本文報告在根據實例8之胞吞轉送作用分析中顯示高胞吞轉送作用之兔抗體299之人類化變體，其對人類及食蟹猴轉鐵蛋白受體具有交叉反應性(即特異性結合至該轉鐵蛋白受體之兩種異種同源物)，其顯示良好細胞染色且其針對該人類轉鐵蛋白受體之半衰期與鼠類抗體128.1針對食蟹猴轉鐵蛋白受體之半衰期相似(藉由解離速率反映)。
如本文報告之一個態樣係特異性結合至人類轉鐵蛋白受體之人類化抗體，其中該抗體包含：
在重鏈可變域中，SEQ ID NO: 66、68及72之HVR，
及
在輕鏈可變域中，SEQ ID NO: 75、76及78之HVR。
在一個實施例中，該人類化抗體包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域。
在一個實施例中，該人類化抗體係效應子功能沉默。
在一個實施例中，該人類化抗體特異性結合至人類轉鐵蛋白受體及食蟹猴轉鐵蛋白受體。
在一個實施例中，該人類化抗體係：
a)人類子類IgG1之全長抗體，或
b)人類子類IgG4之全長抗體，或
c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類IgG1之全長抗體，
d)具有突變S228P、L235E及視需要P329G之人類子類IgG4之全長抗體，
e)在兩個重鏈中具有突變L234A、L235A及P329G及在一個重鏈中具有突變T366W及S354C及在各自其他重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體，或
f)在兩個重鏈中具有突變S228P、L235E及視需要P329G及在一個重鏈中具有突變T366W及S354C及在各自其他重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG4之全長抗體。
如本文報告之一個態樣係雙特異性抗體，其包含：
i)包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域之第一結合位點，
及
ii)選自以下之第二結合位點：
a)SEQ ID NO: 81之重鏈可變域及SEQ ID NO: 82之輕鏈可變域，或
b)SEQ ID NO: 83之重鏈可變域及SEQ ID NO: 84之輕鏈可變域，或
c)SEQ ID NO: 85之重鏈可變域及SEQ ID NO: 86之輕鏈可變域，或
d)SEQ ID NO: 87之重鏈可變域及SEQ ID NO: 88之輕鏈可變域，或
e)SEQ ID NO: 91之重鏈可變域及SEQ ID NO: 92之輕鏈可變域，或
f)SEQ ID NO: 89之重鏈可變域及SEQ ID NO: 90之輕鏈可變域，或
g)SEQ ID NO: 93之重鏈可變域及SEQ ID NO: 94之輕鏈可變域，或
h)SEQ ID NO: 79之重鏈可變域及SEQ ID NO: 80之輕鏈可變域。
如本文報告之一個態樣係包含如本文報告之抗體及視需要醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。
如本文報告之一個態樣係如本文報告之抗體，其用作藥劑。
如本文報告之一個態樣係如本文報告之抗體在治療神經失調症中之用途。
如本文報告之一個態樣係如本文報告之抗體在製造藥劑中之用途。
如本文報告之一個態樣係一種治療方法，其包括投與如本文報告之抗體以治療神經失調症。
I.定義
出於本文之目的，「接受者人類框架」係包含衍生自人類免疫球蛋白框架或人類共同框架(如下文定義)之輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架之胺基酸序列之框架。「衍生自」人類免疫球蛋白框架或人類共同框架之接受者人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數量係10或以下、9或以下、8或以下、7或以下、6或以下、5或以下、4或以下、3或以下或2或以下。在一些實施例中，該VL接受者人類框架序列係與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共同框架序列相同。
「親和性」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)間之非共價相互作用之強度之總和。除非另有指示，否則如本文使用，「結合親和性」係指反映在結合對(例如，抗體及抗原)之成員間之1:1相互作用之內在結合親和性。分子X針對其配偶體Y之親和性可通常藉由解離常數(Kd)表示。親和性可藉由此項技術中已知的常用方法(包括本文描述者)量測。下文中描述用於量測結合親和性之特定闡述性及例示性實施例。
「親和性成熟」抗體係指在一或更多個高度可變區(HVR)中具有一或更多個改變之抗體，相較於無此等改變之親代抗體，此等改變導致抗體針對抗原之親和性有所改善。
本文之術語「抗體」係以最廣義使用且包含各種抗體結構，其等包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要顯示所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體之結合該完整抗體所結合之抗原一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')
2
；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分係衍生自特定之源或物種，同時該重鏈及/或輕鏈之剩餘部分係衍生自不同之源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。抗體之五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等中之數個可進一步分為子類(同型)，例如，IgG
1
、IgG
2
、IgG
3
、IgG
4
、IgA
1
及IgA
2
。對應於免疫球蛋白之不同類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
「效應子功能」係指彼等歸因於抗體之Fc區之生物活性，其隨抗體類別而變化。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及互補依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指以必要之劑量及時間週期有效達成所需治療結果或預防結果之量。
本文之術語「Fc區」用以定義免疫球蛋白重鏈之C端區，其含有恆定區之至少一部分。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至該重鏈之羧基端。然而，該Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非另有說明，否則該Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU指數)，如描述於Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242中。
「框架」或「FR」係指除高度可變區(HVR)殘基外之可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，該等HVR及FR序列通常出現於下列在VH (或VL)中之序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
本文可交換使用之術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」係指具有大體上類似於天然抗體結構之結構或具有含有如本文定義之Fc區之重鏈之抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可交換使用且係指其中已引入外源性核酸之細胞，其等包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉形體」及「轉形細胞」，其等包括原代轉形細胞及自其衍生之子代(不考慮傳代數)。子代在核酸含量上與親代細胞可能不完全相同，但其可含有突變。本文包括具有與在最初轉形細胞中篩選或選擇之功能或生物活性相同之功能或生物活性之突變體子代。
「人類共同框架」係表示在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變域序列之子組。通常，序列之子組係如於Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242，第1至3卷中之子組。在一個實施例中，就VL而言，該子組係如於Kabat等人(同上)中之子組κ I。在一個實施例中，就VH而言，該子組係如於Kabat等人(同上)中之子組III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含大體上所有之至少一個及通常兩個可變域，其中所有或大體上所有之HVR (例如，CDR)對應於彼等非人類抗體者，及所有或大體上所有之FR對應於彼等人類抗體者。人類化抗體視需要可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化形式」係指已經人類化之抗體。
如本文使用，術語「高度可變區」或「HVR」係指抗體可變域之區之各者，其等在序列(「互補決定區」或「CDR」)中高度可變且形成結構上定義之環(「高度可變環」)，及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸體」)。通常，抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，及三個在VL中(L1、L2、L3)。
本文之HVR包括：
(a)於胺基酸殘基26至32 (L1)、50至52 (L2)、91至96 (L3)、26至32 (H1)、53至55 (H2)及96至101 (H3)處出現之高度可變環(Chothia, C.及Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)；
(b)於胺基酸殘基24至34 ( L1)、50至56 (L2)、89至97 (L3)、31至35b(H1)、50至65 (H2)及95至102 (H3)處出現之CDR (Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991), NIH Publication 91-3242)；
(c)於胺基酸殘基27c至36 (L1)、46至55 (L2)、89至96 (L3)、30至35b (H1)、47至58 (H2)及93至101 (H3)處出現之抗原觸體(MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及
(d) (a)、(b)及/或(c)之組合，其等包括HVR胺基酸殘基46至56 (L2)、47至56 (L2)、48至56 (L2)、49至56 (L2)、26至35 (H1)、26至35b (H1)、49至65 (H2)、93至102 (H3)及94至102 (H3)。
除非另有指示，否則本文根據Kabat等人(同上)編號可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)。
「個體(individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如，牛、羊、貓、狗及罵)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該個體係人類。
「經分離之」抗體係已自其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體係經純化至大於95%或99%純度，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)測得。就回顧用於評估抗體純度之方法而言，參見，例如，Flatman, S.等人，J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87。
「經分離之」核酸係指已自其天然環境之組分分離之核酸分子。經分離之核酸包括通常含有核酸分子之細胞內含有之該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或位於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
如本文使用之術語「單株抗體」係指自大體上均質抗體群體獲得之抗體，即，組成該群體之個別抗體係相同的及/或結合相同抗原決定基，除可能之變體抗體(例如，含有天然生成之突變或於產生單株抗體製劑之期間產生)外，此等變體通常少量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示如獲得自抗體之大體上均質群體之抗體之特性，且不應視為需要以任何特定方法產生該抗體。例如，根據本發明待使用之單株抗體可藉由各種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體顯示方法及利用含有所有或部分之人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物之方法，本文正描述用於製備單株抗體之此等方法及其他例示性方法。
「天然抗體」係指具有變化結構之天然生成之免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體係約150,000道爾頓之異四聚醣蛋白，其由以二硫化物鍵聯之兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈組成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)(亦稱為可變重域或重鏈可變域)，接著具有三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。同樣地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變輕域或輕鏈可變域)，接著具有恆定輕(CL)域。抗體之輕鏈基於其恆定域之胺基酸序列可分配兩種類型 (稱為kappa (κ)及lambda (λ))中之一者。
術語「包裝插頁」用以係指通常包括於治療產品之商業包裝中之使用說明，其等含有關於適應症、使用方法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或涉及使用此等治療產品之警告之資訊。
相對於參考多肽序列之「百分率(%)胺基酸序列一致性」定義為在比對序列並引入間隔(若有必要)後得到最大百分率序列一致性，及未考慮任何保守取代為序列一致性之一部分時，候選者序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分率。出於測定百分率胺基酸序列一致性之目的之比對可以熟悉此項技術者已知的各種方式達成，例如，使用公開可用之電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體)。熟習此項技術者可決定用於比對序列之適當參數，其等包括在比較中之序列之全長上達成最大比對所需之任何演算法。出於本文之目的，然而，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生%胺基酸序列一致性值。該ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.授權，且源代碼已與用戶文檔一起於U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559提出申請，其中其以U.S. Copyright Registration No. TXU510087註冊。該ALIGN-2程式係公開獲得自Genentech, Inc., South San Francisco, California或可編譯自源代碼。該ALIGN-2程式應經編譯以於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且請勿變更。
在其中採用ALIGN-2以比較胺基酸序列之情況下，給定胺基酸序列A相對於給定胺基酸序列B之%胺基酸序列一致性(或者，可表述為相對於給定胺基酸序列B具有或包含一定%胺基酸序列一致性之給定胺基酸序列A)係如下計算：
100乘以分數X/Y
其中X係藉由序列比對程式ALIGN-2於A及B之程式之比對中評為相同匹配之胺基酸殘基之數量，且其中Y係B中之胺基酸殘基之總數。將瞭解在胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對B之%胺基酸序列一致性將不等於B對A之%胺基酸序列一致性。除非另有明確說明，否則本文使用之所有%胺基酸序列一致性值可如前一段落中描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指以可以讓其中所含之活性成分之生物活性起效之形式呈現之製劑，且其不含有毒性是該調配物所投與之個體所不能接受之額外組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對個體無毒的成分。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文使用，「治療(treatment)」 (及其語法變化，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變治療中之個體之自然病程之臨床干預，且可針對預防或在臨床病理病程期間進行。所需之治療效果包括(但不限於)防止疾病之發生或復發；緩解症狀；減小該疾病之任何直接或間接病理學後果；防止轉移；減小疾病進展之速率；改善或減輕疾病狀態；及緩和或提高預後。在一些實施例中，本發明之抗體係用以延遲疾病之發展或減緩疾病之進展。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及將該抗體結合至抗原之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別係VH及VL)通常具有相似結構，且各域包含四個保守框架區(FR)及三個高度可變區(HVR)。(參見，例如，Kindt, T.J.等人，Kuby Immunology，第6版，W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007)，第91頁)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之VH或VL域以分別篩選互補VL或VH域之庫進行分離。參見，例如，Portolano, S.等人，J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T.等人，Nature 352 (1991) 624-628)。可變區(輕鏈及重鏈可變區)中之胺基酸殘基之編號將根據Kabat完成(Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD (1991)，NIH Publication 91-3242，第1至3卷)。
如本文使用，術語「載體」係指核酸分子，該核酸分子可傳播連接至其之另一核酸。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體及併入宿主細胞(該宿主細胞中已引入該載體)之基因體內之載體。某些載體可引導其等操作連接之核酸之表現。本文中亦將此等載體稱為「表現載體」。
術語「血腦障壁」(BBB)表示在末梢循環與腦及脊髓間之生理學障壁，其由腦毛細管內皮細胞漿膜內之緊密連接形成，其產生限制分子(甚至非常小分子諸如脲(60道爾頓))輸送至腦內之嚴密障壁。腦內之BBB、脊髓內之血液-脊髓障壁及視黃醛內之血液-視黃醛障壁係CNS內之連續毛細管障壁，且本文中將其等統稱為血腦障壁或BBB。該BBB亦包含血液CSF障壁(脈絡叢)，其中該障壁由室管膜細胞而非毛細管內皮細胞組成。
術語「中樞神經系統」(CNS)表示控制身體功能之神經組織之複合體，且包括腦及脊髓。
術語「血腦障壁受體」(BBBR)表示表現於腦內皮細胞上之細胞外膜連接受體蛋白，其可跨BBB輸送分子或用以輸送外源性投與分子。BBBR之實例包括(但不限於)轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、類胰島素生長因子受體(IGF-R)、低密度脂蛋白受體(包括(但不限於)低密度脂蛋白受體相關蛋白質1 (LRP1)及低密度脂蛋白受體相關蛋白質8 (LRP8))及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。例示性BBBR係轉鐵蛋白受體(TfR)。
術語「腦效應子實體」表示欲跨BBB輸送至腦之分子。該效應子實體通常具有遞送至腦所需之特性治療活性。效應子實體包括神經失調症藥物及細胞毒性劑(諸如，例如，多肽及抗體，特定言之，針對腦目標之單株抗體或其片段)。
術語「單價結合實體」表示可特異性並以單價結合模式結合至BBBR之分子。如本文報告之血腦穿梭模組及/或結合物之特徵在於存在單價結合實體之單一單元，即，本發明之血腦穿梭模組及/或結合物包含恰好一個單元之單價結合實體。該單價結合實體包括(但不限於)多肽、全長抗體、抗體片段(包括Fab、Fab'、Fv片段)、單鏈抗體分子(諸如，例如，單鏈Fab、scFv)。該單價結合實體可(例如)係使用諸如噬菌體顯示或免疫之目前最佳技術改造之支架蛋白。該單價結合實體亦可為多肽。在某些實施例中，該單價結合實體包含CH2-CH3 Ig域及針對血腦障壁受體之單鏈Fab (scFab)。該scFab係藉由連接子偶合至該CH2-CH3 Ig域之C端。在某些實施例中，該scFab係針對轉鐵蛋白受體。
術語「單價結合模式」表示特異性結合至BBBR，其中單價結合實體與BBBR間之相互作用通過一個單一抗原決定基發生。該單價結合模式因單一抗原決定基相互作用點而阻止該BBBR之任何二聚化/多聚化。該單價結合模式阻止BBBR之細胞內分選被改變。
術語「抗原決定基」表示任何可特異性結合至抗體之多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面組群，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且在某些實施例中，可具有特異性三維結構特性，及或特異性電荷特性。抗原決定基係抗原中被抗體結合之區域。
「轉鐵蛋白受體」(TfR)係跨膜醣蛋白(具有約180,000 Da之分子量)，其由兩個經二硫鍵結合之子單元(各者具有約90,000 Da之視分子量)組成且其涉及脊椎動物中之鐵攝取。在一個實施例中，本文之TfR係包含如報告於Schneider等人，(Nature 311 (1984) 675 - 678)中之胺基酸序列之人類TfR。
術語「成像劑」表示具有一或更多種允許直接或間接偵測化合物之存在及/或定位之性質之該化合物。此等成像劑之實例包括併入允許偵測之經標記之實體之蛋白質及小分子化合物。
術語「CNS抗原」及「腦目標」表示表現於CNS (包括腦)中之可用抗體或小分子靶向之抗原及/或分子。此抗原及/或分子之實例包括(但不限於)：β-分泌酶1 (BACE1)、類澱粉蛋白β (Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、Tau、載脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、富白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、帕金蛋白(parkin)、早老素1、早老素2、γ-分泌酶、死亡受體6 (DR6)、類澱粉前驅蛋白(APP)、p75神經營養素受體(p75NTR)、葡萄糖腦苷脂酶及卡斯蛋白酶6。
術語「特異性結合」表示抗體選擇性或優先地結合至抗原。該結合親和性通常使用標準分析(諸如Scatchard分析)或表面電漿共振技術(例如，使用BIACORE®)測定。
如本文使用之術語「CH2-CH3 Ig實體」係指衍生自免疫球蛋白CH2或CH3域之蛋白質實體。該「CH2-CH3 Ig實體」包含兩個形成二聚物之「CH2-CH3」多肽。該免疫球蛋白可為IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在一個實施例中，該CH2-CH3 Ig實體衍生自IgG免疫球蛋白且本文中將其稱為「CH2-CH3 IgG實體」。該術語包括CH2-CH3域之天然序列及變體CH2-CH3域。在一個實施例中，該「CH2-CH3 Ig實體」衍生自人類重鏈CH2-CH3 IgG域，其自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非另有說明，否則CH2-CH3域區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU指數)，如描述於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
「結合物」係結合至一或更多個異源分子之本發明之融合蛋白，異源分子包括(但不限於)標記、神經失調症藥物或細胞毒性劑。
術語「連接子」表示共價連接如本文報告之血腦障壁穿梭模組及/或融合多肽及/或結合物之不同實體之化學連接子或單鏈肽連接子。該連接子將(例如)腦效應子實體連接至單價結合實體。例如，若該單價結合實體包含CH2-CH3 Ig實體及針對血腦障壁受體之scFab，則該連接子將該scFab結合至該CH3-CH2 Ig實體之C端。將腦效應子實體結合至單價結合實體之連接子(第一連接子)及將scFab連接至CH2-CH3 Ig域之C端之連接子(第二連接子)可相同或不同。
可使用包含藉由肽鍵相連之一至二十個胺基酸殘基之單鏈肽連接子。在某些實施例中，該等胺基酸係選自二十個天然生成之胺基酸。在某些其他實施例中，該等胺基酸中之一或更多者係選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸及離胺酸。在其他實施例中，該連接子係化學連接子。在某些實施例中，該連接子係具有長度為至少25個胺基酸殘基，在一個較佳實施例中，長度為32至50個胺基酸殘基之胺基酸序列之單鏈肽連接子。在一個實施例中，該肽連接子係(GxS)n連接子且G =甘胺酸、S =絲胺酸，(x =3，n=8、9或10)或(x = 4及n= 6、7或8)，在一個實施例中，x =4，n=6或7，在一個較佳實施例中，x=4，n=7。在一個實施例中，該連接子係(G4S)4 (SEQ ID NO: 95)。在一個實施例中，該連接子係(G4S)6G2 (SEQ ID NO: 96)。
可使用各種化學連接子進行結合。例如，單價結合實體或融合多肽及腦效應子實體可使用諸如以下之各種雙功能蛋白偶合劑進行結合：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸鹽(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-l-羧酸鹽(SMCC)、亞胺基硫烷(IT)、亞氨酸酯之雙官能衍生物(諸如二甲基己二亞醯胺化合物HC1)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鎓衍生物(諸如雙(對重氮鎓苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。該連接子可為「可裂解連接子」，其一經遞送至腦即促進效應子實體之釋放。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含有二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Res. 52 (1992) 127-131；US 5,208,020)。
共價結合可為直接的或經由連接子。在某些實施例中，直接結合係藉由構築多肽融合(即，藉由基因融合編碼針對BBBR之單價結合實體及效應子實體之兩個基因且表現為單一多肽(鏈))。在某些實施例中，直接結合係藉由在單價結合實體中針對BBBR之兩部分中之一者上之反應性基團與腦效應子實體上之對應基團或接受者間形成共價鍵。在某些實施例中，直接結合係藉由修飾(即，基因修飾)待結合之兩個分子中之一者以包括在適當之條件下與待結合之另一分子形成共價連接之反應性基團(作為非限制性實例，巰基或羧基)。作為一個非限制性實例，可將具有所需反應性基團(即，半胱胺酸殘基)之分子(即，胺基酸)引入(例如)針對BBBR之單價結合實體內並與神經藥物形成二硫鍵。此項技術中亦已知用於將核酸共價結合至蛋白質之方法(即，光交聯，參見，例如，Zatsepin等人，Russ. Chem. Rev. 74 (2005) 77-95)。亦可使用各種連接子進行結合。例如，可使用諸如以下之各種雙功能蛋白偶合劑結合單價結合實體及效應子實體：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸鹽(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-l-羧酸鹽(SMCC)、亞胺基硫烷(IT)、亞氨酸酯之雙官能衍生物(諸如二甲基己二亞醯胺化合物HC1)、活性酯(諸如辛二酸琥珀醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鎓衍生物(諸如雙(對重氮鎓苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。亦可使用由藉由肽鍵連接之一至二十個胺基酸殘基組成之肽連接子。在某些此等實施例中，該等胺基酸殘基係選自二十個天然生成之胺基酸。在某些其他此等實施例中，該等胺基酸殘基中之一或更多者係選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸及離胺酸。該連接子可為「可裂解連接子」，其一經遞送至腦部即促進效應子實體之釋放。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含有二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Res. 52 (1992) 127-131；US 5,208,020)。
II.組合物及方法 平衡解離常數(K
D
)通常用以描述分子相互作用。平衡解離常數用作兩個分子彼此間之相互作用強度(例如，親和性)之衡量。因此，該K
D
值係用於雙分子相互作用之強度之衡量。
但K
D
值本身不描述分子相互作用之動力學，即，一方面，自K
D
值無法推導出兩個分子彼此結合有多快(結合速率常數或「結合速率」)及另一方面，自K
D
值無法推導出該等分子解離有多快(解離速率常數或「解離速率」)。僅藉由K
D
值表徵雙分子相互作用忽視相同K
D
值可藉由極其不同(量級有差異)之結合速率及解離速率組成(因K
D
值係其比率)之事實。
但結合速率及解離速率對表徵分子之結合行為係重要的。解離速率尤其重要，因為其表徵(例如)抗體對其抗原之結合持續時間。長解離速率與所形成之複合體之慢解離有關，而短解離速率與快解離有關。
為獲得持久(即，無需頻繁給藥)或特製(例如，取決於周圍情況)之相互作用，必須以實驗方式測定解離速率。此係甚至更為重要，因為幾乎不可能預測解離速率。另外，如上文概述解離速率與結合親和性間之相關性較差。例如，因為K
D
值係結合速率與解離速率之比率之事實，所以甚至弱結合劑亦可保持長時間結合至其等目標，而強結合劑可快速解離。
抗體產生工程之典型瓶頸係基於抗體結合強度淘選後獲得之許多候選者之分級。理想地，此方法將在沒有抗原之先前標記及具有粗細菌溶解物之情況下起效。Ylera, F.等人，(Anal.Biochem. 441 (2013) 208-213)報告一種含有單價Fab片段之粗大腸桿菌溶解物之解離速率篩選方法，其能用於選擇高親和性抗藥物抗體。其等將所選選解離速率作為分級參數，因為尤其該解離速率係非濃度依賴性的。其等已選擇單價格式以避免在解離速率分級及親和性測定期間將隨全長IgG觀察到之親和力效應。Ylera等人已發現具有最佳koff速率之純系藉由koff分級步驟識別，但使用僅ELISA訊息強度作為選擇標準將未經識別。
Murray, J.B.等人(J. Med. Chem. 57 (2014) 2845-2850)報告藉由表面電漿共振進行解離速率篩選(ORS)，其作為自未經純化之反應產物動力學樣品命中先導化學空間之有效方法(Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance as An Efficient Method to Kinetically Sample Hit to Lead Chemical Space from Unpurified Reaction Products)。其概述解離速率常數kd (解離速率)係具有增強化合物效力之最顯著潛能之配位體-蛋白質結合之分量。作者確實概述在整個藥物發現程序期間動力學量測親和性相較於穩定狀態親和性平衡測定具有更多資訊。例如，若藉由親和性之平衡量測進行評估，則具有慢10倍之結合速率及解離速率之化合物將不會識別為不同化合物。此外，作者已發現使用BIAcore T200儀器測定之資料顯示粗產物與純樣品間之kd之平均差異係19%，同樣地，使用更舊之BIAcore T100儀器測定之資料具有15%之差異。作者觀察到當跨儀器及跨時間比較時，kd平均變化僅30%。此證實攜帶污染物、長期儲存及不同設備對觀察到之kd具有適度之影響。實際上，kd之此等小偏差緊密反映多實驗室研究中觀察到之差異，其中已報告觀察到之變異性取決於系統而於14%至40%之範圍內變化(Murray, J.B.等人，J. Med. Chem. 57 (2014) 2845-2850；Katsamba, P.S.等人，Anal. Biochem. 352 (2006) 208-221)。
在WO 2014/189973中，報告抗轉鐵蛋白受體抗體及使用方法。其進一步報告以傳統特異性高親和性抗體靶向BBB受體通常導致BBB輸送之有限增加。隨後發現在經研究之抗BBB抗體中，被抗體攝取至CNS內之抗體之量級及抗體於CNS中之分佈之量級與抗體對BBB受體之結合親和性呈逆相關。例如，以治療劑量水平給藥的針對轉鐵蛋白受體(TfR)之低親和性抗體相對於較高親和性抗TfR抗體極大改善BBB輸送及抗TfR抗體之CNS滯留時間，且可更容易於CNS中達成治療濃度(Atwal等人，Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra43)。使用結合TfR及類澱粉前驅蛋白(APP)裂解酶(β-分泌酶(BACE1))兩者之雙特異性抗體證明此BBB輸送。使用低親和性抗體改造之雙特異性抗TfR/BACE1抗體之單一全身性劑量相較於單獨單特異性抗BACE1不僅導致腦中顯著之抗體攝取，亦顯著減小腦Aβ1-40之濃度，此表明BBB穿透影響抗BACE1之效力(Atwal等人，Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra43；Yu等人，Sci. Transl. Med. 3 (2011) 84ra44)。
可獲得之資料及實驗強調使用低親和性抗體方法增加抗體於CNS內之攝取背後之數個原因機制。
第一，高親和性抗BBB-受體(BBB-R)抗體(例如，來自Atwal等人及Yu等人之抗TfR抗體，同上)藉由快速飽和腦脈管系統中之BBB-R而限制腦攝取，因此減小腦內攝取之抗體之總量且亦限制其對脈管系統之分佈。顯著地，降低對BBB-R之親和性可改善腦攝取及分佈，及於自脈管系統定位至分佈於CNS內之神經元及相關神經纖維網中觀察到之穩健位移。已發現該親和性必須低於某一上限並高於某一下限。
第二，建議以抗體針對BBB-R之較低親和性削弱抗體經由BBB-R自膜之CNS側返回至BBB之血管側之能力，因為抗體針對BBB-R之整體親和性較低且抗體於BBB之CNS側之局部濃度因抗體快速分散至CNS隔室內而不為飽和的。
第三，在活體內且如針對TfR系統所觀察，針對BBB-R具有較低親和性之抗體不會與彼等針對BBB-R具有較大親和性者一樣被高效地清除出該系統，且因此相較於其等較高親和性對應體而保持處於較高循環濃度。此係有利的，因為較低親和性抗體之循環抗體濃度相較於較高親和性抗體維持治療濃度達更長時間週期，其因此較長時間週期地改善腦中之抗體之攝取。此外，血漿及腦曝露兩者之此改善可減小臨床給藥之頻率，其將不僅對病患依從性及便利性同時亦對減輕抗體及/或結合至其之治療化合物之任何潛在副作用或脫靶效應具有潛在利益。
此等先前研究利用特異性結合至小鼠TfR但不特異性識別靈長類動物或人類TfR之小鼠抗體。因此，本文提供確實特異性識別靈長類動物(尤其食蟹猴)及人類TfR兩者之抗體及其功能部分，以在該等抗體用於人類中治療或診斷之前，促進在靈長類動物中之安全性及效用研究。
因為抗體改造態樣之漸增複雜度及由用於產生抗體之重組產生細胞系統之多樣性誘發之變異性，所以旨在用於治療應用之單株抗體(mAb)之深入非臨床安全性評估係非常重要的。此外，除因對長期臨床使用mAb以治療慢性疾病之關注外，相較於傳統小分子藥物，mAb之複雜結構、獨特生物功能及更長半衰期應納入安全性考慮中(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11；Kim, S.J.等人，Mol. Cells 20 (2005) 17-29)。
針對mAb之非臨床研究之整體目標係定義留待討論之mAb之毒物學性質並提供用於產品開發之資訊。非臨床評估之主要目標係(1)識別靶器官中之毒性並判定該毒性在治療後是否係可逆的，(2)為人類I期臨床試驗及後續劑量遞增方案識別安全起始劑量，(3)提供資訊以在臨床試驗中監測安全性參數並(4)提供安全性資料以支援產品標簽上之專利申請。為達成此等目標，進行旨在定義並瞭解抗體之藥理學性質之活體外及活體內非臨床研究兩者(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11；Cavagnaro, J.A., In: Cavagnaro, J.A. (編) 「Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals」；Hoboken, NJ: Wiley 2008; 45-65)。
就mAb之成功非臨床安全評估而言，應選擇最相關動物物種用於毒性測試(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11；Chapman, K.等人，Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126)。相關物種係其中抗體具有藥理學活性之物種，靶抗原應存在或經表現且組織交叉反應性概況應類似於人類(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11；Chapman, K.等人，Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126；Subramanyam, M.及Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (編)；Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205；Hall, W.C.等人，In: Cavagnaro, J.A. (編)；Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008；207-240)。使用免疫化學或功能分析，可識別表現所需抗原決定基且證實組織交叉反應性概況類似於人類組織之相關動物物種(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11；Hall, W.C.等人，In: Cavagnaro, J.A. (編)；Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008；207-240)。適用於此方法之物種交叉反應性研究涉及使用市售多物種組織微陣列對來自各種物種之組織進行免疫組織化學研究(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11；Hall, W.C.等人，In: Cavagnaro, J.A. (編)；Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008；207-240)。或者，藉由流式活化細胞分選(FACS)評估針對此等動物之細胞之抗體結合通常比組織切片之免疫組織化學分析更敏感(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11；Subramanyam, M.及Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (編)；Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008；181-205)。應跨物種比較靶抗原之DNA及胺基酸序列；應判定物種間之同源性(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11；Subramanyam, M.及Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (編)；Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008；181-205)。
此外，抗原之生物分佈、功能及結構應在相關動物物種與人類間具有可比性以容許評估自靶抗原之抗體結合產生之毒性，其稱為中靶毒性(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11; 19,20)。此外，動物物種及人類之靶抗原組織分佈之強烈相似性使於動物中識別之靶器官毒性將更可能預測人類中之潛在毒性。動物物種與人類間之抗原組織分佈之相似性之缺乏不完全妨礙使用動物物種以用於毒性研究，但此等差異必須納入針對人類風險評估之考慮中。至於抗原密度或親和性，同樣不要求動物模型與人類之間之絕對等值。用於針對毒性測試所選擇之物種之相關性之合理性應包括於監管意見書內。若僅使用一個物種用於安全性評估，則證實缺乏額外相關物種之實驗之概述係必要的(Lynch, C.M.等人，mAbs 1 (2009) 2-11)。
若旨在用於治療用途之單株抗體不具有物種交叉反應性，則針對該模型不得不使用替代抗體或不同物種。因此，替代抗體係一種可能與具有受限物種交叉反應性之人類化單株抗體一起用於有限安全性測試之潛在解決方案。然而，當前沒有潛在替代抗體應在其用以判定用於臨床藥劑之安全性問題前經判定之指定標準(Regulatory Toxicology and Pharmacology，第40卷，第3期，2004年12月，第219至226頁)。
因此，為針對特定mAb識別動物模型，不得不作出上文之考慮。但儘管如此留待討論之mAb仍有必要具有與測試物種之靶抗原所進行之交叉反應性。否則，甚至最合適之測試物種亦無法使用。因此，仍需要具有以下mAb：在預期用於非臨床試驗之人類及物種中針對其目標沒有物種內交叉反應性但具有物種間交叉反應性。
A.例示性抗轉鐵蛋白抗體 本文報告具有結合至人類轉鐵蛋白受體之解離速率在某一範圍內以確保適當之BBB穿梭之抗轉鐵蛋白受體抗體。已發現此範圍之一端藉由表面電漿共振針對食蟹猴轉鐵蛋白受體測得之鼠類抗轉鐵蛋白受體抗體128.1 (給定於SEQ ID NO: 64及65中之可變域胺基酸序列)之解離速率界定及另一端藉由該解離速率之5%(即，減慢20倍之解離)界定。在一個實施例中，針對人類轉鐵蛋白受體之解離速率係介於0.1 l/s至0.005 l/s之範圍內且包括0.1 l/s及0.005 l/s。
如本文報告之純系299之人類化抗體無法藉由應用標準人類化技術獲得。需在胺基酸序列中引入非標準突變以獲得具有在0.1 l/s至0.005 l/s之預期範圍(且包括0.1 l/s及0.005 l/s)內之轉鐵蛋白受體結合解離速率之人類化抗體。此尤其重要，因為正開發如本文報告之抗體以用於跨人類血腦障壁使治療有效負載穿梭至腦內。
已發現為獲得合適且可開發之人類化抗體，親代兔抗體之輕鏈中之兩個半胱胺酸胺基酸殘基不得不分別經脯胺酸及天冬醯胺酸胺基酸殘基置換。除在給定解離速率範圍內外，存在於兔CDRL3之中間之絲胺酸殘基不得不經丙胺酸殘基置換。
已進一步發現在重鏈中於位置65、100g及105 (根據Kabat編號)處改變三個胺基酸殘基係有利的。
如本文使用之所有編號係基於Kabat可變域編號方案。
兔抗轉鐵蛋白抗體純系299顯示堪比抗轉鐵蛋白受體抗體128.1之性質之性質。此可見自下表。
| 起源 | 胞吞轉送負載[pg] | 胞吞轉送
%基底外側 | 總基底外側
[pg] | 總頂端
[pg] | 輸送總和
[pg] |
| mAb 128.1 | 2226 | 34 | 757 | 1229 | 1986 |
| 純系-299 | 2773 | 36 | 998 | 1346 | 2344 |
| 起源 | mAb 128.1之負載
% | mAb 128.1之總基底外側% | mAb 128.1之總頂端
% | mAb 128.1之輸送總和
% | EC50 [ng/mL] FACS hTfR-CHO |
| mAb 128.1 | 100 | 100 | 100 | 100 | 96 |
| 純系-299 | 125 | 132 | 110 | 118 | 275 |
| 起源 | 最大幾何平均hTfR-CHO | EC50 [ng/mL] FACS 食蟹猴TfR | 最大幾何平均食蟹猴TfR-CHO | EC50比率
食蟹猴/人類 | 最大比率
食蟹猴/人類 |
| mAb 128.1 | 78200 | 314 | 52100 | 3.3 | 0.6 |
| 純系299 | 55600 | 241 | 52000 | 0.9 | 1.0 |
| 起源 | BIAcore 解離速率huTfR [l/s] | BIAcore t1/2 huTfR [min] | BIAcore解離速率cyTfR [l/s] | BIAcore t1/2食蟹猴TfR [min] | 比率t1/2
人類/食蟹猴 |
| mAb 128.1 | 6.06E-04 | 19 | 5.47E-02 | 0.2 | 90.2 |
| 純系299 | 6.16E-04 | 19 | 2.77E-04 | 42 | 0.4 |
在下表中，顯示純系299之兔輕鏈可變域之人類化變體與純系299之兔重鏈可變域之人類化變體之組合之解離速率。結合配偶體係人類轉鐵蛋白受體(在25℃下測得)。
| VH
→
VL↓ | 0 (rb) | 1 | 2 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 11 | 12 |
| 0 (rb) | 4.34
E-04 | 9.08
E-04 | 8.06
E-04 | 7.72
E-04 | 6.63
E-04 | 5.15
E-04 | 4.06
E-04 | 9.01
E-04 | 9.05
E-04 | 9.21
E-04 |
| 1 | 5.69
E-03 | 1.00
E-03 | 1.00
E-03 | 1.00
E-03 | 1.00
E-03 | 7.52
E-03 | 3.19
E-03 | 6.94
E-03 | 1.00
E-03 | 1.00
E-03 |
| 2 | 1.25
E-03 | 2.86
E-03 | 2.75
E-03 | 2.41
E-03 | 1.87
E-03 | 1.31
E-03 | 1.01
E-03 | 3.99
E-03 | 3.85
E-03 | 6.35
E-03 |
| 3 | 1.32
E-03 | 4.31
E-03 | 3.84
E-03 | 3.16
E-03 | 2.82
E-03 | 1.45
E-03 | 1.00
E-03 | 4.17
E-03 | 5.65
E-03 | 5.86
E-03 |
| 4 | 1.36
E-03 | 2.56
E-03 | 2.63
E-03 | 2.38
E-03 | 1.87
E-03 | 1.25
E-03 | 7.88
E-04 | 2.70
E-03 | 3.88
E-03 | 3.11
E-03 |
| 5 | 1.94
E-03 | 2.71
E-03 | 2.62
E-03 | 2.53
E-03 | 1.66
E-03 | 1.35
E-03 | 1.07
E-03 | 3.50
E-03 | 4.56
E-03 | 5.82
E-03 |
| 6 | 1.90
E-03 | 5.38
E-03 | 5.55
E-03 | 4.64
E-03 | 3.06
E-03 | 1.97
E-03 | 1.40
E-03 | 6.83
E-03 | 6.71
E-03 | 7.05
E-03 |
| 7 | 4.63
E-03 | 7.33
E-03 | 7.50
E-03 | 6.97
E-03 | 5.63
E-03 | 3.66
E-03 | 2.31
E-03 | 7.61
E-03 | 7.81
E-03 | 7.71
E-03 |
| 8 | 1.39
E-03 | 4.85
E-03 | 3.94
E-03 | 3.78
E-03 | 3.01
E-03 | 1.72
E-03 | 1.16
E-03 | 5.23
E-03 | 5.52
E-03 | 5.31
E-03 |
| 9-
NY
A | 1.41
E-03 | 2.46
E-03 | 2.21
E-03 | 2.03
E-03 | 1.41
E-03 | 1.21
E-03 | 1.01
E-03 | 2.52
E-03 | 2.42
E-03 | 2.19
E-03 |
| 10 | 1.88
E-03 | 6.77
E-03 | 6.49
E-03 | 6.53
E-03 | 4.55
E-03 | 2.64
E-03 | 1.73
E-03 | 7.19
E-03 | 7.16
E-03 | 7.79
E-03 |
| 12 | 5.41
E-03 | 7.05
E-03 | 8.14
E-03 | 1.00
E-03 | 7.78
E-03 | 7.75
E-03 | 6.72
E-03 | 1.00
E-03 | 7.87
E-03 | 1.00
E-03 |
| 14 | 1.78
E-03 | 2.99
E-03 | 2.44
E-03 | 2.33
E-03 | 2.20
E-03 | 1.53
E-03 | 1.04
E-03 | 3.32
E-03 | 3.51
E-03 | 5.46
E-03 |
| 15 | 6.63
E-03 | 6.69
E-03 | 6.38
E-03 | 6.37
E-03 | 4.21
E-03 | 2.73
E-03 | 1.81
E-03 | 7.39
E-03 | 7.09
E-03 | 7.76
E-03 |
| 17 | 1.49
E-03 | 7.56
E-03 | 7.12
E-03 | 7.45
E-03 | 7.17
E-03 | 1.87
E-03 | 1.12
E-03 | 4.25
E-03 | 7.55
E-03 | 7.27
E-03 |
| VH→
VL↓ | 13 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23-DAN
G |
| 0 (rb) | 4.82
E-04 | 7.63
E-04 | 6.53
E-04 | 4.13
E-04 | 1.09
E-03 | 1.00
E-03 | 1.11
E-03 | 5.65
E-04 | 5.06
E-04 | 3.38
E-04 |
| 1 | 1.00
E-03 | 7.72
E-03 | 7.71
E-03 | 4.33
E-03 | 1.00
E-03 | 1.00
E-03 | 1.00
E-03 | 7.71
E-03 | 5.78
E-03 | 2.80
E-03 |
| 2 | 2.46
E-03 | 2.16
E-03 | 1.97
E-03 | 1.05
E-03 | 4.89
E-03 | 7.69
E-03 | 5.25
E-03 | 1.38
E-03 | 1.26
E-03 | 7.15
E-04 |
| 3 | 2.77
E-03 | 2.07
E-03 | 1.73
E-03 | 8.43
E-04 | 6.65
E-03 | 1.00
E-03 | 7.15
E-03 | 1.94
E-03 | 1.43
E-03 | 7.83
E-04 |
| 4 | 1.30
E-03 | 1.34
E-03 | 1.27
E-03 | 7.23
E-04 | 3.35
E-03 | 1.00
E-03 | 4.36
E-03 | 1.46
E-03 | 1.18
E-03 | 7.61
E-04 |
| 5 | 2.18
E-03 | 2.14
E-03 | 2.23
E-03 | 1.23
E-03 | 3.49
E-03 | 1.00
E-03 | 3.52
E-03 | 1.37
E-03 | 1.41
E-03 | 8.80
E-04 |
| 6 | 3.65
E-03 | 3.50
E-03 | 3.39
E-03 | 1.71
E-03 | 6.74
E-03 | 1.00
E-03 | 6.06
E-03 | 2.07
E-03 | 2.14
E-03 | 1.16
E-03 |
| 7 | 6.68
E-03 | 5.43
E-03 | 5.25
E-03 | 2.33
E-03 | 7.66
E-03 | 1.00
E-03 | 7.14
E-03 | 2.38
E-03 | 3.37
E-03 | 1.55
E-03 |
| 8 | 2.47
E-03 | 2.09
E-03 | 1.97
E-03 | 1.11
E-03 | 6.77
E-03 | 6.71
E-03 | 6.58
E-03 | 1.74
E-03 | 1.65
E-03 | 9.41
E-04 |
| 9-
NY
A | 1.39
E-03 | 1.42
E-03 | 1.36
E-03 | 9.34
E-04 | 2.21
E-03 | 6.17
E-03 | 1.89
E-03 | 1.13
E-03 | 1.26
E-03 | 7.69
E-04 |
| 10 | 5.89
E-03 | 3.99
E-03 | 4.24
E-03 | 1.88
E-03 | 7.46
E-03 | 1.00
E-03 | 7.05
E-03 | 2.11
E-03 | 2.09
E-03 | 1.20
E-03 |
| 12 | 7.85
E-03 | 7.64
E-03 | 7.54
E-03 | 2.84
E-03 | 1.00
E-03 | 1.00
E-03 | 1.00
E-03 | 7.54
E-03 | 6.44
E-03 | 1.87
E-03 |
| 14 | 2.22
E-03 | 1.94
E-03 | 1.75
E-03 | 1.05
E-03 | 3.00
E-03 | 7.96
E-03 | 2.39
E-03 | 1.03
E-03 | 1.12
E-03 | 7.33
E-04 |
| 15 | 7.11
E-03 | 6.03
E-03 | 4.77
E-03 | 1.56
E-03 | 7.58
E-03 | 1.00
E-03 | 7.85
E-03 | 1.92
E-03 | 1.79
E-03 | 9.86
E-04 |
| 17 | 3.39
E-03 | 1.69
E-03 | 1.66
E-03 | 9.88
E-04 | 5.30
E-03 | 1.00
E-03 | 4.57
E-03 | 9.97
E-04 | 9.38
E-04 | 6.94
E-04 |
選擇VH23及VL9之組合作為用於進一步改造以發展結合位點之起始點，該結合位點反映相對於結合至人類轉鐵蛋白受體，抗體128.1對食蟹猴轉鐵蛋白受體之結合性質更緊密。
在下表中，比較顯示VH23與VL9之不同例示性變體及不同其他可變域人類化變體針對人類轉鐵蛋白受體之解離速率(根據實例14在25℃下測得)。
| | VK9- | VK9- | VK9- | VK9- | VH567- | VK12- | VK17- | VK15- | VK2- | VK6- |
| | NYA | SYA | GYS | CYS | P…NYA | HYS | TYS | AYS | SYS | SYS |
| VH23-DANG | 8.83E-03 | | 3.96E-03 | | 4.62E-03 | 1.53E-02 | 2.29E-03 | 6.97E-03 | 5.22E-03 | 1.32E-02 |
| VH23-DASG | 3.95E-02 | 4.84E-04 | 3.73E-03 | 2.33E-03 | | | | | | |
| VH23-DAQG | 1.49E-02 | 7.55E-04 | 3.75E-03 | 1.51E-03 | | | | | | |
| VH9-DANG | 1.82E-03 | | | 6.52E-03 | | | | | 4.02E-02 | |
| VH9-DAQG | 1.25E-03 | | | | | | | | | |
| VH7-DANG | | | | | | | | | | 3.08E-02 |
參考：128.1 = 7.78E-02 (針對食蟹猴轉鐵蛋白受體測得)。
在下表中，比較顯示VH23及VL9之不同例示性變體之動力學資料(根據實例13測得)。
| 在25 ℃下之BIAcore 分析 | TfR | kd [s-1
] | ka [s-1
M-1
] | kD [M] |
| mAb 128.1 | 食蟹猴 | 7.33E-02 | 5.41E+05 | 1.36E-07 |
| VH23-DASG/VL09-NYA | 人類 | 3.95E-02 | 8.83E+04 | 4.47E-07 |
| VH23-DAQG/VL09-NYA | 人類 | 1.37E-02 | 1.21E+05 | 1.13E-07 |
| VH23-DANG/VL09-NYA | 人類 | 8.83E-03 | 1.55E+05 | 5.72E-08 |
在下表中，顯示純系494之鼠類輕鏈可變域之人類化變體與純系494之鼠類重鏈可變域之人類化變體之組合之解離速率。結合配偶體係人類轉鐵蛋白受體。
| VH→
VL↓ | 0 (mu) | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 0 (mu) | 1.36E-04 | 1.37E-04 | 1.56E-04 | 1.48E-04 | 1.77E-04 |
| 1 | 3.70E-04 | 4.10E-04 | 4.54E-04 | 4.76E-04 | 4.48E-04 |
| 2 | 3.64E-04 | 3.99E-04 | 4.26E-04 | 4.15E-04 | 4.38E-04 |
| 3 | 3.39E-04 | 3.86E-04 | 4.30E-04 | 4.34E-04 | 4.52E-04 |
| 4 | 5.42E-04 | 6.57E-04 | 7.03E-04 | 6.83E-04 | 7.05E-04 |
| 5 | 5.44E-04 | 6.84E-04 | 7.17E-04 | 7.17E-04 | 7.28E-04 |
| 6 | 3.81E-04 | 4.86E-04 | 5.27E-04 | 5.50E-04 | 5.52E-04 |
| 7 | 2.32E-04 | 2.74E-04 | 2.99E-04 | 3.06E-04 | 3.26E-04 |
更詳細地，在一個態樣中，本發明(部分)基於以下發現：如本文報告之抗轉鐵蛋白受體抗體可用作血腦障壁穿梭模組以跨血腦障壁將腦效應子實體遞送至腦內。在某些實施例中，該血腦障壁穿梭模組係特異性結合至轉鐵蛋白受體之單價結合實體。如本文報告之抗轉鐵蛋白受體抗體在用作血腦障壁穿梭模組時係有用的，例如，用於診斷或治療神經失調症諸如阿茲海默症、帕金森氏症及阿茲海默症伴帕金森氏症共發病。
已發現包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域之抗體相對於人類轉鐵蛋白受體反映鼠類抗體128.1相對於食蟹猴轉鐵蛋白受體之結合性質(關於結合解離速率)。
因此，如本文報告之一個態樣係結合至人類轉鐵蛋白受體(huTfR)及食蟹猴轉鐵蛋白受體(cyTfR)之經分離之抗體，其中該抗體具有針對人類轉鐵蛋白受體之藉由表面電漿共振測得之介於0.1 l/s與0.005 l/s之間之解離速率。
如本文報告之另一態樣係結合至人類轉鐵蛋白受體(huTfR)及食蟹猴轉鐵蛋白受體(cyTfR)之抗體或抗體片段之用途，其中該抗體具有藉由針對人類轉鐵蛋白受體之藉由表面電漿共振測得之介於0.1 l/s與0.005 l/s之間之解離速率，其用於跨血腦障壁遞送治療實體。
在一個實施例中，該解離速率係在500、250、125、62.5、31.25、15.625及0 nM下測得。
在一個實施例中，該解離速率係使用表面電漿共振晶片及生物素表面及補充250 mM氯化鈉之1xPBS之運行緩衝液在10 µL/min流動速率下測得。
在一個實施例中，該結合係監測180秒且該解離係監測600秒。
在一個實施例中，該解離速率係於BIAcore T200上測得。
在一個實施例中，該解離速率係介於0.08 l/s至0.008 l/s之間。
在所有態樣之一個實施例中，該解離速率係在25℃下測得。
在所有態樣之一個實施例中，該解離速率係在25℃下測得之解離速率。
如本文報告之一個態樣係特異性結合至人類轉鐵蛋白受體(huTfR)及食蟹猴轉鐵蛋白受體(cyTfR)之抗轉鐵蛋白受體抗體，其包含i)衍生自SEQ ID NO: 01之重鏈可變域之人類化重鏈可變域及ii)衍生自SEQ ID NO: 26之輕鏈可變域之人類化輕鏈可變域，其中該輕鏈可變域於位置80處具有脯胺酸胺基酸殘基(P)；於位置91處具有天冬醯胺酸胺基酸殘基(N)及於位置93處具有丙胺酸胺基酸殘基(A) (根據Kabat編號)。
在一個實施例中，該抗體在重鏈可變域中於位置100g處進一步具有絲胺酸胺基酸殘基(S) (根據Kabat編號)。
在一個實施例中，該抗體在重鏈可變域中於位置65處進一步具有絲胺酸胺基酸殘基(S) (根據Kabat編號)。
在一個實施例中，該抗體在重鏈可變域中於位置105處進一步具有麩醯胺酸胺基酸殘基(Q) (根據Kabat編號)。
如本文報告之一個態樣係特異性結合至人類轉鐵蛋白受體(huTfR)及食蟹猴轉鐵蛋白受體(cyTfR)之抗轉鐵蛋白受體抗體，其包含i)衍生自SEQ ID NO: 01之重鏈可變域之人類化重鏈可變域及ii)衍生自SEQ ID NO: 26之輕鏈可變域之人類化輕鏈可變域，其中該抗體針對人類轉鐵蛋白受體之解離速率(以單位l/s計)等於或小於(即，最多)抗轉鐵蛋白受體抗體128.1針對食蟹猴轉鐵蛋白受體l/s之解離速率，藉此該等解離速率係藉由表面電漿共振測定，且藉此該抗轉鐵蛋白受體抗體128.1具有SEQ ID NO: 64之重鏈可變域及SEQ ID NO: 65之輕鏈可變域。
在一個實施例中，該抗體針對人類轉鐵蛋白受體之解離速率(以單位l/s計)i)等於或小於(即，最多)抗轉鐵蛋白受體抗體128.1針對食蟹猴轉鐵蛋白受體之解離速率(以單位l/s計)及ii)等於或大於(即，至少)抗轉鐵蛋白受體抗體128.1針對食蟹猴轉鐵蛋白受體之解離速率(以單位l/s計)之5%。
如本文報告之一個態樣係特異性結合至人類轉鐵蛋白受體(huTfR)及食蟹猴轉鐵蛋白受體(cyTfR)之抗轉鐵蛋白受體抗體。在某些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體
結合至人類轉鐵蛋白受體(huTfR)及食蟹猴轉鐵蛋白受體(cyTfR)；
針對人類轉鐵蛋白受體之解離速率(以單位l/s計)等於或小於(即，最多)抗轉鐵蛋白受體抗體128.1針對該食蟹猴轉鐵蛋白受體之解離速率，藉此該等解離速率係藉由表面電漿共振測定，且藉此該抗轉鐵蛋白受體抗體128.1具有SEQ ID NO: 64之重鏈可變域及SEQ ID NO: 65之輕鏈可變域；
以介於0.1 l/s至0.005 l/s之間且包括0.1 l/s及0.005 l/s)之解離速率結合人類轉鐵蛋白受體。
在一個態樣中，本文提供抗轉鐵蛋白受體抗體，其包含選自以下之至少一、二、三、四、五或六個HVR：(a)包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO: 71、72或73之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO: 71或72或73之胺基酸序列之HVR-H3。在一個態樣中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之HVR-H3。在一個態樣中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體包含含有SEQ ID NO: 71或72或73之胺基酸序列之HVR-H3。在另一實施例中，該抗體包含含有SEQ ID NO: 71或72或73之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3。在另一實施例中，該抗體包含含有SEQ ID NO: 71或72或73之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3；及包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2。在另一實施例中，該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明之抗體包含：(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO: 71或72或73之胺基酸序列之HVR-H3，及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3。
在上文實施例之任一項中，抗轉鐵蛋白受體抗體係經人類化。在一個實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含如上文實施例中任一項之HVR，且進一步包含接受者人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共同框架。
在另一態樣中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列且具有與包含SEQ ID NO: 24之重鏈可變域(VH)序列之抗體約相同之解離速率。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、嵌入或刪除，但包含該序列之抗轉鐵蛋白受體抗體保留以相同解離速率結合至該轉鐵蛋白受體之能力。在某些實施例中，總計1至10個胺基酸已於SEQ ID NO: 24中經取代、嵌入及/或刪除。在某些實施例中，取代、嵌入或刪除發生於HVR外之區中(即，發生於FR中)。視需要，該抗轉鐵蛋白受體抗體包含SEQ ID NO: 24之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，該VH包含選自以下之一、二或三個HVR：(a)包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中，提供抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 37之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)且具有與包含SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域(VL)序列之抗體約相同之解離速率。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、嵌入或刪除，但包含該序列之抗轉鐵蛋白受體抗體保留以相同解離速率結合至該轉鐵蛋白受體之能力。在某些實施例中，總計1至10個胺基酸已於SEQ ID NO: 37中經取代、嵌入及/或刪除。在某些實施例中，該等取代、嵌入或刪除發生於HVR外之區中(即，發生於FR中)。視需要，該抗轉鐵蛋白受體抗體包含於SEQ ID NO: 37中之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，該VL包含選自以下之一、二或三個HVR：(a)包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中，提供抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗體包含如於上文提供之實施例中任一項中之VH及如於上文提供之實施例中任一項中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO: 24及SEQ ID NO: 37中之VH及VL序列，其等包括彼等序列之轉譯後修飾。
在本發明之另一態樣中，上文實施例中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體係單株抗體，其包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體係抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，該抗體係全長抗體，例如，完整IgG1抗體或其他抗體類別或如本文定義之同型。
在所有態樣之一個實施例中，該抗體係偶合至治療化合物。
在所有態樣之另一實施例中，該抗體係偶合至成像劑或標記。
在另一實施例中，該抗體係多特異性抗體且該治療化合物視需要形成該多特異性抗體之一部分。在一個此實施例中，該多特異性抗體包含結合TfR之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在一個此態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1 (BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、tau、載脂蛋白E (ApoE)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白、(PrP)、富白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ-分泌酶、死亡受體6 (DR6)、類澱粉前驅蛋白(APP)、p75神經營養素受體(p75NTR)、葡萄糖腦苷脂酶及卡斯蛋白酶6。在另一實施例中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1兩者。在另一實施例中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ兩者。在另一實施例中，該多特異性抗體結合TfR及α突觸核蛋白兩者。在另一實施例中，該多特異性抗體結合TfR及CD20兩者。在另一實施例中，該多特異性抗體結合TfR及葡萄糖腦苷脂酶兩者。在另一實施例中，該治療化合物係神經失調症藥物。
在上文實施例之一個態樣中，本發明提供包含前述抗體中之任何一者及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。
在上文實施例之一個態樣中，本發明提供前述抗體中之任何一者，其用作藥劑。
在上文實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任何一者在製造用於治療神經失調症之藥劑中之用途。在一個實施例中，該神經失調症係選自由以下組成之群：神經病變失調症、神經退化性疾病、癌症、眼疾病失調症、癲癇症、溶體儲積症、類澱粉變性症、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為異常及CNS炎症。
在上文實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任何一者，其用於治療神經失調症。在一個實施例中，該神經失調症係選自由以下組成之群：神經病變失調症、神經退化性疾病、癌症、眼疾病失調症、癲癇症、溶體儲積症、類澱粉變性症、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為異常及CNS炎症。
在上文實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任何一者，其用於跨BBB輸送一或更多種化合物。
在上文實施例之另一態樣中，提供前述抗體中之任何一者在製造用於跨BBB輸送一或更多種化合物之藥劑中之用途。
在上文實施例之一個態樣中，提供跨個體之BBB輸送化合物之方法，其包括使前述抗體中之任何一者曝露於該BBB使得該抗體跨該BBB輸送偶合至該抗體之化合物。在一個實施例中，該BBB係於人類個體中。在一個實施例中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個實施例中，該治療劑量係TfR飽和之劑量。在另一實施例中，該抗體之投與係以經校準以最小化抗體投與之急性臨床症狀之劑量及/或劑量頻率。
在上文實施例之另一態樣中，提供增加個體之CNS曝露於化合物之方法，其包括使前述抗體中之任何一者曝露於BBB使得該抗體跨該BBB輸送偶合至該抗體之化合物。在一個實施例中，該BBB係於人類個體中。在一個實施例中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個實施例中，該治療劑量係TfR飽和之劑量。在另一實施例中，該抗體之投與係以經校準以最小化抗體投與之急性臨床症狀之劑量及/或劑量頻率。
在上文實施例之一個態樣中，提供增加向個體投與之化合物於CNS中之滯留時間之方法，其包括使前述抗體中之任何一者曝露於BBB使得該化合物於CNS中之滯留時間增加。在一個實施例中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個實施例中，該治療劑量係TfR飽和之劑量。在另一實施例中，該抗體之投與係以經校準以最小化抗體投與之急性臨床症狀之劑量及/或劑量頻率。
在上文實施例之一個態樣中，提供治療哺乳動物之神經失調症之方法，其包括以前述抗體中之任何一者治療該哺乳動物。在一個實施例中，該神經失調症係選自由以下組成之群：神經病變失調症、神經退化性疾病、癌症、眼疾病失調症、癲癇症、溶體儲積症、類澱粉變性症、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為失調症及CNS炎症。在一個實施例中，該神經失調症係於人類個體中。在一個實施例中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個實施例中，該治療劑量係TfR飽和之劑量。在另一實施例中，該抗體之投與係以經校準以最小化抗體投與之急性臨床症狀之劑量及/或劑量頻率。
在一個實施例中，抗體係針對選自以下之一或更多種性質加以修飾：該抗體Fc區之效應子功能；該抗體之互補活化功能及該抗體對TfR之親和性。
在一個實施例中，該性質係該抗體Fc區之效應子功能。
在一個實施例中，該性質係該抗體之互補活化功能。
在一個實施例中，該性質係抗體對TfR之親和性。
在一個實施例中，該效應子功能或互補活化功能係相對於相同同型之野生型抗體已加以減少或消除。在一個實施例中，該效應子功能係藉由選自以下之方法加以減少或消除：減少該抗體之醣化；將該抗體同型修飾成天然具有減少或消除之效應子功能之同型；及修飾Fc區。
在一個實施例中，該效應子功能係藉由減少抗體之醣化而減少或消除。在一個實施例中，該抗體之醣化係藉由選自以下之方法來減少：在不允許野生型醣化之環境下產生該抗體；移除已存在於該抗體上之碳水化合物基團；及修飾該抗體使得不發生野生型醣化。
在一個實施例中，該抗體之醣化係藉由在不允許野生型醣化之環境下產生該抗體而減少，諸如於非哺乳動物細胞產生系統中產生或其中該抗體係以合成方式產生。在一個實施例中，該抗體係於非哺乳動物細胞產生系統中產生。在另一實施例中，該抗體係以合成方式產生。
在一個實施例中，該抗體之醣化係藉由修飾該抗體使得不發生野生型醣化而減少，諸如其中該抗體之Fc區包含於位置297處之突變使得該位置處之野生型天冬醯胺酸殘基經於該位置處干擾醣化之另一胺基酸置換。
在一個實施例中，該效應子功能係藉由Fc區之至少一種修飾而減少或消除。在一個實施例中，該效應子功能或互補活化功能係藉由刪除該Fc區之所有或部分，或藉由改造該抗體使得其不包括用於效應子功能或互補活化功能之Fc區或非Fc區而減少或消除。在一個實施例中，該Fc區之至少一種修飾係選自：Fc區之點突變以減少與選自下列位置之一或更多個Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333,30 335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439；該Fc區之點突變以減少與選自下列位置之C1q之結合：270、322、329及321；消除該Fc區中之一些或所有，及在CH1域之位置132處之點突變。在一個實施例中，該修飾係該Fc區之點突變以減少與選自下列位置之C1q：270、322、329及321之結合。在另一實施例中，該修飾係消除該Fc區中之一些或所有。在另一實施例中，互補觸發功能係藉由刪除該Fc區之所有或部分，或藉由改造該抗體使得其不包括參與互補路徑之Fc區而減少或消除。在一個實施例中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一實施例中，該抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除該抗體對該互補路徑之活化。在一個實施例中，該修飾係CH1區之點突變以減少與C3結合。在一個實施例中，該點突變係位於位置132處(參見，例如，Vidarte等人，J. Biol. Chem. 276(2001)38217-38223)。
在上文實施例之一個態樣中，該抗體對TfR之親和性係相對於不具有對TfR之減弱之親和性之相同同型之野生型抗體衡量而言經減小。在一個此態樣中，該抗體針對TfR具有約1 pM至約100 μM之K
D
或IC
50
。
在一個實施例中，如本文報告之抗體係效應子功能沉默。在一個實施例中，該抗體沒有效應子功能。在一個實施例中，該抗體係人類IgG1子類之抗體且在兩個重鏈中具有突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU指數編號)。
在一個實施例中，該抗體係：
a)人類子類IgG1之全長抗體，或
b)人類子類IgG4之全長抗體，或
c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類IgG1之全長抗體，
d)具有突變S228P、L235E及視需要P329G之人類子類IgG4之全長抗體，
e)在兩個重鏈中具有突變L234A、L235A及P329G及在一個重鏈中具有突變T366W及S354C及在各自其他重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體，或
f)在兩個重鏈中具有突變S228P、L235E及視需要P329G及在一個重鏈中具有突變T366W及S354C及在各自其他重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG4之全長抗體。
在上文實施例之一個態樣中，本發明提供包含前述抗體中之任何一者及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。
在上文實施例之一個態樣中，本發明提供前述抗體中之任何一者，其用作藥劑。
在上文實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任何一者在製造用於治療神經失調症之藥劑中之用途。在一個實施例中，該神經失調症係選自由以下組成之群：神經病變失調症、神經退化性疾病、癌症、眼疾病失調症、癲癇症、溶體儲積症、類澱粉變性症、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為異常及CNS炎症。
在上文實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任何一者，其用於治療神經失調症。在一個實施例中，該神經失調症係選自由以下組成之群：神經病變失調症、神經退化性疾病、癌症、眼疾病失調症、癲癇症、溶體儲積症、類澱粉變性症、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為異常及CNS炎症。
在上文實施例之另一態樣中，本發明提供前述抗體中之任何一者，其用於跨BBB輸送一或更多種化合物。
在上文實施例之另一態樣中，提供前述抗體中之任何一者在製造用於跨BBB輸送一或更多種化合物之藥劑中之用途。
在上文實施例之一個態樣中，提供跨個體之BBB輸送化合物之方法，其包括使前述抗體中之任何一者曝露於該BBB使得該抗體跨該BBB輸送偶合至該抗體之化合物。在一個實施例中，該BBB係於人類個體中。在一個實施例中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個實施例中，該治療劑量係TfR飽和之劑量。在另一實施例中，該抗體之投與係以經校準以最小化抗體投與之急性臨床症狀之劑量及/或劑量頻率。
在上文實施例之另一態樣中，提供增加個體之CNS對化合物之曝露之方法，其包括使前述抗體中之任何一者曝露於BBB使得該抗體跨該BBB輸送偶合至該抗體之化合物。在一個實施例中，該BBB係於人類個體中。在一個實施例中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個實施例中，該治療劑量係TfR飽和之劑量。在另一實施例中，該抗體之投與係以經校準以最小化抗體投與之急性臨床症狀之劑量及/或劑量頻率。
在上文實施例之一個態樣中，提供增加向個體投與之化合物於CNS中之滯留時間之方法，其包括使前述抗體中之任何一者曝露於BBB使得該化合物於CNS中之滯留時間增加。在一個實施例中，該BBB係於人類個體中。在一個實施例中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個實施例中，該治療劑量係TfR飽和之劑量。在另一實施例中，該抗體之投與係以經校準以最小化抗體投與之急性臨床症狀之劑量及/或劑量頻率。
在上文實施例之一個態樣中，提供治療哺乳動物之神經失調症之方法，其包括以前述抗體中之任何一者治療該哺乳動物。在一個實施例中，該神經失調症係選自由以下組成之群：神經病變失調症、神經退化性疾病、癌症、眼疾病失調症、癲癇症、溶體儲積症、類澱粉變性症、病毒或微生物疾病、局部缺血、行為失調症及CNS炎症。在另一此態樣中，該神經失調症係於人類個體中。在一個實施例中，偶合至該化合物之抗體係以治療劑量投與。在一個實施例中，該治療劑量係TfR飽和之劑量。在另一實施例中，該抗體之投與係以經校準以最小化抗體投與之急性臨床症狀之劑量及/或劑量頻率。
在另一實施例中，提供一種減小向個體投與之化合物之廓清率之方法，其中該化合物係偶合至以低親和性結合至TfR之抗體，使得該化合物之廓清率減小。
在另一實施例中，本文提供一種使有效化合物於個體CNS中之藥物動力學及/或藥效動力學最佳化之方法，其中該化合物係偶合至以低親和性結合至TfR之抗體，且該抗體係經選擇使得其在偶合至該化合物後對TfR之親和性導致一定量之結合至該化合物之抗體跨BBB輸送，該量使該化合物於CNS中之藥物動力學及/或藥效動力學最佳化。
在另一態樣中，上文之態樣及實施例中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體可以單一或組合形式併入下文部分1至5中所描述之特徵中之任何一者：
1.抗體親和性 在一個實施例中，Kd係藉由放射性標記抗原結合分析(RIA)測定。在一個實施例中，RIA係以所感興趣抗體之Fab形式及其抗原進行。例如，Fab對抗原之溶液結合親和性係藉由將Fab與最小濃度之(
125
I)標記抗原在滴定系列之未標記抗原之存在下平衡化，然後用塗覆抗Fab抗體之盤捕獲經結合之抗原進行量測(參見，例如，Chen, Y.等人，J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881)。為建立用於該分析之條件，MICROTITER
®
多孔盤(Thermo Scientific)用5 µg/mL含於50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs)塗覆過夜，且接著在室溫(約23℃)下用含於PBS中之2% (w/v)牛血清白蛋白阻斷二至五個小時。在非吸附盤(Nunc #269620)中，使100 pM或26 pM [
125
I]-抗原與所感興趣Fab之連續稀釋液混合(例如，與Presta, L.G.等人，Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599中之抗VEGF抗體、Fab-12之評估一致)。接著將所感興趣Fab培養過夜；然而，該培養可繼續較長時間(例如，約65小時)以確保達成平衡。此後，將混合物轉移至捕獲盤以用於在室溫下培養(例如，培養一個小時)。然後移除該溶液並用含於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20
®
)將該盤清洗八次。當該盤乾燥時，添加150 µL/孔之閃爍體(MICROSCINT-20
TM
；Packard)，且將該等盤於TOPCOUNT
TM
γ計數器(Packard)上計數十分鐘。選擇各Fab之產生小於或等於最大結合之20%之濃度以用於競爭性結合分析中。
根據另一實施例，Kd係使用BIACORE
®
表面電漿共振分析量測。例如，在25℃下用固定化抗原CM5晶片以~10反應單元(RU)進行使用BIACORE
®
-2000或BIACORE
®
-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)之分析。在一個實施例中，根據供應商指示，以N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5, BIACORE, Inc.)。用10 mM醋酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 µg/mL (~0.2 µM)，接著以5 µL/min之流動速率注射，以達成約10個反應單元(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。為得到動力學量測值，在25℃下以約25 µL/min之流動速率將Fab之兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)注射於具有0.05%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20
TM
)表面活性劑(PBST)之PBS中。結合速率(k
on
)及解離速率(k
off
)係使用簡單一對一朗繆爾(Langmuir)結合模式(BIACORE
®
評估軟體3.2版)藉由同時擬合結合及解離感測圖來計算。將平衡解離常數(KD)計算為k
off
/k
on
之比率(參見，例如，Chen, Y.等人，J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881)。若藉由上文之表面電漿共振分析測得結合速率超過10
6
M
-1
s
-1
，則該結合速率可藉由使用螢光淬滅技術測定，該技術量測在25 °C下，在如於分光計(諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌光析管之8000系列SLM-AMINCO
TM
分光光度計(ThermoSpectronic))中量測之漸增濃度之抗原之存在下，含於PBS(pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發= 295 nm；發射= 340 nm，16 nm帶通)之增大或減小。
2.抗體片段 在某些實施例中，本文提供之抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於) Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)
2
、Fv及scFv片段及下文描述之其他片段。為回顧某些抗體片段，參見Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134。為回顧scFv片段，參見，例如，Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore (編)，Springer-Verlag, New York (1994)，第269至315頁；亦參見WO 93/16185；US 5,571,894及US 5,587,458。為討論包含救難受體結合抗原決定基殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')
2
片段，參見US 5,869,046。
雙功能抗體係具有兩個二價或雙特異性抗原-結合位點之抗體片段。參見，例如，EP 0 404097；WO 1993/01161；Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (20039 129-134)中。
單域抗體係包含抗體之重鏈可變域之所有或部分或抗體之輕鏈可變域之所有或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體係人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見，例如，US 6,248,516)。
如本文描述，抗體片段可藉由各種技術(包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解消化及藉由重組宿主細胞(例如，大腸桿菌或噬菌體)產生)製得。
3.嵌合抗體及人類化抗體 在某些實施例中，本文提供之抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體描述(例如)於US 4,816,567；及Morrison, S.L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體係「類別轉換之」抗體，其中該類別或子類已變化自親代抗體之類別或子類。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，非人類抗體係經人類化以減小對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和性。通常，人類化抗體包含一或更多個可變域，其中HVR(例如，CDR或其部分)係衍生自非人類抗體，且FR (或其部分) 係衍生自人類抗體序列。人類化抗體視需要將亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基係經來自非人類抗體(例如，其中衍生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改善抗體特異性或親和性。
人類化抗體及其製法回顧(例如)於Almagro, J.C.及Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633中，且進一步描述(例如)於Riechmann, I.等人，Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；US 5, 821,337、US 7,527,791、US 6,982,321及US 7,087,409；Kashmiri, S.V.等人，Methods 36 (2005) 25-34 (描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (描述「重整」)；Dall’Acqua, W.F.等人，Methods 36 (2005) 43-60(描述「FR穿梭」)；及Osbourn, J.等人，Methods 36 (2005) 61-68及Klimka, A.等人，Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (描述以FR穿梭之「導向選擇」方法)中。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(參見，例如，Sims, M.J.等人，J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308；衍生自特定子組之人類抗體之輕鏈或重鏈可變區之共同序列之框架區(參見，例如，Carter, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及Presta, L.G.等人，J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632)；人類成熟(經體細胞突變)之框架區或人類生殖系列框架區(參見，例如，Almagro, J.C.及Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633)；及衍生自篩選FR庫之框架區(參見，例如，Baca, M.等人，J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及Rosok, M.J.等人，J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)。
4.多特異性抗體 在某些實施例中，本文提供之抗體係多特異性抗體，例如，雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，該等結合特異性中之一者係用於轉鐵蛋白受體及另一者係用於任何其他抗原。雙特異性抗體亦可用以將細胞毒性劑定位至表現轉鐵蛋白受體之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein, C.及Cuello, A.C., Nature305 (1983)537-540、WO 93/08829及Traunecker, A.等人，EMBO J.10 (1991) 3655-3659)，及「節至孔中(knob-in-hole)」改造(參見，例如，US 5,731,168)。多特異性抗體亦可藉由以下方式製得：改造用於製造抗體Fc-異二聚物分子之靜電轉向效應(WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段(參見，例如，US 4,676,980及Brennan, M.等人，Science229 (1985) 81-83)；使用白胺酸拉鍊以產生雙特異性抗體(參見，例如，Kostelny, S.A.等人，J. Immunol.148 (1992) 1547-1553；使用「雙功能抗體」技術製造雙特異性抗體片段(參見，例如，Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (1993) 6444-6448)；及使用單鏈Fv (scFv)二聚物(參見，例如，Gruber, M等人，J. Immunol.152 (1994) 5368-5374)；且製備如描述(例如)於Tutt, A.等人，J. Immunol.147 (1991) 60-69)中之三特異性抗體。
具有三個或更多個功能抗原結合位點之經改造抗體(包括「章魚抗體」)亦包括於本文中(參見，例如，US 2006/0025576)。
本文之抗體或片段亦包括包含結合至轉鐵蛋白受體及另一不同抗原之抗原結合位點之「雙重作用Fab」或「DAF」(例如，參見，US 2008/0069820)。
本文之抗體或片段亦包括描述於WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2010/145793中之多特異性抗體。
在如本文報告之所有態樣之一個實施例中，該抗轉鐵蛋白受體抗體係雙特異性抗體。
如本文報告之一個態樣係二價雙特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原之抗體之第一輕鏈及第一重鏈，及
b)特異性結合至第二抗原之抗體之第二輕鏈及第二重鏈，其中第二輕鏈及第二重鏈之可變域VL及VH係經彼此置換，
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
a)情況下之抗體不含有如b)情況下所報告之修飾且a)情況下之重鏈及輕鏈係經分離之鏈。
在b)情況下之抗體中，
於輕鏈內
可變輕鏈域VL係經該抗體之可變重鏈域VH置換，
及
於重鏈內
可變重鏈域VH係經該抗體之可變輕鏈域VL置換。
在一個實施例中，
i)在a)情況下之第一輕鏈之恆定域CL中，位置124處之胺基酸(根據Kabat編號)係經帶正電之胺基酸取代，且其中在a)情況下之第一重鏈之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸(根據Kabat EU指數編號)係經帶負電之胺基酸取代，
或
ii)在b)情況下之第二輕鏈之恆定域CL中，位置124處之胺基酸(根據Kabat編號)係經帶正電之胺基酸取代，且其中在b)情況下之第二重鏈之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸(根據Kabat EU指數編號)係經帶負電之胺基酸取代。
在一個較佳實施例中
i)在a)情況下之第一輕鏈之恆定域CL中，位置124處之胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H) (根據Kabat編號) (在一個較佳實施例中獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R))取代，且其中在a)情況下之第一重鏈之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D) (根據Kabat EU指數編號)取代，
或
ii)在b)情況下之第二輕鏈之恆定域CL中，位置124處之胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H) (根據Kabat編號) (在一個較佳實施例中獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R))取代，且其中在b)情況下之第二重鏈之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D) (根據Kabat EU指數編號)取代。
在一個實施例中，在第二重鏈之恆定域CL中，位置124及123處之胺基酸係經K (根據Kabat EU指數編號)取代。
在一個實施例中，在第二輕鏈之恆定域CH1中，位置147及213處之胺基酸係經E (根據Kabat之EU指數編號)取代。
在一個較佳實施例中，在第一輕鏈之恆定域CL中，位置124及123處之胺基酸係經K取代，及在第一重鏈之恆定域CH1中，位置147及213處之胺基酸係經E (根據Kabat EU指數編號)取代。
在一個實施例中，在第二重鏈之恆定域CL中，位置124及123處之胺基酸係經K取代，且其中在第二輕鏈之恆定域CH1中，位置147及213處之胺基酸係經E取代，及在第一輕鏈之可變域VL中，位置38處之胺基酸係經K取代，在第一重鏈之可變域VH中，位置39處之胺基酸係經E取代，在第二重鏈之可變域VL中，位置38處之胺基酸係經K取代，及在第二輕鏈之可變域VH中，位置39處之胺基酸係經E (根據Kabat EU指數編號)取代。
如本文報告之一個態樣係二價雙特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原之抗體之第一輕鏈及第一重鏈，及
b)特異性結合至第二抗原之抗體之第二輕鏈及第二重鏈，其中第二輕鏈及第二重鏈之可變域VL及VH係經彼此置換，且其中第二輕鏈及第二重鏈之恆定域CL及CH1係經彼此置換，
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
a)情況下之抗體不含有如於b)情況下所報告之修飾且a)情況下之重鏈及輕鏈係經分離之鏈。
在b)情況下之抗體中，
於輕鏈內
可變輕鏈域VL係經該抗體之可變重鏈域VH置換，且恆定輕鏈域CL係經該抗體之恆定重鏈域CH1置換；
及
於重鏈內
可變重鏈域VH係經該抗體之可變輕鏈域VL置換，且恆定重鏈域CH1係經該抗體之恆定輕鏈域CL置換。
如本文報告之一個態樣係二價雙特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原之抗體之第一輕鏈及第一重鏈，及
b)特異性結合至第二抗原之抗體之第二輕鏈及第二重鏈，其中第二輕鏈及第二重鏈之恆定域CL及CH1係經彼此置換，
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
a)情況下之抗體不含有如於b)情況下所報告之修飾且a)情況下之重鏈及輕鏈係經分離之鏈。
在b)情況下之抗體中，
於輕鏈內
恆定輕鏈域CL係經該抗體之恆定重鏈域CH1置換；
且於重鏈內
恆定重鏈域CH1係經該抗體之恆定輕鏈域CL置換。
如本文報告之一個態樣係多特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈組成之全長抗體，及
b)特異性結合至一至四個其他抗原(即，第二及/或第三及/或第四及/或第五抗原，較佳特異性結合至一個其他抗原，即，第二抗原)之一、二、三或四個單鏈Fab片段，
其中b)情況下之該等單鏈Fab片段係經由肽連接子於該全長抗體之重鏈或輕鏈之C端或N端處融合至a)情況下之該全長抗體，
其中第一抗原或其他抗原中之一者係人類轉鐵蛋白受體。
在一個實施例中，一或兩個相同之結合至第二抗原之單鏈Fab片段係經由肽連接子於該全長抗體之重鏈或輕鏈之C端處融合至該全長抗體。
在一個實施例中，一或兩個相同之結合至第二抗原之單鏈Fab片段係經由肽連接子於該全長抗體之重鏈之C端處融合至該全長抗體。
在一個實施例中，一或兩個相同之結合至第二抗原之單鏈Fab片段係經由肽連接子於該全長抗體之輕鏈之C端處融合至該全長抗體。
在一個實施例中，兩個相同之結合至第二抗原之單鏈Fab片段係經由肽連接子於該全長抗體之各重鏈或輕鏈之C端處融合至該全長抗體。
在一個實施例中，兩個相同之結合至第二抗原之單鏈Fab片段係經由肽連接子於該全長抗體之各重鏈之C端處融合至該全長抗體。
在一個實施例中，兩個相同之結合至第二抗原之單鏈Fab片段係經由肽連接子於該全長抗體之各輕鏈之C端處融合至該全長抗體。
如本文報告之一個態樣係三價雙特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈組成之全長抗體，
b)第一多肽，其由以下組成：
ba)抗體重鏈可變域(VH)，
或
bb)抗體重鏈可變域(VH)及抗體恆定域1 (CH1)，
其中該第一多肽係以其VH域之N端經由肽連接子融合至該全長抗體之兩個重鏈中之一者之C端，
c)第二多肽，其由以下組成：
ca)抗體輕鏈可變域(VL)，
或
cb)抗體輕鏈可變域(VL)及抗體輕鏈恆定域(CL)，
其中該第二多肽係以VL域之N端經由肽連接子融合至該全長抗體之兩個重鏈中之另一者之C端，
及
其中第一多肽之抗體重鏈可變域(VH)與第二多肽之抗體輕鏈可變域(VL)一起形成特異性結合至第二抗原之抗原結合位點，
且
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
在一個實施例中，b)情況下之多肽之抗體重鏈可變域(VH)及c)情況下之多肽之抗體輕鏈可變域(VL)係經由鏈間二硫橋藉由在下列位置間引入二硫鍵而相連並穩定化：
i)重鏈可變域位置44至輕鏈可變域位置100，或
ii)重鏈可變域位置105至輕鏈可變域位置43，或
iii)重鏈可變域位置101至輕鏈可變域位置100 (總根據Kabat EU指數編號)。
引入非自然二硫橋以穩定化之技術描述(例如)於WO 94/029350，Rajagopal, V.等人，Prot. Eng. (1997) 1453-59；Kobayashi, H.等人，Nuclear Medicine & Biology，第25卷，(1998) 387-393；或Schmidt, M.等人，Oncogene (1999) 18 1711-1721中。在一個實施例中，在b)及c)情況下之多肽之可變域間之可選二硫鍵係介於重鏈可變域位置44與輕鏈可變域位置100之間。在一個實施例中，在b)及c)情況下之多肽之可變域間之可選二硫鍵係介於重鏈可變域位置105與輕鏈可變域位置43 (總根據Kabat編號)之間。在一個實施例中，在單鏈Fab片段之可變域VH與VL間無可選二硫鍵穩定化之三價雙特異性抗體係較佳的。
如本文報告之一個態樣係三特異性或四特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原之全長抗體之第一輕鏈及第一重鏈，及
b)特異性結合至第二抗原之全長抗體之第二(經修飾之)輕鏈及第二(經修飾之)重鏈，其中可變域VL及VH係經彼此置換，及/或其中恆定域CL及CH1係經彼此置換，且
c)其中特異性結合至一或兩個其他抗原(即，結合至第三及/或第四抗原)之一至四個抗原結合肽係經由肽連接子融合至a)及/或b)之輕鏈或重鏈之C端或N端，
其中第一抗原或第二抗原或其他抗原中之一者係人類轉鐵蛋白受體。
a)情況下之抗體不含有如於b)情況下所報告之修飾且a)情況下之重鏈及輕鏈係經分離之鏈。
在一個實施例中，該三特異性或四特異性抗體包含c)情況下之一或兩個特異性結合至一或兩個其他抗原之抗原結合肽。
在一個實施例中，該等抗原結合肽係選自由scFv片段及scFab片段組成之群。
在一個實施例中，該等抗原結合肽係scFv片段。
在一個實施例中，該等抗原結合肽係scFab片段。
在一個實施例中，該等抗原結合肽係融合至a)及/或b)之重鏈之C端。
在一個實施例中，該三特異性或四特異性抗體包含c)情況下之一或兩個特異性結合至一個其他抗原之抗原結合肽。
在一個實施例中，該三特異性或四特異性抗體包含c)情況下之兩個相同之特異性結合至第三抗原之抗原結合肽。在一個較佳實施例中，此等兩個相同之抗原結合肽係經由相同肽連接子融合至a)及b)之重鏈之C端。在一個較佳實施例中，兩個相同抗原結合肽係scFv片段或scFab片段。
在一個實施例中，該三特異性或四特異性抗體包含c)情況下之兩個特異性結合至第三及第四抗原之抗原結合肽。在一個實施例中，該等兩個抗原結合肽係經由相同肽連接子融合至a)及b)之重鏈之C端。在一個較佳實施例中該等兩個抗原結合肽係scFv片段或scFab片段。
如本文報告之一個態樣係雙特異性四價抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原(且包含兩個Fab片段)之抗體之兩個輕鏈及兩個重鏈，
b)特異性結合至第二抗原之抗體之兩個額外之Fab片段，其中該等額外之Fab片段係經由肽連接子融合至a)之重鏈之C端或N端，
且
其中在Fab片段中，進行下列修飾：
i)在a)之兩個Fab片段中或在b)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，及/或恆定域CL及CH1係經彼此置換，
或
ii)在a)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，及恆定域CL及CH1係經彼此置換，
且
在b)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，或恆定域CL及CH1係經彼此置換，
或
iii)在a)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，或恆定域CL及CH1係經彼此置換，
且
在b)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，及恆定域CL及CH1係經彼此置換，
或
iv)在a)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，及在b)之兩個Fab片段中，恆定域CL及CH1係經彼此置換，
或
v)在a)之兩個Fab片段中，恆定域CL及CH1係經彼此置換，及在b)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
在一個實施例中，該等額外之Fab片段係經由肽連接子融合至a)之重鏈之C端，或融合至a)之重鏈之N端。
在一個實施例中，該等額外之Fab片段係經由肽連接子融合至a)之重鏈之C端。
在一個實施例中，該等額外之Fab片段係經由肽連接子融合至a)之重鏈之N端。
在一個實施例中，於Fab片段中進行下列修飾：
i)在a)之兩個Fab片段中或在b)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，
及/或
恆定域CL及CH1係經彼此置換。
在一個實施例中，於Fab片段中進行下列修飾：
i)在a)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，
及/或
恆定域CL及CH1係經彼此置換。
在一個實施例中，於Fab片段中進行下列修飾：
i)在a)之兩個Fab片段中，恆定域CL及CH1係經彼此置換。
在一個實施例中，於Fab片段中進行下列修飾：
i)在b)之兩個Fab片段中，可變域VL及VH係經彼此置換，
及/或
恆定域CL及CH1係經彼此置換。
在一個實施例中，於Fab片段中進行下列修飾：
i)在b)之兩個Fab片段中，恆定域CL及CH1係經彼此置換。
如本文報告之一個態樣係雙特異性四價抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原且包含第一VH-CH1域對之第一抗體之(經修飾之)重鏈，其中該第一抗體之第二VH-CH1域對之N端係經由肽連接子融合至該重鏈之C端，
b) a)之該第一抗體之兩個輕鏈，
c)特異性結合至第二抗原且包含第一VH-CL域對之第二抗體之(經修飾之)重鏈，其中該第二抗體之第二VH-CL域對之N端係經由肽連接子融合至該重鏈之C端，及
d) c)之該第二抗體之兩個(經修飾之)輕鏈，各包含CL-CH1域對，
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
如本文報告之一個態樣係雙特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原之第一全長抗體之重鏈及輕鏈，及
b)特異性結合至第二抗原之第二全長抗體之重鏈及輕鏈，其中該重鏈之N端係經由肽連接子連接至該輕鏈之C端，
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
a)情況下之抗體不含有如於b)情況下所報告之修飾且重鏈及輕鏈係經分離之鏈。
如本文報告之一個態樣係雙特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈組成之全長抗體，及
b)特異性結合至第二抗原之Fv片段，其包含VH
2
域及VL
2
域，其中兩個域係經由二硫鍵彼此相連，
其中僅VH
2
域或VL
2
域係經由肽連接子融合至特異性結合至第一抗原之全長抗體之重鏈或輕鏈，
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
在雙特異性中，a)情況下之重鏈及輕鏈係經分離之鏈。
在一個實施例中，VH
2
域或VL
2
域中之另一者係非經由肽連接子融合至特異性結合至第一抗原之全長抗體之重鏈或輕鏈。
在如本文報告之所有態樣中，第一輕鏈包含VL域及CL域且第一重鏈包含VH域、CH1域、拉鍊區、CH2域及CH3域。
如本文報告之一個態樣係雙特異性三價抗體，其包含：
a)兩個特異性結合至第一抗原之Fab片段，
b)一個特異性結合至第二抗原之CrossFab片段，其中CH1及CL域彼此交換，
c)一個包含第一Fc區重鏈及第二Fc區重鏈之Fc區，
其中兩個Fab片段之CH1域之C端係連接至重鏈Fc區多肽之N端，且
其中CrossFab片段之CL域之C端係連接至Fab片段中之一者之VH域之N端，且
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
如本文報告之一個態樣係雙特異性三價抗體，其包含：
a)兩個特異性結合至第一抗原之Fab片段，
b)一個特異性結合至第二抗原之CrossFab片段，其中CH1及CL域彼此交換，
c)一個包含第一Fc區重鏈及第二Fc區重鏈之Fc區，
其中第一Fab片段之CH1域之C端係連接至重鏈Fc區多肽中之一者之N端及CrossFab片段之CL域之C端係連接至其他重鏈Fc區多肽之N端，且
其中第二Fab片段之CH1域之C端係連接至第一Fab片段之VH域之N端或連接至CrossFab片段之VH域之N端，且
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
如本文報告之一個態樣係雙特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈組成之全長抗體，及
b)特異性結合至第二抗原之Fab片段，其包含含有重鏈片段及輕鏈片段之VH
2
域及VL
2
域，其中
於輕鏈片段內
可變輕鏈域VL
2
係經該抗體之可變重鏈域VH
2
置換，
及
於重鏈片段內
可變重鏈域VH
2
係經該抗體之可變輕鏈域VL
2
置換，
其中重鏈Fab片段係嵌入於全長抗體之重鏈中之一者之CH1域與全長抗體之各自Fc區之間，且輕鏈Fab片段之N端係結合至全長抗體之輕鏈之C端，該全長抗體之輕鏈與其中已嵌入重鏈Fab片段之全長抗體之重鏈配對，且
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
如本文報告之一個態樣係雙特異性抗體，其包含：
a)特異性結合至第一抗原且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈組成之全長抗體，及
b)特異性結合至第二抗原之Fab片段，其包含含有重鏈片段及輕鏈片段之VH
2
域及VL
2
域，其中
於輕鏈片段內
可變輕鏈域VL
2
係經該抗體之可變重鏈域VH
2
置換，
及
於重鏈片段內
可變重鏈域VH
2
係經該抗體之可變輕鏈域VL
2
置換，
其中Fab片段之重鏈片段之C端係結合至全長抗體之重鏈中之一者之N端且Fab片段之輕鏈片段之C端係結合至全長抗體之輕鏈之N端，該全長抗體之輕鏈與其中結合Fab片段之重鏈片段之全長抗體之重鏈配對，且
其中第一抗原或第二抗原係人類轉鐵蛋白受體。
在所有態樣之一個實施例中，如本文報告之抗體係多特異性抗體，其需要至少兩個重鏈多肽之異二聚化，且其中抗體特異性結合至人類轉鐵蛋白受體及第二非人類轉鐵蛋白受體抗原。
用於CH3修飾以支援異二聚化之數種方法已描述(例如)於WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291，其等以引用之方式包括於本文中。通常，於此項技術中已知的方法中，第一重鏈之CH3域及第二重鏈之CH3域兩者皆以互補之方式經改造使得包含一個經改造之CH3域之重鏈無法再與具有相同結構之另一重鏈同二聚化(例如，CH3經改造之第一重鏈無法再與另一CH3經改造之第一重鏈同二聚化；及CH3經改造之第二重鏈無法再與另一CH3經改造之第二重鏈同二聚化)。藉此包含一個經改造之CH3域之重鏈被迫與另一包含CH3域(其以互補之方式經改造)之重鏈異二聚化。就本發明之此實施例而言，第一重鏈之CH3域及第二重鏈之CH3域係以互補之方式藉由胺基酸取代而經改造，使得第一重鏈及第二重鏈被迫異二聚化，而第一重鏈及第二重鏈無法再同二聚化(例如，由於空間位阻之原因)。
將上文引用並包括之此項技術中已知用於支援重鏈異二聚化之不同方法視為用於本發明之多特異性抗體中之不同替代方法，本發明之多特異性抗體包含衍生自特異性結合至第一抗原之第一抗體之「非交叉Fab區」及衍生自特異性結合至第二抗原之第二抗體之「交叉Fab區」與上文針對本發明描述之特定胺基酸取代之組合。
如本文報告之多特異性抗體之CH3域可藉由「節至孔中(knob-into-hole)」技術改變，該技術以若干實例詳細描述(例如)於WO 96/027011，Ridgway, J.B.等人，Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及Merchant, A.M.等人，Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681中。在此方法中，兩個CH3域之相互作用表面係經改變以增強含有此等兩個CH3域之兩個重鏈之異二聚化。該等(兩個重鏈之)兩個CH3域中之各者可為「節」，而另一者係「孔」。二硫橋之引入進一步穩定化異二聚物(Merchant, A.M.等人，Nature Biotech. 16 (1998) 677-681；Atwell, S.等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)並提高產率。
在一個較佳實施例中，如本文報告之多特異性抗體包含「節鏈」之CH3域中之T366W突變及「孔鏈」之CH3域中之T366S、L368A、Y407V突變(根據Kabat EU指數編號)。亦可使用CH3域間之額外之鏈間二硫橋 (Merchant, A.M.等人，Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)，例如，藉由將Y349C突變引入至「節鏈」之CH3域內並將E356C突變或S354C突變引入至「孔鏈」之CH3域內。因此在另一較佳實施例中，如本文報告之多特異性抗體包含兩個CH3域中之一者中之Y349C及T366W突變及兩個CH3域中之另一者中之E356C、T366S、L368A及Y407V突變或如本文報告之多特異性抗體包含兩個CH3域中之一者中之Y349C及T366W突變及兩個CH3域中之另一者中之S354C、T366S、L368A及Y407V突變(一個CH3域中之額外之Y349C突變及另一CH3域中之額外之E356C或S354C突變形成鏈間二硫橋) (根據Kabat EU指數編號)。
而且或者或另外可使用如由EP 1 870 459A1描述之其他節至孔中技術。在一個實施例中，如本文報告之多特異性抗體包含「節鏈」之CH3域中之R409D及K370E突變及「孔鏈」之CH3域中之D399K及E357K突變(根據Kabat EU指數編號)。
在一個實施例中，如本文報告之多特異性抗體包含「節鏈」之CH3域中之T366W突變及「孔鏈」之CH3域中之T366S、L368A及Y407V突變且此外「節鏈」之CH3域中之R409D及K370E突變及「孔鏈」之CH3域中之D399K及E357K突變(根據Kabat EU指數編號)。
在一個實施例中，如本文報告之多特異性抗體包含兩個CH3域中之一者中之Y349C及T366W突變及兩個CH3域中之另一者中之S354C、T366S、L368A及Y407V突變，或如本文報告之多特異性抗體包含兩個CH3域中之一者中之Y349C及T366W突變及兩個CH3域中之另一者中之S354C、T366S、L368A及Y407V突變且另外「節鏈」之CH3域中之R409D及K370E突變及「孔鏈」之CH3域中之D399K及E357K突變(根據Kabat EU指數編號)。
除「節至孔中技術」外，此項技術中已知其他用於修飾多特異性抗體之重鏈之CH3域以強迫異二聚化之技術。本文中將此等技術，尤其描述於WO 96/27011, WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954及WO 2013/096291中者視為「節至孔中技術」之替代方法組合如本文報告之多特異性抗體。
在如本文報告之多特異性抗體之一個實施例中，使用描述於EP 1870459中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。此方法基於於第一與第二重鏈兩者間之CH3/CH3-域-界面中之特異性胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸。
因此，此實施例係關於如本文報告之多特異性抗體，其中在該抗體之三級結構中，第一重鏈之CH3域及第二重鏈之CH3域形成位於各自抗體CH3域間之界面，其中第一重鏈之CH3域及第二重鏈之CH3域之各自胺基酸序列各包含一組位於該抗體之三級結構中之該界面內之胺基酸，其中來自該組位於一個重鏈之CH3域中之界面中之胺基酸之第一胺基酸經帶正電之胺基酸取代及來自該組位於其他重鏈之CH3域中之界面中之胺基酸之第二胺基酸經帶負電之胺基酸取代。本文將此實施例之多特異性抗體亦稱為「CH3(+/-)經改造之多特異性抗體」(其中縮寫「+/-」表示引入各自CH3域內之帶相反電荷之胺基酸)。
在如本文報告之該CH3(+/-)經改造之多特異性抗體之一個實施例中，帶正電之胺基酸係選自K、R及H，及帶負電之胺基酸係選自E或D。
在如本文報告之該CH3(+/-)經改造之多特異性抗體之一個實施例中，帶正電之胺基酸係選自K及R，及帶負電之胺基酸係選自E或D。
在如本文報告之該CH3(+/-)經改造之多特異性抗體之一個實施例中，帶正電之胺基酸係K，及帶負電之胺基酸係E。
在如本文報告之該CH3(+/-)經改造之多特異性抗體之一個實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置409處之胺基酸R係經D取代及在位置處之胺基酸K係經E取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置399處之胺基酸D係經K取代及位置357處之胺基酸E係經K (根據Kabat EU指數編號)取代。
在如本文報告之多特異性抗體之一個實施例中，使用描述於WO2013/157953中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。在如本文報告之該多特異性抗體之一個實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置366處之胺基酸T係經K取代，及於其他重鏈之CH3域中，位置351處之胺基酸L係經D (根據Kabat EU指數編號)取代。在如本文報告之該多特異性抗體之另一實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置366處之胺基酸T係經K取代及位置351處之胺基酸L係經K取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置351處之胺基酸L係經D (根據Kabat EU指數編號)取代。
在如本文報告之該多特異性抗體之另一實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置366處之胺基酸T係經K取代及位置351處之胺基酸L係經K取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置351處之胺基酸L係經D (根據Kabat EU指數編號)取代。另外，下列取代中之至少一者包含於其他重鏈之CH3域中：位置349處之胺基酸Y係經E取代，位置349處之胺基酸Y係經D取代及位置368處之胺基酸L係經E (根據Kabat EU指數編號)取代。在一個實施例中，位置368處之胺基酸L係經E (根據Kabat EU指數編號)取代。
在如本文報告之多特異性抗體之一個實施例中，使用描述於WO 2012/058768中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。在如本文報告之該多特異性抗體之一個實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置351處之胺基酸L係經Y取代及位置407處之胺基酸Y係經A取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置366處之胺基酸T係經A取代及位置409處之胺基酸K係經F (根據Kabat EU指數編號)取代。在另一實施例中，除上述取代外，於其他重鏈之CH3域中，位置411 (最初T)、399 (最初D)、400 (最初S)、405 (最初F)、390 (最初N)及392 (最初K)處之胺基酸中之至少一者係經取代(根據Kabat EU指數編號)。較佳取代係：
- 藉由選自N、R、Q、K、D、E及W (根據Kabat EU指數編號)之胺基酸取代於位置411處之胺基酸T，
- 藉由選自R、W、Y及K (根據Kabat EU指數編號)之胺基酸取代於位置399處之胺基酸D，
- 藉由選自E、D、R及K (根據Kabat EU指數編號)之胺基酸取代於位置400處之胺基酸S，
- 藉由選自I、M、T、S、V及W (根據Kabat EU指數編號)之胺基酸取代於位置405處之胺基酸F；
- 藉由選自R、K及D (根據Kabat EU指數編號)之胺基酸取代於位置390處之胺基酸N；及
- 藉由選自V、M、R、L、F及E (根據Kabat EU指數編號)之胺基酸取代於位置392處之胺基酸K。
在如本文報告之該多特異性抗體(根據WO 2012/058768改造)之另一實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置351處之胺基酸L係經Y取代及位置407處之胺基酸Y係經A取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置366處之胺基酸T係經V取代及位置409處之胺基酸K係經F (根據Kabat EU指數編號)取代。在如本文報告之該多特異性抗體之另一實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置407處之胺基酸Y係經A取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置366處之胺基酸T係經A取代及位置409處之胺基酸K係經F (根據Kabat EU指數編號)取代。在該最後一個上述實施例中，於該其他重鏈之CH3域中，位置392處之胺基酸K係經E取代，位置411處之胺基酸T係經E取代，位置399處之胺基酸D係經R取代及位置400處之胺基酸S係經R (根據Kabat EU指數編號)取代。
在如本文報告之多特異性抗體之一個實施例中，使用描述於WO 2011/143545中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。在如本文報告之該多特異性抗體之一個實施例中，於位置368及/或409 (根據Kabat EU指數編號)處引入兩個重鏈之CH3域中之胺基酸修飾。
在如本文報告之多特異性抗體之一個實施例中，使用描述於WO 2011/090762中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。WO 2011/090762係關於根據「節至孔中」技術之胺基酸修飾。在如本文報告之該CH3(KiH)經改造之多特異性抗體之一個實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置366處之胺基酸T係經W取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置407處之胺基酸Y係經A (根據Kabat EU指數編號)取代。在如本文報告之該CH3(KiH)經改造之多特異性抗體之另一實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置366處之胺基酸T係經Y取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置407處之胺基酸Y係經T (根據Kabat EU指數編號)取代。
在如本文報告之多特異性抗體(其具有IgG2同型)之一個實施例中，使用描述於WO 2011/090762中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。
在如本文報告之多特異性抗體之一個實施例中，使用描述於WO 2009/089004中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。在如本文報告之該多特異性抗體之一個實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置392處之胺基酸K或N係經帶負電之胺基酸(在一個較佳實施例中，經E或D，在一個較佳實施例中，經D)取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置399處之胺基酸D、位置356處之胺基酸E或D或位置357處之胺基酸E係經帶正電之胺基酸取代(在一個較佳實施例中，K或R，在一個較佳實施例中，經K，在一個較佳實施例中，位置399或356處之胺基酸經K取代) (根據Kabat EU指數編號)。在一個其他實施例中，除上述取代外，於一個重鏈之CH3域中，位置409處之胺基酸K或R係經帶負電之胺基酸(在一個較佳實施例中，經E或D，在一個較佳實施例中，經D) (根據Kabat EU指數編號)取代。在一個甚至其他實施例中，除上述取代外或或者上述取代，於一個重鏈之CH3域中，位置439處之胺基酸K及/或位置370處之胺基酸K彼此獨立地經帶負電之胺基酸(在一個較佳實施例中，經E或D，在一個較佳實施例中，經D) (根據Kabat EU指數編號)取代。
在如本文報告之多特異性抗體之一個實施例中，使用描述於WO 2007/147901中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。在如本文報告之該多特異性抗體之一個實施例中，於一個重鏈之CH3域中，位置253處之胺基酸K係經E取代，位置282處之胺基酸D係經K取代及位置322處之胺基酸K係經D取代，且於其他重鏈之CH3域中，位置239處之胺基酸D係經K取代，位置240處之胺基酸E係經K取代及位置292處之胺基酸K係經D (根據Kabat EU指數編號)取代。
在如本文報告之多特異性抗體之一個實施例中，使用描述於WO 2007/110205中之方法以支援多特異性抗體之第一重鏈及第二重鏈之異二聚化。
在如本文報告之所有態樣及實施例之一個實施例中，該多特異性抗體係雙特異性抗體或三特異性抗體。在本發明之一個較佳實施例中，該多特異性抗體係雙特異性抗體。
在如本文報告之所有態樣之一個實施例中，該抗體係二價或三價抗體。在一個實施例中，該抗體係二價抗體。
在如本文報告之所有態樣之一個實施例中，該多特異性抗體具有IgG型抗體之恆定域結構。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體具有人類子類IgG1或具有具有突變L234A及L235A之人類子類IgG1。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體係具有人類子類IgG2。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體係具有人類子類IgG3。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體係具有人類子類IgG4或具有具有額外之突變S228P之人類子類IgG4。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體係具有人類子類IgG1或人類子類IgG4。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體係具有具有突變L234A及L235A (根據Kabat EU指數編號)之人類子類IgG1。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體係具有具有突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU指數編號)之人類子類IgG1。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體係具有具有突變S228P及L235E (根據Kabat EU指數編號)之人類子類IgG4。在如本文報告之所有態樣之一個其他實施例中，該多特異性抗體之特徵在於該多特異性抗體係具有具有突變S228P、L235E及P329G (根據Kabat EU指數編號)之人類子類IgG4。
在如本文報告之所有態樣之一個實施例中，包含包括如本文指定之CH3域之重鏈之抗體包含額外之C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU指數編號)。在如本文報告之所有態樣之一個實施例中，包含包括如本文指定之CH3域之重鏈之抗體包含額外之C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU指數編號)。
5.抗體變體 在某些實施例中，預期本文提供之抗體之胺基酸序列變體。例如，可能需要改善抗體之結合親和性及/或其他生物性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由將適當之修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列內或藉由肽合成製得。此等修飾包括(例如)於該抗體之胺基酸序列內之殘基之刪除及/或嵌入及/或取代。可作出刪除、嵌入及取代之任何組合以達成最終構築體，只要該最終構築體具有所需之特性(例如，抗原結合特性)即可。
a)取代、嵌入及刪除變體 在某些實施例中，提供具有一或更多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代突變形成之所感興趣位點包括HVR及FR。保守取代係以「保守取代」之標題顯示於表1中。更實質性之變化係以「例示性取代」之標題提供於表1中，且如參考胺基酸側鏈類別進一步描述於下文中。可將胺基酸取代引入所感興趣抗體內並針對所需活性(例如，保留/改善之抗原結合、減小之免疫原性或改善之ADCC或CDC)篩選產物。
表 1 | 原始 殘基 | 例示性 取代 | 保守 取代 |
| Ala (A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg (R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn (N) | Gln；His；Asp；Lys；Arg | Gln |
| Asp (D) | Glu；Asn | Glu |
| Cys (C) | Ser；Ala | Ser |
| Gln (Q) | Asn；Glu | Asn |
| Glu (E) | Asp；Gln | Asp |
| Gly (G) | Ala | Ala |
| His (H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile (I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 | Leu |
| Leu (L) | 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys (K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met (M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe (F) | Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Tyr |
| Pro (P) | Ala | Ala |
| Ser (S) | Thr | Thr |
| Thr (T) | Val；Ser | Ser |
| Trp (W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr (Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val (V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 | Leu |
胺基酸可根據常見側鏈性質進行分組：
(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)鹼性：His、Lys、Arg；
(5)影響鏈位向之殘基：Gly、Pro；
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將涉及將此等類別中之一者之成員交換為另一類別。
取代變體之一種類型涉及取代親代抗體(例如，人類化或人類抗體)之一或更多個高度可變區殘基。通常，經選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體將於某些生物性質(例如，增強之親和性、減小之免疫原性)方面具有修飾(例如，改善)及/或將具有親代抗體之大體上經保留之某些生物性質。例示性取代變體係親和性成熟抗體，其可合宜地(例如)使用基於噬菌體顯示之親和性成熟技術(諸如彼等本文描述者)來產生。簡而言之，一或更多個HVR殘基係經突變且該等變體抗顯示於噬菌體上體並針對特定生物活性(例如，結合親和性)進行篩選。
可於HVR中作出改變(例如，取代)(例如)以改善抗體親和性。可於HVR 「熱點」(即，由在體細胞突變過程期間經受高頻突變之密碼子編碼之殘基 (參見，例如，Chowdhury, P.S.，Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196))及/或接觸抗原之殘基中作出此等改變，且測試所得變體VH或VL之殘基之結合親和性。藉由構築且再選擇自輔助庫(secondary library)之親和性成熟已描述(例如)於Hoogenboom, H.R.等人之 Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37中。在親和性成熟之一些實施例中，藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈混組或寡核苷酸定向誘變)中之任何一者將多樣性引入針對成熟選擇之可變基因內。然後建立輔助庫。然後篩選該庫以識別具有所需親和性之任何抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及由HVR定向之方法，其中隨機化若干HVR殘基(例如，每次4至6個殘基)。涉及抗原結合之HVR殘基可(例如)使用丙胺酸掃描誘變或建模來特定識別。特定言之，通常將CDR-H3及CDR-L3作為目標。
在某些實施例中，取代、嵌入或刪除可發生於一或更多個HVR內，只要此等改變不大體上減小抗體結合抗原之能力即可。例如，可於HVR中作出不大體上減小結合親和性之保守改變(例如，如本文提供之保守取代)。此等改變可(例如)在於HVR中接觸抗原之殘基之外部。在上文提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未經改變或含有不超過一、二或三個胺基酸取代。
適用於識別抗體之可經靶向以誘變之殘基或區域之方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham, B.C.及Wells, J.A.，Science 244 (1989) 1081-1085描述。在此方法中，殘基或目標殘基(例如，帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)之群經識別且經中性或帶負電之胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)置換以判定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可於該等胺基酸位置處引入證實對初始取代功能敏感之其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合體之晶體結構識別抗體與抗原間之接觸點。可將此等接觸殘基及相鄰殘基作為目標或作為用於取代之候選者進行消除。變體可經篩選以判定其等是否含有所需之性質。
胺基酸序列嵌入包括長度介於一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽之範圍內之胺基端及/或羧基端融合，及單一或多個胺基酸殘基之序列內嵌入。端嵌入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他嵌入變體包括將抗體之N端或C端融合至酶(例如，針對ADEPT)或增加抗體之血清半衰期之多肽。
b)醣化變體 在某些實施例中，本文提供之抗體係經改變以增大或減小該抗體之醣化程度。藉由改變胺基酸序列使得建立或移除一或更多個醣化位點可便利地完成抗體之醣化位點之添加或刪除。
在抗體包含Fc區之情況下，連接至該抗體之碳水化合物可經改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支、雙觸寡醣，其通常藉由N鍵聯連接至Fc區之CH2域之Asn297 (參見，例如，Wright, A.及Morrison, S.L.，TIBTECH 15 (1997) 26-32)。該寡醣可包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯基葡萄胺糖(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc之海藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中之寡醣作出修飾以產生具有某些經改善之性質之抗體變體。
在一個實施例中，提供具有缺乏(直接或間接)連接至Fc區之海藻糖之碳水化合物結構之抗體變體。例如，此抗體中之海藻糖之量可為1%至80%；1%至65%；5%至65%或20%至40%。例如，海藻糖之量係藉由相對於如藉由MALDI-TOF質譜儀測得之連接至Asn 297之所有醣結構(例如，複合體、混合物及高甘露糖結構)之總數，計算在Asn297處之糖鏈內之海藻糖之平均量而測定，如WO 2008/077546中所描述。Asn297係指在Fc區中位於約位置297 (Fc區殘基之EU編號)處之天冬醯胺酸殘基；然而，Asn297亦可因抗體中之輕微序列變化而位於位置297之約± 3個胺基酸上游或下游(即，在位置294與300間)。此等海藻糖化變體可具有改善之ADCC功能。參見，例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。涉及「去海藻糖化」或「海藻糖缺乏」抗體變體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki, A.等人，J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249；Yamane-Ohnuki, N.等人，Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622。可產生去海藻糖化抗體之細胞系之實例包括蛋白質海藻糖化中缺乏Lec13 CHO細胞(Ripka, J.等人，Arch. Biochem. Biophys.249 (1986) 533-545；US 2003/0157108及WO 2004/056312，尤其於實例11處)，敲除細胞系(諸如α-1,6-海藻糖轉移酶基因、FUT8)，敲除CHO細胞(參見，例如，Yamane-Ohnuki, N.等人，Biotech. Bioeng.87 (2004) 614-622；Kanda, Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；及WO2003/085107)。
進一步提供具有平分型寡醣之抗體變體，例如，其中連接至抗體之Fc區之雙觸寡醣係藉由GlcNAc平分。此等抗體變體可具有減少之海藻糖化及/或改善之ADCC功能。此等抗體變體之實例描述(例如)於WO 2003/011878；US 6,602,684及US 2005/0123546中。亦提供具有至少一個連接至Fc區之寡醣中之半乳糖殘基之抗體變體。此等抗體變體可具有改善之CDC功能。此等抗體變體描述(例如)於WO 1997/30087；WO 1998/58964及WO 1999/22764中。
c) Fc區變體 在某些實施例中，可將一或更多種胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區內，藉此產生Fc區變體。該Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或更多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如，取代)。
在某些實施例中，本發明預期具有一些但非所有效應子功能之抗體變體，該等效應子功能使該抗體變體成為其中該抗體活體內之半衰期係重要的應用所需之候選者，然而某些效應子功能(諸如互補及ADCC)係非必要的或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之減小/損耗。例如，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保該抗體缺乏FcγR結合(因此，很可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於調節ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現Fc(RIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現匯總於Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492之第464頁上之表3中。活體外分析以評定所感興趣分子之ADCC活性之非限制性實例描述於US 5,500,362 (參見，例如，Hellstrom, I.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及Hellstrom, I.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502)；US 5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361)中。或者，可採用非放射性分析方法，參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96
®
非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI。適用於此等分析之效應子細胞包括末梢血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，所感興趣分子之ADCC活性可活體內例如於動物模型(諸如揭示於Clynes, R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656中之動物模型)來評估。亦可進行C1q結合分析以證實抗體無法結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見，例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定互補活化，可進行CDC分析(參見，例如，Gazzano-Santoro, H.等人，J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S.等人，Blood 101 (2003) 1045-1052；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743)。FcRn結合及活體內廓清率/半衰期測定亦可使用此項技術中已知的方法來進行(參見，例如，Petkova, S.B.等人，Int. Immunol. 18(2006) 1759-1769)。
具有減少之效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329 (US 6,737,056)中之一或更多者之取代。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩個或更多者處具有取代之Fc突變體，其等包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂之「DANA」 Fc突變體(US 7,332,581)。
描述某些具有改善或減少之結合至FcR之抗體變體(參見，例如，US 6,737,056；WO 2004/056312及Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。
在某些實施例中，抗體變體包含具有一或更多個改善ADCC之胺基酸取代(例如，於Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號))之Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中作出導致改變之(即，改善或減少之) C1q結合及/或互補依賴性細胞毒性(CDC)之改變，例如，如描述於US 6,194,551、WO 99/51642及Idusogie, E.E.等人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184中。
具有增加之半衰期及改善之與負責將母體IgG轉移至胎兒之結合(Guyer, R.L.等人，J. Immunol. 117 (1976) 587-593及Kim, J.K.等人，J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)之新生Fc受體(FcRn)之抗體描述於US2005/0014934中。彼等抗體包含其中具有一或更多個取代之Fc區，該等取代改善Fc區對FcRn之結合。此等Fc變體包括彼等於Fc區殘基中之一或更多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc區殘基434之取代(US 7,371,826)。
亦參見涉及Fc區變體之其他實例之Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821及WO 94/29351。
d) 經半胱胺酸改造之抗體變體 在某些實施例中，可能需要產生經半胱胺酸改造之抗體例如「硫Mab (thioMAb)」，其中抗體之一或更多個殘基係經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，該等經取代之殘基出現於該抗體之可接近位點。如本文進一步描述，藉由以半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此放置於該抗體之可接近位點且可用以將該抗體結合至其他部分諸如藥物部分或連接子-藥物部分，以產生免疫結合物。在某些實施例中，下列殘基中之任何一者或更多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。可產生經半胱胺酸改造之抗體，如描述(例如)於US 7,521,541中。
e)抗體衍生物 在某些實施例中，本文提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之額外非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而在製造中可具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或非分支鏈。連接至抗體之聚合物之數量可變化，且若連接超過一個聚合物，則其等可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數量及/或類型可基於包括(但不限於)以下之考量來決定：抗體欲改善之特定性質或功能；該抗體衍生物是否將在已定義之條件下用於療法中等。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由曝露於放射下而經選擇性加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，該非蛋白質部分係碳奈米管(Kam, N.W.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。該放射可具有任何波長，且包括(但不限於)不傷害普通細胞但會將該非蛋白質部分加熱至殺死鄰近抗體-非蛋白質部分之細胞之溫度之波長。
B.血腦障壁穿梭模組 在所有態樣之一個實施例中，該抗體係具有至少一種針對轉鐵蛋白受體之結合特異性及至少一種針對治療目標之結合特異性之多特異性抗體。在一個實施例中，該抗體包含結合轉鐵蛋白受體之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一實施例中，該腦抗原係選自由以下組成之群：Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、α-突觸核蛋白、CD20、葡萄糖腦苷脂酶或類澱粉前驅蛋白(APP)。在一個較佳實施例中，該多特異性抗體結合以下兩者：
i)轉鐵蛋白受體及Aβ，或
ii)轉鐵蛋白受體及CD20，或
iii)轉鐵蛋白受體及α-突觸核蛋白，或
iv)轉鐵蛋白受體及磷酸化tau，或
v)轉鐵蛋白受體及HER2，或
vi)轉鐵蛋白受體及葡萄糖腦苷脂酶。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域及至少一對針對Aβ形成結合位點之SEQ ID NO: 81之重鏈可變域及SEQ ID NO: 82之輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域及至少一對針對人類CD20形成結合位點之SEQ ID NO: 79之重鏈可變域及SEQ ID NO: 80之輕鏈可變域之雙特異性抗體。在一個實施例中，該重鏈可變區包含以除白胺酸外之任何胺基酸置換Kabat位置11之胺基酸殘基。在一個實施例中，該取代包含以非極性胺基酸置換Kabat位置11之胺基酸殘基。在一個較佳實施例中，該取代包含以選自由纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸及苯丙胺酸組成之群之胺基酸殘基置換SEQ ID NO: 79之重鏈可變域中之Kabat位置11之胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之SEQ ID NO: 83之重鏈可變域及SEQ ID NO: 84之輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 85之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 86之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 87之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 88之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 89之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 90之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 91之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 92之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 93之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 94之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點及針對人類葡萄糖腦苷脂酶形成結合位點之SEQ ID NO: 24之重鏈可變域及SEQ ID NO: 37之輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 7之重鏈可變域及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之SEQ ID NO: 83之重鏈可變域及SEQ ID NO: 84之輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 7之重鏈可變域及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 85之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 86之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 7之重鏈可變域及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 87之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 88之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 7之重鏈可變域及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 89之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 90之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 7之重鏈可變域及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 91之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 92之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點之SEQ ID NO: 7之重鏈可變域及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變域及至少一對針對人類α-突觸核蛋白形成結合位點之衍生自SEQ ID NO: 93之人類化重鏈可變域及衍生自SEQ ID NO: 94之人類化輕鏈可變域之雙特異性抗體。
在一個實施例中，該抗體係包含至少一對針對轉鐵蛋白受體形成結合位點及針對人類葡萄糖腦苷脂酶形成結合位點之SEQ ID NO: 7之重鏈可變域及SEQ ID NO: 34之輕鏈可變域之雙特異性抗體。
特異性結合至血腦障壁受體之單價結合實體可針對其等結合及胞吞轉送作用性質進行表徵：
-單價結合實體對BBBR表現細胞之高效細胞結合，
-單價結合實體之高效活體外胞吞轉送作用，
-人類-食蟹猴交叉反應性(例如，於BIAcore及FACS實驗中)。
可於基於hCMEC/D3之分析中進行胞吞轉送作用篩選。該分析可以脈衝追蹤模式進行。該等hCMEC/D3腦內皮細胞用單價結合實體培養1小時，之後清洗且在清洗後之0小時及4小時內測定下列參數：
i)在裝載階段期間，被攝取至細胞內之單價結合實體之量；
ii)裝載及清洗後4小時，單價結合實體之基底外側量；
iii)裝載及清洗後4小時，單價結合實體之頂端量；
iv)裝載及清洗後0小時及4小時，細胞(藉由細胞溶解)中之單價結合實體之量；
v)裝載及清洗後0小時及4小時，單價結合實體之總量。
為勝任作為如本文報告之血腦障壁穿梭模組中之單價結合實體，該抗轉鐵蛋白受體抗體(例如，作為單價結合實體)不得不i)被hCMEC/D3細胞攝取(內吞作用)；ii)被輸送到hCMEC/D3細胞外(胞吐作用)；及iii)在hCMEC/D3細胞內穩定(無或低輸送至胞內體以用於降解)。
因此，在一個實施例中，該單價結合實體係於基於hCMEC/D3之分析中藉由以下來表徵：i)一個小時之裝載期間hCMEC/D3細胞之(實質性)攝取，ii)在裝載期間及清洗步驟後於該清洗後4小時內釋放至頂端及/或基底外側隔室的量，及iii)低(細胞內)降解速率。
在一個實施例中，該裝載係以約2.67 µg/mL單價結合實體之濃度持續一個小時。
已發現單價結合實體為勝任如本文報告之血腦障壁穿梭模組之單價結合實體，必須於上文描述之基於hCMEC/D3之分析中顯示下列臨限值：
i)在裝載階段期間，被攝入細胞內之單價結合實體之量為400 pg或以上，
ii)在裝載及清洗後4小時，單價結合實體之基底外側量為100 pg或以上，及
iii)在裝載及清洗後4小時，單價結合實體之頂端量為150 pg或以上。
小鼠抗人類轉鐵蛋白-受體抗體128.1 (就可變區序列而言，參見WO 93/10819及SEQ ID NO: 64及65)可作為參考。在此情況下，該單價結合實體為勝任如本文報告之血腦障壁穿梭模組之單價結合實體，必須於上文描述之基於hCMEC/D3之分析中顯示下列臨限值：
i)在裝載階段期間，被攝入細胞內之單價結合實體之量為抗體128.1之裝載之60%或以上，
ii)在裝載及清洗後4小時，單價結合實體之基底外側量為抗體128.1之基底外側量之60%或以上；及
iii)在裝載及清洗後4小時，單價結合實體之頂端量為抗體128.1之頂端量之60%或以上。
基於hCMEC/D3之分析可如下進行(此係如本文報告之所有態樣之一個實施例)：
用於hCMEC/D3之培養基及補充物(參見WO 2006/056879及Weksler, B.B.等人，FASEB J. 19 (2005) 1872-1874)可獲得自Lonza。hCMEC/D3細胞(傳代26至29)係/可經培養以長滿於塗覆膠原蛋白之蓋玻片(顯微術)或燒瓶上之含有2.5% FBS、四分之一所供應生長因子且經所供應氫化可體松、健他黴素及抗壞血酸完全補充之EBM2培養基中。
就所有胞吞轉送作用分析而言，將高密度孔(1×10
8
個孔/cm
2
) PET膜過濾器嵌入物(0.4 µm孔徑，12 mm直徑)用於/可用於12孔細胞培養盤中。針對頂端及基底外側室算得之培養基體積分別係400 µL及1600 µL。過濾器嵌入物之頂端室係/可塗覆大鼠尾膠原蛋白I (7.5 µg/cm
2
)，接著塗覆纖網蛋白(5 µg/mL)，各培養在RT下持續一個小時。hCMEC/D3細胞係/可於EBM2培養基中歷時10至12天生長成長滿的單層(~2×10
5
個細胞/cm
2
)。空過濾器係/可在該分析前於含有1% BSA之PBS中阻斷1小時或過夜(o/n)且然後在該分析前於EBM2中校準至少1小時。
該分析(就分析方案而言，參見圖1)係於另外如本文描述重新構造之無血清EBM2培養基中進行。在分析當天，使細胞經血清飢餓60 min以耗盡留待討論之血腦障壁受體之天然配位體。將有或無(但於完全培養基中阻斷過夜)細胞之過濾器嵌入物用留待討論之單株抗體(單價結合實體)在37℃下頂端培養1小時。在室溫下(RT)於無血清培養基中將單層頂端(400 µL)及基底外側(1600 µL)清洗三次，各清洗3至5 min。將經預先加熱之培養基添加至頂端室中並將過濾器轉移至含有1600 µL經預先加熱之培養基之新鮮12孔盤(用含有1% BSA之PBS阻斷過夜)盤。此時，使有或無細胞之過濾器溶解於500 µL RIPA緩衝液中以測定特異性抗體(單價結合實體)攝取。將殘餘之過濾器在37℃或4℃下培養且在各種時間點收集樣品以測定抗體(單價結合實體)之頂端及/或基底外側釋放。樣品中之抗體之含量可使用高度敏感之IgG ELISA定量(參見實例9)。就各時間點而言，資料應產生自兩個空過濾器及三個過濾器細胞培養物中。
C.重組方法及組合物 抗體可使用(例如)如描述於US 4,816,567中之重組方法及組合物產生。在一個實施例中，提供編碼本文描述之抗轉鐵蛋白受體抗體之經分離之核酸。此核酸可編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供包含此核酸之一或更多個載體(例如，表現載體)。在另一實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞包含(例如，已經以下轉形者)：(1)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸之載體，或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之核酸之第一載體及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸之第二載體。在一個實施例中，該宿主細胞係真核細胞，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或類淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製造抗轉鐵蛋白受體抗體之方法，其中該方法包括在適用於表現抗體(如上文提供)之條件下培養包含編碼該抗體之核酸之宿主細胞，及視需要自該宿主細胞(或宿主細胞培養物培養基)中回收該抗體。
就抗轉鐵蛋白受體抗體之重組產生而言，分離編碼抗體之核酸(例如，如上文描述)並嵌入於一或更多個載體內以用於進一步選殖及/或於宿主細胞中表現。此核酸可使用習知程序(例如，藉由使用可特異性結合至編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)容易地分離並定序。
適用於抗體編碼載體之選殖或表現之宿主細胞包括本文描述之原核細胞或真核細胞。例如，抗體可於細菌中產生，特定言之當無需醣化及Fc效應子功能時。就於細菌中表現抗體片段及多肽而言，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo, B.K.C. (編)，Humana Press, Totowa, NJ (2003)，第245至254頁，其描述於大腸桿菌中表現抗體片段)。表現後，該抗體可自於可溶性溶離份中之細菌細胞糊狀物分離且可經進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母菌)係適用於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，其等包括真菌及酵母菌菌株，其等醣化路徑已經「人類化」，從而導致具有經部分或完全人類醣化模式之抗體之產生。參見Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及Li, H.等人，Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。
適用於表現醣化抗體之宿主細胞亦衍生自多細胞生物(於脊椎動物及脊椎動物中)。脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。許多桿狀病毒菌株已經識別，其等可與昆蟲細胞結合使用，特定言之，用於草地夜蛾細胞之轉染。
亦可使用植物細胞培養物作為宿主細胞。參見，例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429 (描述用於在基因轉殖植物中產生抗體之PLANTBODIES
TM
技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主細胞。例如，適應於懸浮生長之哺乳動物細胞系可為有用的。有用之哺乳動物宿主細胞系之其他實例係經SV40轉形之猴腎CV1系(COS-7)；人類胚胎腎系(如描述(例如)於Graham, F.L.等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74中之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞氏(sertoli)細胞 (如描述(例如)於Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252中之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如描述(例如)於Mather, J.P.等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68中；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用之哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其等包括DHFR
-
CHO細胞(Urlaub, G.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，諸如Y0、NS0及Sp2/0。為回顧適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系，參見，例如，Yazaki, P.及Wu, A.M., Methods in Molecular Biology,第248卷，Lo, B.K.C. (編)，Humana Press, Totowa, NJ (2004)，第255至268頁。
D.分析 本文提供之抗轉鐵蛋白受體抗體可藉由此項技術中已知的各種分析針對其等物理/化學性質及/或生物活性進行識別、篩選、或表徵。
1.結合分析 在一個態樣中，測試本發明之抗體之抗原結合活性，例如，藉由已知的方法諸如ELISA、αLISA、西方墨點轉漬法、抗體或逆相陣列等。
在例示性ELISA或αLISA分析中，溶液(細胞上清液、細胞或組織溶解物、體液等)中之轉鐵蛋白受體藉由捕獲抗體(其特異性結合至轉鐵蛋白受體上之第一抗原決定基或呈某些構形之轉鐵蛋白受體)及偶合至偵測實體之偵測抗體(其特異性結合至轉鐵蛋白受體之第二抗原決定基或構形)結合。讀數係基於該偵測實體(化學發光、螢光、能量轉移引發之發光等)。
在抗體陣列之情況下，將抗體點斑至玻璃或硝基纖維素晶片上。阻斷該等載玻片並用含有轉鐵蛋白受體之溶液培養，清洗以移除未經結合之抗體且用經螢光標記之相應二級抗體偵測經結合之抗體。螢光信號藉由螢光載玻片掃描儀量測。同樣地，就逆相陣列而言，將重組轉鐵蛋白受體、細胞上清液、細胞或組織溶解物、體液等點斑至玻璃或硝基纖維素晶片上。阻斷該等載玻片且個別陣列用針對轉鐵蛋白受體上之特異性抗原決定基之抗體進行培養。洗淨未經結合之抗體並用經螢光標記之相應二級抗體偵測經結合之抗體。該螢光信號藉由螢光載玻片掃描儀量測(Dernick, G.等人，J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331)。
E.用於診斷及偵測之方法及組合物 在某些實施例中，本文提供之抗轉鐵蛋白受體抗體中之任何一者適用於偵測生物樣品中人類轉鐵蛋白受體之存在。如本文使用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織諸如腦組織。
在一個實施例中，提供用於診斷或偵測之方法中之抗轉鐵蛋白受體抗體。在另一態樣中，提供偵測生物樣品中轉鐵蛋白受體之存在之方法。在某些實施例中，該方法包括使生物樣品與如本文描述之抗轉鐵蛋白受體抗體在允許該抗轉鐵蛋白受體抗體結合至轉鐵蛋白受體之條件下接觸，並偵測是否於抗轉鐵蛋白受體抗體與轉鐵蛋白受體間形成複合體。此方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體係用以選擇勝任使用抗轉鐵蛋白受體抗體之療法之個體，例如，在該轉鐵蛋白受體係用於選擇患者之生物標誌物之情況中。
可使用本發明之抗體診斷之例示性失調症包括具有腦鐵聚集1型之神經退化(NBIA1)、單純性自主神經衰竭、唐氏症候群、關島複合症及數種雷維體失調症，諸如瀰漫性雷維體疾病(DLBD)、阿茲海默症之雷維體變體(LBVAD)、Gaucher氏症之某些形式及帕金森氏症失智症(PDD)。
在某些實施例中，提供經標記之抗轉鐵蛋白受體抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、色基、電子緻密、化學發光及放射性標記)及間接偵測(例如，通過酶反應或分子相互作用)之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素(
32
P、
14
C、
125
I、
3
H及
131
I)、螢光團(諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物)、玫瑰紅及其衍生物、丹磺醯基、繖形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(US 4,737,456))、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶)、雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)與採用過氧化氫以氧化染料前驅物之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)之偶合、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、細菌噬菌體標記、穩定自由基及類似物。
F.醫藥調配物 如本文描述之抗轉鐵蛋白受體抗體之醫藥調配物係藉由將具有所需純度之此抗體與一或更多種可選醫藥上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A. (編) (1980))混合成凍乾調配物或水溶液之形式來製備。醫藥上可接受之載劑通常在採用之劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯化苄二甲烴銨；氯化本索寧；苯酚；丁醇或苄醇；對羥苯甲酸烷基酯(諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯)；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚(乙烯基吡咯啶酮)；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑(諸如EDTA)；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽之相對離子(諸如鈉)；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)及/或非離子表面活性劑(諸如聚乙二醇(PEG))。本文之例示性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性-活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白，諸如rhuPH20 (HYLENEX
®
，Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP(包括rhuPH20)及使用方法描述於US 2005/0260186及US 2006/0104968中。在一個態樣中，sHASEGP組合一或更多種額外之醣胺聚醣酶(諸如軟骨素酶)。
例示性凍乾抗體調配物描述於US 6,267,958中。水性抗體調配物包括彼等描述於US 6,171,586及WO 2006/044908中者，該等後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文之調配物亦可含有超過一種針對治療中之特定適應症而言所必需之活性成分，較佳係彼等具有不會不利地影響彼此之互補活性者。此等活性成分適宜地以就預期目標而言有效之量存在於組合中。
活性成分可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合分別於膠狀藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒奈米膠囊)中或於巨乳液中所製備之微膠囊(例如，羥基甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A. (編) (1980)中。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有該抗體之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，其中基質係以成型物件之形式，例如，薄膜或微膠囊。
待用於活體內投與之調配物通常係無菌的。無菌可容易地例如藉由通過無菌過濾膜過濾達成。
G.治療方法及組合物 本文提供之抗TfR抗體中之任何一者可用於治療方法中。在一個態樣中，提供用作藥劑之抗TfR抗體。例如，本發明提供跨血腦障壁輸送治療化合物之方法，其包括使偶合至治療化合物之抗TfR抗體(例如，結合TfR及腦抗原兩者之多特異性抗體)曝露於BBB使得該抗體跨該BBB輸送偶合至其之治療化合物。在另一實例中，本發明提供跨血腦障壁輸送神經失調症藥物之方法，其包括使偶合至腦失調症藥物之本發明之抗TfR抗體(例如，結合TfR及腦抗原兩者之多特異性抗體)曝露於BBB使得該抗體跨該BBB輸送偶合至其之神經失調症藥物。在一個實施例中，該BBB係於哺乳動物(例如，人類)中，例如，患有神經失調症者，包括(但不限於)：阿茲海默症(AD)、中風、失智症、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊腫纖化症、天使人症候群(Angelman’s syndrome)、里德爾症候群(Liddle syndrome)、帕金森氏症、匹克症(Pick’s disease)、派傑氏病(Paget’s disease)、癌症、創傷性腦損傷等。在一個實施例中，該神經失調症係選自：神經病變、類澱粉變性症、癌症(例如，涉及CNS或腦)、眼疾病或失調症、病毒或微生物感染、炎症(例如，CNS或腦之炎症)、局部缺血、神經退化性疾病、癲癇、行為失調症、溶體儲積症等。本發明之抗體特別適用於治療此等神經失調症，因為其等具有跨BBB將一或更多種相關活性成分/經偶合之治療化合物輸送至其中此等失調症之分子、細胞或病毒/微生物基礎所在之CNS/腦內之能力。神經病變失調症係特徵在於不適當或不受控之神經傳訊或缺乏神經傳訊之神經系統疾病或異常，且包括(但不限於)慢性疼痛(包括傷害性疼痛)、由身體組織受傷引起之疼痛(包括與癌症相關聯之疼痛)、神經性病變疼痛(由神經、脊髓或腦中之異常引起之疼痛)及精神性疼痛(完全或主要與心理失調症相關聯)、頭痛、偏頭痛、神經病變及通常伴有此等神經病變失調症之症狀及症候群(諸如眩暈或噁心)。
就神經病變失調症而言，可選擇係止痛劑之神經藥物，包括(但不限於)麻醉劑/類鴉片止痛劑(即，嗎啡、酚太尼枸椽酸鹽、氫可酮、美吡利啶(meperidine)、美沙酮(methadone)、氧嗎啡酮、鎮痛新(pentazocine)、丙氧芬(propoxyphene)、曲馬多(tramadol)、可待因(codeine)及氧可酮(oxycodone))、非類固醇抗炎藥物(NSAID) (即，伊布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、雙氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依託度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬酯(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奧沙普嗪(oxaprozin)、吡羅昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)及托美汀(tolmetin))、皮質類固醇(即，可體松、普賴鬆(prednisone)、普賴蘇穠(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)及曲安奈德(triamcinolone))、抗偏頭痛劑(即，舒馬曲坦(sumatriptin)、阿莫曲坦(almotriptan)、福伐曲坦(frovatriptan)、舒馬普坦(sumatriptan)、利紮曲坦(rizatriptan)、依立曲坦(eletriptan)、佐米曲坦(zolmitriptan)、二氫麥角胺(dihydroergotamine)、依來曲普坦(eletriptan)及麥角胺(ergotamine))、乙醯胺酚(acetaminophen)、柳酸鹽(即，阿斯匹林(aspirin)、水楊酸膽堿(choline salicylate)、水楊酸鎂(magnesium salicylate)、二氟尼柳(diflunisal)及雙水楊酸酯(salsalate))、抗驚厥劑(即，卡馬西平(carbamazepine)、可那氮平(clonazepam)、加巴噴汀(gabapentin)、拉莫三嗪(lamotrigine)、普瑞巴林(pregabalin)、噻加賓(tiagabine)及托吡酯(topiramate))、麻醉劑(即，異氟醚(isoflurane)、三氯乙烯、氟烷、七氟醚、苯佐卡因(benzocaine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、可卡因(cocaine)、環甲卡因(cyclomethycaine)、二甲卡因(dimethocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、普魯卡因(procaine)、奴佛卡因(novocaine)、丙美卡因(proparacaine)、丁卡因(tetracaine)、阿替卡因(articaine)、布比卡因(bupivacaine)、卡替卡因(carticaine)、辛可卡因(cinchocaine)、依替卡因(etidocaine)、左旋布比卡因(levobupivacaine)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、哌羅卡因(piperocaine)、丙胺卡因(prilocaine)、羅哌卡因(ropivacaine)、美索卡因(trimecaine)、蛤蚌毒素(saxitoxin)及河豚毒素(tetrodotoxin))及cox-2-抑制劑(即，塞來昔布(celecoxib)、羅非考昔(rofecoxib)及伐地考昔(valdecoxib))。就涉及眩暈之神經病變失調症而言，可選擇係抗眩暈劑之神經藥物，包括(但不限於)美克洛嗪(meclizine)、苯海拉明(diphenhydramine)、異丙嗪(promethazine)及地西泮(diazepam)。就涉及噁心之神經病變失調症而言，可選擇係抗噁心劑之神經藥物，包括(但不限於)異丙嗪(promethazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、三甲氧苯醯胺(trimethobenzamide)及甲氧氯普胺(metoclopramide)。
類澱粉變性係與沈積於CNS中之細胞外蛋白質相關聯之疾病及失調症之群，包括(但不限於)繼發性類澱粉變性症、與年齡相關聯之類澱粉變性症、阿茲海默症(AD)、輕度認知障礙(MCI)、雷維體失智症、唐氏症候群、患有類澱粉變性症(荷蘭型)之遺傳性腦出血；關島帕金森癡呆綜合征(Guam Parkinson-Dementia complex)、類澱粉腦血管病、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington’s disease)、進行性核上性麻痺、多發性硬化症；克-雅氏疾病(Creutzfeldt Jacob disease)、帕金森氏症、傳染性海綿狀腦病、與HIV相關聯之失智症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、包涵體肌炎(IBM)及涉及β-類澱粉蛋白沈積之眼病(即，黃斑變性、與隱結相關聯之視神經病變及白內障)。
就類澱粉變性症而言，可選擇包括(但不限於)特異性結合至選自以下之目標之抗體或其他結合分子(包括(但不限於)小分子、肽、適配體或其他蛋白結合劑)之神經藥物：β分泌酶、tau、早老素、類澱粉前驅蛋白或其部分、類澱粉蛋白β肽或其寡聚物或原纖維、死亡受體6 (DR6)、用於晚期醣化終產物(RAGE)之受體、帕金蛋白(parkin)及杭丁頓氏蛋白(huntingtin)；膽鹼酯酶抑制劑(即，加蘭他敏(galantamine)、多奈派齊(donepezil)、卡巴拉汀(rivastigmine)及他克林(tacrine))；NMDA受體拮抗劑(即，美金剛胺(memantine))、單胺耗竭劑(即，四苯喹嗪(tetrabenazine))；甲磺酸二氫麥角鹽(ergoloid mesylate)；抗膽鹼能抗帕金森症藥劑(即，普環啶(procyclidine)、苯海拉明(diphenhydramine)、苯海索(trihexylphenidyl)、苯甲托品(benztropine)、比哌立登(biperiden)及苯海索)；多巴胺能抗帕金森症藥劑(即，恩他卡朋(entacapone)、司來吉蘭(司來吉米(selegiline))、普拉克索(pramipexole)、溴隱亭(bromocriptine)、羅替伐汀(rotigotine)、司來吉蘭、羅匹尼羅(ropinirole)、雷沙吉蘭(rasagiline)、阿撲嗎啡(apomorphine)、卡比多巴(carbidopa)、左旋多巴(levodopa)、培高利特(pergolide)、托卡朋(tolcapone)及金剛烷胺(amantadine))；四苯喹嗪(tetrabenazine)；抗炎(包括(但不限於)非類固醇抗炎藥物(即，吲哚美辛(indomethicin)及上文列舉之其他化合物)；激素(即，雌激素、黃體酮及亮丙瑞林(leuprolide))；維生素(即，葉酸鹽及菸鹼醯胺)；二甲弗林(dimebolin)；高牛磺酸(即，3-胺基丙烷磺酸；3APS)；血清素受體活性調節劑(即，紮利羅登(xaliproden))；干擾素及醣皮質素(glucocorticoid)。
CNS之癌症具有一或更多個CNS細胞(即，神經細胞)之異常增殖之特徵且包括(但不限於)神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、腦脊髓膜瘤、星形細胞瘤、聽神經瘤、軟骨瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經節細胞膠質瘤、神經鞘瘤、神經纖維瘤、神經胚細胞瘤及硬膜外、髓內、硬腦膜內腫瘤或周圍腫瘤之CNS轉移(諸如CD20或HER2陽性癌症)。
就癌症而言，可選擇係化學治療劑之神經藥物。
化學治療劑之實例包括烷化劑，諸如塞替派(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯胺；烷基磺酸鹽，諸如硫酸布他卡因(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及烏瑞替哌(uredopa)；伸乙亞胺及甲基蜜胺，其等包括六甲蜜胺、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫磷醯胺及三羥甲基蜜胺；番荔枝內酯(尤其泡番荔枝辛(bullatacin)及泡番荔枝辛酮(bullatacinone)；Δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚，MARINOL®)；β-拉帕酮(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼；樺木酸；喜樹鹼(包括合成類似之拓撲替康(topotecan) (HYCAMTIN®), CPT-11 (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹鹼、東莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；海綿多聚乙醯(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素(cryptophycin) (特定言之，隱藻素1及隱藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin) (包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；珊瑚類二萜(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，諸如氮芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、鹽酸氮芥、氮芥鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、氮芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、、氯乙環磷醯胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)尤其係卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1 (參見，例如，Angew. Chem. Intl.編，Engl., 33 (1994) 183-186)；炔黴素(dynemicin)，包括炔黴素A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；及新製癌菌素發色團及相關色素蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安曲黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素c (cactinomycin)、卡洛比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycini)、放線菌素d (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®多柔比星(doxorubicin) (包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星及脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、蒽環類(marcellomycin)、絲裂黴素類(mitomycin)，諸如絲裂黴素C、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波非羅黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、新製癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如胺甲喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-25氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、雙脫氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酪(testolactone)；抗雄激素，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸顯影劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；乙醯葡萄糖內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝塔布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；伊達曲仙(edatraxate)；德弗法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；洛尼達寧(lonidainine)；美登素類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocins)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫吡丹莫(mopidanmol)；根瘤菌劑(nitraerine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙肼(ethylhydrazide)；甲基苄肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯族毒素類(trichothecenes) (尤其係T-2毒素、弗納庫林A (verracurin A)、桿孢菌素A (roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；胺基酸乙酯(urethan)；長春地辛(vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；5 哌泊溴烷(pipobroman)；瓜西託辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside) (「Ara-C」)；塞替派(thiotepa)；紫杉烷類化合物(taxoid)，例如，TAXOL®紫杉醇(Bristol-Myers-Squibb Oncology, Princeton, N.J.)，紫杉醇之無ABRAXANETM聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)之經白蛋白改造之奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及TAXOTERE®多西他賽(doxetaxel) (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR®)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(vinblastine) (VELBAN®)；鉑；依託泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine) (ONCOVIN®)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；葉酸亞鈣(leucovovin)；長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE®)；鹽酸米托蒽醌(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鈉(ibandronate)；拓撲異構酶(topoisomerase)抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；維甲酸類化合物(retinoid)，諸如維甲酸；卡培他濱(capecitabine) (XELODA®)；上文中之任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物；及上文中之兩種或更多種之組合，諸如CHOP (環磷醯胺、多肉比星、長春新鹼及普賴蘇穠之組合療法之縮寫)及FOLFOX (使用奧沙利鉑(ELOXATINTM)與5-FU及葉酸亞鈣之組合之治療方案之縮寫)。
化學治療劑之此定義中亦包括調節、減少、阻斷或抑制可促進癌症之生長之激素效應且通常呈系統或整體治療之形式之抗激素藥劑。其等可為激素自身。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，其等包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen) (包括NOLVADEX®他莫昔芬)、EVISTA®雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON®托瑞米芬(toremifene)；抗黃體酮；雌激素受體下調劑(ERD)；用以抑制或關閉卵巢之藥劑，例如，黃體化激素釋放之激素(LHRH)促效劑，諸如LUPRON®及ELIGARD®醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)及曲普瑞林(tripterelin)；其他抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制酶芳香化酶之芳香酶抑制劑，其調節於腎上腺中之雌激素產生，諸如，例如，4(5)-咪唑類、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE®醋酸甲地孕酮、AROMASIN®依西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR®伏氯唑(vorozole)、FEMARA®伏羅唑(letrozole)及ARIMIDEX®阿那曲唑(anastrozole)。此外，化學治療劑之此定義包括雙膦酸鹽，諸如氯膦酸鹽(例如，BONEFOS®或OSTAC®)、DIDROCAL®依替膦酸鹽(etidronate)、NE-58095、ZOMETA®唑來膦酸/唑來膦酸鹽、FOSAMAX®阿侖膦酸鹽(alendronate)、AREDIA®帕米膦酸鹽(pamidronate)、5 SKELID®替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL®利塞膦酸鹽(risedronate)；及曲沙他濱(troxacitabine) (1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特定言之，彼等抑制涉及異常細胞增殖之傳訊路徑中之基因(諸如，例如，PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)) 之表現者；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如，ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；拉帕替尼對甲苯磺酸酯(lapatinib ditosylate) (亦如GW572016已知的ErbB-2及EGFR雙酪胺酸激酶小分子抑制劑)；及上文中之任何一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
可經選擇作為用於癌症治療或預防之神經藥物之化合物之另一組係抗癌症免疫球蛋白(包括(但不限於)曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、帕尼單抗(panitumumab)及利妥昔單抗(rituximab))。在一些實例中，可使用抗體與毒性標記或結合物之結合以靶向所需細胞(即，癌細胞)或殺死所需細胞(即，癌細胞)，其等包括(但不限於)具有131I放射性同位素標記之托西莫單抗(tositumomab)或曲妥珠單抗依坦辛(trastuzumab emtansine)。
眼病或失調症係眼部之疾病或失調症，出於本文之目的將其等視為由BBB隔離之CNS器官。眼病或失調症包括(但不限於)鞏膜、角膜、虹膜及睫狀體之失調症(即，鞏膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、角膜擦破、雪盲、弧眼、希傑森氏淺層點狀角膜炎(Thygeson’s superficial punctate keratopathy)、角膜新生血管化、富克斯氏營養不良(Fuchs’ dystrophy)、圓錐角膜、乾燥性角膜結膜炎、虹膜炎及眼色素層炎)、晶體之失調症(即，白內障)、脈絡膜及視網膜之失調症(即，視黃醛脫落、視網膜劈裂、高血壓性視網膜病變、糖尿病性視網膜病變、視網膜病變、早產兒視網膜病變、年齡相關之黃斑變性、黃斑變性(濕潤或乾燥)、視網膜前膜、視網膜色素變性及黃斑水腫)、青光眼、飛蚊症、視神經及視覺路徑之失調症(即，雷伯氏遺傳性視神經病變(Leber’s hereditary optic neuropathy)及視盤玻璃疣)、眼肌/雙眼移動調節/折射之失調症(即，斜視、眼肌癱瘓、進行性眼外肌麻痹症、內斜視、外斜視、遠視、近視、散光、屈光參差、老花眼及眼外肌麻痺)、視覺障礙及失明(即，弱視、萊伯氏先天性黑內障(Lever’s congenital amaurosis)、盲點、色盲、全色盲、夜盲症、失明、河盲症及微眼炎/缺損)、紅眼、阿蓋爾羅伯遜瞳孔(Argyll Robertson pupil)、真菌性角膜炎、乾眼症及無虹膜。
就眼疾病或失調症而言，可選擇係抗血管生成滴眼劑之神經藥物(即，貝伐單抗、雷珠單抗(ranibizumab)及哌加他尼(pegaptanib))、眼青光眼藥劑(即，碳醯膽鹼、腎上腺素、地美卡林(demecarium bromide)、安普尼定(apraclonidine)、溴莫尼定(brimonidine)、布林佐胺(brinzolamide)、鹽酸左布諾洛爾(levobunolol)、噻嗎洛爾(timolol)、倍他洛爾(βxolol)、多佐胺(dorzolamide)、比馬前列素(bimatoprost)、卡替洛爾(carteolol)、美替洛爾(metipranolol)、地匹福林(dipivefrin)、曲伏前列素(travoprost)及拉坦前列素(latanoprost))、碳酸酐酶抑制劑(即，甲醋唑胺及乙醯唑胺)、眼抗組織胺(即，萘甲唑啉、苯腎上腺素及四氫唑林)、眼潤滑劑、眼類固醇(即，氟米龍(fluorometholone)、普賴蘇穠(prednisolone)、氯替潑諾(loteprednol)、地塞米松(dexamethasone)、二氟潑尼酯(difluprednate)、瑞美松龍(rimexolone)、氟新諾龍(fluocinolone)、甲羥孕酮(medrysone)及曲安奈德(triamcinolone))、眼麻醉劑(即，利多卡因(lidocaine)、丙美卡因(proparacaine)及丁卡因(tetracaine))、眼抗感染(即，左氧氟沙星(levofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、氯黴素(chloramphenicol)、枯草桿菌素(bacitracin)/多黏桿菌素B (polymyxin B)、磺胺醋醯、妥布黴素(tobramycin)、阿奇黴素(azithromycin)、貝西沙星(besifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、磺胺異噁唑、慶大黴素(gentamicin)、碘苷(idoxuridine)、紅黴素(erythromycin)、納他黴素(natamycin)、短桿菌素(gramicidin)、新黴素(neomycin)、氧氟沙星(ofloxacin)、脫氧尿苷(trifluridine)、更昔洛韋(ganciclovir)、阿糖尿苷(vidarabine))、眼抗炎藥劑(即，奈帕芬胺(nepafenac)、酮咯酸(ketorolac)、氟比洛芬酯(flurbiprofen)、舒洛芬(suprofen)、環孢黴素(cyclosporine)、曲安奈德(triamcinolone)、雙氯芬酸(diclofenac)及溴芬酸(bromfenac))及眼抗組織胺或減充血劑(即，酮替芬(ketotifen)、奧洛他定(olopatadine)、依匹斯汀(epinastine)、萘甲唑啉(naphazoline)、色甘酸(cromolyn)、四氫唑林(tetrahydrozoline)、吡嘧司特(pemirolast)、貝他司汀(bepotastine)、萘甲唑啉(naphazoline)、苯腎上腺素、奈多羅米(nedocromil)、洛度沙胺(lodoxamide)、苯腎上腺素、依美斯汀(emedastine)及氮卓斯汀(azelastine))。
CNS之病毒或微生物感染包括(但不限於)由病毒(即，流感、HIV、脊髓灰白質炎病毒、風疹)、細菌(即，奈瑟氏球菌屬(Neisseria sp.)、鏈球菌屬(StreptococcUS sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、變形桿菌屬(Proteus sp.)、大腸桿菌(E. coli)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、肺炎球菌屬(Pneumococcus sp.)、腦膜炎雙球菌屬(Meningococcus sp.)、嗜血桿菌屬(Haemophilus sp.)及肺結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))及其他微生物諸如真菌(即，酵母菌、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans))、寄生蟲(即，弓形蟲(toxoplasma gondii))或變形蟲(amoebas)引起之感染，從而導致CNS病理生理學包括(但不限於)可為急性或慢性之腦膜炎、腦炎、脊髓炎、血管炎及膿腫。
就病毒或微生物疾病而言，可選擇包括(但不限於)以下之神經藥物：抗病毒化合物(包括(但不限於)，金剛烷抗病毒藥(即，金剛烷乙胺(rimantadine)及金剛烷胺(amantadine))、抗病毒干擾素(即，聚乙二醇-干擾素α-2b)、趨化介素受體拮抗劑(即，馬拉維若(maraviroc))、整合酶股轉移抑制劑(即，雷特格韋(raltegravir))、神經胺糖酸苷酶抑制劑(即，奧司他韋(oseltamivir)及紮那米韋(zanamivir))、非核苷逆轉錄酶抑制劑(即，依法韋侖(efavirenz)、依曲韋林(etravirine)、地拉韋啶(delavirdine)及奈韋拉平(nevirapine))、核苷逆轉錄酶抑制劑(替諾福韋(tenofovir)、阿巴卡韋(abacavir)、拉米夫定(lamivudine)、齊多夫定(zidovudine)、司他夫定(stavudine)、恩替卡韋(entecavir)、恩曲他濱(emtricitabine)、阿德福韋酯(adefovir)、紮西他濱(zalcitabine)、替比夫定(telbivudine)及去羥肌苷(didanosine))、蛋白酶抑制劑(即，地瑞那韋(darunavir)、阿紮那韋(atazanavir)、福沙那韋(fosamprenavir)、替拉那韋(tipranavir)、利托那韋(ritonavir)、奈非那韋(nelfinavir)、安普那韋(amprenavir)、茚地那韋(indinavir)及沙奎那韋(saquinavir))、嘌呤核苷(即，伐昔洛韋(val阿昔洛韋(acyclovir))、泛昔洛韋(famciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)、利巴韋林(ribavirin)、更昔洛韋(ganciclovir)、纈更昔洛韋(valganciclovir)及西多福韋(cidofovir))及其他抗病毒藥(即，恩夫韋地(enfuvirtide)、膦甲酸(foscarnet)、帕裏珠單抗(palivizumab)及福米韋生(fomivirsen)))、抗生素(包括(但不限於)青黴素(aminopenicillin) (即，阿莫西林(amoxicillin)、氨比西林(ampicillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氯唑西林(cloxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucoxacillin)、替莫西林(temocillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄青黴素(carbenicillin)、替凱西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)、哌拉西林(piperacillin)及巴氨西林(bacampicillin))、頭孢菌素(即，頭孢唑林(cefazolin)、頭孢氨苄(cephalexin)、頭孢噻吩(cephalothin)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢羥氨(cefadroxil)、頭孢拉定(cephradine)、洛拉卡比(loracarbef)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢克洛(cefaclor)及頭孢西汀(cefoxitin))、碳青黴烯類/青黴烯類(即，亞胺培南(imipenem)、美洛培南(meropenem)、厄他培南(ertapenem)、法羅培南(faropenem)及多尼培南(doripenem))、單菌黴素(即，氨曲南(aztreonam)、替吉莫南(tigemonam)、諾卡黴素A(norcardicin A)及煙毒因(tabtoxinine)-β-內醯胺、β內醯胺酶抑制劑(即，克拉維酸(clavulanic acid)、他唑巴坦(tazobactam)及與另一β-內醯胺抗生素結合之舒巴坦(sulbactam))、胺基糖苷類(即，阿米卡星(amikacin)、慶大黴素(gentamicin)、卡那黴素(kanamycin)、新黴素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、鏈黴素(streptomycin)、妥布黴素(tobramycin)及巴龍黴素(paromomycin))、安沙黴素(即，格爾德黴素(geldanamycin)及除莠黴素(herbimycin))、碳頭孢烯類(即，洛拉卡比(loracarbef))、醣肽(即，替考拉寧(teicoplanin)及萬古黴素(vancomycin))、大環內酯類(即，阿奇黴素(azithromycin)、克拉黴素(clarithromycin)、地紅黴素(dirithromycin)、紅黴素(erythromycin)、羅紅黴素(roxithromycin)、醋竹桃黴素(troleandomycin)、泰利黴素(telithromycin)及大觀黴素(spectinomycin))、單環β內醯胺類(即，氨曲南(aztreonam))、喹諾酮(即，環丙沙星(ciprofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、格雷沙星(grepafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)及替馬沙星(temafloxacin))、磺胺劑(即，磺胺米隆(mafenide)、2,4-二胺基偶氮苯-4-磺醯胺(sulfonamidochrysoidine)、磺胺醋醯、磺胺嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺異噁唑、三甲氧芐二氨嘧啶、三甲氧芐二氨嘧啶及磺胺甲噁唑)、四環素類(即，四環素、地美環素(demeclocycline)、多西環素(doxycycline)、米諾環素(minocycline)及土黴素(oxytetracycline))、抗腫瘤或細胞毒性抗生素(即，多柔比星、米托蒽醌、博來黴素、道諾黴素、放線菌素d、表柔比星、伊達比星、普卡黴素、絲裂黴素、噴司他汀及戊柔比星(valrubicin))及其他抗菌化合物(即，枯草桿菌素、黏菌素及多黏桿菌素B))、抗真菌劑(即，甲硝咪唑、硝唑尼特(nitazoxanide)、替硝唑(tinidazole)、氯奎寧(chloroquine)、雙碘喹啉(iodoquinol)及巴龍黴素(paromomycin))及抗寄生物劑(包括(但不限於)奎寧、氯奎寧、阿莫地喹(amodiaquine)、乙胺嘧啶、磺胺多辛(sulphadoxine)、氯胍(proguanil)、甲氟喹(mefloquine)、阿托伐醌(atovaquone)、伯氨喹(primaquine)、青蒿素(artemesinin)、鹵泛群(halofantrine)、多西環素、克林黴素(clindamycin)、甲苯咪唑、雙羥萘酸噻吩嘧啶(pyrantel pamoate)、噻苯咪唑、乙胺嗪(diethylcarbamazine)、伊維菌素(ivermectin)、利福平(rifampin)、兩性黴素B (amphotericin B)、美拉胂醇(melarsoprol)、依氟鳥胺酸(efornithine)及阿苯達唑(albendazole))。
CNS之炎症包括(但不限於)由CNS之損傷(其可為物理損傷(即，由於意外、外科手術、腦創傷、脊髓損傷、腦震蕩))及由CNS之一或更多種其他疾病或失調症(即，膿腫、癌症、病毒或微生物感染)引起或與其相關聯之損傷引起之炎症。
就CNS炎症而言，可選擇解決炎症本身之神經藥物(即，非類固醇抗炎藥劑，諸如伊布洛芬或萘普生)，或可治療該炎症之根本原因之藥物(即，抗病毒或抗癌症藥劑)。
如本文使用，CNS之局部缺血係指一組涉及腦中之異常血液流動或血管行為或造成該等現象之原因之失調症，且包括(但不限於)：病灶性腦局部缺血、全腦局部缺血、中風(即，蛛網膜下腔出血及腦內出血)及動脈瘤。
就局部缺血而言，可選擇包括(但不限於)以下之神經藥物：溶解血栓劑(即，尿激酶(urokinase)、阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)及替奈普酶(tenecteplase))、血小板聚集抑制劑(即，阿斯匹林、西洛他唑(cilostazol)、氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)及潘生丁(dipyridamole))、他汀類(即，洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、羅蘇伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、西立伐他汀及匹伐他汀)及改善血液流動或血管可撓性之化合物，其包括(例如)降血壓藥物。
神經退化性疾病係一組與CNS中之神經細胞之功能損失或死亡相關聯之疾病及失調症，且包括(但不限於)：腎上腺白質失養症、亞歷山大氏氏病(Alexander’s disease)、亞爾培氏病(Alper’s disease)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、共濟失調毛血管擴張、巴登氏病(Batten disease)、柯凱因氏症候群(cockayne syndrome)、皮質基底外側核退化症、由類澱粉變性症引起或與其相關聯之退化症、弗裏德賴西氏共濟失調(Friedreich’s ataxia)、額顳葉退化、肯尼迪氏症(Kennedy’s disease)、多系統萎縮症、多發性硬化症、原發性脊髓側索硬化症、進行性核上性麻痺、脊髓性肌萎縮症、橫貫性脊髓炎、雷夫蘇姆氏病(Refsum’s disease)及脊髓小腦共濟失調。
就神經退化性疾病而言，可選擇係生長激素或神經營養素因子之神經藥物；實例包括(但不限於)腦源神經營養素因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、神經營養素-4/5、纖維母細胞生長因子(FGF)-2及其他FGF、神經營養素(NT)-3、紅血球生成素(EPO)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉形生長因子(TGF)-α、TGF-β、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、介白素-1受體拮抗劑(IL-1ra)、睫狀神經營養素因子(CNTF)、衍生自神經膠細胞之神經營養素(GDNF)、神經生長因子(neurturin)、血小板源生長因子(PDGF)、調蛋白、神經調節蛋白、artemin、persephin、介白素、神經膠細胞細胞系源神經營養素因子(GFR)、顆粒細胞-菌落刺激因子(CSF)、顆粒細胞巨噬細胞-CSF、神經導向因子(netrin)、心肌營養素-1、hedgehog、白血病抑制因子(LIF)、中期因子、多效因子、骨形態演變蛋白(BMP)、神經導向因子、鞘脂啟動蛋白、腦信號蛋白及幹細胞因子(SCF)。
CNS之癲癇發作(seizure)疾病及失調症涉及CNS中之不適當及/或異常之電導，且包括(但不限於)癲癇(即，意識喪失型癲癇發作、失張性癲癇發作、良性羅蘭癲癇(benign Rolandic epilepsy)、兒童意識喪失型癲癇、陣攣性癲癇發作、複雜部分性癲癇發作、額葉癲癇、發熱性癲癇發作、嬰兒點頭式痙攣、青少年肌陣攣性癲癇、青少年缺失性癲癇、雷葛氏症候群(Lennox-Gastaut syndrome)、蘭道-克雷夫症候群(Landau-Kleffner Syndrome)、德維特氏症候群(Dravet’s syndrome)、大田原症候群(Otahara syndrome)、韋氏症候群(West syndrome)、肌陣攣性癲癇發作、粒線體失調症、進行性肌陣攣性癲癇、心因性癲癇發作、反射性癲癇、拉斯穆森氏症候群(Rasmussen's Syndrome)、簡單部分性癲癇發作、繼發全面性癲癇發作、顳葉癲癇、強直陣攣性癲癇發作、強直性癲癇發作、精神運動性癲癇發作、邊緣葉癲癇、部分發作性癲癇發作、全面發作性癲癇發作、癲癇持續狀態、腹性癲癇、難動性癲癇發作、自主神經性癲癇發作、大規模雙邊肌陣攣、經期性癲癇、跌倒性癲癇發作、情緒化癲癇發作、病灶性癲癇發作、癡笑性癲癇發作、夾克森擴布(Jacksonian March)、拉福拉(Lafora)病、運動性癲癇發作、多病灶性癲癇發作、夜間癲癇發作、光敏癲癇發作、假性癲癇發作、感覺性癲癇發作、微小癲癇發作、sylvan癲癇發作、戒斷性癲癇發作及視覺反射性癲癇發作)。就癲癇發作症而言，可選擇係抗驚厥或抗癲癇之神經藥物，其包括(但不限於)巴比妥類抗驚厥藥物(即，撲米酮(primidone)、美沙比妥(metharbital)、戊巴比妥(mephobarbital)、阿洛巴比妥(allobarbital)、異戊巴比妥(amobarbital)、阿普比妥(aprobarbital)、烯丙苯巴比妥(alphenal)、巴比妥(barbital)、溴烯比妥(brallobarbital)及苯巴比妥(phenobarbital))、苯二氮抗驚厥藥物(即，地西泮、可那氮平及勞拉西泮(lorazepam))、胺基甲酸酯抗驚厥藥物(即，非氨酯(felbamate))、碳酸酐酶抑制劑抗驚厥藥物(即，乙醯唑胺、托吡酯及唑尼沙胺(zonisamide))、二苯并氮卓抗驚厥藥物(即，廬非醯胺(rufinamide)、卡馬西平及奧凱西平(oxcarbazepine))、脂肪酸衍生物抗驚厥藥物(即，雙丙戊酸鈉(divalproex)及丙戊酸)、γ-胺基丁酸類似物(即，普瑞巴林、加巴噴汀及氨己烯酸(vigabatrin))、γ-胺基丁酸再攝取抑制劑(即，噻加賓(tiagabine))、γ-胺基丁酸轉胺酶抑制劑(即，氨己烯酸)、乙內醯脲抗驚厥藥物(即，苯妥英(phenytoin)、乙妥英(ethotoin)、磷苯妥英(fosphenytoin)及美芬妥英(mephenytoin))、其他抗驚厥藥物(即，拉科醯胺(lacosamide)及硫酸鎂)、黃體酮類(即，黃體酮)、噁唑烷二酮抗驚厥藥物(即，甲乙雙酮及三甲雙酮)、吡咯啶抗驚厥藥物(即，左乙拉西坦(levetiracetam))、琥珀醯亞胺抗驚厥藥物(即，乙琥胺(ethosuximide)及甲琥胺(methsuximide))、三嗪類抗驚厥藥物(即，拉莫三嗪(lamotrigine))及尿素抗驚厥藥物(即，苯乙醯脲(phenacemide)及苯丁醯脲(pheneturide))。
行為失調症係CNS之失調症，其等具有受折磨個體之一部分之異常行為之特徵且包括(但不限於)：睡眠失調症(即，失眠症、異睡症、夢悸、晝夜節律性睡眠失調症及嗜睡症)、情感失調症(即，抑鬱症、自殺性抑鬱症、焦慮症、慢性情感失調症、恐懼症、恐慌發作、強迫症、注意力缺陷多動症失調症(ADHD)、注意力缺陷失調症(ADD)、慢性疲勞症候群、空室恐懼症、創傷後精神壓力失調症、雙極性失調症)、飲食失調症(即，厭食症或暴食症)、精神病、發展性行為失調症(即，自閉症、雷特氏症候群(Rett’s syndrome)、亞斯伯格氏症候群(Aspberger’s syndrome))、人格障礙及精神性失調症(即，精神分裂症、妄想症及類似疾病)。
就行為失調症而言，神經藥物可選自修飾行為之化合物，其包括(但不限於)非典型抗精神病藥物(即，利培酮(risperidone)、奧氮平(olanzapine)、阿立哌唑(apripiprazole)、喹硫平(quetiapine)、帕利哌酮(paliperidone)、阿塞那平(asenapine)、氯氮平(clozapine)、伊潘立酮(iloperidone)及齊拉西酮(ziprasidone))、吩噻嗪抗精神病藥物(即，丙氯拉嗪、氯丙嗪、氟非那嗪(fluphenazine)、奮乃靜(perphenazine)、三氟拉嗪、硫利達嗪及美索達嗪)、硫雜蒽類(即，硫雜蒽)、其他抗精神病藥物(即，匹莫齊特(pimozide)、鋰、嗎啉酮、氟哌啶醇及洛沙平(loxapine))、選擇性血清素再攝取抑制劑(即，西酞普蘭(citalopram)、艾司西酞普蘭(escitalopram)、帕羅西汀(paroxetine)、氟西汀(fluoxetine)及舍曲林(sertraline))、血清素-去甲腎上腺素再攝取抑制劑(即，度洛西汀(duloxetine)、萬拉法新(venlafaxine)、地文拉法辛(desvenlafaxine)、三環類抗抑鬱藥物(即，多塞平(doxepin)、氯米帕明(clomipramine)、阿莫沙平(amoxapine)、去甲替林(nortriptyline)、阿米替林(amitriptyline)、三甲丙咪嗪(trimipramine)、丙咪嗪(imipramine)、普羅替林(protriptyline)及地昔帕明(desipramine))、四環類抗抑鬱藥物(即，米氮平(mirtazapine)及麥普替林(maprotiline))、苯基哌嗪抗抑鬱藥物(即，曲唑酮(trazodone)及耐法唑酮(nefazodone))、單胺氧化酶抑制劑(即，異卡波肼(isocarboxazid)、苯乙肼(phenelzine)、司來吉米(selegiline)及反苯環丙胺)、苯二氮卓(即，阿普唑侖(alprazolam)、艾司唑侖(estazolam)、氟胺安定(flurazeptam)、可那氮平(clonazepam)、勞拉西泮及地西泮)、去甲腎上腺素-多巴胺再攝取抑制劑(即，安非他酮(bupropion))、CNS興奮劑(即，苯丁胺(phentermine)、安非拉酮(diethylpropion)、甲基安非他命(methamphetamine)、右旋苯丙胺(dextroamphetamine)、安非他命(amphetamine)、哌甲酯(methylphenidate)、右哌甲酯(dexmethylphenidate)、二甲磺酸賴右苯丙胺(lisdexamfetamine)、莫達非尼(modafinil)、匹莫林(pemoline)、苯二甲嗎啉(phendimetrazine)、芐非他明(benzphetamine)、苯二甲嗎啉(phendimetrazine)、阿莫達非尼(armodafinil)、安非拉酮(diethylpropion)、咖啡因、阿托莫西汀(atomoxetine)、多沙普侖(doxapram)及馬吲哚(mazindol))、抗焦慮藥物/鎮靜藥物/安眠藥物(包括(但不限於)巴比妥酸鹽(即，司可巴比妥(secobarbital)、苯巴比妥及戊巴比妥)、苯二氮卓(如上文描述)及其他抗焦慮藥物/鎮靜藥物/安眠藥物(即，苯海拉明、羥丁酸鈉、紮來普隆、羥嗪、水合氯醛、唑吡坦、丁螺環酮、多塞平(doxepin)、右旋佐匹克隆(eszopiclone)、雷美爾通(ramelteon)、眠爾通(meprobamate)及乙氯戊烯炔醇(ethclorvynol)))、分泌素(參見，例如，Ratliff-Schaub等人，Autism 9 (2005) 256-265)、類鴉片肽(參見，例如，Cowen等人，J. Neurochem. 89 (2004) 273-285)及神經肽(參見，例如，Hethwa等人，Am. J. Physiol. 289 (2005) E301-305)。
溶體儲積症係新陳代謝失調症，其等在一些情況下係與CNS相關聯或具有CNS-特異性症候群；此等失調症包括(但不限於)：戴氏-薩克斯氏病(Tay-Sachs disease)、高歇氏病(Gaucher’s disease)、法布瑞氏病(Fabry disease)、黏多醣貯積病(I、II、III、IV、V、VI及VII型)、肝醣貯積病、GM1-神經節苷脂貯積病、異染性白質失養症、法伯氏病(Farber’ disease)、卡納文氏氏白質失養症(Canavan’s leukodystrophy)及神經元蠟樣脂褐質沈積症1型及2型、尼曼－匹克二氏病(Niemann-Pick disease)、龐貝氏症(Pompe disease)及克拉培氏病(Krabbe’s disease)。
就溶體儲積症而言，可選擇疾病中受損之酶本身或模仿其活性之神經藥物。用於治療溶體儲積症之例示性重組酶包括(但不限於)彼等闡述於(例如)美國專利申請公開案第2005/0142141號中者(即，α-L20艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、β-g葡萄糖醛酸酶、酸性α葡萄糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶A、己醣胺酶A、酸性神經髓磷脂酶、β-半乳糖腦苷酶、β-半乳糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、酸性神經醯胺酶、天冬胺酸醯基轉移酶、棕櫚醯基-蛋白硫酯酶1及三肽基胺基肽酶1)。
在一個態樣中，本發明之抗體係用以在症狀發病前偵測神經失調症及/或評估疾病或失調症之嚴重性或持續時間。在一個態樣中，該抗體容許神經失調症之偵測及/或成像，包括藉由放射線攝影術、斷層攝影術或磁振造影(MRI)成像。
在一個態樣中，提供用作藥劑之本發明之低親和性抗TfR抗體。在其他態樣中，提供用於治療神經系統疾病或失調症(例如，阿茲海默症)而不消耗紅血球(即，網狀紅血球)之低親和性抗TfR抗體。在某些實施例中，提供用於如本文描述之方法中之經修飾之低親和性抗TfR抗體。在某些實施例中，本發明提供低親和性抗TfR抗體，其經修飾以改善其用於治療患有神經疾病或失調症之個體中之安全性，該方法包括向該個體投與有效量之抗TfR抗體(視需要偶合至神經失調症藥物)。在一個此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種額外之治療劑。在其他實施例中，本發明提供抗TfR抗體，其經修飾以改善其用於減少或抑制患神經疾病或失調症(例如，阿茲海默症)之風險或正經受其折磨之病患中類澱粉蛋白血小板形成之安全性。根據上文實施例中之任何一者之「個體」視需要係人類。在某些態樣中，用於本發明之方法中之本發明之抗TfR抗體改善其偶合之神經失調症藥物之攝取。
在另一態樣中，本發明提供本發明之低親和性抗TfR抗體在製造或製備藥劑中之用途。在一個實施例中，該藥劑係用於治療神經疾病或失調症。在另一實施例中，該藥劑係用於治療神經疾病或失調症之方法中，該方法包括向患有神經疾病或失調症之個體投與有效量之該藥劑。在一個此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種額外之治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療阿茲海默症之方法。在一個實施例中，該方法包括向患有阿茲海默症之個體投與有效量之結合BACE1及TfR兩者或Aβ蛋白及TfR兩者之本發明多特異性抗體。在一個此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種額外之治療劑。根據上文實施例中任一項之「個體」可為人類。
本發明之抗TfR抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。例如，本發明之抗TfR抗體可與至少一種額外之治療劑共投與。在某些實施例中，額外之治療劑係有效治療與抗TfR抗體所治療相同或不同之神經失調症之治療劑。例示性額外之治療劑包括(但不限於)：上文描述之各種神經藥物、膽鹼酯酶抑制劑(諸如多奈派齊、加蘭他敏、雷司替明(rovastigmine)及他克林)、NMDA受體拮抗劑(諸如美金剛胺)、類澱粉蛋白β肽聚集抑制劑、抗氧化劑、γ-分泌酶調節劑、神經生長因子(NGF)模擬物或NGF基因療法、PPARγ促效劑、HMS-CoA還原酶抑制劑(他汀類)、安帕金(ampakine)、鈣通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝醣合成酶激酶抑制劑、靜脈內免疫球蛋白、蕈毒受體促效劑、煙鹼性受體調節劑、主動或被動類澱粉蛋白β肽免疫、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑及抗類澱粉蛋白β肽抗體。在某些實施例中，該至少一種額外之治療劑係針對其減輕神經藥物之一或更多個副作用之能力加以選擇。
在某些其他此等實施例中，該至少一種其他治療劑係針對一經投與抗TfR抗體則其抑制或預防互補路徑之活化之能力加以選擇。此等治療劑之實例包括(但不限於)：干擾抗TfR抗體結合至或活化互補路徑之能力之藥劑及抑制互補路徑內之一或更多種分子相互作用之藥劑，及通常描述於Mollnes及Kirschfink (Molec. Immunol. 43 (2006) 107-121)中之藥劑，其等內容以引用之方式明確併入本文中。
上文及本文指示之此等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於相同或不同之調配物中)及分開投與，在分開投與之情況下，本發明之抗體之投與可發生於額外之治療劑及/或佐劑之投與之前、同時及/或之後。在一個實施例中，該抗TfR抗體之投與及額外之治療劑之投與可發生於彼此投與之約一個月內，或發生於約一、二或三週內，或發生於約一、二、三、四、五或六天內。本發明之抗體亦可與其他介入性療法組合(諸如(但不限於)放射療法、行為療法或此項技術中已知且適用於待治療或預防之神經失調症之其他療法)使用。
本發明之抗TfR抗體(及任何額外之治療劑)可藉由任何合適之方式投與，投與方式包括非經腸、肺內及鼻內及(若需要針對局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任何合適之途徑給藥，例如，藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分取決於該投與係短暫的抑或係長期的。各種給藥方案包括(但不限於)經各種時間點之單一或多次投與，且本文預期推注投與及脈衝輸注。
本發明之抗體將以與良好之醫學實務一致之方式調配、給藥並投與。此內文中應考慮之因素包括治療中之特定失調症、治療中之特定哺乳動物、個別病患之臨床病症、失調症之病因、藥劑之遞送部位、投與方法、投與時間安排表及醫務人員已知的其他因素。
該抗體不一定，但視需要需與目前用以預防或治療待討論之失調症或用以預防、減輕或改善抗體投與之一或更多種副作用之一或更多種藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量取決於存在於調配物中之抗體之量、失調症或治療之類型及上文討論之其他因素。此等通常以相同劑量及以如本文描述之投與途徑，或以本文描述之劑量之約1至99%，或以任何劑量及藉由經驗/臨床判定係適當之任何途徑來使用。
就疾病之預防或治療而言，本發明之抗體之適當劑量(在單獨使用或與一或更多個其他額外之治療劑組合使用時)將取決於待治療之疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重性及病程、該抗體是否出於預防抑或治療目的投與、先前療法、病患之臨床歷史及對抗體之反應、及主治醫師之判斷。抗體適用於向病患一次性投與或經一系列治療投與。取決於該疾病之類型及嚴重性，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如，0.1 mg/kg至10 mg/kg)之抗體可為用於向該病患投與之初始候選劑量，無論例如藉由一或更多次分開投與或藉由連續輸注。一個典型每日劑量可介於約1 μg/kg至100 mg/kg或以上之範圍內，取決於上文提及之因素。就經數日或更久之重複投與而言，取決於病症，該治療將通常持續直至出現對疾病症狀之所需抑制。抗體之例示性劑量將係介於約0.05mg/kg至約40 mg/kg之範圍內。因此，可向病患投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg、5.0mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg或40 mg/kg (或其任何組合)中之一或更多個劑量。此等劑量可間歇性投與，例如，每週或每三週(例如，使得病患接受抗體之自約二至約二十，或例如約六個劑量)。初始較高負荷劑量後，可接著投與一或更多個較低劑量。然而，其他劑量方案可為有用的。將瞭解藉由投與抗TfR抗體以減小對網織紅細胞群體之影響之方法係修飾該等劑量之量或時間設定使得血流中存在整體數量較低之循環抗體以與網狀紅血球相互作用。在一個非限制性實例中，抗TfR抗體之較低劑量可以比較高劑量更大之頻率進行投與。所用劑量可於以下中達成平衡：遞送至CNS所必需之抗體量(其本身係與該抗體之CNS抗原-特異性部分之親和性有關)；該抗體對TfR之親和性；及保護紅血球(即，網織紅細胞)、刺激生長及發育或抑制互補路徑之化合物是否與該抗體共投與或連續投與。此療法之進展係容易藉由如本文描述及如此項技術中已知的習知技術及分析來監測。
應瞭解上文之調配物或治療方法中之任何一者可使用本發明之免疫結合物代替抗TfR抗體或除抗TfR抗體外亦使用本發明之免疫結合物來進行。
III.製造物件 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於上文描述之失調症之治療、預防及/或診斷之材料之製造物件。該製造物件包含容器及貼於該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。合適之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由各種材料諸如玻璃或塑膠製成。該容器裝載組合物本身或與對治療、預防及/或診斷病症有效之其他組合物之組合且可具有無菌入孔(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺破之塞子之小瓶)。該組合物中之至少一種活性成分係本發明之抗體。該標籤或包裝插頁指示用於治療所選病症之組合物。此外，該製造物件可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物含有其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中之製造物件可進一步包含指示該等組合物可用以治療特定病症之包裝插頁。或者或另外，該製造物件可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接收之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)及葡萄糖溶液。其可進一步包括商業及使用者立場所需之其他材料，其等包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應瞭解上文之製造物件中之任何一者可包括本發明之免疫結合物代替抗轉鐵蛋白受體抗體或除抗轉鐵蛋白受體抗體外亦包括本發明之免疫結合物。
IV.實例 以下係本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，在給定上文提供之一般描述下，可實踐各種其他實施例。
材料及方法 重組 DNA 技術
使用標準方法以操作DNA，如描述於Sambrook, J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中。根據製造商之使用說明使用分子生物試劑。
基因及寡核苷酸合成
所需基因片段係藉由化學合成於Geneart GmbH (Regensburg, Germany)加以製備。將經合成之基因片段選殖至大腸桿菌質體中以用於增殖/擴增。經子選殖之基因片段之DNA序列藉由DNA定序證實。或者，短合成DNA片段藉由使化學合成之寡核苷酸退火或經由PCR加以組裝。各自寡核苷酸係由metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany)加以製備。
試劑
若無其他說明，則所用之所有市售化學品、抗體及套組如根據製造商之協議提供般來使用。
實例 1
兔及小鼠之免疫
小鼠之免疫
使用編碼全長人類或食蟹猴TfR之質體表現載體，藉由皮膚內施用100 µg載體DNA，接著電穿孔(2個1000 V/cm之矩形脈衝，持續時長0.1 ms，間隔0.125 s；接著4個287.5 V/cm之矩形脈衝，持續時長10 ms，間隔0.125 s)對NMRI小鼠進行基因免疫。小鼠在第0、14、28、42、56、70及84天接受6或7次連續免疫。第四及第六次免疫用編碼食蟹猴TfR之載體進行；編碼人類TfR之載體用於所有其他免疫。在第36、78及92天進行採血並製備血清，將該血清用於ELISA效價測定(參見下文)。選擇具有最高效價之動物以用於在第96天藉由靜脈內注射10
6
個人類TF-1細胞或50 µg缺乏螺旋域(人類TfR之細胞外域，其起始自Leu122，結束自Asn608)之重組人類可溶性TfR(其以N端融合至人類Fc區之形式表現於HEK293F細胞中並藉由蛋白A親和性層析術及粒徑排阻層析術純化)來加強免疫，且單株抗體係藉由融合瘤技術基於其等結合表現於經穩定轉染之CHO-K1細胞之表面上之人類及食蟹猴轉鐵蛋白受體之能力進行分離(參見實例3)。
兔之免疫
使用編碼全長人類或食蟹猴TfR之質體表現載體，藉由皮膚內施用400 µg載體DNA，接著電穿孔(5個750 V/cm之矩形脈衝，持續時長10 ms，間隔1 s)對表現人類化抗體庫之紐西蘭白兔或基因轉殖兔進行基因免疫。兔在0、14、28、56、84及112天接受6次連續免疫。第四及第六次免疫用編碼食蟹猴TfR之載體進行；編碼人類TfR之載體用於所有其他免疫。在第35、63、91及119天進行採血(經估算之血液總體積之10%)。製備血清，將該血清用於ELISA效價測定(參見下文)，且分離末梢單核細胞，其等用作B細胞選殖方法中之抗原特異性B細胞之來源(參見實例2)。
血清效價之測定 (ELISA)
以3 µg/mL、100 µL/孔將人類重組可溶性TfR (R&D Systems Cat.No. 2474-TR)固定於96孔NUNC Maxisorb盤之PBS中，接著：用含於PBS 中之2% CroteinC以200 µL/孔阻斷該盤；一式兩份地將抗血清之連續稀釋液以100 µL/孔施用在含於PBS中之0.5% CroteinC中；用(1)結合HRP之山羊抗小鼠抗體(Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16 000)偵測所有小鼠血清，(2)結合HRP之驢抗兔IgG抗體(Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16 000)偵測所有兔血清，(3)兔抗人類IgG抗體(Pierce/Thermo Scientific 31423; 1/5000)偵測僅來自基因轉殖兔之血清，(4)生物素化山羊抗人類κ抗體(Southern Biotech/Biozol 2063-08, 1/5 000)及鏈黴親和素-HRP偵測僅來自基因轉殖兔之血清；以100 µL/孔稀釋於含於PBS中之0.5% CroteinC中。就所有步驟而言，將盤在37℃下培養1 h。在所有步驟之間，用含於PBS中之0.05%吐溫20將盤清洗3次。藉由以100 µL/孔添加可溶性BM藍莢受質(BM Blue POD Substrate soluble) (Roche)以顯現信號；並藉由以100 µL/孔添加1 M HCl停止顯現該信號。於450 nm下讀取吸光度，針對690 nm作為參考。效價定義為導致半最大信號之抗血清之稀釋倍數。
實例 2
自兔選殖B細胞
兔末梢血液單核細胞 (PBMC) 之分離
收集總計6隻動物(2隻野生型(wt)兔及4隻基因轉殖(tg)兔)之血液樣品。此等兔源自於2個不同免疫活動(immunization campaign)：第一活動具有2隻wt及2隻tg兔且第二活動具有2隻tg兔(亦參見實例「兔之免疫」)。用1x PBS (PAA, Pasching, Austria)將含有EDTA之全血稀釋兩倍，接著使用淋巴球哺乳動物(Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canada)根據製造商之說明書進行密度離心。該等PBMC用1x PBS清洗兩次。
EL-4 B5 培養基
RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Germany)，用10% FCS (Hyclone, Logan, UT, USA)、2 mM麩醯胺酸、1%青黴素/鏈黴素溶液(PAA, Pasching, Austria)、2 mM丙酮酸鈉、10 mM HEPES (PAN Biotech, Aidenbach, Germany)及0.05 mM β-巰基乙醇(Gibco, Paisley, Scotland)補充。
細胞之耗 盡
第一免疫活動：使用經長滿的CHO細胞單層覆蓋之無菌6孔盤(細胞培養等級)以通過非特異性黏附及非特異性結合淋巴球耗盡巨噬細胞/單核細胞。
第二免疫活動：省略使用經CHO細胞覆蓋之孔之耗盡步驟，因為吾人無法排除彼等產生與倉鼠轉鐵蛋白受體抗體發生交叉反應之抗體之B細胞將被耗盡。因此，使用空白無菌6孔盤(細胞培養等級)以通過非特異性黏附耗盡巨噬細胞及單核細胞，使得產生倉鼠交叉反應性(及可能產生小鼠交叉反應性)表面抗體之潛在B淋巴球用於工作流程中之下一步驟。
就各免疫活動而言：各孔填充最大4 mL培養基及來自經免疫之兔之高達6x10
6
個PBMC且容許於培養器中在37℃下結合1 h。上清液中之細胞(末梢血液淋巴球(PBL))用於抗原平移步驟中。
人類轉鐵蛋白受體上之 B 細胞之富集
將經人類轉鐵蛋白受體陽性CHO細胞之單層覆蓋之6孔組織培養盤接種高達每4 mL培養基6x10
6
個PBL並容許於培養器中在37℃下結合1 h。非黏附細胞藉由用1x PBS將該等孔仔細清洗1至2次而移除。殘餘之黏性細胞藉由胰蛋白酶於培養器中在37℃下分離10 min。胰蛋白酶化用EL-4 B5培養基停止。將該等細胞保持於冰上直至免疫螢光染色。
免疫螢光染色及流動式細胞測量術
使用抗IgG FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Germany)以供單一細胞分選。就表面染色而言，來自耗盡及富集步驟之細胞用含於PBS中之抗IgG FITC抗體培養且在4℃下於黑暗中培養45 min。染色後，該等PBMC用冰冷PBS清洗兩倍。最終，將該等PBMC重懸浮於冰冷PBS中並立即經受FACS分析。在FACS分析前添加濃度為5 µg/mL之碘化丙啶(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)以區分死細胞與活細胞。
使用配備電腦及FACSDiva軟體之Becton Dickinson FACSAria(BD Biosciences, USA)以供單一細胞分選。
B 細胞培養
兔B細胞之培養係藉由類似於由Zubler等人(1985)描述之方法加以製備。簡而言之，經單一分選之兔B細胞用含有Pansorbin細胞(1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland)、5%兔胸腺細胞上清液(裝載TSN-M13 (10242), MicroCoat, Bernried, Germany)及經γ放射之鼠類EL-4-B5胸腺瘤細胞(2.5 × 10
4
/孔)之200 µL/孔EL-4 B5培養基於培養器中在37℃及5% CO
2
之氣氛下於96孔盤中培養7天。移除B細胞培養之上清液以供篩選且立即獲得殘餘之細胞並在-80℃下於100 μL RLT緩衝液中冷凍(Qiagen, Hilden, Germany)。
實例 3
藉由細胞ELISA識別人類及食蟹猴TfR-結合抗體 為篩選兔B細胞或小鼠融合瘤上清液中的識別人類及食蟹猴TfR之抗體，採用使用經穩定轉染之CHO-K1細胞之細胞ELISA。穩定之轉染子係藉由用含有用於人類或食蟹猴TfR及用於新黴素-磷酸轉移酶之表現匣之表現質體轉染CHO-K1細胞獲得。轉染後，將細胞稀釋於含有500 µg/mL G418 (Life Technologies)之生長培養基中。生長純系出現後，分離細胞，用MEM-75 (Abcam)或13E4 (Life Technologies)及針對人類或食蟹猴TfR之PE標記二級抗體染色，且將高度螢光細胞作為單一細胞分選至96孔盤之孔(FACS Aria)中。生長7天後，再次檢查純系之TfR表現並選擇最佳表現之純系以供細胞ELISA實驗。
簡而言之，將15,000個細胞接種於384孔盤之每孔中並在37℃，5% CO
2
下培養18 h。上清液使用自動清洗機(BIOTEK)移除，並將30 µL含有抗體之上清液添加至各孔中，接著添加24 µL生長培養基。培養2小時後，清空該等孔並在RT下歷時45 min添加30 µL含於PBS中之0.05%戊二醛。用PBS/0.025%吐溫20 (PBST)清洗3次後，添加以1:5000稀釋於阻斷緩衝劑中之30 µL抗兔-HRP或抗小鼠-HRP (Southern Biotech)並在RT下將盤培養1小時。用PBST將孔清洗6次及使用每孔30 µL之TMB產生信號且於450 nm下量測吸光度。
實例 4
抗TfR抗體之選殖及表現
重組 DNA 技術
使用標準方法以操作DNA，如描述於Sambrook, J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中。分子生物試劑根據製造商之使用說明使用。
基因及寡核苷酸合成
所需基因片段係藉由化學合成於Geneart GmbH (Regensburg, Germany)加以製備。將經合成之基因片段選殖至大腸桿菌質體中以用於增殖/擴增。經子選殖之基因片段之DNA序列藉由DNA定序證實。或者，短合成DNA片段藉由使經化學合成之寡核苷酸退火或經由PCR加以組裝。各自寡核苷酸係由metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany)加以製備。
V- 域之 PCR 擴增
全部RNA使用NucleoSpin 8/96 RNA套組(Macherey&Nagel; 740709.4, 740698)根據製造商方案製備自B細胞溶解物(重懸浮於RLT緩衝液- Qiagen - Cat. N 79216)。RNA用60 µL無RNAse之水溶離。使用6 µL RNA以使用Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen 18080-400)及oligo-dT-primer根據製造商之使用說明藉由逆轉錄反應產生cDNA。所有步驟均於Hamilton ML Star系統上進行。針對野生型兔B細胞之重鏈使用引子rbHC.up及rbHC.do，針對野生型兔B細胞之輕鏈使用rbLC.up及rbLC.do及針對基因轉殖兔B細胞之輕鏈使用BcPCR_FHLC_前導子.fw及BcPCR_huCkappa.rev，將4 µL cDNA與AccuPrime SuperMix (Invitrogen 12344-040) 以50 µL最終體積一起用於擴增免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區(VH及VL) (參見下表)。所有正向引子對訊息肽(分別為VH及VL之訊息肽)具有特異性，而反向引子對恆定區(分別為VH及VL之恆定區)具有特異性。用於RbVH+RbVL之PCR條件如下：在94℃下開始加熱5 min；進行35個循環：在94℃下20 sec，在70℃下20 sec，在68℃下45 sec及在68℃下最終延伸7 min。用於HuVL之PCR條件如下：在94℃下開始加熱5 min；進行35個循環：在94℃下20 sec，在52℃下20 sec，在68℃下45 sec及在68℃下最終延伸7 min。
| rbHC.up
(SEQ ID NO: 97) | AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC
|
| rbHCf.do
(SEQ ID NO: 98) | CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG
|
| rbLC.up
(SEQ ID NO: 99) | AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC |
| rbLC.do
(SEQ ID NO: 100) | CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC
|
| BcPCR_FHLC_前導子.fw
(SEQ ID NO: 101) | ATGGACATGAGGGTCCCCGC |
| BcPCR_huCkappa.rev
(SEQ ID NO: 102) | GATTTCAACTGCTCATCAGATGGC |
將50 µL PCR溶液中的8 µL裝載於48 E-Gel 2% (Invitrogen G8008-02)上。使用NucleoSpin Extract II套組(Macherey&Nagel; 740609250)根據製造商方案淨化陽性PCR反應並於50 µL溶離緩衝液中溶離。所有淨化步驟均於Hamilton ML Starlet系統上進行。
兔單株二價抗體之重組表現
就兔單株二價抗體之重組表現而言，將編碼VH或VL之PCR產物作為cDNA藉由突出端選殖方法(RS Haun等人，BioTechniques (1992) 13, 515-518；MZ Li等人，Nature Methods (2007) 4, 251-256)選殖至表現載體中。該表現載體含有由包括內含子A之5' CMV啟動子及3' BGH聚腺苷酸化序列組成之表現匣。除該表現匣外，該等質體含有pUC18衍生之複製起點及賦予氨比西林抗大腸桿菌中之質體擴增之β-內醯胺酶基因。使用鹼性質體之三種變體：一種質體含有經設計以接受VH區之兔IgG恆定區，而兩種額外之質體含有接受VL區之兔或人類κ LC恆定區。
編碼κ或γ恆定區之線性化表現質體及VL/VH嵌入物係藉由PCR使用重疊引子擴增。
經純化之PCR產物用產生單股突出端之T4 DNA-聚合酶培養。反應藉由添加dCTP停止。
在下一步驟中，組合質體及嵌入物並用誘發位點特異性重組之recA培養。使經重組之質體轉形至大腸桿菌中。第二天，挑選生長之集落並藉由質體製備、限制分析及DNA定序針對正確重組之質體進行測試。
就抗體表現而言，將經分離之HC及LC質體瞬態共轉染至HEK293細胞中且1週後獲得上清液。
用於表現兔單株單價抗體之載體之產生
就經選擇作為單株單價抗體之候選者之重組表現而言，將所有VH鏈之兔恆定區轉化為使節突變封閉於CH3片段中之人類恆定區。就衍生自兔野生型B細胞之VL鏈而言，將兔C κ恆定區轉化為人類。使用對訊息肽具有特異性之正向引子及對具有(於3’端處)與人類恆定區(分別為VH及VL之恆定區)同源之重疊序列(20 bp)之CDR3-J區具有特異性之反向引子，使用所選候選者中的4 µL cDNA與AccuPrime SuperMix (Invitrogen 12344-040)以50 µL最終體積一起擴增免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區。用於VH及VL鏈擴增之PCR條件如下：在94℃下開始加熱5 min；進行35個循環：在94℃下20 sec，在68℃下20 sec，在68℃下45 sec且及在68℃下最終延伸7 min。
將編碼VH或VL之PCR產物作為cDNA藉由突出端選殖方法(RS Haun等人，BioTechniques (1992) 13, 515-518；MZ Li等人，Nature Methods (2007) 4, 251-256)選殖至表現載體中。該表現載體含有由包含內含子A之5' CMV啟動子及3' BGH聚腺苷酸化序列組成之表現匣。除該表現匣外，該質體含有pUC18衍生之複製起點及賦予氨比西林抗大腸桿菌中之質體擴增之β-內醯胺酶基因。使用鹼性質體之三種變體：一種質體含有經設計以接受新擴增之VH鏈之人類IgG恆定區及第二質體含有接受VL鏈之人類κ LC恆定區。
編碼κ或γ恆定區之線性化表現質體及VL/VH嵌入物係藉由PCR使用重疊引子擴增。
經純化之PCR產物用產生單股突出端之T4 DNA-聚合酶培養。反應藉由添加dCTP停止。
在下一步驟中，組合質體及嵌入物並用誘發位點特異性重組之recA培養。使經重組之質體轉形至大腸桿菌中。第二天，挑選生長之集落並藉由質體製備、限制分析及DNA定序針對正確重組之質體進行測試。
實例 5
單價抗TfR抗體之瞬態表現 該等抗體係於培養於F17培養基 (Invitrogen Corp)中之經瞬態轉染之HEK293細胞(源自人類胚胎腎細胞系293)中活體內產生。就轉染而言，使用「無293」之轉染試劑(Novagen)。如上文描述之抗體及基於抗體修飾之分子表現自個別表現質體。如製造商之使用說明中之說明進行轉染。轉染後三至七天，獲得含有重組蛋白之細胞培養物上清液。將上清液儲存於低溫(例如，-80℃)下直至純化。
關於人類免疫球蛋白於(例如) HEK293細胞中之重組表現之一般資訊給定於：Meissner, P.等人，Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203中。
實例 6
高通量單臂轉鐵蛋白受體抗體之純化 將96深孔盤中之含有單臂抗體之50 mL澄清上清液裝載於200 µL MabSelectSuRe管柱上。用pH 7.4的PBS進行清洗步驟後，蛋白質使用Tecan/Atoll系統以2.5 mM HCl溶離，從而得到0.5 mL溶離液。溶離液藉由2 M Tris pH 8中和。經純化之蛋白質使用Nanodrop分光光度計定量並藉由CE-SDS在變性及還原條件下及分析型SEC進行分析。為獲得具有高純度(＞95%)之蛋白質，很大比例之抗體必須於粒徑排阻層析術上進行進一步純化以自半抗體、節-節抗體及更高之聚集物分離。接著，於Superdex200 10/300GL上使用Dionex UltiMate 3000將500 µL樣品注射於含有140 mM NaCl (pH 6.0)之20 mM組胺酸中。此方法容許分餾25至30個樣品/天且因此容許以單臂格式修正大量篩選命中。匯集溶離份並如上文描述再次進行分析。
實例 7
用於胞吞轉送作用分析之hCMEC/D3細胞培養物 用於hCMEC/D3之培養基及補充物(Weksler, B. B.等人，FASEB J.19 (2005), 1872-1874)獲得自Lonza。hCMEC/D3細胞(傳代26至29)係經培養以長滿於塗覆膠原蛋白之蓋玻片(顯微術)或燒瓶上之含有2.5% FBS、四分之一所供應生長因子且經所供應氫化可體松、健他黴素及抗壞血酸完全補充之EBM2培養基中。
就所有胞吞轉送作用分析而言，將高密度孔(1×10
8
個孔/cm
2
) PET膜過濾器嵌入物(0.4 µm孔徑，12 mm直徑)用於12孔細胞培養盤中。針對頂端及基底外側室算得之最佳培養基體積分別係400 µL及1600 µL。對過濾器嵌入物之頂端室塗覆大鼠尾膠原蛋白I (7.5 µg/cm
2
)，接著塗覆纖網蛋白(5 µg/mL)，各培養在RT下持續一個小時。hCMEC/D3細胞於EBM2培養基中歷時10至12天生長成長滿的單層(~2×10
5
個細胞/cm
2
)。
實例 8
單價抗體之胞吞轉送分析 該整體分析係於另外如實例1中描述重新構造之無血清EBM2培養基中進行。具有細胞之過濾器嵌入物在頂端以單價抗體(濃度：2.67 µg/mL)在37℃下培養1小時，接著收集全部頂端及基底外側培養基。自此等值中，計算細胞旁通量。該等單層在RT下於無血清培養基中頂端(400 µL)及基底外側(1600 µL)清洗3 x (每次) 3至5 min。收集所有清洗物以監測移除未結合之抗體之效率。將經預先加熱之培養基添加至頂端室中並將過濾器轉移至含有1600 µL經預先加熱之培養基之新鮮12孔盤(用含有1% BSA之PBS阻斷過夜)中。此時，將過濾器上之細胞溶解於500 µL RIPA緩衝液中以測定特異性抗體攝取。將殘餘之過濾器在37℃下培養且在各種時間點收集樣品以測定抗體之頂端及/或基底外側釋放。樣品中之抗體之含量係使用高度敏感之IgG ELISA定量(參見實例3)。就各時間點而言，自三個過濾器細胞培養物產生資料。
實例 9
胞吞轉送作用分析後之敏感IgG ELISA 整個程序係在RT下使用針對清洗步驟之自動清洗機進行。歷時2小時對384孔盤塗覆30 µL/孔之1 µg/mL抗人類/小鼠-IgG(Fcγ特異性)之PBS溶液，接著於含有1% BSA或1% CroteinC之阻斷緩衝劑PBS中培養1小時以分別供人類及小鼠IgG分析。將來自胞吞轉送作用分析之連續稀釋樣品及標準濃度之用於胞吞轉送作用之抗體添加至盤中並培養2小時。清洗四次後，添加含於阻斷緩衝劑中之30 µL/孔之50 ng/mL抗人類/小鼠-F(ab)2-生物素並再培養2小時。清洗6次後，添加30 µL/孔之50 ng/mL (huIgG分析)或100 ng/mL (mIgG分析)聚-HRP40-鏈黴親和素(Fitzgerald；含於含有1% BSA及0.05%吐溫-20之PBS中)並培養30 min。清洗4次後，藉由添加30 µL/孔之BM化學發光受質(Roche)偵測免疫複合體。使用發光盤讀數器量測發光信號並使用擬合標準曲線計算濃度。該分析之靈敏度介於10 pg/mL至10 ng/mL之範圍內。
實例 10
藉由經hTfR突變體轉染之CHO細胞之細胞ELISA進行抗原決定基繪圖(Epitope mapping)
為能夠測定人類轉鐵蛋白受體(hTfR)上之抗原決定基區域，將突變引入hTfR序列中的其中表面曝露胺基酸簇在經比對之小鼠TfR序列(參見下表)中具有不同胺基酸之位置，此遵循以下基本原理：儘管人類與小鼠TfR間具有顯著同源性(77%一致性)，但未知針對細胞外部分之抗體，其等於異種同源物兩者間顯示良好之交叉反應性。上文描述具有相應突變之質體之選殖。為繪製人類TfR結合物對彼等抗原決定基之結合，CHO-K1細胞經所描述之質體瞬態轉染並於細胞ELISA中量測抗體結合。簡而言之，在實驗前一天，以每孔10
4
個細胞接種於96孔盤之正常生長培養基(RPMI/10% FCS)中盤。前幾天，將培養基換成OPTI-MEM減血清培養基(Gibco)，且在預培養30分鐘後，向該等孔中添加1200 µL OPTI-MEM、12 µg質體DNA及12 µL XtremeGENE轉染試劑(Roche)之混合物中的10 µL。細胞在37℃/7.5% CO
2
下培養2天，然後移除培養基並以1 nM至100 nM之濃度將TfR抗體添加於生長培養基中，接著在4℃下培養2 h。隨後，抗體溶液用含於PBS中之0.05%戊二醛代替並在RT下將細胞固定15 min，然後用PBS清洗兩次且用結合HRP之抗人類-Fc二級抗體(BioRad；1:2000稀釋於ELISA阻斷試劑(Roche)中)在RT下培養1.5小時。信號係在使用每孔50 µL之TMB之PBS清洗3次後產生並於450 nm下量測吸光度。
| 質體# | hTfR 中之突變 |
| 10188 | - |
| 18909 | Thr518Asp/Gln520Lys/Phe521Ser/Gln524Arg |
| 18910 | Arg325Gln |
| 18911 | Ser355Ala/Asp356Arg/Lys358Asn/Thr359Ile |
| 18912 | Asp204Gln/Lys205Ser/Arg208Asn |
| 18913 | Lys574Gly/Glu575Ala/Ile577Thr/Glu578Gln |
| 18914 | Ala196Ile/Gln197Gly/Asn198Gln/Ser199Asn/Val200Met/Ile201Val/Ile202Thr/Val203Ile/Asp204Val/Lys205Gln/Asn206Ser/Gly207Asn/Arg208Gly/Leu209Asn/Val210Leu/Tyr211Asp/Leu212Pro |
| 18974 | Asp245Glu/Tyr247Ser/Thr248Tyr/Pro249Ser |
實例 11
用於人類TfR–抗體相互作用之基於表面電漿共振之結合分析 該結合實驗係於配備經抗人類Fab抗體(GE Healthcare, cat.no 28-9583-25)使用標準胺偶合化學程序根據供應商之說明書預處理之C1感測器晶片(GE Healthcare, cat.no. BR1005-35)之BIAcore B 4000 (GE Healthcare)上進行。
就動力學量測而言，在25℃下施用60秒接觸時間及10 µL/min之流動速率將樣品抗體固定於磷酸鹽緩衝生理鹽水(pH 7.4)、0.05%吐溫20中。以漸增濃度施用重組His6標誌人類轉鐵蛋白受體(R&D系統，cat.no 2474-TR-050)並經時監測信號。記錄30 µL/min流動速率之150秒結合時間及600秒解離時間之平均時間跨度。資料使用1:1結合模式(朗繆爾等溫線)擬合。
實例 12
鼠類及兔抗轉鐵蛋白受體抗體之VH及VL域之人類化 非人類抗轉鐵蛋白受體抗體如下進行人類化：基於表徵包含具有κ輕鏈之IgG1類別之非人類抗轉鐵蛋白受體抗體之VH及VL域之編碼序列及胺基酸序列，相應人類化抗轉鐵蛋白受體抗體基於用於純系299之人類生殖系列框架VH4_3及VK1_10組合藉由CDR移植反向/正向突變而產生。
實例 13
測定人類/食蟹猴TfR受體親和性之方法 在此實例中，闡述測定人類轉鐵蛋白受體親和性以比較解離行為之方法。
就所有分析而言，使用來自GE Healthcare (Instruction 28-9242-34 AB)之生物素CAPture套組。第一，晶片藉由將其對接於BIAcore T200儀器中而復水。此後，將晶片留於流動緩衝液上過夜以備用。就表面製備而言，將生物素CAPture試劑1:100稀釋於流動緩衝液(1xPBS，用0.25 M NaCl補充)中。此溶液以2 µL/min之流動速率歷時360 sec注射於流槽1至4上。接著，感測器表面以三次一分鐘注射生物素CAPture套組中所提供之再生溶液進行調節。此必須針對對接程序或第一次或儲存後完成。100 nM人類或食蟹猴(分別)單生物素化轉鐵蛋白受體溶液應以10 µL/min之流動速率歷時30 sec注射於流槽2上。就親和性測定而言，施用具有六個濃度(500、250、125、62.5、31.25、15.625及0 nM)之注射。其等以180 sec (結合)之注射時間及10 µL/min之流動速率注射於「hu-TfR-流槽」 (例如，如上文闡述製備之流槽2)上。在600 sec之解離階段後，表面根據製造商之使用說明以生物素CAPture中所提供之再生溶液套組進行再生且進行下一循環。
使用BIAcore T200評估軟體評估動力學資料。在施用1:1 朗繆爾結合模型後，尤其將不同人類轉鐵蛋白受體結合物之解離速率常數納入考慮中。
實例 14
人類/食蟹猴轉鐵蛋白受體解離之B4000相對分級 根據製造商之使用說明，將CAP感測晶片(提供於生物素CAPture套組中，S系列#28-9202-34 GE)安裝於BIAcore B4000系統(以流體動力學方式標準化及定址)中。在第一循環中，以10 µL/min之流動速率歷時300 sec將該CAP試劑(如提供於該套組中)定址至斑點1、2、4及5。人類轉鐵蛋白受體捕獲以10 µL/min之流動速率及30 sec之接觸時間發生於斑點1 (生物素化人類轉鐵蛋白受體)及斑點5 (生物素化食蟹猴轉鐵蛋白受體)處。以流動緩衝劑(1xPBS #28995084,GEHealthcare，用0.25M NaCl補充)將該等受體稀釋至50 nM之濃度。以30 µL/min之流動速度以100 nM、50 nM、25 nM及0 nM之濃度系列歷時180 sec將抗體注射於所有流槽內。解離時間設定為300 sec。自CAP晶片中再生完整複合體已利用生物素CAPture套組中所提供之再生溶液(120 sec，10 µL/min流動速率)進行。為控制活性蛋白質濃度，於斑點5中利用生物素化蛋白A (#P2165-2MG, Sigma)以10 µL/min流動速率及30 sec接觸時間進行第二循環。斑點1於此控制循環中保持空之狀態。該等抗體及再生類似循環1中進行處理。使用BIAcore B4000評估軟體計算相關動力學資料。應用1:1解離擬合已測定來自人類轉鐵蛋白受體之解離。