MXPA02009626A - Uso combinado de anticuerpos anti-citocina o antagonistas y anti-cd20 para el tratamiento de linfoma de celulas b. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe terapias combinadas para el tratamiento de tumores malignos hematologicos, incluyendo los linfomas. de celulas B y leucemias o tumores solidos no hematologicos, que comprenden la administracion de anticuerpos anti-citocina o antagonistas para inhibir la actividad de citocinas que juegan un papel al perpetuar la activacion de las celulas B. La administracion de estos anticuerpos y antagonistas, particularmente anticuerpos anti-IL-10 y antagonistas, es particularmente util para evitar o disminuir la resistencia de las celulas de tumores malignos hematologicos o de celulas de tumores solidos a los agentes quimioterapeuticos y anticuerpos anti-CD20 o anti-CD22. La invencion tambien proporciona terapias de combinacion para tumores solidos que tienen una implicacion de celulas B y que comprende la administracion de un anticuerpo anti-citocina y un anticuerpo reductor de celulas B tal como el RITUXAN(.

Description

USO COMBINADO DE ANTICUERPOS ANTI-CITOCINA O ANTAGONISTAS Y ANTI-CD20 PARA EL TRATAMIENTO DE LINFOMA DE CÉLULAS B Campo de la Invención La presente invención concierne a métodos para tratar los tipos de cáncer maligno hematológico incluyendo los linfomas de células B y leucemias con agentes anti-citocina tal como anticuerpos y antagonistas, en donde las citocinas con especificidad de objetivo juegan un papel potencializador en el proceso de enfermedad al estimular las células malignas hematológicas incluyendo las células de leucemia y de linfoma B. Ei tratamiento con agentes anti-citocina en combinación con otras terapias conocidas como la quimioterapia y la administración de anticuerpos terapéuticos ha sido descubierto por proporcionar un efecto sinérgico. La invención también abarca el tratamiento de tumores sólidos no hematológicos (no linfoides) , por ejemplo cáncer coiorrectal o hepático, estos tumores se caracterizan por involucrar las células B, y se tratan mediante la administración de un anticuerpo para citocinas o antagonista REF: 142534 para citocinas, en combinación con un tratamiento de un anticuerpo en una célula B objetivo, por ejemplo CD20.

Antecedentes de la Invención Eí sistema inmune de los vertebrados (por ejemplo, primates, que incluye a los humanos, simios, monos, etc.) consiste de una variedad de órganos y tipos celulares que han evolucionado para: reconocer de forma específica y precisa a los microorganismos ("antígenos") que invaden al hospedero vertebrado; que se aglutinan específicamente a estos microorganismos extraños, y, que eliminan/destruyen estos microorganismos extraños. Los linfocitos, así como los otros tipos de células, son críticos para el sistema inmune y para la eliminación y destrucción de los microorganismos extraños. Los linfocitos se producen en el timo, bazo, y la médula ósea (adulto) y representan aproximadamente el 30% del total de leucocitos presentes en el sistema circulatorio de humanos (adultos). Existen dos subpoblaciones principales de linfocitos: 'células T y células B. Las células T son responsables de la inmunidad mediada por células (inmunidad celular) , mientras que las células B son responsables de la producción de anticuerpos (inmunidad humoral) . ?in embargo, las células T y las células B pueden considerarse como interdependientes; en una típica respuesta inmune, las células T se activan cuando el receptor de la célula T se une a los fragmentos de un antígeno que se aglutinan a las glicoproteínas del complejo principal de histocompatibilidad ("MHC") sobre la superficie de la célula presentadora del antígeno; esta activación causa la liberación de los mediadores biológicos ( "interleucinas ó "citocinas") que, en esencia, estimulan a las células B a diferenciarse y producir los anticuerpos ("inmunoglobulinas") en contra del antígeno. Cada célula B dentro del hospedero expresa para un anticuerpo diferente sobre su superficie; por lo tanto una célula B expresa para un anticuerpo específico para un antígeno, mientras que otra célula B expresa para un anticuerpo específico para un antígeno diferente. En consecuencia, las células B son bastante diversas, y esta diversidad es crítica para el sistema inmune. Los humanos, cada célula B puede producir una cantidad enorme de moléculas de anticuerpo (es decir, aproximadamente 107 a 108) . Esta producción de anticuerpos en la mayor de las veces se detiene (o disminuye sustancialmente) cuando el antígeno extraño ha sido neutralizado. ?in embargo, ocasionalmente, la proliferación de una célula B en particular continuará sin disminuir;- ' esta proliferación puede resultar en un tipo de cáncer referido como "linfoma de célula B" . El linfoma no Hodgkins es un tipo de linfoma que se caracteriza por el crecimiento maligno de los linfocitos B. ?egún American Cáncer Society, se estima que se diagnosticarán un estimado de 54000 nuevos casos, de los cuales el 65% se clasificará como linfoma intermedio o de alto grado. 'Los pacientes diagnosticados con el linfoma de grado intermedio tienen una tasa promedio de sobrevivencia de 2 a 5 años, y los pacientes diagnosticados con el linfoma de alto grado sobreviven un promedio de 6 meses a dos años luego del diagnóstico. Las terapias convencionales han incluido la quimioterapia y radiación, posiblemente acompañadas ya sea por un trasplante autólogo o halogenéico de la médula ósea o de células madre si es que se encuentra disponible un donados adecuado, y si la médula ósea contiene demasiadas células tumorales al momento de retirarse. Aunque los pacientes normalmente responden a las terapias convencionales, normalmente tienen recaídas dentro de un lapso de varios meses . Una metodología relativamente nueva para tratar el linfoma no Hodgkin ha sido tratar a los pacientes con un anticuerpo" monoclonal dirigido hacia una proteína sobre la superficie de las células B cancerígenas. El anticuerpo se puede conjugar a una toxina o radiomarcarse con lo cual afecta la muerte celular luego de su aglutinación. Alternativamente, se puede manipular genéticamente un anticuerpo con las regiones constantes de humanos de manera tal que los mecanismos efectores de anticuerpos en humanos sean generados al momento de la aglutinación del anticuerpo lo cual resulta en una apoptosis o muerte celular. El Rituximab® (IDEC pharmaceuticals Corporation) es uno de una nueva generación de anticuerpos monoclonales desarrollados para el tratamiento de los linfomas B, y en particular del linfoma no Hodgkin. El Rituximab® es una anticuerpo monoclonal anti-CD20 genéticamente manipulado con regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de murino y regiones constantes de cadena ligera Kappa y cadena pesada gamma I de humano. El Rituximab es más efectivo que su contraparte de murino para fijar el complemento y para mediar ei ADCC, y también actúa como mediador del CDC en presencia del complemento de humano. El anticuerpo inhibe el crecimiento celular en las líneas FL-18, Ramos y Raji de células B, sensibiliza las líneas quimioresistentes de células de linfoma humano para la toxina diftérica, ricina, CDDP, doxorubicina y etopócido, e induce la apoptosis en la línea DHL-4 de linfoma de células B de humano en forma dependiente de la dosis. Sin embargo, diversos pacientes son refractarios (resistentes a tratamiento) o tienen recaídas luego de la terapia con Rituximab , asi como con la quimioterapia. Por lo tanto, aún permanece la necesidad de tratamientos para el linfoma que puedan combinarse con la terapia con Rituximab o la quimioterapia a fin de incrementar la oportunidad de remisión y disminuir la tasa de recaídas en los pacientes con linforna. Diversos grupos han sugerido utilizar citocinas para el tratamiento de los diversos tipos de cánceres. Por ejemplo Wang et al. sugiere que las citocinas son "directamente citotóxicas para las células tumorales" y mostraron que la interleucina-la (ILla) potencializa el efecto antitumoral de los fármacos antitumorales en contra de varias células tu oraíes de humano in vitro (Int . J. Cáncer (Nov. 27, 1996) 68 (5) : 583-587 ) . Bonvida et al. describen que la citocina tienen el potencial de "intensificar la eficacia de los agentes quimioterapéuticos" y demuestran que el factor recombinante de necrosis tumoral y el agente quimioterapéutico cisplatino muestran un efecto sinérgico en contra de" -las células de cáncer de ovario ( Gynecol Oncol . (Sept. 1990) 38 (3) : 333-339) . La patente de E.U. No. 5,716,62 muestra que la IL-4 puede utilizarse para potencializar el efecto de los agentes quimioterapéuticos en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, algunos grupos también han reconocido que las citocinas pueden tener un papel nocivo en el desarrollo de algunos tipos de cáncer. Por ejemplo, la interleucina-6 (IL-6) ha sido conocida por su habilidad en algunos casos de inhibir la apoptosis de células leucémicas. (ver Yonish-Rouach et ai. Wild type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells and is inhibited by interleukin-6. Nature 352:345-347(1991)). Recientemente, se demostró que la IL6 puede jugar un papel en la resistencia de algunas células leucémicas hacia los agentes quimioterapéuticos cancerígenos, que in vitro, el anticuerpo anti-IL6 incrementa la sensibilidad de las células K562-4 resistentes a la cisplatino hacia la apoptosis inducida por cisplatino. (Ver Dedoussis et al. Endogenous Interleukin 6 conveys resistance to cis-diaminedichloroplatinum-mediated apoptosis of the K62 human leukemic cell line) . ün efecto potencializador en las células B también se ha postulado para la IL10, de la cual su producción se indica que puede-'regularse en forma incrementada en algunas líneas celulares derivadas en los linfomas de células B (ver Cortes et al. Interleukin-10 in non-Hodgkin' s lymphoma. Leuk Limphoma 26- (3-4 ): 251-259 (July, 1997). Sin embargo, cuando el suero -de pacientes NHL se analizó para la correlación entre los niveles de IL10 y la prognosis, se colocó mayor importancia de IL10 viral, que se produce a partir de un marco de lectura abierto homólogo de BCFR1, ubicado en el genoma del virus Epstein Barr (EBV) . De hecho, otro grupo informó aproximadamente al mismo tiempo, que la IL10 es un factor autócrino de crecimiento para las células de linfoma infectadas por EBV. (Ver Beatty et al. Involvement of IL10 in the antonomous growth of EBV-transformed B cell lines. J. Inmunol . 158 (9) : 045-51 (May 1, 1997)). Alternativamente, otros han elaborado hipótesis de que la producción por los macrófagos IL6 e IL10 juega un papel clave en la ocurrencia de las enfermedades linfocíticas . (Ver Patente de E.U. No. 5,639,600) . También se ha informado que la IL10 puede trabajar en combinación con IL6, IL2 y TNF alfa para incrementar la proliferación de células de linfoma no Hodgkin. (Ver Yoosangen et al. Interleukin- (IL) 10 and IL6 are produced in vivo by non Hodgkin ' s lymphoma cells and as cooperative growth factors. Cáncer Res. 56 (23) : 5499-505 (Dec. 1, 19S6) . También se observaron en pacientes . NHL niveles estadísticamente y significativamente más elevados de IL2, IL6, IL8, IL10, receptor soluble IL2, receptor soluble de transferrina y neopterina en comparación a un grupo testigo, aunque no se halló ningún parámetro único de significado prognóstico. (Ver Stasi et al. Clinical implications of cytokine and soluble receptor measurements in patients with newly diagnosed non-Hodgkin' s lymphoma. Eur J. Haemotol 54 (1) : 9-17 (Jan. 1995) . Sin embargo, han habido bastantes informes en la literatura que sugieren que las citocinas como la IL10 no muestran correlación al progreso de la enfermedad, y que estas citocinas pueden de hecho ayudar a combatir el linfoma en vez de contribuir a la enfermedad. Por ejemplo, cuando Bomefoix et al. analizó el potencial de 10 citocinas (IL2, IL3, IL4, IL6, IL10, IL3, G-CSF, GM-CSF, interferón alfa e interferón gama) para regular la respuesta espontánea proíiferativa de células B de linfoma no Hodgkin de diversos subtipos histológicos, este grupo descubrió que cada citocina puede ser, ya sea inhibitoria o estimulante dependiendo de la muestra, y que no había ninguna relación con los diferentes subtipos citológicos. De hecho, la patente de E.U. 5,770,190, incorporada en la presente por referencia, sugiere la administración de IL10 en combinación con los agentes quimioterapéuticos para la leucemia aguda. 'Sería un gran beneficio para los pacientes con linfoma si los programas o régimen terapéuticos que incorporan los anticuerpos anti-citocina pudieran diseñarse por medio de lo cual estos anticuerpos se pudieran utilizar para incrementar la sensibilidad de los linfocitos B hacia otros tipos de fármacos terapéuticos. Sería particularmente beneficioso si los anticuerpos anti-citocina pudieran administrarse para el propósito de evitar o sobreponerse a la resistencia de los linfocitos B en los pacientes con linfoma hacia los agentes quimioterapéuticos, y para el propósito de potencializar la actividad apoptótica de los anticuerpos terapéuticos. Estos programas de tratamiento combinado se agregarían a las terapias disponibles para los pacientes con linfoma y podrían disminuir potencialmente el índice de recaídas en estos pacientes .

Objetivos de la Invención Es un objetivo de la invención proporcionar un método para evitar, disminuir o sobreponerse a la resistencia de las células de tumores malignos hematológicos o de células de tumores sólidos no hematológicos hacia por lo menos un agente quimioterapéutico, que comprenda administrarle un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina a un paciente diagnosticado con un tumor maligno hematológico antes, simultáneamente o luego de la administración de por lo menos un agente quimioterapéutico. Es un objetivo más específico de la invención proporcionar un método para evitar, disminuir o sobreponerse a la resistencia de las células de tumores malignos hematológicos a la apoptosis inducida por un agente terapéutico, que comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina a un paciente diagnosticado con un tumor maligno hematológico. Es otro objetivo de la invención proporcionar un método para tratar un paciente con un tumor maligno hematológico que ha recaído luego de quimioterapia, que comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina al paciente. Es otro objetivo de la invención proporcionar un método para tratar un paciente que tenga un tumor maligno hematológico que sea refractario a quimioterapia, que comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina al paciente.

Es incluso otro objetivo de la invención proporcionar ur. método para tratar un paciente con un tumor maligno hematológico que ha recaído luego de la terapia con un anticuerpo terapéutico, que comprende administrarle un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina al paciente. Es aún más otro objetivo de la invención proporcionar un método para tratar un paciente con un tumor maligno hematológico que sea refractario a la terapia, con un anticuerpo terapéutico, que comprende administrarle un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina al paciente . Es aún otro objetivo de la invención proporcionar un método para tratar un paciente linfoma de células B, que comprende administrarle al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD20 en forma simultánea con, o consecutivamente con, en cualquier orden, un anticuerpo anti-citocina. Es otro objetivo de la invención proporcionar un método para tratar un tumor sólido no hematológico (no linfoide) en donde las células B producen una respuesta protumoral mediante la administración de un anticuerpo anti-citocina, por ejemplo un anticuerpo anti-ILlO y por lo menos un anticuerpo" reductor de células B, particularmente un anticuerpo reductor anti-CD20.

Breve Descripción de la Invención En un primer aspecto, la presente invención se relaciona a la administración de anticuerpos anti-citocina y antagonistas de citocina, particularmente anticuerpos para IL10, en combinación con fármacos de quimioterapia y/o anticuerpos terapéuticos para incrementar la tasa de respuesta y la duración de respuesta en pacientes con tumores malignos hematológicos como los linfomas de células B y leucemias o tumores sólidos no hematológicos, como el cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer testicular y otros más. De esta forma, la presente invención se relaciona a métodos para tratar los tumores malignos hematológicos como los linfomas de células B y leucemias al administrarle a un paciente que tenga un tumor maligno hematológico como un linfoma de célula B o leucemia, anticuerpos dirigidos contra los receptores de células B y anticuerpos o antagonistas que interfieren con la acción de ciertas citocinas. En particular, la presente invención se relaciona a la administración de anticuerpos hacia los marcadores de células B que inician la apoptosis de los linfocitos B, tal como anti-CD20, anti-CD22, anti-CD40, anti-CD23, anti-CD19, anti-CD37 y otros identificados más adelante, y anticuerpos para o antagonistas de citocinas que pueden interferir con la apoptosis, por ejemplo anti-ILlO. Los programas terapéuticos combinados que incluyen otros tratamientos que también se benefician de la terapia anticitocina, es decir, quimioterapia, están también abarcados. Los métodos encuentran un uso, particularmente para tratar pacientes que tienen tumores malignos hematológicos como los linfomas de células B o leucemias caracterizadas por células que se han vuelto resistentes hacia los agentes quimioterapéuticos y anticuerpos terapéuticos . En un segundo aspecto, la presente invención proporciona métodos novedosos para tratar los tumores sólidos no hematológicos (no linfoides) que tengan una implicación de células B (pero no un origen de células B) particularmente los cánceres en donde las células B desencadenan una respuesta protumoral mediante la administración de un anticuerpo a una citocina, por ejemplo IL10 en combinación con una terapia de anticuerpos específicos para células B, particularmente un anticuerpo reductor de células B, y preferiblemente una terapia con anticuerpos CD20, opcionalmente en combinación con radioterapia o quimioterapia. Los ejemplos de estos tumores sólidos incluyen el cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de próstata, cáncer del estómago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovarios, cáncer testicular, cáncer del esófago y otros mas. Las quimioterapias adecuadas se discuten más adelante. Estos cánceres pueden comprender precánceres, cánceres en etapa I y II, y cánceres avanzados, por ejemplo más allá de la etapa II incluyendo tumores sólidos que se han extendido en una metástasis.

Descripción Detallada de la Invención En un primer aspecto, la presente invención incluye los métodos para evitar, disminuir o sobreponerse a la resistencia de las células de tumores malignos hematológicos, incluyendo, por ejemplo, las células de leucemia y de linfoma de células B hacia por lo menos un agente quimioterapéutico, que comprende administrarle un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina a un paciente diagnosticado con linfoma de células B. Por lo común, esta resistencia de un tumor maligno hematológico de las células B del pacientes esta mediada por ia estimulación de células B causantes de tumores debido a una o más -"citocinas de manera tal que las células no pueden responder a las señales de apoptosis. En estos casos como ios métodos de la presente invención pueden describirse como métodos para evitar, disminuir o sobreponerse a la resistencia de estas células B causantes de tumor hacia la apoptosis, con los agentes quimioterapéuticos siendo ejemplos de agentes que pueden inducir la apoptosis. También están abarcados los anticuerpos dirigidos hacia los objetivos sobre la superficie de las células B, tal como anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD40 y antí-CD28 y otros objetivos de células B identificados más adelante. Debido a que la resistencia de las células B es normalmente solo aparente luego de que el paciente ha recaído después de, o es refractario a, un primer tratamiento con un agente terapéutico, los métodos de la presente invención normalmente abarcan tratar a los pacientes con tumores malignos hematológicos como el linfoma de células B o leucemia que han recaído después de, o que son refractarios a, la quimioterapia o terapia con un anticuerpo terapéutico. Sin embargo, los anticuerpos anti-citocina y antagonistas de la presente invención también puede utilizarse en combinación con otras terapias o antes de otras terapias en pacientes recientemente diagnosticados con linfoma, para disminuir la probabilidad de recaída, e incrementar la duración de la respuesta a la terapia. Los métodos de la presente invención son apropiados para tratar una amplia variedad de tumores malignos hematológicos, especialmente los linfomas de células B, incluyendo pero no limitándose al linfoma no Hodgkin de bajo grado/folicular, (NHL) de linfocitos pequeños, NHL (SDL) de grado intermedio de grado/folicular, (NHL) difuso de grado intermedio, (NHL) inmunoblástico de alto grado, (NHL) linfoblástico de alto grado, (NHL) de alto grado de células B pequeñas no hendidas, (NHL) con enfermedad masiva o voluminosa y macroglobulinemia de Waldenstrom' s, leucemia leucocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia iinfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia linfobiástica, leucemia linfocítica, leucemia monocítica, leucemia mielógena y leucemia promielocítica. Debe estar claro para aquellos diestros en la técnica que estos linfomas normalmente tienen diferentes nombres debido a los sistemas cambiantes de clasificación, y que los pacientes que tienen linfomas y leucemias clasificados bajo diferentes nombres también pueden beneficiarse de los programas terapéuticos combinados de la presente invención.

Por ejemplo, un sistema reciente de clasificación propuesto por patólogos europeos y americanos se llama Revised European American Lymphoma (REAL) Classification. Este sistema de clasificación reconoce al linfoma de células manto -y al linfoma de células marginales entre otras neoplasias periféricas de células B, y separa algunas clasificaciones en grados basándose en citología, es decir, de célula pequeña, mezcla de células grandes y pequeñas, de células grandes. Se entiende que todos estos linfomas clasificados pueden beneficiarse de las terapias combinadas de la presente invención. El U.S. National Cáncer Institute (NCI) a su vez ha dividido algunas de las clases de REAL en designaciones "indolentes" o "agresivas" de linfoma para que sean más útiles clínicamente. Los linfomas indolentes incluyen los linfomas de células foliculares, separados en "grados" citológicos, • iinfoma linfocítico difuso de célula pequeña/leucemia crónica linfocítica (CLL) , macroglobulinemia de Waldenstrom/linfoplasmacitoide, linfoma de zona marginal y linfoma de célula pelúcida. Los linfomas agresivos incluyen el linfoma difuso mixto y de célula grande, linfoma de Burkitt/linforna difuso de célula pequeña no hendida, linfoma linfoblástico, linfoma de célula manto y linfoma relacionado al SIDA. Todo lo que se requiere es que el alcance o duración-de la respuesta a la terapia se extienda como resultado de ia administración del anticuerpo anti-citocina o del antagonista. Pero los métodos se utilizan más preferiblemente para tratar pacientes que tienen el linfoma no Hodgkin NHL, en donde los presentes inventores han descubierto de manera sorprendente que la administración de anticuerpos anti-citocina y antagonistas tiene un efecto sinérgico. Ya que el efecto de las citocinas y la identidad de las citocinas perjudiciales puede variar entre diferentes pacientes y diferentes tipos de linfomas, y el efecto de las diversas citocinas sobre la resistencia de los linfocitos B puede variar con los diferentes agentes quimioterapéuticos e inmunoterapéuticos, se sugiere que los niveles de las citocinas respectivas en los pacientes individuales se analice antes de que los pacientes sean administrados con la terapia anti-citocina. En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para tratar los tumores sólidos no hematológicos en donde las células B desencadenan una respuesta proteica (promueven el crecimiento tumoral y/o metástasis) que comprende la administración de un anticuerpo anti-citocina, por ejemplo un anticuerpo antí-ILlO y un anticuerpo para un objetivo de célula B, preferiblemente un anticuerpo anti-CD20 que tenga una actividad reductora de las células B. Sin embargo la invención incluye el uso de anticuerpos hacia otros objetivos diferentes a las células identificados más adelante. También, este aspecto también incluye el uso adicional de quimioterapia y/o radioterapia. Se han aplicado al tratamiento de los diferentes tipos de cáncer una diversidad de quimioterapéuticos, y los métodos de la presente invención evitarán, disminuirán o se sobrepondrán a la resistencia de las células de tumores malignos, por ejemplo linfoma, hacia por lo menos uno, pero posiblemente varios de estos agentes quimioterapéuticos. En particular, las quimioterapia que se pueden beneficiar mediante la terapia suplemental an-citocina incluyen pero no se limitan a CHOP ICE Mitozantrone, Citarabina, DVP, ATRA, Idarubicina, régimen quimioterapéutico hoelzer, régimen quimioterapéutico La La, ABVD, CEOP, 2-CdA, FLAG y IDA con o sin un tratamiento subsecuente de G-CSF) , VAD, M&P, C-semanaímente, ABCM. MOPP, DHAP, metotrexato, doxorubicina, daunorubicina, tamoxifeno, toremifeno, y cisplatino. Otros agentes quimioterapéuticos se identifican más adelante en la sección relacionada a las modalidades preferidas.

Probablemente hay una diversidad de citocinas que juegan un papel nocivo y simulatorio en los tumores malignos hematológicos o no hematológicos incluyendo las enfermedades leucémicas y de linfoma, ya sea solas o en cooperación con otras citocinas. Por lo tanto, dependiendo del paciente y de la enfermedad, más de un anticuerpo anti-citocina, o antagonista puede beneficiar a un paciente en particular como terapia suplementaria. Aquellas citocinas incluyen pero no se limitan a IL2, IL6, IL10 y TNF-alfa. Otras citocinas apropiadas s'e identifican más adelante en las modalidades preferidas. Para el linfoma no Hodgkin, el tratamiento preferido con anti-citocinas comprende la terapia con anti-IL10. Hay diversos anticuerpos anti-ILlO que se conocen en la técnica y que pueden utilizarse para los propósitos de la presente invención. La Patente de E.U. No. 5,871,725 describe un anticuerpo anti-humano de rata designado 19FI. Otro anticuerpo anti-ILlO, ala-ILlO, se describe en la Patente de E.ü. No. 5,837,293. Los anticuerpos anti-ILlO también se describen en Ti R. Mossman, et al. "Isolation of Monoclonal Antibodies Specific For IL4, IL5, IL6 and a New Th2-SpecificCytokine (IL10) , Citokine Synthesis Inhibitory Factor, By Using A Solid Phase Radioimmunoadsorbent Assay, "The Journal of Xnmmunology , 145 (9) : 2938-2945, Nov. 1, 1990. Los antagonistas pueden tomar la forma de proteínas que compiten para la aglutinación al receptor, por ejemplo, que carecen de la habilidad _ de activar al receptor mientras que bloquean la aglutinación de IL10, o las moléculas aglutinadoras de IL10, como los anticuerpos. El término anticuerpo debe de entenderse en forma que abarque los fragmentos de anticuerpos así como los anticuerpos completos, es decir, los fragmentos Fab, Fab2 y FV. Los anticuerpos también pueden aislarse al inmunizar otro animal con IL10 de humano, pero luego se pueden humanizar utilizando métodos conocidos en la técnica para disminuir su inmunogenicidad una vez que se administran a un paciente humano. La dosificación apropiada para al anticuerpo anti-citocina dependerá de la citocina objetivo, los resultados de los perfiles séricos preliminares en pacientes individuales, el tipo de linfoma siendo tratado y la etapa de la enfermedad. Para los anticuerpos anti-ILlO en el tratamiento de un linfoma no Hodgkin de bajo grado recientemente diagnosticado, la dosificación preferida puede abarcar desde .001 mg a 100 mg/kg preferiblemente desde aproximadamente 0.1 a 100 mg/kg, y más normalmente de aproximadamente 0.4 a 20 mg/kg de peso corporal, dependiendo de si el anticuerpo se administra junto con o antes de otro agente terapéutico. Preferiblemente, ei anticuerpo anti-citocina se administra al mismo tiempo o antes de un agente quimioterapéutico o de otra terapia, normalmente desde aproximadamente una hora antes, hasta aproximadamente 1 mes antes, preferiblemente de un período de uno a 7 días antes de la administración del agente quimioterapéutico o de algún otro agente. También se incluye en la presente invención los juegos de reactivos para lograr y llevar a cabo los métodos descritos. Un juego de reactivo según la presente invención comprende por lo menos un anticuerpo anti-citocina o antagonista que puede mezclarse fácilmente o volverse a suspender con un portador farmacéuticamente aceptable e inyectarse de manera conveniente en un paciente con linfoma. En los casos en donde el suero con un paciente con linfoma se analiza preferiblemente para determinar los perfiles de citocina antes de la administración del anticuerpo anti-citocina o antagonista, el juego de reactivos también puede o alternativamente puede comprender reactivos y materiales para analizar las cantidades relativas de las diversas citocinas en el suero del paciente. También se abarcan en la presente invención los métodos terapéuticos combinados para tratar los tumores malignos hematológicos como el linfoma de células B y leucemias que comprende administrarle a un paciente con un tumor maligno hematológico,' una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo terapéutico en forma simultánea o consecutivamente, ya sea en cualquier orden un anticuerpo anti-citocina. Los anticuerpos terapéuticos se definen como aquellos que se aglutinan a los receptores sobre la superficie de las células malignas hematológicas, por ejemplo, células B tumorigénicas y regulan su destrucción o agotamiento cuando se aglutinan, es decir, anti-CD20, anti-CD19, anti-CD22, anti-CD21, anti-CD23, anti-CD37, y otros objetivos de células B identificados a continuación. Mientras que los agentes anti-citocina de la presente invención tienen cierto efecto beneficioso por sí solos, debido a que bloquean la proliferación mediada por citocinas de células B tumorigénicas, la administración combinada de los anticuerpos terapéuticos con los agentes antí-citocina tendrá un efecto sinérgico debido a que la duración y/o magnitud de la respuesta será mejor que el efecto aditivo de ambos tipos de terapias aplicadas independientemente. Aunque no se desea esta limitado a la siguiente teoría, los actuales inventores creen que los efectos sinérgicos observados mediante la administración simultánea de los agentes anti-citocina de ia presente invención se relacionan a la inhibición de la citocina con especificidad de objetivo que normalmente puede tener el efecto de inhibir la apoptosis. En consecuencia, cuando los agentes anti-citocina de la presente invención se combinan con un agente que actúa al inducir la apoptosis, por ejemplo, anticuerpos anti-CD20, anti-CD22, anti-CD19, anti-CD21, anti-CD23, ó anti-CD40, la administración combinada muestra un efecto sinérgico mucho más allá del efecto aditivo de alguno de los agentes por sí solo. No obstante, esto no impide el uso de los anticuerpos anti-citocina y antagonistas de la presente invención en terapias combinadas con otros anticuerpos o agentes terapéuticos cuya eficacia no se facilita por medio de la apoptosis, por ejemplo, los anticuerpos radiomarcados facilitan la destrucción de células tumorales al aglutinarse a la superficie de las células B y administrar una dosis letal de radiación. Estos anticuerpos, así como los anticuerpos conjugados atoxinas, también pueden utilizarse en combinación con los agentes anti-citocina de la presente invención. Los anticuerpos radiomarcados preferidos son aquellos marcados con itrio[90°] (90Y) . Un anticuerpo radiomarcado particularmente preferido es Zevelin (IDEC Pharmaceutical Corporation) , el cual es un anticuerpo anti-CD20 conjugado a S0Y. Los métodos terapéuticos combinados de la presente invención además pueden comprender la administración de por lo menos un agente quimioterapéutico o programa o régimen terapéutico, en donde esta quimioterapia incluye, a manera de ejemplo, CHOP, ICE, Mitozantrone, Citarabina, DVP, ATRA, Idarubicina, régimen quimioterapéutico hoelzer, régimen quimioterapéutico La La, ABVD, CBOP, 2-CdA, FLAG & IDA con o sin un tratamiento subsecuente con G-CSF, VAD, M & P, C-semanalmente, ABCM, MOPP, DHAP, doxorubicina, cisplatino, daunorubicina, tamoxifeno, toremifeno y metotrexato así como los agentes quimioterapéuticos identificados más adelante. Un programa o régimen quimioterapéutico preferido para el tratamiento de los pacientes con linfoma no Hodgkin es el CHOP. El anticuerpo anti-citocina o antagonista se administra preferiblemente antes del anticuerpo con objetivo hacia la célula B, por ejemplo, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD19 ó anti-CD40 y/o quimioterapia, de forma tal que la proliferación de linfocitos B como resultado de la citocina con especificidad de objetivo se suprima antes de la administración del agente terapéutico para células B. Como se describe anteriormente, la citocina objetivo puede ser IL2, IL6, IL10; "ó TNF-alfa entre otras, dependiendo del perfil de citocinas del paciente antes del tratamiento, pero preferiblemente la citocina con especificidad de objetivo es IL10. Como se menciona anteriormente los anticuerpos terapéuticos de la presente invención pueden ser cualquier anticuerpo con objetivo específico hacia una molécula expresada sobre la superficie de las células B, particularmente una que tenga una actividad reductora de células B. Una lista de los objetivos adecuados de células B se identifica más adelante-. Dependiendo del paciente y de la magnitud de la enfermedad, el anticuerpo anti-célula B que se aglutina al objetivo, por ejemplo Rituximab" puede administrarse a una dosis gue abarca desde .01 hasta aproximadamente 100 mg/kg, más preferiblemente desde aproximadamente .1 a 50 mg/kg, y más preferiblemente desde aproximadamente .4 a 20 mg/kg de peso corporal. Las dosis efectivas pueden ser mas bajas en los programas terapéuticos combinados que incluyen los agentes anti-citocina debido a que se reducirá el potencial proliferativo de los linfocitos B. Nuevamente, las dosis efectivas dependerán de la terapia anti-citocina seleccionada, y de los niveles relativos de las citocinas potencializadoras en el suero del paciente. Las terapias combinadas de la presente invención también son adecuadas para tratar una amplia gama de linfomas, incluyendo pero no limitándose al linfoma no Hodgkins folicular/de bajo grado (NHL), (SL)NHL de linfocitos pequeños, NHL folicular/de grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de alto grado de células B pequeñas no hendidas, NHL con enfermedad masiva o voluminosa y macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia leucocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia monocítica, leucemia mielógena y leucemia promielocítica. Las enfermedades preferidas consideradas como objetivo son el linfoma no Hodgkin (NHL) y particularmente el NHL folicular de bajo grado. Nuevamente, puede ser beneficioso para el suero dei paciente con linfoma que sea analizado para determinar los perfiles de citocinas antes de la administración del anticuerpo anti-citocina o del antagonista .

Coma ya se había mencionado, las terapias de combinación proporcionadas en la presente, particularmente el uso combinado de un anticuerpo anti-citocina, por ejemplo, anti-IL10 y un anticuerpo objetivo anti-célula B, por ejemplo anti-CD20, también son útiles para tratar los cánceres sólidos, no hematológicos (no linfoides) , incluyendo a manera de ejemplo el cáncer colorrectal, cáncer hepático, y otros cánceres del aparato digestivo, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer de la cabeza y cuello, cáncer pulmonar, cáncer de ovario, cáncer de próstata y cáncer testicular. Estos cánceres pueden estar en etapas tempranas, intermedias o avanzadas, por ejemplo metástasis. La presente invención también abarca los juegos de reactivos para administrar el anticuerpo terapéutico y el anticuerpo anti-citocina o antagonista según los métodos descritos. Los juegos de reactivos pueden comprender más de un tipo de anticuerpo terapéutico y más de un agente anti-citocina. Los juegos de reactivos también pueden comprender reactivos y materiales para analizar el perfil de citocinas antes de la administración del anticuerpo terapéutico y del anticuerpo anti-citocina o antagonista. Como se indicó, la invención además abarca el tratamiento de tumores sólidos, no linfoides mediante la administración de un anticuerpo anti-citocina, por ejemplc, un anticuerpo anti-ILlO, y un anticuerpo específico para células B, preferiblemente un anticuerpo que tenga una actividad sustancial reductora de células B tai como el RITUXAN . Se ha informado que algunos tumores sólidos aparentemente tienen una implicación de células B. Esto es, que las células B de alguna forma se involucran para promover o mantener el estado tumorigénico y pueden impedir la actividad del sistema inmune de defensa del propio cuerpo en contra de este tumor. Con respecto a eso, el documento WO 020864 Al, incorporado en la presente por referencia, identifica a Biocrystal Inc. como el Solicitante, describe el tratamiento de un tumor sólido, no linfoide utilizando anticuerpos . que tienen como objetivo las células B, incluyendo RITUXANB. Se informó en el documento que este tratamiento resultó en respuestas antitumorales muy marcadas, incluso en pacientes con cáncer colorrectal en estado avanzado, cáncer pulmonar en estado avanzado y cáncer hepático en estado avanzado. A diferencia de esto, la presente invención proporciona una terapia de combinación mejorada, en donde los tumores sólidos no linfoides se someten a tratamiento mediante el uso de un anticuerpo anti-citocina, tal como anti-ILlO y un anticuerpo reductor de células B, tal como un anticuerpo anti-CD20. Este régimen de combinación debe producir un método intensificado para tratar los tumores sólidos, particularmente aquellos en donde las células B están implicadas, pero que no son por sí mismas las células cancerosas. En este régimen, el antagonista de citocina, por ejemplo, un anticuerpo anti-citocina y el anticuerpo reductor de células B, por ejemplo RITUXAN , se han de administrar por separado o conjuntamente y en cualquier orden. Además, este régimen puede incluir el uso de la radioterapia, por ejemplo, irradiación externa de haz, irradiación total del cuerpo, radioinmunoterapia o quimioterapia. Las quimioterapias adecuadas se identifican más adelante. La radioinmunoterapia puede comprender el tratamiento con un anticuerpo radiomarcado que se aglutina a un objetivo expresado por el tumor sólido. Normalmente, el anticuerpo anti-citocina se administrará antes del anticuerpo reductor de células B. Esta anticipado que esta terapia de combinación es adecuada para el tratamiento de cualquier tumor sólido que tenga implicación de células B. Los ejemplos adecuados de tumores sólidos se han identificado previamente. Un ejemplo notable es el cáncer colorrecta-1. En esta modalidad, el anticuerpo reductor de células B y las citocinas se han de administrar en forma tal que se suministren en el sitio del tumor sólido. Preferiblemente, los anticuerpos serán inyectados próximos o directamente en el sitio tumoral, por ejemplo, mediante inyección intravenosa en una vena próxima al tumor. Este programa de combinación resulta en una disminución o encogimiento del tumor sólido, por ejemplo, un tumor pulmonar o colorrectal.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas A fin de describir aún más las modalidades preferidas y el alcance total de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones.

I . Definiciones Un "antagonista de citocinas" es un compuesto que inhibe o bloquea la expresión y/o actividad de una citocina, por ejemplo una interleucina o interferón u otra citocina. Un " • marcador de superficie de célula B" ó "especificidad de objetivo" ó "antígeno de célula B" en la presente, es un antígeno expresado sobre la superficie de una célula B el cual puede determinarse en forma de objetivo con un antagonista que se aglutina a este. Los marcadores ejemplificantes para la superficie de células B incluyen los marcadores de superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21,CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86: el marcador de superficie de células B de interés particular se expresa preferencialmente sobre las células B en comparación a otros tejidos que no son de células B de un mamífero y pueden expresarse tanto de células B precursoras como en células B maduras. En una modalidad, el marcador es, al igual que CD20 ó CD19, hallado sobre las células B durante la diferenciación del linaje desde la etapa de célula madre (hemocitoblasto) hasta justo antes del momento de la diferenciación terminal a células plasmáticas. Los marcadores preferidos de la superficie de células B en la presente son CD19 y CD20. El antígeno "CD20" es una fosfoproteína no glucosada de -35 kDA, hallada sobre la superficie de más de 90% de las células B de la sangre periférica u órganos linfoides. El CD20 se expresa durante el desarrollado temprano de células pre-B y permanece hasta la diferenciación de la célula plasmática. El CD20 se encuentra presente tanto en células B normales como también en células B de tumores malignos. Otros nombres para el CD20 en la literatura incluyen "antígeno restringido de linfocitos B" y "Bp35". El antígeno CD20 se describe en Clark et al PNAS (EUA) 82:1766 (1985), por ejemplo. El antígeno "CD19" se refiere a un antígeno de -90kDa identificado, por ejemplo, por el anticuerpo HD237-CD19 ó 134 (Kiesel et al . Leukemia Research 11 , 12:1119(1987)). Al igual que el CD20, CD19 se halla en células durante la diferenciación del linaje desde la etapa de célula madre (hemocitoblasto) justo antes del momento de la diferenciación terminal en células plasmáticas. La aglutinación de un antagonista al CD19 causa la internalización del antígeno CD19. Un "tumor maligno hematológico" incluye cualquier tumor maligno asociado con células en el flujo sanguíneo. Los ejemplos de éstos incluyen los linfomas de células B y T, leucemias incluyendo pero no limitándose al linfoma no Hodgking de bajo grado/folicular (NHL), NHL(SL) de linfocitos pequeños, NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de alto grado de células pequeñas no hendidas, NHL con enfermedad masiva o voluminosa y Macroglobuíinemia de Waldenstrom, leucemia leucocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia monocítica, leucemia mielógena, y leucemia promielocítica . Deberá estar claro para aquellos diestros en la técnica que los linfomas normalmente tienen diferentes nombres debido a los sistema cambiantes de clasificación (como se discutió previamente) , y que los pacientes que tienen linfomas y leucemias clasificados bajo los diferentes nombres también pueden beneficiarse de los programas terapéuticos combinados de la presente invención. Un tumor sólido, no hematológico (no linfoide) se refiere a un tumor maligno no hematológico que tiene una implicación de células B, es decir en donde las células B están involucradas en una respuesta "protumoral". Estos tumores sólidos se caracterizan por tumores palpables al tacto, normalmente de por lo menos 0.5 mm de diámetro, más típicamente de por lo menos 1.0 mm de diámetro. Los ejemplos de estos incluyen el cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de cabeza y cuello, cáncer del estómago, cáncer testicular, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer uterino y otros más. Estos cánceres pueden, en las primeras etapas "precáncer", en etapas intermedias (etapas I y II) o avanzadas, incluir tumores sólidos qué se han diseminado o extendido en una metástasis. Estos tumores sólidos preferiblemente serán cánceres en donde las células B desencadenan una respuesta protumoral, es decir, que la presencia de la células B esta involucrada en el desarrollo, mantenimiento o metástasis del tumor. Un "antagonista" de célula B es una molécula en donde, al momento de aglutinarse a un marcador de superficie de la célula B, destruye o agota las células B en un mamífero y/o interfiere con una o más de las funciones de la célula B, por ejemplo al reducir o prevenir la respuesta humoral desencadenada por la célula B. El antagonista es preferiblemente capaz de agotar las células B (es decir, reducir los niveles de células B en circulación ) en un mamífero sometido a tratamiento con éste. Esta reducción puede lograrse mediante diversos mecanismos como la citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (DAC) y/o la .citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , inhibición de proliferación de células B y/o inducción de muerte de células B ( por ejemplo vía apoptosis) . Los antagonistas incluyen dentro del alcance de la presente invención anticuerpos, péptidos de secuencias naturales o sintéticas y antagonistas de moléculas pequeñas que se aglutinan al marcador de célula B, opcionalmente conjugado con o fusionado a un agente citotóxico. El antagonista preferido contiene un anticuerpo, más preferiblemente un anticuerpo reductor del número de células B. Una "citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan para los receptores Fc (FcRs) (por ejemplo células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo aglutinado en una célula objetivo y subsecuentemente causan la lisis de la célula objetivo. La células primarias para mediar el ADCC, células NK, expresan solamente para FcyRIII, mientras que los monocitos expresan para FcyRI, FcyRIII. La expresión para el FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Inmunol 9 : 457-92 (1991) . Para evaluar la actividad de ADCC en una molécula de interés, una valoración in vi tro de ADCC, como la descrita en la Patente de E.U: No. 5,500,362 ó 5,821,337 también puede llevarse a cabo. Las células efectoras útiles para estas valoraciones incluyen las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) y ' las células asesinas naturales (NK) .

Alternativamente, o además, la actividad de ADCC en la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo "experimental de animal como el que se describe en Clynes et al PNAS (EUA) 95:652-656 (1998). Las "células efectoras de humanos" son leucocitos que expresan para uno o más FcR y llevan a cabo funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan para por lo menos un FcyRIII y llevan a cabo función efectora de ADCC. Los efectos de leucocitos humanos que intervienen en ADCC incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxícas y neutrófilos; siendo preferidas las células PBMC y NK. Los términos "receptor Fc" ó "FCR" se utilizan para describir un receptor que se aglutina de la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Más aún un FcR es uno que se aglutina a un anticuerpo IgG (un receptor gama) e incluye receptores de los subtipos FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y alternativamente las formas escindidas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB ( un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias similares de aminoácidos que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de éstos. El receptor activador FcyRIIA contiene un segmento invariable de activación basado en tirosina para el inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcuRIIB contiene un segmento invariable de inhibición basada en tirosina para el inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Ver Daeron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcRs se repasan en Raveth y Kinet, An u. Rev.

Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Hass et al, J. Lab. Clin. Med. 126-330-41 (1995) . Otros FcRs, incluyendo aquellos que se han de identificar en el futuro, están abarcados mediante el término "FCR" en la presente. El termino también incluye al receptor neonato, FcRn, ei cual es responsable para la transferencia de los IgG hacia el feto (Guyer et al, J. I munol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)). La "citotoxicidad dependiente del complemento" ó "CDC" se refiere a la habilidad de una molécula para lisar un objetivo en presencia del complemento. La vía para la activación del complemento se inicia mediante la aglutinación del primer componente del sistema del complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo a un anticuerpo) que se forma en complejos con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, una valoración CDC, por ejemplo la descrita en Gazapo^Santoro et al. J. Immunol . Methods 202:163 (1996), puede llevarse a cabo. Los antagonistas "inhibitorios del crecimiento" son aquéllos que previenen o reducen la proliferación de una célula que exprese para un antígeno al cual se aglutina el antagonista. Por ejemplo, el antagonista puede prevenir o reducir la proliferación de células B in vitro y/o in vivo. Los antagonistas que "inducen la apoptosis" son aquellos que inducen la muerte celular programada, por ejemplo de una célula B, como se determina mediante las valoraciones convencionales de la apoptosis, como la aglutinación de la anexina V, fragmentación del ADN, encogimiento de célula, dilación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas (llamadas cuerpos apoptópicos) el término "anticuerpos" en la presente se utiliza en su sentido más amplio y específicamente cubre los anticuerpos monoclonales _ intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada . Los " fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente comprenden la región variable o la región aglutinadora del antígeno de éste. Los ejemplos de fragmentos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab1, F(ab't)2, y Fv; anticuerpos bivalentes, anticuerpos lineales, moléculas monocatenarias de anticuerpos; y anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los "anticuerpos naturales" normalmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está enlazada a la cadena pesada mediante un enlace covalente disulfúrico, mientras que la cantidad de enlaces disulfúricos varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena ligera y pesada también tiene fuentes disulfuro intracatenarios regularmente separados. Cada una de las cadenas pesadas tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de una cierta cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y ei dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en cuanto a secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la aglutinación y determinación de la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno en particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye por igual a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de las cadenas pesadas como de las cadenas ligeras. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman las regiones, estructurales (FR) . Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas naturales comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración en hojas-P, conectadas por tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de tres láminas. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en forma cercana mediante los FR y, con las regiones hipervariabies de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio aglutinador del antígeno de los anticuerpos (ver Kaba t et' al . , Seguences of Proteins of Immunological Interest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están directamente involucrados en la aglutinación de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . La digestión de la papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de aglutinación al antígeno, llamados fragmentos "Fob", cada uno con un solo sitio aglutinador al antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento Fab ' 2 que tiene dos sitios de unión al antígeno y es aún capaz de entrecruzarse con el antígeno. El "Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un ' sitio completo de unión al antígeno y de reconocimiento al antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en una cercana asociación no covalente. Es en esta configuración de en donde las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir el sitio de unión al antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL.

Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren ia especificidad de aglutinación al antígeno con el anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y aglutinar un antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio completo de aglutinación. Fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHI) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab debido a la adición de unos cuantos residuos en el término carboxilo del dominio CHI de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en donde los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan por lo menos un grupo libre de tiol. Los fragmentos Fab' del anticuerpo se producían originalmente como pares de fragmentos F(ab')Z que tienen cisteínas de bisagra entre ellos . También se conocen otras copulaciones químicas de fragmentos de anticuerpos. Las "cadenas ligeras" (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados Kappa (x) y lambda (k) , basándose- en la secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesada, los anticuerpos pueden asignarse en diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos pueden además dividirse en subclases (isotipos) , por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, 8, s, y, y R, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien. Los fragmentos "Fv monocatenarios" ó "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena de polipéptido. El polipéptido Fv además comprende un ligador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el scGv forme la estructura deseada para la estructuración del antígeno. Para un repaso scFv, ver Pluckthun in Teh Pharmacology of Monoclonal antibodies , vol . 113, Rosenburg y Moore, eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp.269-315 (1994).

El término "anticuerpos bivalentes" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de aglutinación al antígeno, estos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH - VL) . Al utilizar un ligador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre dos dominios en la misma cadena, los dominios se forzan a formar pares con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de aglutinación al antígeno. Los anticuerpos bivalentes se describen con mayor claridad en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al . , Proc. Nad. Acad. Sci . EUA, 90:6444.-6448 (1993). El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente y que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen en contra de un solo sitio antigénico. Más aún, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicas (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una sola determinante antigénica sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan mediante el cultivo de hibidroma, sin estar contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo debido a que se obtienen a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse por requerir la producción de anticuerpo mediante cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para ser utilizados de conformidad con la presente invención pueden hacerse mediante el método del hibridoma descrito primero por Kohier et al . , Na ture, , 256:495 (1975), o se pueden hacer mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente de E.U. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos utilizando técnicas descritas en Claxon et al . , Na ture, 352-624-628 (1991 y Marks et al . , J. Mol . Biol . . , 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en donde - una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica o es homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especia particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico con, o es homólogo a, las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (patente de E.U. 4,816,657; Morrison et al . , Proc . Nazi , Acad. Sci . EUA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de dominio variable de aglutinación al antígeno de un primate no humano (por ejemplo, simios del viejo mundo como el babuino, mono rhesus ó mono cynomolgus) y la secuencias de la región constante en humanos (Patente de E.U: No. 5,693,780). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en donde los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplaza por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo ó primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de las regiones estructurales (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Más aún, los anticuerpos humanos pueden comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar aún más el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos 1, y normalmente 2, dominios variables, en donde la totalidad o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a los de la inmunogiobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de los FR son aquellos de la secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcíonalmente también comprende por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , Para mayores detalles, ver Jones et al . , Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Na ture 332-323-329 (1988); y Presta, Curr, Op, Struct . Biol . . 2:593-596 (1992).

El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo los cuales son responsables para la aglutinación al antígeno. La reacción hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante complementaria " ó "CDR" (por ejemplo residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5S Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada: Chothia y Lesk J. Mol. Biol . . 196:901-917 (1987)). Los residuos "estructurales" ó "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes a los residuos de la región hipervariable como se define en la presente. Un antagonista que "se aglutina" a un antígeno de' interés, por ejemplo un marcador de superficie de célula B, es uno capaz de aglutinar ese antígeno con una afinidad y/o avidez suficientes de forma tal que el antagonista sea útil a manera de un agente terapéutico para apuntar con especificidad de objetivo hacia una célula que expresa el antígeno. Los ejemplos de anticuerpos que aglutinan al antígeno CD20 incluyen: "C2B8" que ahora se llama "rituximab" ("RITUXAN®) (Patente de E.U. No. 5,736,137, expresamente incorporada en la presente por referencia) ; el anticuerpo de murino 2138 marcado con itrio- [90] -designado "Y2B8" (Patente de E.U: No. 5,736,137, expresamente incorporada en la presente por referencia) ; IgG2a "131" de murino opcionalmente marcado con 1311 para generar el anticuerpo "131I-BI" (BEXARTM) (Patente de E.U. No. 5,595,721, expresamente incorporada a la presente por referencia) ; anticuerpo monoclonal de murino "1F5" (Press et al . Blood 69 (2) : 584-591 (1987)); anticuerpo "2H7" quimérico (Patente de E.U. No. 5,677,180, expresamente incorporada a la presente por referencia); y anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1133, B-Cl -o UN-B2 disponibles de International Leukocito Typing Worshop (Valentine et al . , In; Leukocyts Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987). Los ejemplos de anticuerpos que se aglutinan al antígeno CD19 incluyen los anticuerpos anti-CD19 en Hek an et al . , Cáncer Immunol . Immunother. 32:364-372 (1991) y Vlasveld et al .

Cáncer immúnol . immunother. 40:37-47(1995); y el anticuerpo B4 en Kiesel et al . Leukemia Research 11 , 12:1119 (1987). Los términos "rituximab" ó "RITUXAN®* en la presente, se refieren al anticuerpo monoclonal quimérico de murino/humano genéticamente manipulado y dirigido en contra del antígeno CD20 y designado "C2B8" en la Patente de E.U. No. 5,736,137, expresamente incorporada en la presente por referencia. El anticuerpo es una inmunoglobulina IgG, Kappa que contiene las secuencias de región variable de cadena ligera y pesada en murino y las secuencias de la región constante de humano. El Rituximab tiene una afinidad de aglutinación para el antígeno CD20 de aproximadamente d.OnM. Un antagonista "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interfieren con los usos diagnósticos o terapéuticos para el antagonista, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las modalidades preferidas, el antagonista se ha de purificar (J) a más del 95% por peso de antagonista como se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente a más del 99% por peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia N-terminal-" o internas de aminoácidos mediante el uso de un secuenciador centrífugo, o (3) hasta lograr la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El antagonista aislado incluye al antagonista in situ dentro de células recombinantes ya que por lo menos un componente del ambiente natural del antagonista no estará presente. Sin embargo, de manera ordinaria, el antagonista aislado se ha de preparar mediante por lo menos un paso de purificación. El término "mamífero" para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo a humanos, animales domésticos y de granja y zoológico, para deportes o animales de compañía o mascota, como perros, caballos, gatos, vacas, etc., Preferiblemente, el mamífero es un humano. El término "tratamiento" se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas. Aquellos en necesidad de un tratamiento incluyen a los que ya tienen la enfermedad o trastorno así como aquellos en donde la enfermedad o trastorno se ha de prevenir. Por consiguiente, el mamífero puede haberse diagnosticado por tener la enfermedad o el trastorno o puede estar predispuesto o susceptible a la enfermedad.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de antagonista que es efectiva para prevenir, disminuir o tratar la enfermedad autoinmune en cuestión. El • término "agente inmunosupresor" como se utiliza en la presente para la terapia adjunta se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del mamífero siendo tratado ahí. Esto incluiría sustancias que suprimen la producción de citocinas, que lentifican o suprimen la expresión de autoantígenos, o enmascaran los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad MHC. Los ejemplos de estos agentes incluyen las pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (ver Patente de E.U. No. 4,665,077, de la cual se incorpora en la presente su descripción por referencia) ; azatioprina; ciclofosfamida, bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (que enmascara ios antígenos MHC, como se describe en la Patente de E.ü. No. 4,120,649); anticuerpos anti-iditípico MHC y fragmentos MHC; ciclosporina A; esteroides como glucocorticosteroides, por ejemplo, prednisona, metilprednisona y dexametasona, citocinas o antagonistas de receptor de citocinas incluyendo anticuerpos anti-interferón-y, -3, anticuerpos anti-factor-a de necrosis tumoral, antícuerpo-s" anti-factor-y factor de necrosis tumoral, anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos anti-receptor IL-2; anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo anticuerpos anti-CD_lla y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfocítica; anticuerpos pan-T, preferiblemente anticuerpos antiCD3 ó anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene el dominio aglutinante LFA-3 (WO 90/08187 publicado el 7/26/90); estreptocinasa; TGF-0; estreptodornasa; ARN o ADN del hospedero; FK506; RS-61443; deoxispergualina; rapamicina; receptor de células T (Cohén et al . , Patente de E.U. No. 5,114,721); fragmentos del receptor de células T (Offner et al . , Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; laneway, Na tura, 341:482 (1989): y ¥10 91/01133); y anticuerpos para el receptor de células T (EP 340,109) tal como TL0B9. El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de las células. El término pretende incluir los isótopos radioactivos (por ejemplo, I13 , Ysc, Ar2i:', P32, Re18e, Re186, Sm153, B212 y otros más), agentes quimíoterapéuticos, y toxinas como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, fungal, vegetal o animal o fragmentos de éstas . Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimiot-erapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXANTM) ; sulfonatos de alquilo como busulan, improsulfan y piposulfan; aziridina como benzodopa, carbocona, meturedopa, y uredopa; etiliniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosfaoramida y triemtilolomelamina, mostazas nitrogenadas como clorambucil, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, meclortamina, clorhidrato de óxido de meclortamina, melfalan, novembiehin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustima, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, caliquemicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cro oinicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, _ idambicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicins, peplomicina, potfiromiciha, puromicina, quelamicina, roduribicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos como el metotrexato y el 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos del ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fluradabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, zacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedores del ácido fólico co o ácido frolínico; aceglatona; glucósido aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonida ina, mitoguazona; mitoxantrona, mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilinico; 2-etiihidrazida; procarbazina; PSKS; razoxano; sizofrano; espirogermanio; ácido tenuazonico; tríazicona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindecina; dacarbazina; manomustina; mitobronito; mitolactol; pipobroman; gacitocina; arabinósido" ("Ara-C"); ciclo'fosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Prenceton, NJ) y doxetaxel (TAXOTEW, Rone-Poulenc Rorer, Anthony, Francia) ; clorambucil; gemcitabina; ß-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos del platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandonato; CPT-11; inhibidor de topoisonerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinóico; esperamicina; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. .También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores como los antiestrógenos incluyendo como por ejemplo el tamoxifeno, raloxifeno, 4 (5) -imidazoles, inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifen, trioxifen, keoxifeno, LY117018, onapristona, y torimifeno (Fareston) ; y antiandrógenos como fluta ida, milutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelin; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables en cualquiera de los anteriores. El término "citocinas" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediaaores o intermediarios intercelulares. Los ejemplos de estas citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales1. Entre las citocinas se incluyen la hormona de 5 crecimiento como la hormona humana de crecimiento, hormona humana de crecimiento n-metionil, y hormona bovina de crecimiento; hormona paratiroídea; tiroxina; insulina; • proinsulina, relaxina, prorelaxína; hormonas glucoprotéicas como la hormona folículoestimulante (FSH) , hormona estimuladora de la tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor -a y -0 de necrosis tumoral; sustancia inhibidora de muleriano; péptido de ratón asociado a gonadotropina; inhibina; activina; factor de crecimiento . del endotelio vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso como NGF-P; factor de crecimiento plaquetario; factores transformantes del crecimiento (TGF) tal como TGF-a • y TGF-0; factor -I y -II de crecimiento similar a la insulina; erítropoyetina (EPO) factores osteoinductores; interferones como el interferón -a, -P, e —y; factores estimulantes del crecimiento de colonias (CSF) tal como el - CSF de macrófagos (M-CSF) ; -CSF de macrófagos granulocíticos (GM-CSF);- y -CSF de granuiocitos (GCSF) ; interleucinas (IL) tal como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; un factor de necrosis tumoral como el TNF-a ó TNF-P; y otros factores polipeptídicos incluyendo LIF y el ligando kit (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y sus equivalentes . biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural. El término "profármaco" cuando se utiliza en esta solicitud, se refiere a un precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación al fármaco primario y es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse en la forma originaría más activa. Ver, por ejemplo, Wihnan, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 114 , pp, 375-382, 615a. Rev; Belfast (1986) y Stella et al.' "Prodrugs; A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al . , (ed) , pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contiene sulfatos, profármacos que contiene péptidos, -" profármacos modificados por D-aminoácidos, profármacos glucosilados, profármacos que contienen 3-lactana, profármacos que contienen fenoxiaceta ida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorositosina y otro profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco más activo libre de citotoxicidad. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivar en forma de profármacos para utilizarse en esta invención incluye, pero no se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente. Una "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agentes surfactantes la cual es útil para administrar un fármaco (como los antagonistas descritos en la presente y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes de ia liposoma se configuran normalmente en formación de una bikappa, similar a la configuración lipídica de ias membranas biológicas. El término "inserto en el empaque"" se utiliza para referirse a las instrucciones normalmente incluidas en los empaques comerciales de los productos terapéuticos, que contiene información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias concernientes al uso de estos productos terapéuticos.

II . Producción de Antagonistas Los métodos y artículos de fabricación de la presente invención, utilizan o incorporan, un antagonista que se aglutina a un marcador de superficie de la célula B y/o a una citocina. En consecuencia, los métodos para generar estos antagonistas se describen a continuación en la presente. El marcador de superficie de la célula B o citocina al ser utilizada para la producción de o la detección de, agonistas puede ser, por ejemplo, una forma soluble del antígeno o una porción de éste, que contenga el epítopo deseado. Alternativamente o adicionalmente las células que expresan para el marcador de superficie de la célula B en su superficie celular se puede utilizar para generar o para detectar,- los antagonistas. Otras formas de los marcadores de superficie de las células B útiles para generar antagonistas serán aparentes para aquellos diestros en la técnica. Preferiblemente, el marcador de superficie de la célula B es el antígeno CD19 ó CD20. Preferiblemente, la citocina es IL-10.

Mientras gue el antagonista preferido es un anticuerpo, los antagonistas diferentes a los anticuerpos se contemplan en la presente, por ejemplo, el antagonista puede comprender un antagonista de molécula pequeña fusionado opcionalmente a, o conjugado con, un agente citotóxico (como aquellos descritos en la presente) , las bibliotecas de moléculas pequeñas pueden detectarse en contra del marcador de superficie dé la célula B de interés en la presente a fin de identificar una molécula pequeña que se aglutine a ese antígeno. La molécula pequeña ademas puede detectarse para determinar sus propiedades antagonistas y/o conjugarse con un agente citotóxico. El antagonista también puede ser un péptido generado mediante un diseño racional mediante un despliegue de fagos (ver, por ejemplo WO98/35036 publicado el 13 de agosto de 1998). En una modalidad, la molécula de elección puede ser un imitador de "CDR" o análogo de anticuerpo diseñado basándose en los CDR de un anticuerpo. Mientras que estos péptidos pueden ser antagonistas por sí -mismos el péptido puede fusionarse opcionalmente a. un agente citotóxico para de esta forma agregar o intensificar las propiedades antagonistas del péptido.

A continuación sigue una descripción referente a las técnica ejemplificantes para la producción de antagonistas de anticuerpos utilizados de conformidad con la presente invención.

Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales preferiblemente se desarrollan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (so) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adjuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que sea inmunogénica en la especie a ser inmunizada, por ejemplo, la hemocianina de lapa (Megathura . crenulate) californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o derivatizador, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación mediante residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (mediante residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, en donde S0C12, ó RIN=C=NR, en donde R y Rl son diferentes grupos de alquilo.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación de, por ejemplo, 100' pg ó 5 wg de la proteína o conjugado (para conejos o-" ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adjuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se reforzaron con una dosis de 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o del conjugado en un adjuvante completo de Freund mediante una inyección subcutánea en sitios múltiples. Siete a 14 días después, a los animales se les extrae sangre y el suero se evalúa para determinar la titulación de anticuerpos. Los animales se estimulan con dosis de refuerzo hasta que la titulación alcanza un punto muerto. Preferiblemente, el animal se estimula mediante refuerzo del conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un diferente reactivo de entrecruzamiento. Los conjugados también pueden hacerse en un cultivo de células recombinantes a manera de fusiones proteicas. También, los agentes de .agregación como el alumbre (sulfato de aluminio) se utilizan de manera adecuada para intensificar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, Le, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos -excepto posiblemente por mutaciones que ocurren naturalmente y que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden hacer utilizando primero el método de hibridoma descrito por Kohier et al . , Na ture, 256:495 (1975), o se pueden hacer mediante métodos del ADN recombinante (Patente de E.ü: No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón o algún otro animal hospedero apropiado, como un hámster, se inmuniza como se indica anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se aglutinarán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Luego, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente adecuado de fusión, tal como el poletilenglicol para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. Las células de hibridoma se preparan así se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células iniciales de mieloma no fusionadas. Por ejemplo, sí las células de mieloma iniciadoras carecen de la enzima hipoxantinguanima fosforibosil transferasa (HGPRT ó PRET) , el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluye hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , y estas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células preferidas de mieloma son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan de manera estable un elevado nivel de producción de anticuerpos mediante las células seleccionadas productoras de anticuerpos, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre estas, las líneas preferidas de células de mieloma son las líneas de mieloma murino, como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-lldisponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA, y las células SP-2 ó X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Las líneas de células de ratón de heteromieloma humano y mieloma humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales de humano [Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applica tions,pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.,- Nueva York, 1987) ] . El medio de cultivo en donde las células de hibridoma se cultivan se evalúa para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos en contra del antígeno. Preferiblemente, la especificidad de aglutinación de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante una inmunoprecipitación o mediante una valoración de aglutinación in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RÍA) ó el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) . La afinidad de aglutinación del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis de Sctchard de Munson et al . Anal . Biochem . , 107;220 (1980). Luego de que las células hibridomas se identifican por producir los anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitada y cultivarse mediante métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, el medio D-MEM ó RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, del fluido de ascitis o del suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas como por ejemplo, A-Sepharosa de proteínas, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleótidos que son capaces de aglutinarse de manera específica a los genes que codifican para las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos de murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de éste ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en los vectores de expresión, que luego se transfectan en las células hospederas como las células E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , ó células de mieloma que no producen de otra forma la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. Los. artículos de repaso sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica para el anticuerpo incluyen Skerra et al . , Curr. Opinión in Ummunol . 5:256-262 (1993) y Phickthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992). En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse a partir de las fagotecas de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de humano y murino, respectivamente utilizando fagotecas. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos de humano elevada afinidad (alcance nM) mediante un reordenamiento de cadenas (Marks et al . , BiolTechnology, 10:779-783 (1992)). así como una infección combinatoria y una recombinación in vivo como una estrategia para reestructurar fagotecas muy amplias (Waterhouse et al . , Nuc . Acids . Res . , 21:2265-2266 (1993) ) . Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables de las técnicas tradicionales del hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificadora para los dominios constantes de humano para las cadenas ligeras y pesadas en lugar de las secuencias homologas de murino (Patente de E.U. No. 4,816,567; Morrison , et al . , Proc. Nati Acad. Sci . EUA, 81;685 (1984)), o mediante la unión covalente a la secuencia codificadora de la inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia co.dificadora para un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Normalmente, estos polipéptidos no inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación al antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación al antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación al antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. (iii) Anticuerpos humanizados Los métodos para humanizar los anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en éste a partir de una fuente que no es de humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos comúnmente se refieren como residuos "importados", que normalmente se toman de un dominio variable "importado". La humanización puede llevarse a cabo de manera esencial siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al . , Na ture, 321:522-525 (1986); Riechmann et al , Na ture, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al , Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U. No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos típicamente humanos en donde algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por los residuos de los sitios análogos de los anticuerpos de roedor. La elección de los dominios variables de humano, tanto ligeros como pesado, para ser utilizados en la elaboración de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método llamado "adaptación óptima", la secuencia • del dominio variable de un anticuerpo de roedor se detecta en contra de la biblioteca completa d'e las secuencias conocidas del dominio variable de humano. La secuencia de humano que está más cercana a la del roedor se acepta entonces como la región estructural humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al , J. Immunol , 151:2296 (1993); Chothia et al , J. Mol . Biol . 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región estructural particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al , Proc. Nad. Acad. Sci .

EUA, 89:4285 (1992) Presta, et al . , J. Immunol, 151:2623 (1993) ) . Además es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de una elevada afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para elaborar este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias paternas o iniciadoras y diversos productos conceptuales humanizados utilizando los modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas e iniciadoras (paternas) . Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas comúnmente se encuentran disponibles y se utilizan por aquellos diestros en la técnica. Los programas de computadora también se encuentran disponibles e ilustran la probable visualización tridimensional de las estructuras conformacionales de las secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del probable papel de los residuos, en el funcionamiento de la secuencia de la inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la habilidad de la inmunoglobulina candidata para aglutinar su antígeno. De esta forma, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse del receptor e importar secuencias para que de esta forma la característica deseada del anticuerpo, como su afinidad incrementada para el antígeno objetivo, se pueda lograr. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente involucrados en influir en la aglutinación al antígeno. (iv) Anticuemos Humanizados Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos de humano. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos ( por ejemplo, ratones) que son capaces, al momento de su inmunización de producir, de producir un repertorio completo de anticuerpos de hum'ano en ausencia de una producción de inmunoglobulina endógena. Se ha descrito que la supresión homocigótica del gen (JH) de la región de unión a la cadena pesada en ratones quiméricos y mutantes a partir de líneas de gérmenes resulta en una completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la secuencia de genes humanos de inmunoglobulina de línea de gérmenes en estos ratones mutantes con línea de gérmenes resulta en la producción de anticuerpos humanos al momento de un desafío con el antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al . , Proc . Mad. Acad. Sci . EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al . , Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermarm et al . , Year in Ummuno . , 7:33 (1993); y Patentes de E.U. Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807.

Alternativamente, la tecnología de despliegue de fagos (McCafferty • et al . , Nature 348:552-553 (1990)) puede utilizarse para producir anticuerpos de humano y fragmentos de anticuerpos in vi tro , a partir de los repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados. Según esta técnica, los genes del dominio V se clonan en un marco ya sea en un gen para una proteína de recubrimiento menor o principal de un bacteriófago filamentoso, tal co o M13 -o fd, y se despliegan como fragmentos funcionales de anticuerpos sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una sola copia del ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. El despliegue de fagos puede llevarse a cabo en una diversidad de formatos; para un repaso ver Jonson, Kevin S. y Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3:564-571(1993).

Varias fuentes de segmentos de genes V se pueden utilizar para el despliegue de fagos. Claxon et al . , Na ture, 352:624-628(1991) aislaron una serie diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca de combinación aleatoria de genes B derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de los donantes de humano inmunizado puede estructurarse y los anticuerpos para una serie diversa de antígenos (incluyendo los autoantígenos) se pueden aislar esencialmente al seguir las técnicas descritas por Marks et al . , J. Mol . Biol . . 222:581-597 (1991) ó Griffith et al . , EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también, los Nos de Patente de E.U. 5,565,.332 y 5,573,905. Los anticuerpos de humano también pueden generarse mediante células B activadas in vi tro (ver Patente de E.U. 5,567,610 y 5,229,275) . (v) Fragmentos de Anticuerpos Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan por medio de una digestión proteolítica de los anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al . , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan et al . , Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, ahora se pueden producir estos fragmentos en forma directa mediante células hospederas recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse a partir de las fagotecas de anticuerpos discutidas con anterioridad. Alternativamente, los fragmentos Fab' -Sli pueden recuperarse directamente a partir de E. coli y copularse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 [Cárter et al . , Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]. Según otro método, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente a partir de un cultivo de células hospederas recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán aparentes para el practicante diestro en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv) . Ver el documento WO 93/16185; Patente de EE. UU. No. 5,571,894; y Patente de EE. UU. No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como el descrito en la Patente de EE. UU. No. 5,641,870, por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . 5 (vi) Anticuerpos Eiespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen • especificidades de aglutinación para por lo menos dos diferentes epítopos. Los anticuerpos biespecíficos ejemplificantes pueden aglutinarse a dos diferentes epítopos del marcador de superficie de la célula B. Otros anticuerpos de estos pueden aglutinarse a un primer marcador de célula B y después aglutinarse a un segundo marcador de superficie de la célula B. Alternativamente, un brazo de unión (brazo de anclaje) de un anti-marcador de célula B puede combinarse con un brazo que se una a una molécula .activadora en un leucocito tal como una molécula del receptor de la célula T (por ejemplo, CD2 ó CD3) , o los receptores Fc para IgG (FcyR) , tal • como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para de esta forma enfocar los mecanismos de defensa celular en las células B. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para ubicar los agentes citotóxicos en la célula B. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión en el marcador de la célula B y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, alcaloide vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno de isótopo radioactivo) . Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de cadena completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')Z). Se conocen en la técnica los métodos para hacer los anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de cadena completa está basada en la expresión simultánea de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde ambas cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al . , Nature, 305: 537-539 (1983) ) . Debido a la variedad aleatoria de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente' se lleva a cabo mediante pasos de cromatografía de afinidad, es más bien difícil, y la producción del producto es baja. Se describen los procedimientos similares en WO 93/08859, y en Traumecker et al . , EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).

Según una metodología diferente, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de aglutinación deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la visagra, regiones CH2, y CH3. Se prefiere tener una primera región constante de cadena pesada (CHI) que contenga el sitio necesario para la aglutinacion.de la cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se transfectan simultáneamente en un organismo hospedero adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en las modalidades en donde las proporciones diferentes de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan las producciones óptimas. Sin' embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales resulta en altas producciones o cuando las proporciones no tienen una importancia particular. En una modalidad preferida de éste método, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de aglutinación en un brazo, y un par de cadena ligera cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de aglutinación) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones indeseadas de cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina solamente en la mitad de la molécula biespecífica proporciona \ una forma fácil de separación. Este método se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles de cómo generar anticuerpos biespecíficos, ver por ejemplo, Suresh et al . , Methods in Enzymology, 121: 210 (1986) . Según otro método descrito en la Patente de EE. UU. No. ,731,168, la interconexión entre un par de moléculas de anticuerpo puede manipularse genéticamente para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interconexión preferida comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En éste método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interconexión de la primera molécula de anticuerpo se reemplaza con cadenas laterales mayores (por ejemplo tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de un tamaño idéntico o similar a las cadenas secundarias grandes se crean en la interconexión de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales grandes de aminoácidos con las pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esta proporción del mecanismo para incrementar la producción del heterodímero sobre otros productos finales indeseados como los homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede copularse a la avidina, y el otro a la biotína. . Por ejemplo, estos anticuerpos han sido propuestos para apuntar con especificidad de objetivo las células del sistema inmune hacia las células indeseadas (Patente de EE. UU. No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden hacer utilizando métodos convenientes de entrecruzamiento. Los agentes adecuados de entrecruzamiento se conocen bien en la técnica, y se describen en la Patente de EE. UU. No. 4,676,980, junto con una variedad de técnicas de entrecruzamiento. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando un enlace químico. Brennan et al . , Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamernte para generar ' fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de un agente de formación de complejos de ditiol, arsenita sódica, para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados entonces se convierten a los derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se vuelve a reconvertir en Fab' -tiol mediante una reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que pueden copularse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al . , J. Exp .- Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de un anticuerpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' se secreta por separado de E. coli y se somete a una copulación química directa in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera es capaz de aglutinarse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos en contra de los objetivos de tumores de mama en humano . También se han descrito diversas técnicas para hacer y aislar de manera directa los fragmentos de anticuerpos biespecíficos a partir de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido al utilizar péptidos de cremallera de leucina. Kostelny et al . , J. Immunol . , 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazan a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante una fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se reducen en la región de la visagra para formar monómeros y luego se vuelven a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo.

Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "anticuerpos divalentes" descrita por Hollinger et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 90: 6444-6448 (1993) ha probado ser un mecanismo alternativo para hacer los fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un ligador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre ambos dominios de la misma cadena. En consecuencia, los dominios VL del VH desnudo de un fragmento se forzan a formar pares con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, y de esta forma se hacen dos sitios de aglutinación del antígeno. Otra estrategia para hacer los fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros Fv(sFv) monocatenarios también se han mencionado. Ver Gruber et al . , Immunol . , 152: 5368 (1994). Los anticuerpos con más de dos valencias también están contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al . , Immunol . 147: 60 (1991).

III . Conjugados y otras Modi icaciones del Antagonista Los antagonistas utilizados en los métodos o incluidos en los artículos de fabricación en la presente están opcionalmente conjugados a un agente citotóxico. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos conjugados de agentes antagonistas-citotóxicos se han descrito con anterioridad. Los conjugados de un antagonista y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tal como una caliqueamicina, una maitansina (Patente de EE. UU. No. 5,208,020), un tricoteno y CC1065 también están contemplados en la presente. En una modalidad de la invención, el antagonista se conjuga a una o más moléculas de maitansina (por ejemplo aproximadamente de 1 hasta aproximadamente 10 moléculas -de maitansina por molécula de antagonista) . La maitansina puede, por ejemplo, convertirse en May-SS-Me la cual puede reducirse a May-SH3 y hacerse reaccionar con un antagonista modificado (Chari et al . Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) para generar un conjugado de maitansinoide-antagonista. Alternativamente, el antagonista se conjuga a una ' o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir rupturas en el ADN bicatenario en concentraciones sub-picomolares. Los análogos estructurales de la caliqueamicina que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, ?ill, a21, a31, N-acetil-il' , PSAG y 011 (Hin an et al . Cáncer Research, 53: 3336-3342 (1993) y Lode et al . Cáncer Research 58: 2925-2928 (1998)). En las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de éstas que pueden utilizarse, incluyen la cadena A de difteria, los fragmentos activos no aglutinantes de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modexina, alfa-sarcina, proteínas de 41euritesfordii, proteínas de diantina, proteínas (PAPI, PAPII y PAP-S) de Phylotaca americana, inhibidor de Momordica charantia, curcina, y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93-21232 publicado el 28 de octubre de 1993. La presente invención además contempla al antagonista conjugado con un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una' ribonucleasa o una endonucleasa ADN tal como deoxirribonucleasa; ADNasa) . ?e encuentran disponibles una variedad de isótopos radioactivos -para la producción de antagonistas radioconj ugados . Los ejemplos incluyen Ate'', 113', 1125, Y9o Re 186, Re 188, ?m 153, BÍ212 P32 e isótopos radioactivos de Lu. Los conjugados del antagonista y el agente citotóxico pueden hacerse utilizando una diversidad de agentes bifuncionales de copulación proteica como N-succinimidil-3- (2-piridiltiol) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (como el adipimidato de dimetilo HCL) , esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivado de bis-diazonio (tal como bis- (diazoniumbenzoil) -etilenediamina) , diisocianatos (tal como el tolien-2, 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1, 5-difluor-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al . Science 238: 1098 (1987). El ácido triaminpentaacético de l-isotiocianatobencil-3-metildietileno (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplificante para la conjugación de un radionucleótido en un antagonista. Ver WO94/11026. El ligador puede ser un "ligador escindible" lo que facilita la liberación del fá aco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un ligador acidolábil, ligador sensible a la peptidasa, ligador de dimetilo o ligador que contiene disulfuro (Chari et al . Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) también pueden utilizarse. Alternativamente, una proteína de fusión que comprende al antagonista y al agente citotóxico también se puede hacer, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. Incluso en otra modalidad, el antagonista puede conjugarse a un "receptor" (como estreptavidina) para su utilización en el apunte previo con especificidad de objetivo en donde el conjugado antagonista-receptor se administra al paciente, seguido del retiro del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente depurador y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que está conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido) . Los antagonistas de la presente invención también pueden conjugarse con una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver Wo81/01145) en un fármaco anticancerígeno activo. Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y la Patente de EE. UU. No. 4,975,278. El componente enzimático de estos conjugados incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco en forma tal que lo convierta a su forma más activa, la forma citotóxica. Las enzimas que son útiles en el método dé esta invención incluyen, pero no se limitan a, la fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir los profármacos que contienen sulfato ' en fármacos libres; citocina deaminasa útil para convertir la 5-fluorocitocina no tóxica en . el fármaco anticancerígeno, 5-fluoroacilo; proteasas, como la serratia proteasa, termolicina, subtilicina, carboxipeptidasas y catepsinas (como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptidos en las formas libres de fármaco; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir los profármacos que contienen sustitutos de D-aminoácido; enzimas escisoras de carbohidratos como la li-galactosidasa y neuraminidasa útil para convertir los profármacos glucosilados en los fármacos libres; (3-lactamasa útil para convertir los fármacos derivatizados con (3-lactamas en fármacos libres; y amidasas de penicilina, como la amidasa de penicilina V o amidasa de penicilina G, útil para convertir los fármacos derivatizados en sus nitrógenos aminados con grupos de fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", pueden utilizarse para convertir los profármacos de la invención en los fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados de antagonista-abzima se pueden preparar como se describe en la presente para la administración de la abzima a una población de células tumorales . Las enzimas de esta invención pueden enlazarse covalentemente al antagonista mediante métodos bastante conocidos en la técnica como el uso de reactivos heterobifuncionales de entrecruzamiento que se discuten anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos a la región aglutinadora del antígeno de un antagonista de la invención enlazadas por lo menos a la porción funcionalmente activa de una enzima de la invención pueden estructurarse utilizando métodos de ADN recombinante que se conocen bien en la técnica [ver, por ejemplo, Neuberger et al . , Na ture, 312: 604-608 (1984)]. Otras modificaciones del antagonista se contemplan en la presente. Por ejemplo, el antagonista puede estar ligado a uno o una diversidad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros del polietilenglicol y polipropilenglicol. Los antagonistas descritos en la presente pueden también formularse como liposomas. Las liposomás que contienen el antagonista se preparan mediante métodos bien conocidos en la técnica, como se describe en Epstein et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 82: 3688 (1985); Hwang et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 11 : 4030 (1980); Patentes de EE. UU. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Las liposomas con un período de tiempo de circulación intensificado se describen en la Patente de EE. UU. No. 5,013,556. Las liposomas particularmente útiles se pueden generar mediante un método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidil colina, colesterol y fosfatidil etanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Las liposomas se extruyen a través de filtros de un tamaño de poro definido para producir liposomas con un diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse en los -liposomas como se describe en Martin et al . , J. Biol . Chem . 257: 286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido dentro de la liposoma. Ver Gabizon et al . J. National Cáncer Inst . 81(19) 1484 (1989) . Las modificaciones a la secuencia de aminoácidos de los antagonistas de la proteína o péptido descritos en la presente están contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de aglutinación y/o de más propiedades biológicas del antagonista.

Las variantes en la secuencia de aminoácidos del antagonista se preparan al introducir los cambios apropiados en los nucleótidos en el ácido nucleico del antagonista, o mediante una síntesis de péptidos. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones a y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del antagonista. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se hace para llegar a la estructura final, con la condición de que la estructura final tenga las características deseadas. Los cambios en los aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traductoriales del antagonista, tal como cambiar el número o posición de los sitios de glucosilación. Un método útil para identificar ciertos residuos o regiones del antagonista que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se llama "mutagénesis de rastreo de alanina" como se describe en Cunningham y Wells Science, 244: 1081-1085 (1989) . En la presente, un residuo o grupo de residuos objetivos se identifican (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, is, lys, y gin) y se reemplazan -con un aminoácido neutro o negativamente cargado (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan introduciendo más variantes o diferentes variantes en, o para, los sitios de sustitución. De esta forma, aunque el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio determinado, una detección de ala o una mutagénesis aleatoria se lleva a cabo en el codón o región objetivo y las variantes del antagonista expresado se detectan para determinar su actividad deseada. Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de amino- y/o carboxilo- terminal que abarcan en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen 100 o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de un solo o varios residuos de aminoácidos. Los ejemplos de las inserciones terminales incluyen un antagonista con un residuo de metionilo N-terminal o el antagonista fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula antagonista incluyen la fusión del N- ó C-terminus del antagonista de un enzima, o un polipéptido que incrementa la vida media en el suero del antagonista.

Otro tipo de variante es una variante en la sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácidos en la molécula antagonista que son reemplazados por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución de antagonistas de anticuerpos incluyen las regiones' hipervariables, pero las alteraciones FR también están contempladas. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones resultan en un cambio en cuanto a la actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplificantes" en la -Tabla 1, o como se describe aún más a continuación en referencia a los tipos de aminoácidos, se pueden producir y los productos ser sometidos a una detección.

Tabla 1 Las modificaciones sustanciales ' a las propiedades biológicas del antagonista se logran al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en cuanto a su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, a manera de una conformación helicoidal o en lámina, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren naturalmente se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrofóbico: norleucina; met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr; (3) acídico: 'asp, glu; (4) básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro, ; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras conllevan el intercambio de un miembro de una de estas clases por el de otra clase. Cualquier residuo de cisteína no involucrado en el mantenimiento de la conformación apropiada del antagonista también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir un entrecruzamiento aberrante. A diferencia de esto, los enlaces de cisteína pueden agregarse al antagonista para mejorar su estabilidad (particularmente en donde el antagonista es un 5 fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variantes de f sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo inicial. Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para un mayor desarrollo tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo inicial del cual se generan. Una forma conveniente para generar estas variantes de sustitución es la maduración • por afinidad utilizando el despliegue de fagos. En breve, diversos sitios de la región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpos que se generan de esta forma se despliegan en forma monovalente desde partículas filamentosas de fagos en • forma de fusiones al producto del gen III de M13 empacado dentro de 'cada partícula. Las variantes desplegadas por 'fagos se detectan para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de aglutinación) como se describe en la presente. A fin de identificar los sitios candidatos para la región hipervariable para modificación, se puede llevar a cabo una mutagénesis de rastreo de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen de manera significativa a la aglutinación del antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Estos residuos de contacto y los residuos circundantes son candidatos para sustitución según las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se han generado estas variantes, el panel de variantes se somete a una detección como se describe en la presente y los anticuerpos con propiedades superiores en una o más valoraciones relevantes pueden seleccionarse para un mayor desarrollo. Otro tipo de variante de aminoácido del antagonista altera el patrón original de glucosilación del antagonista. Mediante la alteración, se da a entender suprimir una o más porciones de carbohidratos halladas en' el antagonista, y/o agregar uno o más sitios de glucosilación que no se encuentran presentes en el antagonista. La glucosilación de los polipéptidos normalmente es N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de' reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidrato en la cadena lateral de asparagina. De esta forma, la presencia ya sea de las secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio potencial de glucosilación. La glucosilación O-enlazada se refiere a la unión de alguno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa o xilosa o a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de los sitios de glucosilación al antagonista se logra de forma conveniente al alterar la secuencia de aminoácidos en forma tal que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos anteriormente descritas (para los sitios de glucosilación N-enlazados) . La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del antagonista original (para los sitios de glucosilación 0-ligados) . Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para las variantes de la secuencia de aminoácidos del antagonista se trataron mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan al aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de las variantes de secuencias de aminoácidos que ocurren naturalmente) o mediante la preparación por una mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida en sitio) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cassette de una variante anteriormente preparada o una versión no variante del antagonista. Puede s'er deseable modificar el antagonista de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo para intensificar de esta forma la citotoxicidad mediada por células dependiente del antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad depediente del complemento (CDC) del antagonista. Esto puede lograrse al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc de un antagonista de anticuerpo. Además .o adicional o alternativamente, los residuos de cisteína pueden introducirse en la región Fc, y de esta forma permitir la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico que se genera de' esta forma puede tener una capacidad mejorada de internalización y/o una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo y eliminación celular incrementada y mediada por el complemento (ADCC). Ver Carón et al . , J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con una actividad anti-tumoral intensificada también pueden prepararse utilizando agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales como se describe en Wolff et al . ancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede manipularse genéticamente para que tenga regiones Fc duales y de esta forma pueda tener una lisis intensificada por el complemento y capacidades ADCC. Ver Stevenson et al . Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). Para incrementar la vida media sérica del antagonista, se puede incorporar un epítopo de salvamento para la unión al receptor dentro del antagonista (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de EE. UU. No. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítopo de salvamento para unión al receptor" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ó IgG4) que sea responsable para incrementar la vida media sérica in vivo de la molécula 'IgG) .

IV. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los antagonistas utilizados de conformidad con la presente invención se preparan mediante almacenamiento al mezclar un antagonista o antagonistas que tengan el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico y metionina; preservantes (como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol alcohol butílico o bencílico; parabenos de alquilo como el parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol; y - cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, como la albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes como el EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trialosa o sorbitol; contraiones de formación de sales como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteínas); y/o agentes surfactantes no iónicos como el TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones ejemplificantes de anticuerpos anti-CD20 se describen en el documento W098/56418, expresamente incorporado en la presente por referencia. Esta publicación describe una formulación líquida de dosis múltiples que comprende 40 mg/mL rituximab, 25 mM acetato, 150 mM trehalosa, 0.9% alcohol bencílico, 0.02% polisorbato 20 a pH 5.0 que tiene una vida mínima en anaquel de dos años a 2-8 °C. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende 10 mg/mL rituximab en 9.0 mg/mL de cloruro sódico, 7.35 mg/mL de citrato sódico dihidratado, 0.7 mg/mL de polisorbato 80 y agua estéril para inyección, pH 6.5. Las formulaciones liofilizadas adaptadas para la administración subcutánea se describen en WO97/04801. Estas formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse con un diluyente adecuado en una alta concentración proteica y la formulación reconstituida se puede administrar subcutáneamente en un mamífero a ser tratado. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo zi.; el cuál es necesario para la indicación particular que está siendo tratada, preferiblemente para aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Por ejemplo, es deseable proporcionar además un agente citotóxico, agente quimioterapéutico, citocina o agente inmunosupresor (por ejemplo uno que actúe sobre las células T, tal como la ciclosporina o un anticuerpo que se aglutina a las células T, por ejemplo uno que aglutine LFA-1) . La cantidad efectiva de los oreos agentes depende de la cantidad del agonista presente en la formulación, el tipo de enfermedad o trastorno o el tratamiento deotros factores que se mencionan anteriormente. Estos generalmente se utilizan en las mismas dosis y las mismas rutas de administración que se mencionan anteriormente o desde 1 a 99% de las dosis empleadas de aquí en adelante. Los ingredientes activos también pueden introducirse en microcápsulas que se preparan, mediante técnicas de coacervo o mediante una polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y cápsulas de poli (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas coloidales para la administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. 1980) . También se pueden elaborar las preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación prolongada incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, cuyas matrices se encuentran en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de las matrices de liberación prolongada incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (alcohol vinílico)), poliláctidos (Patente de EE. UU. No. 3,773,949), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato etilenvinílico no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradable como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímeros de ácido glicólico, ácido láctico y acetato de leuprólido) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico .

Las formulaciones para ser utilizadas en la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante la filtración a través de las membranas estériles de filtración.

V. Tratamiento con el Antagonista Una composición que comprende un antagonista que se aglutina a un antígeno de superficie de la célula B y una composición que contiene un antagonista de citocina, por ejemplo un anticuerpo, en donde ambos están en la misma composición se puede formular, dosificar y administrar de manera consistente con la buena práctica medicinal. Preferiblemente, la anti-citocina comprende un anticuerpo anti-ILlO y el antagonista de célula B comprende un anticuerpo para disminuir las células B, preferiblemente un anticuerpo anti-CD20 tal como Rituxan®. Los factores para tomar en cuenta en este contexto incluyen la enfermedad o el trastorno particular siendo tratado, el mamífero en particular a ser tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o el trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y los factores conocidos por los practicantes de medicina. La cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista a ser administrada está gobernada por estas consideraciones. Como una proposición general, la cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista administrado parenteralmente, por dosis, se da en la gama de aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg del peso corporal del paciente por día, con la gama inicial típica del antagonista utilizado estando en la gama de aproximadamente 2 a 10 mg/kg. El antagonista preferido es un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo como RITUXAN®, que no está conjugado a un agente citotóxico. Las dosis adecuadas para un anticuerpo no conjugado son, por ejemplo, en la gama desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 1000 mg/kg. En una modalidad, la dosificación del anticuerpo difiere a la actualmente recomendada para RITUXAN®. Por ejemplo, se puede administrar a un paciente una o más dosis de sustancialmente menos de 375 mg/m2 del anticuerpo, por ejemplo cuando la dosis se encuentra en la gama de aproximadamente 20 mg/m2 hasta aproximadamente 250 mg/m2, por ejemplo desde aproximadamente 50 mg/m2 hasta aproximadamente 200 mg/m2. Más aún, se 'puede administrar una o más dosis iniciales del anticuerpo seguido de una o más dosis subsecuentes, en donde la dosis mg/m2 del anticuerpo en las dosis subsecuentes excede la dosis de mg/m2 del anticuerpo en las dosis iniciales. Por ejemplo, la dosis inicial puede estar en la gama de aproximadamente 20 mg/m2 hasta aproximadamente 250 mg/m2 (por ejemplo, desde aproximadamente 50 mg/m2 hasta aproximadamente 200 mg/m2) y la dosis subsecuente puede estar en la gama desde aproximadamente 250 mg/m2 hasta aproximadamente 1000 mg/m2. Como se indica anteriormente, sin embargo, estas cantidades sugeridas de antagonista están sometidas a bastante discresión terapéutica. El factor clave para seleccionar la dosis apropiada y el programa apropiado de dosificación es el resultado obtenido, como se indica anteriormente . Por ejemplo, las dosis relativamente mayores pueden necesitarse 'al inicio del tratamiento para enfermedades agudas. Para obtener los resultados más eficaces, dependiendo de la enfermedad o trastorno, el antagonista se administra justo al comienzo del primer signo, diagnóstico, ocurrencia o surgimiento de la enfermedad o trastorno tanto como sea posible o durante las remisiones de la enfermedad o el trastorno. El antagonista se administra mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para un tratamiento local inmunosupresor, la administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el antagonista puede administrarse de manera adecuada mediante una infusión eñ pulso, por ejemplo con dosis cada vez menores del antagonista. Preferiblemente, la dosificación se administra mediante inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se pueden administrar otros compuestos, como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores y/o citocinas con los antagonistas en ellos. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o de una sola formulación farmacéutica, y una administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente hay un período de tiempo mientras que ambos agentes activos (o todos) ejercen de manera simultánea sus actividades biológicas. Además de la administración de antagonistas proteicos en el paciente, la presente solicitud contempla la administración de antagonistas mediante terapia génica. Esta administración del ácido nucleico que codifica para el antagonista está abarcado en la expresión "administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista". Ver por ejemplo, WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996 concerniente al uso de la terapia génica para generar anticuerpos intracelulares. Hay dos metodologías principales para colocar el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del' paciente; in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, usualmente en el sitio donde se requiere el antagonista. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente se retiran, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran en el paciente ya sea directamente o, por ejemplo, de forma encapsulada dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (ver, por ejemplo Patentes de EE. Uü. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Hay una diversidad de técnicas disponibles para introducir los ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varian dependiendo de 'si el ácido nucleico se transfiere de células cultivadas in vitro ó in vivo en las células del hospedero pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en las células de mamífero in vi tro incluye el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación del fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente utilizado para la administración ex vivo del gen es un retrovirus. Las técnicas altamente preferidas para la transferencia in vivo de ácidos nucleicos incluyen la transfección con vectores virales (como adenovirus, virus de Herpex simplex I, o virus adeno-asociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol) . En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácidos nucleicos con un agente que apunta hacia las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en una célula objetivo, etc. Cuando se emplean los liposomas, las proteínas que se aglutinan a una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis se puede utilizar para apuntar con especificidad de objetivo y/o facilitar la captación, por ejemplo, proteínas de cápside o fragmentos de éstas que sean tróficas para un tipo particular de célula, los anticuerpos para proteínas que experimentan internalización durante la ciclización, y proteínas que apuntan con especificidad de objetivo hacia una ubicación intracelular e intensifican la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por un receptor se describe, por ejemplo, en Wu et al . , J. Biol . Chem . 262: 4429-4432 (1987); y Wagner et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 87: 3410-3414 (1990). Para un repaso de los protocolos actualmente conocidos de la terapia génica y del marcado de genes ver, Anderson et al . , Science 256: 808-813 (1992). Ver también WO 93/25673 y las referencias citadas ahí.

VI . Artículos de Fabricación En otra modalidad de la invención, un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de las enfermedades o trastornos descritos anteriormente también se proporcionan. El artículo de fabricación comprende un contenedor y un marbete o inserto de empaque en o asociado con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores pueden formarse a partir d'e una diversidad de materiales como vidrio o plástico. El contenedor mantiene o contiene una composición que es efectiva para el tratamiento de una enfermedad o trastorno de elección y puede tener un puerto estéril de acceso (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa para solución intravenosa o un frasco que tenga tapón puncionable con una aguja de inyección hipodérmica) . Por lo menos un agente activo en la composición es el antagonista que se aglutina a un marcador de superficie de célula B. Preferiblemente el CD20, y un anticuerpo anti-citocina, por ejemplo un anticuerpo anti-ILlO. El marbete o el inserto del paquete indica que la composición se utiliza para tratar a un paciente que tenga o esté predispuesto a tener una enfermedad autoinmune, como los que se enumeran en la presente. El artículo de 'fabricación puede además comprender un segundo contenedor que comprenda un amortiguador diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución dextrosa. Además puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de uso, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Otros detalles de la invención se ilustran eh los siguientes Ejemplos no limitantes. La descripción de todas las citas en la especificación se incorpora expresamente por referencia.

Ejemplos Ejemplo 1 Tratamiento del Linforna no Hodgkin Un paciente con linfoma no Hodgkin es intravenosamente administrado con un anticuerpo anti-ILlO a una dosis de 50 mg/m2 IV semanalmente durante 4 semanas. De ahí en adelante, al paciente se le administra RITUXAN® de manera intravenosa según los siguientes programas de dosificación: (A) 50 mg/m2 IV día 1 150 mg/m2 en días 8, 15 y 22 (B) 150 mg/m2 IV día 1 375 mg/m2 en días 8, 15 y 22 (C) 375 mg/m2 en días 1, 8, 15 y 22 A este -mismo paciente se le administra quimioterapia CHOP según el programa descrito en la Patente de EE. UU. No. 5,736,137. Luego del tratamiento, el paciente se monitorea para evaluar el efecto sobre el estatus del linfoma, por ejemplo el número y el tamaño de los tumores.

Ejemplo 2 Tratamiento del Tumor Sólido en Etapa Avanzada Un paciente que tiene un cáncer colorrectal avanzado caracterizado por una implicación de células B se trata de manera concurrente con un anticuerpo anti-ILlO y RITUXAN® a las mismas dosificaciones que en el Ejemplo 1. Luego del tratamiento el paciente es evaluado para determinar si el tratamiento ha resultado en una respuesta anti-tumoral, por ejemplo, basándose en el encogimiento del tumor, una menor expresión del antígeno tumoral u otros medios para evaluar la prognosis de la enfermedad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Claims (85)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un método para evitar, disminuir o sobreponerse a la resistencia de células de tumores malignos hematológicas o de células de tumores sólidos no hematológicos a por lo menos un agente quimioterapéutico, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o un fragmento de éste o un antagonista de citocina a un paciente diagnosticado con un tumor maligno hematológico o un tumor sólido no hematológico antes de, junto cono después de, la administración de por lo menos un agente quimioterapéutico. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células - hematológicas comprenden linfoma de células B o células de leucemia.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el linfoma de células B se selecciona a partir del grupo que consiste de linfoma no Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL) , (SL) NHL de linfocitos pequeños, NHL folicular/ grado intermedio, NHL difuso, de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL . linfoblástico de alto grado, NHL de alto grado de células B pequeñas no hendidas, NHL con enfermedad masiva o voluminosa, y Macroglobulinemia de Waldenstrom.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el linfoma de células B es el NHL linfoma no Hodgkin folicular/bajo grado.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la célula leucémica se selecciona a partir del .grupo que consiste de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia monocítica, leucemia mielógena, y leucemia promielocítica.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos un agente quimioterapéutico se selecciona a partir del grupo que consiste de CHOP, ICE, Mitozantrona, Cytarabina, DVP, ATRA, Idarubicina, programa quimioterapéutico hoelzer, programa quimioterapéutico La La, ABVD, CEOP, '2-CdA, FLAG y IDA, con o sin un tratamiento subsecuente de G-CSF, VAD, M y P, C-Semanal, ABCM, ' MOPP, DHAP, daunorubicina, doxorubicina, tamoxifen, toremifeno, metotrexato, y cisplatino.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la citocina se selecciona a partir del grupo que consiste de IL2, IL6, IL10 y TNF-alfa.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la citocina es- IL10.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo anti-ILlO es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo anti-ILlO se administra a una dosis de 0.01 a 1000 mg/kg por peso corporal.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la dosis de anticuerpo abarca desde aproximadamente 0.1 a 50 mg/kg de peso corporal.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo anti-citocina se administra junto con y/o antes del agente quimioterapéutico.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo anti-citocina se administra junto con o desde aproximadamente una hora' a 30 días antes de la administración del agente quimioterapéutico.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el suero del paciente con linfoma se analiza para determinar los perfiles de citocinas antes de la administración del anticuerpo anti-citocina o del fragmento de éste o del antagonista.
15. 15. Un juego de reactivos para administrar el anticuerpo o el antagonista según el método de conformidad con la reivindicación 1.
16. 16. Un juego de reactivos para analizar el perfil de citocina según el método de conformidad con la reivindicación 1.
17. 17. Un juego de reactivos para, analizar el perfil de citocinas y administrar el anticuerpo o el antagonista según el método de conformidad con la reivindicación 16.
18. 18. Un método para evitar, disminuir o sobreponerse la resistencia de las células de tumores malignos hematológicos a un agente terapéutico, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina a un paciente diagnosticado con un tumor maligno hematológico.
19. 19. Un método para evitar, disminuir o sobreponerse a la resistencia de las células de tumores, malignos hematológicos a la apoptosis inducida por el agente terapéutico, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o un antagonista de citocina a un paciente diagnosticado con un tumor maligno hematológico.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el tumor maligno es un linfoma de células B o leucemia.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la tumor maligno es un linfoma de células B o leucemia.
22. 22. Un método para tratar un paciente con un tumor maligno hematológico que ha recaído luego de la quimioterapia, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o un fragmento de éste o antagonista de citocina al paciente.
23. 23. Un método para tratar un paciente que tiene un tumor maligno hematológico y que es refractario a la quimioterapia, caracterizado porque comprende administrarle un anticuerpo anti-citocina o un fragmento de éste o antagonista de citocina al paciente.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el tumor maligno es un linfoma de células B o leucemia.
25. 25. Un método para tratar un paciente con un tumor maligno hematológico que ha recaído luego de la terapia con un anticuerpo terapéutico o fragmento terapéutico, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o fragmento o antagonista de citocina al paciente.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el anticuerpo terapéutico es un anticuerpo anti-CD20, anti-CD19, anti-CD22, anti-CD37, anti-CD40, anti-CD28.
27. 27. El método para tratar un paciente con un tumor maligno hematológico que 'es refractario a la terapia con un anticuerpo terapéutico, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo anti-citocina o fragmento o antagonista de citocina al paciente.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el tumor maligno hematológico es un linfoma de células B o leucemia.
29. 29. Un método para tratar a un paciente con linfoma de células B, caracterizado porque comprende administrarle al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo reductor de células B en forma simultánea o consecutiva en cualquier orden con un .fragmento o anticuerpo anti-citocina.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo reductor de células B se aglutina al antígeno de célula B seleccionado a partir del grupo que consiste de CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD?78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CDw84, CD85 y CD86.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo reductor de células B se aglutina al CD20.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo reductor de células B se aglutina al CD22.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque además comprende la administración de por lo menos un agente quimioterapéutico.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque por lo menos un agente quimioterapéutico se selecciona a partir del grupo que consiste de CHOP, ICE, Mitozantrone, Cytarabina, DVP, ATRA, Idarubicina, programa quimioterapéutico hoelzer, programa quimioterapéutico La La, ABVD, CEOP, 2-CdA, FLAG y IDA, con q sin un tratamiento subsecuente von G-CSF, VAD, M y P, C-Semanal, ABCM, MOPP, DHAP, daunorubicina, doxorubicina, metotrexato, y cisplatino.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el anticu rpo anti-citocina o el antagonista se administra antes del anticuerpo anti-CD20 y por lo menos después del agente quimioterapéutico.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo anti-citocina o el antagonista se administra antes del anticuerpo anti-CD20.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la citocina se selecciona a partir del grupo que consiste de IL2, IL6, IL10 y TNF-alfa.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la citocina es IL10.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo quimérico humanizado o humano anti-CD20.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo anti-CD20 quimérico.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 quimérico es Rituximab®.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el Rituximab® se administra a una dosis de 0.4 a 20 mg/kg de peso corporal.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque por lo menos un agente quimioterapéutico es parte de un programa quimioterapéutico CHOP.
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el linfoma de células B se selecciona a partir del grupo que consiste de linfoma (NHL) no Hodgkin folicular bajo grado, NHL (SL)de linfocitos pequeños, NHL folicular/ grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de alto grado de células B pequeñas no hendidas, NHL con enfermedad masiva o voluminosa, y Macroglobulinemia de Waldenstrom.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el linfoma de células B es un linfoma no Hodgkin folicular NHL.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el linfoma de células B es un NHL folicular de bajo grado.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el suero del paciente con linfoma se analiza para determinar los perfiles de citocinas antes de la administración del anticuerpo antí-citocina o de su antagonista.
48. 48. Un juego de reactivos para administrar el anticuerpo anti-CD20 y el antagonista o anticuerpo anti-citocina según el método de conformidad con la reivindicación 29.
49. 49. Un juego de reactivos para analizar el perfil de citocinas y administrar un anticuerpo anti-CD20 y un anticuerpo anti-citocina o antagonista según el método de conformidad con la reivindicación 42.
50. 50. Un método para tratar un tumor que tiene una implicación de células B que comprende administrarle a un paciente en necesidad del tratamiento una cantidad efectiva de un anticuerpo específico para una citocina y un anticuerpo reductor de células B que se aglutine a un antígeno expresado en las células B.
51. 51. Un juego de reactivos para administrar el anticuerpo anti-CD20 y el anticuerpo anti-citocina o el antagonista según el método de conformidad con la reivindicación 50.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el anticuerpo anti-citocina se aglutina a una citocina seleccionada a partir del grupo que consiste de un interferón, interleucina, factor de necrosis tumoral, y factor estimulante de colonias .
53. 53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el anticuerpo anti-citocina se aglutina a una citocina seleccionada a partir del grupo que consiste de un interferón, interleucina, factor de necrosis tumoral, y factor estimulante de colonias.
54. 54. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el anticuerpo anti-citocina se aglutina específicamente al IL-10.
55. 55. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el anticuerpo anti-citocina se aglutina específicamente al IL-10.
56. 56. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el antígeno de células B se selecciona a partir del grupo que consiste de CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD?78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CDw84, CD85 y CD86.
57. 57. Un juego de reactivos para administrar el anticuerpo anti-CD20 y el anticuerpo anti-citocina o el antagonista según el método de conformidad con la reivindicación 51.
58. 58. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el antígeno de células B es CD20.
59. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo anti-CD20 humano, humanizado o quimérico.
60. 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo posee una actividad ADCC y/o CDC.
61. 61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anti-CD20 induce la apoptosis de las células B.
62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 es Rituxan®, un anticuerpo anti-CD20 quimérico que se produce por ATCC 69119.
63. 63. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el paciente comprende un tumor sólido no linfoide asociado con un cáncer seleccionado a partir del grupo que consiste de cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de ovarios, cáncer pulmonar, cáncer del esófago, cáncer de la tráquea, cáncer del riñon, cáncer de la vejiga y cáncer colorrectal.
64. 64. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el linfoma de células B se selecciona a partir del grupo que consiste de (NHL) linfoma no Hódgkin folicular/bajo grado, NHL (SL) de linfocitos pequeños, NHL folicular/ de grado intermedio, NHL difuso, grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, .NHL de células B pequeñas no hendidas de alto grado, NHL con enfermedad masiva o voluminosa, y Macroglobulinemia de Waldenstrom.
65. 65. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque los anticuerpos se administran mediante una administración intravenosa, intramuscular, intratumoral, o intraperitoneal.
66. 66. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque los anticuerpos se administran mediante la una administración intravenosa, intramuscular, intratumoral, o intraperitoneal.
67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el tumor sólido comprende un precáncer, un cáncer sólido en etapa temprana (Etapa I ó II) . Cáncer avanzado (cáncer después de la Etapa II) o cáncer que se ha diseminado en metástasis.
68. 68. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el paciente tiene cáncer colorrectal o cáncer pulmonar.
69. 69. Un método para tratar el cáncer colorrectal o el cáncer pulmonar que implican células B, caracterizado porque comprende administrarle a un paciente en necesidad de este tratamiento, una cantidad efectiva de un anticuerpo específico para IL-10 y un anticuerpo anti-CD20 con actividad reductora.
70. 70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 reductor es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
71. 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el anticuerpo es Rituxan®, producido por ATCC 69119.
72. 72. Un método para tratar un linfoma ' de células B en un paciente en necesidad de este tratamiento, que incluye la necesidad de .administración de un anticuerpo anti-ILlO.
73. 73. Un método para tratar el linfoma no Hodgkin en un paciente en necesidad de este tratamiento, y este método comprende la administración de por lo menos un anticuerpo anti-ILlO.
74. 74. Un método para tratar el linfoma de células B en un paciente en necesidad del tratamiento, este método incluye la administración del anticuerpo anti-ILlO y por lo menos un anticuerpo reductor de células B.
75. 75. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el anticuerpo reductor de células B se aglutina al antígeno de células B a partir del grupo que consiste de CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD?78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CDw84, CD85 y CD86.
76. 76. Un método para tratar el linfoma de células B en un paciente en necesidad del tratamiento, este método comprende la administración de un anticuerpo anti-ILlO y un anticuerpo anti-CD20 ó anti-CD22 reductor de células B.
77. 77. Un método para tratar el linfoma de células B en un paciente en necesidad del tratamiento que comprende la administración del anticuerpo anti-ILlO y un anticuerpo anti-CD20 reductor de células B.
78. 78. Un método para tratar el linfoma no Hodgkin en un paciente en necesidad de este tratamiento, caracterizado porque comprende la administración de un anticuerpo anti-ILlO y un anticuerpo reductor de células B.
79. 79. Un método para tratar el linfoma no Hodgkin en un paciente en necesidad del tratamiento, caracterizado porque comprende la administración de un anticuerpo anti-ILlO y un anticuerpo anti-CD20 reductor de células B.
80. 80. Un método para tratar el linfoma no Hodgkin en un paciente en necesidad del tratamiento, caracterizado porque comprende la administración de un anticuerpo anti-ILlO y un anticuerpo anti-CD22 reductor de células B.
81. 81. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo es Rituxan®.
82. 82. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el anticuerpo es Rituxan®.
83. 83. Una terapia de combinación para el tratamiento del linfoma de células B en un paciente, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TLlO, un anticuerpo anti-CD20 para la disminución de células B y, quimioterapia.
84. 84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 es Rituxan®.
85. 85. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el paciente ha recaído luego de un tratamiento con un anticuerpo para la disminución de células B. 85. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es Rituxan®.