan bli administrert i form av en depotinjeksjon eller implantatfremstilling som kan bli formulert på en slik måte at den muliggjør en langvarig frigjøring av den aktive bestanddelen. Et eksempel på blanding innbefatter monoklonalt antistoff ved 5 mg/ml formulert i vandig buffer bestående av 50 mM L-histidin, 150 mM NaCI, justert til pH 6,0 med

HCI.

Normalt fremstilles blandinger som injeksjonsløsninger enten som væskeløsninger eller suspensjoner; fast stoff egnet for løsning i, eller suspensjon i, flytende bindemidler før injeksjon kan også bli fremstilt. Fremstillingen kan også bli emulgert eller innkapslet i liposomer eller mikropartikler slik som polylaktid, polyglykolid eller kopolymer for økt adjuvanseffekt, som diskutert ovenfor (se Langer, Science 249, 1527 (1990) og Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Agensene i denne oppfinnelsen kan bli administrert i form av en depotinjeksjon eller implantatfremstilling som kan bli formulert på en slik måte at den muliggjør en langvarig eller pulserende frigjøring av den aktive bestanddelen.

Ytterligere formuleringer egnet for andre administreringsmåter innbefatter orale-, intranasale-, pulmonale- og transdermale formuleringer og stikkpiller.

For stikkpiller inkluderer bindemidler og bærere for eksempel polyalkylenglykoler eller triglyserider; slike stikkpiller kan bli dannet fra blandinger inneholdende den aktive bestanddelen i området på 0,5 % til 10 %, fortrinnsvis 1 %-2 %. Orale formuleringer innbefatter bindemidler, slik som farmasøytisk kvalitet av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, cellulose og magnesiumkarbonat. Disse blandingene er i form av løsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler, langvarige frigjøringsformuleringer eller pulvere og inneholder 10 %-95 % av aktiv bestanddel, fortrinnsvis 25 %-70 %.

Lokal anvendelse kan resultere i transdermal eller intradermal avlevering. Lokal administrering kan bli gjort enklere med administrering av agensen sammen med koleratoksin eller detoksifiserte derivater eller subenheter derav eller andre lignende bakterielle toksiner (se Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). Samadministrering kan bli utført ved å anvende komponentene som en blanding eller som koblede molekyler fremskaffet med kjemisk kryssbinding eller ekspresjon som et fusjonsprotein.

Alternativt kan transdermal avlevering bli oppnådd ved å anvende en hudvei eller ved anvendelse av transferosomer (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).

VI. Fremgangsmåter for diagnostisering

Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for deteksjon av en immunrespons mot Ap-peptid i en pasient som lider av eller er mottakelig for Alzheimers sykdom. Fremgangsmåtene er spesielt egnet for å monitorere en behandling som blir administrert til en pasient. Fremgangsmåtene kan bli anvendt til å monitorere både terapeutisk behandling på symptomatiske pasienter og profylaktisk behandling på symptomfrie pasienter. Fremgangsmåtene er nyttige for monitorering av både aktiv immunisering (f.eks. antistoff produsert i respons til administrering av immunogen) og passiv immunisering (f.eks. måle nivå av administrert antistoff).

1. Aktiv immunisering

Noen fremgangsmåter medfører å bestemme en startverdi for en immunrespons i en pasient før administrering av en agensdose, og sammenligne denne med en verdi for immunresponsen etter behandling. En betydelig økning (dvs. mer enn den typiske marginen for eksperimentelle feil i gjentatte målinger av den samme prøven, uttrykt som ett standardavvik fra gjennomsnittet av slike målinger) i immunresponsverdi signaliserer et positivt behandlingsresultat (dvs. at administrering av agensen har oppnådd eller økt en immunrespons). Hvis verdien for immunrespons ikke forandres betydelig, eller avtar, indikerer det et negativt behandlingsresultat. Generelt er det forventet at pasienter som gjennomgår en første behandling med en immunogen agens viser en økning i immunrespons med suksessive doser, som til slutt når et platå. Administrering av agens fortsetter generelt mens immunresponsen øker. Oppnåelse av platået er en indikator på at den administrerte behandlingen kan bli stanset eller redusert i dose eller frekvens.

I andre fremgangsmåter bestemmes en kontrollverdi (dvs. et gjennomsnitt og standardavvik) av immunrespons for en kontrollpopulasjon. Normalt har ikke individene i kontrollpopulasjonen mottatt behandling tidligere. Målte immunresponsverdier i en pasient etter administrering av en terapeutisk agens sammenlignes deretter med kontrollverdien. En signifikant økning i forhold til kontrollverdien (f.eks. mer enn ett standardavvik fra gjennomsnittet) signaliserer et positivt behandlingsresultat. Mangel på signifikant økning eller en reduksjon signaliserer et negativt behandlingsresultat. Administrering av agens fortsetter generelt mens immunresponsen øker i forhold til kontrollverdien. Som tidligere, er oppnåelse av et platå relativt til kontrollverdier en indikator på at behandlingsadministreringen kan bli stanset eller redusert i dose eller frekvens.

I andre fremgangsmåter bestemmes en immunresponskontrollverdi (f.eks. et gjennomsnitt og standardavvik) fra en kontrollpopulasjon med individer som har gjennomgått behandling med en terapeutisk agens og hvor immunresponser har nådd et platå i respons til behandling. Målte immunresponsverdier i en pasient sammenlignes med kontrollverdien. Hvis det målte nivået i en pasient ikke er signifikant forskjellig (f.eks. mer enn ett standardavvik) fra kontrollverdien, kan behandling bli stanset. Hvis nivået i en pasient er signifikant under kontrollverdien, rettferdiggjøres fortsatt administrering av agens. Hvis nivået i pasienten forblir under kontrollverdien, så kan en forandring i behandlingskuren, for eksempel anvendelse av et annet adjuvans, bli bestemt.

I andre fremgangsmåter monitoreres en pasient som ikke mottar behandling nå, men som har gjennomgått en behandling tidligere, for immunrespons for å bestemme om en gjenopptakelse av behandling er nødvendig. Den målte immunresponsverdien i pasienten kan bli sammenlignet med en immunresponsverdi tidligere oppnådd i pasienten etter en tidligere behandling. En signifikant reduksjon i forhold til den tidligere målingen (dvs. mer enn en typisk feilmargin i gjentatte målinger av den samme prøven) er en indikasjon på at behandling kan bli gjenopptatt. Alternativt kan verdien målt i en pasient bli sammenlignet med en kontrollverdi (gjennomsnitt pluss standardavvik) bestemt i en pasientpopulasjon etter at de har gjennomgått en behandling. Alternativt kan den målte verdien i en pasient bli sammenlignet med en kontrollverdi i populasjoner med profylaktisk behandlede pasienter som forblir frie for sykdomssymptomer eller populasjoner med terapeutisk behandlede pasienter som viser bedring av sykdomskarakteristika. I alle disse tilfellene er en signifikant reduksjon i forhold til kontrollnivået (dvs. mer enn et standardavvik) en indikator på at behandling bør bli gjenopptatt i en pasient.

Vevsprøven foranalyse er vanligvis blod, plasma, serum, slim eller cerebrospinalvæske fra pasienten. Prøven analyseres for indikasjon på en immunrespons til enhver form av Ap-peptid, vanligvis Ap42. Immunresponsen kan bli bestemt fra nærværet av f.eks. antistoffer eller T-celler som binder spesifikt til Ap-peptid. ELISA-fremgangsmåter for deteksjon av antistoffer spesifikke for Ap er beskrevet i avsnittet med eksempler. Fremgangsmåter for å detektere reaktive T-celler har blitt beskrevet ovenfor (se Definisjoner). I noen fremgangsmåter blir immunresponsen bestemt ved å anvende en fjerningstest, slik som beskrevet i Del III ovenfor. I slike fremgangsmåter kommer en vevsprøve fra en pasient som blir testet i kontakt med amyloide avleiringer (f.eks. fra en PDAPP-mus) og fagocytterende celler med Fc-reseptorer. Påfølgende fjerning av den amyloide avleiringen blir deretter monitorert. Tilstedeværelsen og omfanget av fjerningsrespons gir en indikasjon på eksistensen og nivået av antistoffer som er effektive til å fjerne Ap i vevsprøven til pasienten som blir testet.

2. Passiv immunisering

Generelt ligner fremgangsmåtene for monitorering av passiv immunisering på de for monitorering av aktiv immunisering beskrevet ovenfor. Imidlertid viser antistoffprofilen etter passiv immunisering vanligvis en umiddelbar antistoffkonsentrasjonstopp etterfulgt av en eksponentiell tilbakegang. Uten ytterligere en dose når tilbakegangen pre-behandlingsnivåer i løpet av en periode på dager til måneder, avhengig av halveringstiden til det administrerte antistoffet. For eksempel er halveringstiden til noen humane antistoffer 20 dager.

I noen fremgangsmåter blir en utgangsverdimåling av antistoff til Ap i pasienten utført før administrering, en andre måling blir utført raskt deretter for å bestemme det maksimale antistoffnivået, og én eller flere videre målinger blir utført i intervaller for å monitorere tilbakegang av antistoffnivåer. Når antistoffnivået har avtatt til startverdien eller en forhåndsbestemt prosent av startverdien (f.eks. 50 %, 25 % eller 10 %), administreres ytterligere en antistoffdose. I noen fremgangsmåter blir maksimum eller senere målte nivåer minus bakgrunn sammenlignet med tidligere bestemte referansenivåer for å fastsette en fordelaktig profylaktisk eller terapeutisk behandlingskur i andre pasienter. Hvis det målte antistoffnivået er betydelig lavere enn et referansenivå (f.eks. mindre enn gjennomsnittet minus ett standardavvik av referanseverdien i populasjon av pasienter som drar nytte av behandling), blir administrering av en ekstra antistoffdose bestemt.

3. Diagnostiske testsett

Oppfinnelsen tilveiebringer videre diagnostiske testsett for å utføre de diagnostiske fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. Normalt inneholder slike testsett en agens som binder spesifikt til antistoffer til Ap. Testsettet kan også innbefatte en markør. For deteksjon av antistoffer til Ap er markøren vanligvis i form av merkede anti-idiotypiske antistoffer. For deteksjon av antistoffer kan agensen bli fremskaffet forhåndsbundet til en fast fase, slik som til brønnene i en mikrotiterplate. Testsett inneholder også vanligvis en bruksanvisning for testsettet. Merkingen kan også innbefatte en tabell eller andre korresponderende behandlingskorrelerende nivåer av målt markør med nivåer av antistoffer til Ap. Begrepet merking henviser til ethvert skrevet eller registrert materiale som er festet til eller på annen måte følger med et testsett på ethvert tidspunkt i løpet av dets produksjon, transport, salg eller anvendelse. For eksempel omfatter begrepet merking reklamesedler og brosjyrer, pakningsmaterialer, instruksjoner, lyd- eller videokassetter, datamaskindisketter, så vel som tekst skrevet direkte på testsettet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også diagnostiske testsett for å utføre bildeanalyse in vivo. Slike testsett inneholder vanligvis et antistoff som binder til en epitope i Ap, fortrinnsvis i restene 1-10. Fortrinnsvis er antistoffet merket eller et sekundært markørreagens er inkludert i testsettet. Fortrinnsvis er testsettet merket med instruksjoner for å utføre en in v/Vo-bildeanalysetest.

VII. In wVo-bildeanalyse

Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å avbilde amyloide avleiringer in vivo i en pasient. Slike fremgangsmåter er egnet for å diagnostisere eller bekrefte diagnose av Alzheimers sykdom eller mottakelighet dertil. For eksempel kan fremgangsmåtene bli anvendt på en pasient som har symptomer på demens. Hvis pasienten har unormale amyloide avleiringer, lider pasienten trolig av Alzheimers sykdom. Fremgangsmåtene kan også bli anvendt på symptomfrie pasienter. Tilstedeværelse av unormale amyloide avleiringer indikerer mottakelighet for fremtidig symptomatisk sykdom. Fremgangsmåtene egner seg også for å monitorere sykdomsprogresjon og/eller respons til behandling i pasienter som tidligere har blitt diagnostisert med Alzheimers sykdom.

Fremgangsmåtene fungerer ved å administrere et reagens, slik som antistoff, som binder til Ap i pasienten og deretter detektere agensen etter at den har bundet. Foretrukne antistoffer binder til Ap-avleiringer i en pasient uten å binde til fullengde APP-polypeptid. Antistoffer som binder til en epitope i Ap innenfor aminosyrene 1-10 er spesielt foretrukne. I noen fremgangsmåter binder antistoffet til en epitope i aminosyrene 7-10 i Ap. Slike antistoffer binder vanligvis uten å indusere en vesentlig fjerningsrespons. I andre fremgangsmåter binder antistoffet til en epitope i aminosyrene 1-7 i Ap. Slike antistoffer binder vanligvis og induserer fjerning av Ap. Fjerningsresponsen kan imidlertid bli unngått ved å anvende antistoffragmenter som mangler en fullengde konstant region, som slike Fab'er. I noen fremgangsmåter kan det samme antistoffet fungere som både et behandlings- og diagnostisk reagens. Generelt viser ikke antistoffer som binder til C-terminale epitoper på rest 10 i Ap like sterkt signal som antistoffer som binder til epitoper i restene 1-10, trolig fordi de C-terminale epitopene er utilgjengelige i amyloide avleiringer. Derfor er slike antistoffer mindre foretrukket.

Diagnostiske reagenser kan bli administrert med intravenøs injeksjon i kroppen til pasienten, eller direkte inn i hjernen med intrakranial injeksjon eller ved å bore et hull gjennom skallen. Reagensdosen bør være i de samme områdene som for behandlingsfremgangsmåter. Normalt er reagenset merket, selv om det primære reagenset med affinitet for Ap i noen fremgangsmåter er umerket og en sekundær markøragens blir anvendt for å binde til det primære reagenset. Valget av markør er avhengig av deteksjonsmåten. For eksempel er en fluorescerende markør egnet for optisk deteksjon. Anvendelse av paramagnetiske markører er egnet for tomografisk deteksjon uten kirurgisk inngrep. Radioaktive markører kan også bli detektert ved å anvende PET eller SPECT.

Diagnose blir stilt ved å sammenligne antall, størrelse og/eller intensitet av merkede loki med korresponderende normalverdier. Normalverdiene kan representere gjennomsnittsnivåene i en populasjon med friske individer. Normalverdier kan også representere tidligere nivåer bestemt i den samme pasienten. For eksempel kan normalverdier bli bestemt i en pasient før behandling startes og målte verdier deretter sammenlignet med normalverdiene. En reduksjon i verdier i forhold til normalverdi signaliserer en positiv respons til behandling.

Eksempler

I. Profylaktisk effektivitet av Ap mot AD

Disse eksemplene beskriver administrering av Ap42-peptid til transgene mus som overuttrykker APP med en mutasjon i posisjon 717 (APP717V-+F) som predisponerer dem til å utvikle Alzheimers-lignende nevropatologi. Produksjon og karakteristika av disse musene (PDAPP-mus) er beskrevet i Games et al., Nature, supra. Disse dyrene, i deres heterozygote form, begynner å avleire Ap fra seks måneders alder. Ved 15 måneders alder har de Ap-avleiringsnivåer som er ekvivalente med det som er observert i Alzheimers sykdom. PDAPP-mus ble injisert med aggregert AP42(aggregert AP42) eller fosfatbufret saltvann. Aggregert AP42ble valgt pga. dets evne til å indusere antistoffer til flere epitoper i Ap.

A. Fremgangsmåter

1. Mus

Tretti PDAPP-heterogene hunnmus ble tilfeldig delt inn i følgende grupper: 10 mus som skulle bli injisert med aggregert Ap42 (én døde under transport), 5 mus som skulle bli injisert med PBS/adjuvans eller PBS, og 10 ikke-injiserte kontroller. Fem mus ble injisert med peptider avledet fra sekvensen til amyloid serumprotein (SAP).

2. Fremstilling av immunogener

Fremstilling av aggregert Ap42: to milligram av Ap42 (US Peptides Inc., batch K-42-12) ble løst opp i 0,9 ml vann og laget opp til 1 ml ved tilsetning av 0,1 ml 10 x PBS. Dette ble vortekset og fikk inkubere natten over ved 37 °C, under betingelser der peptidet aggregerte. Ethvert ubrukt Ap ble lagret som et tørt, frysetørket pulver ved - 20 °C til den neste injeksjonen.

3. Forberedelse av injeksjoner

For hver injeksjon ble 100 ug av aggregert Ap42 i PBS per mus emulgert 1:1 med

fullstendig Freunds adjuvans (CFA) i et sluttvolum på 400 ul emulsjon for den første immuniseringen, etterfulgt av en boosterdose med den samme immunogenmengden i ufullstendig Freunds adjuvans (IFA) etter 2 uker. To ekstra doser i IFA ble gitt med månedlige intervaller. De senere immuniseringene ble gjort med månedlige intervaller i 500 ul PBS. Injeksjoner ble gitt intraperitonealt (i.p.).

PBS-injeksjoner fulgte det samme skjemaet og mus ble injisert med en 1:1 blanding av PBS/adjuvans ved 400 ul per mus eller 500 ul PBS per mus. SAP-injeksjoner fulgte likeledes det samme skjemaet ved å anvende en dose på 100ug per injeksjon. 4. Titrering av museblodprøver, vevspreparering og immunhistokjemi Fremgangsmåtene ovenfor er beskrevet infra i "Generelle materialer og fremgangsmåter".

B. Resultater

PDAPP-mus ble injisert med enten aggregert Ap42 (aggregert Ap42), SAP-peptider eller fosfatbufret saltvann. En gruppe med PDAPP-mus var også ikke-injiserte, positive kontroller. Titerne til musene for aggregert Ap42 ble monitorer! annen hver måned fra den fjerde boosterdosen til musene var ett år gamle. Musene ble ofret 13 måneder gamle. Ved alle undersøkelsestidspunktene utviklet åtte av de ni aggregerte Ap42-musene en høy antistofftiter, som forble høy i løpet av injeksjonsserien (titere høyere enn 1/10000). Den niende musen hadde en lav, men målbar titer på ca. 1/1000 (Figur 1, Tabell 1). SAPP-injiserte mus hadde titere på 1:1.000 til 1:30.000 for dette immunogenet, med bare en enkel mus som hadde høyere enn 1:10.0000.

De PBS-behandlede musene ble titrert mot aggregert Ap42 etter seks, ti og tolv måneder. Ved en 1/100 fortynning oversteg PBS-musene, når de ble titrert mot aggregert Ap42, bakgrunnen bare 4 ganger på ett datapunkt, ellers var de mindre enn 4 ganger bakgrunnen på alle tidspunkter (Tabell 1). Den SAP-spesifikke responsen var neglisjerbar på disse tidspunktene med alle titere mindre enn 300.

Sju av de ni musene i gruppen behandlet med aggregert Api-42 hadde ikke noe detekterbart amyloid i hjernene sine. I motsetning til dette inneholdt hjernevev fra mus i SAP- og PBS-gruppene mange amyloide avleiringer i hippocampus, så vel som i de frontale og cingulate korteksene. Avleiringsmønsteret lignet på det til ubehandlede kontroller, med karakteristisk involvering av vulnerable subregioner, slik som det ytre molekylære laget av hippocampal dentate gyrus. Én mus fra den Api-42-injiserte gruppen hadde en sterkt redusert amyloidmengde, begrenset til hippocampus. Et isolert plakk ble identifisert i en annen Api-42-behandlet mus.

Kvantitative bildeanalyser av amyloidmengden i hippocampus verifiserte den dramatiske reduksjonen oppnådd i de Ap42(AN1792)-behandlede dyrene (Figur 2). Medianverdiene til amyloidmengden for PBS-gruppen (2,22 %) og for den ubehandlede kontrollgruppen (2,65 %) var signifikant høyere enn for de immunisert med AN 1792 (0,00 %, p = 0,0005). I motsetning til dette var medianverdien for gruppen immunisert med SAP-peptider (SAPP) 5,74 %. Hjernevev fra de ubehandlede kontrollmusene inneholdt mange Ap-amyloide avleiringer visualisert med det Ap-spesifikke monoklonale antistoffet (mAb) 3D6 i hippocampus, så vel som i retrosplenial korteks. Et lignende mønster for amyloid avleiring ble også observert i mus immunisert med SAPP eller PBS (Figur 2). I disse tre siste gruppene var det i tillegg en karakteristisk involvering av vulnerable subregioner i hjernen som er typisk for AD, slik som det ytre molekylære laget av hippocampal dentate gyrus.

Hjernene som ikke hadde noen Ap-avleiringer var også blottet for nevrittiske plakk, som vanligvis visualiseres i PDAPP-mus med det humane APP-antistoffet 8E5. Alle hjernene fra de resterende gruppene (SAP-injiserte-, PBS- og ikke-injiserte mus) hadde mange nevrittiske plakk typisk for ubehandlede PDAPP-mus. Et lite antall nevrittiske plakk var til stede i én mus behandlet med AN 1792, og en enkel duster med dystrofisk nevritt ble funnet i en annen mus behandlet med AN1792. Bildeanalyser av hippocampus, og vist i Figur 3, demonstrerte den faktiske elimineringen av dystrofisk nevritt i AN1792-behandlede mus (median 0,00 %) sammenlignet med mottakerne av PBS (median 0,28 %, p = 0,0005).

Astrocytose som er karakteristisk for plakkassosiert betennelse var også fraværende i hjernene til den Api-42-injiserte gruppen. Hjernene fra musene i de andre gruppene inneholdt rikelige og GFAP-positive astrocytter samlet i klynge typisk for Ap plakkassosiert gliose. En undergruppe av de GFAP-reagerte objektglassene ble farget på nytt med Thioflavin S for å lokalisere Ap-avleiringene. De GFAP-positive astrocyttene ble assosiert med Ap-plakk i SAP, PBS og ubehandlede kontroller. Ingen slik assosiering ble funnet i de plakknegative Ap 1-42-behandlede musene, mens minimal plakkassosiert gliose ble identifisert i én mus behandlet med AN1792.

Bildeanalyser, vist i Figur 4 for retrosplenial korteks, verifiserte at reduksjonen i astrocytose var signifikant med en medianverdi på 1,56 % for de behandlet med AN1792 versus medianverdier større enn 6 % for grupper immunisert med SAP-peptider, PBS eller ubehandlet (p = 0,0017).

Resultater fra en undergruppe av de Api-42- og PBS-injiserte musene indikerte at plakkassosiert MHC ll-immunreaktivitet var fraværende i de Api-42-injiserte musene, som var sammenfallende med mangel på en Ap-relatert inflammatorisk respons.

Snitt av musehjernene ble også reagert med et mAb spesifikt med et monoklonalt antistoff spesifikt for MAC-1, et celleoverflateprotein. MAC-1 (CD11b) er et integrinfamiliemedlem og eksisterer som en heterodimer med CD18. CD11b/CD18-komplekset foreligger på monocytter, makrofager, nøytrofiler og naturlige dreperceller (Mak og Simard). Den residerende MAC-1-reaktive celletypen i hjernen er sannsynligvis mikroglia basert på lignende fenotypisk morfologi i MAC-1-immunreagerte snitt. Plakkassosiert MAC-1 merking var lavere i hjernene til mus behandlet med AN 1792 sammenlignet med PBS-kontrollgruppen, et funn som er sammenfallende med mangelen på en Ap-indusert inflammatorisk respons.

C. Konklusjon

Mangelen på Ap-plakk og reaktive nevronale- og gliotiske forandringer i hjernene til de Api-42-injiserte musene indikerer at ikke noe eller ekstremt lite amyloid ble avleiret i hjernene deres, og patologiske konsekvenser, slik som gliose og nevrittisk patologi, var fraværende. PDAPP-mus behandlet med Api-42 viser praktisk talt den samme mangelen på sykdom som ikke-transgene kontrollmus. Derfor er Ap 1-42 injeksjoner svært effektive i forebyggelsen av avleiring eller fjerning av humant Ap fra hjernevev og eliminering av senere nevronale og inflammatorisk degenerative forandringer. Administrering av Ap-peptid kan derfor ha både forebyggende og terapeutisk gevinst i forebyggelse av AD.

II. Doseresponsstudie

Grupper med fem uker gamle, sveitsiske Webster-hunnmus (N = 6 per gruppe) ble immunisert med 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 eller 0,13ug av Ap formulert i CFA/IFA administrert intraperitonealt. Tre doser ble gitt annen hver uke, etterfulgt av en fjerde dose én måned senere. Den første dosen ble emulgert med CFA og de resterende dosene ble emulgert med IFA. Dyrene ble tatt blodprøver av 4-7 dager etter hver immunisering, med start etter den andre dosen, for måling av antistofftitere. Dyr i en undergruppe av tre grupper, de immunisert med 11, 33 eller 300ug antigen, ble i tillegg tatt blodprøver av ca. månedlig i fire måneder etter den fjerde immuniseringen for å monitorere tilbakegangen av antistoffresponsen over et doseområde av immunogene formuleringer. Disse dyrene mottok en siste femte immunisering sju måneder etter studiestart. De ble ofret én uke senere for å måle antistoffresponser til AN 1792 og for å utføre toksikologiske analyser.

En avtagende doserespons ble observert fra 300 til 3,7ug, med ingen respons på de to laveste dosene. Gjennomsnittlig antistofftiter er ca. 1:1000 etter 3 doser og ca. 1:10.000 etter 4 doser med 11 -300ug antigen (se Figur 5).

Antistofftitere steg dramatisk for alle, bortsett fra den laveste dosegruppen, etter den tredje immuniseringen med økning i GMT'er som varierte fra 5- til 25-fold. Lave antistoffresponser ble deretter detekterbare til og med for mottakerne av 0,4ug. 1,2 og 3,7 ug gruppene hadde sammenlignbare titere med GMT'er på ca. 1000 og de høyeste fire dosene lå samlet med GMT'er på ca. 25.000, med unntak av 33ug dosegruppen med en lavere GMT på 3000. Etter den fjerde immuniseringen var titerøkningen mer beskjeden for de fleste gruppene. Det var en tydelig doserespons på tvers av de lavere antigendosegruppene fra 0,14ug til 11ug, som varierte fra ikke noe detekterbart antistoff for mottakere av 0,14ug til en GMT på 36.000 for mottakere av 11ug. Igjen lå titere for de fire høyeste dosegruppene på 11 til 300ug samlet. Etter to immuniseringer var derfor antistofftiteren avhengig av antigendosen over hele det brede området fra 0,4 til 300ug. Etter den tredje immuniseringen var alle titerne på de høyeste fire dosene sammenlignbare, og de forble på et platå etter en ekstra immunisering.

Én måned etter den fjerde immuniseringen var titere 2- til 3-fold høyere i 300ug gruppen enn de målt fra blodprøver tatt fem dager etter immuniseringen (Figur 6). Denne observasjonen indikerer at den maksimale, anamnestiske antistoffresponsen forelå senere enn 5 dager post-immunisering. En mer beskjeden (50 %) økning ble observert på dette tidspunktet i 33ug gruppen. I 300ug dosegruppen avtok GMT'er voldsomt med ca. 70 % to måneder etter den siste dosen. Etter ytterligere én måned var reduksjonen mindre kraftig med 45 % (100ug) og ca. 14 % for dosene på 33 og 11 ug. Derfor ser reduksjonen av sirkulerende antistofftitere etter avsluttet immunisering ut til å ha to faser med en kraftig reduksjon den første måneden etter maksimal respons etterfulgt av en mer beskjeden reduksjon deretter.

Antistofftiterne og responskinetikkene til disse sveitsiske Webster-musene ligner på de til unge, heterozygote PDAPP-transgene mus immunisert på en tilsvarende måte. Doser som er effektive til å indusere en immunrespons i mennesker ligner vanligvis på doser som er effektive i mus.

III. Screening for terapeutisk effektivitet mot stadfestet AD

Denne testen er designet for å teste immunogene agenser for aktivitet i å arrestere eller reversere nevropatologiske karakteristika av AD i gamle dyr. Immuniseringer med 42 aminosyrer langt Ap (AN 1792) ble startet på et tidspunkt når amyloide plakk

allerede foreligger i hjernene til PDAPP-musene.

I løpet av tidsforløpet anvendt i denne studien utvikler ubehandlede PDAPP-mus flere nevrodegenerative forandringer som ligner på de funnet i AD (Games et al., supra, og Johnson-Wood et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94, 1550-1555 (1997)). Avleiringen av Ap i amyloide plakk er assosiert med en degenerativ, nevronal respons bestående av avvikende aksonale og dendrittiske elementer, kalt dystrofisk nevritt. Amyloide avleiringer som er omgitt av og inneholder dystrofisk nevritt kalles nevrittiske plakk. I både AD og PDAPP-musene har dystrofisk nevritt en utpreget kuleformet struktur, er immunreaktive med et panel av antistoffer som gjenkjenner APP og cytoskjelettkomponenter og har komplekse, subcellulære, degenerative forandringer på ultrastrukturelt nivå. Disse karakteristikaene muliggjør sykdomsrelevante, selektive og reproduserbare målinger av nevrittisk plakkdannelse i PDAPP-hjernene. Den dystrofiske, nevronale komponenten av PDAPP-nevrittiske plakk er enkel å visualisere med et antistoff spesifikt for humant APP (monoklonalt antistoff 8E5) og er enkel å måle med bildeanalyse på datamaskin. Derfor, i tillegg til å måle effektene av AN 1792 på amyloid plakkdannelse, monitorerte vi effektene av denne behandlingen på utviklingen av nevrittisk dystrofi.

Astrocytter og mikroglia er ikke-nevronale celler som responderer til og reflekterer graden av nevronal skade. GFAP-positive astrocytter og MHC ll-positive mikroglia er mye observert i AD, og aktiveringen av dem øker med sykdommens alvorlighetsgrad. Derfor monitorerte vi også utviklingen av reaktiv astrocytose og mikrogliose i de AN1792-behandlede musene.

A. Materialer og fremgangsmåter

Førtiåtte 11 til 11,5 måneder gamle heterozygote PDAPP-hunnmus, fremskaffet fra Charles River, ble tilfeldig delt inn i to grupper: 24 mus som skulle bli immunisert med 100ug av AN1792 og 24 mus som skulle bli immunisert med PBS, hver kombinert med Freunds adjuvans. AN 1792 og PBS-gruppene ble igjen delt når de ble 15 måneder gamle. Ved 15 måneders alder ble ca. halvparten av hver gruppe med de AN 1792- og PBS-behandlede dyrene gitt en lett og rolig død (henholdsvis n=10 og 9), de gjenværende fortsatte å motta immuniseringer til studieslutt ved -18- måneders alder (henholdsvis n=9og 12). Totalt 8 dyr (5 AN1792, 3 PBS) døde i løpet av studien. I tillegg til de immuniserte dyrene ble ett år gamle (n=10), 15 måneder gamle (n=10) og 18 måneder gamle (n=10) ubehandlede PDAPP-mus inkludert for sammenligning i ELISA'ene for å måle Ap- og APP-nivåer i hjernen; de ett år gamle dyrene ble også inkludert i de immunhistokjemiske analysene.

Metodologien var som i Eksempel 1, med mindre noe annet er indikert. US-peptider batch 12 og California-peptider batch ME0339 av AN 1792 ble anvendt for å fremstille antigenet for de seks immuniseringene som ble administrert før 15 måneders tidspunktet. California-peptider batch ME0339 og ME0439 ble anvendt for de tre ekstra immuniseringene administrert mellom 15 og 18 måneder.

For immuniseringer ble 100 ug avAN1792 i 200 ul PBS eller PBS alene emulgert 1:1 (vol:vol) med fullstendig Freunds adjuvans (CFA) eller ufullstendig Freunds adjuvans (IFA) eller PBS i et sluttvolum på 400 ul. Den første immuniseringen ble gitt med CFA som adjuvans, de neste fire dosene ble gitt med IFA og de siste fire dosene med PBS alene uten tilsatt adjuvans. Totalt ni immuniseringer ble gitt i løpet av sju måneders perioden, med annen hver uke for de første tre dosene etterfulgt av et fire ukers intervall for de resterende injeksjonene. Fire måneders behandlingsgruppen, som ble gitt en lett og rolig død 15 måneder gamle, mottok bare de første 6 immuniseringene.

B. Resultater

1. Effekter av AN1792-behandling på amyloidmengde

Resultatene av AN1792-behandling på kortikal amyloidmengde, bestemt med kvantitativ bildeanalyse, er vist i Figur 7. Medianverdien til kortikal amyloidmengde var 0,28 % i en gruppe med ubehandlede, 12 måneder gamle PDAPP-mus, en verdi som er representativ for plakkmengden i mus ved studiestart. Ved 18 måneder økte amyloidmengden over 17-fold til 4,87 % i PBS-behandlede mus, mens AN 1792-behandlede mus hadde en sterkt redusert amyloidmengde på bare 0,01 %, klart mindre enn de 12 måneder ubehandlede- og både de 15 og 18 måneder PBS-behandlede gruppene. Amyloidmengden var signifikant redusert i mottakerne av AN1792 etter både 15 (96 % reduksjon; p = 0,003) og 18 (> 99 % reduksjon; p =

0,0002) måneder.

Normalt starter kortikal amyloid avleiring i PDAPP-mus i de frontale og retrospleniale korteksene (RSC) og fortsetter i en ventral-lateral retning for å involvere de temporale og entorhinale korteksene (EC). Lite eller ikke noe amyloid ble funnet i EC til 12 måneder gamle mus, gjennomsnittsalderen for når AN1792 ble først administrert. Etter 4 måneder med AN1792-behandling var amyloid avleiring i høy grad redusert i RSC, og den progressive involveringen av EC var fullstendig eliminert med AN1792-behandling. Den siste observasjonen viste at AN1792 fullstendig stanset progresjonen av amyloid som normalt ville invadere de temporale og ventrale korteksene, så vel som arresterte eller muligvis reverserte avleiring i RSC.

De tydelige effektene av AN1792-behandling på utviklende kortikal amyloidmengde i PDAPP-musene er videre demonstrert med 18-måneders gruppen, som hadde blitt behandlet i sju måneder. Et nesten fullstendig fravær av kortikalt amyloid ble funnet i den AN1792-behandlede musen, med en total mangel på spredte plakk, så vel som en reduksjon i kompakte avleiringer.

2. AN1792-behandlingsassosierte cellulære og morfologiske forandringer En populasjon av Ap-positive celler ble funnet i hjerneregioner som typisk inneholder amyloide avleiringer. Bemerkelsesverdig, i flere hjerner fra AN1792-mottakere, ble det funnet veldig få eller ingen ekstracellulære kortikale amyloide plakk. Mesteparten av Ap-immunreaktiviteten viste seg å være i celler med stor lobulær eller klumpet soma. Fenotypisk lignet disse cellene på aktiverte mikroglia eller monocytter. De var immunreaktive med antistoffer som gjenkjenner ligander uttrykt av aktiverte monocytter og mikroglia (MHC II og CD11b) og ble leilighetsvis assosiert med blodåreveggen eller -lumenet. Sammenligning av nærliggende snitt merket med Ap-og MHC ll-spesifikke antistoffer avslørte at lignende mønstre av disse cellene ble gjenkjent av begge antistoffklassene. Detaljert undersøkelse av de AN1792-behandlede hjernene avslørte at de MHC ll-positive cellene var begrenset til området i nærheten av det begrensede, gjenværende amyloidet i disse dyrene. Under fikseringsbetingelsene som ble anvendt var ikke cellene immunreaktive med antistoffer som gjenkjenner T-celle- (CD3, CD3e) eller B-celle- (CD45RA, CD45RB) ligander eller leukocyttvanlig antigen (CD45), men var reaktive med et antistoff som gjenkjenner leukosialin (CD43) som kryssreagerer med monocytter. Ingen slike celler ble funnet i noen av de PBS-behandlede musene.

PDAPP-mus utvikler ufravikelig mye amyloid avleiring i det ytre molekylære laget av hippocampal dentate gyrus. Avleiringen danner en tydelig stripe i perforantveien, en subregion som typisk inneholder amyloide plakk i AD. Den karakteristiske tilstedeværelsen av disse avleiringene i PBS-behandlede mus ligner på det som tidligere erkarakteriserti ubehandlede PDAPP-mus. Den amyloide avleiringen bestod av både diffuse og kompakte plakk i et sammenhengende bånd. I flere hjerner fra AN1792-behandlede mus var dette mønsteret derimot forandret drastisk. Den hippocampale amyloide avleiringen inneholdt ikke lenger diffust amyloid, og båndmønsteret var fullstendig ødelagt. I stedet var flere uvanlige punktstrukturer til stede som er reaktive med anti-Ap antistoffer, der flere av disse viste seg å være amyloidinneholdende celler.

MHC ll-positive celler ble ofte observert i nærheten av ekstracellulært amyloid i AN1792-behandlede dyr. Assosieringsmønsteret av Ap-positive celler med amyloid var veldig likt i flere hjerner fra AN1792-behandlede mus. Fordelingen av disse monocyttiske cellene var begrenset til området i nærheten av det avleirede amyloidet og var fullstendig fraværende fra andre hjerneregioner fri for Ap-plakk.

Konfokalt mikroskopi av MHC II- og Ap-merkede snitt avslørte at plakkmateriale var til stede i mange av de monocyttiske cellene.

Kvantitativ bildeanalyse av MHC II og MAC 1-merkede snitt viste en tendens mot økt immunreaktivitet i RSC og hippocampus i AN1792-behandlede mus sammenlignet med PBS-gruppen som var signifikant med målingen av MAC 1-reaktivitet i hippocampus.

Disse resultatene antyder aktiv, cellemediert fjerning av amyloid i plakkinneholdende hjerneregioner.

3. AN1792-effekter på Ap-nivåer: ELISA-analyser

(a) Kortikale nivåer

I ubehandlede PDAPP-mus var mediannivået av totalt Ap i korteksen etter 12 måneder 1.600 ng/g, som økte til 8.700 ng/g etter 15 måneder (Tabell 2). Etter 18 måneder var verdien 22.000 ng/g, en økning på over 10-fold i løpet av forsøket. PBS-behandlede dyr hadde 8.600 ng/g totalt Ap etter 15 måneder, som økte til 19.000 ng/g etter 18 måneder. I motsetning hadde AN1792-behandlede dyr 81 % mindre totalt Ap etter 15 måneder (1.600 ng/g) enn den PBS-immuniserte gruppen. Signifikant mindre (p = 0,0001) totalt Ap (5.200 ng/g) ble funnet etter 18 måneder når AN 1792- og PBS-gruppene ble sammenlignet (Tabell 2), som representerer en 72 % reduksjon i Ap som ellers ville være til stede. Lignende resultater ble fremskaffet når kortikale nivåer av Ap42 ble sammenlignet, nemlig at den AN1792-behandlede gruppen inneholdt mye mindre Ap42, men i dette tilfellet var forskjellene mellom AN 1792- og PBS-gruppene signifikante etter både 15 måneder (p = 0,04) og 18 måneder (p = 0,0001, Tabell 2).

(b) Hippocampale nivåer

I ubehandlede PDAPP-mus var hippocampale mediannivåer av totalt Ap ved tolv måneders alder 15.000 ng/g, som økte til 51.000 ng/g etter 15 måneder og videre til 81.000 ng/g etter 18 måneder (Tabell 3). Likeledes viste PBS-immuniserte mus verdier på 40.000 ng/g og 65.000 ng/g etter henholdsvis 15 måneder og 18 måneder. AN1792-immuniserte dyr hadde mindre totalt Ap, nærmere bestemt 25.000 ng/g og 51.000 ng/g på de respektive 15- og 18-måneders tidspunktene. 18- måneders verdien til den AN1792-behandlede gruppen var signifikant lavere enn den til den PBS-behandlede gruppen (p = 0,0105; Tabell 3). Måling av Ap42 fremskaffet det samme resultatmønsteret, nemlig at nivåer i den AN1792-behandlede gruppen var signifikant lavere enn i PBS-gruppen (henholdsvis 39.000 ng/g vs. 57.000 ng/g; p = 0,002) ved 18-måneders evalueringen (Tabell 3).

(c) Cerebellare nivåer

112 måneder gamle ubehandlede PDAPP-mus var det cerebellare mediannivået av totalt Ap 15 ng/g (Tabell 4). Etter 15 måneder økte denne medianen til 28 ng/g, og etter 18 måneder hadde den steget til 35 ng/g. PBS-behandlede dyr hadde medianverdier av totalt Ap på 21 ng/g etter 15 måneder og 43 ng/g etter 18 måneder. AN1792-behandlede dyr ble funnet å ha 22 ng/g totalt Ap etter 15 måneder og signifikant mindre (p = 0,002) totalt Ap etter 18 måneder (25 ng/g) enn den korresponderende PBS-gruppen (Tabell 4).

4. Effekter av AN1792-behandling på APP-nivåer

Både APP-a og fullengde APP-molekylet inneholder hele eller en del av Ap-sekvensen og kan dermed potensielt bli påvirket av genereringen av en AN 1792-rettet immunrespons. I studier så langt har en liten økning av APP-nivåer blitt registrert når nevropatologi øker i PDAPP-musen. I korteksen var nivåer av enten APP-a/FL (fullengde) eller APP-a praktisk talt uforandret ved behandling, med unntak av at APP-a var redusert med 19 % på 18-måneders tidspunktet i den AN1792-behandlede gruppen vs. den PBS-behandlede gruppen. De 18-måneders AN1792-behandlede APP-verdiene var ikke signifikant forskjellige fra verdier til de 12-måneders og 15-måneders ubehandlede og 15-måneders PBS-gruppene. I alle tilfellene var APP-verdiene innenfor områdene som vanligvis foreligger i PDAPP-mus. 5. Effekter av AN1792-behandling på nevrodegenerativ og gliotisk patologi Nevrittisk plakkmengde var redusert signifikant i den frontale korteksen i AN 1792-behandlede mus sammenlignet med PBS-gruppen ved både 15 (84 %; p = 0,03) og 18 (55 %; p = 0,01) måneders alder (Figur 8). Medianverdien til den nevrittiske plakkmengden økte fra 0,32 % til 0,49 % i PBS-gruppen mellom 15 og 18 måneders alder. Dette var forskjellig fra den svært reduserte utviklingen av nevrittiske plakk i AN1792-gruppen, med median av nevrittiske plakkmengdeverdier på 0,05 % og 0,22 % i henholdsvis 15- og 18-måneders gruppene.

Immuniseringer med AN1792 virket veltolererte, og reaktiv astrocytose var også signifikant redusert i RSC til AN1792-behandlede mus sammenlignet med PBS-gruppen ved både 15 (56 %; p = 0,011) og 18 (39 %; p = 0,028) måneders alder (Figur 9). Medianverdier av astrocytoseprosenten i PBS-gruppen økte mellom 15 og 18 måneder fra 4,26 % til 5,21 %. AN1792-behandling undertrykte utviklingen av astrocytose på begge tidspunkter til henholdsvis 1,89 % og 3,2 %. Dette indikerer av nevropilen ikke ble skadet med fjerningsprosessen.

6. Antistoffresponser

Som beskrevet ovenfor, mottok elleve måneder gamle heterozygote PDAPP-mus (n = 24) en serie på 5 immuniseringer av 100ug AN 1792 emulgert med Freunds adjuvans og administrert intraperitonealt på ukene 0, 2, 4, 8 og 12 og en sjette immunisering med PBS alene (uten Freunds adjuvans) på uke 16. Som en negativ kontroll mottok et parallelt sett med 24 aldersmatchende transgene mus immuniseringer av PBS emulgert med de samme adjuvantiaene og levert etter det samme skjemaet. Blodprøver ble tatt i løpet av tre til sju dager etter hver immunisering med start etter den andre dosen. Antistoffresponser til AN1792 ble målt med ELISA. Geometrisk gjennomsnittlige titere (GMT) for dyrene som ble immunisert med AN 1792 var ca. 1.900, 7.600 og 45.000 etter henholdsvis den andre, tredje og siste (sjette) dosen. Ikke noe Ap-spesifikt antistoff ble målt i kontrolldyr etter den sjette immuniseringen.

Bortimot halvparten av dyrene ble behandlet i ytterligere tre måneder og mottok immuniseringer etter ca. 20, 24 og 27 uker. Hver av disse dosene ble levert i PBS alene uten Freunds adjuvans. Gjennomsnittlige antistofftitere forble uforandret i løpet av denne tidsperioden. Faktisk viste antistofftitere seg å forbli stabile fra den fjerde til den åttende blodprøven, som svarer til en periode som dekker den femte til den niende injeksjonen.

For å bestemme om de Ap-spesifikke antistoffene, produsert som følge av immunisering som ble detektert i seraene til AN1792-behandlede mus, også ble assosiert med amyloid hjerneavleiring, ble snitt fra de AN 1792- og PBS-behandlede musene reagert med et antistoff spesifikt for mus IgG. I motsetning til PBS-gruppen ble Ap-plakk i AN1792-behandlede hjerner dekket med endogent IgG. Denne forskjellen mellom de to gruppene ble observert i både 15- og 18-måneders grupper. Spesielt påfallende var mangelen på merking i PBS-gruppen, til tross for nærvær av en stor amyloidmengde i disse musene. Disse resultatene viser at immunisering med et syntetisk Ap-protein genererer antistoffer som gjenkjenner og binder in vivo til Ap i amyloide plakk.

7. Cellemedierte immunresponser

Milter ble fjernet fra ni AN 1792-immuniserte og 12 PBS-immuniserte 18 måneder gamle PDAPP-mus 7 dager etter den niende immuniseringen. Splenocytter ble isolert og dyrket i 72 timer i nærvær av Ap40, Ap42 eller Ap40-1 (protein med reversert rekkefølge). Con A-mitogenet fungerte som en positiv kontroll. Optimale responser ble fremskaffet med > 1,7 nM protein. Celler fra alle ni AN 1792-behandlede dyrene prolifererte i respons til enten Api-40 eller Api-42 protein, med like inkorporeringsnivåer for begge proteinene (Figur 10, øvre panel). Det var ingen respons til det reverserte Ap40-1 proteinet. Celler fra kontrolldyr responderte ikke til noen av Ap-proteinene (Figur 10, nedre panel).

C. Konklusjon

Resultatene fra denne studien viser at AN1792-immunisering av PDAPP-mus som har eksisterende amyloide avleiringer saktner og forebygger progressiv amyloid avleiring og bremser følgende nevropatologiske forandringer i den aldrende PDAPP-musehjernen. Immuniseringer med AN 1792 praktisk talt stanset amyloid utvikling i strukturer som vanligvis ville bukke underfør amyloidose. Derfor har administrering av Ap-peptid terapeutisk nytte i behandlingen av AD.

IV. Screening av Ap-fragmenter

100 PDAPP-mus i alderen 9-11 måneder ble immunisert med 9 ulike regioner av APP og Ap for å bestemme hvilke epitoper som gir den effektive responsen. De 9 ulike immunogenene og én kontroll ble injisert i.p. som beskrevet ovenfor. Immunogenene inkluderer fire humane Ap-peptidkonjugater, 1-12,13-28, 32-42, 1-5, der alle er koblet til sau anti-mus IgG via en cystinbinding; APP-polypeptidaminosyrene 592-695, aggregert humant Api-40, og aggregert humant Ap 25-35 og aggregert gnager Ap42. Aggregert Ap42 og PBS ble anvendt henholdsvis som positive og negative kontroller. Ti mus ble anvendt per behandlingsgruppe. Titere ble monitorer! som ovenfor, og musene ble gitt en lett og rolig død etter 4 måneder med injeksjoner. Histokjemi, Ap-nivåer og toksikologianalyse ble bestemt post mortem.

A. Materialer og fremgangsmåter

1. Fremstilling av immunogener

Fremstilling av koblede Ap-peptider: fire humane Ap-peptidkonjugater

(aminosyrerestene 1-5, 1-12, 13-28 og 33-42, hver konjugert til sau anti-mus IgG) ble fremstilt med binding via et kunstig cystein tilsatt Ap-peptidet ved å anvende det kryssbindende reagenset sulfo-EMCS. Ap-peptidderivatene ble syntetisert med de følgende endelige aminosyresekvensene. I hvert tilfelle er lokaliseringen av den innsatte cysteinresten indikert med understreking. AP13-28 peptidderivatet hadde også to glysinrester tilsatt før det karboksylterminale cysteinet, som antydet.

Ap1-12 peptid NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH (SEKV ID NR:72)

Ap1-5 peptid NH2-DAEFRC-COOH (SEKV ID NR:73)

Ap33-42 peptid NH2-C-amino-heptansyre-GLMVGGVVIA-COOH (SEKV ID NR:74) Ap13-28 peptid Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (SEKV ID NR:75)

For å forberede til bindingsreaksjonen ble 10 mg sau anti-mus IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) dialysert natten over mot 10 mM natriumboratbuffer, pH 8,5. Det dialyserte antistoffet ble deretter konsentrert til et volum på 2 ml ved å anvende et Amicon Centriprep-rør.

Ti mg sulfo-EMCS [N (e-maleimidocuproyloksy)suksinimid] (Molecular Sciences Co), ble løst opp i én ml avionisert vann. Et 40-fold molart overskudd av sulfo-EMCS ble tilsatt dråpevis med røring til sau anti-mus IgG, og deretter ble løsningen rørt i ytterligere ti min. Aktivert sau anti-mus IgG ble renset og bufferen ble skiftet ved passering gjennom en 10 ml gelfiltreringskolonne (Pierce Presto-kolonne, fremskaffet fra Pierce Chemicals) ekvilibrert med 0,1 M NaPCM, 5 mM EDTA, pH 6,5. Antistoffinneholdende fraksjoner, identifisert med absorbans på 280 nm, ble slått sammen og fortynnet til en konsentrasjon på ca. 1 mg/ml ved å anvende 1,4 mg per OD som ekstinksjonskoeffisienten. Et 40-fold molart overskudd av Ap-peptid ble løst opp i 20 ml av 10 mM NaP04, pH 8,0, med unntak av Ap33-42 peptidet der 10 mg først ble løst opp i 0,5 ml DMSO og deretter fortynnet til 20 ml med 10 mM NaP04-buffer. Peptidløsningene ble hver satt til 10 ml aktivert sau anti-mus IgG og vugget ved romtemperatur i 4 timer. De resulterende konjugatene ble konsentrert til et sluttvolum på mindre enn 10 ml ved å anvende et Amicon Centriprep-rør og deretter dialysert mot PBS for å skifte bufferen og fjerne fritt peptid. Konjugatene ble ført gjennom filtre med 0,22 nm porestørrelse for sterilisering og deretter alikvottert i fraksjoner på 1 mg og lagret ved -20 °C. Konsentrasjonene av konjugatene ble bestemt ved å anvende BCA-proteintesten (Pierce Chemicals) med hest IgG for standardkurven. Konjugering ble dokumentert med molekylvektøkningen av de konjugerte peptidene i forhold til den til aktivert sau anti-mus IgG. Api-5 sau anti-mus konjugatet var en samling av to konjugeringer, resten var fra en enkel fremstilling.

2. Fremstilling av aggregerte Ap-peptider

Humant 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Lot ME0541), humant 1-42 (AN1792; California Peptides Inc., Lot ME0339 og ME0439), humant 25-35 og gnager 1-42 (California Peptides Inc., Lot ME0218) peptider ble nyoppløstfor fremstillingen av hvert sett med injeksjoner fra frysetørkede pulvere som hadde blitt lagret tørket ved -20 °C. For dette formålet ble 2 mg peptid satt til 0,9 ml avionisert vann, og blandingen ble vortekset for å generere en relativt ensartet løsning eller suspensjon. Av de fire var AN 1528 det eneste peptidet som var løselig på dette trinnet. En 100 ni delmengde av 10 x PBS (1 x PBS: 0,15 M NaCI, 0,01 M natriumfosfat, pH 7,5) ble deretter tilsatt, og på dette punktet begynte AN1528 å presipitere. Suspensjonen ble vortekset igjen og inkubert natten over ved 37 °C for anvendelse neste dag.

Fremstilling av pBx6 proteinet: Et ekspresjonsplasmid som koder for pBx6, et fusjonsprotein bestående av en 100-aminosyrer lang bakteriofag MS-2 polymerase N-terminal ledersekvens etterfulgt av aminosyrene 592-695 til APP (PAPP), ble konstruert som beskrevet av Oltersdorf et al., J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Plasmidet ble transfektert inn i E. coli og proteinet ble uttrykt etter induksjon av promoteren. Bakteriene ble lysert i 8 M urea, og pBx6 ble delvis renset med forberedende SDS-PAGE. Fraksjoner inneholdende pBx6 ble identifisert med Western blott ved å anvende et kanin anti-pBx6 polyklonalt antistoff, slått sammen, konsentrert ved å anvende et Amicon Centriprep-rør og dialysert mot PBS. Renheten til fremstillingen, estimert med Coomassie Blue-farget SDS-PAGE, var ca. 5 til 10 %.

B. Resultater og diskusjon

1. Studiedesign

Ett hundre heterozygote PDAPP-transgene hann- og hunnmus som var ni til elleve måneder gamle ble fremskaffet fra Charles River Laboratory og Taconic Laboratory. Musene ble sortert inn i ti grupper for å bli immunisert med ulike regioner av Ap eller APP kombinert med Freunds adjuvans. Dyr ble fordelt for å matche kjønn, alder, opphav og kilde for dyrene i gruppene så godt som mulig. Immunogenene inkluderte fire Ap-peptider avledet fra den humane sekvensen, 1-5, 1-12, 13-28 og 33-42, hvert konjugert til sau anti-mus IgG; fire aggregerte Ap-peptider, humant 1-40 (AN1528), humant 1-42 (AN 1792), humant 25-35 og gnager 1-42; og et fusjonspolypeptid, kalt pBx6, inneholdende APP-aminosyrerestene 592-695. En tiende gruppe ble immunisert med PBS kombinert med adjuvans som en kontroll.

For hver immunisering ble 100 ng av hvert Ap-peptid i 200 ni PBS eller 200 ng av APP-derivatet pBx6 i det samme volumet av PBS eller PBS alene emulgert 1:1 (vol:vol) med fullstendig Freunds adjuvans (CFA) i et sluttvolum på 400 ni for den første immuniseringen, etterfulgt av en boosterdose med den samme immunogenmengden i ufullstendig Freunds adjuvans (IFA) for de senere fire dosene og med PBS for den siste dosen. Immuniseringer ble gitt intraperitonealt annen hver uke for de første tre dosene, deretter månedlig. Blodprøver ble tatt fire til sju dager etter hver immunisering, med start etter den andre dosen, for målingen av antistofftitere. Dyr ble gitt en lett og rolig død ca. én uke etter den siste dosen.

2. Ap- og APP-nivåer i hjernen

Etter ca. fire måneder med immunisering med de ulike Ap-peptidene eller APP-derivatet, ble hjerner fjernet fra dyr som hadde gjennomgått saltvannsperfusjon. Én hemisfære ble tilberedt for immunhistokjemisk analyse og den andre ble anvendt til kvantifiseringen av Ap- og APP-nivåer. For å måle konsentrasjonene av ulike former av beta-amyloidpeptid og amyloidforløperprotein, ble hemisfæren dissekert og homogenater av de hippocampale-, kortikale- og cerebellare regionene ble fremstilt i 5 M guanidin. Disse ble fortynnet og nivået av amyloid eller APP ble kvantifisert ved sammenligning med en standardfortynningsserie av Ap-peptid eller APP med kjente konsentrasjoner i et ELISA-format.

Mediankonsentrasjonen av totalt Ap for kontrollgruppen immunisert med PBS var 5,8-fold høyere i hippocampus enn i korteksen (median på 24.318 ng/g hippocampalt vev sammenlignet med 4.221 ng/g for korteksen). Mediannivået i cerebellum til kontrollgruppen (23,4 ng/g vev) var ca. 1.000-fold lavere enn i hippocampus. Disse nivåene ligner på de som vi har rapportert tidligere for heterozygote PDAPP-transgene mus på denne alderen (Johnson-Woods et al., 1997, supra).

For korteksen hadde en undergruppe av behandlingsgrupper mediannivåer for totalt Ap og Api-42 som skilte seg signifikant fra kontrollgruppen (p < 0,05), der dyrene mottok AN1792, gnager Api -42 ellerApi-5 peptidkonjugatet som vist i Figur 11. Mediannivåene av totalt Ap ble redusert med henholdsvis 75 %, 79 % og 61 %, sammenlignet med kontrollen for disse behandlingsgruppene. Det var ingen merkbare korrelasjoner mellom Ap-spesifikke antistofftitere og Ap-nivåer i den kortikale regionen til hjernen for noen av gruppene.

I hippocampus var ikke den mediane reduksjonen av totalt Ap assosiert med AN1792-behandling (46 %, p = 0,0543) så stor som den observert i korteksen (75 %, p = 0,0021). Imidlertid var vektreduksjonen mye større i hippocampus enn i korteksen, en netto reduksjon på 11.186 ng/g vev i hippocampus versus 3.171 ng/g vev i korteksen. For grupper med dyr som mottok gnager Api-42 eller Api-5, ble mediannivåene av totalt Ap redusert med henholdsvis 36 % og 26 %. Imidlertid, pga. de små gruppestørrelsene og den høye variabiliteten av amyloidpeptidnivåene fra dyr til dyr innenfor begge gruppene, var ikke disse reduksjonene signifikante. Når nivåene av Api-42 ble målt i hippocampus, var ingen av de behandlingsinduserte reduksjonene signifikante. Derfor, pga. den mindre mengden av Ap i korteksen, er forandringer i denne regionen en mer sensitiv indikator på behandlingseffekter. Forandringene i Ap-nivåer målt med ELISA i korteksen ligner, men er ikke identisk med, resultatene fra den immunhistokjemiske analysen (se nedenfor).

Totalt Ap ble også målt i cerebellum, en region som vanligvis er minimalt affisert med AD-patologi. Ingen av Ap-mediankonsentrasjonene til noen av gruppene immunisert med de ulike Ap-peptidene eller APP-derivatet skilte seg fra kontrollgruppen i denne hjerneregionen. Dette resultatet indikerer at ikke-patologiske nivåer av Ap er uaffisert med behandling.

APP-konsentrasjon ble også bestemt med ELISA i korteksen og cerebellum fra behandlede mus og kontrollmus. To ulike APP-tester ble anvendt. Den første, kalt APP-a/FL, gjenkjenner både APP-alfa (a, den sekrerte formen av APP som har blitt kuttet i Ap-sekvensen) og fullengde former (FL) av APP, mens den andre bare gjenkjenner APP-a. I motsetning til den behandlingsassosierte minkingen av Ap i en undergruppe av behandlingsgrupper, var APP-nivåene uforandret i alle de behandlede dyrene sammenlignet med kontrolldyrene. Disse resultatene indikerer at immuniseringene med Ap-peptider ikke fjerner APP; i stedet er behandlingseffekten spesifikk for Ap.

Kort fortalt ble totalt Ap og Ap 1-42 nivåer redusert signifikant i korteksen ved behandling med AN1792, gnager Api-42 eller Api-5 konjugat. I hippocampus ble totalt Ap bare redusert signifikant med AN1792-behandling. Ingen andre behandlingsassosierte forandringer i Ap eller APP-nivåer i de hippocampale, kortikale eller cerebellare regionene var signifikante.

2. Histokjemiske analyser

Hjerner fra en undergruppe på seks grupper ble fremstilt for immunhistokjemisk analyse: tre grupper immunisert med Ap-peptidkonjugatene Api-5, Api-12 og Api3-28; to grupper immunisert med fullengde Ap-aggregatene AN 1792 og AN 1528 og den PBS-behandlede kontrollgruppen. Resultatene fra bildeanalyser av amyloidmengden i hjernesnitt fra disse gruppene er vist i Figur 12. Det var signifikante reduksjoner av amyloidmengde i de kortikale regionene til tre av behandlingsgruppene versus kontrolldyr. Den største reduksjonen av amyloidmengde ble observert i gruppen som mottok AN1792, der gjennomsnittsverdien ble redusert med 97 % (p = 0,001). Signifikante reduksjoner ble også observert for dyrene som var behandlet med AN1528 (95 %, p = 0,005) og Ap1-5 peptidkonjugatet (67 %, p = 0,02).

Resultatene fremskaffet med kvantifisering av totalt Ap eller Api-42 med ELISA og amyloidmengde med bildeanalyse er til en viss grad forskjellige. Behandling med AN1528 hadde en signifikant effekt på nivået av kortikal amyloidmengde når den ble målt med kvantitativ bildeanalyse, men ikke på konsentrasjonen av totalt Ap i den samme regionen når den ble målt med ELISA. Forskjellen mellom disse to resultatene skyldes trolig spesifisitetene til testene. Bildeanalyse måler bare uløselig Ap aggregert inn i plakk. I motsetning måler ELISA alle former av Ap, både løselig og uløselig, monomer og aggregert. Siden sykdomspatologien er antatt å være assosiert med den uløselige, plakkassosierte formen av Ap, kan bildeanalyseteknikken være mer sensitiv for å avsløre behandlingseffekter. Imidlertid, siden ELISA er en raskere og enklere test, er den veldig egnet for screeningsformål.

I tillegg kan den detektere at den behandlingsassosierte reduksjonen av Ap er større for plakkassosiert enn totalt Ap.

For å bestemme om de Ap-spesifikke antistoffene produsert som følge av immunisering i de behandlede dyrene reagerte med amyloide avleiringer i hjernen, ble en undergruppe av snittene fra de behandlede dyrene og kontrollmusene reagert med et antistoff spesifikt for mus IgG. I motsetning til PBS-gruppen, ble Ap-inneholdende plakk dekket med endogent IgG for dyr immunisert med Ap-peptidkonjugatene Api-5, Api-12 og AP13-28; og fullengde Ap-aggregatene AN1792 og AN1528. Hjerner fra dyr immunisert med de andre Ap-peptidene eller APP-peptidet pBx6 ble ikke analysert med denne testen.

3. Måling av antistofftitere

Mus ble tatt blodprøver av fire til sju dager etter hver immunisering, med start etter den andre immuniseringen, for totalt fem blodprøver. Antistofftitere ble målt som Api-42-bindende antistoff ved å anvende en sandwich-ELISA med multibrønners plastplater belagt med Api-42. Som vist i Figur 13, ble maksimale antistofftitere produsert som følge av den fjerde dosen for de fire immunogene formuleringene som førte til de høyeste titerne av AN1792-spesifikke antistoffer: AN 1792 (maksimal GMT: 94.647), AN1528 (maksimal GMT: 88.231), Ap1-12 konjugat (maksimal GMT: 47.216) og gnager Api -42 (maksimal GMT: 10.766). Titere for disse gruppene avtok noe etter den femte og sjette dosen. For de gjenværende fem immunogenene ble maksimale titere nådd etter den femte eller den sjette dosen, og disse var mye lavere enn de i de fire høyeste titergruppene: Api-5 konjugat (maksimal GMT: 2.356), pBx6 (maksimal GMT: 1.986), Ap 13-28 konjugat (maksimal GMT: 1.183), Ap33-42 konjugat (maksimal GMT: 658) og Ap25-35 (maksimal GMT: 125). Antistofftitere ble også målt mot de homologe peptidene ved å anvende det samme ELISA-sandwichformatet for en undergruppe av immunogener, de gruppene som var immunisert med Ap1-5, Ap 13-28, AP25-35, Ap33-42 eller gnager Api-42. Disse titerne var omtrent de samme som de målt mot Api-42, bortsett fra gnager Api-42 immunogenet der antistofftitere mot det homologe immunogenet var ca. to-fold høyere. Størrelsen på den AN1792-spesifikke antistofftiteren til individuelle dyr eller gjennomsnittsverdiene til behandlingsgrupper korrelerte ikke med effektiviteten målt som reduksjonen av Ap i korteksen.

4. Lymfoproliterative responser

Ap-avhengig lymfoproliferasjon ble målt ved å anvende miltceller høstet ca. én uke

etter den siste, sjette, immuniseringen. Nyhøstede celler, 105 per brønn, ble dyrket i 5 dager i nærvær av Api-40 ved en konsentrasjon på 5 nM for stimulering. Celler fra en undergruppe av sju av de ti gruppene ble også dyrket i nærvær av det reverserte peptidet, Ap40-1. Som en positiv kontroll ble ekstra celler dyrket med T-cellemitogenet, PHA, og som en negativ kontroll ble celler dyrket uten tilsatt peptid.

Lymfocytter fra et flertall av dyrene prolifererte i respons til PHA. Det var ingen signifikante responser til det Ap40-1 reverserte peptidet. Celler fra dyr immunisert med de større aggregerte Ap-peptidene, AN1792, gnager Api-42 og AN 1528 prolifererte kraftig når de ble stimulert med Api-40, med høyest cpm i mottakerne av AN1792. Ett dyr i hver av gruppene immunisert med Api-12 konjugat, AP13-28 konjugat og AP25-35 prolifererte i respons til Api-40. De gjenværende gruppene som mottok Api-5 konjugat, AP33-42 konjugat pBx6 eller PBS hadde ingen dyr med en Ap-stimulert respons. Disse resultatene er oppsummert i Tabell 5 nedenfor. Disse resultatene viser at AN 1792 og AN 1528 stimulerer sterke T-celleresponser, mest sannsynlig med CD4+ fenotypen. Fraværet av en Ap-spesifikk T-cellerespons i dyr immunisert med Api-5 er ikke overraskende, siden peptidepitoper gjenkjent av CD4+ T-celler vanligvis er ca. 15 aminosyrer lange, selv om kortere peptider enkelte ganger kan fungere med mindre effektivitet. Derfor ligger sannsynligvis majoriteten av hjelper T-celleepitoper for de fire konjugatpeptidene i IgG-konjugatpartneren, ikke i Ap-regionen. Denne hypotesen er støttet av den veldig lave hyppigheten av proliferative responser for dyr i hver av disse behandlingsgruppene. Siden Api-5 konjugatet var effektivt til å redusere Ap-nivået i hjernen signifikant, med åpenbart fravær av Ap-spesifikke T-celler, ser hovedeffektorimmunresponsen indusert med immunisering med dette peptidet ut til å være antistoff.

Mangel på T-celle og lav antistoffrespons fra fusjonspeptid pBx6, som omfatter APP-aminosyrene 592-695 inkludert alle Ap-restene, kan skyldes den dårlige immunogeniteten til denne spesielle fremstillingen. Den dårlige immunogeniteten til AP25-35 aggregatet skyldes trolig at peptidet er for lite til å inneholde en god T-celleepitope for å bidra til med induksjon av en antistoffrespons. Hvis dette peptidet var konjugert til et bærerprotein, ville det sannsynligvis være mer immunogent.

V. Fremstilling av polyklonale antistoffer for passiv beskyttelse

125 ikke-transgene mus ble immunisert med 100 ng Api-42 pluss CFA/IFA adjuvans og gitt en lett og rolig død etter 4-5 måneder. Blod ble tappet fra immuniserte mus. IgG ble separert fra andre blodkomponenter. Antistoff spesifikt for immunogenet kan

bli delvis renset med affinitetskromatografi. Et gjennomsnitt på ca. 0,5-1 mg av immunogenspesifikt antistoff blir fremskaffet per mus, som gir totalt 60-120 mg.

VI. Passiv immunisering med antistoffer til Ap

Grupper med 7-9 måneder gamle PDAPP-mus ble hver injisert med 0,5 mg i PBS av polyklonalt anti-Ap eller spesifikke anti-Ap monoklonale antistoffer, som vist nedenfor. Alle antistoffremstillinger ble renset for å ha lave endotoksinnivåer. Monoklonale antistoffer kan bli fremstilt mot et fragment ved å injisere fragmentet eller lenger form av Ap inn i en mus, fremstille hybridomer og screene hybridomene for et antistoff som binder spesifikt til et ønsket Ap-fragment uten å binde til andre ikke-overlappende Ap-fragmenter.

Mus ble injisert i.p. etter behov over en 4 måneders periode for å opprettholde en sirkulerende antistoffkonsentrasjon målt med ELISA-titer på mer enn 1/1000, som er definert med ELISA til Ap42 eller annet immunogen. Titere ble monitorer! som ovenfor og musene ble gitt en lett og rolig død etter 6 måneder med injeksjoner. Histokjemi, Ap-nivåer og toksikologi ble utført post mortem. Ti mus ble anvendt per gruppe. Ytterligere studier av passiv immunisering er beskrevet i Eksempel XI og XII nedenfor.

VII. Sammenligning av ulike adjuvantia

Dette eksempelet sammenligner CFA, alun, en olje-i-vann emulsjon og MPL for

evnen til å stimulere en immunrespons.

A. Materialer og fremgangsmåter

1. Studiedesign

Ett hundre seks uker gamle Hartley-stamme hunnmarsvin, fremskaffet fra Eim Hill, ble sortert inn i ti grupper for å bli immunisert med AN 1792 eller et palmitoylert derivat derav kombinert med ulike adjuvantia. Sju grupper mottok injeksjoner av AN 1792 (33 ng med mindre noe annet er spesifisert) kombinert med a) PBS, b) Freunds adjuvans, c) MPL, d) squalen, e) MPL/squalen f) lav dose alun eller g) høy dose alun (300 ng AN 1792). To grupper mottok injeksjoner med et palmitoylert derivat av AN 1792 (33 ng) kombinert med a) PBS eller b) squalen. En siste, tiende gruppe mottok PBS alene uten antigen eller ekstra adjuvans. For gruppen som mottok Freunds adjuvans, ble den første dosen emulgert med CFA og de gjenværende fire dosene med IFA. Antigen ble administrert ved en dose på 33 ng for alle gruppene unntatt gruppen med høy alundose, som mottok 300 ng av AN 1792. Injeksjoner ble administrert intraperitonealt for CFA/IFA og intramuskulær! i quadriceps i bakbeinet vekselvis på den høyre og venstre siden for alle andre grupper. De første tre dosene ble gitt annen hver uke, etterfulgt av to doser med et månedlig intervall. Blodprøver ble tatt seks til sju dager etter hver immunisering, med start etter den andre dosen, for måling av antistofftitere.

2. Fremstilling av immunogener

To mg A042 (California Peptide, Lot ME0339) ble satt til 0,9 ml avionisert vann, og blandingen ble vortekset for å generere en relativt ensartet suspensjon. En 100 ni delmengde av 10 x PBS (1 x PBS, 0,15 M NaCI, 0,01 M natriumfosfat, pH 7,5) ble tilsatt. Suspensjonen ble vortekset igjen og inkubert natten over ved 37 °C for anvendelse neste dag. Ubrukt Api-42 ble lagret med fuktighetsfjernende middel som et frysetørket pulver ved -20 °C.

Et palmitoylert derivat av AN1792 ble fremstilt ved å binde palmitinanhydrid, oppløst i dimetylformamid, til den aminoterminale resten i AN1792 før fjerning av det voksende peptidet fra resinet ved behandling med hydrofluorinsyre.

For å fremstille formuleringsdoser med fullstendig Freunds adjuvans (CFA) (gruppe 2), ble 33 ng AN1792 i 200 ni PBS emulgert 1:1 (vol:vol) med CFA i et sluttvolum på 400 ni for den første immuniseringen. For senere immuniseringer ble antigenet lignende emulgert med ufullstendig Freunds adjuvans (IFA).

For å fremstille formuleringsdoser med MPL for gruppe 5 og 8, ble frysetørket pulver (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) satt til 0,2 % vandig trietylamin til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml og vortekset. Blandingen ble oppvarmet til 65-70 °C i 30 sekunder for å lage en tynn, ugjennomsiktig, ensartet suspensjon av miceller. Løsningen ble nyfremstilt for hvert sett med injeksjoner. For hver injeksjon i gruppe 5 ble 33 ng AN 1792 i 16,5 ni PBS, 50 ng MPL (50 nO og 162 ni PBS blandet i et borosilikatrør umiddelbart før anvendelse.

For å fremstille formuleringsdoser med den lave olje-i-vann emulsjonen, ble AN 1792

i PBS satt til 5 % squalen, 0,5 % Tween 80, 0,5 % Span 85 i PBS for å oppnå en endelig enkeltdosekonsentrasjon på 33 ng AN 1792 i 250 n' (gruppe 6). Blandingen ble emulgert ved å passere gjennom en to-kamret, håndholdt anordning 15 til 20 ganger til emulsjonsdråpene, ved hjelp av et mikroskop, så ut til å ha omtrent samme diameter som en standard latekskule med diameter på 1,0 nm. Den resulterende suspensjonen var opalescent, melkehvit. Emulsjonene ble nyfremstilt for hver serie med injeksjoner. For gruppe 8 ble MPL i 0,2 % trietylamin tilsatt ved en konsentrasjon på 50 ng per dose til squalen og detergentblandingen for emulgering som nevnt ovenfor. For palmitoylderivatet (gruppe 7) ble 33 ng per dose av palmitoyl-NH-Api-42 satt til squalen og vortekset. Tween 80 og Span 85 ble deretter tilsatt med vorteksing. Denne blandingen ble satt til PBS for å oppnå endelige konsentrasjoner på 5 % squalen, 0,5 % Tween 80, 0,5 % Span 85 og blandingen ble emulgert som nevnt ovenfor.

For å fremstille formuleringsdoser med alun (gruppe 9 og 10) ble AN 1792 i PBS satt til Alhydrogel (aluminiumhydroksidgel, Accurate, Westbury, NY) for å oppnå konsentrasjoner på 33 ng (lav dose, gruppe 9) eller 300 ng (høy dose, gruppe 10) AN1792 per 5 mg alun i et endelig dosevolum på 250 ni. Suspensjonen ble forsiktig blandet i 4 timer ved romtemperatur.

3. Måling av antistofftitere

Marsvin ble tatt blodprøver av seks til sju dager etter immunisering, med start etter den andre immuniseringen, for totalt fire blodprøver. Antistofftitere mot Ap42 ble målt med ELISA som beskrevet i "Generelle materialer og fremgangsmåter".

4. Vevspreparering

Etter ca. 14 uker ble alle marsvin gitt en lett og rolig død ved administrering av CO2. Cerebrospinal væske ble høstet, hjernene ble fjernet og tre hjerneregioner (hippocampus, korteks og cerebellum) ble dissekert og anvendt for å måle konsentrasjonen av totalt Ap-protein ved å anvende ELISA.

B. Resultater

1. Antistoffresponser

Det var et bredt spekter i styrken av de ulike adjuvantiaene når man målte antistoffresponsen til AN 1792 etter immunisering. Som vist i Figur 14, når AN 1792 ble administrert i PBS, ble ikke noe antistoff detektert etter to eller tre immuniseringer, og neglisjerbare responser ble detektert etter den fjerde og femte dosen med geometrisk gjennomsnittlige titere (GMT'er) på bare ca. 45. Olje-i-vann emulsjonen induserte beskjedne titere etter den tredje dosen (GMT 255), som ble opprettholdt etter den fjerde dosen (GMT 301) og falt med den siste dosen (GMT 54). Det var en klar antigendoserespons for AN 1792 bundet til alun, der 300 ng var mer immunogen på alle tidspunkter enn 33 ng. Ved maksimal antistoffrespons, etter den fjerde immuniseringen, var forskjellen mellom de to dosene 43 % med GMT'er på ca. 1940 (33 ng) og 3400 (300 ng)- Antistoffresponsen til 33 ng AN 1792 pluss MPL var veldig lik den som ble generert med nesten en ti-fold høyere antigendose (300ng) bundet til alun. Tilsetningen av MPL til en olje-i-vann emulsjon reduserte effekten av formuleringene i forhold til den med MPL som det eneste adjuvanset med så mye som 75 %. Et palmitoylert derivat av AN 1792 var fullstendig ikke-immunogent når det ble administrert i PBS, og fremskaffet beskjedne titere når det ble presentert i en olje-i-vann emulsjon med GMT'er på 340 og 105 for den tredje og fjerde blodprøven. De høyeste antistofftiterne ble generert med Freunds adjuvans med en maksimal GMT på ca. 87.000, en verdi nesten 30-fold høyere enn GMPene

til de to nestbeste potente formuleringene, MPL og høy dose AN1792/alun.

De mest lovende adjuvantiaene identifisert i denne studien er MPL og alun. Av disse to er MPL foretrukket, fordi en 10-fold lavere antigendose var nødvendig for å generere den samme antistoffresponsen som ble oppnådd med alun. Responsen kan bli økt ved å øke dosen av antigen og/eller adjuvans og ved å optimalisere immuniseringsskjemaet. Olje-i-vann emulsjonen var et veldig svakt adjuvans for AN1792 og tilsetning av en olje-i-vann emulsjon til MPL-adjuvans reduserte den reelle adjuvansaktiviteten til MPL alene.

2. Ap-nivåer i hjernen

Etter ca. 14 uker ble marsvinene kraftig anestesert, cerebrospinalvæsken (CSF) ble høstet og hjerner ble fjernet fra dyr i en undergruppe av gruppene, de immunisert med Freunds adjuvans (gruppe 2), MPL (gruppe 5), alun med en høy dose, 300 ng, av AN1792 (gruppe 10) og den PBS-immuniserte kontrollgruppen (gruppe 3). For å måle nivået av Ap-peptid ble én hemisfære dissekert og homogenater av de hippocampale-, kortikale- og cerebellare regionene ble fremstilt i 5 M guanidin. Disse ble fortynnet og kvantifisert ved sammenligning med en standardfortynningsserie av Ap-protein med kjente konsentrasjoner i et ELISA-format. Nivåene av Ap-protein i hippocampus, korteksen og cerebellum var veldig like for alle fire gruppene, til tross for det brede spekteret av antistoffresponser til Ap utløst av disse formuleringene. Gjennomsnittlige Ap-nivåer på ca. 25 ng/g vev ble målt i hippocampus, 21 ng/g i korteks og 12 ng/g i cerebellum. Derfor forandret ikke nærvær av en høy sirkulerende antistofftiter til Ap i nesten tre måneder i noen av disse dyrene de totale Ap-nivåene i hjernene deres. Nivåene av Ap i CSF var også ganske like mellom gruppene. Mangelen på stor effekt av AN1792-immunisering på endogent Ap indikerer at immunresponsen er fokusert på patologiske dannelser av Ap.

VIII. Immunrespons til ulike adjuvantia i mus

Seks uker gamle sveitsiske Webster-hunnmus ble anvendt i denne studien med 10-13 dyr per gruppe. Immuniseringer ble gitt på dagene 0, 14, 28, 60, 90 og 20 administrert subkutant i et dosevolum på 200 ni. PBS ble anvendt som bufferen for alle formuleringer. Dyr ble tatt blodprøve av sju dager etter hver immunisering, med start etter den andre dosen, for analyse av antistofftitere med ELISA. Behandlingskuren til hver gruppe er oppsummert i Tabell 7.

ELISA-titerne til antistoffer mot Ap42 i hver gruppe er vist i Tabell 8 nedenfor.

Tabellen viser at de høyeste titerne ble fremskaffet for gruppe 4, 5 og 18, der adjuvantiaene var 125 ng MPL, 50 ng MPL og QS-21 pluss MPL.

IX. Terapeutisk effekt av ulike adjuvantia

En studie av terapeutisk effekt ble utført i PDAPP-transgene mus med et sett med adjuvantia egnet for anvendelse i mennesker for å bestemme deres evne til å forsterke immunresponser til Ap og til å indusere den immunmedierte fjerningen av amyloide avleiringer i hjernen.

Ett hundre og åtti heterozygote PDAPP-transgene hann- og hunnmus som var 7,5 til 8,5 måneder gamle ble fremskaffet fra Charles River Laboratories. Musene ble sortert inn i ni grupper inneholdende 15 til 23 dyr per gruppe som skulle bli immunisert med AN1792 eller AN1528 kombinert med ulike adjuvantia. Dyr ble fordelt for å matche kjønn, alder og opphav av dyrene innenfor gruppene så godt som mulig. Adjuvantiaene inkluderte alun, MPL og QS-21, hvert kombinert med begge antigenene, og Freunds adjuvans (FA) bare kombinert med AN1792. En ekstra gruppe ble immunisert med AN 1792 formulert i PBS-buffer pluss konserveringsmiddelet thimerosal uten adjuvans. En niende gruppe ble immunisert med PBS alene som en negativ kontroll.

Fremstilling av aggregerte Ap-peptider: humane Api-40 (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; Lot ME0541) og humane Ap1-42 (AN1792; California Peptides Inc., Lot ME0439) peptider ble nyoppløst for fremstillingen av hvert sett med injeksjoner fra frysetørkede pulvere som hadde blitt lagret tørket ved -20 °C. For dette formålet ble 2 mg peptid satt til 0,9 ml avionisert vann, og blandingen ble vortekset for å generere en relativt ensartet løsning eller suspensjon. AN 1528 var oppløselig på dette trinnet i motsetning til AN 1792. En 100 ni delmengde av 10 x PBS (1 x PBS: 0,15 M NaCI, 0,01 M natriumfosfat, pH 7,5) ble deretter tilsatt, og på dette punktet begynte AN 1528 å presipitere. Suspensjonene ble vortekset igjen og inkubert natten over ved 37 °C for anvendelse neste dag.

For å fremstille formuleringsdoser med alun (gruppe 1 og 5), ble Ap-peptid i PBS satt til Alhydrogel (2 % vandig aluminiumhydroksidgel, Sargeant, Inc., Clifton, NJ) for å oppnå konsentrasjoner på 100 ng Ap-peptid per 1 mg alun. 10 x PBS ble satt til et endelig dosevolum på 200 ni i 1 x PBS. Suspensjonen ble deretter forsiktig blandet i ca. 4 timer ved romtemperatur før injeksjon.

For å fremstille formuleringsdoser med MPL (gruppe 2 og 6), ble frysetørket pulver (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lot 67039-E0896B) satt til 0,2 % vandig trietylamin til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml og vortekset. Blandingen ble oppvarmet til 65-70 °C i 30 sekunder for å lage en tynn, ugjennomsiktig, ensartet suspensjon av miceller. Løsningen ble lagret ved 4 °C. For hvert sett med injeksjoner ble 100 ng peptid per dose i 50 ni PBS, 50 ng MPL per dose (50ni) og 100 ni PBS per dose blandet i et borosilikatrør umiddelbart før anvendelse.

For å fremstille formuleringsdoser med QS-21 (gruppe 3 og 7), ble frysetørket pulver (Aquila, Framingham, MA; Lot A7018R) satt til PBS, pH 6,6-6,7, til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml og vortekset. Løsningen ble lagret ved -20 °C. For hvert sett med injeksjoner ble 100 ng peptid per dose i 50 n' PBS, 25 ng QS-21 per dose i 25 ni PBS og 125 n' PBS per dose blandet i et borosilikatrør umiddelbart før anvendelse.

For å fremstille formuleringsdoser med Freunds adjuvans (gruppe 4), ble 100 ng AN 1792 i 200 ni PBS emulgert 1:1 (vol:vol) med fullstendig Freunds adjuvans (CFA) i et sluttvolum på 400 n' for den første immuniseringen. For senere immuniseringer ble antigenet lignende emulgert med ufullstendig Freunds adjuvans (IFA). For formuleringene inneholdende adjuvantiaene alun, MPL eller QS-21, ble 100 ng per dose av AN1792 eller AN1528 kombinert med alun (1 mg per dose), eller MPL (50 ng per dose) eller QS-21 (25 ng per dose) i et sluttvolum på 200 n' PBS og levert med subkutan inokulering på ryggen mellom skulderbladene. For gruppen som mottok FA, ble 100 ng AN 1792 emulgert 1:1 (vol:vol) med fullstendig Freunds adjuvans (CFA) i et sluttvolum på 400 ni og levert intraperitonealt for den første immuniseringen, etterfulgt av en boosterdose med den samme immunogenmengden i ufullstendig Freunds adjuvans (IFA) for de senere fem dosene. For gruppen som mottok AN 1792 uten adjuvans, ble 10 ng AN 1792 kombinert med 5 ng thimerosal i et sluttvolum på 50 n' PBS og levert subkutant. Den niende kontrollgruppen mottok bare 200 n' PBS levert subkutant. Immuniseringer ble gitt annen hver uke for de første tre dosene og deretter månedlig på dagene 0, 16, 28, 56, 85 og 112. Blodprøver ble tatt seks til sju dager etter hver immunisering, med start etter den andre dosen, for målingen av antistofftitere. Dyr ble gitt en lett og rolig død ca. én uke etter den siste dosen. Resultater ble målt med ELISA-test av Ap- og APP-nivåer i hjerne og med immunhistokjemisk evaluering av nærværet av amyloide plakk i hjernesnitt. I tillegg ble Ap-spesifikke antistofftitere og Ap-avhengige proliferative responser og cytokinresponser bestemt.

Tabell 9 viser at de høyeste antistofftiterne til Api-42 ble produsert med FA og AN1792, der titere var størst etter den fjerde immuniseringen (maksimal GMT: 75.386) og deretter avtok med 59 % etter den siste, sjette, immuniseringen. Den maksimale gjennomsnittstiteren produsert av MPL med AN 1792 var 62 % lavere enn den som ble generert med FA (maksimal GMT: 28.867) og ble også oppnådd tidlig i immuniseringsskjemaet, etter 3 doser, etterfulgt av en reduksjon til 28 % av maksimumverdien etter den sjette immuniseringen. Den maksimale gjennomsnittstiteren generert med QS-21 kombinert med AN1792 (GMT:1.511) var ca. 5-fold lavere enn den oppnådd med MPL. I tillegg var responskinetikkene saktere, siden en ekstra immunisering var nødvendig for å oppnå den maksimale responsen. Titere generert av alunbundet AN1792 var marginalt større enn de fremskaffet med QS21, og responskinetikkene var raskere. For AN 1792 levert i PBS med thimerosal var frekvensen og størrelsen på titere såvidt større enn for PBS alene. De maksimale titerne generert med MPL og AN 1528 (maksimal GMT 3099) var ca. 9-fold lavere enn de med AN 1792. Alunbundet AN1528 var veldig lite immunogen med lave titere bare generert i noen av dyrene. Ingen antistoffresponser ble observert i kontrolldyrene immunisert med PBS alene.

Resultatene av AN 1792- eller AN 1528-behandling med ulike adjuvantia eller thimerosal på kortikal amyloidmengde i 12 måneder gamle mus bestemt med ELISA er vist i Figur 15. I PBS-kontroll PDAPP-mus var mediannivået av totalt Ap i korteksen etter 12 måneder 1.817 ng/g. Spesielt reduserte nivåer av Ap ble observert i mus behandlet med AN1792 pluss CFA/I FA, AN1792 pluss alun, AN1792 pluss MPL og QS-21 pluss AN1792. Reduksjonen var bare statistisk signifikant (p < 0,05) for AN1792 pluss C FA/I FA. Imidlertid, som vist i Eksempel I og III, blir effektene av immunisering for å redusere Ap-nivåer vesentlig større i 15 og 18 måneder gamle mus. Det er derfor forventet at i hvert fall blandingene av AN1792 pluss alun, AN1792 pluss MPL og AN1792 pluss QS-21 vil være statistisk signifikante i behandling av eldre mus. Derimot viste AN 1792 pluss konserveringsmiddelet thimerosal et Ap-mediannivå som var omtrent likt det i PBS-behandlede mus. Lignende resultater ble oppnådd når kortikale nivåer av Ap42 ble sammenlignet. Mediannivået av Ap42 i PBS-kontroller var 1624 ng/g. Spesielt reduserte mediannivåer på 403, 1149, 620 og 714 ble observert i musene behandlet med henholdsvis AN1792 pluss CFA/I FA, AN1792 pluss alun, AN1792 pluss MPL og AN1792 pluss QS-21, der reduksjonen var statistisk signifikant (p=0,05) for AN1792 CFA/IFA behandlingsgruppen. Mediannivået i musene behandlet med AN1792 thimerosal var 1619 ng/g Ap42.

En ytterligere terapeutisk adjuvans/immunogen-effektstudie ble utført i heterozygote PDAPP-transgene hann- og hunnmus som var 9-10,5 måneder gamle. Studien varte i 25 uker med 29-40 dyr per behandlingsgruppe; derfor var dyrene 15-16,5 måneder gamle ved terminering. Behandlingsgruppene er identifisert i Tabell 10 nedenfor.

Tabell 10- forkortelser: MAP - multiantigent peptid; TT - tetanustoksoid T-celleepitope (830-844); SC - subkutan; IP - intraperitonealt; PBS - fosfatbufret saltvann; ISA-51 - er et kommersielt tilgjengelig adjuvans som ligner på IFA; GCS - er en glysin/sitrat/sukrose-formulering, MPL-SE er MPL i en stabilisert vann og olje emulsjon.

Immuniseringsskjemaet var identisk for alle behandlingsgruppene bortsett fra gruppe 3, den QS21/AN1792-forkortede skjemagruppen. Musene ble injisert på ukene 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 og 24, med blodprøver på ukene 3, 5, 9, 13, 17, 21 og 25. Gruppe 1 og 2 mottok åtte injeksjoner og gruppe 3 mottok fire injeksjoner i løpet av 25 ukers perioden av studien. Gruppe 4, den QS21/AN1792-forkortede gruppen, mottok injeksjoner bare på ukene 0, 2, 4 og 8. Denne gruppen ble ikke injisert i resten av studien, selv om musene ble tatt blodprøver av etter det samme skjemaet som resten av studien for å følge titernedgang. Gruppe 3 og 5, henholdsvis QS21/AN1792 og PBS, fungerte som de positive og negative kontrollene for denne studien.

Titerne ble bestemt med anti-Ap antistofftitertesten.

Gruppe 1, MPL-SE/AN1792 gruppen, fremskaffet en maksimal geometrisk gjennomsnittlig titer (GMT) på 17.100 etter 9 uker, som avtok til en GMT på 10.000 etter 25 uker. I begynnelsen steg MPL-SE titerne med en noe høyere hastighet enn QS21/AN1792 kontrollgruppen (gruppe 4).

Gruppe 2, ISA 51/AN1792 gruppen, produserte høye titere i løpet av hele studien og oppnådde en GMT på over 100.000 for de siste 9 ukene av studien.

Gruppe 3, QS21/AN1792 kontrollgruppen, oppnådde dens maksimale titer etter 17 uker med en GMT på 16.000. Titeren falt deretter over de neste 8 ukene til en GMT på 8.700. Ett dyr i denne gruppen klarte ikke å oppnå en titer i løpet av hele forsøket.

Gruppe 4, den QS21/AN1792-forkortede injeksjonsskjemagruppen, oppnådde en maksimal titer på 7.300 etter 13 uker, fem uker etter dens siste injeksjon. Titeren falt deretter til en GMT på 2.100 i den siste blodprøven (25 uker). Som i kontrollgruppen, klarte ett dyr ikke å oppnå en detekterbar titer, mens et annet dyr tapte all titer på slutten av tilbakegangsperioden.

Gruppe 5, gruppen med PBS alene, hadde ingen titere.

For å evaluere de kortikale Ap-nivåene, ble totalt Ap og Ap 1-42 målt med ELISA. Kort fortalt ble én hjernehemisfære dissekert for kortikalt-, hippocampalt- og cerebellart vev, etterfulgt av homogenisering i 5 M guanidinbuffer og undersøkt for hjerne-Ap. Resultatene for kortikal totalt Ap og Ap42 er like. En Mann-Whitney statistisk analyse ble utført for å bestemme signifikans mellom gruppene, der en p-verdi på 0,05 indikerer en signifikant forandring i Ap.

Alle behandlingsgruppene senket totale Ap-nivåer signifikant sammenlignet med PBS-kontrollgruppen (se Tabell 11). MPL-SE/AN1792 gruppen hadde den største forandringen i Ap, og den er signifikant bedre enn de andre behandlingsgruppene. Den QS21/AN 1792-forkortede gruppen var lignende i dens totale forandring av Ap i forhold til QS21-kontrollgruppen som mottok alle åtte injeksjonene. Ap-nivåene i ISA 51/AN 1792 gruppen var lignende redusert sammenlignet med CFA/IFA:MAP (Api-7) gruppen.

Som konklusjon er MPL-SE-, ISA-51- og QS21-adjuvantia kombinert med AN 1792 effektive til å indusere en tilstrekkelig immunrespons som signifikant forsinker Ap-avleiring i korteksen.

X. Toksisitetsanalyse

Vev ble høstet for histopatologisk undersøkelse på slutten av studier beskrevet i Eksemplene 2, 3 og 7. I tillegg ble hematologi og klinisk kjemi utført på sluttblodprøver fra Eksemplene 3 og 7. De fleste av hovedorganene ble evaluert, innbefattende hjerne, lunge, lymfe, mage/tarm, lever, nyre, binyre og gonader. Selv om sporadiske lesjoner ble observert i studiedyrene, var det ingen åpenbare forskjeller, verken i affiserte vev eller lesjonsgraden, mellom AN1792-behandlede og ubehandlede dyr. Det ble ikke registrert unike histopatologiske lesjoner i AN 1528-immuniserte dyr sammenlignet med PBS-behandlede eller ubehandlede dyr. Det var heller ingen forskjeller i den kliniske kjemiprofilen mellom adjuvansgrupper og de PBS-behandlede dyrene i Eksempel 7. Selv om det var signifikante økninger i flere av hematologiparametrene mellom dyr behandlet med AN 1792 og Freunds adjuvans i Eksempel 7 i forhold til PBS-behandlede dyr, er disse effektene forventet fra Freunds adjuvans-behandling og medfølgende peritonitt og indikerer ikke noen ugunstige effekter fra AN1792-behandling. Selv om det ikke var en del av den toksikologiske evalueringen, ble PDAPP-musehjernepatologi omfattende undersøkt som del av effektendepunktene. Ingen tegn på behandlingsrelatert ugunstig effekt på hjernemorfologi ble observert i noen av studiene. Disse resultatene indikerer at AN1792-behandling er godt tolerert og i hvert fall vesentlig fri for bivirkninger.

XI. Terapeutisk behandling med anti-Ap antistoffer

Dette eksemplet tester evnen ulike monoklonale og polyklonale antistoffer til Ap har til å inhibere akkumulering av Ap i hjernen til heterozygote, transgene mus.

1. Studiedesign

Seksti heterozygote PDAPP-transgene hann- og hunnmus, 8,5 til 10,5 måneder gamle, ble fremskaffet fra Charles River Laboratory. Musene ble sortert inn i seks grupper som skulle bli behandlet med ulike antistoffer rettet mot Ap. Dyrene ble fordelt for å matche kjønn, alder, opphav og kilde for dyrene innenfor gruppene så godt som mulig. Som vist i Tabell 10, inkluderte antistoffene fire murine Ap-spesifikke monoklonale antistoffer: 2H3 (rettet mot Ap-restene 1-12), 10D5 (rettet mot Ap-restene 1-16), 266 (rettet mot Ap-restene 13-28 og binder til monomert, men ikke til aggregert, AN1792) og 21F12 (rettet mot Ap-restene 33-42). En femte gruppe ble behandlet med en Ap-spesifikk polyklonal antistoffraksjon (fremskaffet ved immunisering med aggregert AN 1792). Den negative kontrollgruppen mottok fortynningsmidlet, PBS, alene uten antistoff.

De monoklonale antistoffene ble injisert ved en dose på ca. 10 mg/kg (antok at musene veide 50 g). Injeksjoner ble administrert intraperitonealt gjennomsnittlig hver sjuende dag for å opprettholde anti-Ap titere over 1000. Selv om lavere titere ble målt for mAb 266, fordi det ikke binder bra til aggregert AN 1792 anvendt som oppfangingsantigen i testen, ble det samme doseringsskjemaet opprettholdt for denne gruppen. Gruppen som mottok monoklonalt antistoff 2H3 ble avbrutt i løpet av de første tre ukene, siden antistoffet ble fjernet for raskt in vivo. Blodprøver ble tatt før hver dosering for måling av antistofftitere. Behandling varte over en seks måneders periode i totalt 196 dager. Dyrene ble gitt en lett og rolig død én uke etter den siste dosen.

2. Materialer og fremgangsmåter

a. Fremstilling av antistoffene

Det anti-Ap polyklonale antistoffet ble fremstilt fra blod høstet fra to grupper med dyr. Den første gruppen bestod av 100 sveitsiske Webster-hunnmus som var 6 til 8 uker gamle. De ble immunisert på dagene 0, 15 og 29 med 100 ng AN1792 kombinert med CFA/IFA. En fjerde injeksjon ble gitt på dag 36 med halve dosen av AN1792. Dyrene ble tappet for blod ved avliving på dag 42, serum ble fremstilt og seraene ble slått sammen for å gi totalt 64 ml. Den andre gruppen bestod av 24 hunnmus isogene med PDAPP-musene, men ikke-transgene for det humane APP-genet, som var 6 til 9 uker gamle. De ble immunisert på dagene 0, 14, 28 og 56 med 100 ng AN1792 kombinert med CFA/IFA. Disse dyrene ble også tappet for blod ved avliving på dag 63, serum ble fremstilt og slått sammen for å gi totalt 14 ml. De to serum-batchene ble slått sammen. Antistoffraksjonen ble renset ved å anvende to sekvensielle runder med presipitering med 50 % mettet ammoniumsulfat. Det siste presipitatet ble dialysert mot PBS og testet for endotoksin. Endotoksinnivået var mindre enn 1 EU/mg.

De anti-Ap monoklonale antistoffene ble fremstilt fra ascitesvæske. Først ble lipidene i væsken fjernet ved tilsetning av konsentrert natriumdekstransulfat til iskald ascitesvæske under omrøring på is for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,238 %. Konsentrert CaCb ble deretter tilsatt under omrøring for å oppnå en endelig konsentrasjon på 64 mM. Denne løsningen ble sentrifugert ved 10.000 x g, og pelleten ble kastet. Supernatanten ble rørt på is med et like stort volum av mettet ammoniumsulfat tilsatt dråpevis. Løsningen ble sentrifugert igjen ved 10.000 x g og supernatanten ble kastet. Pelleten ble resuspendert og dialysert mot 20 mM Tris-HCI, 0,4 M NaCI, pH 7,5. Denne fraksjonen ble overført til en Pharmacia FPLC Sefarose Q-kolonne og eluert med en revers gradient fra 0,4 M til 0,275 M NaCI i 20 mM Tris-HCI, pH 7,5.

Antistofftoppen ble identifisert med absorbans på 280 nm og egnede fraksjoner ble slått sammen. Den rensede antistoffremstillingen blekarakterisert vedå måle proteinkonsentrasjonen med BCA-fremgangsmåten og renheten ved å anvende SDS-PAGE. De sammenslåtte fraksjonene ble også testet for endotoksin. Endotoksinnivået var lavere enn 1 EU/mg titere og titere som var lavere enn 100 ble vilkårlig tilskrevet en titerverdi på 25.

3. Ap- og APP-nivåer i hjernen:

Etter ca. seks måneder med behandling med de ulike anti-Ap antistoffremstillingene, ble hjerner fjernet fra dyrene etter saltvannsperfusjon. Én hemisfære ble fremstilt for immunhistokjemisk analyse og den andre ble anvendt for kvantifiseringen av Ap- og APP-nivåer. For å måle konsentrasjonene av ulike former av beta-amyloidpeptid og amyloidforløperprotein (APP), ble hemisfæren dissekert og homogenater av de hippocampale-, kortikale- og cerebellare regionene ble fremstilt i 5 M guanidin. Disse ble seriefortynnet og nivået av amyloidpeptid eller APP ble kvantifisert ved sammenligning med en standardfortynningsserie av Ap-peptid eller APP med kjente konsentrasjoner i et ELISA-format.

Nivåene av totalt Ap og av Api-42 målt med ELISA i homogenater av korteksen og hippocampus og nivået av totalt Ap i cerebellum er henholdsvis vist i Tabell 11,12 og 13. Mediankonsentrasjonen av totalt Ap for kontrollgruppen, inokulert med PBS, var 3,6-fold høyere i hippocampus enn i korteksen (median på 63.389 ng/g hippocampalt vev sammenlignet med 17.818 ng/g for korteksen). Mediannivået i cerebellum til kontrollgruppen (30,6 ng/g vev) var mer enn 2.000-fold lavere enn i hippocampus. Disse nivåene ligner på de som vi tidligere har rapportert for heterozygote PDAPP-transgene mus på denne alderen (Johnson-Wood et al., 1997).

For korteksen hadde én behandlingsgruppe et Ap-mediannivå, målt som Api-42, som skilte seg signifikant fra kontrollgruppen (p < 0,05), der disse dyrene mottok det polyklonale anti-Ap antistoffet, som vist i Tabell 13. Mediannivået av Api-42 var redusert med 65 % sammenlignet med kontrollen for denne behandlingsgruppen. Mediannivåene av Api-42 var også signifikant redusert med 55 % sammenlignet med kontrollen i én ekstra behandlingsgruppe, der disse dyrene var dosert med mAb 10D5 (p = 0,0433). I hippocampus var ikke median prosentreduksjon av totalt Ap assosiert med behandling med polyklonalt anti-Ap antistoff (50 %, p = 0,0055) så stor som den observert i korteksen (65 %) (Tabell 14). Imidlertid var den absolutte størrelsen på reduksjonen nesten 3-fold større i hippocampus enn i korteksen, en netto reduksjon på 31.683 ng/g vev i hippocampus versus 11.658 ng/g vev i korteksen. Når den ble målt som nivået av den mer amyloidogene formen av Ap, Api-42, heller enn som totalt Ap, var reduksjonen med det polyklonale antistoffet signifikant (p = 0,0025). Mediannivåene i grupper behandlet med de mAb'ene 10D5 og 266 ble redusert med henholdsvis 33 % og 21 %. Total Ap ble også målt i cerebellum (Tabell 15). De gruppene som ble dosert med polyklonalt anti-Ap og 266-antistoffet hadde signifikante reduksjoner av nivåene av totalt Ap (henholdsvis 43 % og 46 %, p = 0,0033 og p = 0,0184), og gruppen som ble behandlet med 10D5 hadde en nesten signifikant reduksjon (29 %, p = 0,0675).

APP-konsentrasjon ble også bestemt med ELISA i korteks og cerebellum fra antistoffbehandlede mus og kontroll, PBS-behandlede mus. To ulike APP-tester ble anvendt. Den første, kalt APP-a/FL, gjenkjenner både APP-alfa (a, den sekrerte formen av APP som har blitt kuttet i Ap-sekvensen) og fullengde former (FL) av APP, mens den andre bare gjenkjenner APP-a. I motsetning til den behandlingsassosierte minkingen av Ap i en undergruppe av behandlingsgrupper, var APP-nivåene praktisk talt uforandrede i alle de behandlede dyrene sammenlignet med kontrolldyrene. Disse resultatene indikerer at immuniseringene med Ap-antistoffer fjerner Ap uten å fjerne APP.

For å oppsummere dette ble Ap-nivåer redusert signifikant i korteks, hippocampus og cerebellum i dyr behandlet med det polyklonale antistoffet fremskaffet mot AN1792. I en mindre grad viste også monoklonale antistoffer til den aminoterminale regionen i Ap 1-42, nærmere bestemt aminosyrene 1-16 og 13-28, signifikante behandlingseffekter.

4. Histokjemiske analyser:

Morfologien til Ap-immunreaktive plakk i undergrupper av hjerner fra mus i gruppene behandlet med PBS, polyklonalt Ap42, 21F12, 266 og 10D5 ble sammenlignet kvalitativt med tidligere studier der standard immuniseringsfremgangsmåter med Ap42 ble fulgt.

Den største forandringen i både omfanget og morfologi av amyloide plakk skjedde i dyrene immunisert med det polyklonale Ap42-antistoffet. Reduksjonen av

amyloidmengde, erodert plakkmorfologi og celleassosiert Ap-immunreaktivitet lignet mye på effekter produsert med den standard immuniseringsfremgangsmåten. Disse observasjonene støtter ELISA-resultater, der signifikante reduksjoner i både totalt Ap og Ap42 ble oppnådd ved administrering av det polyklonale Ap42-antistoffet.

I lignende kvalitative evalueringer var også amyloide plakk i 10D5-gruppen redusert i antall og omfang, med noen holdepunkter for celleassosiert Ap-immunreaktivitet. I forhold til kontrollbehandlede dyr reduserte den polyklonale Ig-fraksjonen mot Ap og ett av de monoklonale antistoffene (10D5) plakkmengde med henholdsvis 93 % og 81 % (p < 0,005). 21F12 viste seg å ha en relativt beskjeden effekt på plakkmengde. Mikrografer av hjerne etter behandling med pabApi-42viser diffuse avleiringer og fravær av mange av de større kompakte plakkene i den pabApi^2behandlede gruppen relativt til kontrollbehandlede dyr.

5. Måling av antistofftitere:

En undergruppe av tre tilfeldig valgte mus fra hver gruppe ble tatt blodprøve av rett før hver intraperitoneale inokulering, for totalt 30 blodprøver. Antistofftitere ble målt som Api-42-bindende antistoff ved å anvende en sandwich-ELISA med multibrønners plastplater belagt med Api-42, som beskrevet i detalj i "Generelle materialer og fremgangsmåter". Gjennomsnittstitere for hver blodprøve er vist i

Figurene 16-18 for henholdsvis det polyklonale antistoffet og de monoklonale antistoffene 10D5 og 21F12. Gjennomsnitt av titere var ca. 1000 i løpet av denne tidsperioden for den polyklonale antistoffremstillingen og var litt over dette nivået for de 10D5- og 21F12-behandlede dyrene.

6. Lymfoproliterative responser:

Ap-avhengig lymfoproliferasjon ble målt ved å anvende miltceller høstet åtte dager etter den endelige antistoffinfusjonen. Nyhøstede celler, 10<5>per brønn, ble dyrket i 5 dager i nærvær av Api-40 ved en konsentrasjon på 5 nM for stimulering. Som en positiv kontroll ble ekstra celler dyrket med T-cellemitogenet, PHA, og som en negativ kontroll ble celler dyrket uten tilsatt peptid.

Splenocytter fra gamle PDAPP-mus passivt immunisert med ulike anti-Ap antistoffer ble stimulert in vitro med AN1792, og proliferative responser og cytokinresponser ble målt. Formålet med disse testene var å bestemme om passiv immunisering lettet antigenpresentasjon og dermed priming av T-celleresponser spesifikke for AN 1792. Ingen AN1792-spesifikke proliferative responser eller cytokinresponser ble observert i mus passivt immunisert med anti-Ap antistoffene.

XII: Videre studie av passiv immunisering

I en annen studie ble behandling med 10D5 repetert, og to ekstra anti-Ap antistoffer ble testet, de monoklonale antistoffene 3D6 (AP1-5) og 16C11 (AP33-42). Kontrollgrupper mottok enten PBS eller et irrelevant isotypematchende antistoff (TM2a). Musene var eldre (11,5-12 måneder gamle heterozygoter) enn i den tidligere studien, men ellers var det eksperimentelle oppsettet det samme. Enda en gang, etter seks måneder med behandling, reduserte 10D5 plakkmengde med mer enn 80 % i forhold til enten PBS-kontroll eller isotypematchende antistoffkontroll (p = 0,003). Ett av de andre antistoffene mot Ap, 3D6, var like effektivt og resulterte i en 86 % reduksjon (p = 0,003). Derimot hadde ikke det tredje antistoffet mot peptidet, 16C11, noen effekt på plakkmengde. Lignende funn ble fremskaffet med A042ELISA-målinger. Disse resultatene demonstrerer at en antistoffrespons mot Ap-peptid, i fravær av T-celleimmunitet, er tilstrekkelig for å redusere amyloid avleiring i PDAPP-mus, men at ikke alle anti-Ap antistoffer er effektive. Antistoffer rettet mot epitoper innbefattende aminosyrene 1-5 eller 3-7 i Ap er spesielt effektive.

Som en oppsummering har vi vist at passivt administrerte antistoffer mot Ap reduserte omfanget av plakkavleiring i en musemodell for Alzheimers sykdom. Når de ble holdt ved beskjedne serumkonsentrasjoner (25-70 ng/rnl), fikk antistoffene tilgang til CNS ved nivåer tilstrekkelige for å dekorere p-amyloide plakk. Antistoffankomst inn i CNS skyldtes ikke unormal lekkasje av blod-hjerne-barrieren, siden det ikke var økning i vaskulær permeabilitet, som ble målt med Evans Blue i PDAPP-mus. I tillegg var antistoffkonsentrasjonen i hjerneparenkymet til gamle PDAPP-mus den samme som i ikke-transgene mus, som representerer 0,1 % av antistoffkonsentrasjonen i serum (uavhengig av isotype).

XIII: Monitorering av antistoffbinding

For å bestemme om antistoffer mot Ap kan virke direkte i CNS, ble hjerner tatt fra mus som hadde gjennomgått saltvannsperfusjon på slutten av Eksempel XII undersøkt for nærvær av de perifert administrerte antistoffene. Ikke-fikserte kryostathjernesnitt ble eksponert for et fluorescerende reagens mot museimmunglobulin (geit anti-mus lgG-Cy3). Plakk i hjerner til 10D5- og 3D6-gruppene var sterkt dekorert med antistoff, mens det var ingen farging i 16C11-gruppen. For å avdekke hele omfanget av plakkavleiring, ble serielle snitt av hver hjerne først immunreagert med et anti-Ap antistoff og deretter med det sekundære reagenset. 10D5 og 3D6 fikk etter perifer administrering tilgang til de fleste plakk i CNS. Plakkmengden var svært redusert i disse behandlingsgruppene sammenlignet med 16C11-gruppen. Disse resultatene indikerer at perifert administrerte antistoffer kan gå over i CNS der de direkte kan igangsette amyloid fjerning. Det er også sannsynlig at 16C11 hadde tilgang til plakkene, men ikke var i stand til å binde.

XIV: Ex wVo-screeningstest for aktivitet av et antistoff mot amyloide avleiringer

For å undersøke effekten av antistoffer på plakkfjerning, etablerte vi en ex wVo-test der primære mikrogliaceller ble dyrket med ikke-fikserte kryostatsnitt av hjerner fra enten PDAPP-mus eller menneske med AD. Mikrogliaceller ble fremskaffet fra de cerebrale korteksene til nyfødte DBA/2N-mus (1-3 dager). Korteksene ble løst opp mekanisk i HBSS"(Hanks balanserte saltløsning, Sigma) med 50ng/ml DNase I (Sigma). De separate cellene ble filtrert med et 100 nm cellefilter (Falcon) og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter. Pelleten ble resuspendert i vekstmedium (DMEM med høy glukose, 10 % FBS, 25 ng/ml rm GM-CSF) og cellene ble overført med en tetthet på 2 hjerner per T-75 plastkulturflaske. Etter 7-9 dager ble flaskene rotert på en orbital ristemaskin ved 200 rpm i 2 timer ved 37 °C. Cellesuspensjonen ble sentrifugert ved 1000 rpm og resuspendert i testmediet.

10 nm kryostatsnitt av hjerner til PDAPP-mus eller menneske med AD (post mortem-intervall < 3 timer) ble festet ved tining på polylysin-belagte runde dekkglass og plassert i brønner i 24-brønners vevskulturplater. Dekkglassene ble vasket to ganger med testmedium bestående av H-SFM (Hybridom-serumfritt medium, Gibco BRL) med 1 % FBS, glutamin, penicillin/streptomycin og 5 ng/ml rm GM-CSF (R&D). Kontroll eller anti-Ap antistoffer ble tilsatt ved en 2x konsentrasjon (5 ng/ml endelig konsentrasjon) i 1 time. Mikrogliacellene ble deretter dyrket ved en tetthet på 0,8 x 10<6>celler/ml testmedium. Kulturene ble opprettholdt i en fuktig inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 24 timer eller mer. På slutten av inkuberingen ble kulturene fiksert med 4 % paraformaldehyd og permeabilisert med 0,1 % Triton-X100. Snittene ble farget med

biotinylert 3D6 etterfulgt av et streptavidin/Cy3-konjugat (Jackson ImmunoResearch). De eksogene mikrogliacellene ble visualisert med kjernefarging (DAPI). Kulturene ble observert med et invertert fluorescensmikroskop (Nikon, TE300) og fotomikrografene ble tatt med et SPOT digitalt kamera ved å anvende SPOT programvare (Diagnostic instruments). For Western blott-analyse ble kulturene ekstrahert i 8 M urea, fortynnet 1:1 i reduserende tricinprøvebuffer og satt på en 16 % tricingel (Novex). Etter overføring til immobilon, ble blott eksponert for 5 ng/ml med pabAp42, etterfulgt av et HRP-konjugert anti-mus antistoff og fremkalt med ECL (Amersham).

Når testen ble utført med PDAPP-hjernesnitt i nærvær av 16C11 (ett av antistoffene mot Ap som ikke var effektivt in vivo), forble p-amyloide plakk intakte og ingen fagocytose ble observert. Derimot, når nærliggende snitt ble dyrket i nærvær av 10D5, var de amyloide avleiringene i stor utstrekning forsvunnet og mikrogliacellene hadde mange fagocyttiske vesikler inneholdende Ap. Identiske resultater ble fremskaffet med AD-hjernesnitt; 10D5 induserte fagocytose av AD-plakk, mens 16C11 var ineffektivt. I tillegg tilveiebragte testen sammenlignbare resultater når den ble utført med mikrogliaceller fra enten mus eller menneske og med muse-, kanin-ener primatantistoffer mot Ap.

Tabell 16 viser om binding og/eller fagocytose ble oppnådd forflere ulike antistoffbindingsspesifisiteter. Det kan bli observert at antistoffer som binder til epitoper innenfor aminosyrene 1-7 både binder og fjerner amyloide avleiringer, mens antistoffer som binder til epitoper innenfor aminosyrene 4-10 binder uten å fjerne amyloide avleiringer. Antistoffer som binder til epitoper C-terminalt i forhold til rest 10 verken binder eller fjerner amyloide avleiringer.

Tabell 17 viser resultater fremskaffet med flere antistoffer mot Ap, som sammenligner deres evne til å indusere fagocytose i ex wVo-testen og til å redusere in wVo-plakkmengde i passive overføringsstudier. Selv om 16C11 og 21F12 bandt til aggregert, syntetisk Ap-peptid med høy aviditet, var ikke disse antistoffene i stand til å reagere med p-amyloide plakk i ikke-fikserte hjernesnitt, kunne ikke igangsette fagocytose i ex wVo-testen og var ikke effektive in vivo. 10D5, 3D6 og det polyklonale antistoffet mot Ap var aktive på alle tre måtene. 22C8-antistoffet binder sterkere til en analog form av naturlig Ap, der asparaginsyre i posisjonene 1 og 7 er byttet ut med iso-asparaginsyre. Disse resultatene viser at effekt in vivo skyldes direkte antistoffmediert fjerning av plakkene i CNS og at ex wVo-testen er prediktiv for effekt in vivo.

Den samme testen har blitt anvendt for å teste fjerning av et antistoff mot et fragment av synuklein henvist til som NAC. Synuklein har blitt vist å være et amyloid plakkassosiert protein. Et antistoff til NAC fikk komme i kontakt med en hjernevevsprøve inneholdende amyloide plakk og mikrogliaceller, som før. Kaninserum ble anvendt som en kontroll. Påfølgende monitorering viste en betydelig reduksjon i antallet og størrelsen på plakk, som indikerer at antistoffet har fjerningsaktivitet.

Konfokalt mikroskopi ble anvendt for å bekrefte at Ap ble internalisert i løpet av ex wVo-testen. I nærvær av kontrollantistoffer forble de eksogene mikrogliacellene i et konfokalt plan over vevet, det var ingen fagocyttiske vesikler inneholdende Ap og plakkene forble intakte i snittet. I nærvær av 10D5 var nesten alt plakkmateriale i vesikler i de eksogene mikrogliacellene. For å bestemme skjebnen til det internaliserte peptidet, ble 10D5-behandlede kulturer ekstrahert med 8 M urea på ulike tidspunkter og undersøkt med Western blott-analyse. Ved én times tidspunktet, når ingen fagocytose enda hadde skjedd, avslørte reaksjon med et polyklonalt antistoff mot Ap et sterkt 4 kD bånd (som korresponderer til Ap-peptidet). Ap-immunreaktivitet avtok på dag 1 og var fraværende på dag 3. Dermed fører antistoffmediert fagocytose av Ap til dets nedbrytning.

For å bestemme om fagocytose i ex wVo-testen var Fc-mediert, ble F(ab')2-fragmenter av anti-Ap antistoffet 3D6 fremstilt. Selv om F(ab')2-fragmentene beholdt hele deres evne til å reagere med plakk, var de ikke i stand til å igangsette fagocytose med mikrogliaceller. I tillegg kunne fagocytose med hele antistoffet bli blokkert med et reagens mot murine Fc-reseptorer (anti-CD16/32). Disse resultatene indikerer at in wVo-fjerning av Ap skjer via Fc-reseptormediert fagocytose.

XV: Passering av antistoffer gjennom blod-hjerne-barrieren

Dette eksempelet bestemmer antistoffkonsentrasjonen levert til hjernen etter intravenøs injeksjon i et perifert vev til enten normal mus eller PDAPP-mus. PDAPP-mus eller normal kontrollmus gjennomgikk perfusjon med 0,9 % NaCI. Hjerneregioner (hippocampus eller korteks) ble dissekert og raskt nedfryst. Hjerne ble homogenisert i 0,1 % triton + proteaseinhibitorer. Immunoglobulin ble detektert i ekstraktene med ELISA. Fab'2 geit anti-mus IgG ble belagt på en RIA-plate som fangende reagens. Serumet eller hjerneekstraktene ble inkubert i 1 time. Isotypene ble detektert med anti-mus lgG1-HRP eller lgG2a-HRP eller lgG2b-HRP (Caltag). Antistoffer, uavhengig av isotype, var til stede i CNS ved en konsentrasjon som er 1:1000 av det som er funnet i blodet. Når for eksempel IgG 1-konsentrasjonen var tre ganger den til lgG2a i blodet, var dette også tilfelle i hjernen, der begge forelå ved 0,1 % av deres respektive nivåer i blodet. Dette resultatet ble observert i både transgene og ikke-transgene mus, så PDAPP har ikke en unik lekkasje i blod-hjerne-barrieren.

XVI: Terapeutisk effekt av et Ap-peptid i MAP-konfigurasjon

En terapeutisk adjuvans/immunogen-effektstudie ble utført i 9-10,5 måneder gamle heterozygote PDAPP-transgene hann- og hunnmus for å teste effekten av et fusjonsprotein innbefattende A01-7 i tetramer MAP-konfigurasjon, som beskrevet ovenfor. Varigheten av studien var 25 uker med 29-40 dyr per behandlingsgruppe; derfor var dyrene 15-16,5 måneder gamle ved terminering. Metodologien anvendt i denne studien er den samme som i den terapeutiske studien av ulike adjuvantia i Eksempel VIII ovenfor. Behandlingsgruppene er identifisert i Tabell 18 nedenfor. Tabellforkortelser: MAP - multiantigent peptid; TT - tetanustoksoid T-celleepitope (830-844); SC - subkutant; IP - intraperitonealt; PBS - fosfatbufret saltvann; GCS er en glysin/sitrat/sukrose-formulering.

Immuniseringsskjemaet var identisk for alle behandlingsgruppene. Musene ble injisert på uke 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 og 24, med blodprøver på uke 3, 5, 9, 13, 17, 21 og 25. Gruppe 1, 2, 3, 4 og 6 mottok åtte injeksjoner. Gruppe 2 og 3, henholdsvis QS21/AN1792 og PBS, fungerte som de positive og negative kontrollene for denne studien.

Titerne ble bestemt med anti-Ap antistofftitertesten.

Gruppe 1, CFA/IFA:MAP(Api-7:TT) gruppen, hadde lave titernivåer. Den maksimale GMT som ble oppnådd var bare 1.200 etter 13 uker og avtok til en GMT på 600 på uke 25. 3 av de 30 musene hadde ikke noe titer, og ytterligere 7 mus hadde en titer som ikke var høyere enn 400 på slutten av studien.

Gruppe 2, QS21/AN1792-kontrollgruppen, oppnådde dens maksimale titer etter 17 uker med en GMT på 16.000. Titeren falt deretter i løpet av de neste 8 ukene for å avslutte med en GMT på 8.700. Ett dyr i denne gruppen klarte ikke å oppnå en titer i løpet av hele forsøket.

Gruppe 3, PBS-alene gruppen, hadde ingen titere.

Begge behandlingsgruppene viste en signifikant reduksjon i kortikale Ap-nivåer sammenlignet med PBS-kontrollgruppen (se Tabell 19). CFA/IFA:MAP(Ap1-7) gruppen reduserte Ap signifikant sammenlignet med PBS-kontrollgruppen, til tross for de relativt lave titerne av anti-Ap antistoffer.

Som konklusjon er Ap 1-7MAP-immunogenet effektivt til å indusere en tilstrekkelig immunrespons som signifikant forsinker Ap-avleiring i korteksen.

XVII. Epitopekartlegging av immunogen respons til Ap i aper

Dette eksempelet analyserer responsen hos en primat til immunisering med AN 1792 (dvs. Api-42). Elleve grupper med aper (4/kjønn/gruppe) ble immunisert med AN1792 (75 eller 300ng/dose) i kombinasjon med QS-21 adjuvans (50 eller 100 ng/dose) eller 5 % steril dekstrose i vann (D5W, kontrollgruppe). Alle dyrene mottok IM-injeksjoner på ett av tre injeksjonsskjemaer, som vist i Tabell 20, for totalt 4, 5 eller 8 doser. Serumprøver (fra 4 aper/kjønn/gruppe) høstet på dag 175 av studien og CSF-prøver (fra 3 aper/kjønn/gruppe) høstet på dag 176 av studien (på 6 måneders nekropsien) ble evaluert for deres evne til å binde til Ap 1-40 peptid og

APP.

Den eksakte matrisen av lineære peptider gjenkjent av antistoffene i serumprøvene fra dyr immunisert med AN 1792 ble bestemt med en ELISA som målte bindingen av disse antistoffene til overlappende peptider som dekket hele A01-42 sekvensen. Biotinylerte peptider med delsekvenser av AN 1792 ble fremskaffet fra Chiron Technologies som 10 aminosyrer lange peptider med et overlapp på 9 rester og et trinn på én rest per peptid (syntese nr. 5366, nr. 5331 og nr. 5814). De første 32 peptidene (fra den åttende aminosyreposisjonen oppstrøms for N-terminalen til AN1792 ned til den tjuefjerde aminosyren i AN1792) er biotinylert på C-terminalen med en linker av GGK. De siste 10 peptidene (som repeterer det trettiandre peptidet fra den tidligere serien) er biotinylert på N-terminalen med en linker bestående av EGEG (SEKV ID NR:76). De frysetørkede, biotinylerte peptidene ble løst opp ved en konsentrasjon på 5 mM i DMSO. Disse peptidstamløsningene ble fortynnet til 5 nM i TTBS (0,05 % Tween 20, 25 mM Tris HCI, 137 mM NaCI, 5,1 mM KCI, pH = 7,5). 100 ni delmengder av denne 5 løsningen ble tilsatt i duplikater til streptavidinforhåndsbelagte 96-brønners plater (Pierce). Plater ble inkubert i én time ved romtemperatur og deretter vasket fire ganger med TTBS. Serumprøver ble fortynnet i prøvefortynningsmiddel uten azid for å normalisere titere, og 100 ni ble tilsatt per brønn. Disse platene ble inkubert én time ved romtemperatur og deretter vasket fire ganger med TTBS. HRP-konjugert geit anti-humant antistoff (Jackson ImmunoResearch) ble fortynnet 1:10.000 i prøvefortynningsmiddel uten azid, og 100 ni ble tilsatt per brønn. Platene ble igjen inkubert og vasket. For å utvikle fargereaksjonen ble TMB (Pierce) tilsatt med 100 ni per brønn og inkubert i 15 min før tilsetningen av 30 ni 2 N hteSCUfor å stoppe reaksjonen. Den optiske tettheten ble målt ved 450 nm på en Vmax eller Spectramax kolorimetrisk plateleser.

Immunisering med AN 1792 resulterte i produksjon av antistoffer i 100 % av dyrene i alle dosegruppene på dag 175. Gjennomsnittstitere i gruppene varierte fra 14596 - 56084. Det var en tendens at titere var høyere i et immuniseringsskjema i nærvær av høyere antigen- og/eller høyere adjuvanskonsentrasjon, men ingen statistisk signifikante forskjeller kunne bli demonstrert pga. den høye variabiliteten i individuelle responser til immuniseringene.

Sera som var positive for antistoffer til AN 1792 var også positive for antistoffer til Api-40. Gjennomsnittstitere i gruppene varierte fra 36867 -165991 og viste, som for anti-AN1792 titere, ingen statistisk signifikante forskjeller mellom grupper på dag 175. Binding til AN1792 viste en svært positiv korrelasjon (Spearman r = 0,8671) med binding til Api-40.

Av de 48 apene som ble immunisert etter ulike skjemaer med AN 1792, ga 33 aper CSF-prøver med tilstrekkelig volum og kvalitet for analyse. Trettito (97 %) av disse apene hadde positive titere til AN 1792. Titere varierte fra 2 - 246, med et gjennomsnitt på 49,44 ± 21,34. CSF anti-AN1792 nivåer var 0,18 ± 0,11 % av det som ble målt i serumet og demonstrerte en svært positiv korrelasjon (Spearman r = 0,7840) med serumtitere. Ingen forskjeller ble observert på tvers av grupper eller mellom kjønn i prosenten av antistoff i CSF. Antistoffnivået i CSF er sammenfallende med den passive overføringen av perifert generert antistoff over blod-hjerne-barrieren inn i sentralnervesystemet.

Testing av en undergruppe av anti-AN1792 positive CSF-prøver demonstrerte, som antistoffet i serumprøver, at antistoff i CSF kryssreagerer med Api-40. Titere til Api-40 viste en høy korrelasjon (Spearman r = 0,9634) til deres respektive AN 1792-titere. Testing av en undergruppe av CSF-prøver med de høyeste titerne til AN 1792 viste ingen binding til APP, som for serumantistoffene.

Når sera fra dag 175 ble testet mot en serie med overlappende 10-mer peptider, bandt antistoffer fra alle apene til peptidet hvis sekvens dekket aminosyrene 1-10 av AN1792-peptidet (aminosyrene 653-672 i APP). I noen dyr var dette det eneste peptidet som binding kunne bli målt til (se Figur 19).

I andre dyr kunne andre reaktiviteter bli målt, men i alle tilfellene var reaktiviteten til den N-terminale peptidsekvensen det dominerende. De ekstra reaktivitetene falt inn i to grupper. Først og mest vanlig var bindingen til peptider sentrert rundt det N-terminale 1-10 AN1792-peptidet (Figur 20). Binding av denne typen ble rettet mot peptidene som dekker aminosyrene -1-8, -1-9 og 2-11 av AN1792-peptidet. Disse reaktivitetene, kombinert med den til 1-10 peptidet, representerer den overveldende majoriteten av reaktivitet i alle dyr. Epitopekartlegging av individuelle dyr over tid indikerer at antistoffreaktiviteten til 1-10 peptidet forsetter spredningen til de nærliggende peptidene. Dette viser en sterk tilbøyelighet for immunresponsen til N-terminalen av AN1792-peptidet med dets frie terminale asparaginsyrerest. Den andre mindre detekterbare aktiviteten i noen dyr var binding til peptider lokalisert C-terminalt i forhold til hovedområdet og sentrert rundt peptider som dekker aminosyrene 7-16, 11-20 og 16-25 i AN1792-peptidet. Disse reaktivitetene ble bare observert i 10-30 % av apene.

Variabilitet i respons mellom ulike dyr (f.eks. om aminosyrene 1-10 var den eneste eller dominerende reaktive epitopen) korrelerte ikke med antigen/adjuvans-dose, doseringsskjema eller antistofftiter og er trolig en refleksjon av hvert individuelle dyrs genetiske makeup.

XVIII. Forebyggelse og behandling av mennesker

En enkeltdose Fase I studie utføres for å vurdere sikkerhet i mennesker. En terapeutisk agens administreres i økende doser til ulike pasienter med start på ca. 0,01 av det antatte effektnivået, og øker med en faktor på tre før et nivå på ca. 10 ganger den effektive musedosen blir nådd.

En Fase II studie utføres for å vurdere terapeutisk effekt. Pasienter med tidlig til middels Alzheimers sykdom, definert ved å anvende kriterier for Alzheimers sykdom og "Related Disorders Association" (ADRDA) for mulig AD, blir selektert. Egnede pasienter har et poengresultat i området 12-26 på den mini-mentale tilstandseksamenen (MMSE). Andre seleksjonskriterier er at pasienter trolig vil overleve så lenge studien varer og ikke har kompliserende omstendigheter, slik som anvendelse av andre medisiner samtidig som kan interferere med studien. Grunnleggende evalueringer av pasientfunksjon blir laget ved å anvende klassiske psykometriske målinger, slik som MMSE, og ADAS, som er en omfattende skala for å evaluere status og funksjon til pasienter med Alzheimers sykdom. Disse psykometriske skalaene gir et mål på progresjon av Alzheimers. Egnede kvalitative livsskalaer kan også bli anvendt for å monitorere behandling. Sykdomsprogresjon kan også bli monitorer! med MRI. Blodprofiler av pasienter kan også bli monitorer! innbefattende tester av immunogenspesifikke antistoffer og T-celleresponser.

Etter de grunnleggende målingene begynner pasienter å motta behandling. De er randomisert og behandlet med enten terapeutisk agens eller placebo i en blindstudie. Pasienter monitoreres minst hver sjette måned. Effekt bestemmes med en signifikant reduksjon i progresjon av en behandlingsgruppe i forhold til en placebogruppe.

En annen Fase II studie utføres for å evaluere utvikling av pasienter fra ikke-Alzheimers sykdom tidlig hukommelsestap, enkelte ganger henvist til som aldersassosiert hukommelsessvekkelse (AAMI) eller mild kognitiv svekkelse (MCI), til sannsynlig Alzheimers sykdom, slik det er definert med ADRDA-kriterier. Pasienter med høy risiko for utvikling av Alzheimers sykdom blir selekter! fra en ikke-klinisk populasjon ved å screene referansepopulasjoner for tidlige tegn på hukommelsestap eller andre problemer assosier! med pre-Alzheimers symptomatologi, en familiehistorie med Alzheimers sykdom, genetiske risikofaktorer, alder, kjønn og andre egenskaper funnet å forutsi høy risiko for Alzheimers sykdom. De grunnleggende poengresultatene fra egnede målinger inkludert MMSE og ADAS sammen med andre målinger designet for å evaluere en mer normal populasjon blir samlet. Disse pasientpopulasjonene blir fordelt i egnede grupper med placebosammenligning mot doseringsalternativer med agensen. Disse pasientpopulasjonene følges i intervaller på ca. seks måneder og endepunktet for hver pasient er om han eller hun utvikler mulig Alzheimers sykdom definert med

ADRDA-kriterier på slutten av observasjonen.

XIX. Generelle materialer og fremgangsmåter

1. Måling av antistofftitere

Blodprøver ble tatt av mus ved å lage et lite snitt i halevenen og høste ca. 200 n' blod i et mikrofugerør. Marsvin ble tatt blodprøver av ved å først barbere rygghaseområdet og deretter anvende en 18 gauge nål for å snitte den metatarsale venen og høste blodet i mikrofugerør. Blod fikk koagulere i én time ved romtemperatur, vortekset, deretter sentrifugert ved 14.000 x g i 10 min for å separere koagelet fra serumet. Serum ble deretter overført til et rent mikrofugerør og lagret ved 4 °C til det skulle bli titrert.

Antistofftitere ble målt med ELISA. 96-brønners mikrotiterplater (Costar EIA-plater) ble belagt med 100 ni av en buffer (0,1 M natriumfosfat, pH 8,5, 0,1 % natriumazid) inneholdende enten 10 ng/ml A042 eller SAPP eller andre antigener, som nevnt i hver av de individuelle rapportene, og oppbevart natten over ved romtemperatur. Brønnene ble aspirert og sera ble satt til brønnene ved å begynne med en 1/100 fortynning i prøvefortynningsmiddel (0,014 M natriumfosfat, pH 7,4, 0,15 M NaCI, 0,6 % bovint serumalbumin, 0,05 % thimerosal). Sju seriefortynninger av prøvene ble laget direkte i platene med tre-fold trinn for å oppnå en endelig fortynning på 1/218.700. Fortynningene ble inkubert i de belagte platebrønnene i én time ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket fire ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween 20. Det sekundære antistoffet, et geit anti-mus lg konjugert til pepperrotperoksidase (fremskaffet fra Boehringer Mannheim), ble satt til brønnene som 100 ni av en 1/3000 fortynning i prøvefortynningsmiddel og inkubert i én time ved romtemperatur. Platene ble igjen vasket fire ganger i PBS, Tween 20. For å fremkalle kromogenet, ble 100 n' av sen TMB (3,3'5,5'-tetrametylbenzidin fremskaffet fra Pierce Chemicals) satt til hver brønn og inkubert i 15 min ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetningen av 25 ni 2 M H2SO4. Fargeintensiteten ble deretter avlest på en Molecular Devices Vmax ved 450-650 nm.

Titere ble definert som den resiproke verdien av serumfortynningen som gir halvparten av maksimal OD. Maksimal OD ble generelt tatt fra en første 1/100 fortynning, unntatt i tilfeller med veldig høye titere der en høyere startfortynning var nødvendig for å etablere maksimal OD. Hvis 50 % punktet falt mellom to fortynninger, ble en lineær tilnærming laget for å beregne den endelige titeren. For å beregne geometrisk gjennomsnittlige antistofftitere, ble titere mindre enn 100 vilkårlig tilskrevet en titerverdi på 25.

2. Lymfocyttproliferasjonstest

Mus ble anestesert med isofluran. Milter ble fjernet og skylt to ganger med 5 ml PBS inneholdende 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum (PBS-FBS) og deretter homogenisert i en 50° Centricon-enhet (Dako A/S, Danmark) i 1,5 ml PBS-FBS i 10 sekunder ved 100 rpm i en Medimaskin (Dako), etterfulgt av filtrering gjennom et nylonnett med porestørrelse på 100 mikron. Splenocytter ble vasket én gang med 15 ml PBS-FBS og deretter pelletert med sentrifugen ng ved 200 x g i 5 min. Røde blodceller ble lysert ved å resuspendere pelleten i 5 ml buffer inneholdende 0,15 M NH4CI, 1 M KHCO3, 0,1 M NaEDTA, pH 7,4, i fem min ved romtemperatur. Leukocytter ble deretter vasket som ovenfor. Nyisolerte miltceller (10<5>celler per brønn) ble dyrket i triplikate sett i 96-brønners, U-bunnede, vevskulturbehandlede mikrotiterplater (Corning, Cambridge, MA) i RPMI 1640 medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS) supplementer! med 2,05 mM L-glutamin, 1 % penicillin/streptomycin og 10 % varmeinaktivert FBS, i 96 timer ved 37 °C. Ulike Ap-peptider, Ap1-16, Ap1-40, Api-42 eller Ap40-1 reverser! sekvensprotein, ble også tilsatt ved doser som varierte fra 5 til 0,18 mikromolar i fire trinn. Celler i kontrollbrønner ble dyrket med Konkanavalin A (Con A) (Sigma, kat. # C-5275, ved 1 mikrogram/ml) uten tilsatt protein. Celler ble pulset i de siste 24 timene med<3>H-tymidin (1nCi/brønn, fremskaffet fra Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Celler ble deretter høstet over på UniFilter-plater og telt i en Top Count Mikroplate-scintillasjonsteller (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Resultater er uttrykt som tall per minutt (cpm) av radioaktivitet inkorporer! i uløselige makromolekyler.

4. Hjernevevfremstilling

Etter eutanasi ble hjernene fjernet og én hemisfære ble fremstilt for immunhistokjemisk analyse, mens tre hjerneregioner (hippocampus, korteks og cerebellum) ble dissekert fra den andre hemisfæren og anvendt for å måle konsentrasjonen av ulike Ap-proteiner og APP-former ved å anvende spesifikke ELISA (Johnson-Wood et al., supra).

Vev bestemt for ELISA ble homogenisert i 10 volumer iskald guanidinbuffer (5,0 M guanidin-HCI, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0). Homogenatene ble blandet med rolig risting ved å anvende en Adams Nutator (Fisher) i tre til fire timer ved romtemperatur, deretter lagret ved -20 °C før kvantifisering av Ap og APP. Tidligere forsøk hadde vist at analyttene var stabile under denne lagringsbetingelsen, og at syntetisk Ap-protein (Bachem) kunne bli kvantifisert etter tilsetning i homogenater av kontrollhjernevev fra søsken i samme musekull (Johnson-Wood et al., supra).

5. Måling av Ap-nivåer

Hjernehomogenatene ble fortynnet 1:10 med iskaldt kaseinfortynningsmiddel (0,25 % kasein, PBS, 0,05 % natriumazid, 20 ng/ml aprotinin, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 ng/ml leupeptin) og deretter sentrifugert ved 16.000 x g i 20 min ved 4 °C. De syntetiske Ap-proteinstandardene (1-42 aminosyrer) og APP-standardene ble fremstilt til å innbefatte 0,5 M guanidin og 0,1 % bovint serumalbumin (BSA) i den endelige blandingen. Den "totale" Ap sandwich-ELISA benytter monoklonalt antistoff 266, spesifikt for aminosyrene 13-28 i Ap (Seubert, et al.), som det fangende antistoffet, og biotinylert monoklonalt antistoff 3D6, spesifikt for aminosyrene 1-5 i Ap (Johnson-Wood, et al.), som rapporteringsantistoffet. Det monoklonale antistoffet 3D6 gjenkjenner ikke sekrert APP eller fullengde-APP, men detekterer bare Ap-arter med en aminoterminal asparaginsyre. Denne testen har en nedre sensitivitetsgrense på -50 ng/ml (11 nM) og har ingen kryssreaktivitet med det endogene, murine Ap-proteinet ved konsentrasjoner opp til 1 ng/ml (Johnson-Wood et al., supra).

Api-42 spesifikk sandwich-ELISA benytter mAb 21F12, spesifikt for aminosyrene 33-42 i Ap (Johnson-Wood, et al.), som det fangende antistoffet. Biotinylert mAb 3D6 er også rapporteringsantistoffet i denne testen, som har en nedre sensitivitetsgrense på ca. 125ng/ml (28 nM, Johnson-Wood et al.). For Ap-ELISA'ene ble 100 ni av enten mAb 266 (ved 10ng/ml) eller mAb 21F12 (ved 5ng/ml) belagt i brønnene til 96-brønners immuntestplater (Costar) med inkubering natten over ved romtemperatur. Løsningen ble fjernet ved aspirering og brønnene ble blokkert ved tilsetning av 200 ni 0,25 % humant serumalbumin i PBS-buffer i minst 1 time ved romtemperatur. Blokkeringsløsningen ble fjernet og platene ble lagret tørket ved 4 °C inntil anvendelse. Platene ble rehydrert med vaskebuffer [Tris-bufret saltvann (0,15 M NaCI, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,5) pluss 0,05 % Tween 20] før anvendelse. Prøvene og standardene ble tilsatt i triplikate delmengder på 100n' per brønn og deretter inkubert natten over ved 4 °C. Platene ble vasket minst tre ganger med vaskebuffer mellom hvert trinn i testen. Biotinylert mAb 3D6, fortynnet til 0,5 ng/ml i kaseintestbuffer (0,25 % kasein, PBS, 0,05 % Tween 20, pH 7,4), ble tilsatt og inkubert i brønnene i 1 time ved romtemperatur. Et avidin-pepperrotperoksidasekonjugat (Avidin-HRP fremskaffet fra Vector, Burlingame, CA), fortynnet 1:4000 i kaseintestbuffer, ble satt til brønnene i 1 time ved romtemperatur. Det kolorimetriske substratet, sen TMB-ELISA (Pierce), ble tilsatt og fikk reagere i 15 minutter ved romtemperatur, og deretter ble enzymreaksjonen stanset med tilsetning av 25 ni 2 N H2SO4. Reaksjonsproduktet ble kvantifisert ved å anvende et Molecular Devices Vmax som måler forskjellen i absorbans ved 450 nm og 650 nm.

6. Måling av APP-nivåer

To ulike APP-tester ble anvendt. Den første, kalt APP-a/FL, gjenkjenner både APP-alfa (a) og fullengde (FL) former av APP. Den andre testen er spesifikk for APP-a. APP-a/FL-testen gjenkjenner sekrert APP, som innbefatter de første 12 aminosyrene i Ap. Siden rapporteringsantistoffet (2H3) ikke er spesifikt for a-kuttesetet, som foreligger mellom aminosyrene 612-613 i APP695 (Esch et al., Science 248, 1122-1124 (1990)), gjenkjenner denne testen også fullengde APP (APP-FL). Preliminære eksperimenter som anvender immobiliserte APP-antistoffer til den cytoplasmatiske halen til APP-FL for å tømme hjernehomogenater for APP-FL antyder at ca. 30-40 % av APP-a/FL APP er FL (resultater er ikke vist). Det fangende antistoffet for både APP-a/FL og APP-a testene er mAb 8E5, fremskaffet mot aminosyrene 444 til 592 i APP695-formen (Games et al., supra). Rapporterende mAb for APP-a/FL testen er mAb 2H3, spesifikt for aminosyrene 597-608 i APP695 (Johnson-Wood et al., supra), og rapporteringsantistoffet for APP-a testen er et biotinylert derivat av mAb 16H9, fremskaffet til aminosyrene 605 til 611 i APP. Den nedre sensitivitetsgrensen til APP-aFL testen er ca. 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood et al.), og den til den APP-a spesifikke testen er 22 ng/ml (0,3 nM). For begge APP-testene ble mAb 8E5 belagt på brønnene til 96-brønners EIA-plater, som beskrevet ovenfor for mAb 266. Renset, rekombinant sekrert APP-a ble anvendt som referansestandarden for APP-a testen og APP-a/FL testen (Esch et al., supra). Hjernehomogenatprøvene i 5 M guanidin ble fortynnet 1:10 i ELISA prøvefortynningsmiddel (0,014 M fosfatbuffer, pH 7,4, 0,6 % bovint serumalbumin, 0,05 % thimerosal, 0,5 M NaCI, 0,1 % NP40). De ble deretter fortynnet 1:4 i prøvefortynningsmiddel inneholdende 0,5 M guanidin. Fortynnede homogenater ble deretter sentrifugert ved 16.000 x g i 15 sekunder ved romtemperatur. APP-standardene og prøvene ble satt til platen i duplikate delmengder og inkubert i 1,5 time ved romtemperatur. Det biotinylerte rapporteringsantistoffet 2H3 eller 16H9 ble inkubert med prøver i 1 time ved romtemperatur. Streptavidin-alkaliskfosfatase (Boehringer Mannheim), fortynnet 1:1000 i prøvefortynningsmiddel, ble inkubert i brønnene i 1 time ved romtemperatur. Det fluorescerende substratet 4-metyl-umbelliferyl-fosfat ble tilsatt for en 30 minutters romtemperaturinkubering, og platene ble avlest på en Cytofluor tm 2350 fluorimeter (Millipore) ved 365 nm eksitasjon og 450 nm emisjon.

7. Immunhistokjemi

Hjerner ble fiksert i tre dager ved 40 °C i 4 % paraformaldehyd i PBS og deretter lagret fra én til sju dager ved 4 °C i 1 % paraformaldehyd i PBS før snitt ble laget. Førti mikron tykke koronare snitt ble kuttet på en vibratom ved romtemperatur og lagret i kuldebeskyttende middel (30 % glyserol, 30 % etylenglykol i fosfatbuffer) ved

-20 °C før immunhistokjemisk prosessering. For hver hjerne ble seks snitt på nivået av dorsal hippocampus, der hvert snitt var separert med konsekutive 240 nm intervaller, inkubert natten over med ett av de følgende antistoffene: (1) et biotinylert anti-Ap (mAb, 3D6, spesifikt for humant Ap) fortynnet til en konsentrasjon på 2 ng/ml i PBS og 1 % hesteserum; eller (2) et biotinylert mAb spesifikt for humant APP, 8E5, fortynnet til en konsentrasjon på 3ng/ml i PBS og 1,0 % hesteserum; eller (3) et mAb spesifikt for glialt, fibrillært, surt protein (GFAP; Sigma Chemical Co.) fortynnet 1:500 med 0,25 % Triton X-100 og 1 % hesteserum i Tris-bufret saltvann, pH 7,4 (TBS); eller (4) et mAb spesifikt for CD11b, MAC-1 antigen, (Chemicon International) fortynnet 1:100 med 0,25 % Triton X-100 og 1 % kaninserum i TBS; eller (5) et mAb spesifikt for MHC ll-antigen (PharMingen) fortynnet 1:100 med 0,25 % Triton X-100

og 1 % kaninserum i TBS; eller (6) et rotte mAb spesifikt for CD 43 (PharMingen) fortynnet 1:100 med 1 % kaninserum i PBS eller (7) et rotte mAb spesifikt for CD 45RA (PharMingen) fortynnet 1:100 med 1 % kaninserum i PBS; eller (8) et rotte monoklonalt Ap spesifikt for CD 45RB (PharMingen) fortynnet 1:100 med 1 % kaninserum i PBS; eller (9) et rotte monoklonalt Ap spesifikt for CD 45 (PharMingen) fortynnet 1:100 med 1 % kaninserum i PBS; eller (10) et biotinylert polyklonalt hamster Ap spesifikt for CD3e (PharMingen) fortynnet 1:100 med 1 % kaninserum i PBS eller (11) et rotte mAb spesifikt for CD3 (Serotec) fortynnet 1:200 med 1 % kaninserum i PBS; eller med (12) en løsning av PBS uten et primært antistoff inneholdende 1 % normalt hesteserum.

Snitt reagerte med antistoffløsninger nevnt i 1,2, og 6-12 ovenfor ble forhåndsbehandlet med 1,0 % Triton X-100, 0,4 % hydrogenperoksid i PBS i 20 min ved romtemperatur for å blokkere endogen peroksidase. De ble videre inkubert natten over ved 4 °C med primært antistoff. Snitt reagerte med 3D6 eller 8E5 eller CD3e mAb'er ble deretter reagert i én time ved romtemperatur med et pepperrotperoksidase-avidin-biotin-kompleks med testsettkomponentene "A" og "B" fortynnet 1:75 i PBS (Vector Elite standard testsett, Vector Labs, Burlingame, CA). Snitt reagerte med antistoffer spesifikke for CD 45RA, CD 45RB, CD 45 og CD3, og PBS-løsningen uten primært antistoff ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med henholdsvis biotinylert anti-rotte IgG (Vector) fortynnet 1:75 i PBS eller biotinylert anti-mus IgG (Vector) fortynnet 1:75 i PBS. Snitt ble deretter reagert i én time ved romtemperatur med et pepperrotperoksidase-avidin-biotin-kompleks med testsettkomponentene "A" og "B" fortynnet 1:75 i PBS (Vector Elite standard testsett, Vector Labs, Burlingame, CA).

Snitt ble fremkalt i 0,01 % hydrogenperoksid, 0,05 % 3,3' diaminobenzidin (DAB) ved romtemperatur. Snitt bestemt for inkubering med de GFAP-, MAC-1- og MHC II-spesifikke antistoffene ble forhåndsbehandlet med 0,6 % hydrogenperoksid ved romtemperatur for å blokkere endogen peroksidase og deretter inkubert natten over med det primære antistoffet ved 4 °C. Snitt som hadde blitt reagert med GFAP-antistoffet ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med biotinylert anti-mus IgG laget i hest (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC-testsett) fortynnet 1:200 med TBS. Snittene ble deretter reagert i én time med et avidin-biotin-peroksidase-kompleks (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC-testsett) fortynnet 1:1000 med TBS. Snitt som hadde blitt inkubert med det MAC-1- eller MHC ll-spesifikke monoklonale antistoffet som det primære antistoffet ble deretter reagert i 1 time ved romtemperatur med biotinylert anti-rotte IgG laget i kanin fortynnet 1:200 med TBS, etterfulgt av inkubering i én time med avidin-biotin-peroksidase-kompleks fortynnet 1:1000 med TBS. Snitt som hadde blitt inkubert med GFAP-, MAC-1- og MHC ll-spesifikke antistoffer ble deretter visualisert med behandling ved romtemperatur med 0,05 % DAB, 0,01 % hydrogenperoksid, 0,04 % nikkelklorid og TBS i henholdsvis 4 og 11 min.

Immunmerkede snitt ble festet på objektglass (VWR, Superfrost-objektglass), lufttørket over natten, dyppet i Propar (Anatech) og dekket med dekkglass ved å anvende Permount (Fisher) som festemedium.

For å farge Ap-plakk, ble en undergruppe av de GFAP-positive snittene festet på Superfrost-objektglass og inkubert i vandig 1 % Thioflavin S (Sigma) i 7 min etter immunhistokjemisk prosessering. Snitt ble deretter dehydrert og skylt i Propar og ble deretter dekket med dekkglass festet med Permount.

8. Bildeanalyse

Et Videometric 150 bildeanalysesystem (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) koblet til et Nikon Mikrophot-FX mikroskop via et CCD-videokamera og en Sony Trinitron-monitor ble anvendt for kvantifisering av de immunreaktive objektglassene. Bildet av snittet ble lagret i en videobuffer, og en farge- og metningsbasert terskelverdi ble bestemt for å selektere og beregne det totale pixel-området okkupert av de immunmerkede strukturene. For hvert snitt ble det tegnet omriss av hippocampus manuelt, og det totale pixel-området okkupert av hippocampus ble beregnet. Prosent amyloidmengde ble målt som: (fraksjonen av det hippocampale området inneholdende Ap-avleiringer immunreaktive med mAb 3D6) x 100. Likeledes ble prosent nevrittisk mengde målt som: (fraksjonen av det hippocampale området inneholdende dystrofisk nevritt reaktiv med monoklonalt antistoff 8E5) x 100. C-bildeanalysesystemet (Compix, Inc., Cranberry Township, PA), som benytter Simple 32 Software Application-programmet, var koblet til et Nikon Mikrophot-FX mikroskop via et Optronics kamera og anvendt for å kvantifisere prosenten av den retrospleniale korteksen okkupert av GFAP-positive astrocytter og MAC-1- og MHC ll-positive mikroglia. Bildet av det immunreagerte snittet ble lagret i en videobuffer, og en monokrombasert terskelverdi ble bestemt for å selektere og beregne det totale pixel-området okkupert av immunmerkede celler. For hvert snitt ble det tegnet omriss av retrosplenial korteks (RSC) manuelt, og det totale pixel-området okkupert av RSC ble beregnet. Prosent astrocytose ble definert som: (fraksjonen av RSC okkupert med GFAP-reaktive astrocytter) x 100. Likeledes ble prosent mikrogliose definert som: (fraksjonen av RSC okkupert av MAC-1- eller MHC ll-reaktiv mikroglia) x 100. For alle bildeanalyser ble seks snitt på nivået av dorsal hippocampus, der hvert snitt var separert med konsekutive 240 nm intervaller, kvantifisert for hvert dyr. I alle tilfellene var behandlingsstatusen til dyrene ukjent for observatøren.

Selv om den foregående oppfinnelsen har blitt beskrevet i detalj for å bringe klarhet i forståelsen, vil det være opplagt at bestemte modifiseringer kan bli praktisert innenfor omfanget av de vedlagte kravene. Alle publikasjoner og patentdokumenter sitert heri er herved inkorporert med referanse i deres helhet for alle formål i samme grad som hvis hver enkelt ble betegnet slik.

Fra det foregående vil det være tydelig at oppfinnelsen har flere anvendelser. For eksempel tilveiebringer oppfinnelsen anvendelsen av ethvert av antistoffene til Ap beskrevet ovenfor i behandling, profylakse eller diagnose av amyloidogen sykdom, eller i produksjonen av et legemiddel eller diagnostisk blanding for anvendelse til det samme. Likeledes tilveiebringer oppfinnelsen anvendelsen av et hvilket som helst av epitopefragmentene av Ap beskrevet ovenfor for behandling eller profylakse av amyloidogen sykdom eller i produksjonen av et legemiddel for anvendelse til det samme.

Claims

1. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et kimært eller humanisert antistoff som spesifikt bindes til en epitope innenfor restene 1-10 i Ap, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

2. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et antistoff som spesifikt bindes til en epitope innenfor restene 1 -10 i A(3, hvor isotypen av antistoffet er human lgG1, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

3. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1,karakterisert vedat isotypen av antistoffet er human lgG1, lgG2, lgG3 eller lgG4.

4. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat antistoffet spesifikt bindes til en epotope innenfor: restene 1-6 avA|3; restene 1-7 avA|3; restene 1-4 avA|3; restene 1-3 avA|3; restene 3-6 avA|3; eller restene 3-7 av Ap.

5. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene,karakterisert vedat antistoffet spesifikt bindes til en epitope omfattende en fri N-terminal rest i Ap.

6. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert vedat antistoffet er et polyklonalt antistoff eller et monoklonalt antistoff.

7. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert vedat antistoffet omfatter to kopier av samme par av lette og tunge kjeder.

8. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisert vedat antistoffet er et bispesifikt antistoff omfattende et første lett og tungt kjede par som spesifikt bindes til epitopen av Ap og et andre lett og tungt kjede par som spesifikt bindes til en Fc reseptor på microglial celler.

9. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene,karakterisert vedat en kjede av antistoffet er fusjonert til et heterologt polypeptid.

10. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene,karakterisert vedat antistoffet bindes spesifikt til Ap-peptidet uten å binde til full lengde amyloidforløper protein (APP).

11. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene,karakterisert vedat den farmasøytiske sammensetningen i tillegg omfatter minst et annet antistoff som bindes til en annen epitope i Ap.

12. Farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11,karakterisert vedat bæreren er et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel for parenteral administrering.

13. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12,karakterisert vedat den er tilpasset til å bli administrert intraperitonealt, oralt, intranasalt, subkutant, intramuskulær!, topisk eller intravenøst.

14. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13,karakterisert vedat den er tilpasset for å bli administrer! i flere doser over en periode på minst 6 måneder.

15. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14,karakterisert vedat den er tilpasset for å bli administrer! som en sammensetning med vedvarende frigjøring.

16. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 15,karakterisert vedat doseringen av antistoffet er 0,01 til 5 mg/kg kroppsvekt av pasienten.

17. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16,karakterisert vedat sammensetningen er for anvendelse for forebygging eller behandling av en sykdom assosier! med amyloide deponeringer av Ap i hjernen til en pasient.

18. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16,karakterisertved a t det er for anvendelse for forebygging eller behandling av en sykdom assosiert med amyloide deponeringer av Ap i hjernen til en pasient.