RS62986B1

RS62986B1 - Antitela na transferinski receptor sa prilagođenim afinitetom

Info

Publication number: RS62986B1
Application number: RS20220201A
Authority: RS
Inventors: Stefan Dengl; Guy Georges; Ulrich Goepfert; Jens Niewoehner; Tilman Schlothauer
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2022-03-31
Also published as: KR20250111749A; PE20221007A1; SI3313879T1; RU2018101978A; MX2021015140A; CR20170562A; JP2020097621A; PE20221008A1; MX2021015139A; NZ775342A; EP4074730A1; KR102836826B1; MY193078A; HRP20220304T1; NZ775278A; TW202206464A; TW201713696A; ZA202203653B; AU2016282334A1; WO2016207240A1

Description

OPIS

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na antitela na transferinski receptor sa dizajniranom brzinom disocijacije za humani transferinski receptor i njihovu upotrebu kao transporter modula krvnomoždane barijere.

OSNOVA

Penetracija lekova za neurološke poremećaje u mozak, npr. veliki bioterapeutski lekovi ili lekovi sa malim molekulom koji imaju mali stepen penetracije u mozak, strogo se ograničava prostranom i nepropusnom krvno-moždanom barijerom (KMB) zajedno sa drugim ćelijskim komponentama u neurovaskularnoj jedinici (NVU). Testirane su mnoge strategije za zaobilaženje ove prepreke, a jedna od njih je da se upotrebi transcitozna putanja posredovana endogenim receptorima eksprimiranim na endotelijumu moždanih kapilara (receptor krvnomoždane barijere). Dizajnirani su rekombinantni proteini protiv ovih receptora, kao što su monoklonska antitela ili peptidi, kako bi se omogućila receptorima potpomognuta isporuka bioterapeutskih lekova u mozak. Ipak, strategije za povećanje maksimalnog unosa u mozak uz minimalizaciju pogrešnog sortiranja u endotelnim ćelijama mozga (BEC-ovi) i stepen akumulacije u određenim organelama (posebno u organelama koje omogućavaju degradaciju bioterapije) u BEC-ovima ostaje neistražena.

Monoklonska antitela i drugi bioterapeutici imaju veliki terapeutski potencijal za lečenje patologije u centralnom nervnom sistemu (CNS). Ipak, ovu putanju za unos u mozak sprečava KMB. Prethodna ispitivanja su prikazala da veoma mali procenat (oko 0,1%) IgG koji je ubrizgan u krvotok može da prodre u deo CNS-a (Felgenhauer, Klin. Wschr.52 (1974) 1158-1164). Ovo svakako ograničava bilo koji farmakološki efekat zbog male koncentracije antitela u okviru CNS.

Ranije je utvrđeno da se procenat antitela koje se distribuira u CNS može poboljšati korišćenjem receptora KMB (tj. receptora za transferin, receptora insulina, i slično) (vidi, npr., WO 95/02421).

Zbog toga postoji potreba za sistemima za isporuku lekova za neurološke poremećaje kroz KMB koji će ih efikasno prenositi u mozak.

U WO 2014/033074 prijavljen je transporter za krvno-moždanu barijeru.

U WO 2014/189973 prijavljena su antitela na transferinski receptor i njihova primena. Nadalje je objavljeno da je ciljanje KMB receptora tradicionalnim specifičnim antitelom velikog afiniteta generalno dovelo do ograničenog povećanja transporta KMB. Kasnije je otkriveno da je obim preuzimanja i distribucije antitela u CNS obrnuto povezan sa njegovim afinitetom vezivanja za KMB receptor među proučavanim anti-KMB antitelima. Na primer, antitelo malog afiniteta prema receptoru transferina (TfR) dozirano u terapijskim dozama uveliko poboljšava transport KMB i zadržavanje u CNS-u anti-TfR antitela u odnosu na anti-TfR antitelo većeg afiniteta, i omogućava lakše postizanje terapijske koncentracije u CNS-u (Atwal et al., Sci. Transl. Med.3 (2011) 84ra43). Dokaz takvog transporta kroz KMB dobijen je pomoću bispecifičnog antitela, koje vezuje i TfR i enzim za razlaganje amiloidnog prekursorskog proteina (APP), β-sekretazu (BACE1). Jedna sistemska doza bispecifičnog anti-TfR/BACE1 antitela dizajniranog pomoću antitela malog afiniteta ne samo što je dovela do značajnog preuzimanja antitela u mozak, nego je i dramatično snizila nivoe Aβ1-40 u mozgu u poređenju sa monospecifičnim anti-BACE1 kada se primeni samostalno, što ukazuje na to da prodiranje u KMB utiče na potentnost anti-BACE1 (Atwal et al., Sci. Transl. Med.3 (2011) 84ra43; Yu et al., Sci. Transl. Med.3 (2011) 84ra44).

Dalja temeljna neklinička procena bezbednosti monoklonskih antitela (mAb) namenjenih terapijskoj primeni je veoma važna zbog sve veće složenosti inženjerskih aspekata antitela i varijabilnosti izazvane raznolikošću rekombinantnih proizvodnih ćelijskih sistema za stvaranje antitela. Nadalje, njihova složena struktura, jedinstvene biološke funkcije i duži poluživot mAb u poređenju sa tradicionalnim lekovima sa malim molekulom doprinose razmatranju bezbednosti uz zabrinutost zbog produžene kliničke upotrebe mAb za lečenje hroničnih bolesti (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Kim, S.J., et al., Mol. Cells 20 (2005) 17-29).

Opšti cilj nekliničkih studija za mAb je da se definišu toksikološka svojstva određenog mAb i obezbede informacije za razvoj proizvoda. Glavni ciljevi nekliničke evaluacije su (1) identifikacija ciljnih organa za toksičnost, i određivanje da li je toksičnost reverzibilna nakon tretmana, (2) identifikacija bezbedne početne doze za klinička ispitivanja faze I na ljudima i naknadne šeme eskalacije doze, (3) pružanje informacija za praćenje bezbednosnih parametara u kliničkim ispitivanjima i (4) pružanje bezbednosnih podataka koji podržavaju tvrdnje na etiketi proizvoda. Da bi se postigli ovi ciljevi, sprovode se i in vitro i in vivo nekliničke studije koje imaju za cilj definisanje i razumevanje farmakoloških svojstava antitela (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Cavagnaro, J.A., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.) „Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals“; Hoboken, NJ: Wiley 2008; 45-65).

Za uspešnu nekliničku procenu bezbednosti mAb, najrelevantnije životinjske vrste bi trebalo izabrati za ispitivanje toksičnosti (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Chapman, K., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126). Relevantna vrsta je ona kod koje je antitelo farmakološki aktivno, ciljni antigen bi trebalo da bude prisutan ili eksprimiran, i profil unakrsne reaktivnosti tkiva bi trebalo da bude sličan ljudskom (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Chapman, K., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Koristeći imunohemijske ili funkcionalne testove, može se identifikovati relevantna životinjska vrsta koja eksprimira željeni epitop i pokazuje profil unakrsne reaktivnosti tkiva sličan ljudskim tkivima (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Studije unakrsne reaktivnosti vrsta, koje su korisne u ovom procesu, uključuju imunohistohemijsko ispitivanje tkiva različitih vrsta koristeći komercijalno dostupne mikronizove tkiva više vrsta (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Alternativno, procena vezivanja antitela za ćelije ovih životinja sortiranjem ćelija aktiviranim protokom (FACS) obično je osetljivija od imunohistohemijske analize delova tkiva (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205). Trebalo bi uporediti sekvence DNK i aminokiselina ciljnog antigena među vrstama; trebalo bi utvrditi homologiju između vrsta (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205).

Osim toga, biodistribucija, funkcija i struktura antigena bi trebalo da budu uporedivi između relevantnih životinjskih vrsta i ljudi da bi se omogućila procena toksičnosti koja proizlazi iz vezivanja antitela ciljnog antigena, što se naziva toksičnost na cilj (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; 19,20). Nadalje, velika sličnost u distribuciji ciljnog antigena u tkivu kod životinjskih vrsta i ljudi čine verovatnijim da će ciljni organi toksičnosti identifikovani kod životinja predvideti potencijalnu toksičnost kod ljudi. Nedostatak sličnosti distribucije antigena u tkivu kod životinjskih vrsta i ljudi ne isključuje u potpunosti korišćenje životinjskih vrsta za studije toksičnosti, ali se ove razlike moraju uzeti u obzir za procenu rizika za ljude. Što se tiče gustine ili afiniteta antigena, apsolutna ekvivalencija između životinjskog modela i ljudi na sličan način nije potrebna. Obrazloženje za relevantnost vrsta izabranih za ispitivanje toksičnosti bi trebalo uključiti u regulatorni podnesak. Ako se za procenu bezbednosti koristi samo jedna vrsta, sažetak eksperimenata koji pokazuju odsustvo dodatnih relevantnih vrsta je opravdan (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11).

Ako monoklonsko antitelo namenjeno terapijskoj upotrebi nema unakrsnu reaktivnost vrste, mora se koristiti surogat antitelo ili druga vrsta za model. Stoga su surogat antitela potencijalno rešenje za ograničeno testiranje bezbednosti koje je moguće sa humanizovanim monoklonskim antitelima sa ograničenom unakrsnom reaktivnošću vrsta. Međutim, trenutno ne postoje definisani kriterijumi prema kojima bi potencijalno surogat antitelo trebalo proceniti pre njegove upotrebe prilikom određivanja bezbednosnih problema vezanih za klinički agens (Regulatory Toxicology and Pharmacology Volume 40, Issue 3, December 2004, Pages 219-226).

Stoga, da bi se identifikovao životinjski model za određeno mAb, potrebno je uzeti u obzir gornja razmatranja. Ali ipak je neophodno da određeno mAb ima unakrsnu reaktivnost sa ciljnim antigenom ispitivane vrste. Inače se ne mogu koristiti čak ni najpogodnije vrste za ispitivanje. Stoga postoji potreba za mAb koja nemaju unakrsnu reaktivnost unutar vrsta, već unakrsnu reaktivnost između vrsta za svoj cilj kod ljudi i vrsta namenjenih za neklinička ispitivanja.

U EP 2708560 prijavljeno je antitelo koje specifično prepoznaje transferinski receptor. U FR 2953 841 prijavljena su antitela usmerena na transferinske receptore i njihova upotreba za imunoterapiju tumora zavisnih od gvožđa. U US 2009/162359 prijavljena su dvovalentna, bispecifična antitela.

Ridgway, J.B., et al. su prijavili inženjering „dugme u rupici“ domena antitela CH3 za heterodimerizaciju teškog lanca (Prot. Eng.9 (1996) 617-621). Yu Y.

Joy et al. su prijavili povećanje apsorpcije terapijskih antitela u mozgu smanjenjem njihovog afiniteta prema meti transcitoze (Sci. Translat. Med.3 (2011) 1-8).

WO 93/10819 navodi mišje antihumano antitelo na transferinski receptor 128.1.

REZIME

Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

Utvrđeno je da se antitela na transferinski receptor, kao što je ovde objavljeno, mogu koristiti kao modul transportera krvno-moždane barijere za isporuku moždanog efektora kroz krvno-moždanu barijeru u mozak. U određenim otelotvorenjima, modul transportera krvnomoždane barijere je jednovalentni vezujući entitet koji se specifično vezuje za receptor transferina. Antitela na transferinski receptor, kao što je ovde objavljeno, kada se koriste kao modul transportera krvno-moždane barijere, korisna su, npr. za dijagnozu ili lečenje neuroloških poremećaja, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i Alchajmerova bolest sa pratećom Parkinsonovom bolesti.

Ovde su prijavljena antitela na receptore transferina koja se specifično vezuju za humani transferinski receptor (huTfR) i cinomolgusov transferinski receptor (cyTfR). U određenim otelotvorenjima, antitelo na transferinski receptor

• vezuje se za humani transferinski receptor (huTfR) i cinomolgusov transferinski receptor (cyTfR);

• ima brzinu disocijacije za receptor humanog transferina koja je jednaka ili manja od (tj. najviše) kao kod antitela 128.1 na receptor za transferin cinomolgusa, pri čemu je brzina disocijacije određena površinskom plazmonskom rezonancom, i pri čemu antitelo na transferinski receptor 128.1 ima varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 64 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 65;

• vezuje se za humani transferinski receptor sa brzinom disocijacije koja je između i uključujući 0,11/s i 0,0051/s.

Ovde je otkriveno antitelo na transferinski receptor koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor i transferinski receptor cinomolgusa, koje uključuje

i) humanizovani varijabilni domen teškog lanca dobijen od varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 01, i

ii) humanizovani varijabilni domen lakog lanca dobijen od varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 26,

pri čemu antitelo ima brzinu disocijacije za humani transferinski receptor koja je jednaka ili manja od (tj. najviše) brzine disocijacije antitela 128.1 za transferinski receptor cinomolgusa,

pri čemu je brzine disocijacije određena površinskom plazmonskom rezonancom, i pri čemu antitelo na transferinski receptor 128.1 ima varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 64 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 65.

Jedan aspekt prema pronalasku je humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor (huTfR) koje uključuje

i) sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, i

ii) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37.

U jednom otelotvorenju, brzina disocijacije za humani transferinski receptor je između i uključujući 0,11/s i 0,0051/s.

Ovde je otkriveno antitelo na transferinski receptor koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71, 72 ili 73; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78.

Otkriveno je antitelo na transferinski receptor koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78.

Ovde je otkriveno antitelo na transferinski receptor koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor (huTfR) koje uključuje

i) sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja sadrži najmanje 90% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 24, i

ii) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži najmanje 90% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 37,

pri čemu antitelo ima približno istu brzinu disocijacije kao i antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 24 i sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 37.

U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo je multispecifično antitelo koje ima najmanje jednu specifičnost vezivanja za receptor transferina i najmanje jednu specifičnost vezivanja za terapeutski cilj. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje vezuje transferinski receptor i drugo mesto vezivanja antigena, koje vezuje moždani antigen. U daljem otelotvorenju, moždani antigen se bira iz grupe koju čine humani Abeta, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 (HER2), humani alfa-sinuklein, humani tau, koji je fosforilovan na ostatku tirozina ili serina, humani CD20, amiloidni prekursorski protein (APP) i humana glukocerebrozidaza. U jednom poželjnom otelotvorenju, multispecifično antitelo vezuje

i) transferinski receptor i Abeta, ili

ii) transferinski receptor i CD20, ili

iii) transferinski receptor i alfa-sinuklein, ili

iv) transferinski receptor i fosfo-tau, ili

v) transferinski receptor i HER2, ili

vi) transferinski receptor i glukocerebrozidazu.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 81 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 82 mesto vezivanja za humani Abeta.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 79 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 80 mesto vezivanja za humani CD20. U jednom otelotvorenju, varijabilni region teškog lanca obuhvata zamenu aminokiselinskog ostatka na Kabatovoj poziciji 11 bilo kojom aminokiselinom osim leucinom. U jednom otelotvorenju, supstitucija uključuje zamenu aminokiselinskog ostatka na Kabatovoj poziciji 11 nepolarnom amino kiselinom. U jednom poželjnom otelotvorenju, supstitucija uključuje zamenu aminokiselinskog ostatka na Kabatovoj poziciji 11 u varijabilnom domenu teškog lanca SEQ ID NO: 79 aminokiselinskim ostatkom izabranim iz grupe koju čine valin, leucin, izoleucin, serin i fenilalanin.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 83 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 84 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 85 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 86 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 87 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 88 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 89 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 90 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 91 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 92 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 93 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 94 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i mesto vezivanja za i) glukocerebrozidazu koja ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97, ili ii) funkcionalnu varijantu SEQ ID NO: 97 koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence, ili iii) funkcionalnu varijantu SEQ ID NO: 97 koja ima jednu ili više aminokiselinskih mutacija, delecija ili insercija, ili iv) skraćenu funkcionalnu varijantu SEQ ID NO: 97 koja ima najmanje jedan aminokiselinski ostatak na N-terminusu ili C-kraju ili u izbrisanoj aminokiselinskoj sekvenci, ili v) kombinaciju iii) i iv).

U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo sadrži

i) homodimerni Fc region potklase humanog IgG1 opciono sa mutacijama P329G, L234A i L235A, ili

ii) homodimerni Fc region potklase humanog IgG4 opciono sa mutacijama P329G, S228P i L235E, ili

iii) heterodimerni Fc region, od čega

a) jedan polipeptid Fc regiona sadrži mutaciju T366W, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T366S, L368A i Y407V, ili

b) jedan polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T366W i Y349C, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i S354C, ili

c) jedan polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T366W i S354C, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i Y349C,

ili

iv) heterodimerni Fc region potklase humanog IgG4, pri čemu oba polipeptida Fc regiona sadrže mutacije P329G, L234A i L235A, i

ili

v) heterodimerni Fc region potklase humanog IgG4, pri čemu oba polipeptida Fc regiona sadrže mutacije P329G, S228P i L235E, i

c) jedan polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T366W i S354C, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i Y349C.

U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo je CrossMab.

Ovde je otkriveno antitelo na transferinski receptor koje sadrži

i) varijabilni domen teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57 i 58, i varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 60, 61, 62 i 63,

ili

ii) varijabilni domen teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 i 25, i varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 i 47.

Jedan aspekt je, kao što je ovde objavljeno, farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Jedan aspekt je, kao što je ovde objavljeno, antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek.

Ovde je otkrivena upotreba antitela kao što je ovde objavljeno za proizvodnju leka za lečenje neurološkog poremećaja.

Jedan aspekt pronalaska je antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju neuroloških

1

poremećaja.

U jednom otelotvorenju, neurološki poremećaj je izabran iz grupe u koju spadaju neuropatski poremećaj, neurodegenerativna bolest, kancer, bolest oka, epileptični poremećaj, lizozomska bolest skladištenja, amiloidoza, virusna ili mikrobna bolest, ishemija, poremećaj ponašanja, upala CNS-a, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, multipla skleroza, CD20 pozitivan kancer sa metastazama na mozgu i Her2 pozitivan kancer sa metastazama na mozgu.

Ovde je otkrivena upotreba antitela kao što je ovde objavljeno u proizvodnji leka za transport jednog ili više jedinjenja kroz krvno-moždanu barijeru (KMB).

OPIS SLIKA

Slika 1: Šema analize transcitoze

Slika 2: Brzina disocijacije različitih antitela na transferinski receptor određena na 25 °C korišćenjem BIAcore; 1: 128.1; 2: 128.1 fuzionisano sa anti-pTau antitelom mAb86; 3: 567; 4: 932; 5: 567 fuzionisano sa anti-pTau antitelom mAb86; 6: 1026; 7: 1027; kvadrati: vezivanje za transferinski receptor cinomolgusa; krug: vezivanje za humani transferinski receptor; y-osa: brzina disocijacije [1/s].

Slika 3: Brzina disocijacije različitih antitela na transferinski receptor određena na 37 °C korišćenjem BIAcore; 1: 128.1; 2: 932; 3: 1026; 4: 1027; kvadrati: vezivanje za transferinski receptor cinomolgusa; krug: vezivanje za humani transferinski receptor; y-osa: brzina disocijacije [1/s]

DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA

Ovde je objavljena humanizovana varijanta zečjeg antitela 299 koja pokazuje visoku transcitozu u testu transcitoze prema primeru 8, koja ima unakrsnu reaktivnost na humani i cinomolgusov transferinski receptor, tj. specifično se vezuje za oba ortologa transferinskog receptora, koja pokazuje dobro bojenje ćelija i koja ima sličan poluživot (što se odražava i na brzinu disocijacije) kao mišje antitelo 128.1 za cinomolgusov transferinski receptor za humani transferinski receptor.

Jedan aspekt pronalaska je humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor koji sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 37.

U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo ima utišanu efektorsku funkciju. U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo se specifično vezuje za humani transferinski receptor i za cinomolgusov transferinski receptor.

U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo je

a) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1, ili

b) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4, ili

c) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G,

d) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i opciono P329G,

e) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu, ili

f) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i opciono P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu.

Jedan aspekt pronalaska je bispecifično antitelo koje sadrži

i) prvo mesto vezivanja koje sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37,

i

ii) drugo mesto vezivanja izabrano od

a) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 81 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 82, ili

b) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 83 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 84, ili

c) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 85 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 86, ili

d) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 87 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 88, ili

e) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 91 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 92, ili

f) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 89 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 90, ili

g) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 93 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 94, ili

h) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 79 i varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 80.

Jedan aspekt pronalaska je farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo iz pronalaska i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač.

Jedan aspekt pronalaska je antitelo iz pronalaska za upotrebu kao lek.

Jedan aspekt pronalaska je antitelo iz pronalaska za upotrebu u lečenju neurološkog poremećaja.

Jedan aspekt pronalaska je upotreba antitela iz pronalaska u proizvodnji leka.

Ovde je otkrivena metoda lečenja koja se sastoji od primene antitela kao što je ovde objavljeno za lečenje neurološkog poremećaja.

I. DEFINICIJE

„Humani akceptorski okvir“ je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Humani akceptorski okvir „dobijen od“ okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao i ova dva okvira, ili može da sadrži izmene u aminokiselinskoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, broj aminokiselinskih izmena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL humani akceptorski okvir je po sekvenci identičan sekvenci VL okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa.

„Afinitet“ se odnosi na jačinu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.

Termin „afinitetno zrelo“ antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.

Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.

„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo

1

netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

Termin „himerno“ antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.

„Klasa“ antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

„Efektorske funkcije“ ukazuju na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koje variraju sa klasom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodno regulisanje površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.

„Delotvorna količina“ agensa, npr. neke farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima delotvorna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.

Termin „Fc region“ u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Termini „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „kompletno antitelo“ u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi za ukazivanje na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano.

Termini „ćelija domaćin“, „linija ćelije domaćina“ i „kultura ćelija domaćina“ koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji.

„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja najčešće aminokiselinske ostatke u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols.1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat i sar., gore navedeno. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat et al., gore navedeno.

„Humanizovano“ antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke nehumanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke humanih FR-ova. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. nehumanog antitela, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.

Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“) i formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigenski kontakti“). Generalno, antitela obuhvataju šest HVR regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3).

U ovom dokumentu, HVR regioni uključuju

(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32

1

(L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) (Chothia, C. i Lesk, A.M., J. Mol. Biol.196 (1987) 901-917);

(b) CDR-ove koji se javljaju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Rabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);

(c) kontakte antigena koji se javljaju na ostacima aminokiselina 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); i

(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).

Osim ako nije drugačije naznačeno, ostaci HVR i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema Rabat et al., gore navedeno.

„Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, pripitomljene životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i neljudske primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.

„Izolovano“ antitelo je ono koje je odvojeno od komponente svog prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforezom (npr., SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reversno faznom HPLC). Za pregled metoda za određivanje čistoće antitela pogledajte npr. Flatman, S. i sar. J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

„Izolovana“ nukleinska kiselina se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.

Termin „monoklonsko antitelo“, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže ovu populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve varijante su obično prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot

1

preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.

„Nativna antitela“ se odnose na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.

Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se tipično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede

1

odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.

U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.

Termin „farmaceutska formulacija“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ se odnosi na sastojak farmaceutske formulacije, osim aktivnog sastojka, koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, bez ograničenja, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

U smislu ovog dokumenta, „lečenje“ (i gramatički oblici ove reči, kao što je „lečiti“)

1

odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.

Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učestvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Vidite npr. Kindt, T.J. i sar. Kuby Immunology, 6. izd, W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), strana 91) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen radi pregledanja biblioteke komplementarnih VL odnosno VH domena. Vidite npr. Portolano, S. i sar. J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628). Numeracija aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu (varijabilni region lakog lanca i teškog lanca) biće urađena prema Kabatu (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., BethesdaMD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols.1-3).

Termin „vektor“, kako se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori“.

Termin „krvno-moždana barijera“ (KMB) označava fiziološku barijeru između perifernog krvotoka i mozga i kičmene moždine koja nastaje tesnim povezivanjem u endotelnim membranama plazme moždanih kapilara, stvarajući čvrstu barijeru koja ograničava transport molekula u mozak, čak i veoma malih molekula, kao što je urea (60 daltona). KMB u mozgu, krvno-moždana barijera u kičmenoj moždini i krvno-retinalna barijera u retini predstavljaju granične kapilarne barijere u CNS-u, i ovde se zbirno pominju kao krvnomoždana barijera ili KMB. KMB takođe obuhvata krvno-CSF barijeru (horoidni pleksus), gde se barijera sastoji od ependimalnih ćelija a ne od kapilarnih endotelnih ćelija.

Termin „centralni nervni sistem“ (CNS) označava kompleks nervnih tkiva koja

1

kontrolišu telesne funkcije, i uključuje mozak i kičmenu moždinu.

Termin „receptor krvno moždane barijere“ (KMBR) označava receptorski protein vezan za ekstracelularnu membranu eksprimiran na endotelnim ćelijama mozga koji može da prenosi molekule kroz KMB ili da se koristi za transport egzogeno primenjenih molekula. Primeri za KMBR uključuju ali nisu ograničeni na transferinski receptor (TfR), insulinski receptor, receptor insulinu sličnog faktora rasta (IGF-R), receptore lipoproteina male gustine, uključujući, bez ograničenja, protein 1 koji povezan sa receptorom lipoproteina male gustine (LRP1) i protein 8 koji je povezan sa receptorom lipoproteina male gustine (LRP8), kao i faktor rasta sličan epidermalnom faktoru rasta koji vezuje heparin (HB-EGF). Primer za KMBR je transferinski receptor (TfR).

Termin „entitet moždanog efektora“ označava molekul koji treba da se transportuje u mozak preko KMB. Entitet efektora obično ima karakterističnu terapijsku aktivnost koja treba da se dovede do mozga. U entitete efektora spadaju lekovi za neurološki poremećaj i citotoksična sredstva, kao što su, npr. polipeptidi i antitela, konkretno, monoklonska antitela ili njihovi fragmenti usmereni na cilj u mozgu.

Termin „jednovalentni vezujući entitet“ označava molekul kojm može namenski da se veže i u režimu jednovalentnog vezivanja za KMBR. Modul krvno-moždanog transportera i/ili konjugat, kao što je ovde objavljeno, karakteriše prisustvo jedne jedinice jednovalentnog vezujućeg entiteta, tj. modula krvno-moždanog transportera i/ili konjugata iz predmetnog pronalaska koji se sastoji tačno od jedne jedinice jednovalentnog vezujućeg entiteta. Jednovalentni vezujući entitet uključuje, ali se ne ograničava na, polipeptide, antitela pune dužine, fragmente antitela uključujući Fab, Fab', Fv fragmente, jednolančane molekule antitela kao što su npr. jednolančani Fab, scFv. Jednovalentni vezujući entitet može, na primer, da bude skeletni protein kreiran pomoću najnovijih tehnologija, kao što je prikaz faga ili imunizacija. Jednovalentni vezujući entitet može da bude polipeptid. U određenim otelotvorenjima, jednovalentni vezujući entitet sastoji se od CH2-CH3 Ig domena i jednog lanca Fab (scFab) usmerenog na receptor krvno-moždane barijere. scFab je spojen sa C-terminalnim krajem CH2-CH3 Ig domena pomoću linkera. U određenim prikazima, scFab je usmeren na transferinski receptor.

Termin „jednovalentni režim vezivanja“ označava specifično vezivanje za KMBR gde se interakcija između jedovalentnog veznog entiteta i KMBR odvija kroz jedan epitop. Jednovalentni režim vezivanja sprečava dimerizaciju/multimerizaciju KMBR usled tačke interakcije u jednom epitopu. Jednovalentni režim vezivanja sprečava promenu intracelularnog sortiranja KMBR.

2

Termin „epitop“ označava bilo koju determinantu polipeptida koja ima sposobnost specifičnog vezivanja za antitelo. U određenim otelotvorenjima, determinante epitopa uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i, u određenim otelotvorenjima, mogu da imaju posebne trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili posebne karakteristike naelektrisanja. Epitop je oblast antigena koja je vezana antitelom.

„Transferinski receptor“ (TfR) je transmembranski glikoprotein (molekulske mase oko 180.000 Da) sastavljen od dve podjedinice vezane disulfidnom vezom (svaka ima prividnu molekulsku masu oko 90.000 Da) koji učestvuje u preuzimanju gvožđa kod kičmenjaka. U jednom otelotvorenju, ovde je TfR humani TfR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je objavljeno u: Schneider et al. (Nature 311 (1984) 675 - 678).

Termin „agens za imidžing“ označava jedinjenje koje ima jednu ili više osobina koje dopuštaju da se njegovo prisustvo i/ili lokacija detektuju direktno ili indirektno. Primeri takvih agensa za imidžing uključuju proteine i jedinjenja sa malim molekulom, koji u sebi sadrže obeleženi deo koji omogućava detekciju.

Termini „CNS antigen“ ili „cilj u mozgu“ označavaju antigen i/ili molekul eksprimiran u CNS-u, uključujući mozak, koji može biti cilj za antitelo ili mali molekul. Primeri za takve antigene i/ili molekule uključuju, bez ograničenja: beta-sekretazu 1 (BACE1), amiloid beta (Abeta), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), receptor 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2), Tau, apolipoprotein E4 (ApoE4), alfa-sinuklein, CD20, hantingtin, prionski protein (PrP), ponovljenu kinazu bogatu leucinom 2 (LRRK2), parkin, presenilin 1, presenilin 2, gama sekretazu, receptor smrti 6 (DR6), amiloidni prekursorski protein (APP), p75 neurotrofinski receptor (p75NTR), glukocerebrozidazu i kaspazu 6.

Termin „koji se specifično vezuje“ označava antitelo koje se selektivno ili preferencijalno vezuje za antigen. Afinitet prema vezivanju se generalno određuje standardnim testom, kao što je Skačardova analiza, ili tehnika površinske plazmonske rezonance (npr. primenom BIACORE®).

Termin „CH2-CH3 Ig entitet“ na način na koji se koristi ovde odnosi se na entitet proteina dobijen iz CH2 ili CH3 domena imunoglobina. „CH2-CH3 Ig entitet“ sastoji se od dva „CH2-CH3“ polipeptida koji formiraju dimer. Imunoglobulin može da bude IgG, IgA, IgD, IgE ili IgM. U jednom prikazu, CH2-CH3 Ig entitet dobijen je iz imunoglobulina IgG i ovde je naveden pod nazivom „CH2-CH3 IgG entitet“. Termin uključuje nativnu sekvencu CH2-CH3 domena i varijantu CH2-CH3 domena. U jednom prikazu, „CH2-CH3 Ig entitet“ potiče iz IgG domena humanog teškog lanca CH2-CH3 koji se pruža od Cys226, ili od Pro230, do karboksi terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numeracija ostataka aminokiselina u regionu CH2-CH3 domena ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekvence proteina od interesa za imunologiju), 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

„Konjugat“ je fuzioni protein iz predmetnog pronalaska konjugovan sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali se ne ograničavajući na oznaku, lek za neurološki poremećaj ili citotoksični agens.

Termin „linker“ označava hemijski linker ili jednolančani peptidni linker koji kovalentno povezuje različite entitete modula transportera krvno-moždane barijere i/ili fuzionog polipeptida i/ili konjugata kao što je ovde objavljeno. Linker, na primer, povezuje entitet moždanog efektora sa jednovalentnim vezujućim entitetom. Na primer, ako se jednovalentni vezujući entitet sastoji od entiteta CH2-CH3 Ig i scFab usmerenog na receptor krvno-moždane barijere, tada linker konjuguje scFab na C-terminalni kraj entitetaCH3-CH2 Ig. Linker koji konjuguje entitet moždanog efektora sa jednovalentnim vezujućim entitetom (prvi linker) i linker koji povezuje scFab sa C-terminalnim krajem CH2-CH3 Ig domena (drugi linker) može da bude isti ili različit.

Mogu da se koriste peptidni linkeri sa jednim lancem, koji se sastoji od jednog do dvadeset ostataka aminokiselina povezanih peptidnim vezama. U nekim otelotvorenjima, aminokiseline su izabrane od dvadeset aminokiselina koje postoje u prirodi. U nekim drugim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselina je izabrana između glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. U drugim otelotvorenjima, linker je hemijski linker. U određenim otelotvorenjima, linker je peptidni linker sa jednim lancem sa aminokiselinskom sekvencom čija je dužina najmanje 25 ostataka aminokiselina, u jednom poželjnom otelotvorenju, dužine od 32 do 50 ostataka aminokiselina. U jednom otelotvorenju, peptidni linker je (GxS)n linker sa G = glicin, S = serin, (x =3, n=8, 9 ili 10) ili (x = 4 i n= 6, 7 ili 8), u jednom otelotvorenju sa x =4, n=6 ili 7, u jednom poželjnom otelotvorenju sa x=4, n=7. U jednom otelotvorenju, linker je (G4S)4 (SEQ ID NO: 95). U jednom otelotvorenju, linker je (G4S)6G2 (SEQ ID NO: 96).

Vezivanje može biti izvršeno pomoću raznovrsnih hemijskih linkera. Na primer, jednovalentni vezujući entitet ili fuzioni polipeptid i entitet moždanog efektora mogu se konjugovati pomoću raznovrsnih bifunkcionalnih agensa za kuplovanje proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-I-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HC1), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Linker može biti "raskidivi linker", koji olakšava oslobađanje entiteta efektora nakon isporuke u mozak. Na primer, kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker sa disulfidom (Chari et al., Cancer Res.52 (1992) 127-131; US 5,208,020) mogu da se koriste.

Kovalentno vezivanje može biti direktno ili preko linkera. U pojedinim otelotvorenjima, direktna konjugacija je putem konstrukcije polipeptidne fuzije (tj. genetskom fuzijom dva gena koji šifriraju jednovalentni vezujući entitet za KMBR i entitet efektora i ekspimirana kao jedan polipeptid (lanac)). U pojedinim otelotvorenjima, direktna konjugacija je stvaranjem kovalentne veze između reaktivne grupe na jednom od dva dela jednovalentnog vezujućeg entiteta za KMBR i odgovarajuće grupe ili akceptora na entitetu moždanog efektora. U pojedinim otelotvorenjima, direktna konjugacija je modifikacijom (tj. genetskom modifikacijom) jednog od dva molekula koji treba da se vežu da se obuhvati reaktivna grupa (kao neograničavajući primeri, sulfhidrilna grupa ili karboksilna grupa) koja formira kovalentnu vezu sa drugim molekulom koji treba da se veže pod odgovarajućim uslovima. Kao jedan neograničavajući primer, molekul (tj. aminokiselina) sa željenom reaktivnom grupom (tj. cisteinskim ostatkom) može biti uveden npr. u jednovalentni vezujući entitet prema KMBR, i disulfidna veza formirana sa neurološkim lekom. Postupci za kovalentno vezivanje nukleinskih kiselina za proteine takođe su poznati u struci (tj. foto umrežavanje, pogledajte, npr. Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74 (2005) 77-95). Vezivanje takođe može biti izvršeno pomoću raznovrsnih linkera. Na primer, jednovalentni vezujući entitet i entitet efektora mogu se povezati pomoću raznovrsnih bifunkcionalnih agensa za kuplovanje proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HC1), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Peptidni linkeri, koji se sastoje od jednog do dvadeset ostataka aminokiselina povezanih peptidnim vezama, mogu takođe da se koriste. U nekim takvim otelotvorenjima, ostaci aminokiselina su

2

izabrani od dvadeset aminokiselina koje postoje u prirodi. U nekim drugim takvim otelotvorenjima, jedan ili više ostataka aminokiselina je izabrano od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. Linker može biti "raskidivi linker", koji olakšava oslobađanje entiteta efektora nakon isporuke u mozak. Na primer, kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker sa disulfidom (Chari et al., Cancer Res.52 (1992) 127-131; US 5,208,020) mogu da se koriste.

II. SMEŠE I POSTUPCI

Ravnotežne konstante disocijacije (KD) obično se koriste za opisivanje molekulskih interakcija. Koristi se kao mera za jačinu međusobne interakcije dva molekula (npr. afinitet). Dakle, KDvrednost je mera za jačinu bimolekulske interakcije.

Ali KDvrednost kao takva ne opisuje kinetiku molekulske interakcije, tj. na osnovu KDvrednosti se ne može zaključiti, sa jedne strane, koliko se brzo dva molekula vezuju jedan za drugi (konstanta brzine asocijacije ili „brzina direktne reakcije“), a sa druge strane, koliko brzo molekuli disosuju (konstanta brzine disocijacije ili „brzina povratne reakcije“). Karakterizacija bimolekulske interakcije samo pomoću njihove KDvrednosti zanemaruje činjenicu da se identična KDvrednost može dobiti na osnovu ekstremno različitih (različiti redovi veličine) brzina direktne i povratne reakcije, jer je KDvrednost njihov količnik.

Ali brzina direktne i povratne reakcije su važne za karakterizaciju ponašanja vezivanja molekula. Brzina povratne reakcije je posebno važna jer karakteriše trajanje vezivanja npr. antitela za njegov antigen. Duga brzina povratne reakcije odgovara sporoj disocijaciji formiranog kompleksa, dok kratka brzina povratne reakcije odgovara brzoj disocijacijj.

Da bi se ostvarila dugotrajna (tj. koja zahteva ređe doziranje) ili prilagođena (npr. u zavisnosti od uslova okoline) interakcija, brzine povratne reakcije moraju da se odrede eksperimentalno. Ovo je još važnije jer je skoro nemoguće predvideti brzinu povratne reakcije. Dodatno, korelacija između brzine povratne reakcije i afiniteta vezivanja je loša, kao što je gore navedeno. Na primer, zbog činjenice da je KDvrednost odnos brzine direktne i povratne reakcije, čak i slaba veziva mogu da ostanu vezana dugo za svoj cilj, dok čvrsta veziva mogu brzo da disosuju.

Tipično usko grlo u projektima generisanja antitela je rangiranje mnogih kandidata dobijenih nakon pregleda na osnovu jačine vezivanja antitela. U idealnom slučaju, takva metoda će raditi bez prethodnog označavanja antigena i sa sirovim bakterijskim lizatima. Ylera, F., et al. (Anal. Biochem. 441 (2013) 208-213) objavili su metodu skrininga brzine povratne reakcije za odabir antitela na lekove visokog afiniteta iz sirovih lizata Escherichia coli koji sadrže jednovalentne Fab fragmente. Izabrali su brzinu povratne reakcije kao parametar rangiranja jer je, između ostalog, brzina povratne reakcije nezavisna od koncentracije. Izabrali su jednovalentni format da bi izbegli efekte avidnosti tokom rangiranja brzine povratne reakcije i određivanja afiniteta jer bi se posmatrali sa punim IgG. Ylera et al. su pronašli da je klon sa najboljom brzinom koff identifikovan korakom rangiranja koff, ali ne bi bio identifikovan koristeći samo jačinu signala ELISA kao kriterijum odabira.

Murray, J.B., et al. (J. Med. Chem. 57 (2014) 2845-2850) objavili su "Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance as An Efficient Method to Kinetically Sample Hit to Lead Chemical Space from Unpurified Reaction Products". Istaknuto je da je konstanta brzine disocijacije kd (brzina povratne reakcije) komponenta vezivanja ligandprotein sa najznačajnijim potencijalom za poboljšanje potentnosti jedinjenja. Autori ističu da je kinetičko merenje afiniteta kroz program otkrivanja lekova informativnije od određivanja ravnoteže afiniteta u stacionarnom stanju. Na primer, jedinjenje sa 10 puta manjom brzinom direktne i povratne reakcije ne bi se prepoznao kao različit ako bi se procenio prema ravnotežnim merama afiniteta. Nadalje, autori su otkrili da podaci utvrđeni pomoću instrumenta BIAcore T200 pokazuju prosečnu razliku kd između sirovih i čistih uzoraka od 19%, slično tome, podaci utvrđeni sa starijim BIAcore T100 instrumentom imaju razliku od 15%. Autori primećuju da se id razlikuju u proseku za samo 30% na različitim instrumentima tokom vremena. Ovo pokazuje da kontaminacija prenošenja, dugotrajno skladištenje i različita oprema imaju skroman uticaj na posmatrani kd. Zaista, ova mala odstupanja kd blisko odražavaju razlike uočene u studijama izvedenim u više laboratorija, gde je prijavljeno da je uočena varijabilnost od 14% do 40%, u zavisnosti od sistema (Murray, J.B., et al., J. Med. Chem. 57 (2014) 2845-2850; Katsamba, P.S., et al., Anal. Biochem. 352 (2006) 208-221).

U WO 2014/189973 prijavljena su antitela na transferinski receptor i njihova primena. Nadalje je objavljeno da je ciljanje KMB receptora tradicionalnim specifičnim antitelom velikog afiniteta generalno dovelo do ograničenog povećanja transporta KMB. Kasnije je otkriveno da je obim preuzimanja i distribucije antitela u CNS obrnuto povezan sa njegovim afinitetom vezivanja za KMB receptor među proučavanim anti-KMB antitelima. Na primer, antitelo malog afiniteta prema receptoru transferina (TfR) dozirano u terapijskim dozama uveliko poboljšava transport KMB i zadržavanje u CNS-u anti-TfR antitela u odnosu na anti-TfR antitelo većeg afiniteta, i omogućava lakše postizanje terapijske koncentracije u CNS-u (Atwal et al., Sci. Transl. Med.3 (2011) 84ra43). Dokaz takvog transporta kroz KMB dobijen je pomoću bispecifičnog antitela, koje vezuje i TfR i enzim za razlaganje amiloidnog prekursorskog proteina (APP), β-sekretazu (BACE1). Jedna sistemska doza bispecifičnog anti-TfR/BACE1 antitela dizajniranog pomoću antitela malog afiniteta ne samo što je dovela do

2

značajnog preuzimanja antitela u mozak, nego je i dramatično snizila nivoe Aβ1-40 u mozgu u poređenju sa monospecifičnim anti-BACE1 kada se primeni samostalno, što ukazuje na to da prodiranje u KMB utiče na potentnost anti-BACE1 (Atwal et al., Sci. Transl. Med.3 (2011) 84ra43; Yu et al., Sci. Transl. Med.3 (2011) 84ra44).

Dostupni podaci i eksperimenti ističu nekoliko uzročnih mehanizama koji stoje iza povećanog prolaza antitela u CNS, primenom pristupa antitela sa manjim afinitetom.

Kao prvo, antitela velikog afiniteta na KMB receptor (KMB-R) (npr. anti-TfRA antitelo iz Atwal et al. i Yu et al., gore navedeno)) ograničavaju prolaz u mozak tako što brzo zasite KMB-R u vaskulaturi mozga, i tako smanjuju ukupnu količinu antitela koje je uneto u mozak, i takođe ograničavaju njegovu distribuciju u vaskulaturi. Upadljivo je da snižavanje afiniteta prema KMB-R poboljšava prolaz i distribuciju u mozgu, uz snažno pomeranje lokalizacije od vaskulature do neurona i povezanog neuropila distribuiranog u CNS-u. Utvrđeno je da afinitet mora biti ispod određenog gornjeg nivoa i iznad određenog donjeg nivoa.

Kao drugo, predloženo je da manji afinitet antitela prema KMB-R-u pogoršava sposobnost antitela da se vrati na vaskularnu stranu KMB putem KMB-R sa CNS strane membrane, jer je ukupni afinitet antitela prema KMB-R-u mali, i lokalna koncentracija antitela na CNS strani KMB nije zasićujuća, usled brzog dispergovanja antitela u CNS kompartmentu.

Kao treće, in vivo, i kao što je primećeno za TfR sistem, antitela sa manjim afinitetom prema KMB-R-u ne uklanjaju se tako efikasno iz sistema kao ona sa većim afinitetom prema KMB-R-u, i tako u većim koncentracijama ostaju u krvotoku u poređenju sa odgovarajućim antitelima sa većim afinitetom. To predstavlja prednost, jer se nivoi antitela sa manjim afinitetom u krvotoku održavaju na terapeutskim nivoima u dužem periodu u poređenju sa odgovarajućim antitelima sa većim afinitetom, što ima za posledicu poboljšanje prolaza antitela u mozak u dužem periodu vremena. Nadalje, ovo poboljšanje izloženosti plazme i mozga može da smanji učestalost doziranja na klinici, što bi potencijalno bilo korisno ne samo zbog komplijanse pacijenata, nego bi uticalo na smanjenje svih potencijalnih neželjenih dejstava ili dejstava antitela i/ili za njega vezanog terapeutskog jedinjenja koja nisu ciljana.

Ove prethodne studije su koristile mišja antitela koja su se specifično vezala za mišji TfR, ali koja nisu specifično prepoznala TfR primata ili čoveka. U skladu sa tim, ovde su data antitela i njihovi funkcionalni delovi koji specifično prepoznaju primate, posebno cinomolgusa, i humani TfR, kako bi se olakšala ispitivanja bezbednosti i efikasnosti kod primata sa antitelima pre terapijske ili dijagnostičke upotrebe kod ljudi.

Temeljna neklinička procena bezbednosti monoklonskih antitela (mAb) namenjenih terapijskoj primeni je veoma važna zbog sve veće složenosti aspekata inženjeringa antitela i

2

varijabilnosti izazvane raznolikošću rekombinantnih proizvodnih ćelijskih sistema za stvaranje antitela. Nadalje, njihova složena struktura, jedinstvene biološke funkcije i duži poluživot mAb u poređenju sa tradicionalnim lekovima sa malim molekulom doprinose razmatranju bezbednosti uz zabrinutost zbog produžene kliničke upotrebe mAb za lečenje hroničnih bolesti (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Kim, S.J., et al., Mol. Cells 20 (2005) 17-29).

Opšti cilj nekliničkih studija za mAb je da se definišu toksikološka svojstva određenog mAh i obezbede informacije za razvoj proizvoda. Glavni ciljevi nekliničke evaluacije su (1) identifikacija ciljnih organa za toksičnost, i određivanje da li je toksičnost reverzibilna nakon tretmana, (2) identifikacija bezbedne početne doze za klinička ispitivanja faze I na ljudima i naknadne šeme eskalacije doze, (3) pružanje informacija za praćenje bezbednosnih parametara u kliničkim ispitivanjima i (4) pružanje bezbednosnih podataka koji podržavaju tvrdnje na etiketi proizvoda. Da bi se postigli ovi ciljevi, sprovode se i in vitro i in vivo nekliničke studije koje imaju za cilj definisanje i razumevanje farmakoloških svojstava antitela (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Cavagnaro, J.A., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.) „Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals“; Hoboken, NJ: Wiley 2008; 45-65).

Za uspešnu nekliničku procenu bezbednosti mAb, najrelevantnije životinjske vrste bi trebalo izabrati za ispitivanje toksičnosti (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Chapman, K., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126). Relevantna vrsta je ona kod koje je antitelo farmakološki aktivno, ciljni antigen bi trebalo da bude prisutan ili eksprimiran, i profil unakrsne reaktivnosti tkiva bi trebalo da bude sličan ljudskom (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Chapman, K., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007) 120-126; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Koristeći imunohemijske ili funkcionalne testove, može se identifikovati relevantna životinjska vrsta koja eksprimira željeni epitop i pokazuje profil unakrsne reaktivnosti tkiva sličan ljudskim tkivima (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Studije unakrsne reaktivnosti vrsta, koje su korisne u ovom procesu, uključuju imunohistohemijsko ispitivanje tkiva različitih vrsta koristeći komercijalno dostupne mikronizove tkiva više vrsta (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Hall, W.C., et al., In: Cavagnaro, J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 207-240). Alternativno, procena vezivanja antitela za ćelije ovih životinja sortiranjem ćelija aktiviranim protokom (FACS) obično je osetljivija od imunohistohemijske

2

analize delova tkiva (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205). Trebalo bi uporediti sekvence DNK i aminokiselina ciljnog antigena među vrstama; trebalo bi utvrditi homologiju između vrsta (Lynch, C.M., et al., mAbs 1 (2009) 2-11; Subramanyam, M. and Mertsching, E., In: Cavagnaro J.A. (Ed.); Preclinical safety evaluation of biopharmaceuticals. Hoboken, NJ: Wiley 2008; 181-205).

Stoga, da bi se identifikovao životinjski model za određeno mAb, potrebno je uzeti u obzir razmatranja iznad. Ali ipak je neophodno da određeno mAb ima unakrsnu reaktivnost sa ciljnim antigenom ispitivane vrste. Inače se ne mogu koristiti čak ni najpogodnije vrste za ispitivanje. Stoga postoji potreba za mAb koja nemaju unakrsnu reaktivnost unutar vrsta, već unakrsnu reaktivnost između vrsta za svoj cilj kod ljudi i vrsta namenjenih za neklinička ispitivanja.

A. Primeri za antitransferinska antitela

2

Ovde su prijavljena antitela na transferinske receptore koja imaju brzinu disocijacije za vezivanje za humani transferinski receptor u određenom rasponua da bi se obezbedilo pravilno prebacivanje KMB. Utvrđeno je da je ovaj raspon na jednom kraju definisan brzinom disocijacije mišjeg antitela na transferinski receptor 128.1 (sekvence aminokiselina varijabilnog domena date u SEQ ID NO: 64 i 65) koja je određena površinskom plazmonskom rezonancom za transferinski receptor cinomolgusa, a na drugom kraju putem 5 % te brzine disocijacije (tj. 20 puta sporija disocijacija). U jednom otelotvorenju, brzina disocijacije za humani transferinski receptor je između i uključujući 0,11/s i 0,0051/s.

Humanizovana antitela klona 299 prema pronalasku nisu bila dostupna primenom standardnih tehnika humanizacije. Bilo je potrebno uvesti nestandardne mutacije u aminokiselinsku sekvencu da bi se dobilo humanizovano antitelo sa brzinom disocijacije vezivanja transferinskih receptora u predviđenom rasponu i uključujući 0,11/s i 0,0051/s. Ovo je posebno važno pošto se antitela, kao što je objavljeno ovde, razvijaju za prelazak humane krvno-moždane barijere kako bi se terapeutski teret prebacio u mozak.

Utvrđeno je da su u cilju dobijanja pogodnog humanizovanog antitela koje se može razviti, dva cisteinska aminokiselinska ostatka u lakom lancu matičnog zečjeg antitela morala biti zamenjena prolinom, odnosno asparaginskim aminokiselinskim ostatkom. Osim što je bio u datom rasponu brzine disocijacije, ostatak serina prisutan u sredini zečjeg CDRL3 morao je biti zamenjen ostatkom alanina.

Nadalje je utvrđeno da je korisno promeniti tri aminokiselinska ostatka u teškom lancu na položajima 65, 100g i 105 (numeracija prema Kabatu).

Sva numeracija, kao što se ovde koristi, zasniva se na Kabatovoj šemi numeracije varijabilnih domena.

Klon 299 zečjeg antitransferinskog antitela pokazao je svojstva uporediva sa antitelom na transferinski receptor 128.1. To se može videti iz sledeće tabele.

2

U sledećoj tabeli prikazana je brzina disocijacije humanizacije varijanti zečjeg varijabilnog domena lakog lanca klona 299 u kombinaciji sa varijantama humanizacije zečjeg varijabilnog domena teškog lanca klona 299. Partner za vezivanje je bio humani transferinski receptor (određen na 25 °C).

1

2

Kombinacija VH23 sa VL9 je odabrana kao polazna tačka za dalji inženjering za razvoj mesta vezivanja koje odražava svojstva vezivanja antitela 128.1 za transferinski receptor cinomolgusa u odnosu na vezivanje za humani transferinski receptor.

U sledećoj tabeli prikazane su brzine disocijacije različitih primera varijanti VH23 i VL9, kao i drugih različitih varijanti humanizacije varijabilnog domena za humani transferinski receptor (određene prema primeru 14, 25 °C).

� U sledećoj tabeli kinetički podaci različitih primera varijanti VH23 i VL9 prikazani su uporedno (određeno prema primeru 13).

U sledećoj tabeli prikazane su brzine disocijacije humanizacije varijanti mišjeg varijabilnog domena lakog lanca klona 494 u kombinaciji sa varijantama humanizacije mišjeg varijabilnog domena teškog lanca klona 494. Partner za vezivanje bio je humani transferinski receptor.

Detaljnije, u jednom aspektu, pronalazak se delom zasniva na nalazu da se antitelo na transferinski receptor, kao što je ovde objavljeno, može koristiti kao modul transportera krvnomoždane barijere za isporuku entiteta moždanog efektora kroz krvno-moždanu barijeru u mozak. U određenim otelotvorenjima, modul transportera krvno-moždane barijere je jednovalentni vezujući entitet koji se specifično vezuje za receptor transferina. Antitela na transferinski receptor, kao što je ovde objavljeno, kada se koriste kao modul transportera krvno-moždane barijere, korisna su, npr. za dijagnozu ili lečenje neuroloških poremećaja, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i Alchajmerova bolest sa pratećom Parkinsonovom bolesti.

Pronađeno je da antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 odražava u odnosu na svojstva humanog transferinskog receptora svojstva vezivanja mišjeg antitela 128.1 u odnosu na transferinski receptor cinomolgusa u pogledu brzine disocijacije.

Shodno tome, jedan aspekt kao što je ovde objavljeno je izolovano antitelo koje se vezuje za humani transferinski receptor (huTfR) i transferinski receptor cinomolgusa (cyTfR), pri čemu antitelo ima brzinu disocijacije određenu površinskom plazmonskom rezonancom za humani transferinski receptor od 0,11/ s do 0,0051/s.

Drugi aspekt koji je ovde otkriven je upotreba antitela ili fragmenta antitela koji se vezuje za humani transferinski receptor (huTfR) i transferinski receptor cinomolgusa (cyTfR), pri čemu antitelo ima brzinu disocijacije određenu površinskom plazmonskom rezonancom za humani transferinski receptor od 0,11/s do 0,0051/s, za isporuku terapeutskog entiteta preko krvno-moždane barijere.

U jednom otelotvorenju, brzina disocijacije je određena na 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,625 i 0 nM.

U jednom otelotvorenju, brzina disocijacije je određena korišćenjem čipa za površinsku plazmonsku rezonancu sa biotinom na površini i puferom za rad od 1xPBS sa dodatkom 250 mM natrijum hlorida pri protoku od 10 µl/min.

U jednom otelotvorenju, asocijacija se prati 180 sekundi, a disocijacija se prati 600 sekundi.

U jednom otelotvorenju, brzina disocijacije je određena na uređaju BIAcore T200. U jednom otelotvorenju, brzina disocijacije je od 0,081/s do 0,0081/s.

U jednom otelotvorenju svih aspekata, brzina disocijacije je određena na 25 °C.

U jednom otelotvorenju svih aspekata, brzina disocijacije je brzina disocijacije određena na 25 °C.

Jedan aspekt, kao što je ovde objavljeno, je antitelo na transferinski receptor koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor (huTfR) i cinomolgusov transferinski receptor (cyTfR), koje sadrži i) humanizovani varijabilni domen teškog lanca izveden iz varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 01 i ii) humanizovani varijabilni domen lakog lanca dobijen od varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 26, pri čemu varijabilni domen lakog lanca ima aminokiselinski ostatak prolina (P) na poziciji 80, aminokiselinski ostatak asparagina (N) na poziciji 91 i aminokiselinski ostatak alanina (A) na poziciji 93 (numeracija prema Kabatu).

U jednom otelotvorenju, antitelo dalje u varijabilnom domenu teškog lanca na poziciji 100g ima serinski aminokiselinski ostatak (S) (numeracija prema Kabatu).

U jednom otelotvorenju, antitelo dalje u varijabilnom domenu teškog lanca na poziciji 65 ima serinski aminokiselinski ostatak (S) (numeracija prema Kabatu).

U jednom otelotvorenju, antitelo dalje u varijabilnom domenu teškog lanca na poziciji 105 ima aminokiselinski ostatak glutamina (Q) (numeracija prema Kabatu).

Jedan aspekt, kao što je ovde objavljeno, je antitelo na transferinski receptor koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor (huTfR) i cinomolgusov transferinski receptor (cyTfR), koje sadrži i) humanizovani varijabilni domen teškog lanca izveden iz varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 01 i ii) humanizovani varijabilni domen lakog lanca dobijen od varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 26, pri čemu antitelo ima brzinu disocijacije u jedinici 1/s za receptor humanog transferina koja je jednaka ili manja od (tj. najviše) brzine disocijacije u jedinici 1/s antitela 128.1 za transferinski receptor cinomolgusa, pri čemu su brzine disocijacije određene površinskom plazmonskom rezonancom, i pri čemu antitelo na transferinski receptor 128.1 ima varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 64 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 65.

U jednom otelotvorenju, antitelo ima brzinu disocijacije u jedinici 1/s za humani transferinski receptor koja je i) jednaka ili manja od (tj. najviše) brzine disocijacije u jedinici 1/s antitela na transferinski receptor 128.1 za cinomolgusov transferinski receptor i ii) jednaka ili veća od (tj. najmanje) 5% brzine disocijacije u jedinici 1/s antitela na transferinski receptor 128.1 za cinomolgusov transferinski receptor.

Jedan aspekt, kao što je ovde objavljeno, je antitelo na transferinski receptor koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor (huTfR) i cinomolgusov transferinski receptor (cyTfR). U određenim otelotvorenjima, antitelo na transferinski receptor

• ima brzinu disocijacije u jedinici 1/s za receptor humanog transferina koja je jednaka ili manja od (tj. najviše) antitela na transferinski receptor 128.1 za transferinski receptor cinomolgusa, pri čemu su brzine disocijacije određene površinskom plazmonskom rezonancom, i pri čemu antitelo na transferinski receptor 128.1 ima varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 64 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 65;

Ovde je obezbeđeno antitelo na transferinski receptor koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68; (c) HVRH3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71, 72 ili 73; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78.

U svim gorepomenutim otelotvorenjima, antitelo na transferinski receptor je humanizovano. U jednom otelotvorenju, antitelo na transferinski receptor sadrži HVR-ove kao u bilo kom od prethodnih otelotvorenja, i dodatno sadrži akceptorski humani okvir, npr. okvir humanog imunoglobulia ili humanog konsenzusa.

U drugom aspektu, antitelo na transferinski receptor sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 24 i koja ima približno istu brzinu disocijacije kao i antitelo, sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 24. U nekim otelotvorenjima, VH sekvenca sa identičnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antitelo na transferinski receptor koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za transferinski receptor sa istom brzinom disocijacije. U nekim otelotvorenjima, zamenjeno je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO: 24. U nekim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antitelo na transferinski receptor sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 24, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom otelotvorenju, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72.

U drugom aspektu, obezbeđeno je antitelo na transferinski receptor, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 37 i koji ima približno istu brzinu disocijacije kao i antitelo, koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 37. U nekim otelotvorenjima, VL sekvenca sa identičnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antitelo na transferinski receptor koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za transferinski receptor sa istom brzinom disocijacije. U nekim otelotvorenjima, zamenjeno je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO: 37. U nekim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antitelo na transferinski receptor sadrži VL sekvencu SEQ ID NO: 37, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom otelotvorenju, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana između (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78.

U drugom aspektu, dato je antitelo na transferinski receptor, pri čemu antitelo sadrži VH kao u svakom gore navedenom otelotvorenju, i VL kao u svakom gore navedenom otelotvorenju. Antitelo ovog pronalaska sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 37, odnosno, uključuje posttranslacione modifikacije tih sekvenci.

U jednom otelotvorenju, antitelo na transferinski receptor je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2 fragment. U drugom otelotvorenju, antitelo je antitelo kompletne dužine, npr. netaknuto IgG1 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela kao što je ovde definisano.

U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo je spojeno sa terapeutskim jedinjenjem. U drugom otelotvorenju svih aspekata, antitelo je povezano sa sredstvom za snimanje ili oznakom.

U drugom otelotvorenju, antitelo je multispecifično antitelo, i terapeutsko jedinjenje opciono čini jedan deo multispecifičnog antitela. U drugom takvom otelotvorenju, multispecifično antitelo sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje vezuje TfR i drugo mesto vezivanja antigena, koje vezuje moždani antigen. U jednom takvom aspektu, moždani antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od: beta-sekretaze 1 (BACE1), Abeta, receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), humanog receptora epidermalnog faktora rasta 2 (HER2), tau, apolipoproteina E4 (ApoE), alfa-sinukleina, CD20, hantingtina, prionskog proteina (PrP), ponovljene kinaze bogate leucinom 2 (LRRK2), parkina, presenilina 1, presenilina 2, gama sekretaze, receptora smrti 6 (DR6), amiloidnog prekursora proteina (APP), p75 neurotrofinskog receptora (p75NTR), glukocerebrozidaze i kaspaze 6. U drugom otelotvorenju, multispecifično antitelo vezuje i TfR i BACE1. U drugom otelotvorenju, multispecifično antitelo vezuje i TfR i Abeta. U drugom otelotvorenju, multispecifično antitelo vezuje i TfR i alfa sinuklein. U drugom otelotvorenju, multispecifično antitelo vezuje i TfR i CD20. U drugom otelotvorenju, multispecifično antitelo vezuje i TfR i glukocerebrozidazu. U drugom otelotvorenju, terapeutsko jedinjenje je lek za neurološke poremećaje.

U jednom aspektu gorenavedenog otelotvorenja, pronalazak pruža farmaceutsku formulaciju koja sadrži bilo koje prethodno navedeno antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač.

U jednom aspektu gorenavedenog otelotvorenja, pronalazak obezbeđuje bilo koje od prethodnih antitela za upotrebu kao lek.

U drugom aspektu gorenavedenog otelotvorenja, pronalazak obezbeđuje upotrebu bilo kog od prethodnih antitela u proizvodnji leka za lečenje neurološkog poremećaja. U jednom otelotvorenju, neurološki poremećaj je izabran iz grupe koju čine neuropatski poremećaj, neurodegenerativna bolest, rak, bolest oka, epileptični poremećaj, lizozomska bolest skladištenja, amiloidoza, virusna ili mikrobna bolest, ishemija, poremećaj ponašanja i upala CNS-a.

U drugom aspektu gorenavedenog otelotvorenja, pronalazak obezbeđuje bilo koje od prethodnih antitela za upotrebu u lečenju neurološkog poremećaja. U jednom otelotvorenju, neurološki poremećaj je izabran iz grupe koju čine neuropatski poremećaj, neurodegenerativna bolest, rak, bolest oka, epileptični poremećaj, lizozomska bolest skladištenja, amiloidoza, virusna ili mikrobna bolest, ishemija, poremećaj ponašanja i upala CNS-a.

U drugom aspektu gorenavedenog otelotvorenja, predviđena je upotreba bilo kog od prethodnih antitela u proizvodnji leka za transport jednog ili više jedinjenja kroz KMB.

U jednom otelotvorenju, antitelo je sa modifikovanim jednim ili više svojstava odabranih od efektorske funkcije Fc regiona antitela, funkcije aktivacije komplementa antitela i afiniteta antitela prema TfR.

U jednom otelotvorenju, svojstvo je efektorska funkcija Fc regiona antitela.

U jednom otelotvorenju, svojstvo je funkcija aktivacije komplementa antitela.

U jednom otelotvorenju, svojstvo je afinitet antitela prema TfR.

U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija ili funkcija aktivacije komplementa je smanjena ili eliminisana u odnosu na divlje antitelo istog izotipa. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija je smanjena ili eliminisana postupkom odabranim od smanjenjem glikozilacije antitela, modifikacije izotipa antitela u izotip koji prirodno ima smanjenu ili eliminisanu efektorsku funkciju, i modifikacije Fc regiona.

U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija se smanjuje ili eliminiše smanjenjem glikozilacije antitela. U jednom aspektu, glikozilacija antitela se smanjuje postupkom odabranim od: proizvodnje antitela u okruženju koje ne dozvoljava glikozilaciju divljeg tipa; uklanjanje grupa ugljenih hidrata koje su već prisutne na antitelu; i modifikacije antitela tako da ne dođe do glikozilacije divljeg tipa.

U jednom aspektu, glikozilacija antitela je smanjena proizvodnjom antitela u okruženju koje ne dozvoljava glikozilaciju divljeg tipa, kao što je proizvodnja u proizvodnom sistemu ćelija nesisara, ili gde se antitelo proizvodi sintetički. U jednom otelotvorenju, antitelo se proizvodi u proizvodnom sistemu ćelija nesisara. U drugom otelotvorenju, antitelo je

4

proizvedeno sintetički.

U jednom otelotvorenju, glikozilacija antitela je smanjena modifikacijom antitela tako da ne dođe do glikozilacije divljeg tipa, kao što je slučaj kada Fc region antitela sadrži mutaciju na položaju 297 tako da je ostatak asparagina divljeg tipa na toj poziciji zamenjen drugom aminokiselinom koja ometa glikozilaciju na toj poziciji.

U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija je smanjena ili eliminisana najmanje jednom modifikacijom Fc regiona. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija ili funkcija aktivacije komplementa se smanjuje ili eliminiše brisanjem celog Fc regiona ili njegovog dela, ili inženjeringom antitela tako da ne uključuje Fc region ili ne-Fc region kompetentan za efektorsku funkciju ili funkciju aktivacije komplementa. U jednom otelotvorenju, najmanje jedna modifikacija Fc regiona se bira između: tačkaste mutacije Fc regiona da bi se narušilo vezivanje za jedan ili više Fc receptora izabranih sa sledećih pozicija: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 30335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 i 439; tačkasta mutacija Fc regiona radi narušavanja vezivanja za C1q izabrana sa sledećih pozicija: 270, 322, 329 i 321; eliminišući deo ili celi Fc region, i tačkastu mutaciju na poziciji 132 CH1 domena. U jednom otelotvorenju, modifikacija je tačkasta mutacija Fc regiona kako bi se narušilo vezivanje za C1q izabrano sa sledećih pozicija: 270, 322, 329 i 321. U drugom otelotvorenju, modifikacija je eliminacija dela ili celog Fc regiona. U drugom otelotvorenju, funkcija aktiviranja komplementa je smanjena ili eliminisana brisanjem celog ili dela Fc regiona ili inženjeringom antitela tako da ono ne uključuje Fc region koji uključuje put komplementa. U jednom otelotvorenju, antitelo se bira između Fab ili jednolančanog antitela. U drugom otelotvorenju, ne-Fc region antitela je modifikovan kako bi se smanjila ili eliminisala aktivacija puta komplementa od strane antitela. U jednom otelotvorenju, modifikacija je tačkasta mutacija regiona CH1 da bi se narušilo vezivanje za C3. U jednom otelotvorenju, tačkasta mutacija je na poziciji 132 (vidi, npr., Vidarte et al., J. Biol. Chem.276 (2001) 38217-38223).

U jednom aspektu gorenavedenog otelotvorenja, afinitet antitela prema TfR je smanjen, mereno u odnosu na antitelo divlje vrste istog izotipa koje nema smanjeni afinitet prema TfR. U jednom takvom aspektu, antitelo ima KDili IC50za TfR od oko 1 pM do oko 100 µM.

U jednom otelotvorenju, kao što je ovde objavljeno, antitelo ima utišanu efektorsku funkciju. U jednom otelotvorenju, antitelo nema efektorsku funkciju. U jednom otelotvorenju, antitelo je potklasa humanog IgG1 i ima mutacije L234A, L235A i P329G u oba teška lanca (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju, antitelo je

a) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1, ili

b) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4, ili

f) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P i opciono P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu.

U daljem aspektu, antitelo na transferinski receptor prema bilo kom od prethodnih aspekata i otelotvorenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u Odeljcima 1-5 u nastavku:

1. Afinitet antitela

U jednom otelotvorenju, Kd se meri testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom otelotvorenju, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab-ova u rastvoru za antigen se meri uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti npr., Chen, Y. i sar. J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Radi utvrđivanja uslova za test, MICROTITER<®>ploče sa većim brojem bunarčića (Thermo Scientific) preko noći se oblažu sa 5 pg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonata (pH 9,6), a zatim se blokiraju pomoću 2% (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12 u radu Presta i sar. Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). Željeni Fab je zatim inkubiran tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše su prenete na ploču za hvatanje i inkubirane su na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodato je 150 µl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim su ploče merene na TOPCOUNT ™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja odabrane su za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.

Prema drugom otelotvorenju, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE<®>. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/minutu da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neproreagovale grupe. Za kinetička merenja, dve serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) injektovane su u PBS-u sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25°C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) izračunavaju se pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon(vidite, npr. Chen, Y. i sar. J. Mol. Biol.293 (1999) 865-881). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog

4

prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM antitela na antigen (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.

2. Fragmenti antitela

U određenim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, i druge fragmente opisane u nastavku. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson, P. J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Za pregled scFv fragmenata, videti npr., Plueckthun, A., u; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore (izd.), Springer-Verlag, New York (1994), str. 269-315; videti takođe WO93/16185; i US5,571,894 i US5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2 fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo videti u US 5,869,046.

Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 0404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. i sar. Nat. Med.9 (2003) 129-134; and Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson, P.J. i sar. Nat. Med. 9 (20039 129-134).

Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti, npr., US6,248,516).

Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

3. Himerna i humanizovana antitela

U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u US 4,816,567; i Morrison, S.L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U drugom primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom“, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela obuhvataju njihove antigen-vezujuće fragmente.

U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Najčešće, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Po pravilu, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.

Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovo dobijanje dali su, npr. Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci.13 (2008) 1619-1633, i dalje su opisani u, npr., Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5, 821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, i US 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (opisuje graftovanje regiona za određivanje specifičnosti (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol.28 (1991) 489-498 (opisuje „obnavljanje površine“); Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (opisuje „FR mešanje“); i Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 i Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (opisuje pristup „vođenim izborom“ FR mešanju).

Humani regioni okvira koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: regione okvira izabrane postupkom "najboljeg slaganja" (pogledajte, npr. Sims, M.J. i sar. J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regione okvira dobijene od sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (pogledajte, npr., Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili regione okvira humane germinativne linije (pogledajte, npr., Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci.13 (2008) 1619-1633); i regione okvira dobijene pregledanjem FR biblioteka (pogledajte, npr., Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 i Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem.271 (1996922611-22618).

4. Multispecifična antitela

U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za transferinski receptor a druga je za bilo koji drugi antigen.

4

Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelijama koje eksprimiraju transferinski receptor. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.

Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac sa različitim specifičnostima (videti Milstein, C. i Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, i Traunecker, A. i sar. EMBO J.10 (1991) 3655-3659), i tehniku „dugme u rupici“ (pogledajte, npr., US 5,731,168). Multispecifična antitela takođe mogu da se dobiju putem konstruisanja efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula (WO 2009/089004); unakrsnim povezivanjem dva ili više antitela ili fragmenata (vidite, npr. US 4,676,980, i Brennan, M. i sar. Science 229 (1985) 81-83); koristeći leucinske zatvarače za proizvodnju bispecifičnih antitela (vidite, npr. Kostelny, S.A. i sar. J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; koristeći tehnologiju „dijatela“ za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (pogledajte, npr. Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); i koristeći dimere jednolančanog Fv (scFv) (vidite, npr. Gruber, M et al., J. Immunol.152 (1994) 5368-5374); i pripremom trispecifičnih antitela, kao što je opisano, npr. u Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice“ (videti, npr., US 2006/0025576).

Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje „dvojno delujući Fab“ ili „DAF“, koji sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za transferinski receptor kao i drugi, različit antigen (pogledajte, na primer US 2008/0069820).

Ovde dato antitelo ili njegov fragment takođe obuhvata multispecifična antitela opisana u WO2009/080251, WO2009/080252, WO2009/080253, WO2009/080254, WO2010/112193, WO2010/115589, WO2010/136172, WO2010/145792 i WO2010/145793.

U jednom otelotvorenju svih aspekata kao što je ovde objavljeno, antitransferinsko receptorsko antitelo je bispecifično antitelo.

Jedan aspekt pronalaska je dvovalentno, bispecifično antitelo koje sadrži

a) prvi laki lanac i prvi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi antigen, i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu zamenjeni jedan drugim,

pri čemu je prvi antigen ili drugi antigen humani transferinski receptor, i pri čemu laki lanac i teški lanac koji se specifično vezuju za humani transferinski receptor obuhvataju

4

varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

Antitelo pod a) ne sadrži modifikaciju kako je objavljeno pod b), i teški lanac i laki lanac pod a) su izolovani lanci.

U antitelu pod b)

unutar lakog lanca

varijabilni domen lakog lanca VL je zamenjen varijabilnim domenom teškog lanca VH navedenog antitela,

i

unutar teškog lanca

varijabilni domen teškog lanca VH je zamenjen varijabilnim domenom lakog lanca VL navedenog antitela.

U jednom otelotvorenju

i) u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 124 (numeracija prema Kabatu) supstituisana je pozitivno naelektrisanom aminokiselinom, i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom.

ili

ii) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 124 (numeracija prema Kabatu) je supstituisana pozitivno naelektrisanom aminokiselinom, i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom.

U jednom poželjnom otelotvorenju

i) u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) aminokiselina na položaju 124 nezavisno je supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju, nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)) i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina na položaju 147 ili aminokiselina na položaju 213 nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu),

ili

ii) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) aminokiselina na položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema

4

Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju, nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)) i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) aminokiselina na položaju 147 ili aminokiselina na položaju 213 nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju, u konstantnom domenu CL drugog teškog lanca, aminokiseline na poziciji 124 i 123 su supstituisane sa K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju, u konstantnom domenu CH1 drugog lakog lanca, aminokiseline na poziciji 147 i 213 su supstituisane sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom poželjnom otelotvorenju, u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca, aminokiseline na poziciji 124 i 123 su supstituisane sa K, i u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca, aminokiseline na poziciji 147 i 213 su supstituisane sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju, u konstantnom domenu CL drugog teškog lanca, aminokiseline na poziciji 124 i 123 su supstituisane sa K, i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 drugog lakog lanca, aminokiseline na poziciji 147 i 213 su supstituisane sa E, i u varijabilnom domenu VL prvog lakog lanca, aminokiselina na poziciji 38 je supstituisana sa K, u varijabilnom domenu VH prvog teškog lanca, aminokiselina na poziciji 39 je supstituisana sa E, u varijabilnom domenu VL drugog teškog lanca, aminokiselina na poziciji 38 je supstituisana sa K, i u varijabilnom domenu VH drugog lakog lanca, aminokiselina na poziciji 39 je supstituisana sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Jedan aspekt pronalaska je dvovalentno, bispecifično antitelo koje sadrži

a) prvi laki lanac i prvi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi antigen, i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu zamenjeni jedan drugim, i pri čemu su konstantni domeni CL i CH1 u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu zamenjeni jedan drugim,

pri čemu je prvi antigen ili drugi antigen humani transferinski receptor, i pri čemu laki lanac i teški lanac koji se specifično vezuju za humani transferinski receptor obuhvataju varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

4

U antitelu pod b)

unutar lakog lanca

varijabilni domen lakog lanca VL je zamenjen varijabilnim domenom teškog lanca VH navedenog antitela, i konstantni domen lakog lanca CL je zamenjen konstantnim domenom teškog lanca CH1 navedenog antitela;

i

unutar teškog lanca

varijabilni domen teškog lanca VH je zamenjen varijabilnim domenom lakog lanca VL navedenog antitela, i konstantni domen teškog lanca CH1 je zamenjen konstantnim domenom lakog lanca CL navedenog antitela.

Jedan aspekt pronalaska je dvovalentno, bispecifično antitelo koje sadrži

a) prvi laki lanac i prvi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi antigen, i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu su konstantni domeni CL i CH1 drugog lakog lanca i drugog teškog lanca zamenjeni jedan drugim,

U antitelu pod b)

unutar lakog lanca

konstantni domen lakog lanca CL je zamenjen konstantnim domenom teškog lanca CH1 navedenog antitela;

i unutar teškog lanca

konstantni domen teškog lanca CH1 je zamenjen konstantnim domenom lakog lanca CL navedenog antitela.

Jedan aspekt prema pronalasku je multispecifično antitelo koje sadrži

a) antitelo kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen i sastoji se od dva teška lanca antitela i dva laka lanca antitela, i

b) jedan, dva, tri ili četiri jednolančana fragmenta Fab koji se specifično vezuju za jedan do četiri dalja antigena (tj. drugi i/ili treći i/ili četvrti i/ili peti antigen, poželjno se specifično vezuju za jedan dalji antigen, tj. drugi antigen),

4

pri čemu su pomenuti jednolančani fragmenti Fab pod b) spojeni sa pomenutim antitelom kompletne dužine pod a) putem peptidnog linkera na C- ili N-terminusu teškog ili lakog lanca pomenutog antitela kompletne dužine,

pri čemu je prvi antigen ili jedan od daljnjih antigena humani transferinski receptor i gde mesto vezivanja koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

U jednom otelotvorenju, jedan ili dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa tim antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu teških ili lakih lanaca pomenutog antitela kompletne dužine.

U jednom otelotvorenju, jedan ili dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa tim antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu teških lanaca pomenutog antitela kompletne dužine.

U jednom otelotvorenju, jedan ili dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa tim antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu lakih lanaca pomenutog antitela kompletne dužine.

U jednom otelotvorenju, dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa tim antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu svakog teškog ili lakog lanca pomenutog antitela kompletne dužine.

U jednom otelotvorenju, dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa tim antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu svakog teškog lanca pomenutog antitela kompletne dužine.

U jednom otelotvorenju, dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa tim antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu svakog lakog lanca pomenutog antitela kompletne dužine.

Jedan aspekt pronalaska je trovalentno, bispecifično antitelo koje sadrži

a) antitelo kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen i sastoji se od dva teška lanca antitela i dva laka lanca antitela,

b) prvi polipeptid koji se sastoji od

ba) varijabilnog domena teškog lanca (VH) antitela,

ili

bb) varijabilnog domena teškog lanca (VH) antitela i konstantnog domena 1 (CH1) antitela,

pri čemu je navedeni prvi polipeptid spojen sa N-terminusom svog VH domena putem peptidnog linkera sa C-terminusom jednog od dva teška lanca navedenog antitela kompletne dužine,

c) drugi polipeptid koji se sastoji od

ca) varijabilnog domena lakog lanca (VL) antitela,

ili

cb) varijabilnog domena lakog lanca (VL) antitela i konstantnog domena lakog lanca (CL) antitela,

pri čemu je navedeni drugi polipeptid spojen sa N-terminusom svog VL domena putem peptidnog linkera sa C-terminusom drugog od dva teška lanca navedenog antitela kompletne dužine,

i

pri čemu varijabilni domen teškog lanca (VH) antitela prvog polipeptida i varijabilni domen lakog lanca (VL) antitela drugog polipeptida zajedno grade antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za drugi antigen,

i

pri čemu je prvi antigen ili drugi antigen humani transferinski receptor, i pri čemu mesto vezivanja koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

U jednom otelotvorenju, varijabilni domen teškog lanca (VH) antitela polipeptida pod b) i varijabilni domen lakog lanca (VL) antitela polipeptida pod c) su povezani i stabilizovani pomoću međulančanog disulfidnog mosta putem uvođenja disulfidne veze između sledećih pozicija:

i) pozicije 44 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 100 varijabilnog domena lakog lanca, ili

ii) pozicije 105 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 43 varijabilnog domena lakog lanca, ili

iii) pozicije 101 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 100 varijabilnog domena lakog lanca (numeracija je uvek prema Kabatovom EU indeksu).

Tehnike uvođenja neprirodnih disulfidnih mostova za stabilizaciju opisane su npr. u WO 94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393; ili Schmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721. U jednom otelotvorenju, opciona disulfidna veza između varijabilnih domena polipeptida pod b) i c) je između pozicije 44 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 100 varijabilnog domena lakog lanca. U jednom otelotvorenju, opciona disulfidna veza između

1

varijabilnih domena polipeptida pod b) i c) je između pozicije 105 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 43 varijabilnog domena lakog lanca (numeracija uvek prema Kabatu). U jednom otelotvorenju, poželjno je trovalentno, bispecifično antitelo bez navedene opcione stabilizacije disulfidom između varijabilnih domena VH i VL fragmenata jednolančanog Fab.

Jedan aspekt pronalaska je trispecifično ili tetraspecifično antitelo koje sadrži a) prvi laki lanac i prvi teški lanac antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen; i

b) drugi (modifikovani) laki lanac i drugi (modifikovani) teški lanac antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH zamenjeni jedan drugim i/ili pri čemu su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim, i

c) pri čemu je jedan do četiri antigen vezujućih peptida koji se specifično vezuju za jedan ili dva dalja antigena (tj. za treći i/ili četvrti antigen) spojeno putem peptidnog linkera sa C- ili N-terminusom lakih lanaca ili teških lanaca a) i/ili b),

pri čemu je prvi antigen, drugi antigen ili jedan od daljnjih antigena humani transferinski receptor, i pri čemu mesto vezivanja koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

U jednom otelotvorenju, trispecifično ili tetraspecifično antitelo sadrži pod c) jedan ili dva antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za jedan ili dva dalja antigena.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući peptidi su izabrani iz grupe scFv fragmenta i scFab fragmenta.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući peptidi su scFv fragmenti.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući peptidi su scFab fragmenti.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući peptidi su spojeni sa C-terminusom teških lanaca a) i/ili b).

U jednom otelotvorenju, trispecifično ili tetraspecifično antitelo sadrži pod c) jedan ili dva antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za jedan dalji antigen.

U jednom otelotvorenju, trispecifično ili tetraspecifično antitelo sadrži pod c) dva identična antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za treći antigen. U jednom poželjnom otelotvorenju, dva takva identična antigen vezujuća peptida su spojena putem istog peptidnog linkera sa C-terminusom teških lanaca a) i/ili b). U jednom poželjnom otelotvorenju,

2

dva identična antigen vezujuća peptida su ili scFv fragment ili scFab fragment.

U jednom otelotvorenju, trispecifično ili tetraspecifično antitelo sadrži pod c) dva antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za treći i četvrti antigen. U jednom otelotvorenju, oba navedena antigen vezujuća peptida su spojena putem istog peptidnog konektora sa C-terminusom teških lanaca pod a) i b). U jednom poželjnom otelotvorenju, navedena dva antigen vezujuća peptida su ili scFv fragment ili scFab fragment.

Jedan aspekt pronalaska je bispecifično, četvorovalentno antitelo koje sadrži

a) dva laka lanca i dva teška lanca antitela koji se specifično vezuju za prvi antigen (i sadrži dva fragmenta Fab),

b) dva dodatna fragmenta Fab antitela koji se specifično vezuju za drugi antigen, pri čemu su navedeni dodatni fragmenti Fab spojeni putem peptidnog linkera sa C- ili N-terminusima teških lanaca a),

i

pri čemu su u fragmentima Fab načinjene sledeće modifikacije

i) u oba fragmenta Fab pod a), ili u oba fragmenta Fab pod b), varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim i/ili su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim, ili

ii) u oba fragmenta Fab pod a) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, i konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim,

i

u oba fragmenta Fab pod b) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim ili su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim,

ili

iii) u oba fragmenta Fab pod a) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim ili su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim,

i

u oba fragmenta Fab pod b) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, i konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim,

ili

iv) u oba fragmenta Fab pod a) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, i u oba fragmenta Fab pod b) konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim, ili

u oba fragmenta Fab pod a) konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim, i u oba fragmenta Fab pod b) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, pri čemu je prvi antigen ili drugi antigen humani transferinski receptor, i pri čemu mesto vezivanja koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

U jednom otelotvorenju, oba navedena dodatna fragmenta Fab su spojena putem peptidnog linkera ili sa C-terminusima teških lanaca pod a) ili sa N-terminusima teških lanaca pod a).

U jednom otelotvorenju, oba navedena dodatna fragmenta Fab su spojena putem peptidnog linkera sa C-terminusima teških lanaca pod a).

U jednom otelotvorenju, oba navedena dodatna fragmenta Fab su spojena putem peptidnog konektora sa N-terminusima teških lanaca pod a).

U jednom otelotvorenju, u Fab fragmentima su načinjene sledeće modifikacije: i) u oba fragmenta Fab pod a) ili u oba fragmenta Fab pod b) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim,

i/ili

konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim.

U jednom otelotvorenju, u Fab fragmentima su načinjene sledeće modifikacije: i) u oba fragmenta Fab pod a) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim,

i/ili

konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim.

U jednom otelotvorenju, u Fab fragmentima su načinjene sledeće modifikacije: i) u oba fragmenta Fab pod a) konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim.

U jednom otelotvorenju, u Fab fragmentima su načinjene sledeće modifikacije: i) u oba fragmenta Fab pod b) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim,

i/ili

konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim.

U jednom otelotvorenju, u Fab fragmentima su načinjene sledeće modifikacije: i) u oba fragmenta Fab pod b) konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim.

Jedan aspekt prema pronalasku je bispecifično, četvorovalentno antitelo koje sadrži: a) (modifikovani) teški lanac prvog antitela koji se specifično vezuje za prvi antigen i sadrži prvi domenski par VH-CH1, pri čemu je za C-terminus navedenog teškog lanca spojen

4

N-terminus drugog domenskog para VH-CH1 navedenog prvog antitela putem peptidnog linkera,

b) dva laka lanca navedenog prvog antitela pod a),

c) (modifikovani) teški lanac drugog antitela koji se specifično vezuje za drugi antigen i sadrži prvi par domena VH-CL, pri čemu je za C-terminus navedenog teškog lanca spojen N-terminus drugog par domena VH-CL navedenog drugog antitela putem peptidnog linkera, i

d) dva (modifikovana) laka lanca navedenog drugog antitela iz c), pri čemu oba sadrže domenski par CL-CH1,

Jedan aspekt pronalaska je bispecifično antitelo koje sadrži

a) teški lanac i laki lanac prvog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen, i

b) teški lanac i laki lanac drugog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu je N-terminus teškog lanca povezan sa C-terminusom lakog lanca putem peptidnog linkera,

Antitelo pod a) ne sadrži modifikaciju kako je objavljeno pod b), i teški lanac i laki lanac su izolovani lanci.

Jedan aspekt pronalaska je bispecifično antitelo koje sadrži

b) fragment Fv koji se specifično vezuje za drugi antigen koji sadrži VH<2>domen i VL<2>domen, pri čemu su oba domena međusobno povezana disulfidnim mostom,

pri čemu je ili samo VH<2>domen ili samo VL<2>domen spojen putem peptidnog linkera sa teškim ili lakim lancem antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen, pri čemu je prvi antigen ili drugi antigen humani transferinski receptor, i pri čemu mesto vezivanja koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

U bispecifičnom antitelu teški lanci i laki lanci pod a) su izolovani lanci.

U jednom otelotvorenju, drugi od VH<2>domena ili VL<2>domena nije spojen putem peptidnog linkera sa teškim ili lakim lancem antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen.

U svim aspektima kako je ovde objavljeno, prvi laki lanac sadrži VL domen i CL domen i prvi teški lanac sadrži VH domen, CH1 domen, region šarke, CH2 domen i CH3 domen.

Jedan aspekt prema pronalasku je bispecifično trovalentno antitelo koje sadrži a) dva fragmenta Fab koji se specifično vezuju za prvi antigen,

b) jedan fragment CrossFab koji se specifično vezuje za drugi antigen u kojem su CH1 i CL domen zamenjeni jedan drugim,

c) jedan Fc region koji sadrži teški lanac prvog Fc regiona i teški lanac drugog Fc regiona,

pri čemu su C-terminusi CH1 domena dva fragmenta Fab povezani sa N-terminusom teškog lanca polipeptida Fc regiona, i

pri čemu je C-terminus CL domena fragmenta CrossFab povezan sa N-terminusom VH domena jednog od fragmenata Fab, i

pri čemu je C-terminus CH1 domena prvog fragmenta Fab povezan sa N-terminusom jednog od teških lanaca polipeptida Fc regiona, i C-terminus CL domena fragmenta CrossFab je povezan sa N-terminusom drugog teškog lanca polipeptida Fc regiona, i

pri čemu je C-terminus CH1 domena drugog fragmenta Fab povezan sa N-terminusom VH domena prvog fragmenta Fab ili sa N-terminusom VH domena fragmenta CrossFab, i pri čemu je prvi antigen ili drugi antigen humani transferinski receptor, i pri čemu mesto vezivanja koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

Jedan aspekt pronalaska je bispecifično antitelo koje sadrži

b) fragment Fab koji se specifično vezuje za drugi antigen koji sadrži VH<2>domen ili VL<2>domen koji sadrži fragment teškog lanca i fragment lakog lanca, pri čemu

unutar fragmenta lakog lanca

varijabilni domen lakog lanca VL<2>je zamenjen varijabilnim domenom teškog lanca VH<2>navedenog antitela,

i

unutar fragmenta teškog lanca

varijabilni domen teškog lanca VH<2>je zamenjen varijabilnim domenom lakog lanca VL<2>navedenog antitela

pri čemu je teški lanac fragmenta Fab umetnut između CH1 domena jednog od teških lanaca antitela kompletne dužine i odgovarajućeg Fc regiona antitela kompletne dužine, i N-terminus lakog lanca fragmenta Fab je spojen sa C-terminusom lakog lanca antitela kompletne dužine koji je uparen sa teškim lancem antitela kompletne dužine u koji je umetnut teški lanac fragmenta Fab, i

Jedan aspekt pronalaska je bispecifično antitelo koje sadrži

unutar fragmenta lakog lanca

i

unutar fragmenta teškog lanca

pri čemu je C-terminus fragmenta teškog lanca fragmenta Fab spojen sa N-terminusom jednog od teških lanaca antitela kompletne dužine, i C-terminus fragmenta lakog lanca fragmenta Fab je spojen sa N-terminusom lakog lanca antitela kompletne dužine koji je uparen sa teškim lancem antitela kompletne dužine sa kojim je spojen fragment teškog lanca fragmenta Fab, i

U jednom otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, antitelo je multispecifično antitelo, koje zahteva heterodimerizaciju najmanje dva polipeptida teškog lanca, i pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani transferinski receptor i drugi antigen nehumanog transferinskog receptora.

Opisano je nekoliko pristupa za CH3-modifikacije kako bi se podržala heterodimerizacija, na primer u WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291. Tipično, u pristupima poznatim u struci, CH3 domen prvog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca su oba konstruisana na komplementaran način tako da teški lanac, koji se sastoji od jednog projektovanog CH3 domena, ne može više da se homodimerizuje sa drugim teškim lancem iste strukture (npr. prvi projektovani CH3 teški lanac više ne može da se homodimerizuje sa drugim projektovanim CH3 teškim lancem; i drugi projektovani CH3 teški lanac više ne može da se homodimerizuje sa drugim projektovanim CH3 teškim lancem). Zbog toga je teški lanac koji se sastoji od jednog projektovanog CH3 domena prisiljen da se heterodimerizuje sa drugim teškim lancem koji sadrži CH3 domen, koji je konstruisan na komplementaran način. Za ovo otelotvorenje pronalaska, CH3 domen prvog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca su konstruisani na komplementaran način supstitucijama aminokiselina, tako da su prvi teški lanac i drugi teški lanac prisiljeni na heterodimerizaciju, dok prvi teški lanac i drugi teški lanac više ne mogu da se homodimerizuju (npr. iz sternih razloga).

Različiti pristupi za podržavanje heterodimerizacije teškog lanca koji su poznati u struci, koji su citirani i uključeni u prethodnom tekstu, razmatraju se kao različite alternative koje se koriste u multispecifičnom antitelu prema pronalasku, koje sadrži „neukršteni Fab region“ izveden iz prvog antitela, koje se specifično vezuje za prvi antigen, i „ukršteni Fab region“ izveden iz drugog antitela, koje se specifično vezuje za drugi antigen, u kombinaciji sa određenim supstitucijama aminokiselina opisanim gore za ovaj pronalazak.

CH3 domeni multispecifičnog antitela kao što je ovde objavljeno, mogu da se menjaju tehnologijom „dugme u rupici" koja je detaljno opisana sa nekoliko primera npr. u WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng.9 (1996) 617-621; i Merchant, A.M., et al., Nat.

Biotechnol. 16 (1998) 677-681. U ovom postupku se menjaju površine interakcije dva CH3 domena kako bi se povećala heterodimerizacija oba teška lanca koji sadrže ova dva CH3 domena. Svaki od dva CH3 domena (dva teška lanca) može biti „dugme“, dok je drugi „rupica“. Uvođenje disulfidnog mosta dodatno stabilizuje heterodimere (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) i povećava prinos.

U jednom poželjnom otelotvorenju, multispecifično antitelo, kao što je ovde objavljeno, sadrži mutaciju T366W u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije T366S, L368A i Y407V u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Može se koristiti i dodatni međulančani disulfidni most između CH3 domena (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech.16 (1998) 677-681) npr. uvođenjem mutacije Y349C u CH3 domen „lanca sa dugmetom“ i mutacije E356C ili mutacije S354C u CH3 domenu „lanca sa rupicom“. Stoga, u drugom poželjnom otelotvorenju, multispecifično antitelo, kao što je ovde objavljeno, sadrži mutacije Y349C i T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije E356C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena ili multispecifično antitelo, kao što je ovde objavljeno, sadrži mutacije Y349C i T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena (dodatna mutacija Y349C u jednom CH3 domenu i dodatna mutacija E356C ili S354C u drugom CH3 domenu grade međulančani disulfidni most) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Takođe, alternativno ili dodatno se mogu koristiti i druge tehnologije "dugme u rupici" kao što su opisane u EP 1870 459A1. U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo, kao što je ovde objavljeno, sadrži mutacije R409D i K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije D399K i E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo, kao što je ovde objavljeno, sadrži mutaciju T366W u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije T366S, L368A i Y407V u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ i dodatno mutacije R409D i K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije D399K i E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo, kao što je ovde objavljeno, sadrži mutacije Y349C i T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena, ili multispecifično antitelo prema pronalasku sadrži mutacije Y349C i T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena i dodatno mutacije R409D i K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije D399K i E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Osim tehnologije „dugme u rupici“, druge tehnike za modifikovanje CH3 domena teških lanaca multispecifičnih antitela radi sprovođenja heterodimerizacije su poznate u struci. Te tehnologije, posebno one opisane u WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 i WO 2013/096291 se ovde razmatraju kao alternative tehnologiji „dugme u rupici“ u kombinaciji sa multispecifičnim antitelom, kao što je ovde objavljeno.

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pristup opisan u EP 1870459 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. Ovaj pristup se zasniva na uvođenju naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjima na specifičnim aminokiselinskim pozicijama u međupovršini CH3/CH3 domena između oba, prvog i drugog teškog lanca.

Shodno tome, ovo otelotvorenje se odnosi na multispecifično antitelo, kao što je ovde objavljeno, pri čemu u tercijarnoj strukturi antitela CH3 domen prvog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca grade međupovršinu koja je locirana između odgovarajućih CH3 domena antitela, pri čemu odgovarajuće aminokiselinske sekvence CH3 domena prvog teškog lanca i CH3 domena drugog teškog lanca sadrže skup aminokiselina koje su locirane u navedenoj međupovršini u tercijarnoj strukturi antitela, pri čemu iz skupa aminokiselina koje su locirane u međupovršini CH3 domena jednog teškog lanca, prva aminokiselina je supstituisana pozitivno naelektrisanom aminokiselinom i iz skupa aminokiselina koje su locirane u međupovršini CH3 domena drugog teškog lanca, druga aminokiselina je supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom. Multispecifično antitelo prema ovom otelotvorenju se ovde takođe naziva „CH3(+/-)-konstruisano multispecifično antitelo“ (pri čemu skraćenica označava suprotno naelektrisane aminokiseline koje su uvedene u odgovarajuće CH3 domene).

U jednom otelotvorenju navedenog CH3(+/-)-konstruisanog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pozitivno naelektrisana aminokiselina je odabrana od K, R i H, a negativno naelektrisana aminokiselina je odabrana od E ili D.

U jednom otelotvorenju navedenog CH3(+/-)-konstruisanog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pozitivno naelektrisana aminokiselina je odabrana od K i R, a negativno naelektrisana aminokiselina je odabrana od E ili D.

U jednom otelotvorenju navedenog CH3(+/-)-konstruisanog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pozitivno naelektrisana aminokiselina je K, a negativno naelektrisana aminokiselina je E.

U jednom otelotvorenju navedenog CH3(+/-)-konstruisanog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina R na poziciji 409 je supstituisana sa D i aminokiselina K na poziciji je supstituisana sa E, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina D na poziciji 399 je supstituisana sa K i aminokiselina E na poziciji 357 je supstituisana sa K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pristup opisan u WO 2013/157953 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom otelotvorenju navedenog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa K, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju navedenog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa K i aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa K, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U drugom otelotvorenju navedenog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa K i aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa K, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Dodatno, najmanje jedna od sledećih supstitucija je sadržana u CH3 domenu drugog teškog lanca: aminokiselina Y na poziciji 349 je supstituisana sa E, aminokiselina Y na poziciji 349 je supstituisana sa D i aminokiselina L na poziciji 368 je supstituisana sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom otelotvorenju, aminokiselina L na poziciji 368 je supstituisana sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pristup opisan u WO 2012/058768 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom otelotvorenju navedenog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa Y i aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa A, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa A i aminokiselina K na poziciji 409 je supstituisana sa F (numeracija prema

1

Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju, kao dodatak prethodno navedenim supstitucijama, u CH3 domenu drugog teškog lanca najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama 411 (originalno T), 399 (originalno D), 400 (originalno S), 405 (originalno F), 390 (originalno N) i 392 (originalno K) je supstituisana (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Poželjne supstitucije su:

- supstitucija aminokiseline T na poziciji 411 aminokiselinom izabranom od N, R, Q, K, D, E i W (numeracija prema Kabatovom EU indeksu),

- supstitucija aminokiseline D na poziciji 399 aminokiselinom izabranom od R, W, Y i K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu),

- supstitucija aminokiseline S na poziciji 400 aminokiselinom izabranom od E, D, R i K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu),

- supstitucija aminokiseline F na poziciji 405 aminokiselinom izabranom od I, M, T, S, V i W (numeracija prema Kabatovom EU indeksu);

- supstitucija aminokiseline N na poziciji 390 aminokiselinom izabranom od R, K i D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i

- supstitucija aminokiseline K na poziciji 392 aminokiselinom izabranom od V, M, R, L, F i E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U drugom otelotvorenju navedenog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, (konstruisano prema WO 2012/058768), u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa Y i aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa A, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa V i aminokiselina K na poziciji 409 je supstituisana sa F (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju navedenog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa A, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa A i aminokiselina K na poziciji 409 je supstituisana sa F (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U navedenom prethodno pomenutom otelotvorenju, u CH3 domenu navedenog drugog teškog lanca aminokiselina K na poziciji 392 je supstituisana sa E, aminokiselina T na poziciji 411 je supstituisana sa E, aminokiselina D na poziciji 399 je supstituisana sa R i aminokiselina S na poziciji 400 je supstituisana sa R (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pristup opisan u WO 2011/143545 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom otelotvorenju navedenog

2

multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, modifikacije aminokiselina u CH3 domenima oba teška lanca su uvedene na pozicijama 368 i/ili 409 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pristup opisan u WO 2011/090762 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. WO 2011/090762 se odnosi na modifikacije aminokiselina u skladu sa tehnologijom „dugme u rupici“. U jednom otelotvorenju navedenog CH3(KiH)-konstruisanog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa W, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju navedenog CH3(KiH)-konstruisanog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa Y, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa T (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, koje je izotipa IgG2, pristup opisan u WO 2011/090762 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela.

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pristup opisan u WO 2009/089004 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom otelotvorenju navedenog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina K ili N na poziciji 392 je supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom (u jednom poželjnom otelotvorenju sa E ili D, u jednom poželjnom otelotvorenju sa D), i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina D na poziciji 399, aminokiselina E ili D na poziciji 356 ili aminokiselina E na poziciji 357 je supstituisana pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (u jednom poželjnom otelotvorenju K ili R, u jednom poželjnom otelotvorenju sa K, u jednom poželjnom otelotvorenju, aminokiseline na pozicijama 399 ili 356 su supstituisane sa K) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom daljem otelotvorenju, pored prethodno pomenutih supstitucija, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina K ili R na poziciji 409 je supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom (u jednom poželjnom otelotvorenju sa E ili D, u jednom poželjnom otelotvorenju sa D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U još daljem otelotvorenju, pored prethodno pomenutih supstitucija ili alternativno njima, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina K na poziciji 439 i/ili aminokiselina K na poziciji 370 je supstituisana nezavisno jedna od druge negativno naelektrisanom aminokiselinom (u jednom poželjnom otelotvorenju sa E ili D, u jednom poželjnom otelotvorenju sa D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pristup opisan u WO 2007/147901 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom otelotvorenju navedenog multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina K na poziciji 253 je supstituisana sa E, aminokiselina D na poziciji 282 je supstituisana sa K i aminokiselina K na poziciji 322 je supstituisana sa D, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina D na poziciji 239 je supstituisana sa K, aminokiselina E na poziciji 240 je supstituisana sa K i aminokiselina K na poziciji 292 je supstituisana sa D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju multispecifičnog antitela, kao što je ovde objavljeno, pristup opisan u WO 2007/110205 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela

U jednom otelotvorenju svih aspekata i otelotvorenja, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je bispecifično antitelo ili trispecifično antitelo. U jednom poželjnom otelotvorenju ovog pronalaska, multispecifično antitelo je bispecifično antitelo.

U jednom otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, antitelo je dvovalentno ili trovalentno antitelo. U jednom otelotvorenju, antitelo je dvovalentno antitelo.

U jednom otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo ima strukturu konstantnog domena antitela IgG tipa. U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG1 ili potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A i L235A. U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG2. U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG3. U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG4, ili potklase humanog IgG4 sa dodatnom mutacijom S228P. U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG1

4

ili potklase humanog IgG4. U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A i L235A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P i L235E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom daljem otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, multispecifično antitelo je okarakterisano time što je navedeno multispecifično antitelo potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, antitelo koje sadrži teški lanac uključujući CH3 domen, kao što je ovde navedeno, sadrži dodatni C-terminalni dipeptid glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde objavljeno, antitelo koje sadrži teški lanac uključujući CH3 domen, kao što je ovde navedeno, sadrži dodatni C-terminalni ostatak glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

5. Varijante antitela

U pojedinim otelotvorenjima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, ubacivanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen vezujuće karakteristike.

a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja

U pojedinim otelotvorenjima, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „konzervativne supstitucije“. Konkretnije izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija“ i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvode ispitane na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.

TABELA 1

Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca:

(1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) kisele: Asp, Glu;

(4) bazne: His, Lys, Arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativne supstitucije zahtevaju zamenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.

Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Po pravilu, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).

Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu biti napravljene na „vrućim tačkama“ HVR, tj. na ostacima koje kodiraju kodoni koji učestalo trpe mutaciju tokom procesa somatskog sazrevanja (pogledajte, npr. Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), i/ili ostacima koji su u kontaktu sa antigenom, pri čemu se nastala varijanta VH ili VL ispituje na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisali su, npr. Hoogenboom, H.R. et al., u Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. U nekim otelotvorenjima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih metoda (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.

U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, umetanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više HVR regiona, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim otelotvorenjima varijantnih sekvenci VH i VL datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.

Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „skenirajuća mutageneza sa alaninom“, i opisali su je Cunningham, B.C. i Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.

Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante molekula antitela sa ubacivanjem obuhvataju spajanje sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptid, što povećava poluživot antitela u serumu.

b) Varijante glikozilacije

U određenim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde dato je izmenjeno da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na antitelu može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaju ili uklone.

Kada antitelo uključuje Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično obuhvataju razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona (videti, npr., Wright, A. i Morrison, S.L., TIBTECH15 (1997) 26-32). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc na „bazi“ biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.

U jednom otelotvorenju, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Vidite, npr. US2003/0157108; US2004/0093621. Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ varijante antitela ili varijante „sa manjkom fukoze“ su sledeći: S 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al. J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Lecl3 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka, J. et al. Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; i WO 2004/056312, naročito u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, poput gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelija (pogledajte, npr., Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng.94 (2006) 680-688; i WO 2003/085107).

Varijante antitela su dalje obezbeđene sa bisektovanim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektiran pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO2003/011878, US6,602,684 i US2005/0123546. Varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanim za Fc region takođe su obezbeđene. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO1997/30087, WO1998/58964 i WO1999/22764.

c) Varijante Fc regiona

U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela koje je ovde dato, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih mesta.

U određenim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, dok su pojedine efektorske funkcije (kao što su komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (stoga, verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch, J.V. i Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u US 5,500,362 (vidite npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; i Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (pogledajte Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med.166 (1987) 1351-1361). Alternativno, mogu biti korišćeni neradioaktivni postupci analize (videti, npr., ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Videti, npr., ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO2006/029879 i WO2005/100402. Da bi se odredila komplementarna aktivacija, može da se obavi CDC test (pogledajte, na primer, Gazzano-Santoro, H. et al. J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; i Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. et al. Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).

Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani "DANA" Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US 7,332,581).

Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcRs (pogledajte, npr., US 6,737,056; WO 2004/056312, i Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem.

276 (2001) 6591-6604).

U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).

U nekim otelotvorenjima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što je opisano u US 6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie, E.E. et ak, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer, R.L. et al. J. Immunol. 117 (1976) 587-593, i Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), opisana su u US 2005/0014934. Ta antitela obuhvataju Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ostatku ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US7,371,826).

Pogledajte takođe Duncan, A.R. i Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; i WO 94/29351 za druge primere varijanti Fc regiona.

d) Varijante antitela konstruisane sa cisteinom

U pojedinim otelotvorenjima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb“, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjen ostacima cisteina. U određenim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linkerlek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U određenim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano,

1

npr. u US7,521,541.

e) Derivati antitela

U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo se može dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i koji su dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

U drugom otelotvorenju, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Kam, N.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.

B. Moduli za transport kroz krvno-moždanu barijeru

U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo iz ovog izuma je multispecifično antitelo koje ima najmanje jednu specifičnost vezivanja za receptor transferina i najmanje jednu specifičnost vezivanja za terapeutski cilj, pri čemu mesto vezivanja koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor uključuje varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje vezuje transferinski receptor i drugo mesto vezivanja antigena, koje vezuje moždani antigen. U daljem otelotvorenju, moždani antigen je izabran iz grupe koju čine Abeta, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 (HER2), alfa-sinuklein, CD20, glukocerebrozidaza ili amiloidni prekursorski

2

protein (APP). U jednom poželjnom otelotvorenju, multispecifično antitelo vezuje

i) transferinski receptor i Abeta, ili

ii) transferinski receptor i CD20, ili

iii) transferinski receptor i alfa-sinuklein, ili

iv) transferinski receptor i fosfo-tau, ili

v) transferinski receptor i HER2, ili

vi) transferinski receptor i glukocerebrozidazu.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 81 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 82 vezno mesto za Abeta.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 79 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 80 mesto vezivanja za humani CD20. U jednom otelotvorenju, varijabilni region teškog lanca obuhvata zamenu aminokiselinskog ostatka na Kabatovoj poziciji 11 bilo kojom aminokiselinom osim leucinom. U jednom otelotvorenju, supstitucija uključuje zamenu aminokiselinskog ostatka na Kabatovoj poziciji 11 nepolarnom amino kiselinom. U jednom poželjnom otelotvorenju, supstitucija uključuje zamenu aminokiselinskog ostatka na Kabatovoj poziciji 11 u varijabilnom domenu teškog lanca SEQ ID NO: 79 aminokiselinskim ostatkom izabranim iz grupe koju čine valin, leucin, izoleucin, serin i fenilalanin.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 83 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 84 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 85 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 86 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 87 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 88 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 89 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 90 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 91 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 92 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i najmanje jedan par varijabilnog domena humanizovanog teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 93 i humanog varijabilnog domena lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO: 94 mesto vezivanja za humani alfa-sinuklein.

U jednom otelotvorenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37 formirajući mesto vezivanja za transferinski receptor i mesto vezivanja za humanu glukocerebrozidazu.

Jednovalentni vezujući entiteti koji se specifično vezuju za receptor krvno-moždane barijere mogu se okarakterisati s obzirom na njihova svojstva vezivanja i transcitoze:

- efikasno vezivanje KMBR eksprimirajućih ćelija kao jednovalentnog vezujućeg entiteta,

- efikasna in vitro transcitoza kao jednovalentni vezujući entitet,

- humana - cinomolgus unakrsna reaktivnost (npr. u BIAcore i FACS eksperimentima).

Skrining transcitoze može da se izvede u testu zasnovanom na hCMEC/D3. Test se može izvesti u pulsnom režimu. hCMEC/D3 endotelne ćelije mozga se inkubiraju sa jednovalentnim vezujućim entitetom 1 sat, nakon toga se isperu, i sledeći parametri se određuju 0 sati i 4 sata nakon ispiranja:

4

i) količina jednovalentnog vezujućeg entiteta preuzetog u ćelije tokom faze punjenja, ii) bazolateralna količina jednovalentnog vezujućeg entiteta 4 sata nakon punjenja i pranja;

iii) apikalna količina jednovalentnog vezujućeg entiteta 4 sata nakon punjenja i pranja; iv) količina jednovalentnog vezujućeg entiteta u ćelijama (lizom ćelije) 0 sati i 4 sata nakon punjenja i ispiranja;

v) ukupna količina jednovalentnog vezujućeg entiteta 0 sati i 4 sata nakon punjenja i pranja.

Da bi bilo kvalifikovano kao jednovalentni vezujući entitet u modulu transportera za krvno-moždanu barijeru, kao što je ovde objavljeno, antitelo na transferinski receptor (npr. kao jednovalentni vezujući entitet) mora biti i) preuzeto od strane hCMEC/D3 ćelija (endocitoza), ii) transportovano izvan hCMEC/D3 ćelija (egzocitoza), i iii) stabilno unutar hCMEC/D3 ćelija (bez transporta, ili mali transport do endozoma radi degradacije).

Dakle, u jednom otelotvorenju jednovalentni vezujući entitet je okarakterisan u testu zasnovanom na hCMEC/D3 i) (znatnim) unosom u hCMEC/D3 ćelije tokom perioda punjenja od jednog sata, ii) oslobađanjem u apikalni i/ili bazolateralni odeljak nakon perioda punjenja i korakom pranja u okviru 4 sata nakon pranja, i iii) malom (intracelularna) brzinom degradacije.

U jednom otelotvorenju, punjenje je u koncentraciji od oko 2,67 µg/ml jednovalentnog vezujućeg entiteta tokom jednog sata.

Utvrđeno je da, kako bi jednovalentni vezujući entitet bio kvalifikovan kao jednovalentni vezujući entitet modula transportera kroz krvno-moždanu barijeru, kao što je ovde objavljeno, moraju se pokazati u gore opisanom testu zasnovanom na hCMEC/D3 sledeće granične vrednosti:

i) količina jednovalentnog vezujućeg entiteta preuzeta u ćelije tokom faze punjenja od 400 pg ili više,

ii) bazolateralna količina jednovalentnog vezujućeg entiteta 4 sata nakon punjenja i ispiranja od 100 pg ili više, i

iii) apikalna količina jednovalentnog vezujućeg entiteta 4 sata nakon punjenja i ispiranja od 150 pg ili više.

Mišje antitelo na transferinski receptor 128.1 (za sekvence varijabilnog regiona pogledajte WO 93/10819 i SEQ ID NO: 64 i 65) mogu se uzeti kao referenca. U ovom slučaju, kako bi jednovalentni vezujući entitet bio kvalifikovan kao jednovalentni vezujući entitet modula transportera kroz krvno-moždanu barijeru, kao što je ovde objavljeno, moraju se pokazati u gore opisanom testu zasnovanom na hCMEC/D3 sledeće granične vrednosti: i) količina jednovalentnog vezujućeg entiteta preuzeta u ćelije tokom faze punjenja od 60% ili više punjenja antitela 128.1,

ii) bazolateralna količina jednovalentnog vezujućeg entiteta 4 sata nakon punjenja i ispiranja 60% ili više bazolateralne količine antitela 128.1; i

iii) apikalna količina jednovalentnog vezujućeg entiteta 4 sata nakon punjenja i ispiranja 60% ili više apikalne količine antitela 128.1.

Test zasnovan na hCMEC/D3 može se izvesti na sledeći način (ovo je jedna varijanta svih ovde objavljenih aspekata):

Medijum i suplementi za hCMEC/D3 (pogledajte WO 2006/056879 i Weksler, B.B., et al., FASEB J.19 (2005) 1872-1874) mogu se nabaviti od kompanije Lonza. hCMEC/D3 ćelije (presejavanja 26-29) uzgajaju se/mogu se uzgajati da se spoje na kolagenom obloženim pokrovnim stakalcima (mikroskopija) ili laboratorijskim bocama u medijumu EBM2 koji sadrži 2,5% FBS, četvrtinu isporučenih faktora rasta i u potpunosti je dopunjen isporučenim hidrokortizonom, gentamicinom i askorbinskom kiselinom.

Za sve testove transcitoze, pore velike gustine (1x10<8>pora/cm<2>) PET membranski filter umeci (veličina pora 0,4 µm, prečnik 12 mm) koriste se/mogu se koristiti u pločicama za kulturu ćelija sa 12 bunarčića. Izračunate zapremine medijuma su 400 µl, odnosno 1600 µl, za apikalne i bazolateralne komore. Apikalne komore filterskih umetaka su obložene/mogu biti obložene kolagenom I repa pacova (7,5 µg/cm<2>) nakon čega sledi fibronektin (5 µg/ml), a svaka inkubacija traje jedan sat na sobnoj temperaturi na hCMEC/D3 ćelijama koje se uzgajaju/mogu uzgajati do konfluentnih monoslojeva (~2x10<5>ćelija/cm<2>) 10-12 dana u EBM2 medijumu. Prazni filteri se blokiraju/mogu se blokirati u PBS-u koji sadrži 1% BSA tokom 1 sat ili preko noći (o/n) pre analize, a zatim kalibrisati najmanje 1 sat u EBM2 pre analize.

Test (za šemu testa pogledajte sliku 1) je izveden u medijumu bez seruma EBM2 koji je inače rekonstituisan kako je ovde opisano. Na dan analize, ćelije su izgladnjivane u serumu 60 minuta, kako bi se iscrpio prirodni ligand određenog receptora krvno-moždane barijere. Umeci filtera sa ćelijama ili bez ćelija (ali blokirani preko noći u kompletnom mediju) inkubirani su apikalno sa određenim monoklonskim antitelima (jednovalentni vezujući entitet) 1 sat na 37 °C. Monoslojevi su isprani na sobnoj temperaturi (RT) u medijumu bez seruma apikalno (400 µl) i bazolateralno (1600 µl) tri puta po 3-5 min. Prethodno zagrejani medijum je dodat u apikalnu komoru, i filteri su prebačeni na svežu pločicu sa 12 bunarčića (blokirani preko noći PBS-om koji sadrži 1% BSA) koja sadrže 1600 µl prethodno zagrejanog medijuma. U ovom trenutku, filteri sa ćelijama ili bez ćelija su lizirani u 500 µl RIPA pufera kako bi se odredio unos specifičnih antitela (jednovalentni vezujući entitet). Preostali filteri su inkubirani na 37 °C ili na 4 °C, a uzorci su sakupljeni u različitim terminima kako bi se odredilo apikalno i/ili bazolateralno oslobađanje antitela (jednovalentni vezujući entitet). Sadržaj antitela u uzorcima može da se kvantifikuje korišćenjem visoko osetljivog IgG ELISA testa (pogledajte Primer 9). Za svaki termin, podatke bi trebalo generisati iz dva prazna filtera i tri filterske ćelijske kulture.

C. Rekombinantni postupci i kompozicije

Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, npr., kao što je opisano u US4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo na transferinski receptor, kao što je ovde opisano. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U sledećem otelotvorenju, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U sledećem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela na transferinski receptor, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Za rekombinantnu proizvodnju antitela na transferinski receptor, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).

Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti npr., US 5,648,237, US 5,789,199 i US 5,840,523. (Videti takođe Charlton, KA, u: Methods in Molecular Biology, sveska 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, koji opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli) Nakon ekspresije, antitelo se može izolovati iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji i može se dalje prečistiti.

Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Vidite Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; i Li, H. et al., Nat. Biotech.24 (2006) 210-215.

Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr., US5,959,177, US6,040,498, US6,420,548, US7,125,978 i US6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).

Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri ćelijskih linija sisara koje se koriste kao domaćini su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); bubrežna linija humanog embriona (293 ili 293 ćelije su opisane, npr. u Graham, F.L. et al. J. Gen Virol.36 (1977) 59-74); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje sertolijeve ćelije (TM4 ćelije su opisane, npr., u Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci.

383 (1982) 44-68; MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub, G. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); i ćelijske linije mijeloma poput Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr. Yazaki, P. i Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, sveska 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp.255-268.

D. Testovi

Ovde obezbeđena antitela na transferinski receptor mogu se identifikovati, pregledati ili okarakterisati prema fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkoj aktivnosti, različitim testovima poznatim u struci.

1. Test vezivanja

U jednom aspektu, antitelo predmetnog pronalaska je ispitano da bi se odredila njegova antigen vezujuća aktivnost, npr., poznatim postupcima kao što je ELISA, alfaLISA, vestern blot, niz antitela ili reversnofazni niz, itd.

U primeru ELISA ili alfaLISA testa, transferinski receptor u rastvoru (ćelijski supernatant, lizati ćelija ili tkiva, telesne tečnosti, itd.) vezuje se antitelom za hvatanje, koje se specifično vezuje za prvi epitop na transferinskom receptoru, ili transferinski receptor u određenoj konformaciji i antitelo za detekciju povezano sa entitetom za detekciju, koji se specifično vezuje za drugi epitop ili konformaciju transferinskog receptora. Očitavanje se temelji na entitetu za detekciju (hemiluminescencija, fluorescencija, luminescencija indukovana prenosom energije, itd.).

U slučaju niza antitela, antitela se primećuju na staklenim ili nitroceluloznim čipovima. Slajdovi se blokiraju i inkubiraju sa rastvorom koji sadrži transferinski receptor, ispiraju kako bi se uklonila nevezana antitela, a vezana antitela se detektuju fluorescentno označenim odgovarajućim sekundarnim antitelom. Signal fluorescencije se meri pomoću skenera za fluorescentne slajdove. Slično kao kod reversno faznog niza, rekombinantni transferinski receptor, ćelijski supernatant, lizati ćelija ili tkiva, telesne tečnosti, itd. nanose se na staklene ili nitrocelulozne čipove. Slajdovi se blokiraju i pojedinačni nizovi se inkubiraju sa antitelom na specifični epitop na transferinski receptor. Nevezana antitela se ispiraju, a vezana antitela se detektuju pomoću fluorescentno obeleženog odgovarajućeg sekundarnog antitela. Signal fluorescencije se meri pomoću skenera za fluorescentne slajdove (Dernick, G., i sar. J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331).

E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje

U pojedinim otelotvorenjima, svako od antitela na transferinski receptor koja su ovde data korisno je za detektovanje prisustva humanog transferinskog receptora u biološkom uzorku. Termin „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo, kao što je moždano tkivo.

U jednom otelotvorenju, dato je antitelo na transferinski receptor za primenu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu, dat je postupak za detekciju prisustva transferinskog receptora u biološkom uzorku. U pojedinim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa antitelom na transferinski receptor kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje antitela na transferinski receptor sa transferinskim receptorom, i otkrivanje da li se formira kompleks između antitela na transferinski receptor i transferinskog receptora. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom otelotvorenju, antitelo na transferinski receptor je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju antitelom na transferinski receptor, npr. kada je transferinski receptor biomarker za izbor pacijenata.

Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati primenom antitela iz predmetnog pronalaska uključuju neurodegeneraciju sa akumulacijom gvožđa u mozgu tipa 1 (NBIA1), čistu autonomnu insuficijenciju, Daunov sindrom, guamski kompleks i nekoliko poremećaja Levijevih tela, poput difuzne bolesti Levijevih tela (DLBD), varijante Levijevog tela kod Alchajmerove bolesti (LBVAD), određenih oblika Gošeove bolesti i demencije kod Parkinsonove bolesti (PDD).

U pojedinim otelotvorenjima, data su obeleženaantitela na transferinski receptor. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (US4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali, i slično.

F. Farmaceutske formulacije

Farmaceutske formulacije antitela na transferinski receptor, prema opisu iz ovog dokumenta, pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili više takvih opcionih nosača. (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. (izd.) (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su uglavnom netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecil dimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je poli(vinilpirolidon); aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorljivi neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rhuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedine primere sHASEGP i postupke primene, uključujući rhuPH20, opisuje US2005/0260186 i US2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.

Primeri liofilizovanih formulacija antitela su opisani u US6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.

Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno mikrokapsula poli(metilmetakrilata), u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol A. (izd.) (1980).

Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, a te matrice su u određenom obliku, npr. film ili mikrokapsule.

Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

1

G. Postupci lečenja i preparati

Svako od anti-TfR antitela koja su ovde data može biti upotrebljeno u postupcima lečenja. U jednom aspektu, dato je anti-TfR antitelo da se koristi kao lek. Na primer, pronalazak daje postupak za transport terapeutskog jedinjenja kroz krvno-moždanu barijeru, uključujući izlaganje anti-TfR antitela povezanog sa terapeutskim jedinjenjem (npr. multispecifičnog antitela koje vezuje i TfR i moždani antigen) KMB-u, tako da antitelo transportuje terapeutsko jedinjenje koje je za njega vezano kroz KMB. U drugom primeru, pronalazak daje postupak za transport leka za neurološki poremećaj kroz krvno-moždanu barijeru, uključujući izlaganje anti-TfR antitela prema pronalasku povezanog sa lekom za poremećaj mozga (npr. multispecifičnog antitela koje vezuje i TfR i moždani antigen) KMB-u, tako da antitelo transportuje lek za neurološki poremećaj koji je za njega vezan kroz KMB. U jednom otelotvorenju, KMB je u sisaru (npr. čoveku), npr. onom koji ima neurološki poremećaj, uključujući, bez ograničenja: Alchajmerovu bolest (AD), moždani udar, demenciju, mišićnu distrofiju (MD), multiplu sklerozu (MS), amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS), cističnu fibrozu, Angelmanov sindrom, Lidlov sindrom, Parkinsonovu bolest, Pikovu bolest, Padžetovu bolest, rak, traumatičnu povredu mozga, itd. U jednom otelotvorenju, neurološki poremećaj je odabran od: neuropatije, amiloidoze, raka (npr. koji uključuje CNS ili mozak), očne bolesti ili poremećaja, virusne ili mikrobne infekcije, upale (npr. CNS-a ili mozga), ishemije, neurodegenerativne bolesti, epilepsiji, poremećaju ponašanja, lizozomske bolesti, itd. Antitela iz ovog pronalaska su posebno prikladna za lečenje takvih neuroloških poremećaja zbog njihove sposobnosti da transportuju jedan ili više povezanih aktivnih sastojaka/sparenih terapijskih jedinjenja preko KMB i u CNS/mozak gde takvi poremećaji nalaze svoju molekularnu, ćelijsku ili virusnu/mikrobnu osnovu. Neuropatski poremećaji su bolesti ili abnormalnosti nervnog sistema koje se karakterišu neodgovarajućom ili nekontrolisanom nervnom signalizacijom, ili potpunim njenim nedostatkom, i uključuju, ali nisu ograničene na, hronični bol (uključujući nociceptivni bol), bol izazvan povredom telesnih tkiva, uključujući bol vezan za kancer, neuropatski bol (bol izazvan abnormalnostima nerava, kičmene moždine ili mozga) i psihogeni bol (u potpunosti ili uglavnom vezan za psihološki poremećaj), glavobolju, migrenu, neuropatiju, kao i simptome i sindrome koji često prate takve neuropatske poremećaje, kao što je vrtoglavica ili mučnina.

Za neuropatski poremećaj može biti izabran neurološki lek koji je analgetik, uključujući, ali se ne ograničavajući na, narkotik/opioidni analgetik (tj. morfin, fentanil, hidrokodon, meperidin, metadon, oksimorfon, pentazocin, propoksifen, tramadol, kodein i oksikodon), nesteroidni anti-inflamatorni lek (NSAIL) (tj. ibuprofen, naproksen, diklofenak,

2

diflunisal, etodolak, fenoprofen, flurbiprofen, indometacin, ketorolak, mefenaminska kiselina, meloksikam, nabumeton, oksaprozin, piroksikam, sulindak i tolmetin), kortikosteroid (tj. kortizon, prednizon, prednizolon, deksametazon, metilprednizolon i triamcinolon), antimigrenski agens (tj. sumatriptin, almotriptan, frovatriptan, sumatriptan, rizatriptan, eletriptan, zolmitriptan, dihidroergotamin, eletriptan i ergotamin), acetaminofen, salicilat (tj. aspirin, holin salicilat, magnezijum salicilat, diflunisal i salsalat), antiepileptik (tj. karbamazepin, klonazepam, gabapentin, lamotrigin, pregabalin, tiagabin i topiramat), anestetik (tj. izofluran, trihlretilen, halotan, sevofluran, benzokain, hlorprokain, kokain, ciklometikain, dimetokain, propoksikain, prokain, novokain, proparakain, tetrakain, artikain, bupivakain, kartikain, sinhokain, etidokain, levobupivakain, lidokain, mepivakain, piperokain, prilokain, ropivakain, trimekain, saksitoksin i tetrodotoksin), i cox-2-inhibitor (tj. selekoksib, rofekoksib i valdekoksib). Za neuropatski poremećaj koji uključuje vrtoglavicu, može biti izabran neurološki lek koji je lek protiv vrtoglavice, uključujući, ali se ne ograničavajući na, meklizin, difenhidramin, prometazin i diazepam. Za neuropatski poremećaj koji uključuje mučninu, može biti izabran neurološki lek koji je lek protiv mučnine, uključujući, ali se ne ograničavajući na, prometazin, hlorpromazin, prohlorperazin, trimetobenzamid i metoklopramid.

Amiloidoze su grupa bolesti i poremećaja vezanih za ekstracelularne proteinske naslage u CNS-u, uključujući, ali se ne ograničavajući na, sekundarnu amiloidozu, amiloidozu vezanu za godine, Alchajmerovu bolest (AD), blago kognitivno oštećenje (MCI), demenciju sa Levijevim telima, Daunov sindrom, naslednu cerebralnu hemoragiju sa amiloidozom (holandski tip); guamski Parkinson-demencija kompleks, cerebralnu amiloidnu angiopatiju, Hantingtonovu bolest, progresivnu supranuklearnu paralizu, multiplu sklerozu; Krojcfeld Jakobovu bolest, Parkinsonovu bolest, prenosivu spongiformnu encefalopatiju, demenciju vezanu za HIV, amiotropnu lateralnu sklerozu (ALS), miozitis sa inkluzionim telima (IBM) i očne bolesti povezane sa beta-amiloidnim naslagama (tj. makularnu degeneraciju, optičke neuropatije vezane za druze i kataraktu).

Za amiloidozu može biti izabran neurološki lek koji uključuje, ali se ne ograničava na, antitelo ili drugi vezujući molekul (uključujući, ali se ne ograničavajući na mali molekul, peptid, aptamer ili drugi vezivač proteina) koji se specifično vezuje za cilj izabran od: beta sekretaze, tau, presenilina, amiloidnog prekursorskog proteina ili njegovih delova, amiloidnog beta peptida ili njegovih oligomera ili fibrila, receptora smrti 6 (DR6), receptora za krajnje proizvode glikacije (RAGE), parkina i hantingtina; inhibitora holinesteraze (tj. galantamin, donepezil, rivastigmin i takrin); NMDA receptora antagonista (tj. memantin), agensa za iscrpljivanje monoamina (tj. tetrabenazin); ergoloid mezilata; antiholinergijskog antiparkinsonika (tj. prociklidin, difenhidramin, triheksilfenidil, benztropin, biperiden i triheksifenidil); dopaminergijskog antiparkinsonika (tj. entakapon, selegilin, pramipeksol, bromokriptin, rotigotin, selegilin, ropinirol, rasagilin, apomorfin, karbidopa, levodopa, pergolid, tolkapon i amantadin); tetrabenazina; anti-inflamatornog leka (uključujući, ali se ne ograničavajući na, nesteroidni antiinflamatorni lek (tj. indometicin i druga gore nabrojana jedinjenja); hormona (tj. estrogen, progesteron i leuprolid); vitamina (tj. folat i nikotinamid); dimebolina; homotaurina (tj.3-aminopropansulfonska kiselina; 3APS); modulatora aktivnosti serotoninskog receptora (tj. ksaliproden); interferona i glukokortikoida.

Kanceri CNS-a se karakterišu aberantnom proliferacijom jedne ili više ćelija CNS-a (tj. nervnih ćelija) i uključuju, ali se ne ograničavaju na, gliom, glioblastom multiforme, meningiom, astrocitom, akustični neurom, hondrom, oligodendrogliom, meduloblastome, gangliogliom, švanom, neurofibrom, neuroblastom, i ekstraduralne, intramedularne, intraduralne tumore ili CNS metastaze perifernih tumora kao što su CD20 ili HER2 pozitivni kanceri.

Za kancer može biti izabran neurološki lek koji je hemoterapeutski agens.

Primeri hemoterapeutskih agenasa uključuju alkilujuće agense, kao što je tiotepa i CYTOXAN® ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetičke analoge topotekan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite kao što je hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike kao što su endiinski antibiotici (npr., kaliheamicin, naročito kaliheamicin gama1I i kaliheamicin omegaI1 (pogledajte, npr. Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33 (1994) 183-186); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i povezane hromofore hromoproteina endiinskih antibiotika), aklacinomisine, aktinomicin, autramicin,

4

azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubicin i dezoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što je mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što je metotreksat i 5-fluoruracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge kao što je ancitabin, azacitidin, 6-25 azauridin, karmofur, citarabin, didezoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što je kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenale kao što je aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljač folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; majtanzinoide kao što je majtanzin i ansamitocine; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2’,2"-trihlortrietilamin; trihotecene (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; 5 pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); tiotepa; taksoide, npr. TAXOL® paklitaksel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM bez kremofora, nanočestičnu formulaciju paklitaksela dizajniranu pomoću albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) i TAXOTERE® doksetaksel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); hloranbucil; gemcitabin (GEMZAR®); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinske analoge kao što je cisplatin i karboplatin; vinblastin (VELBAN®); platinu; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin (ONCOVIN®); oksaliplatin; leukovovin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinonska kiselina; kapecitabin (XELODA®); farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore nabrojanog; kao i kombinacije dva ili više gorepomenutih jedinjenja, kao što je CHOP, što je skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom, i FOLFOX, što je skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATINTM) u kombaciji sa 5-FU i leukovovinom.

U ovu definiciju hemoterapeutskih agenasa takođe su uključeni antihormonski agensi čije dejstvo reguliše, smanjuje, blokira ili inhibira dejstvo hormona koji mogu da podstiču rast kancera, i često su u obliku sistemskog lečenja ili lečenja za ceo organizam. Oni i sami mogu biti hormoni. Primeri uključuju antiestrogene i selektivne modulatore estrogenskog receptora (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX® tamoksifen), EVISTA® raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON® toremifen; antiprogesterone; regulatore smanjenja estrogenskog receptora (ERD); agense koji deluju tako što suzbijaju ili zatvaraju jajnike, na primer, agoniste hormona za oslobađanje leutinizujućeg hormona (LHRH) kao što je LUPRON® iELIGARD® leuprolid acetat, goserelin acetat, buserelin acetat i tripterelin; druge anti-androgene kao što je flutamid, nilutamid i bikalutamid; i inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksemestan, formestanie, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol i ARIMIDEX® anastrozol. Pored toga, takva definicija hemoterapeutskih agensa uključuje bisfosfonate kao što je klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), DIDROCAL® etidronat, NE-58095, ZOMETA® zoledronska kiselina/zoledronat, FOSAMAX® alendronat, AREDIA® pamidronat, 5 SKELID® tiludronat ili ACTONEL® risedronat; kao i troksacitabin (citozinski analog 1,3-dioksolanskog nukleozida); antisens oligonukleotide, naročito one koji inhibiraju ekspresiju gena na signalnim putevima koji učestvuju u aberantnoj ćelijskoj proliferaciji, kao što je, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); vakcine, kao što je THERATOPE® vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; lapatinib ditozilat (ErbB-2 i EGFR dvojna tirozin kinaza inhibitor malih molekula, takođe poznata kao GW572016); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore navedenog.

Druga grupa jedinjenja koja mogu biti izabrana kao neurološki lekovi za lečenje ili prevenciju kancera su antitumorski imunoglobulini (uključujući, ali se ne ograničavajući na, trastuzumab, pertuzumab, bevacizumab, alemtuzumab, cetuksimab, gemtuzumab ozogamicin, ibritumomab tiuksetan, panitumumab i rituksimab). U nekim slučajevima, antitela povezana sa toksičnom oznakom ili konjugatom mogu se upotrebiti da ciljaju i usmrte željene ćelije (tj. ćelije kancera), uključujući, ali se ne ograničavajući na, tositumomab sa radiološkom oznakom 131I, ili trastuzumab emtanzin.

Očne bolesti ili poremećaji su bolesti ili poremećaji oka, koje se za ove svrhe smatra organom CNS odvojenom od KMB. Očne bolesti ili poremećaji uključuju, ali se ne ograničavaju na, poremećaje beonjače, rožnjače, dužice i cilijarnog tela (tj. skleritis, keratitis, čir rožnjače, abraziju rožnjače, snežno slepilo, fotokeratitis, površinsku tačkastu keratopatiju, neovaskularizaciju rožnjače, Fuksovu distrofiju, keratokonus, suvi keratokonjuktivitis, iritis i uveitis), poremećaje sočiva (tj. kataraktu), poremećaje sudovnjače i rožnjače (tj. odvajanje rožnjače, retinoshizu, hipertenzivnu retinopatiju, dijabetsku retinopatiju, retinopatiju, retinopatiju nedonoščadi, starosnu degeneraciju makule, degeneraciju makule (vlažnu ili suvu), epiretinalnu membranu, pigmentni retinitis i edem makule), glaukom, crne tačkice, poremećaje optičkog nerva i vidnih puteva (tj. Leberovu naslednu optičku neuropatiju i druze optičkog diska), poremećaje očnih mišića/akomodaciju binokularnih pokreta/refrakciju (tj. strabizam, oftalmoparezu, progresivnu eksternu oftalmoplegiju, ezotropiju, egzotropiju, hipermetropiju, kratkovidost, astigmatizam, anizometropiju, dalekovidost i oftalmoplegiju), poremećaje vida i slepilo (tj. ambliopiju, Leverovu kongenitalnu amaurozu, skotom, slepilo za boje, ahromatopsiju, noćno slepilo, slepilo, rečno slepilo i mikro-oftalmiju/kolobom), crvenilo oka, Argajl-Robertsonovu zenicu, keratomikozu, kseroftalmiju i aniridiju.

Za bolest ili poremećaj očiju, neurološki lek može biti izabran tako da bude antiangiogeni oftalmološki agens (tj. bevacizumab, ranibizumab i pegaptanib), oftalmološki glaukomski agens (tj. karbahol, epinefrin, demekarijum bromid, apraklonidin, brimonidin, brinzolamid, levobunolol, timolol, betaksolol, dorzolamid, bimatoprost, karteolol, metipranolol, dipivefrin, travoprost i latanoprost), inhibitor ugljene anhidraze (tj. metazolamid i acetazolamid), oftalmološki antihistaminik (tj. nafazolin, fenilefrin i tetrahidrozolin), očni lubrikant, oftalmološki steroid (tj. fluormetolon, prednizolon, loteprednol, deksametazon, difluprednat, rimeksolon, fluocinolon, medrizon i triamcinolon), oftalmološki anestetik (tj. lidokain, proparakain i tetrakain), oftalmološki antiinfektiv (tj. levofloksacin, gatifloksacin, ciprofloksacin, moksifloksacin, hloramfenikol, bacitracin/polimiksin B, sulfacetamid, tobramicin, azitromicin, besifloksacin, norfloksacin, sulfisoksazol, gentamicin, idoksuridin, eritromicin, natamicin, gramicidin, neomicin, ofloksacin, trifluridin, ganciklovir, vidarabin), oftalmološki antiinflamatorni agens (tj. nepafenak, ketorolak, flurbiprofen, suprofen, ciklosporin, triamcinolon, diklofenak i bromfenak), oftalmološki antihistaminik ili dekongestant (tj. ketotifen, olopatadin, epinastin, nafazolin, kromolin, tetrahidrozolin, pemirolast, bepotastin, nafazolin, fenilefrin, nedokromil, lodoksamid, fenilefrin, emedastin i azelastin).

Virusne ili mikrobne infekcije CNS-a uključuju, ali se ne ograničavaju na, infekcije virusima (tj. virus influence, HIV, poliovirus, rubela), bakterijama (tj. Neisseria sp., Streptococcus sp., Pseudomonas sp., Proteus sp., E. coli, S. aureus, Pneumococcus sp., Meningococcus sp., Haemophilus sp. i Mycobacterium tuberculosis) i drugim mikroorganizmima, kao što su gljivice (tj. kvasac, Cryptococcus neoformans), paraziti (tj. Toxoplasma gondii) ili amebe, koje dovode do patofiziologija CNS-a, uključujući, ali bez ograničavanja na, meningitis, encefalitis, mijelitis, vaskulitis i apsces, koji mogu biti akutni ili hronični.

Za virusne bolesti ili bolesti izazvane mikroorganizmima, neurološki lek može biti izabran iz grupe koja uključuje, ali se ne ograničava na, antivirusno jedinjenje (uključujući, ali se ne ograničavajući na, adamantanska antivirusna jedinjenja (tj. rimantadin i amantadin), antivirusni interferon (tj. peginterferon alfa-2b), antagonist receptora hemokina (tj. maravirok), inhibitor integraze (tj. raltegravir), inhibitor neuraminidaze (tj. oseltamivir i zanamivir), nenukleozidni inhibitor reversne transkriptaze (tj. efavirenz, etravirin, delavirdin i nevirapin), nukleozidni inhibitor reversne transkriptaze (tenofovir, abakavir, lamivudin, zidovudin, stavudin, entekavir, emtricitabin, adefovir, zalcitabin, telbivudin i didanozin), inhibitor proteaze (tj. darunavir, atazanavir, fosamprenavir, tipranavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, indinavir i sakvinavir), purinski nukleozid (tj. valaciklovir, famciklovir, aciklovir, ribavirin, ganciklovir, valganciklovir i cidofovir) i mešane antivirotike (tj. enfuvirtid, foskamet, palivizumab i fomivirsen)), antibiotik (uključujući, ali se ne ograničavajući na, aminopenicilin (tj. amoksicilin, ampicilin, oksacilin, nafcilin, kloksacilin, dikloksacilin, flukoksacilin, temocilin, azlocilin, karbenicilin, tikarcilin, mezlocilin, piperacilin i bacampicilin), cefalosporin (tj. cefazolin, cefalksin, cefalotin, cefamandol, ceftriakson, cefotaksim, cefpodoksim, ceftazidim, cefadroksil, cefradin, lorakarbef, cefotetan, cefuroksim, cefprozil, cefaklor i cefoksitin), karbapenem/penem (tj. imipenem, meropenem, ertapenem, faropenem i doripenem), monobaktam (tj. aztreonam, tigemonam, norkardicin A i tabtoksinin-beta-laktam, inhibitor beta-laktamaze (tj. klavulanska kiselina, tazobaktam i sulbaktam) u vezi sa drugim beta-laktamskim antibiotikom, aminoglikozid (tj. amikacin, gentamicin, kanamicin, neomicin, netilmicin, streptomicin, tobramicin i paromomicin), ansamicin (tj. geldanamicin i herbimicin), karbacefem (tj. lorakarbef), glikopeptide (tj. teikoplanin i vankomicin), makrolid (tj. azitromicin, klaritromicin, diritromicin, eritromicin, roksitromicin, troleandomicin, telitromicin i spektinomicin), monobaktam (tj. aztreonam), kvinolon (tj. ciprofloksacin, enoksacin, gatifloksacin, levofloksacin, lomefloksacin, moksifloksacin, norfloksacin, ofloksacin, trovafloksacin, grepafloksacin, sparfloksacin i temafloksacin), sulfonamid (tj.

mafenid, sulfonamidohrisoidin, sulfacetamid, sulfadiazin, sulfametizol, sulfanilamid, sulfasalazin, sulfisoksazol, trimetoprim, trimetoprim i sulfametoksazol), tetraciklin (tj. tetraciklin, demeklociklin, doksiciklin, minociklin i Oksitetraciklin), antineoplastični ili citotoksični antibiotik (tj. doksorubicin, mitoksantron, bleomicin, daunorubicin, daktinomicin, epirubicin, idarubicin, plikamicin, mitomicin, pentostatin i valrubicin) i mešovita antibakterijska jedinjenja (tj. bacitracin, kolistin i polimiksin B)), antifungalni agens (tj. metronidazol, nitazoksanid, tinidazol, hlorokvin, jodokvinol i paromomicin) i antiparazitik (uključujući, ali se ne ograničavajući na, kinin, hlorokvin, amodiakvin, pirimetamin, sulfadoksin, proguanil, meflokvin, atovakvon, primakvin, artemezinin, halofantrin, doksiciklin, klindamicin, mebendazol, pirantel pamoat, tiabendazol, dietilkarbamazin, ivermektin, rifampin, amfotericin B, melarsoprol, efornitin i albendazol).

Upala CNS-a uključuje, ali nije ograničena na, upalu izazvanu povredom CNS-a, koja može biti fizička povreda (tj. usled nezgode, operacije, traume mozga, povrede kičmene moždine, potresa) ili povredom usled, ili u vezi sa jednom ili više drugih bolesti ili poremećaja CNS-a (tj. apsces, kancer, virusne ili mikrobne infekcije).

Za upalu CNS-a može biti izabran neurološki lek koji deluje na samu upalu (tj. nesteroidni antiinflamatorni agens kao što je ibuprofen ili naproksen), ili koji leči osnovni uzrok upale (tj. antivirusni ili antitumorski agens).

Ishemija CNS-a, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na grupu poremećaja vezanih za aberantni protok krvi ili ponašanje krvnih sudova u mozgu, ili uzroke za to, i uključuje, ali se ne ograničava na: fokalnu moždanu ishemiju, globalnu moždanu ishemiju, moždani udar (tj. subarahnoidalnu hemoragiju i intracerebralnu hemoragiju) i aneurizmu.

Za ishemiju, neurološki lek može biti izabran iz grupe koja uključuje, ali se ne ograničava na, trombolitik (tj. urokinazu, alteplazu, reteplazu i tenekteplazu), inhibitor agregacije trombocita (tj. aspirin, cilostazol, klopidogrel, prasugrel i dipiridamol), statin (tj. lovastatin, pravastatin, fluvastatin, rosuvastatin, atorvastatin, simvastatin, cerivastatin i pitavastatin) i jedinjenje koje poboljšava protok krvi ili elastičnost krvnih sudova, uključujući npr. lekove za krvni pritisak.

Neurodegenerativne bolesti predstavljaju grupu bolesti i poremećaja povezanih sa gubitkom funkcije ili umiranjem nervnih ćelija u CNS-u, i uključuju, ali nisu ograničene na: adrenoleukodistrofiju, Aleksanderovu bolest, Alperovu bolest, amiotrofnu lateralnu sklerozu, ataksiju telangiektaziju, Batenovu bolest, Kokejnov sindrom, kortikobazalnu degeneraciju, degeneraciju izazvanu amiloidozom ili povezanu sa njom, Fridrajhovu ataksiju, frontotemporalnu lobarnu degeneraciju, Kenedijevu bolest, multiplu sistemsku atrofiju, multiplu sklerozu, primarnu lateralnu sklerozu, progresivnu supranuklearnu paralizu, spinalnu mišićnu atrofiju, transverzalni mijelitis, Refsumovu bolest i spinocerebelarnu ataksiju.

Za neurodegenerativne bolesti može biti izabran neurološki lek koji je hormon rasta ili neurotrofni faktor; primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na neurotrofni moždani faktor (BDNF), nervni faktor rasta (NGF), neurotrofin-4/5, faktor rasta fibroblasta (FGF)-2 i druge FGF, neurotrofin (NT)-3, eritropoetin (EPO), faktor rasta hepatocita (HGF), epidermalni faktor rasta (EGF), transformišući faktor rasta (TGF)-alfa, TGF-beta, vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), antagonist receptora interleukina-1 (IL-1ra), cilijarni neurotrofni faktor (CNTF), glijalni neurotrofni faktor (GDNF), neurturin, trombocitni faktor rasta (PDGF), heregulin, neuregulin, artemin, persefin, interleukine, glijalni neurotrofni faktor poreklom iz ćelijskih linija (GFR), faktor stimulacije kolonija granulocita (CSF), CSF granulocita-makrofaga, netrine, kardiotrofin-1, sonične ježeve, faktor inhibicije leukemije (LIF), midkin, plejotrofin, koštane morfogenetičke proteine (BMP), netrine, saposine, semaforine i faktor matičnih ćelija (SCF).

Epilepsije i epileptični poremećaji CNS-a obuhvataju neodgovarajuće i/ili nenormalno provođenje električnih impulsa u CNS-u, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: epilepsiju (tj. apsans napadi, atonični napadi, benigna dečja epilepsija, dečji apsans, klonični napadi, kompleksni parcijalni napadi, epilepsija frontalnog režnja, febrilni napadi, infantilni spazmi, juvenilna mioklonična epilepsija, juvenilna apsans epilepsija, Lenoks-Gastoov sindrom, Landau-Klefnerov sindrom, Dravetov sindrom, Otaharin sindrom, Vestov sindrom, mioklonični napadi, mitohondrijski poremećaji, progresivne mioklonične epilepsije, psihogeni napadi, refleksna epilepsija, Rasmusenov sindrom, jednostavni parcijalni napadi, sekundarno generalizovani napadi, epilepsija temporalnog režnja, toniklonični napadi, tonični napadi, psihomotorni napadi, limbična epilepsija, parcijalni napadi, generalizovani napadi, status epilepticus, abdominalna epilepsija, akinetički napadi, autonomni napadi, masivni bilateralni mioklonus, katamenijalna epilepsija, iznenadni padovi, emocionalni napadi, fokalni napadi, gelastični napadi, Džeksonov marš, Laforina bolest, motorni napadi, multifokalni napadi, noćna epilepsija, fotosenzitivni napad, pseudo napadi, senzorni napadi, suptilni napadi, Rolandova epilepsija, napadi obustavljanja i vizuelno refleksni napadi). Za poremećaj povezan sa epileptičnim napadom može biti izabran neurološki lek koji je antikonvulziv ili antiepileptik, uključujući, ali se ne ograničavajući na, barbituratne antikonvulzive (tj. primidon, metarbital, mefobarbital, alobarbital, amobarbital, aprobarbital, alfenal, barbital, bralobarbital i fenobarbital), benzodiazepinske antikonvulzive (tj. diazepam, klonazepam, i lorazepam), karbamatne antikonvulzive (tj. felbamat), antikonvulzive inhibitore ugljene anhidraze (tj.

acetazolamid, topiramat i zonisamid), dibenzazepinske antikonvulzive (tj. rufinamid, karbamazepin i okskarbazepin), antikonvulzive derivate masnih kiselina (tj. divalproeks i valproinska kiselina), analoge gama-aminobuterne kiseline (tj. pregabalin, gabapentin i vigabatrin), inhibitore ponovnog preuzimanja gama-aminobuterne kiseline (tj. tiagabin), inhibitore transaminaze gama-aminobuterne kiseline (tj. vigabatrin), hidantoinske antikonvulzive (tj. fenitoin, etotoin, fosfenitoin i mefenitoin), mešovite antikonvulzive (tj. lakozamid i magnezijum sulfat), progestine (tj. progesteron), oksazolidindionske antikonvulzive (tj. parametadion i trimetadion), pirolidinske antikonvulzive (tj. levetiracetam), sukcinimidne antikonvulzive (tj. etosuksimid i metsuksimid), triazinske antikonvulzive (tj. lamotrigin) i antikonvulzive derivate uree (tj. fenacemid i feneturid).

Poremećaji ponašanja su poremećaji CNS-a koje karakteriše nenormalno ponašanje osoba koje su njime pogođene, i uključuju, ali nisu ograničeni na: poremećaje spavanja (tj. nesanicu, parasomnije, noćne more, cirkadijalne poremećaje vezane za spavanje i narkolepsiju), poremećaje raspoloženja (tj. depresiju, suicidalnu depresiju, anksioznost, hronične afektivne poremećaje, fobije, napade panike, opsesivno-kompulsivni poremećaj, poremećaj hiperaktivnosti i nedostatka pažnje (ADHD), poremećaj nedostatka pažnje (ADD), sindrom hroničnog umora, agorafobiju, posttraumatski stresni poremećaj, bipolarni poremećaj), poremećaje ishrane (tj. anoreksiju ili bulimiju), psihoze, razvojne poremećaje ponašanja (tj. autizam, Retov sindrom, Aspergerov sindrom), poremećaje ličnosti i psihotične poremećaje (tj. šizofreniju, deluzione poremećaje, i slično).

Za poremećaje ponašanja, neurološki lek može biti izabran od jedinjenja koja modifikuju ponašanje, uključujući, ali se ne ograničavajući na, atipični antipsihotik (tj. risperidon, olanzapin, apripiprazol, kvetiapin, paliperidon, asenapin, klozapin, iloperidon i ziprasidon), fenotiazinski antipsihotik (tj. prohlorperazin, hlorpromazin, flufenazin, perfenazin, trifluoperazin, tioridazin i mesoridazin), tioksanten (tj. tiotiksen), mešoviti antipsihotik (tj. pimozid, litijum, molindon, haloperidol i loksapin), selektivni inhibitor preuzimanja serotonina (tj. citalopram, escitalopram, paroksetin, fluoksetin i sertralin), inhibitor preuzimanja serotonina-norepinefrina (tj. duloksetin, venlafaksin, desvenlafaksin, triciklični antidepresiv (tj. doksepin, klomipramin, amoksapin, nortriptilin, amitriptilin, trimipramin, imipramin, protriptilin i desipramin), tetraciklični antidepresiv (tj. mirtazapin i maprotilin), fenilpiperazinski antidepresiv (tj. trazodon i nefazodon), inhibitor monoamin oksidaze (tj. izokarboksazid, fenelzin, selegilin i tranilcipromin), benzodiazepin (tj. alprazolam, estazolam, flurazeptam, klonazepam, lorazepam i diazepam), inhibitor preuzimanja norepinefrina-dopamina (tj. bupropion), CNS stimulans (tj. fentermin,

1

dietilpropion, metamfetamin, dekstroamfetamin, amfetamin, metilfenidat, deksmetilfenidat, lisdeksamfetamin, modafinil, pemolin, fendimetrazin, benzfetamin, fendimetrazin, armodafinil, dietilpropion, kafein, atomoksetin, doksapram i mazindol), anksiolitik/sedativ/hipnotik (uključujući, ali se ne ograničavajući na, barbiturat (tj. sekobarbital, fenobarbital i mefobarbital), benzodiazepin (kao što je gore opisano) i mešoviti anksiolitik/sedativ/hipnotik (tj. difenhidramin, natrijum oksibat, zaleplon, hidroksizin, hloral hidrat, aolpidem, buspiron, doksepin, eszopiklon, ramelteon, meprobamat i etklorvinol)), sekretin (pogledajte, npr. Ratliff-Schaub et al. Autism 9 (2005) 256-265), opioidni peptid (pogledajte, npr., Cowen et al., J. Neurochem. 89 (2004) 273-285) i neuropeptid (pogledajte, npr., Hethwa et al. Am. J. Physiol.289 (2005) E301-305).

Lizozomski poremećaji nakupljanja su metabolički poremećaji koji su u nekim slučajevima vezani sa CNS-om ili imaju simptome specifične za CNS; takvi poremećaji uključuju, ali se ne ograničavaju na: Tej-Saksovu bolest, Gošeovu bolest, Fabrijevu bolest, mukopolisaharidozu (tip I, II, III, IV, V, VI i VII), poremećaj skladištenja glikogena, GM1-gangliozidozu, metahromatsku leukodistrofiju, Farberovu bolest, Kanavanovu leukodistrofiju i neuronske ceroidne lipofuscinoze tip 1 i 2, Niman-Pikovu bolest, Pompeovu bolest i Krabeovu bolest.

Kod lizozomske bolesti nakupljanja, neurološki lek može biti izabran tako da bude enzim, ili da podražava aktivnost enzima koji je oštećen zbog bolesti. Primeri rekombinantnih enzima za lečenje poremećaja nakupljanja lizozoma uključuju, ali se ne ograničavaju na one koji su navedeni npr. u U.S. Patent Application publication no. 2005/0142141 (tj. alfa-L20-iduronidaza, iduronat-2-sulfataza, N-sulfataza, alfa-N-acetilglukozaminidaza, N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza, beta-galaktozidaza, aril sulfataza B, beta-glukuronidaza, kisela alfaglukozidaza, glukocerebrozidaza, alfa-galaktozidaza A, heksozaminidaza A, kisela sfingomijelinaza, beta-galaktocerebrozidaza, beta-galaktozidaza, arilsulfataza A, kisela ceramidaza, aspartoacilaza, palmitoil-protein tioesteraza 1 i tripeptidil amino peptidaza 1).

U jednom aspektu, antitelo iz pronalaska se koristi za detekciju neurološkog poremećaja pre pojave simptoma i/ili za procenu ozbiljnosti ili trajanja bolesti ili poremećaja. U jednom aspektu, antitelo omogućava detekciju i/ili imidžing neurološkog poremećaja, uključujući tehnike radiografije, tomografije ili magnetne rezonance (MR).

U jednom aspektu, dato je anti-TfR antitelo malog afiniteta prema pronalasku za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, dato je anti-TfR antitelo malog afiniteta za upotrebu u lečenju neurološke bolesti ili poremećaja (npr. Alchajmerove bolesti) bez iscrpljivanja crvenih krvnih zrnaca (tj. retikulocita). U nekim otelotvorenjima, dato je modifikovano anti-TfR

2

antitelo malog afiniteta za upotrebu u postupku lečenja, kao što je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-TfR antitelo malog afiniteta za poboljšanje bezbednosti za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima neurološku bolest ili poremećaj, uključujući primenu na pojedincu efikasne količine anti-TfR antitela (opciono povezanog sa lekom za neurološki poremećaj). U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje primenu efikasne količine bar jednog dodatnog terapeutskog agensa na pojedincu. U daljim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-TfR antitelo za poboljšanje bezbednosti za primenu u smanjivanju ili inhibiranju stvaranja amiloidnog plaka kod pacijenta kod koga postoji rizik od neurološke bolesti ili poremećaja (npr. Alchajmerove bolesti), ili koji je već oboleo. „Pojedinac“ prema bilo kom od gornjih otelotvorenja je opciono čovek. U nekim aspektima, anti-TfR antitelo iz pronalaska za upotrebu u postupcima iz pronalaska poboljšava preuzimanje leka za neurološki poremećaj sa kojim je povezano.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-TfR antitela malog afiniteta iz pronalaska protiv za proizvodnju ili pripremu leka. U jednom otelotvorenju, lek služi za lečenje neurološke bolesti ili poremećaja. U daljem otelotvorenju, lek služi za upotrebu u postupku za lečenje neurološke bolesti ili poremećaja, uključujući primenu efikasne količine leka na pojedincu koji ima neurološku bolest ili poremećaj. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje primenu efikasne količine bar jednog dodatnog terapeutskog agensa na pojedincu.

U daljem aspektu, pronalazak daje postupak za lečenje Alchajmerove bolesti. U jednom otelotvorenju, postupak uključuje davanje efikasne količine multispecifičnog antitela iz pronalaska koje vezuje i BACE1 i TfR ili Abeta i TfR pojedincu koji ima Alchajmerovu bolest. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje primenu efikasne količine bar jednog dodatnog terapeutskog agensa na pojedincu. „Pojedinac“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.

Anti-TfR antitela iz pronalaska mogu da se koriste ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensom u terapiji. Na primer, anti-TfR antitelo iz pronalaska može biti primenjeno zajedno sa bar jednim dodatnim terapeutskim agensom. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je terapeutski agens efikasan za lečenje istog ili različitog neurološkog poremećaja kao što je onaj za čije lečenje se koristi anti-TfR antitelo. Primeri dodatnih terapeutskih agensa uključuju, ali se ne ograničavaju na: različite neurološke lekove koji su gore opisani, inhibitore holinesteraze (kao što je donepezil, galantamin, rovastigmin i takrin), antagoniste NMDA receptora (kao što je memantin), inhibitore agregacije amiloid beta peptida, antioksidanse, modulatore γ-sekretaze, imitatore nervnog faktora rasta (NGF) ili NGF gensku terapiju, PPARγ agoniste, inhibitore HMS-CoA reduktaze (statine), ampakine, blokatore kalcijumskih kanala, antagoniste GABA receptora, inhibitore glikogen sintaze kinaze, intravenski imunoglobulin, agoniste muskarinskog receptora, modulatore nikotinskog receptora, aktivnu ili pasivnu imunizaciju amiloid beta peptidom, inhibitore fosfodiesteraze, antagoniste serotoninskog receptora i antitela protiv amiloid beta peptida. U pojedinim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni terapeutski agens je izabran zbog svoje sposobnosti da ublaži jedno ili više neželjenih dejstava neurološkog leka.

U nekim drugim takvim otelotvorenjima, najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo je odabrano zbog njegove sposobnosti da inhibira ili spreči aktivaciju putanje komplementa nakon primene anti-TfR antitela. Primeri takvih terapijskih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na, agense koji ometaju sposobnost anti-TfR antitela da se vežu ili aktiviraju putanju komplementa i agense koji inhibiraju jednu ili više molekularnih interakcija unutar putanje komplementa, a opisani su uopšteno u Mollnes i Kirschfink (Molec. Immunol.43 (2006) 107-121).

Takve kombinovane terapije koje su gore i ovde pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agensa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela iz pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otelotvorenju, primena anti-TfR antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge. Antitela iz pronalaska mogu takođe da se koriste u kombinaciji sa drugim interventnim terapijama kao što su, ali bez ograničavanja, radijaciona terapija, bihejvioralna terapija ili druge terapije poznate u struci i prikladne za lečenje ili prevenciju datog neurološkog poremećaja.

Anti-TfR antitelo iz predmetnog pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Antitela iz predmetnog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni

4

poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto na koje se agens daje, metod davanja, raspored davanja i drugi faktori poznati lekarima.

Antitelo ne mora biti, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agensa koji se trenutno koriste za prevenciju ili lečenje dotičnog poremećaja, ili za sprečavanje, ublažavanje ili poboljšavanje jedne ili više nuspojava primene antitela. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su prethodno razmatrani. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz predmetnog pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr.0,1 mg/kg - 10 mg/kg) antitela može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, putem jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 40 mg/kg. Dakle, pacijentu se može dati jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg ili 40 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Važno je da je jedan postupak za smanjenje uticaja na populacije retikulocita primenom anti-TfR antitela modifikacija količine ili vremena doza tako da sveukupno manje količine antitela koja cirkulišu budu prisutne u krvotoku za interakciju sa retikulocitima. U jednom neograničavajućem primeru, manja doza anti-TfR antitela može se primeniti sa većom učestalošću nego što bi bila veća doza. Korišćena doza može biti izbalansirana između količine antitela koja je potrebna da se isporuči u CNS (koja se odnosi na afinitet CNS antigenspecifičnog dela antitela), afiniteta tog antitela prema TfR, i da li se jedinjenje(a) koje štiti crvena krvna zrnca (tj. retikulocite), stimuliše rast i razvoj ili koje inhibira putanju komplementa daje istovremeno ili serijski sa antitelom. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima kako je ovde opisano i poznato u struci.

Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-TfR antitela ili kao njegovog dodatka.

III. Proizvodi

U drugom aspektu, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo predmetnog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Podrazumeva se da svaki od gorepomenutih proizvoda može da sadrži imunokonjugat iz pronalaska umesto ili pored antitela na transferinski receptor.

IV. PRIMERI

U nastavku su dati primeri za postupke i preparate iz pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.

Materijali i postupci

Tehnike rekombinantne DNK

Standardni postupci su korišćeni za manipulaciju DNK, kao što je opisano u Sambrook, J. i sar. Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača.

Sinteza gena i oligonukleotida

Željeni segmenti gena su pripremljeni hemijskom sintezom u kompaniji Geneart GmbH (Regensburg, Nemačka). Sintetisani fragmenti gena su klonirani u plazmidu E. coli za propagaciju/amplifikaciju. DNK sekvence subkloniranih genskih fragmenata su proverene sekvenciranjem DNK. Alternativno, kratki sintetički fragmenti DNK su sakupljeni žarenjem hemijski sintetisanih oligonukleotida ili putem PCR-a. Odgovarajuće oligonukleotide je pripremila kompanija metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Nemačka).

Reagensi

Sve komercijalne hemikalije, antitela i kompleti su korišćeni prema protokolu proizvođača, ako nije drugačije naznačeno.

Primer 1

Imunizacija zečeva i miševa

Imunizacija miševa

NMRI miševi su imunizovani genetski, koristeći plazmidni ekspresioni vektor koji kodira humani ili cinomolgusov TfR kompletne dužine, intradermalnom primenom 100 µg vektorske DNK, a zatim elektroporacijom (2 kvadratna impulsa od 1000 V/cm, trajanje 0,1 ms, interval 0,125 s; a zatim 4 kvadratna impulsa od 287,5 V/cm, trajanje 10 ms, interval 0,125 s. Miševi su primili 6 ili 7 uzastopnih imunizacija 0, 14, 28, 42, 56, 70. i 84. dana. Četvrta i šesta imunizacija su obavljene vektorskim kodiranjem za cinomolgusov TfR; vektorsko kodiranje za humani TfR je korišćeno za sve ostale imunizacije. Krv je uzeta 36, 78. i 92. dana i pripremljen je serum koji je korišćen za određivanje titra pomoću ELISA tehnike (vidi dole). Životinje s najvišim titrima su izabrane za pojačavanje 96. dana, intravenskom injekcijom bilo 10<6>humanih TF-1 ćelija ili 50 µg rekombinantnog humanog rastvorljivog TfR bez helikoidnog domena (ekstracelularni domen humanog TfR koji počinje na Leu 122, završava se na Asn608, eksprimiran u HEK293F ćelijama kao N-terminalna fuzija za humani Fc-region i prečišćen afinitetnom hromatografijom za protein A i hromatografijom na molekulskim sitima, a monoklonska antitela su izolovana tehnologijom hibridoma, na osnovu njihove sposobnosti da vežu humani i cinomolgusov transferinski receptor eksprimiran na površini stabilno transficiranih CHO-K1 ćelija (pogledajte Primer 3).

Imunizacija zečeva

Novozelandski beli zečevi ili transgeni zečevi koji eksprimiraju repertoar humanizovanih antitela genetski su imunizovani korišćenjem vektora ekspresije plazmida koji kodira humani ili cinomolgusov TfR pune dužine, intradermalnom primenom 400 µg vektorske DNK, nakon čega sledi elektroporacija (5 kvadratnih impulsa od 750 V/cm, trajanje 10 ms, interval 1 s.). Zečevi su primili 6 uzastopnih imunizacija 0, 14, 28, 56, 84. i 112. dana. Četvrta i šesta imunizacija su obavljene vektorskim kodiranjem za cinomolgusov TfR; vektorsko kodiranje za humani TfR je korišćeno za sve ostale imunizacije. Krv (10% procenjene ukupne količine krvi) uzeta je 35, 63, 91. i 119. dana. Pripremljen je serum koji je korišćen za određivanje titra pomoću ELISA (pogledajte ispod), i izolovane su periferne mononuklearne ćelije koje su korišćene kao izvor antigen-specifičnih B ćelija u procesu kloniranja B ćelija (pogledajte Primer 2).

Određivanje titra u serumu (ELISA)

Humani rekombinantni rastvorljivi TfR (R&D Systems kat. br.2474-TR) imobilizovan je na NUNC Maxisorb pločici sa 96 bunarčića pri 3 µg/ml, 100 µl/bunarčiću, u PBS-u, nakon čega je usledilo: blokiranje pločice sa 2% CroteinC-a u PBS-u, 200 µl/bunarčiću; primena serijskih razblaženja antiseruma, u duplikatu, u 0,5% CroteinC u PBS-u, 100 µl/bunarčiću; detekcija sa (1) HRP-konjugovanim kozjim anti-mišjim antitelom (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16000) za sve mišje serume, (2) HRP-konjugovano magareće anti-zečje IgG antitelo (Jackson/Immunoresearch Dianova 711-036-152; 1/16000) za sve zečje serume, (3) zečja anti-humana IgG antitela (Pierce/Thermo Scientific 31423; 1/5000) samo za serume transgenih zečeva, (4) biotinilovano kozje anti-humano antitelo (Southern Biotech/Biozol 2063-08, 1/5000) i streptavidin-HRP samo za serume transgenih zečeva; razblažen u 0,5% CroteinC u PBS-u, 100 µl/bunarčiću. Za sve korake, ploče su inkubirane 1 sat na 37 °C. Između svih koraka, ploče su isprane 3 puta sa 0,05% Tween 20 u PBS-u. Signal je razvijen dodavanjem rastvorljivog supstrata BM Blue POD (Roche), 100 µl/bunarčiću; i zaustavljen dodavanjem 1 M HCl, 100 µl/bunarčiću. Apsorbanca je očitana na 450 nm, u odnosu na 690 nm kao referencu. Titar je definisan kao razblaženje antiseruma koje daje polumaksimalni signal.

Primer 2

Kloniranje B-ćelija zečeva

Izolovanje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) zeca

Uzeti su uzorci krvi od 6 životinja (2 divlja (wt) zeca i 4 transgena (tg) zeca). Ovi zečevi su proizašli iz 2 različite kampanje imunizacije: prva kampanja sa 2 wt i 2 tg zeca i druga kampanja sa 2 tg zeca (takođe pogledajte primer „Imunizacija zečeva“). EDTA koji sadrži punu krv dvostruko je razblažen sa 1x PBS (PAA, Pasching, Austrija) pre gradijentnog centrifugiranja pomoću medijuma lympholyte za sisare (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Kanada) prema specifikacijama proizvođača. PBMC su dva puta isprane sa 1x PBS.

EL-4 B5 medijum

RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Nemačka) dopunjen sa 10% FCS-a (Hyclone, Logan, UT, SAD), 2 mM glutaminom, 1% rastvorom penicilina/streptomicina (PAA, Pasching, Austrija), 2 mM natrijum piruvatom, 10 mM HEPES (PAN Biotech, Aidenbach, Nemačka) i 0,05 mM β-merkaptoetanolom (Gibco, Paisley, Škotska)

Iscrpljivanje ćelija

Prva kampanja imunizacije: sterilne pločice sa 6 bunarčića (klasa za ćelijsku kulturu) prekrivene konfluentnim monoslojem CHO ćelija korišćene su za iscrpljivanje makrofaga/monocita kroz nespecifičnu adheziju, kao i limfocite koji se nespecifično vezuju.

Druga kampanja imunizacije: korak iscrpljivanja koristeći bunarčiće prekrivene CHO ćelijama je izostavljen jer nismo mogli isključiti da one B-ćelije koje proizvode antitela koja su unakrsno reaktivna na transferinska receptorska antitela hrčka budu iscrpljena. Stoga su prazne sterilne ploče sa 6 bunarčića (klasa za ćelijsku kulturu) korišćene za iscrpljivanje makrofaga i monocita kroz nespecifičnu adheziju omogućavajući potencijalnim B-limfocitima da proizvode unakrsno reaktivna površinska antitela hrčka (i moguće mišja) kako bi došli do sledećeg koraka u toku rada.

Za svaku kampanju imunizacije: svaki bunarčić je bio napunjen sa maksimalno 4 ml medijuma i do 6x10<6>PBMC imunizovanog zeca i ostavljen da se veže tokom 1 h na 37°C u inkubatoru. Ćelije u supernatantu (limfociti periferne krvi (PBL)) korišćene su u koraku ispiranja antigena.

Obogaćivanje B-ćelija na humanom transferinskom receptoru

Pločice sa 6 bunarčića za kulture tkiva premazane su monoslojem CHO ćelija pozitivnih na humani transferinski receptor i zasejane sa najviše 6x10<6>PBL na 4 ml medijuma i ostavljene da se vežu 1 sat na 37 °C u inkubatoru. Ćelije koje se nisu zalepile su uklonjene pažljivim ispiranjem bunarčića 1-2 puta 1x PBS-om. Preostale lepljive ćelije su odvojene tripsinom tokom 10 min na 37 °C u inkubatoru. Delovanje tripsina je prekinuto pomoću medijuma EL-4 B5. Ćelije su čuvane na ledu sve do imunološkog fluorescentnog bojenja.

Imunološko fluorescentno bojenje i protočna citometrija

Anti-IgG FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Nemačka) korišćen je za sortiranje pojedinačnih ćelija. Za površinsko bojenje, ćelije iz koraka iscrpljivanja i obogaćivanja su inkubirane sa anti-IgG FITC antitelom u PBS-u i inkubirane tokom 45 min u mraku na 4°C. Nakon bojenja, PBMC su isprane dva puta ledeno hladnim PBS-om. Konačno, PBMC su ponovo suspendovane u ledeno hladnom PBS-u i smesta podvrgnute FACS analizama. Pre FACS analiza, dodat je propidijum jodid u koncentraciji od 5 µg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, SAD) da bi se razlikovale mrtve i žive ćelije.

Becton Dickinson FACSAria opremljeni kompjuterom i softverom FACSDiva (BD Biosciences, SAD) korišćeni su za sortiranje pojedinačnih ćelija.

Uzgajanje B ćelija

Uzgajanje zečjih B-ćelija pripremljeno je postupkom sličnim onom koji opisuju Zubler i sar. (1985). Ukratko, pojedinačno sortirane zečje B-ćelije inkubirane su na pločicama sa 96 bunarčića sa 200 µl/bunarčiću medijuma koji sadrži Pansorbin ćelije (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Nemačka), 5% supernatantom timocita zeca (šarža TSN-M13 (10242), MicroCoat, Bernried, Nemačka) i gama-ozračenim EL-4-B5 ćelijama mišjeg timoma (2,5 x 10<4>/bunarčiću) tokom 7 dana na 37 °C u atmosferi 5% CO2. Supernatanti kultivacije B-ćelija su uklonjeni radi skrininga, a preostale ćelije su odmah sakupljene i zamrznute na -80 °C u 100 µl RLT pufera (Qiagen, Hilden, Njemačka).

Primer 3

Identifikacija humanih i cinomolgusovih TfR-vezujućih antitela pomoću ćelijske ELISA

Za skrining supernatanta hibridoma B-ćelija zeca ili miša na antitela koja prepoznaju humani i cinomolgusov TfR, korišćena je ćelijska ELISA pomoću stabilno transficiranih CHO-K1 ćelija. Stabilni transfektanti su dobijeni transfekcijom CHO-K1 ćelija ekspresionim plazmidima koji sadrže ekspresione kasete za humani ili cinomolgusov TfR, kao i za neomicinfosfotransferazu. Nakon transfekcije, ćelije su razređene u medijumu za rast koji sadrži 500 µg/ml G418 (Life Technologies). Nakon pojave rastućih klonova, ćelije su odvojene, obojene pomoću MEM-75 (Abcam) ili 13E4 (Life Technologies) i PE-obeleženim sekundarnim antitelima za humani ili cinomolgusov TfR, a visoko fluorescentne ćelije sortirane kao pojedinačne ćelije u pločicu sa 96 bunarčića (FACS Aria). Nakon 7 dana rasta, klonovi su ponovo provereni na ekspresiju TfR i odabrani su klonovi sa najboljom ekspresijom za ćelijske ELISA eksperimente.

Ukratko, 15.000 ćelija je zasejano po pločici sa 384 bunarčića i inkubirano 18 sati na 37 °C, 5% CO2. Supernatant je uklonjen korišćenjem automatizovanog perača (BIOTEK) i 30 µl supernatanta koji sadrži antitela je dodato u svaki bunarčić, a zatim 24 µl medijuma za rast.

1

Nakon 2 sata inkubacije, bunarčići su ispražnjeni i dodato je 30 µl 0,05% glutaraldehida u PBS-u tokom 45 min na RT. Nakon 3 ispiranja pomoću PBS/0,025% Tween20 (PBST), dodato je 30 µl anti-HRP zeca ili anti-HRP miša (Southern Biotech) razređenog 1:5000 u puferu za blokiranje i ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Bunarčići su isprani 6 puta pomoću PBST i signal je generisan korišćenjem 30 µl TMB po bunarčiću, i apsorpcija je izmerena na 450 nm.

Primer 4

Kloniranje i ekspresija anti-TfR antitela

Tehnike rekombinantne DNK

Sinteza gena i oligonukleotida

PCR amplifikacija V-domena

Ukupna RNK je pripremljena iz lizata B-ćelija (resuspendovana u RLT puferu - Qiagen - kat. br. 79216) pomoću NucleoSpin 8/96 RNK kompleta (Macherey&Nagel; 740709.4, 740698) prema protokolu proizvođača. RNK je eluirana sa 60 µl vode bez ribonukleaze.6 µl RNK je korišćeno za stvaranje kDNK reakcijom reversne transkriptaze koristeći Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen 18080400) i oligo dT-prajmer prema uputstvu proizvođača. Svi koraci su izvedeni na Hamilton ML Star sistemu. 4 µl kDNK je upotrebljeno za amplifikaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imunoglobulina (VH i VL) sa AccuPrime SuperMix sistemom (Invitrogen 12344-040) u konačnoj zapremini od 50 µl koristeći prajmere rbHC.up i rbHC.do za teški lanac, rbLC.up i rbLC.do za laki lanac B ćelija divljeg tipa zeca i BcPCR_FHLC_leader.fw i BcPCR_huCkappa.rev za laki lanac transgenih zečjih B-ćelija (pogledajte tabelu ispod). Svi prajmeri su bili specifični za signalni peptid (odnosno VH i VL), dok su reverzni prajmeri bili specifični za konstantne regione (odnosno VH i VL). PCR uslovi za RbVH RbVL bili su sledeći: Vruće pokretanje na 94 °C 5 min; 35

1 1

ciklusa od 20 s na 94 °C, 20 s na 70 °C, 45 s na 68 °C, i konačno produženje na 68 °C u trajanju od 7 min. PCR uslovi za HuVL bili su sledeći: Vruće pokretanje na 94 °C 5 min; 40 ciklusa od 20 s na 94 °C, 20 s na 52 °C, 45 s na 68 °C, i konačno produženje na 68 °C u trajanju od 7 min.

8 µl od 50 µl PCR rastvora je naneto na 48 E-Gel 2% (Invitrogen G8008-02). Pozitivne PCR reakcije su prečišćene korišćenjem kompleta NucleoSpin Extract II (Macherey&Nagel; 740609250) prema protokolu proizvođača i eluirane u 50 µl elucionog pufera. Svi koraci prečišćavanja su izvedeni na Hamilton ML Starlet sistemu.

Rekombinantna ekspresija monoklonskih dvovalentnih antitela zeca

Za rekombinantnu ekspresiju zečjih monoklonskih dvovalentnih antitela, PCR proizvodi koji kodiraju VH ili VL klonirani su kao kDNK u ekspresione vektore postupkom kloniranja „sa prepustom“ (RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518; Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256). Ekspresioni vektori su sadržavali kasetu za ekspresiju koja se sastojala od 5' CMV promotera uključujući intron A, i 3' BGH poliadenilacione sekvence. Pored ekspresione kasete, plazmidi su sadržavali mesto početka replikacije izvedeno iz pUC18-i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin za amplifikaciju plazmida u E.coli. Korišćene su tri varijante osnovnog plazmida: jedan plazmid koji sadrži konstantni region zečjeg IgG dizajniran da prihvati VH regione dok dva dodatna plazmida koji sadrže zečji ili humani kapa LC konstantni region za prihvatanje VL regiona.

Linearizovani ekspresioni plazmidi koji kodiraju kapa ili gama konstantni region i VL/VH umetaka amplifikovani su pomoću PCR-a korišćenjem preklapajućih prajmera.

Prečišćeni PCR proizvodi su inkubirani sa T4 DNK-polimerazom što daje jednolančani

1 2

prepust. Reakcija je prekinuta dodavanjem dCTP-a.

U sledećem koraku, plazmid i umetak su kombinovani i inkubirani sa recA što indukuje rekombinaciju specifičnu za mesto. Rekombinovani plazmidi su transformisani u E.coli. Sledećeg dana, uzgajane kolonije su uzete i testirane na ispravni rekombinovani plazmid putem preparacije plazmida, restrikcione analize i DNK sekvenciranja.

Za ekspresiju antitela, izolovani HC i LC plazmidi su prolazno kotransficirani u ćelije HEK293, a supernatanti su sakupljeni nakon 1 nedelje.

Generisanje vektora za ekspresiju monoklonskih jednovalentnih antitela kunića Za rekombinantnu ekspresiju odabranih kandidata kao monoklonskih jednovalentnih antitela, zečji konstantni regioni svih VH lanaca su konvertovani u humane konstantne regione koji obuhvataju mutaciju u segmentu CH3. Za VL lance izvedene iz B-ćelija divlje vrste zeca, zečji C kapa konstantni regioni su pretvoreni u ljudske. 4 µl kDNK odabranih kandidata korišćeno je za amplifikaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imunoglobulina sa AccuPrime SuperMix (Invitrogen 12344-040) u konačnoj zapremini od 50 µl sa direktnim prajmerima specifičnim za signalni peptid i reversnim prajmerima specifičnim za CDR3-J region sa (na 3' kraju) sekvencom preklapanja (20 bp) homolognom sa ljudskim konstantnim regionima (odnosno VH i VL). PCR uslovi za amplifikaciju VH i VL lanca bili su sledeći: vruće pokretanje na 94 °C 5 min; 35 ciklusa od 20 s na 94 °C, 20 s na 68 °C, 45 s na 68 °C, i konačno produženje na 68 °C u trajanju od 7 min.

PCR proizvodi koji kodiraju VH ili VL klonirani su kao kDNK u ekspresione vektore postupkom kloniranja „sa prepustom“ (RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256). Ekspresioni vektori su sadržavali kasetu za ekspresiju koja se sastojala od 5' CMV promotera uključujući intron A, i 3' BGH poliadenilacione sekvence. Pored ekspresione kasete, plazmidi su sadržavali mesto početka replikacije izvedeno iz pUC18- i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin za amplifikaciju plazmida u E.coli. Korišćene su dve varijante osnovnog plazmida: jedan plazmid koji sadrži humani IgG konstantni region dizajniran da prihvati novi amplifikovani VH lanac i drugi plazmid koji sadrži humani kapa LC konstantni region za prihvatanje VL lanca.

Prečišćeni PCR proizvodi su inkubirani sa T4 DNK-polimerazom što daje jednolančani prepust. Reakcija je prekinuta dodavanjem dCTP-a.

U sledećem koraku, plazmid i umetak su kombinovani i inkubirani sa recA što indukuje rekombinaciju specifičnu za mesto. Rekombinovani plazmidi su transformisani u E.coli.

1

Sledećeg dana, uzgajane kolonije su uzete i testirane na ispravni rekombinovani plazmid putem preparacije plazmida, restrikcione analize i DNK sekvenciranja.

Primer 5

Prolazna ekspresija jednovalentnih anti-TfR antitela

Antitela su proizvedena in vivo u prolazno transficiranim HEK293 ćelijama (linija dobijena iz ćelija bubrega ljudskog embriona 293) uzgajena u medijumu F17 (Invitrogen Corp.). Za transfekciju je korišćen „293-Fectin“ transfekcioni reagens (Novagen). Antitela i modifikovani molekuli zasnovani na antitelima, kao što je gore opisano, eksprimirani su iz pojedinačnih ekspresionih plazmida. Transfekcije se obavljaju na način naveden u uputstvu proizvođača. Supernatanti ćelijske kulture koji sadrže rekombinantno antitelo su sakupljani tri do sedam dana nakon transfekcije. Supernatanti su čuvani na sniženoj temperaturi (npr. -80 °C) do prečišćavanja.

Opšte informacije u vezi sa rekombinantnom ekspresijom humanih imunoglobulina, npr. u HEK293 ćelijama, date su u: Meissner, P. i sar. Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.

Primer 6

Pročišćavanje jednokrakih antitela na transferinski receptor sa velikom propusnošću

50 ml prečišćenih supernatanta koji sadrže jednokraka antitela u 96 pločica sa dubokim bunarčićima stavljeni su na kolone od 200 µl MabSelectSuRe. Nakon koraka ispiranja pomoću PBS na pH 7,4, proteini su eluirani pomoću 2,5 mM HCl koristeći Tecan/Atoll sistem, što je dalo 0,5 ml eluata. Eluat je neutralisan pomoću 2 M Tris pH 8. Prečišćeni proteini su kvantifikovani pomoću Nanodrop spektrofotometra i analizirani pomoću CE-SDS pod denaturišućim i redukcionim uslovima i analitičkim SEC. Da bi se dobio protein visoke čistoće (>95 %), veliki deo antitela mora dalje da se prečisti hromatografijom na molekulskim sitima da bi se odvojila od polovine antitela, antitela dugme-dugmea i viših agregata. U sledećih 500 µl uzorka ubrizgano je na Superdex20010/300GL u 20 mM histidina koji sadrži 140 mM NaCl pH 6,0 koristeći Dionex UltiMate 3000. Ova metoda omogućava frakcionisanje 25-30 uzoraka dnevno, i stoga omogućava poliranje velikog broja pogodaka za skrining u jednokrakom formatu. Frakcije su spojene i ponovo analizirane kao što je gore opisano.

Primer 7

hCMEC/D3 ćelijska kultura za testove transcitoze

Medijum i dodaci za hCMEC/D3 (Weksler, B. B. et al., FASEB J. 19 (2005), 1872-1874) nabavljeni su iz kompanije Lonza. hCMEC/D3 ćelije (presejavanja 26-29) uzgajane su da se spoje na kolagenom obloženim pokrovnim stakalcima (mikroskopija) ili laboratorijskim

1 4

bocama u medijumu EBM2 koji sadrži 2,5% FBS, četvrtinu isporučenih faktora rasta i u potpunosti je dopunjen sa isporučenim hidrokortizonom, gentamicinom i askorbinskom kiselinom.

Za sve testove transcitoze, (1 x 10<8>pora/cm<2>) PET umeci membranskog filtera sa porama velike gustine (0,4 µm, prečnik 12 mm) korišćeni su u pločama za kulturu ćelija sa 12 bunarčića. Izračunate optimalne zapremine medijuma su 400 µl i 1600 µl za apikalne, odnosno bazolateralne komoreo. Apikalne komore filterskih umetaka su obložene kolagenom I repa pacova (7,5 µg/cm<2>) nakon čega sledi fibronektin (5 µg/ml), i svaka inkubacija traje 1 sat na sobnoj temperaturi na hCMEC/D3 ćelijama koje su uzgajane do konfluentnih monoslojeva (pribl. 2x10<5>ćelija/cm<2>) 10-12 dana u EMB2 medijumu.

Primer 8

Transcitozni test jednovalentnih antitela

Celi test je izveden u medijumu EBM2 bez seruma koji je inače rekonstituisan kao što je opisano u Primeru 1. Filterski umeci sa ćelijama inkubirani su apikalno sa jednovalentnim antitelima (koncentracija: 2,67 µg/ml) tokom 1 sata na 37 °C nakon čega je sakupljen celokupni apikalni i bazolateralni medijum. Iz ovih vrednosti izračunat je paracelularni fluks. Monoslojevi su isprani na sobnoj temperaturi u medijumu bez seruma apikalno (400 µl) i bazolateralno (1600 µl) 3 x 3-5 min. Sva ispiranja su sakupljena kako bi se pratila efikasnost uklanjanja nevezanog antitela. Prethodno zagrejani medijum je dodat u apikalnu komoru, i filteri su prebačeni na svežu pločicu sa 12 bunarčića (blokirani preko noći PBS-om koji sadrži 1% BSA) koja sadrže 1600 µl prethodno zagrejanog medijuma. U ovom trenutku, ćelije na filterima su lizirane u 500 µl RIPA pufera kako bi se odredilo specifično uzimanje antitela. Preostali filteri su inkubirani na 37 °C, a uzorci su sakupljeni u različitim vremenskim tačkama kako bi se odredilo apikalno i/ili bazolateralno oslobađanje antitela. Sadržaj antitela u uzorcima je kvantifikovan korišćenjem visoko osetljivog IgG ELISA testa (pogledajte Primer 3). Za svaki termin, podaci su generisani iz tri filterske kulture ćelija.

Primer 9

Senzitivni IgG ELISA nakon testa transcitoze

Cela procedura je izvedena na RT korišćenjem automatizovane mašine za pranje za korake isprianja. Ploča sa 384 bunarčića je obložena sa 30 µl/bunarčiću 1 µg/ml antihumanog/mišjeg IgG, Fcγ-specifičnog u PBS-u tokom 2 sata nakon čega je usledila 1-satna inkubacija u puferu za blokiranje PBS-a koji sadrži 1% BSA ili 1% CroteinC za humane i mišje IgG testove). Serijski razređeni uzorci iz testa transcitoze i standardne koncentracije antitela korišćenih u testu transcitoze dodati su na ploču i inkubirani 2 sata. Nakon četiri ispiranja,

1

dodato je 30 µl/bunarčiću 50 ng/ml antihumanog/mišjeg F(ab)2-biotina u puferu za blokiranje i inkubirano još 2 sata. Nakon 6 ispiranja, dodato je 30 µl/bunarčiću od 50 ng/ml (huIgG test) ili 100 ng/ml (mIgG test) Poly-HRP40-Streptavidin (Fitzgerald; u PBS-u koji sadrži 1% BSA i 0,05% Tween-20) i inkubirano 30 min. Nakon 4 ispiranja, imuni kompleksi su detektovani dodavanjem 30 µl/bunarčiću BM Chemiluminescence supstrata (Roche). Signal luminescencije je meren pomoću čitača luminiscentnih ploča, a koncentracija je izračunata korišćenjem podešene standardne krive. Osetljivost testa se kretala od 10 pg/ml do 10 ng/ml.

Primer 10

Mapiranje epitopa pomoću ćelijske ELISA CHO ćelija transficiranih hTfR mutantima

Da bi se mogli odrediti epitopski regioni na humanom transferinskom receptoru (hTfR), mutacije su uvedene u hTfR sekvencu na pozicijama, gde je grupa površinski izloženih aminokiselina imala različite aminokiseline u poravnatoj TfR sekvenci miša (pogledajte tabelu ispod), sledeći obrazloženje da, uprkos značajnoj homologiji između ljudskog i mišjeg TfR (77% identičnosti), nisu poznata antitela usmerena na ekstracelularni deo koja pokazuju dobru unakrsnu reaktivnost između oba ortologa. Gore je opisano kloniranje plazmida sa odgovarajućim mutacijama. Da bi se mapiralo vezivanje humanih TfR veziva za te epitope, CHO-K1 ćelije su prolazno transficirane opisanim plazmidima i vezivanje antitela izmereno je ćelijskom ELISA testom. Ukratko, 10<4>ćelija je naneto po bunarčiću na ploči sa 96 bunarčića dan pre eksperimenta u normalnom medijumu za rast (RPMI/10% FCS). Narednog dana, medijum je promenjen u OPTI-MEM Serum-reduced Medium (Gibco), a u bunarčiće je dodato 10 µl smeše od 1200 µl OPTI-MEM, 12 µg plazmidne DNK i 12 µl XtremeGENE transfekcionog reagensa (Roche) dodato je nakon 30 minuta predinkubacije. Ćelije su inkubirane 2 dana na 37 °C/7,5% CO2, zatim je medijum uklonjen i TfR antitela su dodata u koncentraciji od 1 nM do 100 nM u medijumu za rast, nakon čega je usledilo 2 sata inkubacije na 4 °C. Nakon toga, rastvori antitela su zamenjeni sa 0,05% glutaraldehida u PBS-u i ćelije su fiksirane 15 min na sobnoj temperaturi, zatim dva puta isprane PBS-om i inkubirane sa HRP-konjugovanim antihumanim-Fc sekundarnim antitelom (BioRad; 1:2000 u ELISA reagensu za blokiranje (Roche)) 1,5 sata na sobnoj temperaturi. Signal je generisan nakon 3 ispiranja PBS-om koristeći 50 µl TMB po bunarčiću i merenje apsorpcije na 450 nm.

1

Primer 11

Test vezivanja zasnovan na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za interakciju humanih TfR-antitela

Eksperiment vezivanja je izveden na BIAcore B 4000 (GE Healthcare) opremljenom C1 senzorskim čipom (GE Healthcare, kat. br. BR1005-35) prethodno tretiran antihumanim Fab antitelom (GE Healthcare, kat. br. 28-9583-25) korišćenjem standardne hemijske procedure za spajanje amina u skladu sa priručnikom proizvođača.

Za kinetička merenja uzorak antitela je imobilizovan primenom kontaktnog vremena od 60 sekundi i brzine protoka od 10 µl/min u fiziološkom rastvoru fosfatnog pufera pH 7,4, 0,05% Tween 20 na 25 °C. Rekombinantni His6-označeni ljudski transferinski receptor (R&D sistemi, kat. br. 2474-TR-050) primenjen je u rastućim koncentracijama i signal je praćen tokom vremena. Zabeležen je prosečni vremenski raspon od 150 sekundi vremena asocijacije i 600 sekundi vremena disocijacije pri brzini protoka od 30 µl/min. Podaci su usklađeni korišćenjem modela vezivanja 1:1 (Lengmirova izoterma).

Primer 12

Humanizacija VH i VL domena mišjih i zečjih antitela na transferinski receptor Nehumana antitela na transferinski receptor su humanizovana na sledeći način: na osnovu karakterizacije kodirajućih sekvenci i aminokiselinskih sekvenci koje sadrže VH i VL domene nehumanih antitela na transferinski receptor klase IgG1 sa lakim lancem kapa, odgovarajuće humanizovano antitelo na transferinski receptor je dobijeno graftovanjem CDR mutacija napred/nazad na osnovu okvira ljudske germinativne linije VH4_3 i VK1_10

1

kombinacije za klon 299.

Primer 13

Postupak za određivanje afiniteta prema humanom/cinomolgusovom TfR receptoru

U ovom primeru je prikazan postupak za određivanje afiniteta humanog transferinskog receptora za poređenje ponašanja disocijacije.

Za sve analize korišćen je Biotin CAPture komplet kompanije GE Healthcare (upustvo 28-9242-34 AB). Prvo je čip rehidriran spajanjem u BIAcore T200 instrumentu. Nakon toga, čip je ostavljen u stanju pripravnosti sa radnim puferom preko noći. Za pripremu površine, biotin CAPture reagens je razređen 1:100 u radnom puferu (1xPBS, dopunjen sa 0,25 M NaCl). Ovaj rastvor je ubrizgan u protočne ćelije 1 do 4 tokom 360 sekundi sa brzinom protoka od 2 µl/min. Zatim je površina senzora kondicionirana sa tri jednominutna injektovanja rastvora za regeneraciju koji se nalazi u Biotin CAPture kompletu. Ovo se mora učiniti za postupak spajanja ili prvi put ili nakon skladištenja. 100 nM humanog ili cinomolgusovog rastvora monobiotinilovanog transferinskog receptora bi trebalo ubrizgati u protočnu ćeliju 2 tokom 30 sekundi pri brzini protoka od 10 µl/min. Za određivanje afiniteta primenjena su injektovanja sa šest koncentracija (500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,625 i 0 nM). One su ubrizgane u „hu-TfR-protočnu ćeliju“ (npr.protona ćelija 2, kako je gore navedeno) sa vremenom ubrizgavanja od 180 sekundi (asocijacija) i brzinom protoka od 10 µl/min. Nakon faze disocijacije od 600 sekundi, površina je regenerisana prema uputstvima proizvođača rastvorom za regeneraciju koji se nalazi u Biotin CAPture kompletu, i izvršen je sledeći ciklus.

Kinetički podaci su procenjeni korišćenjem softvera za procenu BIAcore T200. Posebno su uzete u obzir konstante brzine disocijacije različitih veziva humanih transferinskih receptora nakon primene Lengmirovog modela vezivanja 1:1.

Primer 14

B4000 relativni rang disocijacije humanog/cinomolgusovog transferinskog receptora

Senzorski čip CAP (isporučen u Biotin CAPture kompletu, serija S br.28-9202-34 GE) montiran je u BIAcore B4000 sistem, normalizovan i adresiran na hidrodinamički način, prema uputstvima proizvođača. U prvom ciklusu, CAP reagens (kao što je obezbeđen u kompletu) adresiran je na tačke 1, 2, 4 i 5 sa brzinom protoka od 10 µl/min tokom 300 sekundi. Hvatanje humanog transferinskog receptora odvijalo se na tački 1 (biotinilovana ljudskim transferinskim receptorom) i tački 5 (cinomolgusov transferinski receptor-biotinilovani) sa brzinom protoka od 10 µl/min i vremenom kontakta od 30 s. Receptori su razređeni do koncentracije od 50 nM

1

radnim puferom (1xPBS br.28995084,GE Healthcare, dopunjen sa 0,25 M NaCl). Antitela su ubrizgana u sve protočne ćelije u seriji koncentracija od 100 nM, 50 nM, 25 nM i 0 nM tokom 180 sekundi pri brzini protoka od 30 µl/min. Vreme disocijacije je postavljeno na 300 sekundi. Regeneracija celog kompleksa iz CAP čipa je izvedena pomoću rastvora za regeneraciju koji se nalazi u Biotin CAPture kompletu (120 sekundi sa brzinom protoka od 10 µl/min). Da bi se kontrolisala koncentracija aktivnog proteina, drugi ciklus je izveden na tački 5 koristeći biotinilovani protein A (br. P2165-2MG, Sigma) sa brzinom protoka od 10 µl/min i vremenom kontakta od 30 s. Tačka 1 je ostala prazna u ovom kontrolnom ciklusu. Antitelima i regeneracijom je rukovano kao u ciklusu 1. Relevantni kinetički podaci izračunati su pomoću softvera za procenu BIAcore B4000. Disocijacija sa humanog transferinskog receptora određena je primenom 1:1 uklapanja disocijacije.

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

11

��

�

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za humani transferinski receptor, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 37.

2. Humanizovano antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima utišanu efektorsku funkciju.

3. Humanizovano antitelo prema bilo kojem od zahteva od 1 do 2, pri čemu humanizovano antitelo je multispecifično antitelo koje ima najmanje jednu specifičnost vezivanja za humani transferinski receptor i najmanje jednu specifičnost vezivanja za terapeutski cilj.

4. Humanizovano antitelo prema zahtevu 3, pri čemu humanizovano antitelo sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje vezuje humani transferinski receptor, i drugo mesto vezivanja antigena koje vezuje moždani antigen.

5. Humanizovano antitelo prema zahtevu 4, pri čemu moždani antigen je odabran iz grupe koju čine Abeta, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 (HER2), alfa-sinuklein, CD20, amiloidni prekursorski protein (APP) i glukocerebrozidaza.

6. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 3 do 5, pri čemu multispecifično antitelo vezuje

i) humani transferinski receptor i Abeta, ili

ii) humani transferinski receptor i CD20, ili

iii) humani transferinski receptor i alfa-sinuklein, ili

iv) humani transferinski receptor i fosfo-tau, ili

v) humani transferinski receptor i glukocerebrozidazu.

7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu je humanizovano antitelo bispecifično antitelo koje sadrži

i

ii) drugo mesto vezivanja izabrano od

g) varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 93 i varijabilnog domena n lakog lanca SEQ ID NO: 94, ili

8. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je humanizovano antitelo

a) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1, ili

b) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4, ili

9. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu humanizovano antitelo sadrži

iii) heterodimerni Fc region, od čega

a) jedan polipeptid Fc regiona sadrži mutaciju T366W, i drugi polipeptid Fc

1

regiona sadrži mutacije T366S, L368A i Y407V, ili

ili

10. Farmaceutska formulacija koja sadrži humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

11. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za primenu kao lek.

12. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 6 do 9 za upotrebu u lečenju neuroloških poremećaja.

13. Humanizovano antitelo za upotrebu prema zahtevu 12, pri čemu neurološki poremećaj je izabran iz grupe koju čine neuropatski poremećaj, neurodegenerativna bolest, rak, bolest oka, epileptični poremećaj, lizozomska bolest, amiloidoza, virusna ili mikrobna bolest, ishemija, poremećaj ponašanja i upala CNS-a.

1